JPS62282A - 組換えヒトレニン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　・■の蕾　なＬ （産業上の利用分野） 本発明は組換え手段による貴重な価値あるタンパク質の
実用的な量の化度に関するものである。

特に本発明は診断および薬則設計の試薬として利用でき
るに充分な量のヒトレニンの生産に関するものである。

（従来の技術） レニンは血管収縮／拡張を制御する“アンジオテンシン
系”の鍵となるタンパク質である。従って血管系の不適
当な圧力レベル、特に高血圧、で見られる病気の治療は
この系の制御に焦点が絞られる。

血圧調節に対するアンジオテンシン系の全貌はわかって
いる。血管に作用する物質はオクタペプチドのアンジオ
テンシン■で、これは直接血管平滑筋の収縮に働き、ま
た副腎皮質からアルドステロンの放出を誘導する。アン
ジオテンシン■のレベルはアンジオテンシナーゼによる
失活速度とアンジオテンシノーゲンからの２段階過程で
の形成速度により決定される。アンジオテンシノーゲン
からアンジオテンシン■への変換の速度律速段階はレニ
ンにより触媒される段階、−すなわちアンジオテンシノ
ーゲンからアンジオテンシンＩへの変換である。（アン
ジオテンシンＩのアンジオテンシン■への変換の第２段
階は“変換酵素”により仲介される。）レニンはインビ
ボでは腎臓の隣接糸球体細胞により分泌される。それは
プロレニン前駆体として合成され、これは次に活性なレ
ニン型へとプロセッシングされる。

前述のアンジオテンシン系の種々面から治療薬の標的と
して多数のものが浮かび上がる。事実。

種々のアプローチが試みられた。薬物の大きな群β−ア
ドレナリン作用の阻害剤（β−遮断剤）が特に用いられ
、腎臓の隣接糸球体細胞からのレニン分泌を阻害するこ
とにより少なくとも部分的に作用することが知られてい
る。変換酵素阻害剤が用いられた；変換酵素阻害剤の例
にアンジオテンシン■結合の拮抗阻害剤であるサララシ
ンを含む直接アンジオテンシンＨの作用を阻害する物質
。

カプトプリルおよびエナラプリルがある。インビトロお
よびインビボの研究が、抗レニン抗体のような直接のレ
ニン阻害剤およびアンジオテンシン■アナログに関して
行われた。しかし、これらは充分に治療的に有効な物質
ではなかった。

現在利用できる治療で高血圧の問題に対する満足なもの
はない。薬として実際に用いられている物質は予想でき
ない効力のものであり、またしばしば目的以外に、生物
学的活性の多様性のため。

好ましくない副作用がある。あるものは経口投与できな
い。特にレニン阻害剤の場合がそれで、あるものは動物
およびヒトの両者で静脈内あるいは筋肉内に投与した場
合、血圧降下作用を示したく１１ａｒｂｅｒ＋　　Ｅ、
、　　Ｈｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　　ａｎｄ　　ｔｈｅ　　
Ａｎ　　１ｏｔｅｎｓｉｎＳ　ｓｔｅｍ　：　Ｔｈｅｒ
ａ　ｅｕｔｉｃ　Ａ　　ｒｏａｃｈｅｓ　（１９８４）
　ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ　　１３３−１４５　　；　　
Ｇａｇｎｏｌ＋　　Ｊ、　　Ｐ、＋　　ｅｔ　　ａｌ、
　　八ｂｓｔｒａｃｔｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
５ｏｃｉｅｔ　　ｏｆ　Ｈｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　（１
９８４）１０　：　３７６）　。

レニンはそれ自身、前駆体“プロレニン”型を有する分
泌タンパク質である。従ってこのタンパク質は最初“プ
レプロレニン”として翻訳される。

ヒト腎臓プレプロレニンはＮ−末端から２０アミノ酸残
基のシグナル配列を含んでおり、これは分泌の過程で失
われ、４６アミノ酸残基の“プロ”部分はインビボで切
断されるし、またインビトロでトリプシン分解を受け、
３６０アミノ酸から成る成熟タンパク質となる（Ｉｍａ
ｉ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９８３）　８
０　：　７４０５）。プロレニンあるいはレニンはコン
カナバリンＡ−セファロ−スに対する親和性で示される
ように、多分糖タンパク質として分泌される。成熟ヒト
腎臓レニンは糖残基がない状態で分子量３７．２００ダ
ルトン。

そして糖付加型で約４０，０００である（Ｙｏｋｏｓａ
ｗａ＋　Ｈ，＋ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ｃ
ｈｅｍ、　（１９８０）　２５５　：　３４９８−３５
０２）。

ヒト腎臓レニンに対するｃＤＮＡが作られそして全塩基
配列が決定された（Ｔｍａｉ、　Ｔｏ＋　ｅｔ　ａｌ、
　（前出））。

この配列および導かれたタンパクの配列を第１図に示す
。しかし、レニン、プロレニン、およびプレプロレニン
のいずれも組換え技術により調製されていないし、精製
により得られるヒトレニンは血漿または腎臓から単離で
きるものの量が限定されている。マウス下顎線から調製
されたレニン活性をもつタンパク質が結晶化され、予備
的なＸ−線回折データが得られた；ヒトタンパク質の３
次元モデルが類推により提唱された（Ｃａｒｌｓｏｎ、
　Ｗ、。

ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　　Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　　５ｏｃｉｅｔ　　　ｏｆＩＩ
　　ｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　（１９８４）　１０　：　１
５３　：　Ｍｕｒａｋａｍｉ、　Ｋ、。

同書（１９８４）　１０　：　１５４）。しかし、ヒト
レニン材料はその３次元構造の実験的決定には不充分で
ある。

現在の技術は、３次元構造を決定し、その構造に基づい
て適当な薬剤を設計するための材料を提供するに充分な
量の、ヒト腎臓レニンまたはその前駆体を供給する手段
に欠けている。標的物質の立体配位上での特異的な相互
作用をするリガンドのデザインに関する一般的アプロー
チは他のタンパク質でうまく用いられており、これには
ヒトヘモグロビンでの２．３−ジホスホグリセレート部
位に特異的に結合するリガンドの設計（Ｂｅｄｄｅｌｌ
、　Ｃ。

Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、　　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｐｈａｒｖ
ａｃｏｌ、　（１９７６）５７　：２０１−２０９　；
　Ｂｅｄｄｅｌｌ、　Ｃ，Ｒ，、同書（１９７９）　６
５　：　５３５−５４３）　、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼに特異的に結合する抗癌剤（Ｈａｎｓｃｈ、　Ｃ，、
ｅｔ　ａｌ、−Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅ＋＋。

（１９８２）並：　７７７−７８４）　、プレアルブミ
ンに結合する甲状腺ホルモンアナログ（Ｂｌａｎｅｙ、
　Ｊ、　Ｍ、、　ｅｔａｔ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅ
ｗ＋、　（１９Ｂ２）　２５　：　７８５−７９０）お
よびエラスターゼ阻害剤（Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｄ、　Ｌ、
、　ｅｔ　ａｌ、ムＭｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９８２
）　１６２　：　６４５−６５８）がある。

レニンのプロ配列から成る比較的弱い阻害剤もまたＥｖ
ｉｎ等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、　ＵＳＡ　　（１９８４）　　８１　：　４８−５２
およびＢｏｇｅｒ等のＮａｔｕｒｅ　　（１９８３）　
３０３　：　８１−８４によりマウスレニンおよびヒト
レニンに対して作られた。しかし、　Ｊａｍｅｓ、　Ｍ
。

等のＮａｔｕｒｅ　（１９８６）　　３１９　：　３３
−３８により“開示されたペプシンの活性中心へのペプ
シノーゲンの“プロ”配列の位置は、この比較的弱い成
果はもし純粋の結晶タンパク質が活性中心の充分な研究
を行なえる程多量にあれば克服できること、を示してい
る。

さらに、血液または他の体液中のレニンレベルの診断分
析における標準物質として利用できる多量のレニンを得
ることが望ましい。現在、これらの免疫学的分析は適当
な対、薫物質により標準化されていない。また、精製ヒ
トレニンは潜在的なレニン阻害剤の選別試験の試薬とし
て必要であり。

このような選別は現在利用できる不純な試料により生じ
る妨害反応をなく、すであろう。

分泌成熟タンパク質として組換えレニンを得ることもま
た望まれる。プロインシュリンをコードするベクターで
形質転換された脳下垂体細胞からの成熟インシュリンの
分泌が９分泌促進物質としてのサイクリックＡＭＰアナ
ログでのこれら細胞の処理により得られた（Ｍｏｏｒｅ
、　ＩＩ−Ｐ、ｔｌ、、　ｅｔ　ａ’ｌ、　Ｃｅ１ｌ（
１９８３）並：　５３１−５３８）。したがって、この
組換え　　　゛インシュリンの挙動は、明らかにＡ　Ｃ
Ｔ　ＩＩおよびエンドルフィン生産でこれら細胞により
作動している２分泌機構が使われている（Ｍａｉｎｓ、
　Ｒ，Ｅ、、　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｗ、　（１９８１）　８９　：　２ｌ−２８）。

要約すれば、高血圧または他の血管系の疾患の診断と治
療を行うのにその供給が必要であるにもかかわらず、現
在のところ精製ヒトレニンタンパク質の容易に利用でき
る供給源はなく、そしてこのタンパク質の組換え型の供
給源゛もない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は現在認識されているように、レニンの必要性を
満たすのに充分な量のこのタンパクを提供する。充分な
量は組換え技術により、充分な薬剤設計を可能にし、そ
して診断用標準物質としての量を供給できるように２作
られる。さらに１組換え材料の有用性と本物質の生産方
法は、どのような目指す目的に対しても、この酵素の構
造を最適化するように、このタンパク質の配列の修飾の
機会を提供する。

したがって、１つの観点として２本発明は糖付加型また
は非糖付加型いずれかの、′ｌ＆換えにより生産された
レニンおよびその前駆体に関するものである。他の観点
として２本発明は、これらタンパク質の生産に適した発
現ベクター、これらをコードするＤＮＡ配列で形質転換
された宿主１組換えレニン、プロレニン、およびプレプ
ロレニン生産の方法、そして組換えにより生産される物
質の構造を相補するように設計された治療物質、に関す
るものである。また別の観点として１本発明は培養哺乳
動物細胞に対する成熟レニンの有効な分泌方法に関する
ものである。さらに別の観点として。

本発明はレニンおよびプロレニン、特に組換えにより生
産されたもの、の精製手段に関するものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明の発現系は、ヒトレニン、ヒトプロレニン、また
はヒトプレプロレニンをコードするＤＮＡ配列を含み、
該ヒトレニン、該ヒトプロレニン。

または該ヒトプレプロレニンは１組換え宿主細胞と和合
し得かつ該組換え宿主細胞内で該ＤＮＡ配列の表現を行
い得る制御配列に作動可能に連接した。

本発明の組換え宿主細胞は、レニン、プロレニン、また
はプレプロレニンをコードする組換えＤＮＡ配列で形質
転換された。

本発明の調製法は、ヒトレニンまたはヒトプロレニンの
調製法であって、レニン、プロレニン。

またはプレプロレニンをコードする組換えＤＮＡ配列で
形質転換された組換え宿主細胞を培養すること、および
該培養物からレニンま−たはプロレニンを回収すること
、を含む。

本発明のペプチド（２から１５の７ミノ酸残基）は、結
晶組換えレニンの表面の一部の３次元表面輪郭を相補す
る３次元表面輪郭を有し、レニン活性の阻害剤である。

本発明の物質の組成物は１組換えにより生産され不純物
を含まないヒトレニンまたはヒトプロレニンを含む。

本発明の方法は、＠乳動物細胞を処理することを含む゛
分泌培養成熟組換えレニンを生産する方法であって、該
細胞は制御された分泌系路をそのまま用い、プレプロレ
ニンに対する発現系を含むようにすでに修飾され、そし
てプレプロレニン遺伝子を分泌促進物質で発現させるよ
うすでに誘導されているものである。

本発明の細胞培養上澄からのレニン精製方法は。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＩＩＩｃ）、ペプ
スタチンクロマトグラフィーおよび陰イオン交換を含む
。

本発明の細胞培養上澄からのプロレニン精製方法は、ペ
プスタチンクロマトグラフィー、分子量篩い、および陰
イオン交換を含む。

八一定態 ここで用いられているように、″レニン”は成熟タンパ
ク質すなわち６６番の位置から始まる３４０アミノ酸配
列、として第１図に示されているものに実質的に類似し
たアミノ酸配列を持つタンパク質を意味する。レニンが
すべてのタンパク質と同様に、それの周囲、もしくはそ
れが含まれる溶液のｐＨに依存して中性もしくは塩の形
で存在しているであろうこキはもちろん理解される。中
性および塩の形の両方が定義に含まれる。それに加えて
。

多くのタンパク質と同様に、他の分子、最も多くは炭水
化物残基と結合して即ちグリコジル化もしくは非グリコ
ジル化の形で存在しうる。例えばリン酸との結合２例え
ばスルヒドリル残基の酸化。

ヒドロキシルのエステル化、などのような他の“側鎖の
修飾”も起こりうる。アンジオテンシノーゲンのアンジ
オテンシンＩへの変換を触媒する能力により定義される
“レニンの活性”が壊されない限り、これらの修飾も含
まれる。最後に、配列自身は１例えば１つまたはそれ以
上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換のような小
さな様式で変わり得ることが知られている。レニンの活
性を保持している限り、そのような変化した形もまた含
まれる。特に、多くのタンパク質の場合と同様に、成熟
のアミノ酸配列のほんの一部が活性に必要であることが
理解されている。

“プロレニン”と“プレプロレニン”は同様に第１図を
参照として定義される。（その図で指示される対応する
数字は、アミノ酸残基の下に括弧のある。なしで示され
る。）よって、プレプロレニンは示された全アミノ酸配
列により、そしてプロレニンは２１番目の残基から４０
６０６番目基までのものにより表示されている。１番目
から２０番目までの残基の２０アミノ酸のリーダー・プ
レ配列は。

そのタンパク質が粗面小胞体を通過して移動する時に切
断される。そして２１番目から６６番目の残基までの“
プロ”配列は、トリプシンのような適当な特異性のタン
パク分解酵素を用いて、インビトロで切断可能である。

酵素的に不活性なレニン。

おそらくプロレニン、は実際にプラズマ中（Ｓｅａｌｅ
ｙ＋Ｊ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｔ、　Ｅｎｃｏｃｒｉｎｅ
　Ｒｅｖ　（１９８０）　１　：　３６５−３９１）と
腎臓自身中（Ｃｈａｎｇ、　Ｊ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ
、　　肚匹Ｌｔｅｎｓｉｏｎ　（１９８１）−ジ：　５
０９−５１５）に見出される。ヒトのプラズマ中に見出
されるプロレニンのすべてではないにしてもいくつかは
、腎臓由来であるようである（Ｄｅｒｋｘ＋　Ｆ、　＋
１．　Ｍ、、　ｅｔ　ａｔ、　ＩＩ　　ｅｒｔｅｎｓｉ
ｏｎ（１９８３）　　５　：２４４−２５６）。

ヒトのアンジオテンシノーゲンを加えて保温し。

生成したアンジオテンシン！　（＾りを標準的な免疫検
定法を用いて測定することによりレニンの活性を測定す
ることができる。

“精製した”または“純粋な”は、自然な状態で見られ
るような通常共存する物質が存在しない物質のことを示
す。よって例えば、“純粋な”レニンはヒトのプラズマ
または腎臓中のｉｎ　　５ｉｔｕの周囲に通常関連して
いる物質を含まないレニンを示す、もちろん“純粋な”
レニンは、そのグリコシド残基のような、それに特別縁
関連を持つ物質を含みうる。

“作動可能なように連結した”とは、成分がその通常の
機能を発揮するために、隣接することを示す。よって、
コード配列に作動可能なように連結した制御配列すなわ
ちプロモーターは、コード配列の発現に作用することが
可能である。

“制御配列”とは、　ＤＮＡ配列、すなわち、目的のコ
ード配列に適当に連結した時に、それらの配列と和合す
る宿主中で、その発現に作用することができる配列のこ
とを示す。そのような制御配列は、原核および真核の両
方の宿主中のプロモーターを含み、そして原核生物中で
は２．リポソーム結合部位配列を、そして真核生物中で
は終結信号をも含む。発現に作用することにおいて必要
な、もしくは有用な、さらに付加的な因子もまた同定さ
れうる。ここで使われる場合“制御配列”は単に。

使用される特定の宿主中で発現に作用するために必要な
どの゛ようなりＮＡ配列をも示す。

“発現系”とは、コード配列の発現に作用するために必
要なあらゆる調節配列に作動可能なように連結した。目
的生産物をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ配列である。

“細胞”または“細胞培養”または“組換え宿主細胞”
または“宿主細胞”は文脈から明らかとなるように、し
ばしば交換可能的に用いられる。

これらの用語には、直接に問題の細胞、そしてもちろん
それらの子孫が含まれる。すべての子孫が。

突然変異または環境の相違によって、親細胞と全く同じ
であるわけではないことが理解される。しかし、子孫が
最初の形質転換細胞に与えられたものと関連した特質を
保持する限り、それらの変わった子孫もこれらの用語に
含まれる。

（以下余白） 旦−：」Ｉ壇ロヒ遵　　・ 一般的に９本発明は実用的な量の、そして自然の環境で
このタンパク質に伴っている不純物のない、精製された
形のレニン（またはプロレニン）の生産を目指している
。組換え技術は、この目標を達成するための理想的な手
法を提供する。目的のレニンまたはプロレニン生産物を
コードするＤＮＡ配列を、適当なベクターに連結し、原
核または真核の宿主で発現させることにより、これらの
タンパク質のほぼ無限の供給源を提供しうる。プレ配列
も、特に真核生物中において目的生産物を分泌させるた
めに、有効に使用されうる。単に細胞から培地を除くこ
とから成る簡単で直裁な精製の第一段階を可能にするの
で、もちろん分泌は望ましい。多（の組換え宿主細胞に
おいて分泌されるタンパク質の数は制限されており、よ
って分泌タンパク質では最初の混入物の量が大幅に低く
なるであろう。

ＣＨＯ細胞はレニンをほとんどすべて不活性な前駆体と
して分泌し、トリプシンはプロレニンをレニンに変換す
るので、　Ｃ）１０細胞に代表される動物細胞の集まり
から分泌されたタンパク質は、レニン活性を検定するた
めにトリプシンを加えて、または加えずに保温する必要
がある。検定前に分泌プロレニンのトリプシン処理によ
り、　ＣＦＩＯ細胞の上澄液中のレニン活性を２５倍上
昇させることができる。多種の宿主および調節系が使用
可能であるが、望ましい調節系にはメタロチオネインの
プロモーターを使用する。メタロチオネインのプロモー
ターの制御下にあるプレプロレニン配列を含むこれらの
細胞を２〜？、５Ｘ１０−ＳＭのＺｎ５Ｏ，存在下で培
養することにより、レニンの分泌が２〜３倍上昇する。

１０−’Ｈのデキサメタシンを培養液に加えることによ
り、レニン生産はざらに３〜５倍上昇する。プロレニン
とレニン生産物のこの系を使っての血清を含まない培地
中への分泌も、鉄のような誘導活性化物質の存在により
可能である。

分泌のための調節された経路（構成的経路−概説はＫｅ
口ｙ等の５ｃｉｅｎｃｅ　（１９Ｂ　）　２３０　：　
２５−３２を見よ−に相対するもの。）を利用する動物
細胞中で調製する場合、プロレニンよりも成熟タンパク
質の方の分泌が１分泌促進物質を使用することにより上
昇する。例えば下記の図において、そのような分泌促進
物質、サイクリックＡ？ＩＰアナログが。

プレプロレニンの分泌系を用いて形質転換した分泌細胞
系から、レニンを成熟した形で分泌させる能力を持つ。

成熟した組換えレニンは１通常それらの細胞から分泌さ
れる他の成熟したホルモンと同様に分泌小粒中に貯蔵さ
れ、培養上澄液に内容物を放出することにより分泌促進
物質に応答する。

と考えられている。

本発明ば１例えば視床下部、副甲状腺、心房などの内分
泌腺と外分泌腺、または神経細胞、好塩基球、そして血
小板などのような調節された分泌経路を利用する組織中
で生成する適当な形質転換細胞から、成熟したレニンを
分泌させる方法を含む。分泌させるために、適当な時間
の間組換えタンパク質の生産を′ａ続させた後に、成熟
した形で放出させるために細胞を分泌促進物質で処理す
る。

分泌促進物質は一般的に当業者に知られており。

サイク°リックへＭＰアナログ、カルシウムイオノフオ
ア、そしてノルエピネフリンを含む。これらの化合物を
、用いる分泌促進物質により、放出させるのに効果的な
量で加える。

ｃＤＮＡ配列、ゲノム配列、またはそれらの混成体のい
ずれも、用いられる組換え宿主と調節系の性質に従属し
て発現しうる。下記の図で＋　ｃＤＮＡは腎臓細胞のｍ
ＲＮＡから調製し、適当なゲノム配列により試験される
。ｃＤＮＡはまたＭｕｒａｋａｍｉによっても調製され
ている（Ｉｍａｉ　（前出）参照）。しかし動物細胞宿
主では９例えば、イントロンを含むゲノム配列の発現と
、正しくスプライシングされたｍＲＮＡの生成が可能で
ある。

組換え培養からのし°ニンの成熟した形、または前駆体
を得るための精製方法もまた開示される。

レニンでは１手順は疎水性相互作用クロマトグラフィー
（ＩＩＩｃ）、ペプスタチンクロマトグラフィー。

そして陰イオン交換から成る。プロレニンでは。

成熟したタンパク質への変換が起きるのでＨＩＣは不適
当である。よって、ペプスタチンクロマトグラフイー、
分子量篩い、そして陰イオン交換の順に適用することに
より調製する。

レニンでは、細胞の破片を除（ために培養上澄液を処理
し、その後、塩溶液中のフェニル５２−のような疎水性
カラムに充填し、そしてρ１（８の緩衝液での塩の勾配
の減少により溶出させる。いくつかの適当な吸着剤１例
えばシンクロパック・プロピル（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ、　
Ｌｉｎｄｅｎ、　ＩＮ）そしてフェニル・スーパロース
（Ｐｈａｒｍａｓ　ｉａ）が市販されている。プロレニ
ン（またはレニン）を含む両分を回収し。

（例えばセファロースビーズに付着した）トリプシンで
処理し、そしてペプスタチンカラムに充填する。ペプス
タチンはレニンと活性化プロレニンに効果的に結合する
ことができる阻害剤であり。

これはアフィニティ一段階に不可欠である。ペプスタチ
ンを用いるためには、いろいろな支持体を用いることが
できる。希薄な酸でレニンを溶出させ、そして約ｐ１１
７で陰イオン交換クロマトグラフィーにかける；レニン
は非吸着画分で純粋な形で得られる。ＤＥＡＲまたはそ
の多くが市販の他のイオン交換体のような１便利な陰イ
オン交換樹脂のどれをも使用しうる。Ｂｅｃｋｍａｎ　
ＳＡＸ　Ｌｌｌｔｒａｓｉｌと５ｙｎｃｈｒｏｒ＠ＡＸ
３００がその例である。

プロレニンでは、清澄させた培養上澄液をペプスタチン
・カラムに充填し、上記と同様に酸で溶出させ、そして
プロレニンを含む両分を９例えばＴＳＫ　４０００　Ｓ
Ｗ　、またはＴｏｙｏ　５ｏｄａμｍＳｐｈｅｒｏｇｅ
ｌ　ＴＳＫやＢｅｃｋ＋ｍａｎ　Ｂｉｏｓｉｌ　２５０
のような高・低分子量の混入物を排除する能力のある他
の同等な大きさによる分別ゲルを用いた大きさによる排
除のＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにかけ、その後陰イオンにかけて
プロレニンを上記と同様に非吸着画分に得る。

純粋な組換えヒトレニンとヒトプロレニンを得ることの
望ましいことには、いくつかの面がある。

最初に、この手順を用いることによりミリグラムの量の
物質を得ることが可能である。ミリグラムの量で、Ｘ線
回折とコンピューター解析を用いた３次元の研究を可能
にする結晶化が可能である。

これにより１分子の形に関する推論、よって、レニンが
普通に示す酵素活性の阻害剤として使用可能な物質の適
当な形を明らかにすること、を可能にする。アンジオテ
ンシン■のアンジオテンシン■への続いて起こる変換の
触媒である。“変換酵素”に対して阻害剤がすでに設計
されている。一般的に、これらの拮抗阻害剤は“ジペプ
チド”であり、変換酵素とそれとの相互作用は“ジペプ
チド”が変換酵素と特異的に相互作用する能力を高める
ために、ペプチド結合に関わっている“残基′を修飾す
ることにより安定化される。よってペプチド結合は、特
異的に選択したカルボン酸とアミン（アミノ酸である必
要はない）に加えられる。

これらの“ジペプチド”を、意図する目標である変換酵
素の輪郭を相補するように３次元的に並べて配列させる
。同様な錠と鍵の空間的配置が２本発明の結晶化レニン
の表面輪郭に相補するように設計された分子により得ら
れる。“表面”には内側に面している回転部が含まれ、
そして明確に活性部位が含まれることが理解される。さ
らに、“相補的な”は、“適合する”空間的構造に加え
。

タンパク質とその表面輪郭に適合する分子との相互作用
が吸引的で陽性であることを意味することが理解される
。これらの相互作用は、水素結合。

イオン的または疎水的親和力であろう。

従って１本発明では１組換えレニン（またはプロレニン
）の表面の３次元の輪郭に相補的な３次元の輪郭により
特徴づけられる。レニンに対する類似の安定化ペプチド
拮抗阻害剤（２から１５のアミノ酸）を意図している。

これに関連するペプチドにより、その拮抗阻害剤は、残
基の数より１つ少ない数に対応するカルボン酸・アミド
結合を含むことが示される。関与するカルボン酸とアミ
ンは、α−アミノ酸である必要はない。そのペプチドの
特に望ましい起源はプロレニンの“プロ”部分のアミノ
酸部分である。

第２に、ヒトのレニンは極めて特異的酵素活性を有する
が、しかし、それは非霊長類のレニンの活性とは著しく
異なる。ヒトのレニンは、ヒトのアンジオテンシノーケ
ン中のＬｅｕ−Ｖａｌ結合を、そして非霊長類のアンジ
オテンシノーケン中のＬｅｕ　−Ｌｅｕ結合を切断する
。他の既知の基質は存在しない。非霊長類のレニン、例
えばネズミの顎下腺レニンは、ヒトのアンジオテンシノ
ーゲンを切断しない。それゆえ、ヒトのレニンは非霊長
類のレニンとは異なった独自の特異性を有している。

第３に、たとえ３次元の構造決定の補助がなくても１本
発明の精製レニンは、評価に対する新しい手法としての
、インビトロでのレニン阻害剤の選別における試薬とし
て重要である。最近使用可能となった純粋でないレニン
の標品は、試験結果におよぼす不純物の影響により混乱
した情報を生ずる。例えば、それ自身がレニンに対する
阻害剤。

活性化剤または基質であることがわかっている混入物は
、評価を妨げる。よって、レニンの阻害剤に関する最近
の選別技術における実質的な進歩は。

精製したヒトのレニンタンパク質が使用可能であること
により効果が出るであろう。

さらに、タンパク質の組換え生産のための物質が使用可
能となることは、配列の修飾を可能にするので５例えば
部位特異的突然変異処理により。

基質特異性のような生産タンパク質の特徴の修飾が可能
である。よって１本発明の組換えベクターは、プロセッ
シング変換の範囲に対する。一連の活性化プロテアーゼ
を得るための出発物質を提供する。

最後に１本発明の組換えレニンは、生物学的な試料中の
ヒトのレニンの特異的および敏感な診断検定を提供する
ことにおいても有用である。免疫的検定は研究では用い
られているが、現在、市販されているような血液中のレ
ニンの直接的な免疫的検定はない。レニンまたはプロレ
ニンの標準量を知ることは、適切な治療を決定する上で
非常に重要である（Ｌａｒａｐｈ、　Ｊ、　Ｈ，、肚匣
圓凱旦憇」閃ｕｔｉ　　　Ａ ｔｈｅ　Ａｎ　１ｏｔｅｎｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　：
　Ｔｈｅｒａ　ｅ　　ｃ　　　ｒｏａｃｈｅｓ（１９８
４）　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ　４６−６９）、
−現在用いられている臨床検定は、レニン活性に基づい
ており、即ち酵素検定であり、相当な誤りを生じやすい
。臨床医に、現在では研究のみに使用可能な直接的な免
疫的検定の手法を提供するためには、精製したヒトレニ
ンの適当な標準物を提供することが必要ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　５ｏｃｉｅｔ　　Ｉｆ　　ｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　　
（１９８４）　　１０　：　　１５２；０ｊｉｈａｒａ
、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、　　（同書）　　（１９８４
）　１０　：　４７　；Ｇａ１ｅｎ、Ｆ、ｘ、ｌ　　ｅ
ｔ　ａｌ、　　　Ｊ、Ｃ１１ｎ　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ　　Ｍｅｔａｂ（１９７９）亙：　１０４１−１０４
３）。精製した組換えプロレニンとレニンの有用性は、
この物質を、゛直接的免疫検定と現在用いられているレ
ニン活性の検定の両方の標準化と測定に対して提供する
であろう。

よって、プロレニンまたはレニンの血液中の標準量を、
病気を評価するための予備的な診断として。

そしてまた治療法の有効性を追跡するための監視系とし
て、の両方に用いることができる。

且Ｊ［鼾モＪ京 細胞を形質転換したり、ベクターを作成したり。

メソセンジャーＲＮＡを抽出したり、　ｃＤＮＡライブ
ラリーを調製したりなどするために用いられているほと
んどの技術は、当分野で広〈実施されているものであり
、そしてほとんどの当業者は、特別の条件や手順を記述
する標準的な由来物質に通じている。しかしながら便宜
上、以下の節は指針として役立つものであろう。

Ｃ，１，ｕ　　　と、ド装置 原核生物と真核生物の系の両方がレニンをコードする配
列を発現するために使える。もちろん原核生物の宿主は
クローニングの手順に最も便利である。原核生物は通常
、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｔ）の種々の株である。しかし。

他の微生物の株も使用し得る。用いる宿主に和合する種
に由来する複製部位や制御配列を含むプラスミドベクタ
ーを用いる。例えば、エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は１代表的には、　Ｂｏｌｉ
ｖａｒ等ノＧｅｎｅ　（１９７７）　２　：　９５によ
るエセリシア・コリー　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｔ）種に由来するプラスミド。

ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。ｐＢＲ
３２２はアンピシリンやテトラサイクリン耐性の遺伝子
を含み、このように所望のベクターを構築する上で、保
持することができるか破壊することができるかのどちら
かの付加的な目印を供する。リボゾーム結合部位配列に
沿って転写開始のプロモーター、また随意にオペレータ
ー、を含むとここでは定義されているふつうに用いられ
る原核生物の制御配列は、β−ラクタマーゼ（ベニシリ
ナーゼ）やラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈ
ａｎｇ。

ｅｔ　ａｌ、　　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７７）　１９８
　：　１０５６）　、　　）リプトファンＤｒｐ）プロ
モーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９８０）　
８　：　４０５７）、　そしてラムダ由来Ｐｔ、プロモ
ーターとＮ−遺伝子リボゾーム結合部位（ＳｈｉＩｌａ
ｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１
）２９２　：　１２８）のようなふつうに用いられるプ
ロモーターを含む。

細菌に加えて、酵母のような真核細胞性の微生物をも宿
主として用いることができる。サツカロマイセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）の実験室株のパン酵母がよく使われるが、数種
の他の株もふつう利用できる。例えば、　Ｂｒｏａｃｈ
、　Ｊ。

Ｒ，、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９８３）　１０１　：３
Ｑ７の２μの複製開始点あるいは他の酵母の和合できる
複製開始点（３００を見よ）を用いているベクターを用
いる。酵母ベクターの制御配列は解糖酵素の合成に対す
るプロモーターを含んでし）る（ｌｌｅｓｓ、　ｅＬ　
ａｌ、　　Ｊ　Ａｄｖハ狂肌」町（１９６８）　７　：
　１４９　；　１ｌｏｌｌａｎｄ、　ｅｔ　ａｔ。

肛匹匝畦旦■（１９７８）　１７　：　４９００）。当
分野で知られている付加的なプロモーターは、グリセリ
ン酸３−リン酸キナーゼに対するプロモーター（旧ｔｚ
ｅｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８０
）　２５５　：　２０７３　）や。

他の解糖酵素に対するプロモーターも含む。成育条件に
支配される転写の付加的な利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ１酸性ホスフアターゼ。

窒素代謝に関連する分解酵素、そしてマルトースやガラ
クトースに関与する酵素、に対するプロモーター領域で
ある。ターミネータ−配列は、コード配列の３゛未滴に
あるのが望ましいということも信じられている。そのよ
うなターミネータ−が。

酵母由来の遺伝子のコード配列に続いて３゛非翻訳領域
内に見られる。

もちろん、多細胞生物由来の真核性宿主細胞の培養液中
でポリペプチドをコードしている遺伝子を発現させるこ
とも可能である。例えば＋　Ａｘｅｌ。

等、　４，３９９．２１６を見よ。これらの系は、イン
トロンを切り出す能力という付加的な利点を持ち、従っ
てゲノム断片を直接発現させるのに用いれる。

有用な宿主細胞系は、　ＶＨＲＯ，ｌ１ｅｌａ細胞、そ
してチャイニーズハムスター卯巣（ＣＩＩＯ）細胞を含
む。そのような細胞用の発現ベクターは２例えば一般に
用いるシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０）由来の初期
および後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、
　Ｎａｔｕｒｅ　（１９７Ｂ）匠：　１１３）、あるい
はポリオーマ、アデノウィルス２．牛のパピローマウィ
ルス、あるいはトリ肉腫ウィルスに由来するような他の
ウィルスのプロモーター、のような哺乳動物の細胞に和
合できるプロモーターや制御配列を含む。制御できるプ
ロモーター、　ｈＭＴＩＩ　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、　
ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）烈９　：　７９
７−８０２）も使える。哺乳動物細胞宿主系の形質転換
の一般的見地はＡｘｅｌ（上述）に述べられている。“
エンハンサ−”領域は最適な発現に重要であるというこ
とも今や明らかになっている。これらは一般的に非コー
ドＤＮＡ　？ｉｌＴ域内のプロモーター領域の上流ある
いは下流に見出されている。複製開始点は、もし必要な
ら、ウィルス起源から得られる。しかし、染色体への組
み込みは、真核生物のＤＮＡ複製の共通の機作である。

Ｃ１２，瓜覧軟換 用いる宿主細胞により、形質転換はその細胞に適当な標
準的な操作を用いて行う。Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、。

Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｅｔ　　（Ｉ
ＩｓＡ）　　（１９７２）　　６９　　：　　２１１０
　　で述べているように塩化カルシウムを用いるカルシ
ウム処理、あるいはＭａｎｉａｔｉｓ等のＭｏ１ｅｃｕ
ｌａｒＣ１ｏｎｉｎ　　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　
　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）　ＣｏｌｄＳｐｒｉｒｉ
ｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐ２５４内に述べ
られているＲｈＣｌ、を法は、原核生物あるいは実質的
な細胞壁の障壁を含む他の細胞に対して用いれる。その
ような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、　Ｇｒ
ａｈａｍとｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、−■ｐセｎ−（１９
７Ｂ）　５２　：　５４６　、ときにはＷｉｇｌｅｒ、
　Ｍ、、等のＣｅ１ｌ　（１９７９）　１６　：　７７
７−７８５で一部変更されているようにリン酸カルシウ
ム沈澱法も使える。酵母への形質転換は、　Ｖａｎ　５
ｏｌｉｒ＋４ｅｎ＋Ｐ、１等のＪ、　Ｂａｃｔ　（１９
７７）１３０　：　９４６あるいはＨｓｉａｏ。

Ｃ，Ｌ、、等のＰｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、（ＵＳＡ）　（１９７９）７６　：　３８２９の
方法により行なえる。

Ｃ１３，さ又又二揚莱 望むコード配列や制御配列を含む適当なベクターの構築
は、当業者によく知られている標準的な連結および制限
操作を用いる。単離したプラスミド、　ＤＮ八へ列、あ
るいは合成オリゴヌクレオチドを、切断し、ＡＰＩ整し
、そして望む形態に再連結する。

ベクターを形成するＤＮＡ配列は、多くの供給源より入
手できる。骨格ベクターや制御系は、構築の際の配列の
大半に用いられる入手可能な“宿主”ベクターに一般に
見出される。典型的な配列は上記の第１節に示しである
。適当なコード配列に対して、初期の構築は、　ｃＤＮ
＾あるいはゲノムＤＮＡライブラリー由来の適当な配列
を復活させることであり得るし１通常そうである。しか
し、一度配列が開示されれば１個々のヌクレオシド誘導
体から始めて、インビトロで完全な遺伝子配列を合成す
ることは可能である。手頃な長さ１例えば５００〜１０
００ｂｐの遺伝子の完全な遺伝子配列は９個々の部分に
一致する相補的なオリゴヌクレオチドを合成して、デオ
キシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて一本鎖の部分的に重なり合わない部分を
珈めることにより調製する。

この手法は既知の配列を有するいくつかの遺伝子を構築
する際に首尾よく用いられている。例えば。

Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（１９８１）
　２９２　：　７５６　；　Ｎａｍｂａｉｒ。

Ｋ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ　（１９
８４）　２２３　：　１２９９　；　Ｊａｙ。

Ｅｒｎｅｓｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９
８４）　２５９　：　６３１１を見よ。

合成オリゴヌクレオチドは、　Ｅｆｉｍｏｖ、　Ｖ、Ａ
、、等（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　（１９
Ｂ２）　６８７５−６８９４）の方法により調製したり
、市販の自動オーリボヌクレオチド合成機を用いて調製
することができる。アニールさせる前の一本鎖のリン酸
化、あるいは標識化するためのリン酸化は９例えば、　
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）。

１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｇ、　５ｍＭジチオスレイトール、
１〜２ｍＭ＾ＴＰ＋　１．７　ｐｍｏｌｅ　　７３２Ｐ
−ＡＴＰ　（２，９ｍＣ１／ｍ　ｍｏｌｅ）。

Ｏ０ｌｌｌＩＭスヘルミジン、および０．１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ存在下で。

Ｉｎ　ｍｏｌｅの基質に対して約ｌＯ単位のポリヌクレ
オチドキナーゼ、という過剰量を用いて達成される。

一度、望むベクターの構成成分がこのように手に入ると
、標準的な制限手順および連結手順を用いて、切り取っ
たり、連結したりすることができる。

適当な制限酵素処理を、当分野で一般に理解されている
条件下、およびこれらの市販の制限酵素の製造者により
特定されている明細下で１部位特異的［］ＮＡ分解を行
う。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ
。

Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを見よ。一般的に、約
１．ｃｒｇのプラスミドあるいはＤＮＡ配列を約２０μ
ｌの緩衝液中で１単位の酵素で切断する。この例では、
典型的には過剰量の制限酵素を、　ＤＮＡ基質の完全分
解を行うために用いる。約３７℃で約１時間がら２時間
という保温時間が作用可能であるが、変化は許容できる
。各保温後、フェノール／クロロホルム抽出でタンパク
質を除き２次いでエーテル抽出することもあり、核酸は
水層よリエタノール沈澱で回収する。必要に応じて、切
断した断片の大きさの分離をポリアクリルアミドゲルあ
るいはアガロースゲル電気泳動で標準的な操作を用いて
行う。

大きさの分離の一般的な記述はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

（１９８０）的：　４９９−５６０に見られる。

制限分解断片は、保温時間約１５〜２０分、　２０〜２
５”Ｃ，５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐｔ（７，６）、　５０
ｍＭ　ＮａＣ１，６ｍＭ　ｈｇｃｌ、。

６ｍＭ　ＤＴＴ　、および５〜１０μＭ　ｄＮＴＰ中で
、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の
存在下。

エセリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
ｉ）　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー）の大断片を
用いて処理することにより平滑末端にする。クレノー断
片は４種のｄＮＴＰが存在しさえすれば、５°の粘着末
端を埋めるが、３゛の突き出した一本鎖は削って戻す。

望むなら１選択的な修復を、粘着末端の性質により示さ
れる限度内でｄＮＴＰのうちの１つだけあるいは選択し
たｄＮＴＰを供給することにより行なえる。クレノー処
理後、混合液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させる。

Ｓ１ヌクレアーゼあるいはＢａｔ−３１で適当な条件下
で処理すると、どんな一本鎖部分も加水分解される。

連結は、以下の標準的な条件や温度の下で１５〜５０μ
ｌの体積中で行う。例えば、２抛Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ（
ａｌｌ　　７．５）、　　１０ｍＭ　　ＭｇＣｈ、　　
１０ｍＭ　　ロＴＴ、　　３３／Ｊｇ　　／１ａｉｌＢ
ＳＡ　、　１０ｍＭ−５０ｍＭ　ＮａＣ１，そして“粘
着末−５ｆＩ”連結用には４０，１７Ｍ　ＡＴＰ、　０
．０１〜０．０２　（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、０℃、あるいは“平滑末端”連結用には１ｍＭ　
ＡＴＰ、　０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４　Ｄ
ＮＡリガーゼ、１４℃、のいずれかである。分子間“粘
着末端”連結はふつう３３〜１００．ｃｆｇ／ｍＡ全Ｄ
ＮＡ濃度（５〜１１００ｎ全末端濃度）で行う。分子間
“平滑末端”連結は１μに全末端濃度で行う。

“ベクター断片”を用いるベクター構築では。

５°　リン酸を除去してベクターの再連結を防ぐために
、細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）あるいは子牛
小腸のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）でベクター断
片をふつう処理する。分解は、約１５０ｍＭＴｒｉｓ　
（ｐＨ８）中で、　μｇベクターあたり約１単位のＢＡ
ＰあるいはＣＩＰを用いて６０℃、約１時間、　Ｎａ”
とＨｇ＋ｇの存在下で行う。核酸断片を回収するため。

フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱
させて調製する。他には、付加的な制限酵素分解と不必
要な断片の分離により二重に消化されたベクターでは、
再連結を防ぐことができる。

配列の修飾を要求するｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ由
来のベクタ一部分に対して１部位特異的プライマー指向
変異が用いられる。これは、限定したミスマツチを除い
て変異をかけられるべき一本積ファージＤＮＡに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、
所望の変異を示す。簡単に言うと、ファージに相補的な
鎖を直接合成させるために合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用い、生じた二本鎖ＤＮＡでファージ支
持宿主細菌を形質転換する。形質転層した細菌の培養液
を上層寒天にプレートし、ファージを保持する単一細胞
からのプラーク形成を促す。

理論的には、新しいプラークの５０％は、一本積として
変異のかかった形を持つファージを含む。

５０％はもとの配列である。正確な対のハイブリダイゼ
ーションは起こるが、もとの鎖とのミスマツチによりハ
イブリダイゼーションを防ぐのに充分な温度で、リン酸
化した合成プライマーと生じたプラークをハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズするプラークを選
び取り、培養し。

ＤＮＡを回収する。

Ｃ９４，盪築東確認 以下に示した構築で、プラスミドの構築の正確な連結は
、叶、　Ｍ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　（Ｃａ５ａｄａｂａ
ｎ、　Ｍ、＋ｅｔ　ａｌ、　　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ
ｌ　（１９８０）　１３８　：　１７９−２０７）から
得たエセリシア・コリー（Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）株ＭＣ１０６１をまず形質転換するか、あるい
は他の適当な宿主を連結混合液で形質転換することによ
り確かめる。成功した形質転換体は、当分野で理解され
ているように、アンピシリン、テトラサイクリン、ある
いは他の抗生物質耐性、あるいはプラスミド構築の仕方
により他のマーカーを用いて。

選択する。形質転換体からのプラスミドは、Ｃｌｅｗｅ
ｌｌ。

Ｄ、　Ｂ、、等のＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃ
ｉ　（ＵＳＡ）　（１９６９）　６２　：１１５９の方
法に従って１時にはクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅ
ｗｅｌｌ、　Ｄ、　Ｂ、＋　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
　（１９７２）１１０　：６６７）に続いて、調製する
。単離したＤＮＡを。

制限酵素で分析し、および／もしくはＳａｎｇｅｒ＋　
Ｆ、ｒ等のＰｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　（
ＵＳＡ）　（１９７７）　７４　：　５４６３゜さらに
はＭｅｓｓｉｎｇ＋等のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ　（１９８１）９　：　３０９のジデオキシ法、
あるいはＭａｘａｍ等のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
　ｍｏｌｏ　　（１９８０）６５　：　４９９の方法に
より、配列決定する。

Ｃ・５・貫丞旦亙逍土 ここでクローニングや発現に用い、た宿主株は以下のと
おりである。

クローニングやシーフェンシング用に、そしてほとんど
の細菌のプロモーター制御下での構築物の発現用に、エ
セリシア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）
株ＭＣ１０６１を用いた。

哺乳動物の発現に用いた細胞は、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞あるいはＡＬＴ−２０と表される
ヒトの脳下垂体の細胞系である。

（以下余白） （実施例） 次の実施例は、実例を示すものであり１本発明を限定す
るものではない。プレプロレニンをコードしているＤＮ
Ａおよびそのプロセッシングされた生産物は、腎臓細胞
のｍＲＮＡから作成したｃＤＮＡライブラリーを検索す
る事により、得られる。しかし。

その配列は既知であり、そして、修飾されたヒトのシグ
ナル配列を前にもつヒトのプロレニンの完全なコード配
列を含む一つのベクターを保持する細胞がＡｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎに寄託されているので、この手順を繰り返す必要はな
いであろう。ｐＰＰ１４を保持するＣＢＩ−２８５は、
　１９８５年３月２６日にＡＴＣＣに寄託され、その受
理番号はＣＲＬ８７５８である。完全な遺伝子配列を得
るための方法は、一度その目的の配列が知られていれば
、現在使用可能である。例えば、　Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ
、等のＮａｔｕｒｅ（１９８１）　２９２ニア５６　Ｎ
ａｍｂｉａｒ、　Ｋ、Ｐ、等の５ｃｉｅｎｃｅ　（１９
８４）２２３　：１２９９あるいはＪａｙ、　Ｅ、等の
Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８４）　２承：６３１１
を参照せよ。

施例１　プロレニンをコードする配列の調製ｃＤＮＡラ
イブラリーは、事故犠牲となった人の腎臓から精製した
。オリゴｄＴを付加したポリＡ”ＲＮＡから調製した。

ｃＤＮＡライブラリーは、バクテリオファージ　ベクタ
ーＡｇｔｌｏ中で作成し、そして。

マウスの下顎腺のレニンｃＤＮＡ断片で検索することに
より、ヒトの遺伝子ライブラリーから得たＣｈａｒｏｎ
−４ヒトレニン遺伝子クローンの適当な断片をプローブ
として検索した。そのライブラリーはｍＲＮＡから二本
鎖のｃＤＮＡを得るための標準的手順、　ｃＤＮ＾のＤ
ＮＡポリメラーゼ■　（クレノー）による平滑末端化。

商業的に入手可能なＨｃｏ　ＲＩリンカ−の添加、　Ｅ
ｃｏ　Ｒ１による切断、そして＋　１Ｅｃｏ　Ｒ１で切
断したλｇｔｌｏベクターに断片を連結する事、によっ
て調製した。

２つの有意に反応したｃＤＮ＾クローンは、２つとも。

Ｓａｎｇｅｒのジデオキシ法（前出）を用いて配列決定
したところ、シグナル配列の５゛末端で欠失した７塩基
対を除いて、完全なレニンをコードする配列と３′の翻
訳されない領域を含んでいることが示された。その２つ
のクローンは、コーＦ　領域（７）１２１１　ｂｐ、そ
れに続いて完全な３゛の１９８　ｂｐの翻訳されない領
域、その次に続いてポリＡ末尾を含んでいる。配列の、
適当なプレプロレニンのコドンと読み取り枠への割り当
ては、すでに報告されているＩｍａｉ等（前出）の配列
と比較することにより行なった。２つのクローン化され
た断片は、第１図に示したように、７６２の位置の特有
のＥｃｏ　Ｒ１部位から生成した。（ゲノム構造は複雑
であり、　１０のエキソンを含んでいることが、ヒトの
遺伝子ライブラリーを検索することによってさらに示さ
れている。ゲノムのクローンは以下の構築には用いられ
なかった）。

プレプロレニンタンパク 配列を２つのＥｃｏ　ＲＩ挿入として，　ｐＵｃ９に移
入しクローン化したベクターｐＨＲ１とｐＨＲ２を得た
。ｐＨｌ１１は５゛部分を含んでおり，　ｐＨＲ２は３
゛部分を含んでいる。ｐＨＲ１とｐＨＲ２は，λｇｔｌ
ｏがらＥｃｏ　ＲＩを用いてｃＤＮＡを切り取り，生じ
た断片の各々をＥｃｏ　Ｒ１で切断したｐＵｃ９に連結
することによって調製した。

施伺２　プレプロレニンの哺乳動物発　ベクタ二至盪策 哺乳動物宿主と和合性であり，そしてヒトのメタロチオ
ネイン−ＩＩ　（ｈＭＴ−Ｉｆ）プロモーターの制御下
にあるコード配列を持っているプレプロレニンの発現ベ
クターｐＰＰ１４の構築を第２図に示す。

ｐＰＰ１４を構築するためにｐＭＴ．ＰＲＯを宿主発現
ベクターとして用いた。ｐＭＴ．　ＰＲＯは１９８５年
２月１３日に登録されている米国特許番号７０１，２９
６に記述されているｐ　ＩＩ　Ｓ　１と米国特許番号６
１６．４Ｂ８と６２２，６３９　　（それぞれ１９８４
年６月１日と．　１９８４年６月２０日に登録）に記述
されているｐＭＴ４０１に類似している。既述の米国特
許出願のすべてが本願の出願人に譲渡され，本願に開示
されている。

ｐｌ（ＳｔとｐＭ７４０１両方のプラスミドはｐ８４１
１　（Ｋａｒｉｎ。

Ｍ．、ｅｔ　ａｌ，　　Ｎａｔｕｒｅ（１９８２）２９
９　：２９７−８０２）からのｈＭＴ−　ｎ配列の８４
０　ｂｐを含んでおり，それはｈＭＴ−　ＩＩ遺伝子の
−７６５の旧ｎｄｌｌｒ部位から＋７０番目の塩基にわ
たっている。ｐＭＴ．ＰＲＯは，類似のｈＭＴ−ＩＩ断
片を含んでいる。しかし６それはさらにｐｔｌｃ８に連
結した時にＡＴＧ開始コドンを含んでいる。３つのベク
ターすべては，　ｐＵＣ８に適当なｈＭＴ−　ＩＩｎ配
列連結して得た。（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、、ｅｔ　ａｌ
、　　Ｇｅｎｅ　（１９８２）１９：　２５９−２６８
）。ｐＭＴ、ＰＲＯを構築するために、　ｈＭＴ−カ配
列をｐＭＴＩＩ−ＢＰＶ　　（Ｋａｒｉｎ、　Ｍ、、ｅ
ｔ　ａｌ、　ＰｒｏｃＮａｔｌ　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ
　　（ＵＳＡ）　　（１９８３）８０：４０４０−４０
４４）　　からＨｉｎｄ　ｍ　／　Ｉ（ｉｎｄ　ｍ断片
として切り出し、それからプロモーターと５°転写部分
を得るためにＢａｍＨＩで切断した。ｈＭＴ−ＩＩ配列
を含む旧ｎｄ　ｍ　／　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ断片を旧ｎｄｍ
／ＢａｍＨＩで切断したｐＵｃ８に挿入しｐＭｒ：ｐｐ
。

を得た。

ｐＰＰ１４を構築するために、　ｐＭＴ、ＰＲｏをＢａ
ｍ１ｌＩで切断し、４種のｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリ
メラーゼ（クレノー）を用いて埋め、それからＥｃｏ　
ＲＩで切断した。Ｅｃｏ　Ｒ１はＡＴＧ開始コドンに続
く特有のＢａｍＨＩ部位のすぐ下流を切断する。プレプ
ロレニン遺伝子の５°部分をｐＨＲ１からＥｃｏ　ＲＩ
で切断して切り出し、開環したｐＭＴ、ＰＲＯベクター
のＥｃｏ　Ｒｒ末尾に粘着末端条件下で連結した。挿入
のおよそ５０％が正しい方向で挿入されるだろう。それ
から連結混合液を４種のｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメ
ラーゼ■　（クレノー）で処理して残存する未連結Ｅｃ
ｏ　ＲＩ部位を平滑にした。最終的に、ベクターを連結
によって再環化し、その混合液でＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１
０６１をＡｍｐ’に形質転換した。ｈＭＴ−ｎのプロモ
ーター領域と５°転写部分から供給されたＡＴＧと読み
取り枠に合うように、プレプロレニンのコード配列の５
°部分が入った。正しい構築物を持つコロニーを選び培
養した。中間体プラスミドの構築は制限酵素分析と配列
決定により確かめた。

得られた中間体プラスミドは、　ｐＨＲ−２より得たＥ
ｃｏ　Ｒ１で切り出した３°部分を正しい方向で組み込
み得ないようであった。この問題は、　ｐＵｃ８由来の
中間体のバックボーンベクターをｐＵｃ９の対応する配
列と取り換えることで打開した。これをなすために、中
間体ベクターを旧ｎｄｌＩ［−とＥｃｏ　Ｒ１で処理し
、ｈＭＴ−ｎプロモーター／プレプロレニン５°部分を
含む断片を旧ｎｄｎＩ／Ｅｃｏ　ＲＩで切断したｐＵｃ
９に挿入した。それにより生成する修飾された中間体を
Ｅｃｏ　ＲＩで切断し、　ｐＨＲ−２から単離したＥｃ
ｏ　Ｒ１／Ｅｃｏ　Ｒ１断片と連結して、完全なプレプ
ロレニンコード配列を含んでいるｐＰＰ１４を作った。

ｐＭＴ、ｒ’ＲｏのＡＴＧ　開始コドンと、プレプロレ
ニンのコード配列の５°末端部分の間の接合領域は。

Ｂａｍ　ＩＩＩとＥｃｏ　ＲＩで切断した部位をそれぞ
れ修復した後平滑末端結合によって接合されているので
。

接合領域の配列は５’−ＣＣ工σπＩＴＴＴＣＣＧ　Ａ
　Ｔ　Ｇ　Ｇで。

このように下線の引かれたＡＴＧ開始コドンがコード配
列の残りと共に、読み取り枠にあって位置している。上
線は、　Ｂａｍ　ＩＩＩ（！：ＥＣＯＲ１部位を埋めた
接合を示している。こうして、シグナル配列のプレプロ
ティンのＮ末のコード配列はＭｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−
ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｒｐで、もとの対応するＮ未配列で
あるＭｅｔ−ａｓｐ−ｇｌｎ−ｔｒｐと比較して、２つ
のアミノ酸が付加している。

結果としてできたベクターｐＰＰ１４を、チャイニーズ
ハムスター卵巣（ＣＩＩＯ）とＡＬＴ−２０細胞を含む
宿主補乳動物細胞でのプレプロレニンの発現のために、
下記のように用いた。

“チャイニーズハムスター卵巣”　（ＣＩＩＯ）細胞は
標準細胞系統ＡＴＣＣＣＣＬ−６１とその誘導体ばかり
でなく、同じ組織から単離された関連細胞も含んでいる
。誘導体は、もとの系統と遺伝子的に、あるいは表現的
に、異なるであろうその系統変異株であるが、故意ある
いは偶然の変異により、それから得られたものである。

同様にＡｔＴ−２０細胞は、　ＡＴＣＣ細胞系統ＣＣＬ
−８９と。

上記の関連細胞と誘導体を含んでいる。

ｐＰＰ１４構築は、また、　５ｖ４０　（塩基５１７１
−１０４６）からの１１２０ｂｐのｔｌｉｎｄＩ［［／
旧ｎｄｎ［断片を、そのプロモーターの上流の旧ｎｄｌ
ｌｌｒ部位に挿入することによって修飾した。挿入断片
はＳＶ４０エンハンサ−領域を含んでいる。

２種の細菌発現ベクターを調製した；１つは成熟レニン
に対しくｐＬＦ５と称する）、もう１つはプロレニンに
対する（ｐＡＡ６と称する）ものである。

両方の場合において、宿主プラスミドはｐＫＴ５２で。

ＡＴＧの続く″ｔｒｃ’プロモーターを含む。ｐＫＴ５
２の構築はＵ、Ｓ、通し番号６１６．４８８と６２２．
６３９　　（前出）に記述されている。簡単に言えば、
“ｔｒｃ”プロモ−ターはｔｒｃプロモーターの上流部
分とｌａｃプロモーターのオペレーターを含んだ下流領
域を含んでおり、これらのプロモーターを含む２つの簡
単に入手可能なプラスミドから独自に調製した。Ｂａｍ
ｌ１１／ＨｉｎｄＩ［ｒカセットとしてｔｒｃプロモー
ターを構築するために、ハイブリッドプロモーターを含
む中間体プラスミドｐＫＫ１０−０を調製した。

ｐＫＫｌｏ−０を調製するため、　ｐＥＡ３００（Ａｍ
ｍａｎ、Ｅ　、ｅｔａｌ、　Ｇｅｎｅ　（１９８３）　
２５：１６７−１７８）　　をＰｖｕ　　ＩＩとＣ１ａ
　　！で切断し、　ＤＮＡポリメラーゼ（クレノー）存
在下で、　ｄＣＴＰのみを用いて埋め１次にマングビー
ンヌクレアーゼで処理し、大きい方のベクター断片を単
離した。このベクター断片はｔｒｐプロモーターの上流
部分を含んでいる。この断片にｐＧＬｌｏｌ　（Ｌａｕ
ｅｒ、　Ｇ、ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ａ　　１．
　Ｇｅｎｅｔ（１９８１）　１：１３９−１４７）から
切り取った５ｓｂｐの平滑末端のＨｐａ　ＩＩ／Ｐｖｕ
　ＩＩ切断物、これはｐＧＬｌｏｌをＰｖｕ　ＩＩおよ
び１１ｐａ　ＩＩで切り続いてｄＧＴヒおよび放射能標
識したｄＣＴＰの存在下で修復して調製したものである
が、これを断片に連結した。この断片はｌａｃオペレー
ター領域を含んでいる。これら２つの平滑末端断片を連
結して生成したものがｐＫＫｌｏ−０である。

Ｅｃｏ　Ｒ１で切断し、クレノー断片で埋め、そこにＢ
ａｍ旧のリンカ−５’−ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＧを挿入す
ることにより、　Ｂａｍ　１１１部位をｐＫＫｌｏ−０
のｔｒｐ／１ａｃ（ｔｒｃ）プロモーター／オペレータ
ーの上流に挿入した。

生じたプラスミドｐＫＫ１０−１をＰｖｕ　ＩＦで切断
し、そこにＮｃｏ　　Ｉリンカ−５゛−八ＣＣＡＴＧＧ
Ｔを連結し、　Ｎｃ。

■で切断し、埋めて、その後５°−ＧＣＴＧＣＡＧＣＣ
八八ＧＣＴＴＧＧ−３″とその相補鎖の２つの相補的な
オリゴヌクレオチドとして調製したＰｓｔ　　Ｉおよび
１ｌｉｎｄｎ１部位を含む二本鎖のリンカ−を連結した
。この連結混合液でＥ、ｃｏｌｉを静ｐ′に形質転換し
た。単離したプラスミドＩ）ＮＡをＢａｍ旧と旧ｎｄＩ
［［で切断し、電気泳動して得られた小さいＢａｍ旧／
Ｈｉｎｄｌ［Ｉ断片はｔｒｃプロモーターを含んでいる
。

ｐＫＴ５２を完成させるため、　ｔｒｃプロモーターを
含むＲａｍ旧／Ｈｉｎｄｌ［ｒ断片を、　　Ａｍｐ’遺
伝子と複製開始点を含むｐＸＫｌｏ−２（Ｂｒｏｓｉｕ
ｓ、　Ｊ、、Ｇｅｎｅ　（１９８４）２７：１６１−１
７２）のＢａｍ旧／旧ｎｄＩ［［切断で得られた大きい
断片に連結した。生じたプラスミドｐＫＫ２３３−１を
Ｐｖｕ　　１で完全に分解し、そしてＢｇｌ　　Ｉで部
分分解し、　ｐＵｃ８由来で、　Ｐｓｔ　　１部位を欠
いているがアンピシリン耐性遺伝子に相当する部分を含
む、３６０ｂｐのＰｖｕ　　Ｉ／Ｂｇｌ　　１断片を連
結した。この連結混合液でＥ、ｃｏｌｉを形質転換し、
　ｔｒｃプロモーターの次にＰｓｔ　１部位が唯一存在
することで、形質転換体を選択した。この正しい構築物
、ρにに２３３−２．をＥｃｏ　Ｒ１とＰｖｕ　ＩＩで
切断し、　ｄＡＴＰとｄＴＴＰで埋め、正しい構築物ｐ
ＫＴ５２を得るために再連結した。

ｐＫＴ５２は、目的のｔｒｃプロモーター、下流のＡＴ
Ｇ開始コドン、および下流のＮｃｏ　１部位とＰｓｔ　
　１部位と旧ｎｄＩ［［部位を含んでいる。

ｐＬｆ’　５を得るために（第３図ａに示す）、レニン
のコード配列を次のように調製した。ｐＨＲ１をＥｃ。

ＲＩで分解し、　６９８ｂρの断片を単離することによ
ってレニンのｃＤＮＡの５″部分を切り取った。その断
片を５ａｕ３ＡＩで分解し、成熟レニンのコード配列の
９個のコドンから始まっている４７２　ｂｐの下流側の
断片を得た。この断片を、　Ｂａｍ　ＩＩＩ／Ｅｃｏ　
Ｒ１で分解したｐ８Ｒ３２２に連結した。結果として得
られた中間体プラスミドをＢａｍ　ＩＩＩ／Ｐｖｕ　Ｉ
Ｉで分解し、欠失コドンを供給する一対の合成相補オリ
ゴヌクレオチド ５’　　−ＣＴＧＡＣＣＣＴＴＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＣ
ＣＴＣＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＣＣＧＴＴＧＴ
ＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＣＴＡＧ−５”をその分解
プラスミドと連結した。上流末端に近接したＰｖｕ　Ｕ
部位をこの方法により造り直す。この結果として得られ
た中間体プラスミドをＥｃｏ　Ｒ１とＰｖｕ　Ｉｆで分
解して、成熟レニンの５”側をコードする配列を含む５
０１ｂｐの断片を得た。

３′末端の配列は、　ｐＨＲ２をＳａｃ　Ｉで切断し、
　Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端にし、旧ｎｄＩ［Ｉリン
カ−を加え、そして旧ｎｄｌ［ｒで切断したｐＨＲ２誘
導体のＩＥｃｏ　ＲＩ／旧ｎｄｌｌ１分解による６４５
ｂｐの断片として得た。このＥｃｏ　Ｒ１／ｌ１ｉｎｄ
　ｍ分解物をＩＥｃｏ　Ｒ１と旧ｎｄｌｌＦで分解した
ｐＵｃ９ヘクローン化した。

この２つの部分を、　ｐＫＴ５２のＮｅｏ　Ｉ　　（修
復）／１１ｉｎｄｌ［［分解物に連結した。このことに
より、　ｐＫＴ５２はＬｒｃプロモーターの下流に平滑
のＡＴＧを供給する（第３図ａ参照）。この結果生成す
る発現プラスミドｐＬＦ　５は、　ｔｒｃプロモーター
の制御下で。

ＡＴＧ開始コドンと読み取り枠の合ったレニンの全コー
ド配列を含んでいる。

プロレニンの原核生物発現ベクターｐＡＡ６　（第３図
ｂ）を得るため、　ｐＨＲ１をＡｖａ　　ＩとＥｃｏ　
ＲＩで分解し、　１７１　ｂｐのＥｃｏ　Ｒ１／Ａｖａ
　　Ｉ断片および５２７ｂｐの八νａ　　Ｉ　／Ｅｃｏ
　ＲＩ断片を得た。５％のアクリルアミドゲルで分離し
、電気的に溶出した後、　１７１　ｂｐの断片をさらに
プロレニンの開始部位で切断するＲｓａ■で制限酵素処
理して、　１１２　ｂｐの断片を生成した。

上述の５２７ｂｐと１１２ｂｐの断片を連結し、下流の
コード配列を得るため、　ｐＬＦ　５のＥｃｏ　Ｒ１／
　Ｈｉｎｄ　ｍ分解によって生成する６４５ｂｐの断片
を連結し、これを上述のｐＫＴ５２のＮｅｏ　Ｉ　（修
復）　／ｌ１ｉｎｄｌｌ１分解物に連結した。結果とし
て生成したベクターであるｐＡＡ６はｔｒｃプロモータ
ーの制御下にあり、　ｐＫＴ５２（７）　ＡＴＧ開始コ
ドンと読み取り枠の合ったプロレニンの配列を含んでい
る（第３図す参照）。

−１１胸中でのプレプロレニン配 列！すし啜 哺乳動物発現ベクターであるｐＰＰ１４は１０％の牛胎
児血清を添加した５０％ダルベツコ変更イーグル培地１
５０％クーンＦ１２培地中で生育するＣＨＯ細胞を形質
転換するのに用いた。２０μｇのプラスミド（ｐＰＰ１
４　ＤＮ八）を２μｇのマーカープラスミドのｐＳＶ２
：　Ｎｅｏと共に、標準的なリン酸カルシウム沈澱法（
前出）を用いて、　　１０１）＋ｍの皿中の細胞に加え
、　ＤＮＡ添加３時間後に１５％グリセロールショック
を与えた。感染後２４時間目に、細胞を０．４■／１ｍ
ｌ　Ｇ４１８抗生物質で処理しＧ４１８耐性コロニーを
拡がらせ、そして目的のタンパク質の生産について分析
した。

６４１８耐性コロニーを、タンパク質を生産させるため
に１〜５Ｘ１０−’ＭのＺｎＳＯ４で誘導した。合成さ
れるタンパク質を放射能標識するために、誘導細胞を含
む培地に３５８−メチオニンを加え、培地を取り除き、
一部を天然のレニンに対して調製した抗体（抗レニン抗
体）、またはプロペプチド配列のＣ末端１２アミノ酸に
相当する合成ペプチドに対する抗体（抗“プロ”抗体）
と反応させた。免疫沈澱物をＳＤＳゲル電気泳動にかけ
、バンドをオートラジオグラフィーにより検出した。抗
レニン抗体と抗“プロ”抗体の両方ともプロレニンに一
致する適当な分子量のバンドを生成した。

列りの放射能標識した培地を、まずトリス緩衝液中５０
．ｌｊｇ／１ｌｌｌのトリプシン（ｐＨ８）で２５℃で
６０分間、処理した。トリプシン処理した培地を次に。

上記のように、抗レニン抗体、または抗“ｐｒｏ”抗体
で処理し、免疫沈澱物をＳＤＳゲル電気泳動にがけた。

抗レニン抗体は、今度は、成熟レニンの分子量をもつこ
とを示すタンパク質を免疫沈澱させ゛た。抗プロ抗体は
、この成熟型を免疫沈澱させなかった。

第４図にこの結果を示す。レーン１〜３は対照プラスミ
ドで形質転換した細胞からの培地の免疫沈澱物を表す。

レーン４〜６はｐＰＰ１４で形質転換した細胞からの培
地の免疫沈澱物である。レーン１および４．そしてレー
ン２および５はそれぞれ。

抗プロ抗体および抗レニン抗体を用いた免疫沈澱物を表
す。（Ｄｚａｕ、　Ｖ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、−リｊ
Ｌ−シ徂Ｈｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　（１９８３）Ａ５（７
−８）：１２０？−１２２０に記述されている抗ヒトレ
ニン抗体は、叶、　Ｖｉｃｔｏｒ　Ｄｚａｕ＋（バーバ
ード　メディカル　スクール）により供与された）。レ
ーン３および６はトリプシン処理した培地から抗レニン
抗体を用いて得られた免疫沈澱物のゲルである。

一般に、　ｐＰＰ１４で形質転換した後Ｇ４１８耐性で
選択しりＣＨＯ細胞のプールは、　　５　Ｘｌ０−’Ｍ
　（７）ＺｎＳＯ。

および０．０２〜０．２μｇ７ｍｌの程度の１０−　’
Ｆ！　のデキサメタシンで誘導した後、レニンを生産す
る。こうして生産されたレニンはエンドＦで処理、また
は未処理の　３ＢＳ−メチオニンで放射能標識した分泌
レニンを流したＳＤＳゲルと比較して、グリコジル化し
ていることが示された。

適当な選択により、さらに高レベルのレニンの生産を得
ることが可能である。一つの方法として。

形質転換プールの細胞を５　Ｘｌ０−’ＭのＺｎＳＯ４
存在下で、無血清培地で増殖させ、これらの条件下で生
育したコロニーをひろい、血清を含む培地にまき、そし
て、上述の標準の誘導条件下でレニン生産の検定を行な
った。この過程の後に得られた。

もっとも高いレニンの生産性をもつクローンは。

平均０．８μｇ７ｍｌ生産し、このクラスのクローンの
うちの１つは、　ＣＢＩ−２８５（前出）と称し、受理
番号ＣＲＬ　８７５８　ＡＴＴＣで保管された。

放射能標識物なしで生育した。　ＣＢＩ−２８５と称す
る。ρＰＰ１４で形質転換したＣ１１０細胞の培地はま
た。

直接にレニン活性を調べた。上記の条件下でトリプシン
で前処理した試料を検定に用いた。レニン配列を含まな
いプラスミドで惑染した細胞の培地を対照として用いた
。この検定において、基質として、レニン存在下でアン
ジオテンシンＩに変換するヒトのアンジオテンシンノー
ゲンを供給する。

生成したアンジオテンシン■を、トレーサーとして１２
５■で標識したアンジオテンシン■を用いて。

ジェネンティクートラベノール（社）によって販売され
ているコンペティティブイムノアソセイキットを用いて
測定する。トリプシン処理したＣＢＩ−細胞の培地は、
この検定において、２５％の最大限の基質濃度で検定し
た結果、３０〜５０　Ｘ　１０″ｎｇアンジオテンシン
／ｈｒ／ｍｌ培養液上澄の程度のレニン活性を示した。

対照プラスミドで形質転換した細胞の培地をトリプシン
処理したものは、検出可能な活性を持たなかった。

もう１つの高生産細胞系統は次のようにして得た。プー
ルからの細胞をプレートにまき、ポリエステルの布の上
にレプリカした。そのレプリカ布は次いで１分泌された
細胞のタンパク質を結合させるためにニトロセルロース
フィルターに置いた。

フィルターは次に抗プロレニン抗血清で反応させ。

次に′２ＳＩ−Ｑ標識したプロティンＡで処理した。

この検定により、最も高レベルでレニンを分泌すると思
われるクローンをひろい、血清を含む培地にまき、標準
的な条件下で、活性を再検定した。

クローンは、１〜４μｇ７ｍｌｌのレニンを生産するも
のが得られ、任意に選んだそのうちのただ１つのクロー
ン、　ＣＢＩ−ＡＡ２を下記のように、生産条件下の研
究に選んだ。

Ａ　ｔＴ　−２（はむｌたｌ生 ＡＬＴ−２０細胞は、５％ＣＯ２空気でなく１５％ＣＯ
□空気を用いたことを除いては、　ＣＨＯ細胞の形質転
換するための調製で上述したように生育させた。形質転
換および成功した形質転換体の６４１８耐性による選択
は、下に示すことを除き、　Ｃｌｌ０細胞で記述した通
りであり２選択された細胞は、血清を含む培地を用いた
ことだけを除いては、レニンを生産するＣｌｌ０細胞に
おいて上述したようなプレート検定を用いて、上澄液中
のレニンの生産により選別した。

高生産系統は、培地中にレニンおよびプロレニン両方を
分泌した；レニンの分泌は細胞を８−ブロモｃＡＭＰで
処理することによって、劇的に増加させることができた
。ヒトレニン抗血清で沈澱可能な分泌物の比較を、下記
の第６図に示す。

細胞は上記のように生育させ、プレート当たり１０”個
の細胞をまき、翌日、１０％ＦＣ５のＤＭＥ２１　、で
洗浄した。細胞を１２５μｇのｐＰＰ１４および２５μ
ｇのｐｓＶ２ＮＥｏで感染させ、　２５０８ｇ　／ｍｌ
のＧ４１８で選択した。上記のように発現させるために
誘導し。

組換え生産物を蓄積させた後、培地を５ｍＭの８−ブロ
モｃＡＭＰで処理、または未処理により、３時間後、ト
リプシン存在下、および非存在下において。

上澄をレニン活性について検定した゛（トリプシンなし
ての活性は成熟レニンのものを表し、トリプシン存在下
での活性はレニンとプロレニンの合計のものを表す）。

結果は次に示す通りである。

このように分泌促進物質の添加により、レニン活性にお
いて、約３０ｎｇ　Ａｌ／ｍ　Ａ’　／ｈｒの分泌の上
昇が得られる。

第６図は１次に示すように、３５Ｓ−メチオニンで放射
能標識した細胞の上澄から得た免疫沈澱したタンパク質
のＳＤＳゲルを示す。細胞は、惑染していないＡｔＴ−
２０細胞、　ｐＰＰ１４で感染したＡＬＴ−２０細胞。

およびｐＰＰ１４で形質転換したＣｌｌ０細胞である。

細胞は上記のように誘導させた後、３５Ｓ−メチオニン
で１５時間、放射能標識した。培地を集め、上澄をウサ
ギの抗ヒトレニン抗血清およびプロティンＡセファロー
スで免疫沈澱させ、１０％５Ｏ５−ＰＡＧＥにかけた。

レーン２は形質転換していない細胞の初発の上澄からの
免疫沈澱物を表し、レーン７は形質転換したへｔＴ−２
０細胞から、レーン１３は形質転換したＣ４１０細胞か
らのものである。示すように、感染させたＡＬＴ−２０
細胞はプロレニンとレニンの両方を分泌し。

感染させたＣＨＯ細胞はプロレニン型のみを分泌する。

ウェルを非標識培地で洗浄し、新しい非標識培地で３時
間保温した。３時間後に、この培地を集めた（レーン３
．９および１５）。同じウェルを５ｍＭの８−ブロモｃ
ＡＭＰ　（レーン４．１０および１６）または、ＯｍＭ
の８−ブロモｃＡＭＰ　（レーン５，１１および１７）
のいずれかを含む新しい培地で３時間処理した。

第６図に示したように、３５Ｓ−メチオニンを取り除い
た後には１期待したように標識したレニンまたはプロレ
ニンの分泌は低下した（レーン９および１５）。続けて
培養を行うと、さらに低下した（レニン１１および１７
）が、５ｍＭのブロモｃＡＭＰで処理するとＡＬＴ−２
０細胞から標識されたレニンが分泌された（レーン１０
）。しかしＣＨＯ細胞からのプロレニンの分泌はなかっ
た（レーン１６）。

成功した形質転換体を含むＡＬＴ−２０の培養をまた。

血清なしの条件下で維持可能な細胞について選択した。

培養を１０％のＦＣＳ中で１７２の濃度まで増殖させ、
そして血清なしの培地に変えた。培養プレートに、全て
ではないがほとんどの細胞が死ぬまで血清なしの培地を
加え、その後、生き残っている細胞の***ができるよう
に、１０％ＦＣ５を含む培地を加えた。生き残った細胞
をひろい、再びプレートにまき、１日間１０％のＦＣＳ
で培養した後、血清なしの培地に再び変えた。２週間生
き残った細胞を、１０％のＦＣＳを含む培地を加えて増
殖させ。

限界の希釈度でクローン化し、上記のように誘導仲介物
質として亜鉛イオンおよび鉄を用いて誘導させた後、レ
ニン生産を検定した。

（以下余白） レニンｌｆｔ　　生産レベル 凍結培地１　ｍｊ２に〜１．ＯＸ　１０７細胞を含んで
いる貯蔵細胞の１ガラス瓶を３７℃で、攪拌することに
よって、すばやく解凍する。細胞を均等に分けて、各々
１０ｍ！！ずつの完全培地を含む１００ｕ＋の組織培養
皿２枚にまいた（完全培地は、コーンＦ−１２と、４．
５■７ｍｌのグルコースを含むダルベツコ、変更イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ２１）の、１：１混合に１０％牛脂児
血清を含んでいる）。５０ユニット／ｍｅのペニシリン
、５０μｇ７ｍｌのストレプトマイシン、あるいは４０
０μｇ７ｍ！！のＧ４１８．から成る抗生物質を必要に
応じて加えてもよい。２週間よりも古い貯蔵培地には、
２ｍＭのグルタミンを添加する。解凍した細胞は、細胞
が付着してしまうまで（〜３０分間）５％ＣＯ□恒温器
で３７℃で保温した。培地を吸い出し、細胞に新鮮な完
全培地を再び加える。

細胞をある程度まで増殖させ、標準的な方法によってト
リプシンで処理して拡張させる。必要な場合は、細胞を
１０より高り４０より低い希釈で処理する。長期間保存
するために拡張した貯蔵細胞は。

標準的な方法に従って凍結させる。

８５０　ｃｄの回転瓶に、ある濃度のＴ−１５０フラス
コ（〜４Ｘ１０’細胞）からの細胞をまくコーニング製
回転瓶が好ましい。細胞は、標準的な方法によりトリプ
シンで処理し、　１０ｍＭヘペス（ｐＨ７，２）を加え
た完全培地２００１１　Ａにまく。細胞は、１回転につ
き〜６〜７分間で回転する回転ラックで３７℃の部屋で
ある程度まで増殖させる。

ＣＢＩ−２８５によってレニン生産を増加させるための
無血清誘導培地（ＳＦＩＭ）は、以下のものから成る。

１０ｍＭヘペス（ｐＨ７，２）　（Ｉ　Ｍ貯蔵ヘペスは
、殺菌するために０．２０のフィルターを通して濾過し
、４℃で保存する）　、　　３　Ｘｌ０−’Ｍ　　Ｆｅ
５０４（１００ＯＸ貯蔵硫酸鉄は、水で調製し、ただち
にフィルター殺菌をし、　１．５ｍＡ’ずつ細胞凍結瓶
に分けて、−８０℃で保存する）　、　　５　Ｘｌ０−
’Ｍ　　Ｚｎ５Ｏａ（２０００Ｘ貯蔵液は。

水で調製し、フィルター殺菌をし、小分けして°４℃で
保存する）　、　１０−’Ｍデキサメタシン（１０００
ｘ貯蔵液は、１００％エタノールで調製し、４℃で保存
する）、ターンのＦ１２／ＤＭＥＭ２１　（１：　１　
）　、必要に応じてグルタミンを、要求に応じて抗生物
質を加える。

細胞は、以下のようにして、無血清培地に移す。

完全培地を回転瓶から吸い出し、　２００ｍ　Ｉ　ＤＭ
ＥＭ２１を加える。瓶を１０分間回転ラックに戻した後
、培地を吸い出して１００〜２００ｍ　ｌ　ＳＦＩＭを
再び加える。

細胞によって培地の組成が、ブラッドフォード分析法で
測定した場合〜１００ｍｃｇ／ｍ　１総タンパク質の分
泌タンパク質になった時に、培地を再び加える（回転を
はじめた初期では、　ＣＲＩ−２８５において１００Ｉ
ｌｉｔあたり約２日間であるが、細胞によって培地がそ
の状態となるのに必要な時間は、培地の変換以後の時間
と共に減少しうる）。−非常にゆるやかに、培地を吸い
出すか、あるいはピペットで取り除き（細胞は、やがて
瓶に非常にゆるく付着するようになる）、そして、　　
１００〜２００ｍ　ｊ２　ＳＦＩＭを加え直すことによ
り、培地を再び加える。

ＣＢＩ−ＡＡ２と称するＣ１（０形質転換細胞を、１０
ｍｆの完全培地（５０Ｕ／ｍＡ　ヘニシ’）　７．５０
．ｃｚｇ／　ｍｌ　ストレプトマイシン、あるいは４０
０μｇ／＋ａｊ！Ｇ４１８を含んだＦ１２／ＤＭＥＭ２
１の１０％ＦＣ５”）を含む１００鶴組織培養皿で１回
転瓶培養増殖用に調製した。細胞が付着するまで増殖さ
せ（３０分間）、培地を回収し。

細胞に新鮮な完全培地を再び加える。゛細胞は、ある程
度まで増殖させ８拡張するための標準的な方法を用いて
トリプシンによって処理した。８５０ｃｍノ四角回転瓶
ニ、　１０ｍＭべべ、２．　（ｐＨ７，２）を加えた２
００ｍ１完全培地のある濃度のフラスコ（４Ｘ１０’細
胞）からの細胞をまいた。その細胞をある程度まで３７
℃で回転して増殖させた。

無血清培地でレニンの生産を誘導するために。

完全培地を回転瓶から吸い取り、そして細胞を２００ｍ
　ｆ　ＤＭＥＭ２１で洗浄した。それから細胞に約１０
０〜２００ｍ　Ｉｌ無血清誘導培地（ＳＦＩＭ）を加え
た。ＳＦＩＭ＆：ＩＩ：。

ＩＩｗＭヘペスを含んだＦ１２／口ＭＥＭ２１（１：　
１）、　　３　Ｘｌ０−’ＭＦｅ”Ｏａ　ｒ　　５　Ｘ
ｌ０−’Ｍ　Ｚｎ５Ｏａ　、および１０−’Ｍデキサメ
タシンからなる。細胞は１分泌タンパク質の量によって
決められた周期で１例えば、ブラッドフォード分析法に
よって決定した場合では、約１００μｇ７ｍｌの総タン
パク質が分泌された時に、　ＳＦＩＭを再び加える。一
般的に、このレベルの総タンパク質生産量は、約２日間
で生じる。ＣＢＩ−ＡＡ２は。

１１１ｇ／１ｍｌ！７日あるいは約０．５μｇ７ｍｌ１
口のレニン生産レベルを示した。

上玉ヱ■簾ｌ レニンを、疎水性相互作用クロマトグラフィー。

ペプスタチンアフィニティークロマトグラフィー。

および陰イオン交換クロマトグラフィーを連続的に適用
することによって、無血清ＣＨＯ細胞上澄液から精製し
た。

…虹 特別に、　１．５Ｍ　ＮａＣ１をＣ１１０上澄液に加え
、そして室温でゆるやかに振とうすることにより溶解し
た。その溶液を、ペリスタルチックポンプ付きのザルト
リウス限外濾過装置を使用し、８μｍプレフィルタ−（
ザルトリウス　サルトピュアーカプセル）および０．４
５μｍフィルター（ザルトリウス硝酸セルロース）を通
して濾過した。そのフィルターは、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー（ＩＩＩＣ）の用意ができるまで４℃で
保存した。各々のＨＩＣ操作において、　０．０２％の
アジ化ナトリウムを加えた濾過済上澄液を４１用いた。

使用したカラムは。

７　エニＪＬ／　５　ＰＷ調製用ＨＰＬＣカラム（７，
５Ｘ　２．１ｃｍ、東洋ソーダ株式会社製９日本）で、
　ＬＣＣ−５００クロマトグラフイ一調節器で調節され
る２つのＰ−５００ＦＰＬＣを含むファルマシアＦＰＬ
Ｃクロマトグラフィーシステム中に装備した。１．５Ｍ
　ＮａＣ１と５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩを含むＡ緩衝液
（ｐＨ８，０）で平衡化後、試料を６ｍｌ／分の流速で
直接カラムに注入した。溶出液の吸光度は、ファルマシ
アＵＶ−１吸光度検出器を用いて２８０ｍｍで測定し、
ポンプＡの溶媒切り換えはモーター弁ＭＶ−８で行なっ
た。上澄液１．５１を充填し、Ａ緩衝液でカラムを再平
衡化後、結合しているタンパク質を減少塩勾配、すなわ
ち９５％　Ｂ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　　
ｐＨ８，０）　ヘの１５分間直線勾配に次いで１００％
Ｂへの１５分間直線勾配、によって溶出させた。プロレ
ニンを含む分画（トリプシンにより活性化可能なレニン
活性によって判定する）を集め、別の上澄液１．５１を
充填した。

ペプスタチン　カラム １（ＩＣから集めた分画を、セファローズ４Ｂビーズに
接合したトリプシン（結合手順は、ファルマシア文献の
概説に従い、ベーリンガーマンハイムの約２０■／１ｍ
ｌトリプシンを用いた）を加えることによって、プロレ
ニンからレニンにトリプシン活性化した。ビーズを取り
除くために遠心分離した後。

レニン溶液を、　２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，７
）　（充填緩衝液）で透析し、そして、生じたあらゆる
沈澱を２回目の遠心分離で取り除いた。この試料（４１
ＨＩＣの２回の操作からの５００ｍ　ｌ　）を、充填緩
衝液で平衡化した４０＋＋　ｊ！ペプスタチンカラム（
カラムは、　Ｍｕｒａｋａｍｉ、　ｋ、　ｅｔ　ａｌ　
Ｂｒｏｃｈｅｍ　Ｂｒｏ　ｈ　５Ｒｅｓ　Ｃａｒａｓ＋
（１９７５）６２ニア５７−７６３の毛順によって調製
し、担体としてアミノへキシル　セファロースを用いた
）に（約１ｍｌ／分で）充填した。カラムをＩ　Ｍ　Ｎ
ａＣ１を含む充填緩衝液で洗浄し１次に充填緩衝液のみ
で洗浄した後、レニンを０．ＩＮ酢酸で。

中性化に必要な量の２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　（ｐＨ８，
０）を含む管の中に直接溶出させた。

賂Δ」じこえ艮 ペプスタチンカラムからの溶出物を、保護のためのブロ
ンリー　ニューガードＩＩＰＬｃガードホルダーの陰イ
オンカートリッジ、および分析カラムとしてのＤＥＡＥ
５ＰＷ（７，５Ｘｏ、７５ｃｍ、東洋ソーダ株式会社製
）、を用いてイオン交換ＨＰＬＣによってさらに精製し
た。１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ装置は、４２１調節器装備の２つ
のベックマン／アルチフス１１０Ａ　　ポンチ、エルデ
ソクスポンプ検出器、および２８０ｍｍにセットしキッ
プとゾーネンＢＤ　４０チヤート記録計につないだタラ
トス　スペクトロフロ−７５７可変波長吸光度検出器か
ら成っていた。１．００ｍＭ　）リエチルアンモニウム
アセテート（ｐ）１７．０）で平衡化後、試料（４回の
ベブスクチン操作からの約１００ｔｓ　ｌ　）を１　ｍ
１２７分でカラムにポンプ注入した。２８０ｍｍの吸光
を示す通過物質を集めたところ、それは比活性４００〜
９００ゴ一ルドプラント単位／■の実質的に純粋な活性
レニンを含んでいた。

１旦ｙ三／■猜ｌ ■ＩＣカラムを通す間にプロレニンはレニンに実質的に
活性化されるために、プロレニンの精製において、　ｌ
ｌＩＣ工程を用いずにＣｌｌ０上澄液を使用した。精製
の手順は、ペプスタチアフィニティー。

分子量篩い、イオン交換クロマトグラフィーを用いる。

不活性レニンはレニン阻害剤に結合することができない
ので、ペプスタチンに充填する前に酸によって上澄液を
活性化する。ｐＨ３，３の溶液になるまで、上澄液の攪
拌溶液に１Ｍグリシン（ｐＨ３，３）を４℃で１８時間
滴下して加える。この活性化プロレニンを、　２Ｏｎ＋
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，７）で前もって平衡化した
ペプスタチンカラムに充填する。開始緩衝液、緩衝液＋
ＩＭＮａＣ＋、次いで緩衝液だけで、連続的に洗浄した
後、プロレニンを０．１Ｍ酢酸で溶出させる。プロレニ
ンを含むものを集めた分画を真空下で乾燥し、少量の１
００ｍＭ　　）リエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ
７，０）で再懸濁する。

その分画は高分子量と低分子量の両不純物を含むので、
前のプロレニン精製物からこれらの不純物を取り除くこ
とが示されているＨＰＬＣクロマトグラフィーが次の２
つの段階に含まれる。最初に、上記緩衝液中でのＴＳＫ
４０００　ＳＷカラム（東洋ソーダ株式会社製）による
分子量篩いクロマトグラフィー、次に、　　Ｉ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ７，０）を加え（最終濃度を０．１
Ｍ　Ｔｒｉｓにする）、そして活性レニンに対して上に
述べたように口ＥＡＥクロマトグラフィーを行う。この
カラムの流出分画は純粋なプロレニンを含んでいるはず
である。

−５°　　　でのレニンとプロレニンの主則 細菌での発現のために、　ｐＬＦ５あるいはｐＡＡ６を
用いてＥ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１菌体をＡｍｐ’に形
質転換し。

そして形質転換した細胞を１ｍＭＩＰＴＧを含む旧培地
で３〜５時間、　００が０．２〜０．５になるまで増殖
させた。（ＩＰＴＧは、　Ｉａｃオペレータによって制
御される制御配列に対する標準的な誘導物質である。）
それから、細胞を３５Ｓ−メチオニンでパルスラベルし
、集菌し、超音波または５％のトリクロロ酢酸処理によ
り溶菌させ、細胞抽出液について。

ＳＤＳゲル電気泳動により、目的のタンパク質の分析を
行なった。

抽出液は、抗レニン抗体あるいは抗“プロ”抗体で処理
し、そしてその免疫沈澱物をＳＤＳゲル電気泳動にかけ
た。ｐＡＡ６で形質転換した細胞では。

ゲル上でプロレニンの正確な分子量に相当する位置に移
動する。抗“プロ”抗体との免疫沈澱物が生じた。ｐＬ
Ｆ５で形質転換した細胞では生じなかった。ｐＬＦ５と
ｐＡＡ６からのどちらの抽出物も、抗レニン抗体で免疫
沈澱するタンパク質は生じなかった。

このように沈澱しなかったのは、使用した抗レニン抗体
の立体的依存性によるものであると考えられる。

上記の結果は、概要的に第５図に示しである。

レーン１．３．５と６はそれぞれｐＫＴ５２　、　ｐＡ
Ａ６゜ｐＬＦ５とｐＫＴ５２でＥ、ｃｏｌｉに形質転換
したものからの５％ＴＣＡ沈澱総タンパク質を表してい
る。レーン３には約４２ｋＤの分子量のバンド、レーン
５には約３７ｋＤの分子量のバンド、というレーン１と
６には見られないバンドが存在するのが明白に見られる
。

レーン２と４は、それぞれρＫＴ５２とｐａ＾６を保持
する細胞の抽出液から抗プロ抗体で免疫沈澱したものを
流したゲルである。ｐＡＡ６で形質転換した細菌からの
免疫沈澱タンパク質は、全抽出物中のプロレニンと推定
されるバンドと同じ分子量に相当する移動度である。

上記で示した３７ｋＤに相当するタンパク質は、遠心分
画と調製用ゲル電気泳動によってｐＬＩ’５を含む細菌
から精製し、溶出し、その結果回収されたタンパク質を
Ｎ末端配列決定に用いた。このようにして得られたタン
パク質のＮ末端配列は＋　Ｍｅｔ−１ｅｕ−ｔｈｒ−１
ｅｕ−ｇｌｙ−ａｓｎ−ｔｈｒ−ｔｈｒで、それはＭｅ
ｔ−レニンの正確なＮ末端配列に対応する。

（発明の概要） 組換えレニン、組換えプロレニン、および組換えプレプ
ロレニンの生産を行う発現ベクターと方法を開示する。

このようにして、高血圧のような過剰なレニンレベルに
より起こる疾患の治療に有用な薬剤を供するに充分な量
が、得られる。細胞上澄液からのレニンおよびプロレニ
ンの精製、および成熟レニン分泌の増加の方法もまた開
示される。

４、　文　　の　　゛なｉ゛■ 第１図はプレプロレニンをコードするＤＮＡの全塩基配
列、それに沿って導かれたアミノ酸配列を示す。

第２図はプレプロレニンをコードし、そして哺乳動物細
胞培養からプロレニンの分泌をもたらす。

発現ベクターの構築を示す。

第３図ａとｂはレニン関連タンパク質についての細菌発
現ベクターの構築を示す。

第４図はレニンをコードするプラスミドで形質転換され
、そして３５Ｓ−メチオニン存在下で生育したＣ］１０
細胞の上澄液中の免疫沈澱したタンパク質の５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲルを示す。

第５図はレニンをコードするベクターで形質転換された
エセリシア・コリーから抽出され３Ｓ３−メチオニンで
ラベルされたタンパク質の５ＯＳ−ポリアクリルアミド
ゲルを示す。

第６図は抗レニンで免疫沈澱した。　ＡＬＴ−２０細胞
の培地の３８５−メチオニンでラベルされたタンパク質
の５Ｏ５−ポリアクリルアミドゲルを示す。

−ロ　　　　ロ　　　０６００　　　　ロ　　　ロ　　
　６６６６１１　　＝　　寞　　シ　　ｇ　　ス　　；
　　；　　ス　　Ｓ　　＝　　＝−＝　ヨ　＃　ズ　巨
　妄　ジ　ジ　ス　巨　ヨ６　　　　（５０ｅｌ　　　
　Ｏ’　　　　Ｍ　　　　Ｎ宕　　ｇ　　８　　。　　
Ｎｇ＋４　　　。　　−。

ミ　ピ　ｉ　巨　ｉ　奨　二　呂　」　当且、：嗜 ＦＪＧ。５ ど・・−一−−−−−−−ノーーーーーーー−・・−・
・Ｎｔ２　３　４　　　　　　　　５　６ □□□□□□ ”００”　　　　　　　　　　　　２００　＝寸　　　
寸 ｌ１１ ＋１ ８　９　１０　１１　１２１３　１４　１５１６１７　
　　１ＳＦＩＧ、　６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトレニン、ヒトプロレニン、またはヒトプレプロ
   レニンをコードするＤＮＡ配列を含み、該ヒトレニン、
   該ヒトプロレニン、または該ヒトプレプロレニンは組換
   え宿主細胞と和合し得かつ該組換え宿主細胞内で該ＤＮ
   Ａ配列の表現を行い得る制御配列に作動可能に連接した
   発現系。 ２、前記制御配列が哺乳動物宿主細胞と和合しうる特許
   請求の範囲第１項に記載の発現系。 ３、前記制御配列が細菌宿主と和合しうる特許請求の範
   囲第１項に記載の発現系。 ４、レニン、プロレニン、またはプレプロレニンをコー
   ドする組換えＤＮＡ配列で形質転換された組換え宿主細
   胞。 ５、前記組換えＤＮＡ配列がさらに、レニン、プロレニ
   ン、またはプレプロレニンをコードするＤＮＡに作動可
   能に連接した制御配列を含む特許請求の範囲第４項に記
   載の宿主細胞。 ６、哺乳動物細胞である特許請求の範囲第４項に記載の
   宿主細胞。 ７、細菌細胞である特許請求の範囲第４項に記載の宿主
   細胞。 ８、ヒトレニンまたはヒトプロレニンの調製法であって
   、レニン、プロレニン、またはプレプロレニンをコード
   する組換えＤＮＡ配列で形質転換された組換え宿主細胞
   を培養すること、および該培養物からレニンまたはプロ
   レニンを回収すること、を含む調製法。 ９、結晶組換えレニンの表面の一部の３次元表面輪郭を
   相補する３次元表面輪郭を有し、レニン活性の阻害剤で
   あるペプチド（２から１５のアミノ酸残基）。 １０、組換えにより生産され不純物を含まないヒトレニ
   ンまたはヒトプロレニンを含む物質の組成物。 １１、哺乳動物細胞を処理することを含む分泌培養成熟
   組換えレニンを生産する方法であって、該細胞は制御さ
   れた分泌系路をそのまま用い、プレプロレニンに対する
   発現系を含むようにすでに修飾され、そしてプレプロレ
   ニン遺伝子を分泌促進物質で発現させるようすでに誘導
   されているものである方法。 １２、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、
   ペプスタチンクロマトグラフィーおよび陰イオン交換を
   含む、細胞培養上澄からのレニン精製方法。 １３、ペプスタチンクロマトグラフィー、分子量篩い、
   および陰イオン交換を含む、細胞培養上澄からのプロレ
   ニン精製方法。