JPH04202164A - 被酸化性呈色試薬 - Google Patents
被酸化性呈色試薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
[発明の利用分野]
本発明は、新規なp−フルオロアニリン誘導体又はその
塩、及びこれを発色成分として用いる酸化性物質又はペ
ルオキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
塩、及びこれを発色成分として用いる酸化性物質又はペ
ルオキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
[発明の背景コ
生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行う上で、必須
なものとなっている。例えば、血液中のコレステロール
、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆
汁酸、モノアミンオキシダーゼ等を初め、非常に多種類
の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断上役
立っていることは周知の通りである。
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行う上で、必須
なものとなっている。例えば、血液中のコレステロール
、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆
汁酸、モノアミンオキシダーゼ等を初め、非常に多種類
の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断上役
立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行い、これによ
る生成物、を測定して目的成分量を求める、所謂″酵素
法″が一般的に広く普及している。中でも、過酸化水素
生成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的成分に相
当する過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ
、及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系
に導き、その呈色を比色定量することにより目的成分量
を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増
加しつつある。例えば、コレステロール−コレステロー
ルオキシダーゼ、トリグリセライド−リボプロティンリ
パーゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼ
等の組み合わせで発生する過酸化水素を、ペルオキシダ
ーゼ(POD)及び被酸化性呈色試薬を用いて発色系に
導き、その呈色の吸光度を測定することにより目的成分
量を求める方法がそれである。この方法に於いて用いら
れる発色成分である被酸化性呈色試薬の代表的なものと
しては、4−アミノアンチピリン又はその誘導体とフェ
ノール系化合物又はN、N−ジ置換アニリン系化合物と
を組み合わせた被酸化性呈色試薬、3−メチルベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン(MBTH)とアニリン系化合物
との組み合わせ試薬、2,2′−アジノビス(3−エチ
ルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)、
トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
o−)リジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、
0−フェニレンジアミン等が挙げられる。
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行い、これによ
る生成物、を測定して目的成分量を求める、所謂″酵素
法″が一般的に広く普及している。中でも、過酸化水素
生成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的成分に相
当する過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ
、及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系
に導き、その呈色を比色定量することにより目的成分量
を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増
加しつつある。例えば、コレステロール−コレステロー
ルオキシダーゼ、トリグリセライド−リボプロティンリ
パーゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼ
等の組み合わせで発生する過酸化水素を、ペルオキシダ
ーゼ(POD)及び被酸化性呈色試薬を用いて発色系に
導き、その呈色の吸光度を測定することにより目的成分
量を求める方法がそれである。この方法に於いて用いら
れる発色成分である被酸化性呈色試薬の代表的なものと
しては、4−アミノアンチピリン又はその誘導体とフェ
ノール系化合物又はN、N−ジ置換アニリン系化合物と
を組み合わせた被酸化性呈色試薬、3−メチルベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン(MBTH)とアニリン系化合物
との組み合わせ試薬、2,2′−アジノビス(3−エチ
ルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)(ABTS)、
トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
o−)リジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、
0−フェニレンジアミン等が挙げられる。
しかしながら、これらの呈色試薬に於いては、種々の問
題点、例えば、生成する色素が血清成分の影響により退
色する、吸収極大が短波長域にあるため測定試料中の有
色成分、例えば血清や尿中のヘモクロビンやビリルビン
等の影響を受は易く測定値の信頼性に乏しい、分子吸光
係数が小さいために測定感度が低く限られた測定対象物
にしか利用できない等の問題点があり、必ずしも満足で
きるものではなかった。
題点、例えば、生成する色素が血清成分の影響により退
色する、吸収極大が短波長域にあるため測定試料中の有
色成分、例えば血清や尿中のヘモクロビンやビリルビン
等の影響を受は易く測定値の信頼性に乏しい、分子吸光
係数が小さいために測定感度が低く限られた測定対象物
にしか利用できない等の問題点があり、必ずしも満足で
きるものではなかった。
このような問題点を解決すべく、アニリン誘導体にフル
オロ基を導入したP−フルオロアニリン誘導体が開発さ
れている(特開昭60−243050号公報等)。しか
しながら、これら既存のP−フルオロアニリン誘導体か
ら生成する色素は、血清成分の影響による退色現象は若
干改善されているものの、吸収極大が比較的短波長域に
あるため測定試料中の有色成分、例えば血清や尿中のヘ
モクロビンやビリルビン等の影響を受は易く測定値の信
頼性に乏しいという問題点は依然として解消されておら
ず、更なる改良が望まれている状況にある。
オロ基を導入したP−フルオロアニリン誘導体が開発さ
れている(特開昭60−243050号公報等)。しか
しながら、これら既存のP−フルオロアニリン誘導体か
ら生成する色素は、血清成分の影響による退色現象は若
干改善されているものの、吸収極大が比較的短波長域に
あるため測定試料中の有色成分、例えば血清や尿中のヘ
モクロビンやビリルビン等の影響を受は易く測定値の信
頼性に乏しいという問題点は依然として解消されておら
ず、更なる改良が望まれている状況にある。
[発明の目的コ
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、血
清等の生体体液中の共存成分の影響に基づく退色が殆ど
なく、測定感度が高く且つ吸取極大が長波長側にある色
素を生成し得る被酸化性呈色試薬のカップリング成分と
して有用なP−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を発色成分として用いる酸化性物質及びペル
オキシダーゼ様物質の精度の高い測定法を提供すること
にある。
清等の生体体液中の共存成分の影響に基づく退色が殆ど
なく、測定感度が高く且つ吸取極大が長波長側にある色
素を生成し得る被酸化性呈色試薬のカップリング成分と
して有用なP−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を発色成分として用いる酸化性物質及びペル
オキシダーゼ様物質の精度の高い測定法を提供すること
にある。
[発明の構成コ
本発明は、−形成[Iコ
(式中、R1及びR2は夫々独立して水素原子、アルケ
ニル基又は置換基を有していてもよいアルキル基を表わ
し、R3及びR4は夫々独立してアルコキシ基、アルケ
ニル基、水酸基、ハロゲン原子、スルホン酸基、カルボ
キシル基、ニトロ基、アリール基又は置換基を有してい
てもよいアルキル基を表わし、R5及びR6は夫々独立
して水素原子、アルコキシ基、アルケニル基又は置換基
を有していてもよいアルキル基を表わす。また、R1と
R2、R3とR5、R4とR6とが夫々結合して環を形
成していてもよい。) で示されるp−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を被酸化性呈色試薬のカップリング成分とし
て用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質の定
量方法の発明である。
ニル基又は置換基を有していてもよいアルキル基を表わ
し、R3及びR4は夫々独立してアルコキシ基、アルケ
ニル基、水酸基、ハロゲン原子、スルホン酸基、カルボ
キシル基、ニトロ基、アリール基又は置換基を有してい
てもよいアルキル基を表わし、R5及びR6は夫々独立
して水素原子、アルコキシ基、アルケニル基又は置換基
を有していてもよいアルキル基を表わす。また、R1と
R2、R3とR5、R4とR6とが夫々結合して環を形
成していてもよい。) で示されるp−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を被酸化性呈色試薬のカップリング成分とし
て用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質の定
量方法の発明である。
本発明者らは、所謂”酵素法”に於いて広く用いられて
いる種々の被酸化呈色試薬が有する上記した如き問題点
を解決すべく鋭意研究の途上、アニリン系化合物に弗素
原子を導入したP−フルオロアニリン系化合物の内、更
に3位と5位とに置換基が導入された化合物を4−アミ
ノアンチピリン等と組み合わせたものを被酸化性呈色試
薬として用いた場合には、弗素原子の導入されていない
アニリン系化合物或は3位と5位との少なくとも一方に
は置換基が導入されていないP−フルオロアニリン誘導
体を使用した場合に比較して、生じる色素の極大吸取が
長波長側となり、しかも該色素は血清等の生体体液中の
共存成分の影響に基づく退色が殆どないと言う性質を有
していることを見出し本発明を完成するに至った。
いる種々の被酸化呈色試薬が有する上記した如き問題点
を解決すべく鋭意研究の途上、アニリン系化合物に弗素
原子を導入したP−フルオロアニリン系化合物の内、更
に3位と5位とに置換基が導入された化合物を4−アミ
ノアンチピリン等と組み合わせたものを被酸化性呈色試
薬として用いた場合には、弗素原子の導入されていない
アニリン系化合物或は3位と5位との少なくとも一方に
は置換基が導入されていないP−フルオロアニリン誘導
体を使用した場合に比較して、生じる色素の極大吸取が
長波長側となり、しかも該色素は血清等の生体体液中の
共存成分の影響に基づく退色が殆どないと言う性質を有
していることを見出し本発明を完成するに至った。
一般式[1]で示される本発明のP−フルオロアニリン
誘導体に於いて、R1及びR2としては、夫々独立して
水素原子、例えばエチニル基(ビニル基)、1−プロペ
ニル基、2−プロペニル基(アリル基)、イソプロペニ
ル基、2−ブテニル基等の炭素数2〜4の低級アルケニ
ル基又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチ
ル基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していて
もよいアルキル基(直鎖状、分枝状の何れにても可)が
挙げられ、アルキル基の置換基としては、水酸基、例え
ばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基
、アミルオキシ基等の炭素数1〜5のアルコキシ基(直
鎖状、分枝状の何れにても可)、スルホ基、カルボキシ
ル基、アミノ基、アミド基、例えばアセトアミド基、プ
ロピオンアミド基等の置換アミド基、例えばアセチル基
、プロピオニル基、ブチリル基等のアシル基、例えばア
セチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基等のアシル
オキシ基等が挙げられる。また、これら置換基はアルキ
ル基に複数種、複数個導入されていてもよく、更にこれ
ら置換基のうち、スルホ基、カルボキシル基等は@(例
えば、リチウム、すトリウム、カリウム等のアルカリ金
属との塩、アンモニウム塩等)を形成していてもよいし
、アミン基は鉱酸塩(例えば塩酸塩、硫酸塩等)や有機
酸塩(例えば酢酸塩、プロピオン酸塩等)を形成してい
てもよい。尚、R1とR2とが互いに結合してNとR1
とR2とで例えばモルホリン環、ピペラジン環、ピペリ
ジン環の如き環を成していてもよい。
誘導体に於いて、R1及びR2としては、夫々独立して
水素原子、例えばエチニル基(ビニル基)、1−プロペ
ニル基、2−プロペニル基(アリル基)、イソプロペニ
ル基、2−ブテニル基等の炭素数2〜4の低級アルケニ
ル基又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチ
ル基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していて
もよいアルキル基(直鎖状、分枝状の何れにても可)が
挙げられ、アルキル基の置換基としては、水酸基、例え
ばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基
、アミルオキシ基等の炭素数1〜5のアルコキシ基(直
鎖状、分枝状の何れにても可)、スルホ基、カルボキシ
ル基、アミノ基、アミド基、例えばアセトアミド基、プ
ロピオンアミド基等の置換アミド基、例えばアセチル基
、プロピオニル基、ブチリル基等のアシル基、例えばア
セチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基等のアシル
オキシ基等が挙げられる。また、これら置換基はアルキ
ル基に複数種、複数個導入されていてもよく、更にこれ
ら置換基のうち、スルホ基、カルボキシル基等は@(例
えば、リチウム、すトリウム、カリウム等のアルカリ金
属との塩、アンモニウム塩等)を形成していてもよいし
、アミン基は鉱酸塩(例えば塩酸塩、硫酸塩等)や有機
酸塩(例えば酢酸塩、プロピオン酸塩等)を形成してい
てもよい。尚、R1とR2とが互いに結合してNとR1
とR2とで例えばモルホリン環、ピペラジン環、ピペリ
ジン環の如き環を成していてもよい。
R3及びR4としては、夫々独立して例えばメトキシ基
、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基。
、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基。
アミルオキシ基等の炭素数1〜5のアルコキシ基(直鎖
状、分枝状の何れにても可)、例えばエチニル基(ビニ
ル基)、1−プロペニル基、2−プロペニル基(アリル
基)、インプロペニル基、2−ブテニル基等の炭素数2
〜4の低級アルケニル基、水酸基1例えば沃素、塩素、
臭素、弗素等のハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル
基、ニトロ基、例えばフェニル基、ナフチル基、トリル
基、フルオロフェニル基、フロロフェニル基、ブロモフ
ェニル基、ヨードフェニル基、メトキシフェニル基、ヒ
ドロキシフェニル基等のアリール基又は置換アリール基
、又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えば沃素、塩素。
状、分枝状の何れにても可)、例えばエチニル基(ビニ
ル基)、1−プロペニル基、2−プロペニル基(アリル
基)、インプロペニル基、2−ブテニル基等の炭素数2
〜4の低級アルケニル基、水酸基1例えば沃素、塩素、
臭素、弗素等のハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル
基、ニトロ基、例えばフェニル基、ナフチル基、トリル
基、フルオロフェニル基、フロロフェニル基、ブロモフ
ェニル基、ヨードフェニル基、メトキシフェニル基、ヒ
ドロキシフェニル基等のアリール基又は置換アリール基
、又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えば沃素、塩素。
臭素、弗素等のハロゲン原子、水酸基等が・挙げられる
。これらの置換基のうちスルホ基、カルボキシル基等は
塩(例えば、リチウム、ナトリウム。
。これらの置換基のうちスルホ基、カルボキシル基等は
塩(例えば、リチウム、ナトリウム。
カリウム等のアルカリ金属との塩、アンモニウム塩等)
を形成していてもよい。
を形成していてもよい。
R5及びR6としては、夫々独立して水素原子、例えば
メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基。
メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基。
ブトキシ基、アミルオキシ基等の炭素数1〜5のアルコ
キシ基(直鎖状、分枝状の何れにても可)、例えばエチ
ニル基(ビニル基)、1−プロペニル基。
キシ基(直鎖状、分枝状の何れにても可)、例えばエチ
ニル基(ビニル基)、1−プロペニル基。
2−プロペニル基(アリル基)、イソプロペニル基。
2−ブテニル基等の炭素数2〜4の低級アルケニル基、
水酸基、例えば沃素、塩素、臭素、弗素等のハロゲン原
子又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基。
水酸基、例えば沃素、塩素、臭素、弗素等のハロゲン原
子又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数1〜5の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基。
アミルオキシ基等の炭素数1〜5のアルコキシ基(直鎖
状、分枝状の何れにても可)等が挙げられる。尚、R3
とR5、或はR4とR6とが互いに結合して芳香環を形
成していてもよい。
状、分枝状の何れにても可)等が挙げられる。尚、R3
とR5、或はR4とR6とが互いに結合して芳香環を形
成していてもよい。
本発明のp−フルオロアニリン誘導体は例えば塩酸、硫
酸等の鉱酸や例えば酢酸、プロピオン酸等の有機酸と塩
を形成していてもよい。
酸等の鉱酸や例えば酢酸、プロピオン酸等の有機酸と塩
を形成していてもよい。
一般式[T]で示される本発明のP−フルオロアニリン
誘導体は例えば以下のようにして容易に合成し得る。尚
、以下の合成法は、全てR1及びR2が水素原子以外の
場合についてのものである。
誘導体は例えば以下のようにして容易に合成し得る。尚
、以下の合成法は、全てR1及びR2が水素原子以外の
場合についてのものである。
即ち、例えば一般式[II]
(式中、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ。)で
示される化合物(以下、化合物■と略記する。)と、化
合物■1モルに対して1〜3モル、好ましくは1〜1.
2モルの一般式[■コ X−COR’[mコ (式中、Xはハロゲン原子を表わし、R′はアルキル基
を表わす。) で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類、例えば1,4−
ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)等の環状エ
ーテル類等の溶媒或はこれらに水を混したものに溶解し
、これに例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
酸化カルシウム等の苛性アルカリ、例えば炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム。
示される化合物(以下、化合物■と略記する。)と、化
合物■1モルに対して1〜3モル、好ましくは1〜1.
2モルの一般式[■コ X−COR’[mコ (式中、Xはハロゲン原子を表わし、R′はアルキル基
を表わす。) で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類、例えば1,4−
ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)等の環状エ
ーテル類等の溶媒或はこれらに水を混したものに溶解し
、これに例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
酸化カルシウム等の苛性アルカリ、例えば炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム。
炭酸カルシウム等の炭酸アルカリを化合物■1当量に対
して1〜3当量、好ましくは1〜1.5当量添加しく添
加する際には水溶液としたものを用いてもよい。)−0
〜120℃、好ましくは10〜100℃で数時間乃至数
十時間反応させた後、常法により精製して、先ず一般式
[■コ (式中、R′、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ
。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)を得
る。
して1〜3当量、好ましくは1〜1.5当量添加しく添
加する際には水溶液としたものを用いてもよい。)−0
〜120℃、好ましくは10〜100℃で数時間乃至数
十時間反応させた後、常法により精製して、先ず一般式
[■コ (式中、R′、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ
。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)を得
る。
次に、化合物■に、化合物■1モルに対して1〜3モル
、好ましくは1〜1.2モルの一般式[ %式%[] (式中、X′はハロゲン原子を表わし、R2は前記に同
じ。) で示される化合物を、上記した反応と同様の反応条件、
即ち、アルコール系溶媒、1,4−ジオキサン。
、好ましくは1〜1.2モルの一般式[ %式%[] (式中、X′はハロゲン原子を表わし、R2は前記に同
じ。) で示される化合物を、上記した反応と同様の反応条件、
即ち、アルコール系溶媒、1,4−ジオキサン。
THF等の溶媒中、10〜100°Cで数時間乃至数十
時間反応させた後、常法により精製を行えば、一般式[
■] (式中、R″、R2、R3、R4、R5及びR6は前記
に同じ。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)が得
られる。
時間反応させた後、常法により精製を行えば、一般式[
■] (式中、R″、R2、R3、R4、R5及びR6は前記
に同じ。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)が得
られる。
次いで、化合物■と、化合物■1モルに対して1〜3モ
ル、好ましくは1〜1.2モルの例えばN−フルオロピ
リジニウム坂(例えばN−フルオロ−2,4,6−ドリ
メチルビリジニウム トリフレート、 N−フルオロピ
リジニウム トリフレート、N−フルオロ−3,5−ジ
クロロピリジニウム トリフレート等)等の弗素化剤と
を、例えばベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、
例えばジエチルエーテル。
ル、好ましくは1〜1.2モルの例えばN−フルオロピ
リジニウム坂(例えばN−フルオロ−2,4,6−ドリ
メチルビリジニウム トリフレート、 N−フルオロピ
リジニウム トリフレート、N−フルオロ−3,5−ジ
クロロピリジニウム トリフレート等)等の弗素化剤と
を、例えばベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、
例えばジエチルエーテル。
ジイソプロピルエーテル、 THF、 1.4−ジオキ
サン等のエーテル類、例えばクロロホルム、ジクロロメ
タン、1,2−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素
、ジメチルホルムアミド等の溶媒(何れも乾燥したもの
が望ましい。)中、0〜150℃、好ましくは20〜1
20℃で、数時間乃至数十時間反応させた後、常法によ
り精製することにより、一般式[ (式中、R″、R2、R3、R4、R5及びR6は前記
に同じ。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)を得
る。
サン等のエーテル類、例えばクロロホルム、ジクロロメ
タン、1,2−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素
、ジメチルホルムアミド等の溶媒(何れも乾燥したもの
が望ましい。)中、0〜150℃、好ましくは20〜1
20℃で、数時間乃至数十時間反応させた後、常法によ
り精製することにより、一般式[ (式中、R″、R2、R3、R4、R5及びR6は前記
に同じ。) で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)を得
る。
次いで、化合物■を例えばメタノール、エタノール等の
溶媒中、化合物■1モルに対して、1〜3モル、好まし
くは1〜1.2モルの例えば水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラー
ト等の無機又は有機のアルカリと、0〜150℃、好ま
しくは20〜60°Cで、1乃至数時間反応させた後、
常法により精製すれば、一般式[■] (式中、R2、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ
。) ′ で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)が得
られる。
溶媒中、化合物■1モルに対して、1〜3モル、好まし
くは1〜1.2モルの例えば水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラー
ト等の無機又は有機のアルカリと、0〜150℃、好ま
しくは20〜60°Cで、1乃至数時間反応させた後、
常法により精製すれば、一般式[■] (式中、R2、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ
。) ′ で示される化合物(以下、化合物■と略記する。)が得
られる。
次いで、化合物■と、化合物11モルに対して1〜3モ
ル、好ましくは1〜2モルの一般式[IX]X”−R1
[IXコ (式中、X”はハロゲン原子を表わし、R1は前記に同
じ。) で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類や例えば1,4−
ジオキサン、 THF等の環状エーテル類或はこれらに
水を加えたもの等の溶媒中、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の苛性アルカリ又
は例えば炭酸ナトリウム。
ル、好ましくは1〜2モルの一般式[IX]X”−R1
[IXコ (式中、X”はハロゲン原子を表わし、R1は前記に同
じ。) で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類や例えば1,4−
ジオキサン、 THF等の環状エーテル類或はこれらに
水を加えたもの等の溶媒中、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の苛性アルカリ又
は例えば炭酸ナトリウム。
炭酸カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸アルカリの存在
下、0〜120℃、好ましくは50〜100°Cで数時
間乃至数十時間反応させた後、常法により精製を行えば
、目的とする一般式[I]で示される本発明のp−フル
オロアニリン誘導体を得ることができる。
下、0〜120℃、好ましくは50〜100°Cで数時
間乃至数十時間反応させた後、常法により精製を行えば
、目的とする一般式[I]で示される本発明のp−フル
オロアニリン誘導体を得ることができる。
尚、上記の反応に於いて、一般式[■コで示される化合
物は、例えば以下のような方法によっても得ることがで
きるので、このような方法により得られたものを用いて
もよい。
物は、例えば以下のような方法によっても得ることがで
きるので、このような方法により得られたものを用いて
もよい。
即ち、J 、 Ch e m 、 S o c 、 、
用競、’ 5554頁に記載の方法に準じて、相当する
フルオロベンゼン誘導体をニトロ化して、一般式[■′
] (式中、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ。)で
示される4−フルオロニトロベンゼン誘導体を得る。
用競、’ 5554頁に記載の方法に準じて、相当する
フルオロベンゼン誘導体をニトロ化して、一般式[■′
] (式中、R3、R4、R5及びR6は前記に同じ。)で
示される4−フルオロニトロベンゼン誘導体を得る。
次いで、この4−フルオロニトロベンゼン誘導体を接触
還元等、芳香族ニトロ化合物還元の常法に従って還元す
ることにより、−形成[I[”1(式中、R3、R4、
R5及びR6は前記に同じ。)で示される化合物(以下
、化合物■゛と略記する。
還元等、芳香族ニトロ化合物還元の常法に従って還元す
ることにより、−形成[I[”1(式中、R3、R4、
R5及びR6は前記に同じ。)で示される化合物(以下
、化合物■゛と略記する。
)とし、然る後、これに−形成[V]
X’−R2[Vコ
(式中、X′及びR2は前記に同じ。)で示される化合
物を、前記、化合物■に一般式[V]で示される化合物
を反応させる条件と同様の反応条件で反応させれば、−
形成[■コで示される化合物を得ることができる。
物を、前記、化合物■に一般式[V]で示される化合物
を反応させる条件と同様の反応条件で反応させれば、−
形成[■コで示される化合物を得ることができる。
また、本発明のP−フルオロアニリン誘導体は、例えば
−形成[Xコ に同じ。) で示される化合物を、前記、化合物■を弗素化して化合
物■とする場合と同様の反応条件で弗素化することによ
っても同様に得ることができる。
−形成[Xコ に同じ。) で示される化合物を、前記、化合物■を弗素化して化合
物■とする場合と同様の反応条件で弗素化することによ
っても同様に得ることができる。
尚、−形成[I]のR1及びR2のうち少なくとも一方
が水素原子である化合物を合成する場合には、上記した
合成法に於ける各反応工程のうち、必要な工程のみを行
えば良いことは言うまでもない。
が水素原子である化合物を合成する場合には、上記した
合成法に於ける各反応工程のうち、必要な工程のみを行
えば良いことは言うまでもない。
本発明のp−フルオロアニリン誘導体の製造に用いられ
る化合物■は、市販品がある場合にはそれをそのまま用
いれば良いし、市販品がない場合には、相当するベンゼ
ン誘導体を常法に従いニトロ化、還元してアニリン誘導
体としたものを用いれば良い。
る化合物■は、市販品がある場合にはそれをそのまま用
いれば良いし、市販品がない場合には、相当するベンゼ
ン誘導体を常法に従いニトロ化、還元してアニリン誘導
体としたものを用いれば良い。
また、化合物Xについても全く同様である。
本発明のP−フルオロアニリン誘導体又はその塩は、水
成は界面活性剤の溶存する緩衝液中で極めて安定である
が、これと4−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、MBTH等の発色主剤とを組み合わ
せたものを、酸化剤により酸化(例えばペルオキシダー
ゼの存在下過酸化水素により酸化)すると呈色安定性に
優れた色素を定量的に形成する。しかも、この色素は、
従来の3位又は5位のどちらか一方にしか置換基を有さ
ないP−フルオロアニリン誘導体を用いて同様の方法に
より生成させた色素に比べて、極大吸収が長波長側にあ
り、しかも血清や尿等の生体体液を試料とした場合に於
ける該体液中の共存成分の影響に基づく退色も殆どない
と言う優れた性質を有している。従って、本発明のP−
フルオロアニリン誘導体又はその塩は、酸化性物質の定
量やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色試薬の
カップリング成分として有効に用い得るが、とりわけ酵
素反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの
存在下発色系に導き、その呈色を比色定量することによ
り行う、例えば血清、血漿、尿等の生体試料中の微量成
分の定量に於ける発色試薬のカップリング成分として有
効に使用し得る。
成は界面活性剤の溶存する緩衝液中で極めて安定である
が、これと4−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、MBTH等の発色主剤とを組み合わ
せたものを、酸化剤により酸化(例えばペルオキシダー
ゼの存在下過酸化水素により酸化)すると呈色安定性に
優れた色素を定量的に形成する。しかも、この色素は、
従来の3位又は5位のどちらか一方にしか置換基を有さ
ないP−フルオロアニリン誘導体を用いて同様の方法に
より生成させた色素に比べて、極大吸収が長波長側にあ
り、しかも血清や尿等の生体体液を試料とした場合に於
ける該体液中の共存成分の影響に基づく退色も殆どない
と言う優れた性質を有している。従って、本発明のP−
フルオロアニリン誘導体又はその塩は、酸化性物質の定
量やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色試薬の
カップリング成分として有効に用い得るが、とりわけ酵
素反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの
存在下発色系に導き、その呈色を比色定量することによ
り行う、例えば血清、血漿、尿等の生体試料中の微量成
分の定量に於ける発色試薬のカップリング成分として有
効に使用し得る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量方法は、基質、又は酵
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の微
量成分、即ち基質又は酵素活性の測定方法として特に効
果的に使用し得る。
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の微
量成分、即ち基質又は酵素活性の測定方法として特に効
果的に使用し得る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えばコレステロール、グルコース、グリセリ
ン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリン
エステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量
することにより測定が可能な生体成分は全て定量が可能
である。
しては、例えばコレステロール、グルコース、グリセリ
ン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリン
エステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量
することにより測定が可能な生体成分は全て定量が可能
である。
本発明の測定法は、発色試薬(被酸化性呈色試薬)とし
て、例えば4−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、M B T H等の発色主剤と本発
明のp−フルオロアニリン誘導体又はその塩とを組み合
わせたものを用いる以外は自体公知の酵素法(過酸化水
素生成酵素を用いる)による測定法に準じてこれを行え
ば足りる。
て、例えば4−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、M B T H等の発色主剤と本発
明のp−フルオロアニリン誘導体又はその塩とを組み合
わせたものを用いる以外は自体公知の酵素法(過酸化水
素生成酵素を用いる)による測定法に準じてこれを行え
ば足りる。
発色試薬としての使用濃度としては、特に限定されない
が、発色主剤が通常50〜200μmol/1、好まし
くは100〜1000μmol/1の濃度範囲で、本発
明のP−フルオロアニリン誘導体又はその塩は通常10
0〜2000μmo1/1、好ましくは500〜100
0μmol/1の濃度範囲で、適宜組み合わせて用いら
れる。
が、発色主剤が通常50〜200μmol/1、好まし
くは100〜1000μmol/1の濃度範囲で、本発
明のP−フルオロアニリン誘導体又はその塩は通常10
0〜2000μmo1/1、好ましくは500〜100
0μmol/1の濃度範囲で、適宜組み合わせて用いら
れる。
本発明の方法による生体成分の定量に於いて、過酸化水
素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素(オキシ
ダーゼ)及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵
素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用
量は、被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の
定量方法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜
選択すればよい。また、本発明による過酸化水素の定量
に於いて用いられるペルオキシダーゼ又はペルオキシダ
ーゼ様物質としては、その起源、由来に特に限定はなく
、植物、動物、微生物から得られるペルオキシダーゼ又
はペルオキシダーゼ様物質が、1種若しくは要すれば2
種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量は目
的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素(オキシ
ダーゼ)及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵
素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用
量は、被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の
定量方法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜
選択すればよい。また、本発明による過酸化水素の定量
に於いて用いられるペルオキシダーゼ又はペルオキシダ
ーゼ様物質としては、その起源、由来に特に限定はなく
、植物、動物、微生物から得られるペルオキシダーゼ又
はペルオキシダーゼ様物質が、1種若しくは要すれば2
種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量は目
的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常PH4,0
〜10.0、好ましくはpH8,0〜8.0で実施され
る。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩
、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン、グツド(Good)の緩衝剤等の通常この分
野で用いられる緩衝剤が挙げられるが、特に限定されな
い。
〜10.0、好ましくはpH8,0〜8.0で実施され
る。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩
、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン、グツド(Good)の緩衝剤等の通常この分
野で用いられる緩衝剤が挙げられるが、特に限定されな
い。
本発明のp−フルオロアニリン誘導体は、発色主剤と組
み合わせて過酸化水素、過沃素酸等の酸化性物質の定量
に有効に用い得るが、また、これと発色主剤及び過酸化
水素とを組み合わせることによりペルオキシダーゼ様物
質の定量を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様
物質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグ
ロビンその他のヘム化合物が挙げられる。
み合わせて過酸化水素、過沃素酸等の酸化性物質の定量
に有効に用い得るが、また、これと発色主剤及び過酸化
水素とを組み合わせることによりペルオキシダーゼ様物
質の定量を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様
物質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグ
ロビンその他のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明のp−フルオロアニリン誘導体又はその塩
は、例えばペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素
免疫測定法や血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しく
は過硼素酸Naの様な酸化性物質を用いて測定する場合
等にも有効に使用し得る。
は、例えばペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素
免疫測定法や血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しく
は過硼素酸Naの様な酸化性物質を用いて測定する場合
等にも有効に使用し得る。
尚、本発明はビライケミストリーへも応用が可能である
。
。
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
[実施例コ
実施例1.N−エチル−N−(2−ヒドロキシエチル)
−3゜5−ジメチル−4−フルオロアニリン[本発明化
合物(1)コの合成 3.5−ジメチル−4−フルオロベンゼン(コロンビア
・オルガニック・ケミカル社製)120gを一10℃で
硝酸120m1に1時間を要して溶解させた後、温度を
一15℃として更に1時間撹拌、反応させた。
−3゜5−ジメチル−4−フルオロアニリン[本発明化
合物(1)コの合成 3.5−ジメチル−4−フルオロベンゼン(コロンビア
・オルガニック・ケミカル社製)120gを一10℃で
硝酸120m1に1時間を要して溶解させた後、温度を
一15℃として更に1時間撹拌、反応させた。
反応後、反応液を氷の上に注ぎ、析出した黄色品を濾取
し、これを常圧蒸留して3,5−ジメチル−4−フルオ
ロ−1−ニトロベンゼン40gをbpHl〜112℃の
留分として得た。
し、これを常圧蒸留して3,5−ジメチル−4−フルオ
ロ−1−ニトロベンゼン40gをbpHl〜112℃の
留分として得た。
この3,5−ジメチル−4−フルオロ−1−二トロベン
ゼン15gをメタノール31に溶解し、窒素置換後パラ
ジウムカーボンLogを投入して水素ガスによる接触還
元を行った。反応後、不溶物を濾去し、濾液を濃縮して
3,5−ジメチル−4−フルオロアニリン12.3gを
得た。
ゼン15gをメタノール31に溶解し、窒素置換後パラ
ジウムカーボンLogを投入して水素ガスによる接触還
元を行った。反応後、不溶物を濾去し、濾液を濃縮して
3,5−ジメチル−4−フルオロアニリン12.3gを
得た。
得られた3、5−ジメチル−4−フルオロアニリン12
゜3gと2−クロロエタノール81gとを、エタノール
100m1と2N NaOH水溶液60m1との混合液
に溶解した後、3時間還流下に反応させた。反応後、エ
タノールを留去し、残渣を酢酸エチルで抽出、抽出液を
水洗、乾燥後濃縮して、粗N−(2−ヒドロキシエチル
)−3,5−ジメチル−4−フルオロアニリン14gを
得た。
゜3gと2−クロロエタノール81gとを、エタノール
100m1と2N NaOH水溶液60m1との混合液
に溶解した後、3時間還流下に反応させた。反応後、エ
タノールを留去し、残渣を酢酸エチルで抽出、抽出液を
水洗、乾燥後濃縮して、粗N−(2−ヒドロキシエチル
)−3,5−ジメチル−4−フルオロアニリン14gを
得た。
次いで、これをイソプロパツール100m1に溶解し、
ヨードエタン15gと炭酸カリウム20gを加えて、5
時間還流、反応させた。反応後、溶媒を留去し、残渣を
酢酸エチルで抽出、抽出液を水洗、乾燥後濃縮して、目
的物の組体16gを得た。これをカラムクロマトグラフ
ィ[充填剤;ワコーゲルC−300(和光紬薬工業(株
)登録商標)、溶出溶媒;酢酸エチル二〇−ヘキサン=
1:2]により精製し、油状のN−エチル−N−(2−
ヒドロキシエチル)−3,5−ジメチル−4−フルオロ
アニリン9.5gを得た。
ヨードエタン15gと炭酸カリウム20gを加えて、5
時間還流、反応させた。反応後、溶媒を留去し、残渣を
酢酸エチルで抽出、抽出液を水洗、乾燥後濃縮して、目
的物の組体16gを得た。これをカラムクロマトグラフ
ィ[充填剤;ワコーゲルC−300(和光紬薬工業(株
)登録商標)、溶出溶媒;酢酸エチル二〇−ヘキサン=
1:2]により精製し、油状のN−エチル−N−(2−
ヒドロキシエチル)−3,5−ジメチル−4−フルオロ
アニリン9.5gを得た。
I R(Neat) : 2900−2980cm
’(C1()、1600cm−’(Arom ati
c CH) 、 1500cm−’(Aromat
ic CH) 、 1200cm−1(Co)。
’(C1()、1600cm−’(Arom ati
c CH) 、 1500cm−’(Aromat
ic CH) 、 1200cm−1(Co)。
m p : 33(1−335°C0元素分析値(C
,。H,8PNO) 計算値は) : C68,22、H8,59、N 6
.63、実測値(χ) : C68,62、H8,79
、N 6.24゜実施例2.N−エチル−N−(2−
ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキ
シ−4−フルオロアニリン(本発明化合物[2コ)の合
成 3.5−ジメトキシアニリン(アルドリッチ社製)34
.7gを1,4−シ゛′オキサン450m1と水230
m1との混合液に溶解し、0℃に冷却した後、IN N
a011390m1とクロル炭酸エチル30gとを加え
、20’Cで20時間反応させた。反応終了後、IN
HCIを用いて反応液を酸性にし、酢酸エチルで抽出し
た。得られた有機層を、水洗し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を留去した。次いで、得られた残渣を、
T HF 300m1に溶解し、水酸化ナトリウム9
、07gとヨードエタン35.4gを加えて、40℃で
2時間撹拌反応させた。
,。H,8PNO) 計算値は) : C68,22、H8,59、N 6
.63、実測値(χ) : C68,62、H8,79
、N 6.24゜実施例2.N−エチル−N−(2−
ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキ
シ−4−フルオロアニリン(本発明化合物[2コ)の合
成 3.5−ジメトキシアニリン(アルドリッチ社製)34
.7gを1,4−シ゛′オキサン450m1と水230
m1との混合液に溶解し、0℃に冷却した後、IN N
a011390m1とクロル炭酸エチル30gとを加え
、20’Cで20時間反応させた。反応終了後、IN
HCIを用いて反応液を酸性にし、酢酸エチルで抽出し
た。得られた有機層を、水洗し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を留去した。次いで、得られた残渣を、
T HF 300m1に溶解し、水酸化ナトリウム9
、07gとヨードエタン35.4gを加えて、40℃で
2時間撹拌反応させた。
反応後、反応液を濃縮し、残渣に水を加えた後、1.2
−ジクロルエタン500m1で抽出した。抽出液を無水
硫酸マグネシウムで充分乾燥した後、これにN−フルオ
ロ−2,4,6−ドリメチルピリジニウム トリフレー
ト(小野田セメント(株>m) 64.8gを加えて1
00℃で8時間撹拌反応させた。反応後、溶媒を留去し
、残液に水を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得ら
れた有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥
後、溶媒を留去し、得られた残液をメタノール200m
1に溶解し、IN水酸化ナトリウム水溶液230m1を
加えて50℃で2時間脱炭酸エステル化反応を行った後
、カラムクロマトグラフィ[充填剤;ワコーゲルC−3
00(和光紬薬工業(株)登録商標)、溶出溶媒:ヘキ
サン:酢酸エチル=4 : 1]により処理し、N−エ
チル−3,5−ジメトキシ−4−フルオロアニリンを含
む両分を得た。この両分から溶媒を留去し、残渣を水2
4m1とイソプロピルアルコール24m1の混合液に溶
解し、これにIN NaOH24m1と3−クロロ−2
−ヒドロキシプロピルスルホン酸Na塩(東京化成(株
)製) 4.7gを加えて80℃で5時間撹拌反応させ
た。反応後、溶媒を留去し、残渣をエーテルで洗浄後、
水から再結晶を行って、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシ−4
−フルオロアニリンの白色結晶6.59gを得た。
−ジクロルエタン500m1で抽出した。抽出液を無水
硫酸マグネシウムで充分乾燥した後、これにN−フルオ
ロ−2,4,6−ドリメチルピリジニウム トリフレー
ト(小野田セメント(株>m) 64.8gを加えて1
00℃で8時間撹拌反応させた。反応後、溶媒を留去し
、残液に水を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得ら
れた有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥
後、溶媒を留去し、得られた残液をメタノール200m
1に溶解し、IN水酸化ナトリウム水溶液230m1を
加えて50℃で2時間脱炭酸エステル化反応を行った後
、カラムクロマトグラフィ[充填剤;ワコーゲルC−3
00(和光紬薬工業(株)登録商標)、溶出溶媒:ヘキ
サン:酢酸エチル=4 : 1]により処理し、N−エ
チル−3,5−ジメトキシ−4−フルオロアニリンを含
む両分を得た。この両分から溶媒を留去し、残渣を水2
4m1とイソプロピルアルコール24m1の混合液に溶
解し、これにIN NaOH24m1と3−クロロ−2
−ヒドロキシプロピルスルホン酸Na塩(東京化成(株
)製) 4.7gを加えて80℃で5時間撹拌反応させ
た。反応後、溶媒を留去し、残渣をエーテルで洗浄後、
水から再結晶を行って、N−エチル−N−(2−ヒドロ
キシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキシ−4
−フルオロアニリンの白色結晶6.59gを得た。
■R(KBr) : 3400cm−’(CH)、3
050−2800cm ’(C1+>、1200cm−
’ (SO2)、105105O1(Co)。
050−2800cm ’(C1+>、1200cm−
’ (SO2)、105105O1(Co)。
mp:210〜215℃。
元素分析値(C13H1gFNNaO4S)計算値(χ
):C47,70,H5,85、N 4.28、実測
値(ぶ):C47,37、H5,65、N 4.02
゜参考例10本発明化合物の諸性質の測定(1)分子吸
光係数及び吸収極大(λmax)の測定(発色溶液) 50mM ピペラジン−N、N’−ビス(2−エタンス
ルホン酸) (PIPES)−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH7,0)に、本発明化合物を0.5mM、4−ア
ミノアンチピリンを0.5mM及びペルオキシダーゼを
I U/mlとなるように溶解したものを発色溶液とし
た。
):C47,70,H5,85、N 4.28、実測
値(ぶ):C47,37、H5,65、N 4.02
゜参考例10本発明化合物の諸性質の測定(1)分子吸
光係数及び吸収極大(λmax)の測定(発色溶液) 50mM ピペラジン−N、N’−ビス(2−エタンス
ルホン酸) (PIPES)−水酸化ナトリウム緩衝液
(pH7,0)に、本発明化合物を0.5mM、4−ア
ミノアンチピリンを0.5mM及びペルオキシダーゼを
I U/mlとなるように溶解したものを発色溶液とし
た。
(操作法)
所定の本発明化合物を用いて調製した発色溶液3mlに
、1mMの過酸化水素水20μmを添加し良く混合した
後、37℃で5分間加温した。この反応液の吸収曲線を
測定し、そのλmax及びλmaxに於ける吸光度Es
を求めた。
、1mMの過酸化水素水20μmを添加し良く混合した
後、37℃で5分間加温した。この反応液の吸収曲線を
測定し、そのλmax及びλmaxに於ける吸光度Es
を求めた。
尚、吸収曲線及びλmaxを求める際の対照としては、
各々の発色溶液3mlに精製水20μmを添加し良く混
合した後、37℃で5分間加温したものを用いた。
各々の発色溶液3mlに精製水20μmを添加し良く混
合した後、37℃で5分間加温したものを用いた。
また、分子吸光係数は、各発色溶液を用いて得られたE
sと、各発色溶液の代りに4−アミノアンチピリンとフ
ェノールを夫々50mMずつ及びペルオキシダーゼをI
U/ml含む50mM PIPES−水酸化ナトリウ
ム緩衝液(pH7,0)を用いて、上記の操作法により
得られる505nmに於ける吸光度E。Hとを用いて、
次式により求めた。
sと、各発色溶液の代りに4−アミノアンチピリンとフ
ェノールを夫々50mMずつ及びペルオキシダーゼをI
U/ml含む50mM PIPES−水酸化ナトリウ
ム緩衝液(pH7,0)を用いて、上記の操作法により
得られる505nmに於ける吸光度E。Hとを用いて、
次式により求めた。
分子吸光係数=(Es÷EoH)×5×103結果を表
1−1に示す。
1−1に示す。
(2)血清成分の影響の測定
(1)で調製した発色溶液3mlに、正常プール人血清
20μmを添加混合し、次いで1mMの過酸化水素水2
0μmを添加混合したものを37℃で5分間反応させて
、この反応液のλmaxに於ける吸光度Eefを測定し
た。また、正常プール人血清の代りに精製水を用いて、
前記と同じ発色溶液を用いて同様の操作を行い、吸光度
E stdを得た。
20μmを添加混合し、次いで1mMの過酸化水素水2
0μmを添加混合したものを37℃で5分間反応させて
、この反応液のλmaxに於ける吸光度Eefを測定し
た。また、正常プール人血清の代りに精製水を用いて、
前記と同じ発色溶液を用いて同様の操作を行い、吸光度
E stdを得た。
これらの値を次式に代入して、血清成分の影響を調べる
指標となるa値を求めた。
指標となるa値を求めた。
a=(Eef÷E 5td) X 100尚、血清成分
の影響は、a値を基に以下のように表わした。
の影響は、a値を基に以下のように表わした。
m:8(直がO〜1゜
±:a値が1〜2゜
+十:a値が3以上。
結果を表1−1に併せて示す。
尚、表1−1中の本発明化合物3〜5は、実施例1又は
2に記載の操作法に準じて合成したものである。
2に記載の操作法に準じて合成したものである。
また、比較のために、表1−2及び表1−3に既知のp
−フルオロアニリン誘導体について同様にして諸性質を
測定した結果を併せて示した。
−フルオロアニリン誘導体について同様にして諸性質を
測定した結果を併せて示した。
表1−1、表1−2及び表1−3の結果から明らかな如
く、本発明の化合物は、分子吸光係数に於いてはフルオ
ロ基に隣接した置換基がない既知のp−フルオロアニリ
ン誘導体から生じる色素よりは明らかに高いものの、フ
ルオロ基に隣接した置換基がどちらか一方にある既知の
P−フルオロアニリン誘導体から生じる色素と比較する
と同等乃至やや低いが、極大吸収波長は既知のp−フル
オロアニリン誘導体から生じる色素のそれに比較して明
らかに長波長側にシフトしており、且つ既知のP−フル
オロアニリン誘導体に於いて若干問題となっていた血清
等の生体体液を試料とした場合に体液中の共存成分の影
響により生ずる色素の退色現象が殆ど認められないこと
が判る。
く、本発明の化合物は、分子吸光係数に於いてはフルオ
ロ基に隣接した置換基がない既知のp−フルオロアニリ
ン誘導体から生じる色素よりは明らかに高いものの、フ
ルオロ基に隣接した置換基がどちらか一方にある既知の
P−フルオロアニリン誘導体から生じる色素と比較する
と同等乃至やや低いが、極大吸収波長は既知のp−フル
オロアニリン誘導体から生じる色素のそれに比較して明
らかに長波長側にシフトしており、且つ既知のP−フル
オロアニリン誘導体に於いて若干問題となっていた血清
等の生体体液を試料とした場合に体液中の共存成分の影
響により生ずる色素の退色現象が殆ど認められないこと
が判る。
実施例3.過酸化水素の定量
(測定試液)
50mM PIPES−水酸化ナトリウム緩衝液(pH
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
4−アミノアンチピリン 0.5+nt4本発
明化合物[2コ 0.5mMペルオキシダ
ーゼ 4 U/ml(試料) 市販の過酸化水素水を蒸留水で適宜希釈して、1.0.
2.0.3.0.4.0及び5.0mM溶液としたもノ
ヲ試料とした。
明化合物[2コ 0.5mMペルオキシダ
ーゼ 4 U/ml(試料) 市販の過酸化水素水を蒸留水で適宜希釈して、1.0.
2.0.3.0.4.0及び5.0mM溶液としたもノ
ヲ試料とした。
(操作法)
測定試液3mlに試料20μmを加えよく混合し、37
℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es)を測定
した。
℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es)を測定
した。
また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検値(E Bl)を測定した。
行い盲検値(E Bl)を測定した。
(結果)
測定結果を第1図に示す。
第1図から明らかな如く、横軸の各過酸化水素濃度に対
して得られた吸光度(Es−EBI)を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだ検量線は良好な直線性を示し、本
発明の方法により過酸化水素を定量的に測定し得ること
が判る。
して得られた吸光度(Es−EBI)を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだ検量線は良好な直線性を示し、本
発明の方法により過酸化水素を定量的に測定し得ること
が判る。
実施例4.血清成分による呈色安定性への影響の検討
(測定試液及び試料)
実施例3と同じものを使用した。
(操作法)
測定試液3mlに正常ヒト血清又はイオン交換水50μ
mを加えよく混合し、更に試料20μmを加えよく混合
し、37℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es
)を測定した。
mを加えよく混合し、更に試料20μmを加えよく混合
し、37℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es
)を測定した。
また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検値(FBI)を測定した。
行い盲検値(FBI)を測定した。
(結果)
測定結果を表2に示す。
表2
表2から明らかな如く、本発明のp−フルオロアニリン
誘導体と4−アミノアンチピリンとから生成する色素は
血清成分による影響を殆ど受けないことが判る。
誘導体と4−アミノアンチピリンとから生成する色素は
血清成分による影響を殆ど受けないことが判る。
実施例5.尿酸の定量
(測定試液)
50mM PIPES−水酸化ナトリウム緩衝液(pH
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
7,0)に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
4−アミノアンチピリン 0.5mM本発明化
合物[2コ 0.5mMペルオキシダーゼ
40/mlウリカーゼ
0.050/mi(試料) 10mg/dlの尿酸を含有する標準液及びヒト血清5
検体を試料とした。
合物[2コ 0.5mMペルオキシダーゼ
40/mlウリカーゼ
0.050/mi(試料) 10mg/dlの尿酸を含有する標準液及びヒト血清5
検体を試料とした。
(操作法)
測定試液3mlに試料20μmを加えよく混合し、37
℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es)を測定
した。
℃で5分間加温後、595nmの吸光度(Es)を測定
した。
また、試料の代りにイオン交検水を用いて同様の操作を
行い盲検値(E Bl)を測定した。
行い盲検値(E Bl)を測定した。
次式に従いヒト血清中の尿酸濃度を算出した。
尿酸(mg/dl)=(ヒト血清のEs−FBI)÷(
標準液のEs−EBI) X 10 (結果) 結果を表3に示す。
標準液のEs−EBI) X 10 (結果) 結果を表3に示す。
参考例1.尿酸の定量
実施例5と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット(
尿酸C−テストヮコー、和光紬薬工業(株)製)を使用
して、尿酸濃度を測定した。
尿酸C−テストヮコー、和光紬薬工業(株)製)を使用
して、尿酸濃度を測定した。
結果を表3に併せて示す。
表3
表3から明らかな如く、本発明のp−フルオロアニリン
誘導体を発色試薬のカップリング成分として用いた実施
例5の測定法により得られた尿酸の測定値は、市販キッ
トを用いた従来法のそれと良い相関を示していることが
判る。
誘導体を発色試薬のカップリング成分として用いた実施
例5の測定法により得られた尿酸の測定値は、市販キッ
トを用いた従来法のそれと良い相関を示していることが
判る。
[発明の効果]
以上述べた如く、本発明は、従来同様の目的で用いられ
ていた化合物が有する問題点、即ち水、或は界面活性剤
の溶存する緩衝液中で不安定であることや、生成する色
素が比較的低波長側に極大吸収を有しているため血清や
尿等の生体試料中に共存する成分による測定値への影響
を受は易いことや、血清や尿等の生体試料中に共存する
成分の影響により、生じた色素の呈色安定性が低下する
(退色する)こと等の問題点を全て解決した新規なp−
フルオロアニリン誘導体又はその塩、及びこれを発色成
分として用いる酸化性物質の定量方法を提供するもので
あり、斯業に貢献するところ大なる発明である。
ていた化合物が有する問題点、即ち水、或は界面活性剤
の溶存する緩衝液中で不安定であることや、生成する色
素が比較的低波長側に極大吸収を有しているため血清や
尿等の生体試料中に共存する成分による測定値への影響
を受は易いことや、血清や尿等の生体試料中に共存する
成分の影響により、生じた色素の呈色安定性が低下する
(退色する)こと等の問題点を全て解決した新規なp−
フルオロアニリン誘導体又はその塩、及びこれを発色成
分として用いる酸化性物質の定量方法を提供するもので
あり、斯業に貢献するところ大なる発明である。
第1図は、実施例3に於いて得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度(mM)について得られた59
5nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 特許出願人 和光純薬工業株式会社
横軸の各過酸化水素濃度(mM)について得られた59
5nmの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 特許出願人 和光純薬工業株式会社
Claims (12)
- (1)一般式[ I ] ▲数式、化学式、表等があります▼[ I ] (式中、R^1及びR^2は夫々独立して水素原子、ア
ルケニル基又は置換基を有していてもよいアルキル基を
表わし、R^3及びR^4は夫々独立してアルコキシ基
、アルケニル基、水酸基、ハロゲン原子、スルホン酸基
、カルボキシル基、ニトロ基、アリール基又は置換基を
有していてもよいアルキル基を表わし、R^5及びR^
6は夫々独立して水素原子、アルコキシ基、アルケニル
基又は置換基を有していてもよいアルキル基を表わす。 また、R^1とR^2、R^3とR^5、R^4とR^
6とが夫々結合して環を形成していてもよい。) で示されるp−フルオロアニリン誘導体又はその塩。 - (2)発色主剤及び請求項1に記載のp−フルオロアニ
リン誘導体又はその塩を発色成分として用いることを特
徴とする酸化性物質の定量方法。 - (3)発色主剤が4−アミノアンチピリン又はその誘導
体である、請求項2に記載の定量方法。 - (4)酸化性物質が過酸化水素である、請求項2に記載
の定量方法。 - (5)ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸化発色
させてその呈色を比色定量する、請求項4に記載の定量
方法。 - (6)過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
素である、請求項4又は5に記載の定量方法。 - (7)過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
いて酵素反応により生成する過酸化水素である、請求項
6に記載の定量方法。 - (8)生体試料中の微量成分の定量が、基質又は酵素反
応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過
酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基質又
は酵素活性の定量である、請求項7に記載の定量方法。 - (9)発色主剤及び請求項1に記載のp−フルオロアニ
リン誘導体又はその塩を発色成分として用いることを特
徴とするペルオキシダーゼ様物質の定量方法。 - (10)発色主剤が4−アミノアンチピリン又はその誘
導体である、請求項9に記載の定量方法。 - (11)ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダーゼで
ある、請求項9に記載の定量方法。 - (12)ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン又はそ
の他のヘム化合物である、請求項9に記載の定量方法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2329550A JP2701090B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 被酸化性呈色試薬 |
US07/797,836 US5238818A (en) | 1990-11-30 | 1991-11-26 | Oxidizable color producing reagent |
ES91311060T ES2097798T3 (es) | 1990-11-30 | 1991-11-28 | Reactivo oxidable productor de color. |
DE69124780T DE69124780T2 (de) | 1990-11-30 | 1991-11-28 | Oxidierbares, farbproduzierendes Reagenz |
EP91311060A EP0488756B1 (en) | 1990-11-30 | 1991-11-28 | Oxidizable color producing reagent |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2329550A JP2701090B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 被酸化性呈色試薬 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04202164A true JPH04202164A (ja) | 1992-07-22 |
JP2701090B2 JP2701090B2 (ja) | 1998-01-21 |
Family
ID=18222613
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2329550A Expired - Fee Related JP2701090B2 (ja) | 1990-11-30 | 1990-11-30 | 被酸化性呈色試薬 |
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---|---|
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EP (1) | EP0488756B1 (ja) |
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DE (1) | DE69124780T2 (ja) |
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US5841838A (en) * | 1994-11-17 | 1998-11-24 | Brother Kogyo Kabushiki Kaisha | Telephone answering unit with caller identification and message recording function |
US6753159B1 (en) | 1998-08-06 | 2004-06-22 | Jin Po Lee | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
WO2000008207A1 (en) * | 1998-08-06 | 2000-02-17 | Syntron Bioresearch, Inc. | Uric acid assay device with stabilized uricase reagent composition |
JP4456715B2 (ja) * | 2000-02-28 | 2010-04-28 | 協和メデックス株式会社 | レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬 |
GB0324551D0 (en) * | 2003-10-21 | 2003-11-26 | Karobio Ab | Novel compounds |
MX2007005507A (es) * | 2004-11-12 | 2008-03-13 | Neurochem Int Ltd | Metodos y composiciones fluoradas para el tratamiento de padecimientos relacionados con amiloides. |
CN106404683A (zh) * | 2015-07-27 | 2017-02-15 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定、抗干扰性强的磷脂检测试剂及其检测方法 |
CN111537463A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-08-14 | 广东省第二人民医院(广东省卫生应急医院) | 一种定量检测血清中尿酸的方法 |
CN112485246B (zh) * | 2020-11-19 | 2024-04-26 | 重庆瑞卡威生物科技有限公司 | 一种单项上皮组织肿瘤细胞渗液游离血红素显色液 |
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---|---|---|---|---|
JPS5318559A (en) * | 1976-08-03 | 1978-02-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | N-(3,5-dichloro-4-fluorophenyl) maleimide derivatives and fungicides containing same for agriculutur and horticulture |
JPS6212761A (ja) * | 1985-07-11 | 1987-01-21 | Sumitomo Chem Co Ltd | テトラヒドロインダゾ−ル誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする除草剤 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5425892A (en) * | 1977-07-29 | 1979-02-27 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Quantitative determination of hydrogen peroxide |
US4145364A (en) * | 1977-11-30 | 1979-03-20 | Merck & Co., Inc. | Preparation of fluorinated anilines |
DE3037342A1 (de) * | 1980-01-09 | 1981-07-16 | Dojindo Laboratories, Kumamotoshi | N-sulfoalkylanilinderivate und ihre verwendung |
DE3413693A1 (de) * | 1984-04-11 | 1985-10-17 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Fluorierte anilinderivate und ihre verwendung |
EP0223977B1 (en) * | 1985-11-25 | 1990-10-10 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Colour developing method in clinical examinations |
US4937186A (en) * | 1988-01-28 | 1990-06-26 | Iqbal Siddiqi | Method for the determination of bilirubin in solution |
ES2018977A6 (es) * | 1989-11-29 | 1991-05-16 | Marga Investigacion | Procedimiento de preparacion de n-ciclopropil-4-fluoroanilinas. |
-
1990
- 1990-11-30 JP JP2329550A patent/JP2701090B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-11-26 US US07/797,836 patent/US5238818A/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-28 DE DE69124780T patent/DE69124780T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 ES ES91311060T patent/ES2097798T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-28 EP EP91311060A patent/EP0488756B1/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JPS5318559A (en) * | 1976-08-03 | 1978-02-20 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | N-(3,5-dichloro-4-fluorophenyl) maleimide derivatives and fungicides containing same for agriculutur and horticulture |
JPS6212761A (ja) * | 1985-07-11 | 1987-01-21 | Sumitomo Chem Co Ltd | テトラヒドロインダゾ−ル誘導体、その製造法およびそれを有効成分とする除草剤 |
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Publication number | Publication date |
---|---|
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DE69124780D1 (de) | 1997-04-03 |
DE69124780T2 (de) | 1997-10-16 |
EP0488756A1 (en) | 1992-06-03 |
JP2701090B2 (ja) | 1998-01-21 |
EP0488756B1 (en) | 1997-02-26 |
US5238818A (en) | 1993-08-24 |
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