JP2002119298A - イヌリン測定方法 - Google Patents
イヌリン測定方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】イヌリンを簡便で正確に測定する方法を提供す
る。 【解決手段】イヌリンを酵素的に分解することにより生
成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼを用いて電子受容体を介して酸素との反応により生
成する過酸化水素を測定するイヌリン測定方法におい
て、電子受容体が１−メトキシ−５−メチルフェナジニ
ウムメチルスルフェートであり、かつ過酸化水素をペル
オキシダーゼの触媒作用により４−アミノアンチピリン
とアニリン系トリンダー試薬がカップリングして生成す
るキノン色素の増加を測定するイヌリン測定方法。
る。 【解決手段】イヌリンを酵素的に分解することにより生
成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼを用いて電子受容体を介して酸素との反応により生
成する過酸化水素を測定するイヌリン測定方法におい
て、電子受容体が１−メトキシ−５−メチルフェナジニ
ウムメチルスルフェートであり、かつ過酸化水素をペル
オキシダーゼの触媒作用により４−アミノアンチピリン
とアニリン系トリンダー試薬がカップリングして生成す
るキノン色素の増加を測定するイヌリン測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イヌリンを正確に
測定するための方法、ならびにそのための試薬に関す
る。
測定するための方法、ならびにそのための試薬に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】腎機能の一指標である糸球体濾過値（Ｇ
ＦＲ：glomerular filtration rate）は、一般にクレア
チニンなどの内因性物質、チオ硫酸ナトリウム、イヌリ
ン、放射性のＥＤＴＡやイオタラム酸などの外因性物質
を用いたクリアランス試験によって測定される。
ＦＲ：glomerular filtration rate）は、一般にクレア
チニンなどの内因性物質、チオ硫酸ナトリウム、イヌリ
ン、放射性のＥＤＴＡやイオタラム酸などの外因性物質
を用いたクリアランス試験によって測定される。
【０００３】クレアチニンクリアランスは、クレアチニ
ンが内因性物質であるため被験者への侵襲が少ないメリ
ットはあるが、測定の正確性に関して、尿細管からの分
泌があること、クレアチニン産生量が食事や運動などの
影響を受けること、等の問題点の指摘がある。また、チ
オ硫酸ナトリウムクリアランスは、チオ硫酸ナトリウム
が強く陰性に帯電している近位尿細管腔において水素イ
オンの多量分泌を促し、ＧＦＲに影響を与える可能性が
指摘されている。また、イオタラム酸をはじめとする放
射性物質を用いたクリアランスは、放射性物質の取り扱
いに資格を要すること、放射性負荷に対する配慮が必要
であることなどに問題点の指摘がある。これらに対し、
イヌリンは完全に糸球体により濾過されるのでクリアラ
ンス測定において理想的な物質とされている。
ンが内因性物質であるため被験者への侵襲が少ないメリ
ットはあるが、測定の正確性に関して、尿細管からの分
泌があること、クレアチニン産生量が食事や運動などの
影響を受けること、等の問題点の指摘がある。また、チ
オ硫酸ナトリウムクリアランスは、チオ硫酸ナトリウム
が強く陰性に帯電している近位尿細管腔において水素イ
オンの多量分泌を促し、ＧＦＲに影響を与える可能性が
指摘されている。また、イオタラム酸をはじめとする放
射性物質を用いたクリアランスは、放射性物質の取り扱
いに資格を要すること、放射性負荷に対する配慮が必要
であることなどに問題点の指摘がある。これらに対し、
イヌリンは完全に糸球体により濾過されるのでクリアラ
ンス測定において理想的な物質とされている。
【０００４】イヌリンクリアランスを測定する際には、
被験者の静脈にイヌリンを投与し、その前後で経時的に
単回または複数回採取した被験者の血漿および／または
尿についてイヌリン濃度を適当な方法で測定する。イヌ
リンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産
生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色さ
せる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑
で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースな
ど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘され
ている。特に反応が非特異であることは、クリアランス
に好適な物質としてのイヌリンの長所を損なう。中でも
糖尿病性腎症などグルコース濃度が高い被験者の場合に
は問題が大きい。
被験者の静脈にイヌリンを投与し、その前後で経時的に
単回または複数回採取した被験者の血漿および／または
尿についてイヌリン濃度を適当な方法で測定する。イヌ
リンの測定方法には、従来イヌリンを強酸で加熱して産
生するフルフラールをアンスロン等と反応させて発色さ
せる方法が多用されてきたが、強酸での加熱操作が煩雑
で危険性が高いことや、反応が非特異的でグルコースな
ど他の糖類の影響を受けることなどの問題点が指摘され
ている。特に反応が非特異であることは、クリアランス
に好適な物質としてのイヌリンの長所を損なう。中でも
糖尿病性腎症などグルコース濃度が高い被験者の場合に
は問題が大きい。
【０００５】そこで、イヌリンを簡便で正確に測定する
方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開
発されてきた。これらは、イヌリンを一般にイヌリナー
ゼと呼ばれる酵素等を用いて単糖に分解し、生じたフル
クトースを種々の方法で測定するものである。
方法として、下記に示すように酵素を利用する方法が開
発されてきた。これらは、イヌリンを一般にイヌリナー
ゼと呼ばれる酵素等を用いて単糖に分解し、生じたフル
クトースを種々の方法で測定するものである。
【０００６】例えば、特開昭６２−２０５７９９号公報
には、イヌリンが分解して出来た単糖であるフルクトー
スを、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている。た
だし、この方法は共役反応を触媒するヘキソキナーゼが
グルコースに対しても反応するため、グルコースを前も
って消去する必要がある。
には、イヌリンが分解して出来た単糖であるフルクトー
スを、ヘキソキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されている。た
だし、この方法は共役反応を触媒するヘキソキナーゼが
グルコースに対しても反応するため、グルコースを前も
って消去する必要がある。
【０００７】また、ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．第３９巻、第
１１号、第２３３３〜２３３７頁、および臨床化学 第
１０巻、第６４〜６９頁（１９８１）には、フルクトー
スをソルビトールデヒドロゲナーゼと共役反応させＮＡ
ＤＨの減少を測定する方法が開示されている。この方法
も、前者の文献によれば、グルコース３００ｍｇ／ｄＬ
を試料に上乗せした際に、ソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールの影響が全くなかったのに対し、グル
コースでは１．３ｍｇ／ｄＬ相当とごくわずかではある
が影響を受けることが報告されている。
１１号、第２３３３〜２３３７頁、および臨床化学 第
１０巻、第６４〜６９頁（１９８１）には、フルクトー
スをソルビトールデヒドロゲナーゼと共役反応させＮＡ
ＤＨの減少を測定する方法が開示されている。この方法
も、前者の文献によれば、グルコース３００ｍｇ／ｄＬ
を試料に上乗せした際に、ソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールの影響が全くなかったのに対し、グル
コースでは１．３ｍｇ／ｄＬ相当とごくわずかではある
が影響を受けることが報告されている。
【０００８】そこで、理論上グルコースの影響を受けな
い方法が種々開発された。例えば、臨床化学 第２３
巻、第１６４〜１６９頁（１９９４）には、フルクトー
スをフルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されているが、
この方法は感度が十分でなく、またフルクトキナーゼ、
ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの３種の酵素とアデノシン−３−リン酸
（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）の２種類の補酵素を必要とするので、
妨害物質の影響を受けやすい、高価である等といった欠
点が考えられる。
い方法が種々開発された。例えば、臨床化学 第２３
巻、第１６４〜１６９頁（１９９４）には、フルクトー
スをフルクトキナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと共役反応させ
ＮＡＤＰＨの上昇を測定する方法が開示されているが、
この方法は感度が十分でなく、またフルクトキナーゼ、
ホスホグルコイソメラーゼ、グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼの３種の酵素とアデノシン−３−リン酸
（ＡＴＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸（ＮＡＤＰ）の２種類の補酵素を必要とするので、
妨害物質の影響を受けやすい、高価である等といった欠
点が考えられる。
【０００９】また、特公昭５９−３５５９２号公報に
は、フルクトースを、酸素の存在下で、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼ、および電子受容体であるフェロシアン化カリウム
と反応させ、生成するフェリシアン化カリウムを硫酸第
二鉄、デュパノール試薬と反応させて生じるプルシアン
ブルーを測定する方法が開示されている。しかしなが
ら、この方法では、反応時間が長く操作も複雑なため、
汎用の自動分析機に適用させることが難しい等の欠点が
考えられる。
は、フルクトースを、酸素の存在下で、ＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナ
ーゼ、および電子受容体であるフェロシアン化カリウム
と反応させ、生成するフェリシアン化カリウムを硫酸第
二鉄、デュパノール試薬と反応させて生じるプルシアン
ブルーを測定する方法が開示されている。しかしなが
ら、この方法では、反応時間が長く操作も複雑なため、
汎用の自動分析機に適用させることが難しい等の欠点が
考えられる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記イヌリ
ン測定方法の問題点を解消し、イヌリンを正確に測定す
る方法、ならびにイヌリン測定用試薬を提供するもので
ある。
ン測定方法の問題点を解消し、イヌリンを正確に測定す
る方法、ならびにイヌリン測定用試薬を提供するもので
ある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討したところ、イヌリンを酵素
的に分解し生成したフルクトースを測定するに際し、Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルクトース
デヒドロゲナーゼを用い、電子受容体を介して酸素との
反応により生成する過酸化水素を測定するイヌリン測定
方法において、電子受容体として１−メトキシ−５−メ
チルフェナジニウムメチルスルフェート（略称：１−メ
トキシ−ＰＭＳ）を用い、かつ過酸化水素をペルオキシ
ダーゼの触媒作用により、４−アミノアンチピリンとア
ニリン系トリンダー試薬がカップリングして生成するキ
ノン色素の増加を測定することにより、イヌリンを感度
よく短時間で測定でき、さらに自動分析機への適応も容
易に出来ることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
を達成するために鋭意検討したところ、イヌリンを酵素
的に分解し生成したフルクトースを測定するに際し、Ｎ
ＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としないフルクトース
デヒドロゲナーゼを用い、電子受容体を介して酸素との
反応により生成する過酸化水素を測定するイヌリン測定
方法において、電子受容体として１−メトキシ−５−メ
チルフェナジニウムメチルスルフェート（略称：１−メ
トキシ−ＰＭＳ）を用い、かつ過酸化水素をペルオキシ
ダーゼの触媒作用により、４−アミノアンチピリンとア
ニリン系トリンダー試薬がカップリングして生成するキ
ノン色素の増加を測定することにより、イヌリンを感度
よく短時間で測定でき、さらに自動分析機への適応も容
易に出来ることを見出し、本発明を完成させるに至っ
た。
【００１２】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）イヌリンを酵素的に分解することにより生成した
フルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコチンアミ
ドアデニンヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンア
ミドアデニンヌクレオチドリン酸）を電子受容体としな
いフルクトースデヒドロゲナーゼを用いて電子受容体を
介して酸素との反応により生成する過酸化水素を測定す
るイヌリン測定方法において、電子受容体が１−メトキ
シ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（略
称：１−メトキシ−ＰＭＳ）であり、かつ過酸化水素を
ペルオキシダーゼの触媒作用により４−アミノアンチピ
リンとアニリン系トリンダー試薬がカップリングして生
成するキノン色素の増加を測定するイヌリン測定方法。 （２）第一ステップとしてイヌリンを酵素的に分解する
ことにより生成したフルクトースを酸素の存在下でフル
クトースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体と反応させ
て過酸化水素を生成させ、次いで第二ステップとして生
成した過酸化水素を定量する（１）に記載のイヌリン測
定方法。 （３）第二ステップにおいて過酸化水素の増加を測定す
る際に電子受容体の作用を抑える目的でドデシルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウムを作用させる（１）または
（２）に記載のイヌリン測定方法。 （４）アニリン系トリンダー試薬がＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチル
アニリン（略称：ＴＯＯＳ）である（１）〜（３）のい
ずれかに記載のイヌリン測定方法。 （５）緩衝液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナー
ゼ、１−メトキシ−ＰＭＳ、ペルオキシダーゼ、４−ア
ミノアンチピリン、アニリン系トリンダー試薬、及びド
デシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含むことを特徴
とするイヌリン測定用試薬。
なる。 （１）イヌリンを酵素的に分解することにより生成した
フルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコチンアミ
ドアデニンヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニコチンア
ミドアデニンヌクレオチドリン酸）を電子受容体としな
いフルクトースデヒドロゲナーゼを用いて電子受容体を
介して酸素との反応により生成する過酸化水素を測定す
るイヌリン測定方法において、電子受容体が１−メトキ
シ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェート（略
称：１−メトキシ−ＰＭＳ）であり、かつ過酸化水素を
ペルオキシダーゼの触媒作用により４−アミノアンチピ
リンとアニリン系トリンダー試薬がカップリングして生
成するキノン色素の増加を測定するイヌリン測定方法。 （２）第一ステップとしてイヌリンを酵素的に分解する
ことにより生成したフルクトースを酸素の存在下でフル
クトースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体と反応させ
て過酸化水素を生成させ、次いで第二ステップとして生
成した過酸化水素を定量する（１）に記載のイヌリン測
定方法。 （３）第二ステップにおいて過酸化水素の増加を測定す
る際に電子受容体の作用を抑える目的でドデシルベンゼ
ンスルホン酸ナトリウムを作用させる（１）または
（２）に記載のイヌリン測定方法。 （４）アニリン系トリンダー試薬がＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチル
アニリン（略称：ＴＯＯＳ）である（１）〜（３）のい
ずれかに記載のイヌリン測定方法。 （５）緩衝液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐを電子受容体としないフルクトースデヒドロゲナー
ゼ、１−メトキシ−ＰＭＳ、ペルオキシダーゼ、４−ア
ミノアンチピリン、アニリン系トリンダー試薬、及びド
デシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含むことを特徴
とするイヌリン測定用試薬。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する
が、本発明がこれら実施例により特に限定されるもので
ないことは言うまでもない。
が、本発明がこれら実施例により特に限定されるもので
ないことは言うまでもない。
【００１４】本発明に使用するイヌリン分解酵素は、イ
ヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限
定されない。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）
属、クリベロマイセス（Klyveromyces）属等の微生物等
から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８
０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）など
があり、市販品ではエキソイヌリナーゼとエンドイヌリ
ナーゼの混合物である「Fructozyme」（ノボ・ノルディ
スク社製）などが挙げられる。また、濃度についても特
に限定はなく、例えば反応時の濃度として好ましくは１
〜５００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程
度存在させるのがより好ましい。
ヌリンを単糖に分解する能力があるものであれば特に限
定されない。例えば、アスペルギルス（Aspergillus）
属、クリベロマイセス（Klyveromyces）属等の微生物等
から得られるエキソイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．８
０）、エンドイヌリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７）など
があり、市販品ではエキソイヌリナーゼとエンドイヌリ
ナーゼの混合物である「Fructozyme」（ノボ・ノルディ
スク社製）などが挙げられる。また、濃度についても特
に限定はなく、例えば反応時の濃度として好ましくは１
〜５００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程
度存在させるのがより好ましい。
【００１５】本発明に使用するフルクトースデヒドロゲ
ナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としない
ものであれば由来等は特に限定されない。例えばグルコ
ノバクター（Gluconobacter）属等の微生物から得るこ
とができ、市販品では東洋紡績株式会社製のＦＣＤ−３
０１などが挙げられる。また、濃度についても特に限定
はないが、例えば反応時の濃度として好ましくは１〜５
００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存
在させるのがより好ましい。
ナーゼは、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子受容体としない
ものであれば由来等は特に限定されない。例えばグルコ
ノバクター（Gluconobacter）属等の微生物から得るこ
とができ、市販品では東洋紡績株式会社製のＦＣＤ−３
０１などが挙げられる。また、濃度についても特に限定
はないが、例えば反応時の濃度として好ましくは１〜５
００単位／ｍＬ、さらには３〜１５０単位／ｍＬ程度存
在させるのがより好ましい。
【００１６】本発明で用いる電子受容体は、具体的には
１−ｍ−ＰＭＳである。イヌリン分解工程で生成した単
糖がフルクトースデヒドロゲナーゼの存在下で脱水素さ
れる過程において、電子を１−ｍ−ＰＭＳを介して酸素
に渡し、生じたラジカルが自然不均化を経て過酸化水素
になる。
１−ｍ−ＰＭＳである。イヌリン分解工程で生成した単
糖がフルクトースデヒドロゲナーゼの存在下で脱水素さ
れる過程において、電子を１−ｍ−ＰＭＳを介して酸素
に渡し、生じたラジカルが自然不均化を経て過酸化水素
になる。
【００１７】生成した過酸化水素は、ペルオキシダーゼ
の触媒作用により、４−アミノアンチピリンとアニリン
系トリンダー試薬をカップリングさせてキノン色素を生
成させる。この方法は、測定感度が高い、反応が早くて
簡便であることより自動分析機への適用が容易であるな
どの利点を持つ好ましい方法である。さらには、アニリ
ン系トリンダー試薬としては特に限定されないが、高感
度のＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３−メチルアニリン（略称：ＴＯＯＳ）を使
用するのが好ましい。それ以外にも、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−３−メトキシアニリン（略称：ＡＤＰ
Ｓ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（略称：ＨＤＡＯＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン
（略称：ＴＯＰＳ）などが挙げられる。なお、一般にト
リンダー試薬とは、ハロゲン化フェノール誘導体に代表
されるフェノール系水素供与体をいう。これらは、当初
Trinderらが開発した4-アミノアンチピリンとフェノー
ルの過酸化水素存在下でのペルオキシダーゼによる酸化
縮合による呈色が、さらに多くの研究者たちによって検
討を加えられ見出されたものであるが、さらに近年、よ
り感度の高いものとして、アニリン誘導体を水素供与体
としたアニリン系トリンダー試薬が開発され汎用されて
いる。
の触媒作用により、４−アミノアンチピリンとアニリン
系トリンダー試薬をカップリングさせてキノン色素を生
成させる。この方法は、測定感度が高い、反応が早くて
簡便であることより自動分析機への適用が容易であるな
どの利点を持つ好ましい方法である。さらには、アニリ
ン系トリンダー試薬としては特に限定されないが、高感
度のＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプ
ロピル）−３−メチルアニリン（略称：ＴＯＯＳ）を使
用するのが好ましい。それ以外にも、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−３−メトキシアニリン（略称：ＡＤＰ
Ｓ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−
３，５−ジメトキシアニリン（略称：ＨＤＡＯＳ）、Ｎ
−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン
（略称：ＴＯＰＳ）などが挙げられる。なお、一般にト
リンダー試薬とは、ハロゲン化フェノール誘導体に代表
されるフェノール系水素供与体をいう。これらは、当初
Trinderらが開発した4-アミノアンチピリンとフェノー
ルの過酸化水素存在下でのペルオキシダーゼによる酸化
縮合による呈色が、さらに多くの研究者たちによって検
討を加えられ見出されたものであるが、さらに近年、よ
り感度の高いものとして、アニリン誘導体を水素供与体
としたアニリン系トリンダー試薬が開発され汎用されて
いる。
【００１８】本発明の汎用自動分析機への適用は、例え
ば次のように行うことが出来る。第一ステップとして、
イヌリンを酵素的に分解し生成したフルクトースを酸素
の存在下でフルクトースデヒドロゲナーゼおよび電子受
容体と反応させて過酸化水素を生成させ、次いで第二ス
テップとして、生成した過酸化水素を定量させる。試薬
形態は特に限定されないが、液状２試薬や、測定直前に
複数のパーツを混合するタイプのものでもよく、そのう
ちの一部がバイアルなどの固形製剤であってもよい。
ば次のように行うことが出来る。第一ステップとして、
イヌリンを酵素的に分解し生成したフルクトースを酸素
の存在下でフルクトースデヒドロゲナーゼおよび電子受
容体と反応させて過酸化水素を生成させ、次いで第二ス
テップとして、生成した過酸化水素を定量させる。試薬
形態は特に限定されないが、液状２試薬や、測定直前に
複数のパーツを混合するタイプのものでもよく、そのう
ちの一部がバイアルなどの固形製剤であってもよい。
【００１９】第二ステップにおいては、電子受容体が残
っていると発色した色素を褪色させたり、アニリン系ト
リンダー試薬に直接反応して測定に妨害を与える可能性
があるので、その作用を抑える手段を講じることが望ま
しい。反応抑制方法には、４℃以下に冷却する、少量の
塩酸を添加する、ＳＤＳを添加するなどが考えられる
が、前二者の方法では自動分析機の制約上困難であり、
ＳＤＳを反応停止剤として試薬（第二試薬）へ添加する
方法には、冷蔵保存中に析出する問題点があった。本発
明では、このような問題点のない反応停止剤として、例
えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含ませる
ことが好ましい。具体例としては、例えばネオペレック
スＦ−６５（花王製）などが挙げられる。それ以外に
も、例えば、ニューレックスペーストＨ（日本油脂）、
ルノックス１００（東邦化学工業株式会社）などを用い
てもよい。
っていると発色した色素を褪色させたり、アニリン系ト
リンダー試薬に直接反応して測定に妨害を与える可能性
があるので、その作用を抑える手段を講じることが望ま
しい。反応抑制方法には、４℃以下に冷却する、少量の
塩酸を添加する、ＳＤＳを添加するなどが考えられる
が、前二者の方法では自動分析機の制約上困難であり、
ＳＤＳを反応停止剤として試薬（第二試薬）へ添加する
方法には、冷蔵保存中に析出する問題点があった。本発
明では、このような問題点のない反応停止剤として、例
えばドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含ませる
ことが好ましい。具体例としては、例えばネオペレック
スＦ−６５（花王製）などが挙げられる。それ以外に
も、例えば、ニューレックスペーストＨ（日本油脂）、
ルノックス１００（東邦化学工業株式会社）などを用い
てもよい。
【００２０】本発明のイヌリン測定方法には、必要に応
じて上述したものに加えてさらにその他の添加剤を共存
せしめても良い。該添加剤としては、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォニッ
クアシッド（略称：ＴＥＳ）などのグッド緩衝液や酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液をはじめとする各種緩衝液、ポ
リオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のような
界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミンや
ポリエチレングリコールなどの高分子化合物、アミノ酸
類、糖類、シクロデキストリン類等のような安定化剤、
抗生物質、アジ化ナトリウム等のような防腐剤、ＥＤＴ
Ａ（又はその塩）等のようなキレート剤などが挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではない。
じて上述したものに加えてさらにその他の添加剤を共存
せしめても良い。該添加剤としては、Ｎ−トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルフォニッ
クアシッド（略称：ＴＥＳ）などのグッド緩衝液や酢酸
−酢酸ナトリウム緩衝液をはじめとする各種緩衝液、ポ
リオキシエチレンオクチルフェニルエーテル等のような
界面活性剤、塩化ナトリウムなどの塩類、アルブミンや
ポリエチレングリコールなどの高分子化合物、アミノ酸
類、糖類、シクロデキストリン類等のような安定化剤、
抗生物質、アジ化ナトリウム等のような防腐剤、ＥＤＴ
Ａ（又はその塩）等のようなキレート剤などが挙げられ
るが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２１】本発明におけるイヌリン測定用試薬は、緩
衝液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子
受容体としないフルクトースデヒドロゲナーゼ、１−メ
トキシ−ＰＭＳ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチ
ピリン、アニリン系トリンダー試薬、及びドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウムを含むことを特徴とする。緩
衝液としては、ｐＨ４〜９である酢酸緩衝液、リン酸緩
衝液、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルフォニック
アシッド）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ‐トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２―アミノエタンスルフォニックアシッ
ド）緩衝液などのグッド緩衝液、等を用いるのが好まし
い。また、アニリン系トリンダー試薬としては、ＴＯＯ
Ｓ、ＡＤＰＳ、ＨＤＡＯＳ、ＴＯＰＳなどが好ましい。
また、上述したような種々の添加剤を含んでいてもよ
い。
衝液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを電子
受容体としないフルクトースデヒドロゲナーゼ、１−メ
トキシ−ＰＭＳ、ペルオキシダーゼ、４−アミノアンチ
ピリン、アニリン系トリンダー試薬、及びドデシルベン
ゼンスルホン酸ナトリウムを含むことを特徴とする。緩
衝液としては、ｐＨ４〜９である酢酸緩衝液、リン酸緩
衝液、ＭＥＳ（２−モルフォリノエタンスルフォニック
アシッド）緩衝液、ＴＥＳ（Ｎ‐トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２―アミノエタンスルフォニックアシッ
ド）緩衝液などのグッド緩衝液、等を用いるのが好まし
い。また、アニリン系トリンダー試薬としては、ＴＯＯ
Ｓ、ＡＤＰＳ、ＨＤＡＯＳ、ＴＯＰＳなどが好ましい。
また、上述したような種々の添加剤を含んでいてもよ
い。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明がこれら実施例により特に限定される
ものでないことは言うまでもない。
明するが、本発明がこれら実施例により特に限定される
ものでないことは言うまでもない。
【００２３】実施例１：イヌリン測定（日立７１７０自
動分析機への適用） １．試薬の調製 下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 Ｒ１（濃度はＲ１中） 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Fructozyme）
３０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績株式会社製Ｆ
ＣＤ−３０１） １００Ｕ／ｍＬ １−メトキシ−ＰＭＳ １００ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＰＥＯ−３０
１） １０Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） １ｇ／Ｌ ネオペレックスＦ−６５（花王製） ２０ｇ／Ｌ
動分析機への適用） １．試薬の調製 下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 Ｒ１（濃度はＲ１中） 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Fructozyme）
３０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績株式会社製Ｆ
ＣＤ−３０１） １００Ｕ／ｍＬ １−メトキシ−ＰＭＳ １００ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＰＥＯ−３０
１） １０Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） １ｇ／Ｌ ネオペレックスＦ−６５（花王製） ２０ｇ／Ｌ
【００２４】２．試料の調製 イヌリン水溶液は、０,１０,２０,３０,４０,５０ｍｇ
／ｄＬの各濃度に調製して用いた。
／ｄＬの各濃度に調製して用いた。
【００２５】３．測定 日立７１７０自動分析機を使用した。試料をそれぞれ
２．０μＬ添加後すぐＲ１を１８０μＬを添加し混和後
３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を１８０μ
Ｌ添加し５分間静置した後の２ポイントエンド法で５４
６ｎｍにおける吸光度を８００ｎｍを副波長にして測定
した。ブランク、基準液（２０ｍｇ/ｄＬ）についても
同様に測定し、次の式によりイヌリン濃度を求めた。
２．０μＬ添加後すぐＲ１を１８０μＬを添加し混和後
３７℃にて５分間静置した後と、その後Ｒ２を１８０μ
Ｌ添加し５分間静置した後の２ポイントエンド法で５４
６ｎｍにおける吸光度を８００ｎｍを副波長にして測定
した。ブランク、基準液（２０ｍｇ/ｄＬ）についても
同様に測定し、次の式によりイヌリン濃度を求めた。
【００２６】
【数１】
【００２７】４．結果 表１に示す。５０ｍｇ／ｄＬまで良好な直線性が得られ
ていることが認められる。
ていることが認められる。
【００２８】
【表１】
【００２９】実施例２：試薬の保存 １．試薬の調製 下記組成からなる試薬をそれぞれ調製した。 Ｒ１（濃度はＲ１中） 酢酸緩衝液（ｐＨ５．０） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ イヌリナーゼ（ノボ・ノルディスク社製Fructozyme）
３０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績株式会社製Ｆ
ＣＤ−３０１） １００Ｕ／ｍＬ １−メトキシ−ＰＭＳ １００ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＰＥＯ−３０
１） １０Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） １ｇ／Ｌ （ここまで実施例、比較例共通） 実施例２：ドデシルベンセンスルホン酸ナトリウム（花
王製ネオペレックスＦ−６５） １５ｇ／Ｌ 比較例２：ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク
製） １５ｇ／Ｌ
３０単位／ｍＬ フルクトースデヒドロゲナーゼ（東洋紡績株式会社製Ｆ
ＣＤ−３０１） １００Ｕ／ｍＬ １−メトキシ−ＰＭＳ １００ｍｇ／Ｌ Ｒ２（濃度はＲ２中） ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５） ０．０５ｍｏｌ／Ｌ ペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会社製ＰＥＯ−３０
１） １０Ｕ／ｍＬ ４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ アニリン系トリンダー試薬（ＴＯＯＳ） １ｇ／Ｌ （ここまで実施例、比較例共通） 実施例２：ドデシルベンセンスルホン酸ナトリウム（花
王製ネオペレックスＦ−６５） １５ｇ／Ｌ 比較例２：ドデシル硫酸ナトリウム（ナカライテスク
製） １５ｇ／Ｌ
【００３０】２．試薬の保存 ４℃冷蔵庫にて保存し、析出の有無を目視で観察した。 ３．結果 表２に示す。実施例２では４℃、１週間の保存を行って
も析出は確認されないが、比較例２では冷蔵保存により
析出が生じる。
も析出は確認されないが、比較例２では冷蔵保存により
析出が生じる。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【発明の効果】上述のように、本発明は簡便かつ正確に
イヌリン濃度を測定できる方法を提供することができる
ものである。また、自動分析機への適用も容易である。
イヌリン濃度を測定できる方法を提供することができる
ものである。また、自動分析機への適用も容易である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G045 AA13 AA16 CA25 CA26 CB03 DA30 DA32 FA25 FA26 FA29 FB01 GC10 4B063 QA01 QQ67 QQ68 QR04 QS28 QS36 QX02
Claims (5)
- 【請求項１】 イヌリンを酵素的に分解することにより
生成したフルクトースを測定するに際し、ＮＡＤ（ニコ
チンアミドアデニンヌクレオチド）またはＮＡＤＰ（ニ
コチンアミドアデニンヌクレオチドリン酸）を電子受容
体としないフルクトースデヒドロゲナーゼを用いて電子
受容体を介して酸素との反応により生成する過酸化水素
を測定するイヌリン測定方法において、電子受容体が１
−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルスルフェ
ート（略称：１−メトキシ−ＰＭＳ）であり、かつ過酸
化水素をペルオキシダーゼの触媒作用により４−アミノ
アンチピリンとアニリン系トリンダー試薬がカップリン
グして生成するキノン色素の増加を測定するイヌリン測
定方法。 - 【請求項２】 第一ステップとしてイヌリンを酵素的に
分解することにより生成したフルクトースを酸素の存在
下でフルクトースデヒドロゲナーゼおよび電子受容体と
反応させて過酸化水素を生成させ、次いで第二ステップ
として生成した過酸化水素を定量する請求項１に記載の
イヌリン測定方法。 - 【請求項３】 第二ステップにおいて過酸化水素の増加
を測定する際に電子受容体の作用を抑える目的でドデシ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウムを作用させる請求項１
または２に記載のイヌリン測定方法。 - 【請求項４】アニリン系トリンダー試薬がＮ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メ
チルアニリン（略称：ＴＯＯＳ）である請求項１〜３の
いずれかに記載のイヌリン測定方法。 - 【請求項５】 緩衝液、イヌリン分解酵素、ＮＡＤまた
はＮＡＤＰを電子受容体としないフルクトースデヒドロ
ゲナーゼ、１−メトキシ−ＰＭＳ、ペルオキシダーゼ、
４−アミノアンチピリン、アニリン系トリンダー試薬、
及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含むこと
を特徴とするイヌリン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000315602A JP2002119298A (ja) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | イヌリン測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000315602A JP2002119298A (ja) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | イヌリン測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002119298A true JP2002119298A (ja) | 2002-04-23 |
Family
ID=18794682
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000315602A Withdrawn JP2002119298A (ja) | 2000-10-16 | 2000-10-16 | イヌリン測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002119298A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009268477A (ja) * | 2009-08-18 | 2009-11-19 | Toyobo Co Ltd | イヌリン定量法および定量試薬 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5935592B2 (ja) * | 1980-10-04 | 1984-08-29 | 実 飴山 | Ｄ−フルクト−スの定量法 |
| JPS63248397A (ja) * | 1987-04-02 | 1988-10-14 | Toyobo Co Ltd | Ｄ−マンノ−スの定量法 |
| JPH01256399A (ja) * | 1988-04-06 | 1989-10-12 | Hiroshi Ito | α−アミラーゼ活性測定方法 |
| JPH06209793A (ja) * | 1993-01-14 | 1994-08-02 | Toyobo Co Ltd | ソルビトール測定方法およびその組成物 |
-
2000
- 2000-10-16 JP JP2000315602A patent/JP2002119298A/ja not_active Withdrawn
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5935592B2 (ja) * | 1980-10-04 | 1984-08-29 | 実 飴山 | Ｄ−フルクト−スの定量法 |
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| JPH01256399A (ja) * | 1988-04-06 | 1989-10-12 | Hiroshi Ito | α−アミラーゼ活性測定方法 |
| JPH06209793A (ja) * | 1993-01-14 | 1994-08-02 | Toyobo Co Ltd | ソルビトール測定方法およびその組成物 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009268477A (ja) * | 2009-08-18 | 2009-11-19 | Toyobo Co Ltd | イヌリン定量法および定量試薬 |
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