JPH0393798A - プラスミノゲン活性化因子阻害剤２（ｐａｉ―２）の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不純物をアクリジンまたはキノリン塩基で沈殿
させることより成るグラスミノゲン活性化因子阻害剤２
　ＣＰＡＩ−２）の精製方法に関する。

プラスミノゲン活性化因子（ＰＡ）は線維素溶解系を活
性化するセリンプロテアーゼである。それらはプロ酵素
プラスミノゲンを、フィブリンおよびフィブリノゲンを
分解する活性酵素プラスミンに変える。体内には２種類
のＰＡ，すなわち、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ
−ＰＡ）およびウロキナーゼ（ｕ−ＰＡ）と同じであり
また腎細胞のみならず他の正常または悪性細胞によって
も産生されるＰＡが存在する。ｔ−ＰＡは血栓症の防止
に特に重要である。ｕ−ＰＡは泌尿管系におけるフィプ
リン凝塊形戊を防ぐばかりでなく創傷治ゆにも寄与し、
また新生物が増殖するところに認められている。

ＰＡの濃度および活性はそれらの合戒によってだけでな
く阻害剤によっても調節される。プラスミンまたは他の
グロテアーゼを阻害しない２種類の特異的ＰＡ阻害剤（
ＰＡＩ）が知られている。

そのうちの一つば内皮細胞で産生され（ＰＡＩ−１）、
他方の胎盤に認められるもの（ＰＡＩ−２）は“ミナク
チビン（ｍｉｎａｃｔｉｖｉｎ）”とも呼ばれている。

胎盤抽出物より出発して、硫酸アンモニウム分画、不純
物のＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ−５０吸着、ゲル枦過
およびヒドロキシアパタイトクロマトグラ７イを施す従
来技術に従えば１２０倍濃度のＰＡｉ２を得ることがで
きる。この方法により、７０および４３ｋＤａの分子量
を有する二つ゛の形態のＰＡＩ−２が得られる。イムノ
アフィニティ・クロマトグラフィおよびイムノアフィニ
ティ・クロマトグラフィとＰＬＯの組合せも精製に用い
られている。中性塩による沈殿、ＣＭ一およびＤＥＡＥ
−ｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよびヒドロキシアパタイト
でのクロマトグラフィおよび分取式電気泳動を含む８工
程の組合せにより、胎盤から出発して４７ｋＤａの分子
量を有する精製ＰＡｉ２が得られる。クロマトグラ７イ
精製工程がジチオトレイトール型の還元剤の添加により
有利な影響を受け得ることも知られている。

本発明の目的はＰＡＩ−２単離のために生産規模で使用
できるより簡単な方法を見出すことにある。

驚くべきことに、２−エトキシー６．９−ジアミノアク
リジンラクテートを用いるとＰＡｌ２の溶液から不純物
を沈殿させることができＰＡＩ−２それ自体は上溝に溶
存したまま残ることが見出された。

ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で予めインキユベーショ
ンしでおくことが有利であることも判っｔ二。

本発明は、ＰＡｌ−２含有溶液をジスルフィド結合開裂
剤、好ましくはジチオトレイトール（ＤＴＴ）、と予め
インキユペートし、適当な水溶性アクリジンまたはキノ
リン塩基、好ましくは２−エトキシ−６．９−ジアミノ
アクリジンラクテート、を形威される沈殿が僅少なＰＡ
Ｉ−２しか含まないような量で用いて前記溶液と混合し
、この沈殿を分離し、その上清からＰＡｉ２を取得し、
そして適切な場合には既知方法を用いて更に精製するこ
とより成るグラスミノゲン活性化因子阻害剤２　（ＦＡ
Ｔ−２）の精製方法に関する。

溶存タンパク質量に対して少量のアクリジンまたはキノ
リン塩基を添加してもＦＡ　Ｉ−２は沈殿するであろう
。前記塩基の水溶性塩、好ましくは２−エトキシー６．
９−ジアミノアクリジンラクテート、の適切な濃度は溶
存タンパク質（ＰＡＩ−２は実質的に溶存状態にある）
１９あたり２００１１９〜２９である。この方法は５．
５〜８．５のｐｕで行われる。

ＰＡＩ−２含有溶液は予め低温殺菌しておいてもよく、
適切な場合には安定化剤、好ましくはグリシンおよび／
またはシュークロースを添加しておいてもよい。

ＰＡＩ−２含有溶液は好ましくは胎盤抽出液または遺伝
子工学によるＰＡｉ２を含有する溶液である。

ジスルフィド開裂剤は１０ｍｍｏＱ／　Ｑ〜２５０ｍｔ
ｎｏＱ／Ｃ１好ましくはｌ００ｍｍｏｌ２／　（ｌの濃
度で用いられる。

予備的インキュベーションは１５分〜３時間、好ましく
は１時間、ｌＯ〜４０°Ｃ１好ましくは約３　７　’０
で行われる。

本方法を前記の如く行うとき、上溝には使用ＰＡＩ−２
活性の８５〜９０％が存在するが使用タンパク質の５〜
８％しか存在していない。

沈殿後、好ましくはＮａＣＱ１好ましくは５％、を用い
てアクリジン塩基を塩析することができ、またｖｉｔｍ
アンモニウム沈殿、例えば硫酸アンモニウムで溶液を８
０％飽和することによりＦＡ　Ｉ　−２を濃縮でき、そ
れによって硫酸アンモニウムにより溶液を３０％飽和さ
せることによる予備的沈殿とあいまって更なる精製度が
得られる。使用タンパク質の約９０％がリバノール（Ｒ
ｉｖａｎｏｌ）オよびｉ酸アンモニウム沈殿により除去
されるので、僅少の残留量は次いで容量制限に従う精製
方法に付すことができる：例えばＤＥＡＥ一”Ａｆｆｊ
ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ（アガロースに共有結合したジエチル
アミノエチル基および　”Ｃｉｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ
Ｆ３ＧＡ色素より戊る二官能性ア７イニテイを有するク
ロマトグラ７イゲル）での、およびヒドロキシアバタイ
トでのクロマトグラフイ。この純度の物質はすでに治療
用途に適しているはずである。超精製（ｕｌｔｒａ−ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）はフエニルアラニンカラムで
の疎水性クロマトグラフイによって行うことができるが
実質的損失を伴う。

得られるＦＡ　Ｉ−２は予め行われていない場合には付
加的に低温殺菌してもよい。

本発明方法を以下記載する： ＰＡｌ２の単離を監視するためにアミド分解（ａｍｉｄ
ｏｌｙｔｉｃ）法をＫａｂｉ社の色素原性基質Ｓ−２４
４４（Ｇ　ｌｕ−Ｇ　１ｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）と組合せ
て用いた。測定には、５０ａＱのウロキナーゼ（ｕ−Ｐ
Ａ）（ＩＯＯＯＵ　／　ｍｆｆ）ヲ１００μＱのＰＡｉ
２含有試料と室温で４分間インキユペートし、そしてこ
の混合物８０μａを３７℃に予め加温されたプラスチッ
ク製キュベットに移した。

次に５０ｕ（ｌの緩衝液Ａおよび２０μＱのＳ−２４４
４（６　＋ｍＭ）を添加した。４０５ｎｍでの吸光度増
加をＣｏｂａｓ　Ｂｉｏ遠心分離分析器で測定した。測
定値を内部用（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）　ＰＡＩ−２標準品
の連続希釈を通して作威した希釈プロットと比較するこ
とにより評価し　Ｉこ　。

ＰＡＩ−２の単離に用いた物質： ２−エトキシー６．９−ジアミノアクリジンラクテート
（６．９−ジアミノ−２−エトキシアクリジンラクテー
ト）　：　ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｅ　ＧｍｂＨ，　Ｄ−
６１００ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）　；
　１２．５＋ｍＭ　ｔｒｉｓ，　ｐＨ６．８、中の２．
５％（ｗ／Ｖ）強度溶液を分別沈殿に用いた。

ジチオトレイトール（ＤＴＴ）　　：　Ｓｅｒｖａ　Ｆ
ｅｉｎ−ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ　（；ｍｂＨ　＆　Ｃｏ
．，　　Ｄ−６９００ハイデルペルク（Ｈｅｉｄｅｌｂ
ｅｒｇ） ヒドロキシアパタイト：　”ＢｉｏＲａｄｓ　　リッチ
モンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州（ＣＤ
）、米国 ７エニルアラニンー”ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＣＮＢ
ｒ一活性化”Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　　４　Ｂ　：　Ｄｅ
ｕｔｓｃｈｅＰｈａｒｍａｃｉａ　ＧｍｂＨ，　　Ｄ−
６９００　　フライダルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ） Ｓ−２４４４　：　Ｋａｂｉ　Ｖｉ”ｔｒｕｍ，　Ｓ−
１１２８７ストックホルム（ＳＬｏｃｋｈｏｌｍ）、ス
エーデントリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｌ
ｒｉｓ）：　Ｅ．　Ｍｅｒｃｋ．　Ｄ−６１００ダルム
シュタット ウロキナーゼ（”Ａｃｔｏｓｏｌｖ）：　Ｂ６ｈｒｉｎ
ｇｗｅｒｋｅＡ（；，　Ｄ−３５５０マールブルク（Ｍ
ａｒｂｕｒｇ）緩衝液Ａ　：　５０ｍＭ　ＬｒｉＳｘ　
ｐＨ８．４、１％ポリゲリン、ｌ００ｍＭ　　ＮａＣＱ
，０．０１％”ＴｒｉｔｏｎＸＩＯＯおよび０．０１％
ＮａＮ． 緩衝液Ｂ　：　２Ｑ＋＋＋Ｍ　ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５
、２０＋＋ＩＭ　ＤＴＴ緩衝液Ｃ　：　２０ｍＭ　Ｎａ
２ＨＰＯイｐＨ６．８、２０ｉＭＤＴＴ 緩衝液Ｄ　：　２０＋＋ｌＭ　ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５
、２０＋＊Ｍ　ＤＴＴ１硫酸アンモニウムで３０％飽和 緩衝液Ｅ　：　２０ｍＭ　ｔｒｉｓ，　ｐＨ７．５、１
００ｍＡＪ　ＮａＣ（１緩衝液Ｆ　：　２０ｍＭ　ｔｒ
ｉｓ，　ｐＨ６．８実施例 血液不含に洗浄された凍結ヒト胎盤をＰＡＩ−２調製用
原料として用いた。その胎盤はカッターで寸断しておき
、次いで０．５％ＮａＣ（２および３ｍＭＥＤＴＡで抽
出した。細胞残渣を遠心分離により除去し、そして上溝
を８％リパノールで沈殿させそしてその沈殿を溶解し硫
酸アンモニウムによる分別沈殿に付した。ＰＡＩ−２を
含有する沈殿を緩衝液Ｆに溶解しそしてそれに対して透
析した。

胎盤の濃抽出液は４，６１５Ｕ　ＰＡＩ−２／　ｍＱを
含有し、比活性は１２０Ｕ／１９であった。この物質を
超精製に用いた。

−リバノールおよび硫酸アンモニウム沈殿５００ｌＩＩ
２の前記出発材料（第１表参照）を７．７９のＤＴＴ　
（最終濃度１００ｍＭ）と３７℃で工時間インキュベー
トした。ｌ　．　５２０ｍｆｆの２．５％強度リバノー
ル溶液をこの溶液に注意深く連続撹拌しながら滴加し、
かくて２００％に相当する最終濃度に到らしめた。沈殿
により得られた沈殿を遠心分離により除去し、過剰のり
バノールを、１００９の固体ＮａＣ（ｌを５％最終濃度
まで添加することにより上清から除去した。次に、３４
３ｇの固体硫酸アンモニウムを３０％飽和に相当する最
終濃度に達する，まで上清に添加した。沈殿を遠心分離
（２０分間、３００Ｏｒｐｍ）により除去し、次いで６
９４ｇの固体硫酸アンモニウムを８０％飽和の最終濃度
となるまで添加した。これにより得られる沈殿を緩衝液
Ｂに高濃度で溶解しそして透析した。これにより８０ｒ
ＲＱの溶解・透析硫酸アンモニウム残液が得られｔ二。

−ＤＥＡＥ−’Ａｆｆｉｇｅｌ　Ｂｌｕｅクロマトグラ
フイ８０ｍＱの前記硫酸アンモニウム沈殿を緩衝液Ｂと
平衡させたＤＥＡＥ−Ａｆｆｉｇｅｌ　Ｂｌｕｅ力ラム
（１７．５Ｘ４．４ｃｍ、２６０ｍｌ２ゲル床）にかけ
た。ソノカラムヲ０　〜２００ｍＭ　ＮａＣＱの範囲に
及ぶ緩衝液Ｂ中のＮａＣα勾配（　２　Ｘ　ｌｏｏｏｍ
ｃ）を用いて９Ｑｍｌ２／時の流速で溶出した。夕冫パ
ク質濃度を２８０ｎｍでのＯＤで連続測定し、そしてＰ
Ａｌ−２活性を前述の如く測定しｔ二。

−ヒドロキシアパタイトクロマトグラフイ前工程からの
ＰＡ！−２含有画分を４７２ｍＱ集め、緩衝液Ｃに対し
透析し、そして同じ緩衝液で平衡させたヒドロキシアバ
タイト力ラム（１５Ｘ３．２ｃＩＩＩ１５６１ＩＱゲル
床）（第１表参照）にかけた。そのカラムを同じ緩衝液
を用いてある流速で溶出した。そのカラムを緩衝液Ｃ中
の燐酸ナトリウムの塩勾配（０．０２〜０．３Ｍ　；　
２　Ｘ　２５０ｍ（１）を用イテ５０ｒｒｒＱ／時の流
速で溶出した。溶出液のタンパク質濃度およびＰＡＩ−
２活性を連続測定した。

−７エニルアラニンー”Ｓｅｐｈａｒｏｓｅヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィ後のＰＡＩ−２含有画分を
集め、そして１３．２ｇの固体硫酸アンモニウムを１２
０ｍｌ２のこの物質に添加し３０％飽和とした。この溶
液を緩衝液Ｄと平衡させたフエニルアラニンー”Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ力ラムにかけた。

その樹脂を緩衝液ＤおよびＢから形戊された勾配（２　
Ｘ　ｌ００ｍ０を用いて２０ｍａ／時の流速で溶出した
。ＰＡＩ−２含有画分を集めそして特性を測定した。最
高純度の物質は６０．０００Ｕ　（一単位）／Ｉ＋Ｉｇ
の比活性を有し、またＳＯＳボリアクリルアミドゲル電
気泳動では、４３ｋＤａの分子量を有しそして特異モノ
クローナル抗体を用ｌ／１ｔこイムノブ口トで実証し得
る一体のノ《ンドとして移動しＩ二　。

Ｃ １２　Ｎ ９／９９ ＠発 明 者 カールハインツ●ヴエ ンッ ドイツ連邦共和国デー−　３５５６ヴアイマル．ーセ１
０ タールシュトラ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）プラスミノゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−２）含
   有溶液をジスルフィド結合開裂剤と予めインキュベート
   し、適当な水溶性アクリジンまたはキノリン塩基、好ま
   しくは２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジンラク
   テートを形成される沈殿が僅少なＰＡＩ−２しか含まな
   いような量で用いて前記溶液と混合し、この沈殿を分離
   し、その上清からＰＡＩ−２を取得しそして適切な場合
   には既知方法を用いて更に精製することより成るＰＡＩ
   −２の精製方法。 ２）ＰＡＩ−２含有溶液が胎盤抽出液または遺伝子工学
   によるＰＡＩ−２の溶液である請求項１記載の方法。 ３）ジスルフィド開裂剤がジチオトレイトールである請
   求項１記載の方法。 ４）ジスルフィド開裂剤が１０ｍｍｏｌ／ｌ〜２５ｍｍ
   ｏｌ／ｌ、好ましくは１００ｍｍｏｌ／ｌ、の濃度で用
   いられる請求項１記載の方法。 ５）予備的インキュベーションが１５分〜３時間、好ま
   しくは１時間行われる請求項１記載の方法。 ６）予備的インキュベーションが１０〜４０℃、好まし
   くは約３７℃、で行われる請求項１記載の方法。 ７）塩基が５．５〜８．５のｐＨで溶解された形で用い
   られる請求項１記載の方法。 ８）ＰＡＩ−２含有溶液が低温殺菌される請求項１記載
   の方法。