JPH01104175A - 組換え精製プロテア−ゼネキシン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、心臓血管系に影響を及ぼすタンパクの組換え
生産に関する。特に１本発明は、プロテアーゼネキシン
Ｉ　　（ＰＮ−１）の種々の型をコードする遺伝子のク
ローニングおよび発現に関与する。

（従来の技術） 結合組織の細胞は、セリンプロテアーゼに特異的なプロ
テアーゼ阻害剤を分泌する。セリンプロテアーゼは細胞
の発生や移動に関与するので、これら酵素の活性の制御
は２組織の再構成または破壊について制御するのに必要
である（Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ側　Ｂｉｏｌｏ　１ｃａｌ
　Ｃｏｎｔｒｏｌ　（１９７５）、　Ｒｅ１ｃｈ＋　Ｅ
、ｌ　ｅｔａｌ、　ｅｄｓ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　、プロテア
ーゼネキシンに特異的である阻害剤は、その触媒部位で
、セリンプロテアーゼに不可逆的に３７−４５）　、そ
してリセブター媒介のエンドサイトシスやりソソーム分
解により結合したプロテアーゼの開裂を生じる（Ｌｏｗ
、　Ｄ、Ａ、、　ｅｔ　ａｌ＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ八
ｃａへ　　Ｓｃｉ　　（ＵＳＡ）　　（１９８１）　　
ヱ８　　：　　２３４０−２３４４；　　Ｂａｒｋｅｒ
。

Ｊ、Ｂ、、　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｒｅｃｅ　
ｔｏｒｓ　３　（１９８５）＋　Ｃｏｎｎ。

Ｐ、Ｍ、、　ｅｄ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、
印刷中）。

３つのプロテアーゼネキシンが同定されている。

プロテアーゼネキシンＩ　（ＰＮ−１）は、ヒトの***
細胞により調製された無血清培地から精製される（Ｓｃ
ｏｔｔ、　Ｒ，Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　
Ｃｈｅｍ　（１９８３）５８　：１０４３９−１０４４
４　）。それは、　４３ｋｄの糖タンパクであり、この
タンパクは、繊維芽細胞、筒管、心筋細胞、および脈管
平滑筋細胞により放出される。その放出は、プラスミノ
ーゲンアクチベーターの放出を伴って、ホルボールエス
テルにより、またマイトジェンにより、刺激される（Ｂ
ａｔｏｎ、　Ｄ、Ｌ、　＋　ｅｔａｌ、　Ｊ　Ｃｅ１ｌ
　Ｂｉｏｌ　（１９８３）　１２３　：　１２８）　、
天然のＰＮ−Ｉは、約６％の炭水化物を含むおよそ４０
０のアミノ酸のタンパクである。天然ＰＮ−１は血清中
には微量レベルでしか存在しないので、それは明らかに
。

間質細胞の表面で、あるいはその近くで１機能する。Ｐ
Ｎ−１は、ウロキナーゼプロ酵素、プラスミン。

トリプシン、トロンビンおよびＸａ因子の全ての公知の
アクチベーターを阻害する（Ｅａｔｏｎ、　Ｄ、Ｌ、、
　ｅｔａｌ、　Ｊ旧ｏＩ　Ｃｈｅｍ　（１９８−Ｉ）　
２５９　：　６２４１）。それはまた１組織プラスミノ
ーゲンアクチベーターやウロキナーゼを阻害する。

神経突起の促進因子（ＮＰＦ）と呼ばれるタンパクも、
神経膠腫細胞から単離され得、　４３ｋｄの分子量を有
し、そしてウロキナーゼまたはプラスミノーゲンアクチ
ベーターにより触媒されるタンパク分解を阻害すること
、が報告されている（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ。

Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　　［ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　
（１９８５）　４　：　１９６３−１９６６）。

そのタンパクは、神経芽細胞腫の神経突起派生物を誘導
すると最初に報告された（Ｂａｒｄｅ、　Ｙ、Ａ、、　
ｅｔａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７４　：
　８１Ｂ）。このタンパクのアミノ酸配列（しかし、そ
のタンパクをコードしているｃＤＮＡの配列ではない）
がＧｌｏｏｒ、　Ｓ、、　　ら。

超旦（１９８６）　４７　：　６８７−６９３に開示さ
れている。このＤＮ八とここで報告された事実との間の
いかなる関係も不確かである。ダリアのｃＤＮＡに対す
る制限地図が、ここで開示されたｃＤＮＡの制限酵素地
図とは明らかに異なるからである。このＮＰＦタンパク
は、１８アミノ酸のＭｅｔに続くシグナルにより生じる
３７９アミノ酸配列である。それは、成熟タンパクのア
ミノ酸の位置２４１において、ここで開示されたＰＮ−
１βとは異なる。

精製されたＰＮ４の実際的な必要量は数倍である。

まず、　ＰＮ−Ｔは、ウロキナーゼや組織プラスミノー
ゲンアクチベーターの過剰量により特徴づけられた条件
に対する薬剤として、または血液凝固の溶液の試薬とし
てのこれら酵素の過剰用量に対する解毒剤として、明白
な用途がある。ＰＮ−ｒ処理に明らかに感受性のある指
標には、ふつう犬がかかる自己免疫病ペンフィガス（ｐ
ｅｎｐｈｉｇｕｓ）　、およびプラスミノーゲンアクチ
ベーターの過剰生産によると考えられる乾廚、が含まれ
る。２番目には１組織形成や再構成の種々の発生段階を
調節するＰＮ−Ｉの役割が比較的複雑であるため、　Ｉ
’Ｎ−Ｉの果たす役割をより詳しく識別するために、モ
デル系を使用し得ることが望ましいだろう。実際的な定
量が利用可能ならば、このことは単に効果的になされ得
る。最後に、　ＰＮ−１は、血清中または他の組織中の
免疫レベルの分析、または他の生物学的分析、のための
免疫学的分析における分析試薬として有用である。

ＰＮ−１の役割のさらなる研究が望ましい状態の例には
、腫瘍転移、傷の治癒、および潰瘍である。

ＩＩＩ瘍転移において、悪性細胞は、脈管の平滑筋細胞
が並んでいる細胞外マトリックスを通り抜けねばならな
い。その過程は２分泌されたプラスミノーゲンアクチベ
ーターにより媒介される。Ｊｏｎｅｓ。

Ｐ、八、、　　ｅｔ　　ａｌ、　　　Ｃａｎｃｅｒ　　
Ｒｅｓ　　（１９８０）　　４０　　：　　３２２２　
　のモデル系（これは、ヒトの繊維芽細胞による細胞外
マトリックスの侵入に基づくインビトロの系である）で
は、０．１μ門のＰＮ−１は、その侵入をほぼ完全に抑
制することが示された（Ｉｌｅｒｇｍａｎ、　Ｂ、Ｌ、
＋ｅｔ　　ａｔ、　　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　八ｃ
ａｄ　　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ　　（１９８６）　　）　　
、　　傷の治癒において重要な繊維芽細胞のマイトジェ
ンであるトロンビンのタンパク分解活性は２分泌された
ＰＮ−Ｉの濃度以上の濃度でトロンビンを培養物に加え
たときにのみ有効である（Ｂａｒｋｅｒ＋　Ｊ、Ｂ、＋
ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ　Ｃｅ旦」立旦ｏ１　（１９８２）
■２　：　２９１：　Ｌｏｗ。

Ｄ、Δ、、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８
２）　２９８　：　２４７６）　、　ＰＮ−Ｉは抗炎症
性機能を有することが示唆されている。

層膜の繊維芽細胞によるＰＮ−１の分泌が、インターロ
イキン１で細胞を処理すると、著しく増加するからであ
る（Ｋｒａｎｅ、　Ｓ、＋　　八ｒｔｈ　Ｒｈｅｕｍ　
拝ト→２７　：５２−Ｉ）。ＰＮ−１は神経学的機能を
も有するかもしれない。上で述べた同様のプロテアーゼ
阻害剤は、神経突起の伸長を刺激するからである（Ｍｏ
ｎａｒｄ　ｅｔａｔ、　Ｐｒｏ　　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ
　（１９８３）　５８　：　３５９）。

前述のどれにおいても、　ＰＮ−１の正確な機能の解明
は、純粋な物質の必要量を入手できれば、非常に簡単に
なるだろう。このような量は、また、薬剤として、およ
び診断や分析の際に、　ＰＮ−Ｉ中に用いるのにも必要
である。本発明は、　ＰＮ−Ｉの充分な量を得ることの
問題点の解決、およびその解決をより効果的にするため
にｌ’Ｎ−ｒの構造を修飾する機構を提供する。

（発明の要旨） 本発明は１組換え型を含む高度に精製したＰＮ−１タン
パク、配列をコードするＤＮＡ　、発現系、および組換
え哺乳類ＰＮ−Ｉを生産する方法を提供する。

ｒ’Ｎ−１の２つの代表型が開示されている。

本発明の組換えＤＮＡは、補乳頻プロテアーゼネキシン
Ｉ　（ＰＮ−１）をコードする組換えＤＮＡであって、
該ＰＮ−ＩをコードするＤＮＡと関連したもとのＤＮＡ
配列を含まない。

本発明のＰＮ−１の調製方法は、咄乳頚プロテアーゼネ
キシンＩ　（ＰＮ−１）をコードする組換えＤＮＡであ
って、該ＰＮ−１をコードするＤＮＡと関連したもとの
ＤＮＡ配列を含まない組換えＤＮＡがトランスフェクト
された組換え宿主細胞を培養すること、および該培養物
からＰＮ−Ｉを回収すること、を包含する。

本発明のＰＮ−１は、上記方法により調製される。

本発明のプロテアーゼネキシン■は１通常、結合してい
る不純物を含まず、グリコシル化されたとき４３ｋｄの
分子量を有し、かつＮ−末端配列：　５ｅｒ−１１ｉｓ
　−Ｐｈｅ−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｙ−５ｅｒ−
八５ｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−八ｓｎ−Ｇｌｎ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−３ｅ
ｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−旧５−Ａ５ｐ−Ａｓｎ−１１ｅ−
Ｖａｌ−１１ｅを有し、そして重量で約２．３％のアミ
ノ糖、約１．１％の中性糖、および約、３．０％のシア
ル酸を含む。

本発明の天然ＰＮ−１の精製方法は、　ＰＮ−１を含む
培地を、固体支持体に結合したヘパリンを用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーにかけること。

次いでゲル濾過クロマトグラフィーを施すこと。

を包含する。

本発明の抗体は、上記ＰＮ−Ｉの調製方法または上記天
然ＰＮ−１の精製方法に従い調製されたＰＮ−１と免疫
反応性であり、そして哺乳動物の免疫に応じて形成され
る。

これらの物質および方法を用いることにより。

このＰＮ−１タンパクの所望量が、　ＩＪｉ化された型
、または、糖化されていない型のいずれかで、生産され
得る。この量は、用いた発現系に依存する。この遺伝子
は、もし望むなら、タンパクの所望の特性を高めるため
に、正確なアミノ酸配列を変えるべく、修飾され得る。

このことは、ヒトＰＮ−Ｉをコードする遺伝子を入手す
ることを通して、全く可能である。この遺伝子は、対応
するＰＮ−１を生産するのに直接的に有効であり１種々
の種のこれらの遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を得る
ためのプローブとしても有効である。

２つの非常に関連したＰＮ−１タンパクをコードするヒ
トの遺伝子を、以下に例示する。他の種のＰＮ−１をコ
ードするＤＮＡの探索も望ましい。ネズミのタンパクを
コードするＤＮＡは特に望ましい。このような因子の役
割の詳しい解説を提供するための多くのモデル系が、ネ
ズミ細胞９組織、または全体組織に、うまく基づいてい
るからである。

それゆえ、ある局面では１本発明は補乳頚ＰＮ−１をコ
ードするＤＮＡ配列、およびその誘導体に関する。その
誘導体は、　ＰＮ−Ｉ活性のあるタンパクを得るように
発現され得る。他の局面では２本発明は。

これらＤＮＡ配列で形質転換された細胞に関し、そして
これらの細胞により生産されたＩ’Ｎ−１タンパクに関
する。さらに２本発明は、ここで開示された天然タンパ
クのＮ末端配列を有する精製されたタンパクに関し２組
換え体または精製された天然タンパクの投与により調製
された抗体に関し、そしてＰＮ−１ｃＤＮＡを探索でき
るＤＮＡプローブに関する。

零　Ｂを　　する　工 Ａ、ｎ ここで用いられるように、「プロテアーゼネキシンＩ　
Ｊ　　（ＰＮ−１）は、　ｒ’Ｎ−１に対する標準的な
診断上の検定において活性なタンパクを示す。この検定
は、以下のような４つの基準に基づいている：（１）こ
のタンパクがトロンビンと複合体を形成する；（２）こ
の複合化は、ヘパリンによって促進される；（３）この
タンパクは、その由来の細胞２例えば、以下に例示の繊
維芽細胞、と結合する；そして（−Ｉ）ヘパリンは、こ
の結合を阻害しなければならない。

ＰＮ−１は、他の２つのプロテアーゼネキシン因子。

ＰＮ−ＩＩおよびＰＮ−１１（Ｋｎａｕｅｒ＋　Ｄ、Ｊ
、、　ｅｔ　ａｌ、　　ＪＢｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９
８２）２５７　：　１５０９８−１５１０−Ｉ）と区別
される。これらもまた、主要なトロンビン阻害物質であ
るが、このプロテアーゼにはそれほど強く結合しない。

「制御配列」とは、所望のコード配列とうまく連結され
たとき、このような配列と和合可能な宿主中で、その発
現を生じ得るＤＮ＾配列を示す。このような制御配列に
は、原核生物宿主および真核生物宿主中でのプロモータ
ーが少なくとも含まれ。

好ましくは、転写終結シグナルが含まれる。発現を生じ
るのに必要かまたは役に立つ付加的な因子も、同一視さ
れ得る。ここで用いられるように。

「制御配列」とは、単に、用いられる特定の宿主におい
て１発現を生じるのに必要な全てのＤＮＡ配列を示す。

「細胞」または「細胞培養」、または「組換え宿主細胞
」または「宿主細胞」は１文脈から明らかなように、し
ばしば、交換可能に使用される。

これらの用語には、直接の対象となる細胞、および、も
ちろんその子孫の細胞が含まれる。突然変異または環境
の変化に出くわすために、すべての子孫が、親細胞と正
確に同じとは限らないことは。

明らかである。しかしながら、天然に形質転換された細
胞に与えられる特性と関連した特性を子孫が保持する限
り、このような変化した子孫はこれらの用語に含まれる
。本件の場合では９例えば。

このような特性は２組換えＰＮ−１を生じる能力であろ
う。

「精製された」または［純粋なｊとは１本来の状態で見
出されたとき９通常、それに付随した物質を含まない材
料を示す。それゆえ、「純粋な」ｒ’Ｎ−ｒをコードす
るＤＮＡとは、その本来の環境から単離された状態で見
出され１本来ＰＮ４を生成する細胞により１通常産生さ
れる他のタンパクをコードしたＤＮ八に付随していない
ＤＮＡを指す。「純粋なＪ　ＰＮ−１とは、ヒトまたは
他の哺乳類組織にて。

もとの環境と通常付随している材料を含まないＰＮ−Ｉ
を指す。もちろん、「純粋なＪ　ＰＮ４には、グリコシ
ド残基または２例えば、治療上の処方に導入される材料
のような、共有結合で結合している材料を含み得る。「
純粋な」とは、言及される物質が。

本来の環境、および通常その環境に伴う材料から単離さ
れ得るか、または単離されている状態を単に示す。

もちろん、精製され１通常それに付随した物質を含まな
いが、　ＰＮ−１をコードするように、ここで請求され
るＤＮＡには１例えば、以下のコード配列の５゛末端お
よび／または３°末端の付加配列を含み得る。このコー
ド配列は、このＤＮ八がｃＤＮパライブラリ−に由来す
るとき、メツセンジャーＲＮＡの非コード部分の逆転写
から生じるか、または成熟タンパクをコードする配列だ
けでな（シグナル配列のための逆転写産物を含むだろう
。

ＤＮＡ配列に述べられるように、「〜と縮重」とは、参
照されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列のことを言う。

「動作可能に連結された」とは、構成物が、それらの通
常の機能を達成するように配列されたような並置状態の
ことを言う。それゆえ、コード配列に動作可能に連結さ
れた制御配列またはプロモーターは、このコード配列の
発現を生じ得る。

Ｂ、二殿方屋記述 マイクロキャリアー培養中の、ヒト***繊維芽細胞によ
り調製された無血清培地から、ヘパリン−アガロースの
アフィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過ク
ロマトグラフィーにより。

ＰＮ−Ｉを均一になるまで精製した。このことは、　５
ｃｏｔｔ。

Ｒ，Ｗ、、　　ら、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９
８５）　２６０　：　７０２９−７０３４に詳細に記述
され、その内容はここに示されている。もちろん、アフ
ィニティー結合のためにヘパリンを含む他のクロマトグ
ラフィー支持体も使用可能である。この精製されたタン
パクは、沈降平衡分析に基づく４２〜４３ｋｄのし、ま
たはゲル濾過クロマトグラフィーで算出される４７ｋｄ
のＭ、を示す。この精製された材料は、調製された培地
中に含まれるとき、ＰＮ４の特性を示す。この特性には
。

トロンビン、ウラキナーゼおよびプラスミンとのドデシ
ル硫酸ナトリウムに安定な複合体の形成；プロテアーゼ
活性の阻害：ヘパリンにより増幅されるトロンビン阻害
；およびヘパリン怒受性反応でのプロテアーゼ−ＰＮ複
合体の細胞結合が含まれる。この精製された天然のタン
パクは、２．３％アミノＦ、１．１％中性糖、および３
．０％シアル酸を有するおよそ６％の炭水化物を含んで
いた。単離され精製されたプロテアーゼネキシンのＮ末
端アミノ酸配列は、最初の３４アミノ酸が、　５ｅｒ−
Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−八５
ｎ−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−１１ｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａ　１
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｇ１　ｎ−Ｉ　１　ｅ−Ｖａ　ｌ−
Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ｒ’ｒｏ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
Ａｓｎ−１１ｅ−Ｖａｌ−１１ｃと決定された。

完全なヒトＰＮ−１タンパクをコードするｃＤＮＡは。

***繊維芽細胞ＤＮ＾ライブラリーから得られた。

このクローンの検索には、天然のタンパクで決定された
アミノ酸配列に基づくプローブを利用した。

このクローン化されたｃＤＮ＾は、上述のように、原核
生物の生体および真核生物の生体の両方の組換え細胞中
で、キャリアーベクターからコード配列を切断すること
、および適当な発現系にそれを連結することにより９発
現を受けた。ＮｅｔのＮ末端アミノ酸（こ糺は２発現系
の選択により、プロセッシングされるかまたはされない
）で始まる成熟タンパクは、所望の全ての追加Ｎ末端ま
たはＣ末端配列に対する融合タンパクとして生産され得
るか、またはシグナル配列、それ自体、または異種の配
列（これは１例えば、バクテリアのβ−ラクタマーゼ遺
伝子と関連するかまたは、インシュリン、成長ホルモン
のような分泌されるヒト遺伝子と関連した公知のシグナ
ル配列により供給される）で始まる場合は、成熟タンパ
クとして分泌され得るので、このＰＮ−１は直接に産生
され得る。部位特異的な変異操作により、所望のコード
配列に関して、適当な位置に適当な制限部位を与える手
段は。

よく知られており、それゆえ、このコード配列は。

シグナル配列または融合配列への連結のための適切な部
位とともに、または発現ベクターの中に供給され得る。

もしバクテリア宿主が選択されるなら、グリコシル化さ
れていない形でタンパクが産生されるであろう。もし、
このＰＮ−１が細胞内で「成熟」タンパクとして産生さ
れるなら、このＮ末端メチオニンは９部分的にだけプロ
セッシングされるか、または全くプロセッシングされな
いだろう。それゆえ、生産されたタンパクは、Ｎ末端Ｍ
ｅｔを含み得る。細胞内で、または、このようなバクテ
リアの宿主が分泌された状態、のいずれかで生産された
タンパクの修飾は、多糖基質を供給すること、ジスルフ
ィド結合を切断し再生する技術、または他の翻訳後のエ
クスビボプロセッシング技術を用いて再生することによ
りなされ得る。もしこのタンパクが、咄乳頚または他の
真核細胞宿主内で生産されるなら、この細胞のグリコシ
ル化された形のタンパクが生産される。

この組換え細胞は１問題の宿主に適した条件下で培養さ
れる。そして、このタンパクは、細胞ライゼートまたは
培地から２発現様式で決定されるように１回収される。

このタンパクの精製は、　Ｓｃｏ　ｔ　ｔ　。

Ｒ，Ｗ、、　ｅｔ　ａｌ＋　　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ
　　（前出）によって開示の方法と同様の方法を用いて
、または他の当該技術分野に公知の方法により達成され
る。

この精製されたタンパクは、その適用に応じて処方され
る。薬学上の適用に関しては、このタンパクは、標準的
な賦形剤を用いる組成物に処方される。このことは、当
業者に良く知られており。

例、ｔ　ハ、　ル」頂■士す’ｓ　Ｐｈａ工叩旦鼎１兵
旦Ｉｓ劇至厖逓シュ１ａｔｅｓｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍ
ａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　　
Ｅａｓｔｏｎ＋ＰＡ、に開示されている。もし１診断ま
たは免疫検定に用いるなら、このタンパクは、放射活性
腫（例えば、蛍光マーカー）を用いて標識され得る。

抗体調製物を得るのに使うなら、このタンパクは。

適当なアジュバントとともに注射用に調製される。

本発明の組換えタンパクを、所望の用途に従って修飾す
る方法は、当該分野で６熟練した技術により、一般に明
らかである。

ＰＮ−Ｉの２つの形、ＰＮ４αおよびＰＮ−１βを以下
に例示する。これらは高い相同性があり、成μ）タンパ
クにそれぞれ３７８アミノ酸および３７９アミノ酸を含
み、３１０の位置（ここでは、　ＰＮ−１αのＡｒｇが
ＰＮ−ＩβのＴｈｒ−Ｇｌｙと置き換わっている）だけ
が違う。両方ともＭｅｔで始まる１９アミノ酸シグナル
を有する。このＮ末端の位置は、配列決定された本来の
タンパクから推定され、それは、かなり確実に正しいと
思われる。しかしながら、違うプロセッシング部位（１
つまたは複数）も有用であり得る可能性は、少しある。

Ｃ，ＪＩＬ；１汰 細胞を形質転換すること、ベクターを構築すること、メ
ツセンジャーＲＮＡを抽出すること、　ｃＤＮＡライフ
゛ラリ−を８用型すること、などに用いられるほとんど
の技術は、当該分野において広〈実施されており、また
ほとんどの従事者は、特定の条件や手段についての標準
的な原材料に精通している。

しかしながら３便宜上、以下の節はガイドラインとして
役立つであろう。

Ｃ１１，主および　′配置 原核細胞系および真核細胞系の両方の系は２本発明のＰ
Ｎ−１をコードする配列の発現に用いられ得る。もちろ
ん、原核細胞宿主が、クローニング手段として最も好都
合である。最もよく用いられる原核細胞は工１之ヱ　２
ｉ（Ｅ、　　ｃｏｌｉ）の種々の株に代表される。しか
し、他の微生物株もまた用いられ得る。この宿主と和合
可能な種に由来の複製部位２選択マーカーおよび制御配
列を含むプラスミドベクターが用いられる。例えば、エ
セリ之ヱ　ユニは、典型的には、　ｐＢＲ３２２，（こ
れは工セリシア　ユニ種からポリバールらによって得ら
れたプラスミド（Ｂｏｌｉｖａｒ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｇ
ｅｎｅ　（１９７７）２　：　９５）である）の誘導体
を用いて、形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシ
リンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含む
。それゆえ、これは、所望のベクターを構築する際に、
保持されるかまたは破壊され得る多様な選択可能マーカ
ーとなる。通常用いられる原核細胞の制御配列（これは
転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレ
ーター、リボゾーム結合部位配列とともに含むように、
ここで定義されている）は、β−ラクタマーゼ（ペニシ
リナーゼ）とラクトース（Ｉａｃ）とのプロモーター系
（Ｃｈａｎｇ、　ａｔ　ａｌ＋　Ｎａｔｕｒｅ（１９７
７）　１９８　：　１０５６）、　　トリプトファン（
ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａ
ｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８０
）　８　：　４０５７）、およびラムダ由来のＰＬプロ
モーターおよびＮ遺伝子リボゾーム結合部位（Ｓｈｉｍ
ａｔａｋｅ。

ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２
　：　１２８）のような通常用いられるプロモーターを
含む。

バクテリアに加えて、酵母のような真核微生物もまた。

宿主として用いられ得る。研究室用の株サツカロマイセ
ス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）　　（パン酵母）がもっともよく用いら
れる。しかし、他の多くの株や種も通常利用可能である
。ベクターとしては１例えば、　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ。

Ｒｏの２μ複製オリジン（Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８
３）　１０１　：３０７）　、または酵母に和合可能な
複製オリジン（例えば、　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ、　ｅ
ｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７９）　２８２　
：３９、　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ、　Ｇ、、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｇｅｎｅ　（１９８０）　１０　：　１５７および
Ｃ１ａｒｋｅ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｍｅｔｈ　Ｅ
ｎｚ　（１９８３）　１０し：３００を参照）を用いる
ベクターが使用可能である。

酵母ベクターのための制御配列には９解糖酵素の合成の
ためのプロモーター（ｔｒｅｓｓ、　ｅｔ　ａｌ、　　
Ｊ　Ａｄｖ且互匹」皿（１９６８）　７　：　１４９＋
　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　（１９７８）　１７　：　
４９００）が含まれる。当該分野で公知の付加的なプロ
モーターとしては。

３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター（ｔ（
ｉｔｚｅｍａｎ、　ｅｔ　ａｔ、　　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃ
ｈｅｍ　（１９８０）　２５５　：２０７３　）が含ま
れる。他のプロモーター（これらは。

生育状態および／または遺伝的背景によって転写が制御
されるといった付加的利点を有する）は。

アルコールデヒドロゲナーゼ２．イソチトクロームＣ２
酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ア
ルファ因子系、およびマルトースやガラクトース資化に
関与する酵素、に対するプロモーター領域にある。ター
ミネータ−配列としては、また、このコード配列の３゛
末端が望ましいと考えられる。このようなターミネータ
−は、酵母由来の遺伝子中における。このコード配列に
続く３”非翻訳領域に見い出される。

もちろん、真核宿主細胞の培養物中にてポリペプチドを
コードする遺伝子（これは多細胞生物の組織に由来する
）を発現させることも可能である。

例えば、八ｘｅｌら、米国特許第４，３３９，２１６を
参照せよ。これらの系は、イントロンをスプライスでき
るという付加的な利点を有し、それゆえ、ゲノム断片を
発現させるべく直接用いられ得る。有用な宿主細胞系に
は、　ＶＨＲＯ細胞およびＩＩ　ｅ　Ｌ　ａ細胞、そし
てチャイニーズハムスター卵巣（ＣＩＩＯ）Ｉｌｌ胞が
含まれる。このような細胞のための発現ベクターには。

哺乳動物細胞と和合可能なプロモーターおよび制御配列
、シミアンウィルス４０　（Ｓｉｍｉａｎ　Ｖｉｒｕｓ
　４０＋ＳＶ　４０）からの通常用いられる初期プロモ
ーターおよび後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓ、　ｅｔ　
ａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７８）　２７３　：　１
１３）、　または他のウィルスプロモーターが含まれる
。他のウィルスプロモーターには。

例えば、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２（Ａｄ
ｅｎｏｖｉｒｕｓ　２　）　＋　ウシ乳頭腫ウィルスま
たはトリ肉腫ウィルスに由来のウィルスがある。制御可
能なプロモーターｈＭＴＩＩ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｌｌ　
ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）　２敦：　７
９７−８０２）もまた用いられ得る。哺乳動物の細胞宿
主系の形質転換についての一般的な局面は、　Ａｘｅｌ
　（前出）によって記述されている。

最適な発現には、“エンハンサ−′′領領域重要である
こともまた。現在明らかである。これらの領域は、一般
に、非コードＤＮＡｊＩ域において、プロモーターの上
流側あるいは下流側に見出される配列である。もし必要
であれば、複製のオリジンがウィルス源から得られる。

しかしながら、この染色体への組込みは、真核生物での
ＤＮＡ複製と共通の機構である。

Ｃ０２０皿互伝■ 用いられる宿主細胞に依存して、形質転換は。

このような細胞に適する標準的な方法を用いて行われる
。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、により記述されるような塩化
カルシウムを使用するカルシウム処理法（Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　
（ＵＳＡ）　（１９７２）　６９　：　２１１０）また
は、　Ｍ３１ｉａｔｉｓ＋　　ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍ
ａｎｕａｌ　（１９Ｂ２）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ＋　ｐ、２５４やＨａｎａｈａ
ｎ＋　ｏ、、　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８３）皿
：　５５７−５８０に記述されるＲｂＣ１ｚ法は、原核
生物細胞、または堅固な細胞壁の障壁を含む他の細胞に
用いられ得る。このような細胞壁をもたない哺乳動物細
胞には、　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ。

ｎ皿且■（１９７８）　５２　：　５４６のリン酸カル
シウム沈澱法や、必要に応じて、　Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ
、、　　ら、超旦（１９７９）　１６　：　７７７−７
８５によるその改変法が用いられ得る。酵母への形質転
換は、　Ｂｅｇｇｓ＋　Ｊ−Ｄ−＋の方法（Ｎａｔｕｒ
ｅ　（１９７８）　２７５　：　１０４−１０９）また
は旧ｎｎｅｎ。

Ａ、、らの方法（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　（ＵＳＡ）　（１９７８）７５１９２９　）に従っ
て行われ得る。

Ｃ０３，丘え叉二盪築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクター
の構築には、当該技術分野でよく知られている標準的な
連結方法および制限方法が使用される。単離されたプラ
スミド、　　ＤＮＡ配列または合成オリゴヌクレオチド
は、開裂され、仕立てられ。

所望の形状に再結合される。

このベクターを構成するＤＮＡ配列は、多数のソースか
ら入手可能である。バックボーンとなるベクターおよび
制御系は、構築の際に大部分の配列を使用する適当な“
宿主°°ベクターに２−船釣に見出される。典型的な配
列は上の０．１．に述べている。適当なコード配列のた
めに、最初の構築は、　ｃＤＮパライフ゛ラリ−または
ゲノムＤＮＡライフ゛ラリ−から適当な配列を回収する
ことであり得、ふつうはそうである。しかしながら、こ
の配列が一旦現れると、この個々のヌクレオチド誘導体
から開始するインビトロでの全遺伝子を合成することが
できる。例えば、５００〜１０００ｂｐの相当の長さの
遺伝子に対する全遺伝子配列は９個々のオーバーラツプ
している相補的なオリゴヌクレオチドを合成すること、
およびデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下にて
ＤＮＡポリメラーゼを用いる一本鎖の標準的な非オーバ
ーラツプ部分を埋めること、により調製される。この方
法は、公知の配列のいくつかの遺伝子の構築に有効に用
いられている。例えば、　Ｅｄｇｅ、　Ｍ、　Ｄ、、Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９８１）　２９２　ニア５６　；　Ｎ
ａｍｂａｊｒ、　Ｋ、　Ｐ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　（
１９８−Ｉ）　２２３　：１２９９　；　Ｊａｙ、　Ｉ
Ｅｒｎｅｓｔ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩＩｌ（１９８
−Ｉ）　２５９　：６３１１を参照せよ。

合成オリゴヌクレオチドは、　Ｅｄｇｅら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　（前出）やＤｕｃｋｗｏｒ　ｔｈら、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）β−：　１
６９１に記述のようなホスホトリエステル法。

または、　Ｂｅａｕｃａｇｅ、　Ｓ、Ｌ、、およびＣａ
ｒｕｔｈｅｒｓ＋　Ｍ。

Ｈ，、Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ　（１９８１）　２２：１８
５９およびＭａｔｊｅｕＣＣ１＋Ｍ、Ｄ、、およびＣａ
ｒｕｔｈｅｒｓ　Ｍ、Ｈ，、Ｊ　Ａｍ　ＣｈｅＩＩＩＳ
ｏｃ（１９８１）１０３　：　３１８５に記述のような
ホスホラミダイト法のいずれかによって調製される。こ
のオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能な自動オリ
ゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得る。アニー
リングに先立って、または標識化のための一本鎖のキナ
ーゼ化は、５０ｍＭ）リス（ｐＨ７，６）　、　１０ｔ
ａｎＨｇｃ１ｚ＋　５ｔａＭジチオトレイトール、　　
１〜２ｍＭ　ＡＴＰ。

１．７ｐｍｏｌ　１　”Ｐ−ＡＴＰ（２，９ｍＣ１／ｍ
ｍｏｌｅ）、　０．１ｍＭスペルミジン、　０．１ｍＭ
　ＥＤＴＡの存在下にて、過剰量（例えば、　　ｌｎｍ
ｏｌ基質に対して約１０ユニツトのポリヌクレオチドキ
ナーゼ）を用いて達成される。

所望のベクターの成分がいったん入手できると。

その成分は、標準的な制限手順および連結手順を用いて
切断され、また連結され得る。

部位特異的なりＮＡ開裂は、当該技術分野で一般に知ら
れている条件下にて、および商業的に入手可能な制限酵
素の製造者により特定される事項に基づいて、適当な制
限酵素の処理により達成される。例えばＮｅｗ　Ｅｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔ
ａｌｏｇを参照せよ。一般に、約１μｇのプラスミドま
たはＤＮ＾配列は、約２０μｌの緩衝液中の１ユニツト
の酵素で切断される；ここでの実施例では、典型的には
、このＤＮＡ基質の完全な分解を保証するべく、過剰な
制限酵素が用いられる。約３７°Ｃで約１〜２時間のイ
ンキュベーション時間が使用可能である。しかし、変動
は無視され得る。各インキュベーション後、フェノール
／クロロホルムで抽出スることにより、タンパクが除去
される。次いで。

このタンパクはエーテル抽出にかけられ、エタノールで
沈澱させることより、核酸が水性画分から除去され得る
。もし望むならば、開裂された断片の大きさによる選別
が、標準的な方法を用いるポリアクリルアミドゲルまた
はアガロースゲル電気泳動により達成され得る。大きさ
による選別の一般的な記述は、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　　（１９８０）　６５　：４９９
−５６０に見出される。

制限酵素で開裂された断片は、５０ｍＭ）リス（ｐ）Ｉ
７．６）　、　５０ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ＭｇＣ１
ｇ、　　６ｍＭ　ＤＴＴおよび０．１〜１．ＯｍＭ　ｄ
ＮＴＰ中で、　２０〜２５°Ｃで約１５〜２５分間のイ
ンキュベーション時間を用いて、４つのデオキシヌクレ
オチド三リン酸（ｄＮＴＰ’）存在下にて。

エセリシア　ユｆｉＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片
（クレノー）で処理することにより、平滑末端化され得
る。たとえ４つのｄＮＴＰが存在しても、クレノー断片
は、５”−末鎖突出部を満たすが、突き出た３′−本積
を削る。もし望むなら、この突出部の性質から指示され
る制限内で、　ｄＮＴＰの１つだけあるいは選択された
ｄＮＴＰを与えることにより２選択的な修復が達成され
得る。クレノー処理後、この混合物は、フェノール／ク
ロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿される。Ｓ１
ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１を用いる適当な条件で
の処理により。

いずれの−本鎖部分も加水分解される。

以下の標準的な条件および温度下にて、１５〜５０μｌ
の容量で連結が行われる：この条件は１例えば、２０ｍ
Ｍトリス−１１ｃＩ　（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭ　
ＭｇＣｈ、　１０ｍＭ　ＤＴＴ、　３３μｇ／ＩｎＩＢ
ＳＡ、　１０〜５０ｍＭ　ＮａＣ１，および４０μＭ　
ＡＴＰ、　０．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｓｓ）ユニッ
トＴ、　ＤＮＡリガーゼをＯ″Ｃにて（“粘性末端°”
連結）または１ｍＭ　ＡＴＰ、　　０．３〜０．６　（
Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ、　ＤＮＡリガーゼを１４°Ｃ
にて（“平滑末端“連結）のいずれかである。分子間“
粘性末端”連結は、ふつうは。

３３〜１００μｇｌｒｄ全ＤＮＡ濃度（５〜１００１Ｍ
の全末端濃度）で行われる。分子間平滑末端連結は、１
μＮの全末端濃度で達成される。

“ベクター断片”°を使用するベクター構築において、
５′リン酸塩を除去し、かつベクターの自己連結を妨げ
るために、このベクター断片は９通常。

細菌のアルカリホスファターゼ（１３ＡＰ）または子牛
の腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理される
。ベクター１μｇ当り約１ユニツトのＢＡＰまたはＣＩ
Ｐを用い、約１０ｍＭ　）リス−ＩＣ１，１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ中にて、　ｐＨ８，６０°Ｃで約１時間にわたり分
解が行われる。この核酸断片を回収するために、この調
製物は、フェノール／クロロホルムで抽出され、エタノ
ールで沈殿される。他方、追加の制限酵素分解および不
要な断片の分離によって２重に切断されたベクターでは
、再結合が妨げられ得る。

配列の修飾を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに
由来のベクターの部分には、突然変異を導く部位特異的
なプライマーが用いられ得る（　Ｚ　ｏ　１１　ｅ　ｒ
　＋Ｍ、Ｊ、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｍ、　　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８２）１０　：　６
４Ｂ？−６５００およびＡｄｅｌｍａｎ、　Ｊ、Ｐ、ら
韮（１９８３）２　：　１８３−１９３）。これは、制
限されるミスマツチや所望の変異の表出のため以外は、
突然変異され得る一本鎖ファージｌ１ｉＮＡに相補的な
プライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて２行われる
。要約すれば、この合成オリゴヌクレオチドは、このフ
ァージと相補的な鎖の合成を行うためのプライマーとし
て用いられる。得られた一部または全部が二本鎖のＤＮ
Ａは、ファージを支持する宿主細菌中に形質転換される
。この形質転換された細菌の培養物は寒天上に置かれ、
このファージを含む１個の細胞からプラークを形成させ
る。

理論的には、新しいプラークの５０％は一本鎖として変
異型を有するファージを含むだろう：５０％１よオリジ
ナルな配列を有するだろう。キナーゼ化された合成プラ
イマーとのハイブリダイゼーション後、得られたプラー
クは、以下の洗浄温度で洗浄される。この洗浄温度では
、正確な適合による結合を可能にするが、オリジナル鎖
との不適合（ミスマツチ）があれば結合を妨害するよう
な十分な温度である。このプローブとハイブリダイズさ
れるプラークは２次いで１選択され９培養され。

そしてＤＮＡが回収される。

Ｃ１４，構築■鑑皿 ベクターの構築の確認のため、または他の配列化のため
に、　　ＤＮＡがまず増幅され単離される。この単離さ
れたＤＮＡは、制限酵素で分析され、および／または以
下のダイデオキシヌクレオチド法により、配列決定され
る。この方法とは、　Ｍｅｓｓｉｎｇら　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８１）　９　：３０９
によってさらに記述されたＳａｎｇｅｒ、　Ｆら、　Ｐ
ｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　（ＵＳＡ）　（１
９７７）　　７４　：　５４６３の方法またはＭａｘａ
ｍら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｎｏ　　
　（１９８０）　　６５　：　４９９の方法である。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は９例証を目的とし１本発明を限定するも
のではない。ある局面では、この実施例は、所望ｃＤＮ
Ａ配列を検索する方法を詳細に述べる。

しかしながら、この過程は、繰り返される必要はない。

このＰＮ−ＩαクローンおよびＰＮ−Ｉβクローン中へ
の挿入物のコード領域のための完全なりＮＡ配列を、第
３図および第４図に示す。標準的な合成方法は、これら
正確な配列、または交互のコドンを使用する等価で縮重
した配列のいずれかを構築するべく用いられ得る。この
長さのＤＮＡ配列の合成は、現在、技術的にほぼ型には
まっている。例えば、　Ｅｄｇｅら、　Ｎａｔｕｒｅ　
（１９８１）　２９２　：　７５６を参照せよ。さらに
、　１９８６年６月４日に、出願人は、メリーランド州
、ロックウィルのアメリカン　タイプ　カルチャー　コ
レクションに、　ＡＴＣＣＮｏ、　４０２３８を有する
λｇ　ｔｌＯファージのＰＮ−１８クローンを寄託して
いる。これは、　ＰＮ−１αのための、適切なコード配
列を含む。このコード配列は、生体物質から出発して操
作され得る。このＰＮ−Ｉβ配列は１部位特異的な突然
変異誘発を用いて容易に得られうる。

ＰＮ−１は、　５ｃｏｔｔ、　Ｒ，Ｗ、　＋ら、　Ｊ　
Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８５）（前出）に記述のよ
うに、無血清条件下の培地から調製された。要約すると
、この回収された培地は、４５μミリポアフィルタ−を
通して濾ゝ過され。

そしてこのタンパクは、アミコンホロー繊維濾過により
、濃縮された。単一の３１２の微粒子担体培養物から濃
縮した培地は、　　０．７Ｘ３０ｃｍのヘパリン−アガ
ロースカラムに通して、リン酸塩緩衝液中の０．３Ｍ塩
化ナトリ゛ウム中であらかじめ平衡化し、リン酸塩緩衝
液中の１．０Ｍの塩化ナトリウムで溶出′した。ここで
、リン酸塩緩衝液は、ともに０．０２％のアジ化ナトリ
ウムを含んでいた。溶出物が、　０．５５−０．６Ｍ塩
化ナトリウム中で得られた。このＰＮ−Ｉを含む両分は
、透析により濃縮され２次いで、　　０．５Ｍ塩化ナト
リウムを含むカラム緩衝液に１ｄあたり１〜２ｍｇＰＮ
−１を透析させることにより、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーにかけた。そして、この両分をｌＸ６０ｃｍのＢｔ
ｏ−Ｇｅｌ　Ｐ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　１００−２
００メツシユ）カラムに適用し、そしてカラム緩衝液で
溶出させた。このピークの両分を、１ｍ２まで濃縮し、
そして−８０°Ｃで貯蔵した。このアミノ酸配列および
糖成分を、この精製された物質で決定した。

最初の３４アミノ酸に対するＮ末端アミノ酸配列を、上
に述べた結果を用いて決定した。

人の***繊維芽細胞を３０Ｘ　１５０ｍｍフラスコ中に
て、　５ｃｏｔｔ、　Ｒ，Ｗ、、　　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃ
ｈｅｍ　（１９８３）　２５８：１０４３９に記述のよ
うに、集合体にまで成長させたところ。

約１〜２Ｘ１０１′細胞が得られた。収穫する２４時間
前に、細胞を再び加えて、　ＰＮ−Ｉ　ｍＲＮＡの生産
物を刺激するようにした。この細胞を水冷中で収穫し。

そしてリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄
した。この細胞ペレットを回収し、　２０ｍＭのバナジ
ルコンプレックスおよび０．２％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−
４０洗浄剤を含む緩衝液中でホモジナイズし１次いで。

１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＲＮＡを、
フェノール／クロロホルム抽出によりこの上清みから調
製した。得られた全１２ＮＡを、　ｍＲＮＡを得るため
に。

オリゴ−ｄＴアフィニティークロマトグラフィーにかけ
た。

この単離したメツセンジャーをゲル分割し、そして第１
図ａに示す配列を有する２４種類の１４量体の混合物で
プローブ化した。これは、決定されたＮ末端配列の２０
〜２４アミノ酸をコードしている縮重した逆の相補性の
ＤＮＡを表す。そのプローブは。

長さにおいて、約２５００〜２７００ヌクレオチドのｍ
ＲＮＡにハイブリダイズする。

次いで、全ｍＲＮＡの調製物を、λｇｔｌｏ中にてｃＤ
ＮＡライブラリーを調製するための鋳型として用いた。

このことは、　ｌ１ｕｙｎｈ＋　Ｔ、Ｖ−＋ら、　ＤＮ
Ａ　Ｃ１ｏｎｉｎ二国吐−ｎｉ　ｕｅｓ−戦Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ　Ａ　　ｒｏａｃｈ　（１９８−Ｉ）＋　Ｇｌ
ｏｖｅｒ＋Ｄ、、　ｅｄ、ＩＲＬ、　０ｘｆｏｒｄに充
分に記述されている。

しかし、　Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｖ、＋　　ら、　Ｇｅｎｅ
　（１９８３）　２５　：２６３−２６９の方法に従っ
て行われる第２番目の鎖の合成を用いてなされる。得ら
れたｃＤＮＡを、　　ＥｃｏＲＩで切１析し、そしてλ
ｇｔｌＯのＥｃｏＲ１部位に、　Ｉｆｕｙｎｈ　ら（前
述）により記述されるように、挿入した。数百万のファ
ージプラークを得、そして３枚のフィルターリフトを調
製した。プラークを、上記１４遺体の５゛末端を３２Ｐ
−ＡＴＰで標識した混合物を用いて。

中程度の厳密な条件下で（６Ｘ５ＳＣ，３０°Ｃ）、二
度スクリーニングにかけた。これにより、多数の陽性ク
ローンを得た。

選びとられそして培養された６０クローンのうち。

４８クローンもまた。第１図すに示される３６ヌクレオ
チドオリゴマーの配列に対し、同等に厳重な条件下でハ
イブリダイズさせた。このオリゴマーの配列は、アミノ
酸１４〜２５に基づいて示される共通配列、つまり本来
のタンパク中で決定された配列であった。

これら４８クローンのうちの１５クローンは、完全な配
列をコードするのに充分な長さのｍＲＮＡから予期され
る大きさに近かった。これらは、大きさによって２つの
組（２０００ｂｐと３０００ｂｐ　）に分かれた。

３０００ｂｐのあるクローンは、　ＰＮ−１８と命名さ
れ、そして２０００ｂｐのあるクローンはＰＮ−３３と
命名された。

これらのクローンは、類似のコード配列を有する。

ＰＮ−５，ＰＮ−８およびＰＮ−１１と命名されたクロ
ーンは。

ＰＮ−１８と同じコード配列を有する。　ＰＮ−９クロ
ーンは、　ＰＮ−３３に含まれる少し異なったコード配
列を有する。制限地図により、これらのクローンが。

遺伝子の５′末端を含むことが示される：これらの地図
を、第２図に示す。

ｒ’Ｎ−１８を５ａｕ３ＡＩで制限し、そしてＭ１３（
７）Ｂａｍｌｌ１部位にクローニングした。正しいｃＤ
ＮＡの存在を確認するために、得られたＭ１３サブクロ
ーンを１４量体混合物でスクリーニングした。また、　
５５ｂｐの断片を配列決定し、そして本来のタンパクの
１７〜３４アミノ酸をコードする正しい配列を含むこと
が見出された。

上の１５クローンのうちの１３クローンが、　１４ｆｆ
１体プローブにハイブリダイズし、そしてこの遺伝子の
５゛部分をコードすると思われる７５ｏｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ−ＢｇｌＩ［断片を含んでいた。この分節を配列決定
した。この決定された配列は、上の５５ｂｐの５ａｕ３
旧断片、および、上で決定されたＮ末端配列のコドンを
含む。さらに、　　ＡＴＧの後方に伸長した。１９アミ
ノ酸のシグナル配列に対するコドンを含む。

ＰＮ−１αに対する完全なコード配列は、　ＰＮ−１８
に含まれていた。そして、推定されるアミノ酸配列を第
３図に示す。この最初の１９のコード化アミノ酸は、推
定されるシグナル配列であり、そして２０位のセリンで
始まる推定される成熟タンパクの最初の３４アミノ酸は
１本来のタンパクのＮ末端に完全に一致する。ＰＮ−１
８は、アメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託
され、そしてＡＴＣＣ４０２３８という受は入れ番号を
有する。

ＰＮ−１産物を用いたＰＮ−１８の同定′を、第５図に
示すように、ノーザンプロットによって実証した。

ＰＮ４Ｂから得た５５ｂｐの５ａｕ３ＡＩ断片を標識化
し、そして人の***繊維芽細胞、およびＰＮ−１の産生
能力のないいくつかの他の細胞系から得たｍＲＮＡの配
列決定をするために用いた。このプローブは、　ＰＮ−
１を生産する細胞からの約２．８ｋｂのｍＲＮＡにのみ
、ハイブリダイズする。

ＰＮ−ＩβをコードするＤＮＡを含むＰＮ−３３クロー
ンもまた。そのコード領域について完全に配列決定がな
され、その結果を、推定されるアミノ酸配列とともに、
第４図に示す。ＰＮ−１αについては、最初の１９のコ
ード化アミノ酸は、推定されるシグナル配列であり、そ
して２０位のセリンで始まる成熟タンパクの最初の３４
アミノ酸は２本来のタンパクのＮ末端に正確に一致する
。ＰＮ−Ｉβをコードする配列は、成熟タンパクの３１
０位のコドンの後のグリシンに対応する付加コドンの包
含、およびその位置のアルギニン残基に対するスレオニ
ンの置換。

を除いて、　ＰＮ−Ｉαの配列とほとんど同一である。

それゆえ、成熟ＰＮ−１αは３７８アミノ酸を含む；成
熟ＰＮ−Ｉβは３７９アミノ酸を含む。

第３図および第４図に示されるＰＮ−１８およびＰＮ−
３３ｃＤＮＡの完全な配列部分は、上のアミノ酸配列の
変換に対応するコドンを除いて、同一である。このこと
から、ヒトのゲノムライブラリーからＰＮ−Ｉ遺。

伝子の一部分を回収するために、　ＰＮ−１８をｃＤＮ
Ａプローブとして用いることにより、　ｍＲＮＡをスプ
ライシングする際に差があることが実証された。アミノ
酸に違い（この違いは、２つの隣接するエキソン間に存
在し、このエキーソンを分離しているイントロンにまで
続いている）がある領域について配列決定することによ
り、このスプライス部位に３ｂｐの相違があることが確
認された。これらの結果は、第６図に示す。ＰＮ−１α
中のアルギニンに対する３１０位のコドンの始めにある
Ａは、　ＰＮ−１βの３１０位コドン中の対応するＡよ
りも１次のエクソンへさらに３ｂｐだけ下流側にスプラ
イスされる。

ＰＮ−１αの前述のＡｒｇ、およびＰＮ−ｒβのＴｈｒ
−Ｇｌｙを含むこのコード領域にわたって設計されたプ
ローブは２人の***繊維芽細胞の調製物中のｍＲＮＡの
相対量、および対応するｃＤＮＡライブラリー中のｃＤ
ＮＡの相対量を算出するべく用いられた。これらのノー
ダンプロット法およびサチンプロット法の結果により、
それぞれ、２つのタンパクがおよそ等量で形成されるこ
とが示された。それゆえ、いずれの型が、“正常”であ
るのか優位であるのかが明らかでない。

このＰＮ−ＩタンパクをコードするゲノムＤＮＡは。

次のようにさらに研究された：ＳＫ肝癌細胞から単離さ
れたヒトＤＮへのサザンハイブリダイゼーション分析物
を、　　Ｂｇｌ　ＩＩ　、　ｌ１ｉｎｄＩ［［、または
ＥｃｏＲＩで制限分析した。二重鎖サンプルの組をアガ
ロースゲル上で分離し、メンブランフィルタ−にエレク
トロプロットした。得られたプロットを　２２ｐで標識
されたプローブにハイブリダイズした：このプローブは
、２ｋｂのＰＮ挿入物（ＰＮ−３３）または５°末端か
らの６５０ｂｐのＢｇｌ　Ｉ［断片のいずれかである。

完全なＰＮ−１プローブを用いて得られたハイブリダイ
ゼーションのパターンに基づき、このＰＮ遺伝子を。

少なくとも２０ｋｂに及ぶように見積もった。期待され
たように、この５゛プローブは、　ＰＮ−Ｉの特異的断
片のサブセットにハイブリダイズされ、そして−本のバ
ンドだけが、各酵素分解に対して認められた。これらの
結果は、単一のＰＮ−Ｉ遺伝子に合致する。

実施例２に記述の方法と同様の方法により、マウスの繊
維芽細胞から抽出したｍＲＮＡからλｇｔｌｏに調製さ
れたｃＤＮ＾ライブラリーを、　ＰＮ−１８由来の５５
ｂｐの５ａｕ３ＡＩ断片を用いてスクリーニングする。

−このプローブにハイブリダイズするファージを１次い
で、取り出し、そして所望のマウスＰＮ−Ｉ　ｃＤＮＡ
を得るべ（クローニングする。

ＰＮ−３３またはＰＮ−１８のＥｃｏＲＩカセット由来
のコード配列を、　１９８７年２月４日出願の出願番号
がついていない出願（Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、　ＩＮＶＯ
ＯＩＩＰ）に記述の増幅可能な宿主発現ベクターｐｓＴ
ＩＩ−ＭＤＩにそれぞれ連結させた。このベクターは、
同じ受託者に委託され、その内容はここに示され、一部
再現されている。この増幅可能なりＩＩＰＲ配列は、天
然のプロモーターの制御下にあり、そして肝炎表面抗原
の遺伝子の終結配列に続いている。完成したベクターで
は、二のＩ’Ｎ−Ｉ配列は、　ＳＶ４０初期プロモータ
ーの制御下にあり、そしてまた肝炎表面抗原の終結配列
に続く。

ＰＮ−ＩαおよびＰＮ−１βをコードするＤＮＡを、　
ｔＰＡ発現カセットの代わりに、宿主ベクターｐ　Ｓ　
Ｔ　ＩＩ　−Ｍ　Ｄ　ＩＦ中に、以下の３方向の連結を
用いて挿入した。この連結では、このコード配列の５”
末端および３”末端、および発現系の適当な部分を９分
離断片として挿入した。これらのベクター、　　ｐｓＮ
ｃＸＨ−ｄｈｆｒおよびｐＳＮβ１＋−ｄｈｆｒの構築
のために、実質的に同等の連結を行った。しかし、この
連結は適当な開始剤とともに達成された。

ｐｓＮαｌｌ司ｈｒやｐＮｅｘ　ａ　−ＨＢＶ３’　Ｒ
１の構築のために。

肝炎の終結配列に続（遺伝子のＣ末端コード部分を含む
ベクターを、　　ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで分解し
。

この発現系の３°末端を単離した。この発現系の５゛末
端を含むベクターｐＳＶ−Ｎｅｘ　αをＢｇｌＩＩおよ
び５ａｌＩで分解し、ネキシン５”末端を含むベクタ一
部分を単離した。これらの断片を、３方向の連結にて。

この〇〇ＦＲ選択可能マーカーに連結し、　　ＥｃｏＲ
Ｉ　／　Ｓａｌ　１分解によってｐｓＴＩＩ〜ＭＤＨか
ら切り取り９選択および増幅のためにエセリシア・コリ
に形質転換した。

所望の構築を示すプラスミドＤＮへ、　ｐＳＮαＨ−ｄ
ｈｆｒを、成功した形質転換体から単離した。

全く同じ方法ではあるが、対応するＰＮ−Ｉαを含むベ
クターの代わりにｐＮｅｘβ−ＨＢＶ３’ＲＩおよびｐ
ＳＶ−Ｎｅｘβを用いて、　　ｐＳＮβＨ−ｄｈｆｒを
構築した。

α型およびβ型の両方に共通のネキシン５゛末端に動作
可能に連結されたＳＶ４０初期プロモーターを含むベク
ターは、これらの構築物に共通である。

この中間物ベクター、　ｐＳＶ−ＮｅｘＢａｌ　ｌを、
　ＰＮ−３３，ｐＵｃ１８およびｐｓＶｏｒｉｌｌＢＶ
３’を用いて構築した。ＰＮ−１を含む挿入物を切り出
すために、　ＰＮ−３３をＥｃｏＩＩＩで切断し、　Ｂ
ａ１３１で逆方向に切断した後、この＾ＴＧ開始コドン
を通して、この５”末端を含む仕立てられたネキシン挿
入物を得るために、　　５ａｃｌで分解した。ｌ１ｉｎ
ｃ　ＩＩ　／Ｓａｃ　Ｉで分解したｐＵＣ１８ヘクター
断片にこの断片を連結して、　ｐＵＣＮｅｘ−Ｂａｌ　
Ｔを得た。ｐＵＣＮｅｘ−ＢａｌＩを旧ｎｄｎＩおよび
５ａｌｌで切断し、α型およびβ型に共通のネキシン５
゛末端断片を切り出した。

このホキシン５゛−末端断片は、所望のｐＳＶＮｅｘ−
Ｂａｌ　ｒを与えるべ（、ｌｌ１ｎｄＩ［Ｉ／Ｓａｌ　
Ｉで切断されたｐＳＶｏｒｉ−＋１ＢＶ３’　ベクター
断片（以下参照）に連結されている。

ＥｃｏＲＩおよび１ｌｐａｌでＰＮ−３３を分解し、　
１６５０ｂｐ断片を単離し、そしてｐＵｃ−Ｎｅｘ３’
を得るへ＜　ＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉで分解された
ｐＵｃ１８中にその断片を連結することにより、３゛配
列を含む付加的ベクタ＋、　ｐｓＶＮｅｘ３’１ｌＢＶ
を構築した。ｌｌ１ｎｄＩ［およびＢａｍＨＴで分解し
、所望のｐＳＶＮｅｘ３’　ＨＢＶを得るべく　ｌ１ｉ
ｎｄ　ｍ　／ＢａｍＨＩで分解されたｐＳＶｏｒｉ−）
ＩＶ３’　（以下参照）中に、ホキシン３゛末端を連結
することにより、肝炎終結配列とともにｐＵｃ−Ｎｅｘ
３”を供給した。

この２つの付加的な中間物ベクター、　ｐＳＶＮｅｘα
およびｐＳＶＮｅｘβを、　ＰＮ−３３またはＰＮ−１
８（どちらか適当な物質）に由来の５４０ｂｐの内部断
片およびｐＳＶＮｅｘ−Ｂａｔ　ＩやｐＳＶＮｅｘ３’
　ＨＢＶに由来の対応する５゛末端および３°末端を用
いて得た。各場合では、　ｐＳＶＮｅｘ−Ｂａｌ　　Ｉ
をＢｇｌｌｌおよびＳａｌ　Ｉで分解し、　ｐＳＶＮｅ
ｘ３’　ＩＩＢＶを旧ｎｄｎ［および５ａｌｌで分解し
、そしてＰＮ−１８由来のＰＮ−Ｉαまたはｌ’Ｎ−３
３由来のＰＮ−ＩβのＢｇｌ　ＩＦ　／旧ｎｄ　ｍ　５
４０ｂｐ内部断片で３方向の連結方法により連結して、
それぞれｐＳＶＮｅｘαおよびｐＳＶＮｅｘβを得た。

このＢａｍ１ｌ　ｒ　／Ｓａｃ　１１分解ｐＵｃ−ＨＢ
Ｖ３’中に、　ｐＳＶＮｅｘ　ｔｘまたはｐＳＶＮｅｘ
βのＢｇｌ　Ｕ　／Ｓａｃ　Ｕ挿入部分（どちらか適当
な物′ｆｆ）を挿入することにより１発現系の極端な３
′末端のＨｃｏＲＩ部位を配置するために、これらを修
飾した。得られたベクター、　ｐＮｅｘαＩＩ　Ｂ　Ｖ
　３°ＲＩおよびｐＮｅｘβＩＩＢＶ３°Ｒ１を１次い
で、前述の構築に用いた。得られたベクター（ｐｓＮＩ
Ｉ−ｄｈｆｒと一般に呼ばれる）を第７図に示す。

このベクターを、−時的な発現のためにＣＯ５−７細胞
中にトランスフェクトするか、またはＤ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ
欠失Ｃ１１０細胞中にトランスフェクトし１次いでメト
トレキセートで増幅し、　ＰＮ−ＩαまたはＰＮ−Ｉβ
の生産のために培養した。このＰＮ−Ｉは、シグナル配
列がこの構築物中に保持され、かつ宿主細胞と和合可能
なので、この培地中に分泌される。

この形質転換された細胞の培地を、　Ｅａｔｏｎ、　Ｄ
、Ｌ。

ら、去」劇ユ」１Ｌｄ堕、（１９８３）旦７　：　１７
５−１８５に記述のトロンビン結合性分析を用いて、　
ＰＮ−１生産に関して分析する。要約すれば、集合物の
細胞培養物とともに７２時間にわたり前培養された無血
清培地を遠心にかけ、細胞破片を除去した。０．１βｇ
／ｍｌで標識されたトロンビンＣ２’Ｉ−Ｔｈ）を３７
°Ｃで４５分間この培地とインキュベートした。１２Ｊ
−Ｔｈ−ＰＮ複合体が分解しない条件下にて、　”’Ｉ
−Ｔｈ−ＰＮ複合体を７％ゲルを用いて５ＯＳ−アクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析し、そしてＰＮおよび
ＴｈがＴｈ−ＰＮ複合体中で等モル量存在すると仮定し
て、ガンマシンチレーションカウンターで定量した。形
成された複合体は、　ＰＮ−１ウサギ抗血清を用いる免
疫沈降により、　ＰＮ−Ｉを含むことが確認された。

この分析の結果から、うまくトランスフェクトされたＣ
ＨＯ細胞またはＣＯ５７細胞により、　ＰＮ−１αまた
はＰＮ−１βの生産がわかる。

追放 開用」用■盪築 ｐＳＶｏｒ　１ＨＢＶ３°は、複製開始点、および肝炎
８表面抗原遺伝子に由来の３゛終結配列の上流側にある
ＳＶ４０の初期プロモーターおよび後期プロモーターを
含む。この終結配列とこのプロモーターとの間には、外
来遺伝子の挿入部位がある。ｐｓＶｏｒｉｔ！ＢＶ３゜
をｐＭＬ、　ＳＶ４０およびＩＩＢＶから構築する。ｐ
ＭＬをＥｃｏＲＩで分解し、クレノーで平滑末端にし２
次いで旧ｎｄＩＩ［で分解する。エセリシア・コリの複
製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
断片を単離し、　ＳＶ４０　（これは、　ｌ１ｉｎｄＩ
ＩＩおよび旧ｎｃｌｌによ−るＳＶ４０　ＯＮＡの分解
によって得られた）の複製開始点、および初期プロモー
ターと後期プロモーターとを含むこの単離された５４０
断片に連結した。得られたベクター（これはｐＳＶｏｒ
ｉと命名された）を。

次いで表面抗原遺伝子の３゛終結配列を含むＩＩＢＶ　
ＤＮＡのＢａｍ１ｌ　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｕ分解から単離さ
れた５８５ｂｐ断片を導入するため、ＢａｍＨＩで分解
する。正確な方向を制限分析で確認する。旧ｎｄｌＩ［
およびＢａｍ１ｌ　Ｉの分解により、この正しいベクタ
ーから３５０ｂｐ断片が生じる。連結されて得られたベ
クター、　ｐｓＶｏｒｉｌｌＢＶ３’は、それゆえ、　
ＨＢＶターミネータ−の上流側に５ｖ４０プロモ一ター
配列および複製開始点配列を含み。

コード配列をプロモーターとターミネータ−との間にう
まく挿入させる。

バクテリア複製ベクター中にｔｐ＾遺伝子の仕立てられ
た上流部分を含むｐｔｐＡ−ＢＡｔ、ｔ７も調製した。

このｔＰＡ　ｃＤＮ＾をＰｅｎｎ１ｃａ、　Ｄ、ら　Ｎ
ａｔｕｒｅ　（１９８３）３０１　：２１４−２２１に
記述されるように、　ｔＰＡに対し得られた全ｃＤＮＡ
配列の挿入物を含むバクテリアベクターｐＭｏＮ−１０
６８から供給する。もちろん、このコード配列を含むバ
クテリア複製ベクターなら、いずれも同様に使用できる
だろう。以下で設計される制限部位は、　Ｎａｔｕｒｅ
の参照文献に示されるｔＰＡ　ｃＤＮＡの開示された配
列に含まれている。このｔＰＡをコードするｃＤＮＡを
切り取るために、まずＰＭＯＮ−１０をＢａｍｔｌ　Ｉ
で分解し２次いでＢａ１−３１で分解してこの遺伝子の
各末端を削り取る。線状断片の長さおよび配列の分析か
ら、この断片の５′末端がＡＴＧ開始コドンの１７ｂｐ
以内であることが示されるまで、　ＢＡＬ−３１による
分解を続ける。削り取った正確な長さは。

この発現カセット内にて、このプロモーターから動作可
能な距離にＡＴＧを置くのに十分に短い距離の範囲内に
ある限り１重大ではない。実際、この断片において、約
１０ｂｐのＡＴＧからの５°末端の断片の分離が示され
ている。次いで、この選択された線状断片を５ａｃｌ（
これは、　ｔＰＡ遺伝子のコード配列の内側を切断する
）で分解した。そして得られた平滑末端／５ａｃＩ断片
を単離した。これは。

この遺伝子の適切に仕立てられた５”末端を含み。

この中間物プラスミドｐｔＰＡ−ＢＡＬ１７を与えるべ
く。

Ｓａｃ　Ｔ　／　Ｈｉｎｃ　ＩＩで分解されたｐＵｃ１
３に連結した。

ｐＵｃ−ＤＨＦＲを、　ＤＨＰＲをコードする配列（こ
れは。

関連した制御配列をもたない）のためのクローニングベ
クターとして用いた。Ｆｎｕ４１１１でｐＤＨＦＲ−１
１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ，Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、　　
Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃｉＵＳＡ　（１９
８３）　　胆：　２４９５−２４９９）を分解し、クレ
ノーで平滑末端にし２次いで、　　Ｂｇｌｌｌで分解し
て。

ここで述べたような６６０ｂｐの断片を単離し、この断
片をｐＵｃ１３に連結することにより、　ｐＵＣ−ＤＩ
ＩＦＲを構築した。このｐＵｃ１３は、　１ＩｉｎｃＩ
ＩおよびＢａｍ１ｌ　Ｉで分解される。それゆえ、ρＵ
Ｃ−ＤＨＰＲは、　ＤＨＩ’Ｒに対する直接のクローニ
ングベクターを表す。このＤ　１１　Ｆ　Ｒは、上記の
ｔＰＡ遺伝子の５′部分に対し記述されるｐｔＰＡ−Ｂ
ＡＬ１７ベクターに類似している。

最後に、肺炎Ｂの表面抗原遺伝子に由来の終結配列に対
する分離のクローニングベクター、　ｐＵＣ−１１ＢＶ
３’を、上記のように、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌ　ＩＩ
で１１ＢＶ　ＤＮＡを分解し、　　５８５ｂｐ断片を単
離し、そしてＢａｍ１ｌ　ｆで分解したｐＵｃ１３中に
この断片を連結することにより、構築した。

ＳＶ４０プロモーターおよびＩＩＢＶ終結配列の制御下
ニテ、ｔＰＡＤ−ド配列の全体を含むｐｓｖ−ｔＰＡ１
７を。

１１ｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍ１ｌ　Ｉで分解されたｐ
ｓＶｏｒｉｌｌＢＶ３’に由来のベクター断片の３方向
の連結物として調製した。これは、それゆえ、ベクター
配列を伴うプロモーターおよびターミネータ−を提供す
る；　ｔＰＡの３′末端をｐＭＯＮ−１０６８のＳａｃ
　Ｉ　／Ｂｇｌ　Ｉｆ分解により得た；このｔＰＡコー
ド配列の仕立てられた５′部分を、　ｐｔＰＡ−ＢＡＬ
１７の旧ｎｄ　ＩＩＩ　／Ｓａｃ　ｒ分解物として得た
。

得られた連結混合物を、エセリシア・コリに形質転換し
、この形質転換体をアンピシリン耐性について選択し、
そして所望のｐｓｖ−ｔｌ’Ａ１７を含むプラスミドＤ
ＮＡを単離した。

ＤＨＰＲ発現のための片方のベクター（これはｐＳＶ−
ＤＩＩＦＩ？と命名された）もまた、３方向の連結方法
で得た。ｐｓＶｏｒｉｌｌＢＶ３’　の旧ｎｄ　ＩＩＩ
　／　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ分解から得られたベクター断片を
、再び制御配列を供給するべく用いた。そしてこのＤ　
ＩＩ　Ｐ　Ｒコード配列の５″部分および３”部分を、
それぞれ１ｌｉｎｄｌＴ［と５ａｃｋ（一部）。

およびＢｇｌ　ＩＩとＴａｑＩ（一部）を用いたｐＵＣ
−ＤＨｒ’Ｒの分解により、得た。この連結混合物を、
エセリシア・コリに形質転換し、アンピシリン耐性のあ
る形質転換体を選択し、そしてｐＳＶ−ＤＩＩＰＲと命
名されたプラスミドＤＮＡを単離した。

このＤＩＩＰＲコード配列の弱い発現系を含む単一のプ
ラスミドも調製した。このプラスミドｐ　Ｍ　Ｄ　Ｉｔ
を。

ｐＤＲ３４のＨｃｏＲＩ／Ｔａｑ　Ｉ　　（一部）分解
によるｌｋｂ断片、　　ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ　Ｉで分解
したｐＭＬに由来のベクター断片、および５ａｃｌ（一
部）　／Ｓａｌ　Ｉで分解したｐＳＶ−ＤＩＩＦＲから
単離された遺伝子の３゛末端を用いて。

３方向の連結方法で得た。（このｐＤｌ？３４ベクター
は、　　Ｇａ５５ｅｒ　　ｃ、ｓ、ｌ　　ｅｔ　　ａｌ
、　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｅ４韮
（１９８２）頚：　６５２２−６５２６　（前出）に記
述され。

このベクターはそれ自身のプロモーターと連結されたマ
ウスＤＨＦＲ遺伝子を含む）。得られたベクタ＋、　ｐ
ＭＤｌ（は、このＤＨＦＲ遺伝子がマウスＤＨｒ’Ｒプ
ロモーターの制御下にあること以外は、　ｐＳＶ−ＤＩ
ＩＰＲに類似している。ｐＭＤＨ上に存在する弱い発現
カセットおよびｐＳＶ−ｔＰＡ１７上に存在する強い発
現カセットは、これらを混合して適当なりＨＦＩ？欠失
細胞に形質転換するように用いられるとき２本発明の発
現系の１実施態様を構成する。

最後に、単一のベクター上のｔＰＡおよびＤＨＦＲの発
現カセットを含むｐｓＴＩｌ−ＭＤＨを、　ｐＳＶ−ｔ
ＰＡ１７　、　ｐＭＤＩ（およびｐＵＣ−ＨＢＶ３°の
適切に単離された断片の３方向での連結物として構築し
た。ｐｓｖ−ＬＰＡ１７をＳａｃ　ＩＩおよびＳａｌ　
Ｉで切断し、　ｐＭＤＩＩをＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　
１で、そしてｐＵＣ−１＋ＢＶ３’をＳａｃ　ＩＩおよ
びＥｃｏＲＩで切断した。

（発明の要約） ２つのわずかに異なるプロテアーゼ、ネキシン■型（Ｐ
Ｎ−ＩαおよびＰＮ−１β）をコードするＤＮＡ区分節
は１診断および治療の用途のために、実用的なＰＮ−１
９を供給するべく、クローン化され、そして発現される
。ＰＮ−１は、タンパク分解活性により媒介される状況
を制御する際に、有用なセリンプロテアーゼ阻害剤であ
る。

４６　パ　の〜　な云゛日 第１図ａおよび第１図すは、　ＰＮ−Ｉクローンを同定
するために、以下の例示で用いた２つのプローブ混合物
の配列を示す。

第２図は、　Ｉ’Ｎ−９（ＰＮ−３３が属するクラスの
代表物）およびＰＮ−１８と命名されたｃＤＮＡクロー
ンの制限地図を示す。そのうちの各々は、完全なＰＮ−
１タンパクのコード配列を含む。

第３図は、　ＰＮ−１８のコード領域のヌクレオチド配
列、およびＰＮ−Ｉαの推定されたアミノ酸配列を示す
。

第４図は、　ＰＮ−３３のコード領域のヌクレオチド配
列、およびＰＮ−１βの推定されたアミノ酸配列を示す
。

第５図は、　ＰＮ−１８の５ａｕ３ＡＩ断片をプローブ
として用いるいくつかの細胞系からのｍＲＮＡ抽出物の
ノーザンプロットを示す。

第６図は、　ＰＮ〜■α型およびＰＮ−１β型の生産を
説明するＰＮ−１遺伝子のスプライス連結領域を示す。

第７図は２発現ベクター１）ＳＮＩＩ−ｄｈｆｒを示す
。

以下に本発明の図面をさらに補足的に説明する。

第１図ａ： プロテアーゼネキシンのアミノ酸残基２０から２４に規
定されるコドンを、このアミノ酸配列の下に示す。この
コード配列に逆の相補体として設計された１４ｆｆ１体
の混合オリゴマーは、２４種類の順列の混合物からなる
。

第１図ｂ： プロテアーゼネキシンのアミノ酸残基１４から２５は、
３６塩基オリゴマーを規定する最も明確なコード配列に
対応する。位置３．６．３０および３３での４つの混合
部位を有するコンセンサス３６量体は、示されるような
残留の不確定塩基を指定するのにより好ましいコドンを
用いることにより、設計された。

第２図： ｃＤＮＡ挿入物ＰＮ１８およびＰＮ９の制限地図。ＰＮ
１８は認められた典型的な３ｋｄ挿入物であり、他方Ｐ
Ｎ９は２ｋｄサイズのクラスの代表的なものである。こ
のｃＤＮＡクローンの５゛末端および３”末端のＥｃｏ
Ｒｒ部位は、このクローニング過程で用いられたＥｃｏ
ＲＩリンカ−に由来する。

第５図： ＲＮ＾サンプルを変性させ、メチル水根アガロースゲル
で分画し、シーンスクリーンメンブランフィルタ−に電
気泳動的に移した。このＰＮ−１８プローブを、　”ｌ
’−ｄＣＴＰ存在下にて１１３クローンのブライマー伸
長により調製した。このＲＮＡフィルターをホルムアミ
ド　ハイプリダイゼーシジン緩衝液（５０％ホルムアミ
ド、５ＸＳＳＣ，２Ｘデンハート、　２０ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐｔｌ　７．０）　、　０．２％ＳＯ
Ｓおよび１００μｇ／戚酵母ＲＮＡ　）中で７２×ＩＱ
’　ｃｐｍの３２ｐで標識したプローブと、４２°Ｃで
３６時間ハイブリダイズさせた。このフィルターを０．
２％ＳＯＳを含むｚｘｓｓｃ中にて４２°Ｃで洗浄し、
Ｘ線フィルムに感光させた。

レーン１）１μｇヒト繊維芽細胞の非ポリＡ　ｌ１ｌＮ
Ａ　。

レーン２）６μｇヒト繊維芽細胞のポリ＾＋ＲＮＡ　１
−２３゜レーン３）８μｇヒト繊維芽細胞のポリＡ”　
ＲＮＡ　１−６゜レーン−Ｉ）８μｇヒト２９３細胞ポ
リ＾＋ＲＮＡ　。

レーン５）８μｇ骨髄黒色腫ポリ＾”　ＲＮ＾。

レーン６）５μｇ　ＳＫ肝炎非ポリＡ　ＲＮＡ　。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、哺乳類プロテアーゼネキシン I （ＰＮ− I ）をコ
   ードする組換えＤＮＡであって、該ＰＮ− I をコード
   するＤＮＡと関連したもとのＤＮＡ配列を含まない組換
   えＤＮＡ。 ２、酵素的に活性なＰＮ− I をコードし、かつ３０℃
   で６×ＳＳＣに相当する適度に厳密な条件下でＰＮ−１
   ８またはＰＮ−３３のＤＮＡ配列にハイブリダイズする
   ＤＮＡと縮重している特許請求の範囲第１項に記載のＤ
   ＮＡ。 ３、第３図または第４図のヌクレオチド配列を有するか
   、またはこれらの図の成熟ＰＮ− I αまたはＰＮ− I
   Ｂと縮重し、またはそれらの天然に存在する対立遺伝
   子変種と縮重している特許請求の範囲第１項に記載のＤ
   ＮＡ。 ４、発現制御配列と動作可能に連結された特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡ。 ５、組換え宿主細胞にトランスフェクトされた特許請求
   の範囲第１項に記載のＤＮＡ。 ６、哺乳類プロテアーゼネキシン I （ＰＮ− I ）をコ
   ードする組換えＤＮＡであって、該ＰＮ− I をコード
   するＤＮＡと関連したもとのＤＮＡ配列を含まない組換
   えＤＮＡがトランスフェクトされた組換え宿主細胞を培
   養すること、 および該培養物からＰＮ− I を回収すること、を包含
   するＰＮ− I の調製方法。 ７、哺乳類プロテアーゼネキシン I （ＰＮ− I ）をコ
   ードする組換えＤＮＡであって、該ＰＮ− I をコード
   するＤＮＡと関連したもとのＤＮＡ配列を含まない組換
   えＤＮＡがトランスフェクトされた組換え宿主細胞を培
   養すること、 および該培養物からＰＮ− I を回収すること、を包含
   するＰＮ− I の調製方法により調製されるプロテアー
   ゼネキシン I 。 ８、通常、結合している不純物を含まず、グリコシル化
   されたとき４３ｋｄの分子量を有し、かつＮ−末端配列
   ：【遺伝子配列があります】 を有し、そして重量で約２．３％のア ミノ糖、約１．１％の中性糖、および約３．０％のシア
   ル酸を含むプロテアーゼネキシン I 。 ９、ＰＮ− I を含む培地を、固体支持体に結合したヘ
   パリンを用いるアフィニティークロマトグラフィーにか
   けること、次いでゲル濾過クロマトグラフィーを施すこ
   と、を包含する本来のＰＮ− I の精製方法。 １０、（ａ）哺乳類プロテアーゼネキシン I （ＰＮ−
   I ）をコードする組換えＤＮＡであって、該ＰＮ− I
   をコードするＤＮＡと関連したもとのＤＮＡ配列を含
   まない組換えＤＮＡがトランスフェクトされた組換え宿
   主細胞を培養すること、および該培養物からＰＮ− I
   を回収すること、を包含するＰＮ− I の調製方法、ま
   たは、 （ｂ）ＰＮ− I を含む培地を、固体支持体に結合した
   ヘパリンを用いるアフィニティークロマトグラフィーに
   かけること、次いでゲル濾過クロマトグラフィーを施す
   こと、を包含する本来のＰＮ− I の精製方法。 に従い調製されたＰＮ− I と免疫反応性であり、そし
   て哺乳動物の免疫に応じて形成される抗体。