JPH01256399A

JPH01256399A - α−アミラーゼ活性測定方法

Info

Publication number: JPH01256399A
Application number: JP8432488A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ito; 啓伊藤; Yoshisuke Ogawa; 小川　善資; Nobuhiro Oda; 信博織田; Shigeru Sato; 茂佐藤
Original assignee: Kurita Water Industries Ltd
Current assignee: Kurita Water Industries Ltd
Priority date: 1988-04-06
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1989-10-12
Anticipated expiration: 2009-11-09
Also published as: JPH0687796B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はα−アミラーゼ活性測定方法に係り、特に、α
−アミラーゼ活性を高感度でかつ高精度に測定すること
ができる方法に関する。

［従来の技術］急性すい炎、耳下腺炎等の診断のために、血清や尿中の
α−アミラーゼ活性を測定する手法がある。

α−アミラーゼ活性測定用基質として、従来はでんぷん
が用いられてきたが、精度の点で難点があった。このた
め、でんぷんに代って、近年、マルトペンタオース（Ｇ
５）に代表されるマルトオリゴ環がアミラーゼ活性測定
用基質として採用されつつある。即ち、α−アミラーゼ
の共役酵素として、α−グルコシダーゼを用いると、次
の方法によってα−アミラーゼの活性を測定することが
できる。

マルトース（Ｇ２）＋マルトトリオース（Ｇ３）ここで
生成したグルコース（Ｇ１）は、例えばグルコースオキ
シダーゼ／パーオキシダーゼ／色素系又はヘキソキナー
ゼ／ホスホグルコムターゼ／グルコース−６−ホスフェ
ートデヒドロゲナーゼ／ＮＡＤＨ系等により定量され、
α−アミラーゼ活性が測定される。

また、最近になって、還元末端のグルコースにアブリボ
ンとしてバラニトロフェノール等のフェノール系化合物
を導入し、アブリボンを遊離させてそのスペクトル吸収
を測定することにより、α−アミラーゼ活性を測定する
方法も提案されている（特公昭５７−５３０７９）。

［発明が解決しようとする課題］しかしながら、前述のマルトオリゴ環をアミラーゼ活性
測定基質として用いる場合には、試料である血清や尿中
に内因性のグルコースやマルトースが存在するため、そ
の影響を受け、測定誤差が生じることになる。このため
、マルトオリゴ環を基質として用いる場合には、試料中
のグルコース等を予めヘキソナーゼ等を用いて処理する
必要があった。

一方、特公昭５７−５３０７９の方法において、アブリ
ボンとしてフェノール系化合物を用いた場合には、遊離
した発色基は試料中に共存する種々の物質によって作用
を受け、吸光度が変動しやすくなり、その結果、測定精
度が劣る場合があった。

このように、従来のα−アミラーゼ活性測定方法は、い
ずれも操作性や測定精度等に問題を有するものであフた
。

本発明者らは、これら従来技術の問題点を解決するべく
、鋭意研究を行なった結果、内因性のグルコースやマル
トースの影響を受けず、かつ、精度の高い吸光度の測定
が可能なα−アミラーゼ活性測定用基質及びそれを用い
たα−アミラーゼ活性測定方法を見出し、先に特許出願
を行なった（特願昭６１−２７７７０２゜以下「先願」
という。）。

先願の発明は、下記一般式（ＩＶ　）で表わされるマル
トオリゴ環と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触さ
せ、遊離するＲ−糖類又はその誘導体を測定することに
より、試料中のα−アミラーゼ活性を測定することを特
徴とする。

Ａ−Ｇｎ−Ｂ　　・−−−−−（ＩＶ）（式中、Ｂはグ
ルコース以外の単糖類又はその誘導体を表わし、Ａ、Ｇ
、ｎは後掲の一般式（Ｉ）のものと同一のものを表わす
。）即ち、先願の方法は、具体的には上記一般式（ＩＶ　）
のマルトオリゴ環から、試料中のα−アミラーゼ、グル
コシダーゼの作用により遊離するフルクトース等をマン
ニトールデヒドロゲナーゼやソルビトールデヒドロゲナ
ーゼとＮＡＤＨ共存下で反応させてＮＡＤの生成量を見
るものである。

このような先願の方法によりα−アミラーゼ活性を安定
にかつ精度良く測定することが可能となるが、先願の方
法は退色反応を利用するものであり、発色反応によるも
のに比べると感度や精度が若干劣るという難点があった
。

本発明は上記先願の問題点を解決し、発色反応により、
容易に、高精度、高感度でかつ安定に、α−アミラーゼ
活性を測定することができる方法を）是供することを目
的とする。

［課題を解決するための手段］本発明のα−アミラーゼ活性測定方法は、下記一般式（
Ｉ）で表わされるマルトオリゴ環を含む基質と試料とを
グルコシダーゼの共存下に接触させ、遊離するフルクト
ースを更にフルクトースデヒドロゲナーゼと接触させる
ことにより、試料中のα−アミラーゼ活性を測定するこ
とを特徴とする特Ａ−Ｇｎ　−Ｆ　　　　　　　・・・・・・　（Ｉ）（
式中Ａは、Ｈ又はＨを、Ｆはフルクトースを、Ｇはグルコースを、ｎは３〜
１５の整数をそれぞれ表わす。

ただし、（ＩＩ　）式又は（Ｈｌ　）式において、Ｒ１
−Ｒ４は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ２）、Ｃ
００Ｍ　（ｙは０．１又は２、Ｍは水素原子又はアルカ
リ金属を表わすゆ）を、Ｘ１〜Ｘ４は酸素原子又はイオ
ウ原子をそれぞれ表わす。）以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のα−アミラーゼ活性測定方法で、測定用基質と
して用いる前記−数式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ
環の、非還元末端であるＡは、未置換グルコースでも良
いし、グルコースの４位及び／又は６位を置換したもの
でも良い（即ち、前記−数式（ＩＩ））。更にグルコー
スの４位と６位が一緒になってアルキレン橋を形成して
いるものでも良い（即ち、前記−数式（ＩＩＩ））。

このように、−数式（１）において、Ａは無修飾（未置
換）及び修飾（置換）されたグルコースを含むものであ
る。Ａが無修飾のグルコースの場合でも、本発明の基質
は従来の基質に比べて、はるかに精度よくα−アミラー
ゼ活性を測定し得るものであるが、下記の理由により修
飾グルコースであることが好ましい。

即ち、マルトオリゴ環からなる基質において、非還元末
端がグルコースそのものであると、α−アミラーゼ活性
測定時に使用する共役酵素であるグルコシダーゼが一部
の非還元末端のグルコースを切断し、α−アミラーゼ活
性測定に誤差を与えてしまう場合があるのである。

修飾された非還元末端としては、前記−数式（ＩＩ）又
は（Ｉｌｌ　）において、下記第１表（ａ）、（ｂ）に
示すような置換基を導入したものが例示される。

第　　１　　表（ａ）　　−数式（ＩＩ）（ｂ）　　−数式（ＩＩＩ　）一般式（Ｉ）において、還元末端となるＦはフルクトー
スである。フルクトースは入手が容易である上に、反応
性等にも優れ、本発明に有効である。

また、−数式（１）において、Ａ−Ｇｎは、具体的には
マルトペンタオース（Ｇ、）、マルトオクタツース（Ｇ
ａ）、マルトデカオース（Ｇｏｏ）、マルトヘキサデカ
オース（ａ　＋ａ）等が挙げられる。これらのうち、０
５〜Ｇ８は水溶性に優れるうえに２種のアイソエンザイ
ムの作用を均等に受ける可能性が高いため、基質として
好ましい。

本発明のα−アミラーゼ活性測定用基質としては、−数
式（１）で表わされる化合物が、次の構造式（Ｖ）で表
わされる化合物であることが最も好ましい。

・・・（Ｖ）以下において、上記構造式（Ｖ）の化合物を、ＩＰ０７
Ｆと略すことがある。

このような−数式（Ｉ）で示されるマルトオリゴ環を用
いて、本発明の方法により試料中のα−アミラーゼ活性
を測定する方法について以下に説明する。

体液中の試料に、基質及び共役酵素としてα−グルコシ
ダーゼを加えると、下記のように反応が進む（なお、以
下においては一般式（Ｉ）の具体例として一般式（Ｖ）
で示されるＩＰＧ？Ｆを用いる）。

ここで遊離したフルクトースを、例えば下記■又は■の
方法により定量する。

■　遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロゲナ
ーゼ（ＦＤＨ）、フェナジンメトサルファイド（ＰＭＳ
）及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＴＢ）共存下で
反応させることにより、ホルマザンを生成させ、その吸
光度の変化により、フルクトースの量が測定できる。

ホルマザン　　　　ＮＴＢ（なお、ＮＴＢの他、ＭＴＴ　（３−（４，５−ジメチ
ル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テ
トラゾリウムプロミド）又はＩＮＴ（３−（ｐ−ロドフ
ェニル）−２−（ｐ−ニトロフェニル）−５−フェニル
−２Ｈ−テトラゾリウムクロライド）を用いることもで
きる。）■　遊離したフルクトースをフルクトースデヒ
ドロゲナーゼ（Ｆ　Ｄ　Ｈ）　、フェナジンメトサルフ
ァイド（ＰＭＳ）又はジアフォラーゼと４−アミノ−ア
ンチピリン（４−ＡＡ）及びＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシ−３−スルホプロピル）−トルイジン（ＥＨＳ
ＰＴ）、更にパーオキシダーゼの共存下で反応させるこ
とにより、キノン系色素の変化により、フルクトースの
量が測定できる。

５　Ｋｅｔｏ　−Ｄ　−Ｆｒｕｃｔｏｓｅ＋　Ｐ　Ｍ　
Ｓ　Ｈ２Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｈ２＋　２０２　　　Ｐ　Ｍ　Ｓ
　＋　Ｈ２０□＋０２パーオキシダーゼ２　Ｈ２０２＋　４−　Ａ　Ａ　＋　Ｅ　ＨＳ　Ｐ　Ｔ
　　　　　　ンキノン系色素（λｗａｘ　＝　５５０１
　ｍ）［作　用］ −・数式（Ｉ）で表わされるマルトオリゴ環は、試料中
のα−アミラーゼ及び共役酵素のα−グルコシダーゼと
グルコアミラーゼにより切断されてフルクトースを生じ
る。このフルクトースをフルクトースデヒドロゲナーゼ
で定量することにより、試料中のα−アミラーゼ活性を
発色反応により高感度かつ高精度に測定できる。

しかして、上記■の方法によれば、 ■　発色物であるホルマザンが水に対する溶解性が低い
ためシャープな染料が可能になる。

■　感度が高いため、少ない時間でしかもシャープな像
を作らせることができる。

また、上記■の方法によれば、 ■　特殊な装置を必要としない。

■　高感度に測定が可能なため、使用する検体の量を大
幅に減じることができる。

■　先願の方法に比べ、測定条件の多少のズレがあった
としても測定値にあまり大きな誤差を与えない。

等の効果が奏される。

［実施例］以下、製造例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。

製造例１土ＰＧｙヱｏｇ遺市販のＧ、２９．５ｇにピリジン１４０ｍ１と無水酢酸
１４０ｍｆを加え、室温で４８時間反応させることによ
り、パーアセテート化Ｇ。

５１．８ｇを得た。得られたパーアセテート化Ｇ、２５
．０ｇをクロロホルム１６５ｍ１に溶かし、１０℃以下
で３０％ＨＢｒ−酢酸と２時間反応させることにより、
パーアセテート化Ｇ７ブロマイド２４．５ｇを得た。こ
のパーアセテート化Ｇ７ブロマイドをベンゼン中、Ｈｇ
　（ＣＮ）２６．７ｇ、ベンジルアルコール３３ｍ１１
．と２時間還元反応させることにより、パーアセテート
化Ｇ、ベンジルグリコシドを得た。次いで、パーアセテ
ート化Ｇ？ベンジルグリコシドをメタノール中、ナトリ
ウムメトキシドで室温加水分解することにより、ベンジ
ルグリコシド化Ｇｙ１．９．９ｇを得た。

ベンジルグリコシド化Ｇ、１９．９ｇをＤ　ＭＦ中、ベ
ンズアルデヒドジメチルアセタール１４．８ｇと、ｐ−
トルエンスルホン酸触媒下８５〜９０℃で４時間反応を
行なうことにより、非還元末端４．６−０−ベンジリデ
ン、ベンジルグリコシド化Ｇ７を得た。

非還元末端４．６−０−ベンジリデン、ベンジルグリコ
シド化Ｇ７を、ピリジン１００ｍＡ、無水酢酸１００ｍ
℃と室温で４８時間反応させ、非還元末端４．６−０−
ベンジリデン、ベンジルグリコシド化Ｇ７パーアセテー
ト２６．２ｇを得た。非還元末端４．６−０−ベンジリ
デン、ベンジルグリコシド化Ｇ７パーアセテート２６．
２ｇを、ジオキサン３フ０ｍｆｔ中で、ＫＯＨ１８０ｇ
とともに塩化ベンジル１８０ｎ＋ＪＺと１０５〜１１０
℃で６時間反応させることにより、非還元末端４．６−
０−ベンジリデンパーベンジル化Ｇ７を得た。更に、非
還元末端４．６−〇−ベンジリデンバーベンジル化Ｇ７
を、アセトン７５０ｍＩＬ、ＩＮ−ＨＣｊ２１８０ｍＪ
！中、温浴上で還流させ、ベンジリデンをはずすことに
より、非還元末端４．６−ＯＨパーベンジル化Ｇｙ７．
６ｇを得た。

この非還元末端４．６−ＯＨバーベンジル化Ｇ７７．６
８にＢａ０２３．１８％Ｂａ　（ＯＨ）２・８Ｈ，０９
，４ｇとともにヨウ化メチル８４ｍ℃をＤＭＦ２４０ｍ
λ中で光遮断下、４８時間室温にて反応させ、非還元末
端４．６−０−メチルパーベンジル化Ｇｙを得、非還元
末端４．６−０−メチルパーベンジル化Ｇ７を、メタノ
ール／酢酸エチル中でＰｄによる室温、常圧接触還元を
行なうことにより、非還元末端４．６−ジー０−メチル
化Ｇｙ　１．２ｇを得た。

次に、この非還元末端４，６−ジー０−メチル化Ｇγを
１０％Ｗ　／　Ｖの溶液とし、これにしよ糖液４％Ｗ　
／　Ｖを等全混合し、バチルス・オーベンシス起源のサ
イクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを添加
し、３７℃、ｐＨ６，０の条件下で１６時間静置し、反
応させた。１６時間後、この反応液をカラムクロマトグ
ラフィー法で精製したところ、Ｉ　ＰＧｙ　Ｆｏ、１２
ｇが得られた。

実施例１ α−アミラーゼ活性測　例下記の各試薬を下記濃度となるように、５０ｍＭ−ＰＩ
ＰＥＳバッフｙ−（ｐＨ７，０）に溶解し、試薬工を調
製した。

試薬Ｉ製造例１で得られた基買（Ｉ　ＰＧアＦ）１．０３ｍＭ
／ｆｌＮａＣ１１，０３ｍＭ／ｆＬＣａＣ４２２０，１ｍＭ／ｆＬグルコアミラーゼ　：　　　２５．７５Ｕ／ｍｕα−グ
ルコシダーゼ：　　１６４．８　　Ｕ／ｍＪｌ別に、下
記の各試薬を下記濃度となるように２００ｍＭ−Ｍａｃ
Ｉ　１ｖａｉｎｅバツフアー（ｐＨ４，５）にて溶解し
、試薬ＩＩを調製した。

試薬■！フルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）ニア５　　　
　Ｕ／ｒｎＪｌフェナジンメトサルファイド（ＰＭＳ）：　　０．３　
　ｍＭ／Ｊ２ニトロプルテトラゾリウム（ＮＴＢ）：　　０．７５ｍＭ／ＩＬ試薬Ｉ：９７０μβに、α−アミラーゼ活性が１００，
２００，３００及び４００ｍＵ／ｍｆＬをそれぞれ含む
検体血清３０μ℃を加え、３７℃で１０分間正確に加温
した。次に、試薬Ｉ■＝２０００μｌを加え、３７℃で
５分間正確に加温後、６６０ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、第１図に示す通り、いずれの濃度でも良好な
直線関係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。

実施例２ α−アミラーゼ活性測定例下記の各試薬を下記濃度となるように１００ｍＭ−Ｍａ
ｃ　Ｉ　１　ａｖａ　ｉ　ｎｅバッフｙ−（ｐＨ４，５
）で溶解し、試薬Ｉ１１を調製した。

試薬Ｈｌフルクトースデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）：１００　　
　Ｕ／ｍｆＬ１−メトキシ−フェナジンメトサルファイト−０，４ｍ
Ｍ／ｆ１４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）：　　１０　　　ｍＭ／、Ｑ別に、下記試薬を下記濃度となるように、１．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）を含む２００ｍＭ−ＴＥ
Ｓバッフｙ−（ｐＨ７，５）にて溶解し、試薬■を調製
した。

パーオキシダーゼ　　　　　：６　　　Ｕ／ｍ１ｌＮ−
エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−トルイジン（ＥＭＳＰＴ）ニア、５ｍＭ／ｕ実施例１で調製した試薬Ｉ：９７０μｍに、α−アミラ
ーゼ活性が１００，２００．３００および４００　ｍ　
Ｕ　／　ｍ　ｆ！、をそれぞれ含む検体血清３０μｋを
加え、３７℃で１０分間正確に加温した。次に、試薬Ｉ
ＩＩ　：　１０００μｍを加え、３７℃で５分間正確に
加温した。更に、試薬■：１０００μｍを加えて３７℃
で５分間正確に加温後、５５０ｎｍで吸光度を測定した
。

その結果、第２図に示す通り、いずれの濃度でも良好な
直線間係が得られていることから、本発明の方法によれ
ば、α−アミラーゼ活性の安定かつ高精度な測定が可能
であることが認められる。

［発明の効果］以上詳述した通り、本発明のα−アミラーゼ測定方法に
おいては、測定用基質として、−数式（Ｉ）に示すマル
トオリゴ環を含むものを用いる。このマルトオリゴ環は
、試料中のα−アミラーゼ及び共役酵素のグルコシダー
ゼにより切断されてフルクトースを生じ、これにより定
量が可能となるが、その際、糖の還元末端にフルクトー
スを転位させであるので、試料中に含まれる内因性グル
コースやマルトース等の影響を受けることがない。この
ため、このような測定用基質を用いる本発明のα−アミ
ラーゼ活性測定方法によれば、α−アミラーゼ活性の安
定かつ高精度な測定を容易に行なうことが可能とされる
。

しかも、遊離したフルクトースをフルクトースデヒドロ
ゲナーゼと接触させることにより、発色反応にて、高感
度、高精度に、かつ効率的に測定を行なうことが可能と
される。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ実施例１及び実施例２で得
られた吸光度の測定結果を示すグラフである。代理人　　弁理士　　重　野　　剛 α−アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ　） α−アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記一般式（ I ）で表わされるマルトオリゴ糖
を含む基質と試料とをグルコシダーゼの共存下に接触さ
せ、遊離するフルクトースを更にフルクトースデヒドロ
ゲナーゼと接触させることにより、試料中のα−アミラ
ーゼ活性を測定することを特徴とするα−アミラーゼ活
性測定方法。Ａ−Ｇ＿ｎ−Ｆ……（ I ）（式中Ａは、 ▲数式、化学式、表等があります▼……（II）又は ▲数式、化学式、表等があります▼……（III）を、Ｆはフルクトースを、Ｇはグルコースを、ｎは３〜
１５の整数をそれぞれ表わす。ただし、（II）式又は（III）式において、Ｒ＿１〜Ｒ＿４は水素原子、低級アルキル基又は（ＣＨ
＿２）＿ｙＣＯＯＭ（ｙは０、１又は２、Ｍは水素原子
又はアルカリ金属を表わす。）、を、Ｘ＿１〜Ｘ＿４は
酸素原子又はイオウ原子をそれぞれ表わす。）