JPS6062981A - 線維素溶解酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、線維素溶解酵素に関する。

〈先行技術〉 従来、線雑素溶解酵素としては、ウロキナーゼが著名で
ある。このものは人尿および人腎細胞の培養液から精製
されており、主として分子量３万と、分子量５万の２種
からなる。このウロキナーゼは、高分子のものが活性も
高く最も医薬品として有用である。そしてその分子構造
は、Ｈ鎖（分子量３万）、シ鎖（分子量２万）の２木の
鎖がジスルフィド結合によってのみ連結されている。そ
れ故、還元処理によって容易に低分子化される性質を持
っていた。

本発明者は、上記知見を認識し、よりずぐれた線維素溶
解酵素を得るべく研究を重ねた。その結果、人腎細胞の
無面清培養液中に分子量約５万で、還元処理によって低
分子化が起こらず、しかもフィブリンへの親和性が既知
分子型のウロ４−ナーゼに比して高い線維素溶解酵素を
見い出し、本発明を完成するに至った。

〈発明の開示〉 本発明は、人腎細胞の培地より回収しつる蛋白質であり
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定
した分子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理によっ
て低分子化が起こらず、またプラスミン処理により酵素
活性を発現゛りるチモゲンの一種である線維素溶解酵素
酵素に関Ｊるものである。

［原料の調製］ 原料としては人腎細胞が用いられるが、この人腎細胞は
、例えば人胎児腎より得たｐｒ＋ｍａｒｙｃｕｌｔｕｒ
ｅ又はｄｉｐｉｏｉｄ　ｃｅｌｌｓを入手し、これを継
代培養し、線雑素溶解酵素産生細胞を分離したものが利
用される。例えばｍ胞を２〜２０×１０４ｃｅｌｌｓ　
／ｍＲの数で植え込み、３日間はど培養を続け、細胞数
が植え込み数の約３倍になった時点で！ トリプシン−ＥＤＴＡ混液を添加し、単層の幼若な細胞
を回収して得たものが使われる。

［培養条件］ 培地としては、例えばＷａｙｍｏｕｔｌｌの培地、Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＭＩＥＮ培地な
どが用いられ、前培養時には、前該培地中に熱不活化牛
胎児血清を５％添加し、本酵素産生時には０．１％ヒト
血清アルブミンを添加した無血清培地を用いて培養する
。無血清培地にはヒトまたはウシアルブミン、ラクトア
ルブミン氷解物、トランスフェリン、各種脂肪酸、イン
シュリン等のホルモンなどを添加してもよい。培養時間
は２〜３日程度であり、培養培地を交換・回収する。こ
の培地中に本発明の線維素溶解酵素が産生されている。

［綜維素溶解酵素の回収］ 培地からの線維素溶解酵素の回収は、例えば、当該培地
を遠心分離、減圧濃縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等を、適宜組み合わせることによって行なわ
れる。

より具体的には、例えば次のごとき方法によって回収さ
れる。すなわち、まず培地を遠心分離し、上清を回収す
る。この回収液をイオン交換クロマトグラフィーにより
部分精製する。担体としては、弱酸性陽イオン交換体が
最適であり、例えばＣＭ−交換体、あるいはＤｕｏ　Ｉ
　ｉ　ｔｅ等が例示される。担体をｐＨ４，５〜６．５
、より好ましくはｐ　ｆ−１５〜６に調整した後、回収
液を展開して担体に吸着させる。上記の緩衝液で洗浄し
た後に、Ｉ）８７．５〜９．５、より好ましくはｐＨ８
〜９の緩衝液で本酵素を溶出する。緩衝液としては、リ
ン酸緩衝液等が例示される。さらに、この溶出液をアフ
イニデイークロマトグラフイーにより高度精製する。担
体としては、ポリクロナール抗体カラム、モノクロナー
ル抗体カラムのどちらを用いてもよい。

ポリクロナール法の場合、抗線維素溶解酵素抗体は、高
度に精製した線維素溶解酵素を動物に免疫し、得られた
血清から回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製線維素溶解酵素と７０インドの完全アジュバ
ントの混合乳液を作り、動物の陵内に２〜３回注射し、
最終免疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、
４℃で一夜放置し、３．０００ｒＥ１１．２０分間の遠
心分離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、７１クス、ウサギ、ヤギ、ウマ等
が挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、＾−
、ＣｈｅｔＳｏｃ、、６２．３３８６　（１９４０）　
、　Ｆｅｄ。

Ｐｒｏｃ、、１７．１１６１　（１９５８）に記載の方
法にて行なわれる。

モノクロナール法の場合、細胞融合法により抗線維素溶
解酵素を得る。細胞融合法は自体既知の手段にて行なわ
れ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とする抗体を
産生しているリンパ球とをポリエチレングリコールの存
在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体産生能と
を同時に兼ねそな屍だ細胞を製するもので、この細胞の
産生ずる抗体は一個の抗原決定基に対してのみ反応する
単一の抗体である。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として線維素溶解酵素で免疫さ
れたマウス牌臓細胞（Ｂｉｌｌ胞）を用いて融合させ、
さらに目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニ
ングして、線雑素溶解酵素のモノクロナール抗体を得る
。

また、このようにして得られた抗線雑素溶解酵素を、そ
の活性を失うことなく固定化づる方法としては、以下の
不溶性マトリックスを応用することができる。アミノ酸
のコポリマー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ鵬、、２３６．１
９７０　（１９６１））　、セルロース（Ｎａｔｕｒｅ
己堕、　５７６　（１９６１））　、アガロースあるい
はセファデックス（Ｎａｔｕｒｅ、　２１５．１４９１
　（１９６７）　、　Ｎａｔｕｒｅ、２４５．３０５９
　（１９７０））　、ポリアクリルアミド（Ｂｉｏｃｂ
ｅｎ＋、、８．４０７４　（１９６Ｇ））。これらの方
法により抗線維素溶解酵素を効率良く固定化しうる。ま
た、このようにして得られた吸着剤を用いることにより
、収率良く、しかも高純度の１！維素溶解酵素を得るこ
とができる。

本発明に係るｌｉｔ組素溶解酵素のアフィニティークロ
マトグラフィーは以下の通りである。陽イオン交換体に
より部分精製した線紐受溶解酵素を、１）Ｈ６−８の緩
衝液で平衡化しｌ〔抗線維素溶解酵素抗体カラムと接触
・吸着させる。カラムを洗浄後、ｐＨ２−４の水溶液で
溶出Ｊ°る。

なお、上記の回収法は本発明線紐受溶解酵素回収法の一
例を示したにづ°ぎず、もちろん他の方法によって回収
してもよい。かくして得られた線維素溶解酵素は、化学
用、薬学用、医学用の試薬として用いてもよく、又医薬
品として用いる場合には、医薬品の製造の通例技術にし
たがって、要すれば加熱処理、除菌濾過、凍結乾燥、分
注、製剤化を行なえばよい。又、精製工程中または精製
後、溶液中に安定化剤として、アルブミンまたは非イオ
ン性界面活性剤、例えばトリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅ
ｎ８０等を添加することが好ましい。かくして新規な線
維素溶解酵素を含有する医薬が提供される。

Ｅ本発明線維素溶解酵素の特性］ ■分子間 ５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２２７．６８０−６８５　（１９７０）　）を
用いて、本発明からなる線維素溶解酵素の分子量を測定
し１こところ、約５万ダルトンであった。なお分子量は
分子量既知の標準蛋白との比較によって決定し、また前
処理として、３７℃、２時間または１００℃、２分間、
１％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールによる還元
処理を各々行なった。

■Ｗ９素感受感 受性Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７．３２７６−３２８
３　（１９８０）に準じて、プラスミンに対する感受性
実験を行なった。その結果、本発明からなる線維素溶解
酵素はそれ自身はプラスミノーゲンアクチベーター活性
を示さなかった。しかし、プラスミン処理をすることに
より活性が発現し、その活性発現の程度はプラスミン処
理の１度（表１）、およびその処理時間（表２）に依存
していた。活性測定法は後記の通りである。

前者の実験は、本線紐受溶解酵素蛋白量として、１．３
μ９７ｉｄを調製し、これに各濃度のプラスミンによっ
て約６０分間の前処理を行なった後に発現される酵素活
性を測定した。

後者の実験は、プラスミンを０．１μｇ／ｌｄ及び木線
腑素溶解酵素蛋白聞として１．３μｇ／Ｉｄを調製し、
プラスミンによる処理時間による効果を経時的に測定し
た。

このことから、本発明からなる線帷素溶解酵素はヂモグ
ンの一種であることが判明した。

以下余白 ■還元剤処理 １％ＳＯ８，１％２−メルカプトエタノール、３７℃・
２時間、もしくは、１００℃・２分間の処理に対する本
発明からなる酵素の抵抗性を分子用測定法に準じて調べ
た。その結果、未処理線維素溶解酵素と処理後Ｓ！雑紐
受解酵素は同じ電気泳動パターンを示し、この酵素が一
本鎖であることを確認した。

■活性測定法 合成基質法（クリーソンら　１ＩａｅｌＯ３ｔａｓｉｓ
、　、　７．７６　（１９７８））　、もしくは平板法
（アストラップらＡｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、、４０，３４６−３５１．（１９５２）　）に
よって活性を測定できた。フィブリノーゲンはＭｉ　Ｉ
ｅｓ社のｂｏｖｉｎｅ、　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、　Ｆ
ｒ、　Ｉ　（微酔のプラスミンを含む）を使用した。

■その他の性状について 活性中心：ウロキナーゼのセリン活性部位に結合するｐ
−アミノベンズアミジンを固定したセファローズゲルに
本発明からなる線維素溶解酵素を接触させたが、吸着し
なかった。このことがら、本発明からなる線維素溶解酵
素のセリン活性部位は分子内部にはいっており、従来の
ウロキナーゼとは高次構造が異なっているものと推定さ
れる。

フィブリン親和性：本発明からなる線維素溶解酵素はフ
ィブリンへの親和性が強く、組織プラスミノーゲン・ア
クチベーター類似の性質を有する。

このことは血栓溶解療法において重要な意味を持つ。即
ち、従来のウロキナーゼではプラスミンの失活が早いた
めに大量投与しなければならず、そのために出血傾向な
どの重篤な副作用が惹起される。ところが、本発明から
なる線維素溶解酵素はフィブリンへの親和性が高いため
に固相（フィブリン〉上に限定した線溶現象を惹起させ
ることができ、血栓溶解療法にとって理想的な医薬を提
供するものである。

以下余白 〈実施例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールした培養上清をＩ）８５．
５に調整した後、ＣＭ　−３ｅｐｈａｄｅＸ　Ｃ−５０
に接触した。０．１６　Ｍリン酸緩衝液（ＤＨ５，５）
でカラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ
−１８，５’）で吸着していた線帷素溶解酵素を溶出さ
せた。

一方、線維素溶解酵素で予め免疫しておいたマウスＢＡ
ＬＢ／ｃの牌臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチ
レングリコールにより融合させたハイブリドーマのうち
、線紐受溶解酵素に対する抗体産生の高いクローンを選
択した。この融合細胞の培養液から、抗線維素溶解酵素
モノクローナル抗体を回収した。このモノクローナル抗
体をＢｒＣＮ活性化３　ｃｐｌ＋ａｒｏｓｅ４　Ｂ　（
Ｐ　ｈａｒｗ＋ａｃｉａ社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０．４ＨＮａＣ１含有
０．１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し、これ
に前記の線維素溶解酵素を含有する溶出液を接触した。

０．４ＨＮａＣＩ含有−０−，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＩ
−１７，０）でカラムを洗浄した後、吸着していた線維
素溶解酵素を０．５ＨＮａＣｌ含右０．２Ｈグリシン−
ＭＣＩ水溶液（ｐＨ２，５＞で溶出させた。溶出液を除
菌濾過した後、凍結乾燥し高度精製線維素溶解酵素を得
た。

回収率は、約９０％であり、又ｔの精製品は５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法により分子量５万の１
本の帯を示した。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字 代　理　人　弁理士　圧用　隆 手続補正書（方式） 昭和５９年　２月１６　さ詠 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許１ｒｉ第１７０３５４号２、発明の名称 線紐受溶解醇累 ３、補正をづる者 事ｆ（との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市東区今橋１丁目１５番地の１株
式会社ミドリ十字内 ５、補正命令の日付　昭和５９年　１月１１日６、補正
により増加する発明の数　なし７、補正の対象　明細書
の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄、発明の詳細な
説明の欄 手続補正書（自利 昭和５９年　２月２３日 込 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第１７０３５４号 ２、発明の名称 線維系溶解酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市束区今［１丁目１５番地の１株
式会社ミドリ十字内 電話（０６）　２２８−０７００ ７、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 （１）明、ｔ＋ＩＩｌ書第２頁、第１７行の「酵素酵素
」を「酵素」に訂正する。

（２）回書第３頁、第１２行の「前核培地」を［前記該
培地Ｊに訂正する。

（３）回書第３頁、第１３行の「０１係」を「無血清培
地、好ましくは」に訂正する。゛ （４）　回書第３頁、第１６行の「トランスフェリン、
」の後に、「各種アミノ酸、」を挿入する。

（５）回書第６頁、第１４行〜第１５行、及び回書第７
頁、第２行〜第３行の「抗線維素溶解酵素」を「抗線琲
素溶解酵素抗体」に４正する。

（６）同１第９頁、最終行下に、「又、不発明からなる
線維系溶解酵素を、プラスミン処理した後還元処牌し、
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったとこ
ろ、分子量約３万と、約２万の断片に分解されていた。

よって、このプラスミン処理後の生成物は、従来の人尿
由来ウロキナーゼと同一物と推定される。」を挿入する
。

（７）回書第１２頁、第３行と第４行の間に、［二次構
造：不発明からなる線維系溶解酵素を円偏光二色性によ
って、α−へリックス含量を調べたところ、従来の人尿
由来ウロキナーゼに比較して、α−へリツクス含量が高
かった。このこと院？本線維素溶解酵素と、従来の人尿
由来ウロキナーゼとは、二次構造が異なっている事が示
された。」を挿入する。

（８）回書第１２頁、最終行下に以下を挿入する。

「フィブリノーゲンへの影響：従来の人尿由来つｏキナ
ーゼは、血栓部位のフィブリン以外に、血漿中のフィブ
リノーゲン、凝固因子（第Ｖ因子、第■因子、第Ｘ１ｌ
ｌ因子）をも分解し、出血傾向増大の副作用が問題とな
る。そこで、本発明からなる線維系溶解酵素による血漿
中のフィブリノーゲン分解を調べた。

■でフベルしたフィブリノーゲンを人血漿中に前もって
添加しておき、不発明からなる線維系溶解酵素（５００
ＩＵ／ｍ）または、従来の人尿由来ウロキナーゼ（１５
ｏ　ｏ　ＩＵ／ｄ）を加え、３７℃下２分、１０分、６
０分、１２０分、１８０分後にサン、プリングし、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオートラジオグ
ラフィーにより１２５■−フィブリノーゲンの分解の程
度を経時的に測定した。

分子量３３０，０００のフィブリノーゲンは、プラスミ
ンにより、分子量２４０，００００．１５５，０００．
８５．０００．５０，０００　の断片、およびその他の
小さな断片に分解されるが、本発明からなる線維素溶解
酵素は、血漿中に１８０分間存在してもフィブリノーゲ
ンを（豆とんど分＋！ＩＩしなかった。一方、従来の人
尿由来ウロキナーゼを作用させた場合、１０分間でかな
シ多くのフィブリノーゲンが分解され、さらに分解は進
んでいった。

すなわち、本発明からなる線維素溶解酵素は、フィブリ
ンへの親ｆｌｌ性が高く、フィブリン溶解能が高いが、
血漿中のフィブリノーゲンを分解しないことより、血栓
部位のフィブリンのみを分解し、ウロキナーゼ大量役馬
の際に問題となる副作用である血中フィブリノーゲン減
少に伴う出血傾向の増大を引き起こし難いと言える。

血栓溶解能：ヒト血漿から作成したフィブリン血栓に対
する溶解能を調べだ。１２５Ｉでラベルしたフィブリン
血栓を、本発明から力る線組素溶解酵素または、従来の
人尿由来ウロキナーゼで含有血漿中で３７℃、３時間放
置し、溶解したフィブリンの放射活性を測定した。その
結果を、表４に示す。この結果より本発明からなる線維
素溶解酵素の血栓溶解能は、従来の人尿由来ウロキナー
ゼのそれより、約３倍優れていることが判明した。

表４ 血漿中での安定性：血漿中での本発明からなる線維素溶
解酵素の分子量、及び一本鎖のＷｔ造を調べることによ
り、安定性を横割した。１２５■でラベルした本発明か
らなる線維素溶解酵素１　ｓ　００　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）を
３７℃の人血漿中で放置し、１時間、２時間、３時間後
にサンプリングし、それを２分した。一方は、１ｌｓＤ
ｓで変性し、他方は、１％ＳＤＳ及び１係２−メルカプ
トエタノールで還元処理した。

これらの５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動及び
オートラジオグラフィーを行った結果、３時間後におい
ても、非還元および還元処理ともに０時間と同じ泳動パ
ターンを示し、分子量約５万の１本の帯を示した。よっ
て、本発明からなる線餠素溶解酵素の分子量及び一本鎖
の構造は、血漿中では安定と言える。

前記合成基質法により、本発明からなる線誰素溶解酵素
の血漿中でのウロキナーゼ活性を測定したが、活性は発
見しなかった。

以」二のことより、本発明からなる線維素溶解酵素ｄ、
酵素前駆体として血漿中で安定であると言える。

抗ウロキナーゼ抗体および抗ヒトメラノーマ由来ＴＰＡ
抗体による酵素活性の中和：本発明からなる線維素溶解
酵素の活性をプラスミンにより発現させた。。さらに、
抗ウロキナーゼ抗体、もしくは抗ヒトメラノーマ由来Ｔ
ＰＡ抗体を添カロし、３７℃、９０分間放置後、残存酵
素活性を前Ｆ合成基質法、もしくは平板法で測定したと
ころ、プラスミン処理によって発現する本発明からなる
線維素溶解酵素の酵素活性は、抗ウロキナーゼ抗体によ
って阻害されたが、抗ＴＰＡ抗体によっては阻害されな
かった。

以上のことより、本発明からなる線に、（［素溶解酵素
は、フィブリン親和性において、Ｔ　Ｉ）　Ａと類イ以
の性質を示すが、ＴＰＡや、その前駆物質とは異る物質
である。

血栓溶解の機序：以上の本発明からなる線＃、ｆｌｉ素
溶解酵素の性質か呟　この酵素は従来の人尿由来ウロキ
ナーゼとは血栓溶解機構が異なっているものと思われる
。

人尿由来ウロキナーゼは血漿中および１ｎｔ斗全−ヒの
プラスミノーゲンに直接的に作用し、生成されるプラス
ミンがフィブリノーゲンやライブ１ノンを分解する。

一方、本発明からなる線維素溶解酵素は血漿中ではプラ
スミノーゲン・アクチベーター活性を示さず、フィブリ
ンとの親和性が高い故、血栓部位に到達しやすく、フィ
ブリンに結合し、血栓中に含まれる微量のプラスミンに
より血栓上でウロキナーゼ活性を発現すると思われる。

そして、フィブリン分子に結合しているプラスミノーゲ
ンをプラスミンに変換し、フィブリンを分解すると思わ
れる。

この様に本発明からなる線維素溶解酵素を使用した場合
、フィブリン（血栓）という固相上のみに限定した線溶
現象を期待する事ができ、新しいタイプの線維素溶解剤
として大いに期待できる。」以上 手続補正書（自利 昭和５９年　３月３０日 特許庁長官殿 昭和５８年特許願第１７０３５４号 ２、発明の名称 線維素溶解酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市東区今橋１丁目１５冨地の１株
式会社ミドリ十字内 ６、補正により増加する発明の数　なし７、補正の対象 （１）明細書第１２頁第４行 「フィブリン親和性：」の後に［本発明からなる線維素
溶解酵素（ｆｆ、素置として５工Ｕ）をフィブリノーゲ
ン２　”ｔ　／　ｒｘｌを含む反応混合物（例えは血漿
など）に添加した。この検体をトロンビンにより凝固さ
せた後、３７℃で１５分間インキュベーションした。凝
塊と上清を遠心分離し、上溝中のプラスミノーゲン活性
を測定した。

この値を非結合量とし、全体量から引いた値をフィブリ
ンへの結合量として算出した（表３）。Ｊを挿入する。

（２）　明細書第１２頁第４行以下に 「表３ 」 を挿入する。

手続補正１！！（自発） １、事件の表示 昭和５８年特許願第１７０３５４号 ２、発明の名称 線維素溶解酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市東区今［１丁目１５番地の１株
式会社ミドリ十字内 電話（０６Ｊ　２２８−０７００ ７、補正の対象 （１）　明細書第１１頁、下から第６行と第５行の間に 「■アミノ酸配列 本発明からなる線維素溶解酵素のアミノ酸配列の一部を
アプライド・バイオシステムズ社のＧａｓ　−Ｐｈａｓ
ｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｏｒ、　Ｍｃｘｌ
ｅｌ　４７０　Ａ　によりＮ末端から１６番目まで決定
した。Ｎ末端から１６個のアミノ酸配列は尿由来ウロキ
ナーゼのそれ（Ｈｏｐｐｅ−８ｅｙｌｅｒ’ｓ、　Ｚ、
　′Ｐｋ］ｙｓｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　８６８．１１５
５−１１６５（１９８２））と完全に一致した。」　を
挿入する。

（２）　同書第１１頁、下から第５行の「■」を「■」
に訂正する。

手続補正書（自利 昭和５９年／７月」２日 特許庁長官殿 昭和５８年特許願第１７０３５４号 ２、発明の名称 線紐受溶解酵素 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４、代理人 住所　〒５４１　大阪市束区４Ｉｉ１丁目１５番地の１
株式会社ミドリ十字内 電話（０６１２２８−０７００ ７、補正の対象 明　細　書　（訂正） １、発明の名称 プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体２、特許請求
の範囲 人腎細胞の培養培地より回収しうる蛋白質であり、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分
子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理ににっで低分
子化が起こらず、またプラスミン処理により酵素活性を
発現するチモグンの一種であるプラスミノーゲン・アク
ヂベーター前嬰俸・ ３、発明の詳細な説明 本発明は、プラスミノーゲン・アクチベーター前駆体（
以下ヂモゲンと言う）に関する。

〈先行技術〉 従来、プラスミノーゲン・アクヂベーターとしては、ウ
ロキナーＵが著名である。このものは人尿および人腎細
胞の培養液から精製されており、主として分子量３万と
、分子量５万の２種からなる。このウロキナーゼは、高
分子のものが活性も高く最も医薬品として有用である。

そしてその分子構造は、Ｈ鎖（分子量３万）、Ｌ鎖（分
子量２万）の２本の鎖がジスルフィ１′結合によっての
み連結されている。それ故、還元処理によって容易に低
分子化される性質を持っていた。

本発明者は、上記知見を認識し、よりすぐれたプラスミ
ノーゲン・アクチベーター前駆体を得＝るべく研究を重
ねた。その結果、人腎細胞の無血清培養液中に分子量約
５万で、還元処理によって低分子化が起こらず、しかも
フィブリンへの親和性が既知分子型のウロキナーゼに比
して高い本チｔグンを見い出し、本発明を完成するに至
った。

〈発明の開示〉 本発明は、人腎細胞の培地より回収しうる蛋白質であり
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定
した分子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理によっ
て低分子化が起こらず、またプラスミン処理により酵素
活性を発現するチモグンの一種であるプラスミノーゲン
・アクヂベーター前駆体に関するものである。

［原料の調製］ 原料としては人腎細胞が用いられるが、この人腎細胞は
、例えば人胎児腎より得たＰｒｉｍａｒｙＣｕｌｔｕｒ
ｅ又はｄｉｐｉｏｉｄ　ｃｅｌｌｓを入手し、これを継
代培養し、本チモゲン産生細胞を分離したものが利用さ
れる。例えば細胞を２〜２０Ｘ　１０４ｃｅｌｌＳ／ｄ
の数で植え込み、３日間はど培養を続け、細胞数が植え
込み数の約３倍になった時点でトリプシン−［ＥＤ丁Ａ
混液を添加し、単層の幼若な細胞を回収して得たものが
使われる。

［培養条件コ 培地としては、例えばＷａｙｍｏｕｔｈの培地、Ｄｕ　
Ｉ　ｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　）ＩＥＨ培地
などが用いられ、前培養時には、前記該培地中に熱不活
化生胎児血清を５％添加し、本ヂモゲン産生時には無血
清培地、好ましくは、ヒト血清アルブミンを添加した無
血清培地を用いて培養する。無血清培地にはじトまたは
ウシアルブミン、ラフ１ヘアルブミン氷解物、トランス
フェリン、各種アミノ酸、各種脂ｎｔｒ酸、インシュリ
ン等のホルモンなどを添加してもよい。

培養培地は２〜３日程度ごとに、交換する。この培地中
に本発明のチモグンが産生されている。

［本チモグンの回収］ 培地からの本チモゲンの回収は、例えば、当該培地を遠
心分離、減圧濃縮、塩析分画、ゲル濾過、濃縮、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等を、適宜組み合わせることによって行なわれる
。

より具体的には、例えば次のごとき方法によって回収さ
れる。すなわち、まず培地を遠心分団１し、上清を回収
する。この回収液をイオン交換クロマ１〜グラフイーに
より部分精製する。担体としては、弱酸性陽イオン交換
体が最適であり、例えばＣＭ−交換体、おるいは０ＬＩ
Ｏ１ｉｔｅ等か例示される。担体をｐ）−１４，５〜６
．５、より好ましくはＦ）　Ｉ−１５〜６に調整した後
、回収液を展開して担体に吸着さＵる。上記の緩衝液で
洗浄した後に、ｐ目’７．５〜９．５、より好ましくは
ｐｉ−１８〜９の緩衝液で本チモゲンを溶出する。緩衝
液としては、リン酸緩衝液等が例示される。゛ざらに、
この溶出液をアフィニティークロマトグラフィーにより
高度精製する。

担体としては、ポリクロナール抗体カラム、モノクロナ
ール抗体カラムのどちらを用いてもよい。

ポリクロナール法の場合、杭木チモゲン抗体は、高度に
精製した本チモゲンを動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製水チモグンと７０インドの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の陵内に２〜３回注則し、最終
免疫の数日後採血を行ない室温で凝固ｕしめた後、４°
Ｃで一夜放置し、３．００ｏｒｐｍ、２０分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウナギ、Ａ７ギ、ウマ等
が挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、Ａｍ
、Ｃｈｃｍ、Ｓｏｃ、、６２，３３８６　（１９４０）
　、　Ｆｅｄ。

Ｐｒ０Ｃ，，１７，１１６１（１９５Ｂ）に記載の方法
にて行なわれる。

モノクロナール法の場合、細胞融合法にＪ：り折本チモ
グンを得る。細胞融合法は自体既知の手段にて行なわれ
、その−例は増殖性を持った細胞と目的とする抗体を産
生じているリンパ球とをポリエチレングリコールの存在
下で反応せしめることにより、増殖性と抗体産生能とを
同時に兼ねそなえた細胞を製するもので、この細胞の産
生する抗体は一個の抗原決定基に対してのみ反応する単
一の抗体である。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として本チモゲンで免疫された
マウス牌臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに目
的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングして
、本チモグンのモノクロナール抗体を得る。

また、このにうにして得られた抗水チモグン抗体を、そ
の活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の
不溶性マトリックスを応用Ｊることができる。アミノ酸
のコポリマー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ１１ｃｍ、、２３６．
１９７０　（１９６１））　、セルロース（Ｎａｔｕｒ
ｅ、　１８９、　５７Ｂ　（１９６１））　、アガロー
スあるいはごファデックス（ＮａｊＵｒｏ、　２１５．
１４９１　（１９６７）　、　Ｎａｔｕｒｅ、２４５．
３０５９　（１９７０））　、ポリアクリルアミド（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　、　８、４０７４　（１９６６）　）
。これらの方法により抗水チモグン抗体を効率良く固定
化しうる。また、このようにして得られた吸着剤を用い
ることにより、収率良く、しかも高純度の本ヂモゲンを
得ることができる。

本発明に係るヂモグンのアフィニティークロマ１〜グラ
フイーは以下の通りでおる。陽イオン交換体により部分
精製した本ヂモゲンを、ｐ　１−１６−８の緩衝液で平
衡化した抗水チモゲン抗体カラムと接触・吸着させる。

カラムを洗浄後、ｐＨ２−４の水溶液で溶出する。

なお、上記の回収法は本発明ヂモグン回収法の一例を示
したにすぎず、もちろん他の方法によって回収してもよ
い。かくして得られた本チモゲンは、化学用、薬学用、
医学用の試薬として用いてもよく、又医薬品として用い
る場合には、医薬品の製造の通例技術にしたがって、要
すれば加熱処理、除菌濾過、凍結乾燥、分注、製剤化を
行なえばよい。又、精製工程中または精製後、溶液中に
安定化剤として、アルブミンまたは非イオン性界面活性
剤、例えばトリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ８０等を添
加することが好ましい。かくしてＩＪｉ［な本ヂモゲン
を含有する医薬が提供される。

［本ヂモグンの特性］ ■分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｎａｔｕ
ｒｅ、　２２７．６８０−６８５　（１９７０）　）を
用いて、本発明からなる本チモグンの分子量を測定した
ところ、約５万ダルトンであった。なお分子量は分子量
既知の標準蛋白との比較によって決定し、また前処理と
して、３７°Ｃ１２時間または１００℃、２分間、１％
ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノールによる還元処理
を各々行なった。

■酵素感受性 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７．３２７６−３２８
３　（１９８０）に準じて、プラスミンに対する感受性
実験を行なった。その結果、本発明からなるチモゲンは
それ自身はプラスミノーゲンアクチベーター活性を示さ
なかった。

しかし、プラスミン処理をすることにより活性が発現し
、その活性発現の程度はプラスミン処理の濃度（表１）
、およびその処理時間（表２）に依存していた。活性測
定法は後記の通りである。

前者の実験は、本チモグン蛋白量として、１．３μｇ／
−を調製し、これに各濃度のプラスミンによって約６０
分間の前処理を行なった後に発現される酵素活性を測定
した。

後者の実験は、プラスミンを０．１μｇ／ｍｌｌ及び本
ヂモグン蛋白量として１．３μ９７ｍ１ｌを調製し、プ
ラスミンによる処理時間による効果を経時的に測定した
。

このことから、本発明からなるプラスミノーゲン・アク
チベーター前駆体はチモグンの一種であることが判明し
た。

又、本発明からなるチモゲンを、プラスミン処理した後
還元処理し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行ったところ、分子量約３万と、約２万の断片に分解
されていた。よって、このプラスミン処理後の生成物は
、従来の人尿由来ウロキナーゼと同一物と推定される。

以下余白 表１　プラスミン前処理にＪ：る プラスミノーゲンアクヂベーター活性（ｕＡ／）表２　
プラスミン前処理による プラスミノーゲンアクチベーター活性の経時変化■還元
剤処理 １％ＳＤＳ、１％２−メルカプトエタノール３７℃・２
時間、もしくは、１００’Ｃ・２分間の処理に対する本
発明からなるチモグンの抵抗性を分子量測定法に準じて
調べた。その結果、未処理水チモゲンと処理模本チモグ
ンは同じ電気泳動パターンを示し、この本チモグンが一
本鎖であることを確認した。

■活性測定法 合成基質法（クリーソンら　ｌｌａｅｍｏｓｔａｓ　ｉ
　ｓ．　、　７．　７６’　（１９７８）　）　、もし
くは平板法（アストラップらＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、便，３４６−３５１，（１９５２
）　）によって活性を測定できた。フィブリノーゲンは
Ｍｉｌｅｓ社のｂｏｖｉｎｅ，　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ
，　Ｆｒ．　Ｉ　（微量のプラスミンを含む）を使用し
た。

■アミノ酸組成および配列 本発明者らは、既に、ヒトウロキナーゼをコードしたｍ
ＲＮＡを本発明に用いたのと同じ人腎細胞から分離し、
そのｃＤＮＡの塩基配列を決定したく特願昭５９−３７
１１９＞。一方、本発明からなるヂモグンをＢｒＣＮ分
解し得られた８個の７ラグメントについてアプライドバ
イオシステムズ社のＧａｓ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　Ｍｏｄｅｌ　４７０Ａを使用
した自動Ｅｄｍａｎ分解法により、そのアミノ酸配列の
一部（１０９個のアミノＭ）について分析を行った。そ
の結果、ヒトウロキナーゼ前駆体を］−ドしたｃＤＮＡ
から予想されるアミノ酸配列と本分析結果と一致してい
ることが明らかになった。

さらに、４本発明からなるチモゲンを加水分解し、その
アミノ酸組成を調べた（表３）。アミノ酸組成について
も両者は一致した。

これらの知見から本発明からなるチモゲンは、ヒトウロ
キナーピ前駆体をコードしたｃＤＮＡから推定されたウ
ロキナーピ前駆体そのものに相当することが強く支持さ
れた。

以下余白 表３ ■その他の性状について 活性中心：ウロキノ−−１のセリン活性部位に結合する
ｐ−アミノベンズアミジンを固定したセファローズグル
に本発明からなるチモゲンを接触させたが、吸着しなか
った。このことから、本発明からなるチモゲンのレリン
活性部位は分子内部にはいっており、従来のウロキナー
ゼとは高次ｔＰｉ造か異なっているものと推定される。

二次構造二本発明からなるヂモグンを円偏光二色性によ
って、α−ヘリックス含量を調べたところ、従来の人尿
由来ウロキナーゼに比較して、α−ヘリックス含量が高
かった。このことから、本チモグンと、従来の人尿由来
ウロキナーゼとは、二次構）ｈが異なっている事が示さ
れた。

フィブリン親和１ｉ二本発明からなるチモゲン（酵素量
として５　Ｕ）をフィブリノーゲン２ｍｇ／ｄを含む反
応混合物（例えば血漿など）に添加した。この検体をト
ロンビンにより凝固さぜた後、３７°Ｃで１５分間イン
キュベーションした。凝塊と上清を遠心分離し、上清中
のプラスミノーゲン活性を測定した。この値を非結合量
とし、全体量から引いた値をフィブリンへの結合量とし
て坑１出したく表４）。

本発明からなるヂモグンはフィブリンへの親和性か強く
、組織プラスミノーゲン・アクヂベーター類似の性質を
有する。このことは血栓溶解療法において重要な意味を
持つ。即ち、従来のウロキナーゼではプラスミンの失活
か早いために天吊投与、しなければならず、そのために
出血傾向などの重篤な副作用か惹起される。ところか、
本発明からなるチモゲンはフィブリンへの親和性が高い
ために同相（フィブリン）上に限定した線溶現象を惹起
させることかでき、血栓溶解療法にとって理想的な医薬
を提供するものである。

表４ フィブリノーゲンへの影響：従来の人尿由来ウロキナー
ゼは、血栓部位のフィブリン以外に、血漿中のフィブリ
ノーゲン、凝固因子（第Ｖ因子、第■因子、第Ｘ■因子
〉をも分解し、出血傾向増大の副作用が問題となる。そ
こで、本発明からなるヂモゲンによる血漿中のフィブリ
ノーゲン分解を調べた。

１２５■でラベルしたフィブリノーゲンを人血漿中に前
もって添加しておき、本発明からなるチモグン（５００
Ｕ／ｄ）または、従来の人尿由来ウロキナーゼ（１，５
００１Ｕ／ｍ＞を加え、３７°Ｃ下、２分、１０分、６
０分、１２０分、１８０分後にザンブリングし、５Ｉ）
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオー１〜ラジオ
グラフイーにＪ：す１２５■−フィブリノーゲンの分解
の程度を経時的に測定した。

分子量３３０，０００のフィブリノーゲンは、プラスミ
ンにより、分子量２４０，０００．　１５５，０００．
８５，０００゜５０．０００の断片、およびその他の小
さな断片に分解されるか、本発明からなるヂモゲンは、
血漿中に１８０分間存在してもフィブリノーゲンをほと
んど分解しなかった。一方、従来の人尿由来ウロキナー
ゼを作用させた場合、１０分間でかなり多くのフィブリ
ノーゲンが分解され、さらに分解は進んでいった。

すなわち、本発明からなるチモゲンは、フィブリンへの
親和性か高く、フィブリン溶解能が高いが、血漿中のフ
ィブリノーゲンを分解しないことにす、血栓部位のフィ
ブリンのみを分解し、ウロキナーゼ大量投与の際に問題
となる副作用である血中フィブリノーゲン減少に伴う出
血傾向の増大を引き起こし難いと言える。

血栓溶解能：ヒト血漿から作成したフィブリン血栓に対
する溶解能を調べた。１′■でラベルしたフィブリン血
栓を、本発明からなるチモグンまたは、従来の人尿由来
ウロキナーゼ含有血漿中で３７°Ｃ１３時間放置し、溶
解したフィブリンの放射活性を測定した。その結果を、
表５に示づ。この結果より本発明からなるチモゲンの血
栓溶解能は、従来の人尿由来ウロキナーゼのそれにす、
約３倍優れていることか判明した。

表５ 血漿中での安定性：血漿中での本発明からなるチモゲン
の分子量、及び−水銀の構造を調べるこ２５ とにＪ：す、安定性を検問した。　■でラベルした本発
明からなるヂモゲン（５００Ｕ／ｍ）を３７°Ｃの人血
漿中で放置し、１　［１ｒｊ間、２時間、３時間後にリ
ーンプリングし、それを２分した。一方は、１％ＳＤＳ
で変性し、使方は、１％ＳＤＳ及び１％２−メルカプト
エタノールで還元処理した。

これらの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
オートラジオグラフィーを行った結果、３時間後におい
ても、非還元および還元処理ともに０時間と同じ泳動パ
ターンを示し、分子量約５万の１本の帯を示した。よっ
て、本発明からなるヂモゲンの分子量及び−水銀の構造
は、血漿中では安定と言える。

前記合成基質法により、本発明からなるチモゲンの血漿
中でのウロキナーゼ活性を測定したか、活性は発現しな
かった。

以上のことより、本発明からなるチモゲンは、酵素前駆
体として血漿中で安定であると言える。

抗ウロキナーゼ抗体および抗ヒトメラノーマ由来丁ＰＡ
抗体による酵素活性の中和：本発明からなるチモゲンの
活性をプラスミンにより発現さ−Ｕた。さらに、抗つロ
キナーゼ抗体、もしくは抗ヒトメラノーマ由来ＴＰＡ抗
体を添加し、３７°Ｃ１９０分間放置後、残存酵素活性
を前記合成基質法、もしくは平板法で測定したところ、
プラスミン処理によって発現する本発明からなるチモグ
ンの酵素活性は、抗ウロキナーゼ抗体によって阻害され
たか、抗ＴＰΔ抗体によっては阻害されなかった。

以上のことより、本発明からなるチモグン【、ｌｌ、ウ
ロキナーゼの前駆物質であり、フィブリン親和性におい
て、ＴＩ）Δと類似の性質を示づ−が、丁ＰＡや、その
前駆物質とは異なる物質である。

血栓溶解の機序：以上の本発明からなるヂモゲンの性質
から、この酵素は従来の人尿由来ウロキナーゼとは血栓
溶解機構か異なっているものと思われる。

人尿由来ウロキナーゼは血漿中および血栓上のプラスミ
ノーゲンに直接的に作用し、生成されるプラスミンがフ
ィブリノーグンヤフィプリンを分解する。

一方、本発明からなるヂモグンは血漿中ではプラスミノ
ーゲン・アクヂベーター活性を示さず、フィブリンとの
親和性が高い故、血栓部位に到達しやすく、フィブリン
に結合し、血栓中に含まれる微量のプラスミンにより血
栓上でウロキナーゼ活性を発現すると思われる。そして
、フィブリン分子に結合しているプラスミノーゲンをプ
ラスミンに変換し、フィブリンを分解すると思われる。

この様に本発明からなるチモゲンを使用した場合、フィ
ブリン（血栓）という同相上のみに限定しだ線溶現象を
期待する事かでき、新しいタイプの線維素溶解剤として
大いに期待できる。

〈実施例〉 培養人腎細胞を０．１％ヒト血清アルブミン添加無血清
培養液に３日間培養し、培養液を遠心分離し、その上清
を凍結して保存した。プールしたＪ８養上清をｐＨ５，
５に調整した後、ＣＭ　−Ｓ　ｃＤｈａｄｃｘＣ−５０
に接触した。０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ−４５，５
）でカラムを洗浄した後、０．１６Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８，５＞で吸着していた本チ七グンを溶出させた。

一方、本チモゲンで予め免疫しておいたマウスＢＡＬＢ
／ｃの稗臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレン
グリコールにより融合させたハイブリドーマのうち、本
チモゲンに対する抗体産生　〜の高いクローンを選択し
た。この融合細胞の培養液から、抗水チモゲンモノクロ
ーナル抗体を回収した。このモノクローナル抗体をＣＮ
Ｂｒ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　（ＰＩｌａｒｍ
ａｃｉａ社）に固定した。

このモノクローナル抗体カラムを０ＪＩＮａＣ１含有０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ−（７，０＞で平衡化し、こ
れに前記の本チモゲンを含有する溶出液を接触した。０
．４ＨＮ　ａ　ＣＩ含有０．ＩＮリン酸緩衝液（１）Ｉ
−１７，０）でカラムを洗浄した後、吸着していた本ヂ
モゲンを０．５ＨＮａＣ１含有０．２Ｍグリシン−１−
１０Ｉ水溶液（［）Ｉ−１２，５＞で溶出させた。

溶出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し比活性が少なくと
も８０．０ＯＯＵ　／ｍびの高度精製水ヂモゲンを得た
。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量５万の１本の帯を示した。

特許出願人　株式会社　ミドリ十字 代　理　人　弁理士　圧用　隆

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 人腎細胞の培養培地より回収しうる蛋白質であり、５Ｄ
   Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した分
   子量が約５万ダルトンであり、還元剤処理によって低分
   子化が起こらず、またプラスミン処理により酵素活性を
   発現するヂモゲンの一種である線維素溶解酵素。