JPH01258700A

JPH01258700A - 血液凝固第４因子の精製方法

Info

Publication number: JPH01258700A
Application number: JP8445888A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Takechi; 武智　和男; Toshiharu Motokubota; 本窪田　利晴; Yoshiro Iga; 伊賀　善郎
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1988-04-05
Filing date: 1988-04-05
Publication date: 1989-10-16

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は純度の高い血液凝固第Ｘ因子（以下、第Ｘ因子
ともいう）の製造法に関する。

より詳細には、血液凝固第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗
血液凝固第Ｘ因子抗体により処理することによる血液凝
固第Ｘ因子の精製方法における改良に関する。

〔従来技術〕

第Ｘ因子は、通常単独で使用されることはなく、たとえ
ばヒト血液凝固因子因子、第■因子、および第Ｘ因子等
を含んだ、所謂第Ｘ因子複合体として使用される。

血液凝固は約２０種の促進因子および抑制因子の関連す
るＣａ５ｃａｄｅから成り、これらの血液凝固因子の減
少、増大は血液凝固障害を起こし、種々の疾患をもたら
す、それらの疾患のうち、第■因子の欠乏に基づ（もの
を血友病Ａ、第Ｘ因子の欠乏に基づくものを血友病Ｂと
言う。

この第Ｘ因子は、臨床的にはｉ）血友病Ｂ患者に対する第Ｘ因子の補充、ｉｉ）血友
病Ａ患者（第■因子抗体保有者）に対するバイパス療法
、１ｉｉ）凝固因子生合成不全症（薬物投与による）に対
する凝固因子補充療法などに用いられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は第Ｘ因子含有水溶液中に含まれる夾雑物
質を分離除去し、純度の高い安全な第Ｘ因子製剤を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段］上記目的を達成するために本発明者らは種々研究を重ね
て来た結果、第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗血液凝固第
Ｘ因子抗体によって精製処理する際に、溶出液としてチ
オシアン酸カリウムおよびグアニジンから選ばれる少な
くとも一種を含有する水溶液を使用することによって効
率よく、かつ純度高く第Ｘ因子が得られることを見出し
、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は第Ｘ因子含有水溶液を固定化抗血液凝固
第Ｘ因子抗体により処理することによる第Ｘ因子の精製
方法において、溶出液が、チオシアン酸カリウムおよび
グアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有する水？
８ａであることを特徴とする精製方法である。

（ａ）本発明による処理対象物本発明の方法の処理対象物は、第■因子含有水ン容液で
ある。

第Ｘ因子はヒト血漿由来のものであれば特に限定されな
い。ここに第Ｘ因子含有水溶液とは、活性成分として第
Ｘ因子のみを含有するものの他、たとえば血液分画技術
等によって得られる所の第Ｘ因子および他の成分を含む
、所謂第Ｘ因子複合体含有溶液であってもよい。

第Ｘ因子複合体は、第Ｘ因子を主成分とし、さらに他の
成分、たとえば他の血液凝固に関与する成分を含むもの
をいい、たとえばヒト血液凝固第■因子、第■因子およ
び／または第Ｘ因子をも含んでおり、生物学的製剤基準
で規定される規格に適合したものがあげられる。その組
成比は、たとえば１バイアル（２０ｍ）当たりに換算す
ると、第Ｘ因子、第■因子、第■因子、第Ｘ因子を、各
々４００〜５００単位、１００〜５００単位、５〜１５
０単位、１００〜５００単位の値で含むものである。

第Ｘ因子含有水溶液としては、血漿、血漿分画、血漿濃
縮物などが例示される。

（ｂ）固定化抗体による処理第Ｘ因子は抗第■因子抗体よりなる吸着剤、具体的には
固定化抗第■因子抗体を用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより高度精製する。

担体としては、ポリクローナル抗体カラム、モノクロー
ナル抗体カラムのどちらを用いてもよい。

ポリクローナル抗体に関して、抗第■因子抗体は、高度
に精製した第Ｘ因子を動物に免疫し、得られた血清から
回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行なえばよく、例え
ば高度精製第Ｘ因子とフロイントの完全アジュバントの
混合乳液を作り、動物の皮肉に２〜３回注射し、最終免
疫の数日後採血を行ない室温で凝固せしめた後、４°Ｃ
で一夜放置し、３．００Ｏｒｐｍ　、２０分間の遠心分
離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、例えば、Ｊ、　Ａｍ
、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、、　ＪＬ２．３３８６　（１
９４０）。

Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、、　Ｌｌ、　１１６１　（１９５
Ｂ）に記載の方法にて行なわれる。

モノクローナル抗体に関して、抗第■囚子抗体は細胞融
合法によって得られる。細胞融合法は自体既知の手段に
て行なわれ、その−例は増殖性を持った細胞と目的とす
る抗体を産生しているリンパ球とをポリエチレングリコ
ールの存在下で反応せしめることにより、増殖性と抗体
産生能とを同時に兼ねそなえた細胞を製し、この細胞に
抗体を産生せしめるものであり、当該抗体は一個の抗原
決定基に対してのみ反応する単一の抗体である。

より具体的には増殖性を持つ細胞としてマウスミエロー
マ細胞を、抗体産生リンパ球として第Ｘ因子で免疫され
たマウス肺臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに
目的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングし
て、当該細胞から第Ｘ因子のモノクローナル抗体を得る
。

また、このようにして得られた抗第■因子抗体を、その
活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の不
溶性マトリックスを応用する方法をあげることができる
。かかる方法としては、例えばアミノ酸のコポリマーを
使用する方法（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２３６　１９７０　（１９６
１））　、セルロースを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
　　１８９．５７６　（１９６１））　、アガロースあ
るいはセファデックスを使用する方法（Ｎａｔｕｒｅ、
２ｉｉＬ１４９１　（１９６７）、　Ｎａｔｕｒｅ、　
２４５．３０５９（１９７０））　、ポリアクリルアミ
ドを使用する方法（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、、　８．４０
７４　（１９６６））などがあげられる。

これらの方法により抗第■因子抗体を効率良く固定化し
うる。また、このようにして得られた吸着剤を用いるこ
とにより、収率良く、しかも高純度の第Ｘ因子を得るこ
とができる。

本発明に関して、固定化抗血液凝固第■因子抗体による
処理は、例えば以下の通りにして行われる。まず、適度
に精製した第■因子含有水溶液を適当な溶媒〔例えば、
０．０１〜０．１　Ｍ　）リス緩衝１（ｐＨ６〜８）〕
で平衡化した固定化抗第■因子抗体にアプライする。同
じ溶媒で洗浄後、溶出液で溶出させた第■因子画分を回
収する。

本発明において溶出液としては、チオシアン酸カリウム
およびグアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有す
る水溶液（通常、緩衝液溶液）が使用され、この点が本
発明の特徴点である。

本発明において使用されるチオシアン酸カリウムおよび
グアニジンの濃度は１〜５Ｍ、好ましくは２〜４Ｍであ
る。当該水溶液のｐｉ（は通常６〜８、好ましくは７程
度である。当該溶出液としては、具体的には１〜５Ｍチ
オシアン酸カリウム含有０．０１〜０．１　Ｍ　）リス
緩衝液（ｐＨ６〜８）、１〜５Ｍグアニジン−塩酸含有
０．０１〜０．１　Ｍ　）リス緩衝液（ｐＨ６〜８）な
どが示される。

本発明の方法においては、さらに塩を除去するために、
所望によりたとえば透析を行う。

（ｄ）製剤化上記処理に続いて、第Ｘ因子を主成分とする医薬品製造
における常套手段に従って処理を行って、極めて安全性
の高い第■因子製剤を提供することができる。

〔作用・効果〕

本発明の処理による第Ｘ因子ないしは第■因子複合体の
回収率は極めて高く、生物学的製剤基阜が規定する規格
にも十二分に適合できるものであ従って、本発明は純度
の高い第■因子製剤を製造する上で、橿めて有効な方法
である。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例および実験
例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定される
ものではない。

なお、第Ｘ因子の力価は一段階による凝固測定法（Ｎｅ
ｗ　Ｅｎｇｌ、　Ｍｅｄ、、　Ｌ１２５〜１３０　（１
９６２））によった。

実験例１（溶出液の種類）各種溶出液を用いた場合の、第Ｘ因子の回収率と比活性
を検討した（第１表）。

〔双下奈白〕

第１表実験例２（′ａ度）溶出液としてグアニジン−塩酸含有０．０５　Ｍ　トリ
ス緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて、各濃度における回収
率と比活性を検討した（第２表）。

第２表実施例（１）　　固定化抗体の調製抗第■因子モノクローナル抗体をＣＮＢｒ法により活性
化したセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合さ
せた。

調製した抗第■因子モノクローナル抗体−セファロース
４　Ｂ　（ＩｇＧ：　８．６　ｍｇ／　ｍｌ　ｏｆゲル
）は、ゲルｌ　ｍｌ当たり第Ｘ因子を１５０　Ｕ　（１
７Ｕ／ｍｇ　ｏｆＩｇＧ）を結合しているものである。

（２）処理方法瓢　　上記で得た固定化抗体１ｄを０．０５　Ｍ　）リ
ス緩衝ｎ、　（ｐＨ７，０）で平衡化した。

このカラムに第■因子含有溶液（ｐｒｏｆｉｌｎｉｎｅ
”比活性２．５１Ｊ／Ａｓｓ。）をアプライし、上記の
溶媒で洗浄した。

その後、４Ｍグアニジン−塩酸含有０．０５　Ｍ　）リ
ス緩衝液（ｐＨ１，０＞により溶出した。

（ａ）　　精製した第Ｘ因子は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法に
より分析したところ、非還元条件下で分子置駒６５００
０の単一ピークを示した。

（ｂ）　　精製した第Ｘ因子を用いてフィブリノゲン凝
固時間を測定したところ、３．８時間（第Ｘ因子２５Ｕ
／ｄ）であった。

（Ｃ）　　結合した第Ｘ因子は４Ｍ−塩酸グアニジンに
よりその約８０％が回収された。。

（ｄ）　　溶出された第Ｘ因子の比活性は約９０　丁Ｉ
ｔ　Ａ！１１６で、その純度は９５％以上（ＳＯ５−Ｐ
ＡＧＥ）でありｔまた、このものは生物学的製剤基準活
性凝固否η試験にも適合した。

特許出願人　株式会社　ミドリ＋１

Claims

【特許請求の範囲】

血液凝固第IX因子含有水溶液を固定化抗血液凝固第IX因
子抗体により処理することによる血液凝固第IX因子の精
製方法において、溶出液がチオシアン酸カリウムおよび
グアニジンから選ばれる少なくとも一種を含有する水溶
液であることを特徴とする精製方法。