JPS62282A - 組換えヒトレニン - Google Patents
組換えヒトレニンInfo
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- JPS62282A JPS62282A JP61077502A JP7750286A JPS62282A JP S62282 A JPS62282 A JP S62282A JP 61077502 A JP61077502 A JP 61077502A JP 7750286 A JP7750286 A JP 7750286A JP S62282 A JPS62282 A JP S62282A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12N9/6486—Renin (3.4.23.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
- C12Y304/23015—Renin (3.4.23.15)
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
3、 ・■の蕾 なL
(産業上の利用分野)
本発明は組換え手段による貴重な価値あるタンパク質の
実用的な量の化度に関するものである。
実用的な量の化度に関するものである。
特に本発明は診断および薬則設計の試薬として利用でき
るに充分な量のヒトレニンの生産に関するものである。
るに充分な量のヒトレニンの生産に関するものである。
(従来の技術)
レニンは血管収縮/拡張を制御する“アンジオテンシン
系”の鍵となるタンパク質である。従って血管系の不適
当な圧力レベル、特に高血圧、で見られる病気の治療は
この系の制御に焦点が絞られる。
系”の鍵となるタンパク質である。従って血管系の不適
当な圧力レベル、特に高血圧、で見られる病気の治療は
この系の制御に焦点が絞られる。
血圧調節に対するアンジオテンシン系の全貌はわかって
いる。血管に作用する物質はオクタペプチドのアンジオ
テンシン■で、これは直接血管平滑筋の収縮に働き、ま
た副腎皮質からアルドステロンの放出を誘導する。アン
ジオテンシン■のレベルはアンジオテンシナーゼによる
失活速度とアンジオテンシノーゲンからの2段階過程で
の形成速度により決定される。アンジオテンシノーゲン
からアンジオテンシン■への変換の速度律速段階はレニ
ンにより触媒される段階、−すなわちアンジオテンシノ
ーゲンからアンジオテンシンIへの変換である。(アン
ジオテンシンIのアンジオテンシン■への変換の第2段
階は“変換酵素”により仲介される。)レニンはインビ
ボでは腎臓の隣接糸球体細胞により分泌される。それは
プロレニン前駆体として合成され、これは次に活性なレ
ニン型へとプロセッシングされる。
いる。血管に作用する物質はオクタペプチドのアンジオ
テンシン■で、これは直接血管平滑筋の収縮に働き、ま
た副腎皮質からアルドステロンの放出を誘導する。アン
ジオテンシン■のレベルはアンジオテンシナーゼによる
失活速度とアンジオテンシノーゲンからの2段階過程で
の形成速度により決定される。アンジオテンシノーゲン
からアンジオテンシン■への変換の速度律速段階はレニ
ンにより触媒される段階、−すなわちアンジオテンシノ
ーゲンからアンジオテンシンIへの変換である。(アン
ジオテンシンIのアンジオテンシン■への変換の第2段
階は“変換酵素”により仲介される。)レニンはインビ
ボでは腎臓の隣接糸球体細胞により分泌される。それは
プロレニン前駆体として合成され、これは次に活性なレ
ニン型へとプロセッシングされる。
前述のアンジオテンシン系の種々面から治療薬の標的と
して多数のものが浮かび上がる。事実。
して多数のものが浮かび上がる。事実。
種々のアプローチが試みられた。薬物の大きな群β−ア
ドレナリン作用の阻害剤(β−遮断剤)が特に用いられ
、腎臓の隣接糸球体細胞からのレニン分泌を阻害するこ
とにより少なくとも部分的に作用することが知られてい
る。変換酵素阻害剤が用いられた;変換酵素阻害剤の例
にアンジオテンシン■結合の拮抗阻害剤であるサララシ
ンを含む直接アンジオテンシンHの作用を阻害する物質
。
ドレナリン作用の阻害剤(β−遮断剤)が特に用いられ
、腎臓の隣接糸球体細胞からのレニン分泌を阻害するこ
とにより少なくとも部分的に作用することが知られてい
る。変換酵素阻害剤が用いられた;変換酵素阻害剤の例
にアンジオテンシン■結合の拮抗阻害剤であるサララシ
ンを含む直接アンジオテンシンHの作用を阻害する物質
。
カプトプリルおよびエナラプリルがある。インビトロお
よびインビボの研究が、抗レニン抗体のような直接のレ
ニン阻害剤およびアンジオテンシン■アナログに関して
行われた。しかし、これらは充分に治療的に有効な物質
ではなかった。
よびインビボの研究が、抗レニン抗体のような直接のレ
ニン阻害剤およびアンジオテンシン■アナログに関して
行われた。しかし、これらは充分に治療的に有効な物質
ではなかった。
現在利用できる治療で高血圧の問題に対する満足なもの
はない。薬として実際に用いられている物質は予想でき
ない効力のものであり、またしばしば目的以外に、生物
学的活性の多様性のため。
はない。薬として実際に用いられている物質は予想でき
ない効力のものであり、またしばしば目的以外に、生物
学的活性の多様性のため。
好ましくない副作用がある。あるものは経口投与できな
い。特にレニン阻害剤の場合がそれで、あるものは動物
およびヒトの両者で静脈内あるいは筋肉内に投与した場
合、血圧降下作用を示したく11arber+ E、
、 Hertension and the
An 1otensinS stem : Ther
a eutic A roaches (1984)
RavenPress 133−145 ;
Gagnol+ J、 P、+ et al、
八bstractsInternational
5ociet of Hpertension (1
984)10 : 376) 。
い。特にレニン阻害剤の場合がそれで、あるものは動物
およびヒトの両者で静脈内あるいは筋肉内に投与した場
合、血圧降下作用を示したく11arber+ E、
、 Hertension and the
An 1otensinS stem : Ther
a eutic A roaches (1984)
RavenPress 133−145 ;
Gagnol+ J、 P、+ et al、
八bstractsInternational
5ociet of Hpertension (1
984)10 : 376) 。
レニンはそれ自身、前駆体“プロレニン”型を有する分
泌タンパク質である。従ってこのタンパク質は最初“プ
レプロレニン”として翻訳される。
泌タンパク質である。従ってこのタンパク質は最初“プ
レプロレニン”として翻訳される。
ヒト腎臓プレプロレニンはN−末端から20アミノ酸残
基のシグナル配列を含んでおり、これは分泌の過程で失
われ、46アミノ酸残基の“プロ”部分はインビボで切
断されるし、またインビトロでトリプシン分解を受け、
360アミノ酸から成る成熟タンパク質となる(Ima
i、 T、、 et al、 Proc、 Natl
。
基のシグナル配列を含んでおり、これは分泌の過程で失
われ、46アミノ酸残基の“プロ”部分はインビボで切
断されるし、またインビトロでトリプシン分解を受け、
360アミノ酸から成る成熟タンパク質となる(Ima
i、 T、、 et al、 Proc、 Natl
。
Acad、 Sci、 (USA) (1983) 8
0 : 7405)。プロレニンあるいはレニンはコン
カナバリンA−セファロ−スに対する親和性で示される
ように、多分糖タンパク質として分泌される。成熟ヒト
腎臓レニンは糖残基がない状態で分子量37.200ダ
ルトン。
0 : 7405)。プロレニンあるいはレニンはコン
カナバリンA−セファロ−スに対する親和性で示される
ように、多分糖タンパク質として分泌される。成熟ヒト
腎臓レニンは糖残基がない状態で分子量37.200ダ
ルトン。
そして糖付加型で約40,000である(Yokosa
wa+ H,+et al、 J、 Biol、 c
hem、 (1980) 255 : 3498−35
02)。
wa+ H,+et al、 J、 Biol、 c
hem、 (1980) 255 : 3498−35
02)。
ヒト腎臓レニンに対するcDNAが作られそして全塩基
配列が決定された(Tmai、 To+ et al、
(前出))。
配列が決定された(Tmai、 To+ et al、
(前出))。
この配列および導かれたタンパクの配列を第1図に示す
。しかし、レニン、プロレニン、およびプレプロレニン
のいずれも組換え技術により調製されていないし、精製
により得られるヒトレニンは血漿または腎臓から単離で
きるものの量が限定されている。マウス下顎線から調製
されたレニン活性をもつタンパク質が結晶化され、予備
的なX−線回折データが得られた;ヒトタンパク質の3
次元モデルが類推により提唱された(Carlson、
W、。
。しかし、レニン、プロレニン、およびプレプロレニン
のいずれも組換え技術により調製されていないし、精製
により得られるヒトレニンは血漿または腎臓から単離で
きるものの量が限定されている。マウス下顎線から調製
されたレニン活性をもつタンパク質が結晶化され、予備
的なX−線回折データが得られた;ヒトタンパク質の3
次元モデルが類推により提唱された(Carlson、
W、。
et al、、 Abstracts Int
ernational 5ociet ofII
ertension (1984) 10 : 1
53 : Murakami、 K、。
ernational 5ociet ofII
ertension (1984) 10 : 1
53 : Murakami、 K、。
同書(1984) 10 : 154)。しかし、ヒト
レニン材料はその3次元構造の実験的決定には不充分で
ある。
レニン材料はその3次元構造の実験的決定には不充分で
ある。
現在の技術は、3次元構造を決定し、その構造に基づい
て適当な薬剤を設計するための材料を提供するに充分な
量の、ヒト腎臓レニンまたはその前駆体を供給する手段
に欠けている。標的物質の立体配位上での特異的な相互
作用をするリガンドのデザインに関する一般的アプロー
チは他のタンパク質でうまく用いられており、これには
ヒトヘモグロビンでの2.3−ジホスホグリセレート部
位に特異的に結合するリガンドの設計(Beddell
、 C。
て適当な薬剤を設計するための材料を提供するに充分な
量の、ヒト腎臓レニンまたはその前駆体を供給する手段
に欠けている。標的物質の立体配位上での特異的な相互
作用をするリガンドのデザインに関する一般的アプロー
チは他のタンパク質でうまく用いられており、これには
ヒトヘモグロビンでの2.3−ジホスホグリセレート部
位に特異的に結合するリガンドの設計(Beddell
、 C。
R,、et al、 Br1t、 J、 Pharv
acol、 (1976)57 :201−209 ;
Beddell、 C,R,、同書(1979) 6
5 : 535−543) 、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼに特異的に結合する抗癌剤(Hansch、 C,、
et al、−J、 Med、 Che++。
acol、 (1976)57 :201−209 ;
Beddell、 C,R,、同書(1979) 6
5 : 535−543) 、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼに特異的に結合する抗癌剤(Hansch、 C,、
et al、−J、 Med、 Che++。
(1982)並: 777−784) 、プレアルブミ
ンに結合する甲状腺ホルモンアナログ(Blaney、
J、 M、、 etat、 J、 Med、 Che
w+、 (19B2) 25 : 785−790)お
よびエラスターゼ阻害剤(Hughes、 D、 L、
、 et al、ムMo1. Biol、 (1982
) 162 : 645−658)がある。
ンに結合する甲状腺ホルモンアナログ(Blaney、
J、 M、、 etat、 J、 Med、 Che
w+、 (19B2) 25 : 785−790)お
よびエラスターゼ阻害剤(Hughes、 D、 L、
、 et al、ムMo1. Biol、 (1982
) 162 : 645−658)がある。
レニンのプロ配列から成る比較的弱い阻害剤もまたEv
in等のProc、 Natl、 Acad、 Sci
、 USA (1984) 81 : 48−52
およびBoger等のNature (1983)
303 : 81−84によりマウスレニンおよびヒト
レニンに対して作られた。しかし、 James、 M
。
in等のProc、 Natl、 Acad、 Sci
、 USA (1984) 81 : 48−52
およびBoger等のNature (1983)
303 : 81−84によりマウスレニンおよびヒト
レニンに対して作られた。しかし、 James、 M
。
等のNature (1986) 319 : 33
−38により“開示されたペプシンの活性中心へのペプ
シノーゲンの“プロ”配列の位置は、この比較的弱い成
果はもし純粋の結晶タンパク質が活性中心の充分な研究
を行なえる程多量にあれば克服できること、を示してい
る。
−38により“開示されたペプシンの活性中心へのペプ
シノーゲンの“プロ”配列の位置は、この比較的弱い成
果はもし純粋の結晶タンパク質が活性中心の充分な研究
を行なえる程多量にあれば克服できること、を示してい
る。
さらに、血液または他の体液中のレニンレベルの診断分
析における標準物質として利用できる多量のレニンを得
ることが望ましい。現在、これらの免疫学的分析は適当
な対、薫物質により標準化されていない。また、精製ヒ
トレニンは潜在的なレニン阻害剤の選別試験の試薬とし
て必要であり。
析における標準物質として利用できる多量のレニンを得
ることが望ましい。現在、これらの免疫学的分析は適当
な対、薫物質により標準化されていない。また、精製ヒ
トレニンは潜在的なレニン阻害剤の選別試験の試薬とし
て必要であり。
このような選別は現在利用できる不純な試料により生じ
る妨害反応をなく、すであろう。
る妨害反応をなく、すであろう。
分泌成熟タンパク質として組換えレニンを得ることもま
た望まれる。プロインシュリンをコードするベクターで
形質転換された脳下垂体細胞からの成熟インシュリンの
分泌が9分泌促進物質としてのサイクリックAMPアナ
ログでのこれら細胞の処理により得られた(Moore
、 II−P、tl、、 et a’l、 Ce1l(
1983)並: 531−538)。したがって、この
組換え ゛インシュリンの挙動は、明らかにA C
T IIおよびエンドルフィン生産でこれら細胞により
作動している2分泌機構が使われている(Mains、
R,E、、 etal、 J、 Biol、 Che
w、 (1981) 89 : 2l−28)。
た望まれる。プロインシュリンをコードするベクターで
形質転換された脳下垂体細胞からの成熟インシュリンの
分泌が9分泌促進物質としてのサイクリックAMPアナ
ログでのこれら細胞の処理により得られた(Moore
、 II−P、tl、、 et a’l、 Ce1l(
1983)並: 531−538)。したがって、この
組換え ゛インシュリンの挙動は、明らかにA C
T IIおよびエンドルフィン生産でこれら細胞により
作動している2分泌機構が使われている(Mains、
R,E、、 etal、 J、 Biol、 Che
w、 (1981) 89 : 2l−28)。
要約すれば、高血圧または他の血管系の疾患の診断と治
療を行うのにその供給が必要であるにもかかわらず、現
在のところ精製ヒトレニンタンパク質の容易に利用でき
る供給源はなく、そしてこのタンパク質の組換え型の供
給源゛もない。
療を行うのにその供給が必要であるにもかかわらず、現
在のところ精製ヒトレニンタンパク質の容易に利用でき
る供給源はなく、そしてこのタンパク質の組換え型の供
給源゛もない。
(発明が解決しようとする問題点)
本発明は現在認識されているように、レニンの必要性を
満たすのに充分な量のこのタンパクを提供する。充分な
量は組換え技術により、充分な薬剤設計を可能にし、そ
して診断用標準物質としての量を供給できるように2作
られる。さらに1組換え材料の有用性と本物質の生産方
法は、どのような目指す目的に対しても、この酵素の構
造を最適化するように、このタンパク質の配列の修飾の
機会を提供する。
満たすのに充分な量のこのタンパクを提供する。充分な
量は組換え技術により、充分な薬剤設計を可能にし、そ
して診断用標準物質としての量を供給できるように2作
られる。さらに1組換え材料の有用性と本物質の生産方
法は、どのような目指す目的に対しても、この酵素の構
造を最適化するように、このタンパク質の配列の修飾の
機会を提供する。
したがって、1つの観点として2本発明は糖付加型また
は非糖付加型いずれかの、′l&換えにより生産された
レニンおよびその前駆体に関するものである。他の観点
として2本発明は、これらタンパク質の生産に適した発
現ベクター、これらをコードするDNA配列で形質転換
された宿主1組換えレニン、プロレニン、およびプレプ
ロレニン生産の方法、そして組換えにより生産される物
質の構造を相補するように設計された治療物質、に関す
るものである。また別の観点として1本発明は培養哺乳
動物細胞に対する成熟レニンの有効な分泌方法に関する
ものである。さらに別の観点として。
は非糖付加型いずれかの、′l&換えにより生産された
レニンおよびその前駆体に関するものである。他の観点
として2本発明は、これらタンパク質の生産に適した発
現ベクター、これらをコードするDNA配列で形質転換
された宿主1組換えレニン、プロレニン、およびプレプ
ロレニン生産の方法、そして組換えにより生産される物
質の構造を相補するように設計された治療物質、に関す
るものである。また別の観点として1本発明は培養哺乳
動物細胞に対する成熟レニンの有効な分泌方法に関する
ものである。さらに別の観点として。
本発明はレニンおよびプロレニン、特に組換えにより生
産されたもの、の精製手段に関するものである。
産されたもの、の精製手段に関するものである。
(問題点を解決するための手段)
本発明の発現系は、ヒトレニン、ヒトプロレニン、また
はヒトプレプロレニンをコードするDNA配列を含み、
該ヒトレニン、該ヒトプロレニン。
はヒトプレプロレニンをコードするDNA配列を含み、
該ヒトレニン、該ヒトプロレニン。
または該ヒトプレプロレニンは1組換え宿主細胞と和合
し得かつ該組換え宿主細胞内で該DNA配列の表現を行
い得る制御配列に作動可能に連接した。
し得かつ該組換え宿主細胞内で該DNA配列の表現を行
い得る制御配列に作動可能に連接した。
本発明の組換え宿主細胞は、レニン、プロレニン、また
はプレプロレニンをコードする組換えDNA配列で形質
転換された。
はプレプロレニンをコードする組換えDNA配列で形質
転換された。
本発明の調製法は、ヒトレニンまたはヒトプロレニンの
調製法であって、レニン、プロレニン。
調製法であって、レニン、プロレニン。
またはプレプロレニンをコードする組換えDNA配列で
形質転換された組換え宿主細胞を培養すること、および
該培養物からレニンま−たはプロレニンを回収すること
、を含む。
形質転換された組換え宿主細胞を培養すること、および
該培養物からレニンま−たはプロレニンを回収すること
、を含む。
本発明のペプチド(2から15の7ミノ酸残基)は、結
晶組換えレニンの表面の一部の3次元表面輪郭を相補す
る3次元表面輪郭を有し、レニン活性の阻害剤である。
晶組換えレニンの表面の一部の3次元表面輪郭を相補す
る3次元表面輪郭を有し、レニン活性の阻害剤である。
本発明の物質の組成物は1組換えにより生産され不純物
を含まないヒトレニンまたはヒトプロレニンを含む。
を含まないヒトレニンまたはヒトプロレニンを含む。
本発明の方法は、@乳動物細胞を処理することを含む゛
分泌培養成熟組換えレニンを生産する方法であって、該
細胞は制御された分泌系路をそのまま用い、プレプロレ
ニンに対する発現系を含むようにすでに修飾され、そし
てプレプロレニン遺伝子を分泌促進物質で発現させるよ
うすでに誘導されているものである。
分泌培養成熟組換えレニンを生産する方法であって、該
細胞は制御された分泌系路をそのまま用い、プレプロレ
ニンに対する発現系を含むようにすでに修飾され、そし
てプレプロレニン遺伝子を分泌促進物質で発現させるよ
うすでに誘導されているものである。
本発明の細胞培養上澄からのレニン精製方法は。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(IIIc)、ペプ
スタチンクロマトグラフィーおよび陰イオン交換を含む
。
スタチンクロマトグラフィーおよび陰イオン交換を含む
。
本発明の細胞培養上澄からのプロレニン精製方法は、ペ
プスタチンクロマトグラフィー、分子量篩い、および陰
イオン交換を含む。
プスタチンクロマトグラフィー、分子量篩い、および陰
イオン交換を含む。
八一定態
ここで用いられているように、″レニン”は成熟タンパ
ク質すなわち66番の位置から始まる340アミノ酸配
列、として第1図に示されているものに実質的に類似し
たアミノ酸配列を持つタンパク質を意味する。レニンが
すべてのタンパク質と同様に、それの周囲、もしくはそ
れが含まれる溶液のpHに依存して中性もしくは塩の形
で存在しているであろうこキはもちろん理解される。中
性および塩の形の両方が定義に含まれる。それに加えて
。
ク質すなわち66番の位置から始まる340アミノ酸配
列、として第1図に示されているものに実質的に類似し
たアミノ酸配列を持つタンパク質を意味する。レニンが
すべてのタンパク質と同様に、それの周囲、もしくはそ
れが含まれる溶液のpHに依存して中性もしくは塩の形
で存在しているであろうこキはもちろん理解される。中
性および塩の形の両方が定義に含まれる。それに加えて
。
多くのタンパク質と同様に、他の分子、最も多くは炭水
化物残基と結合して即ちグリコジル化もしくは非グリコ
ジル化の形で存在しうる。例えばリン酸との結合2例え
ばスルヒドリル残基の酸化。
化物残基と結合して即ちグリコジル化もしくは非グリコ
ジル化の形で存在しうる。例えばリン酸との結合2例え
ばスルヒドリル残基の酸化。
ヒドロキシルのエステル化、などのような他の“側鎖の
修飾”も起こりうる。アンジオテンシノーゲンのアンジ
オテンシンIへの変換を触媒する能力により定義される
“レニンの活性”が壊されない限り、これらの修飾も含
まれる。最後に、配列自身は1例えば1つまたはそれ以
上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換のような小
さな様式で変わり得ることが知られている。レニンの活
性を保持している限り、そのような変化した形もまた含
まれる。特に、多くのタンパク質の場合と同様に、成熟
のアミノ酸配列のほんの一部が活性に必要であることが
理解されている。
修飾”も起こりうる。アンジオテンシノーゲンのアンジ
オテンシンIへの変換を触媒する能力により定義される
“レニンの活性”が壊されない限り、これらの修飾も含
まれる。最後に、配列自身は1例えば1つまたはそれ以
上のアミノ酸残基の付加、欠失、または置換のような小
さな様式で変わり得ることが知られている。レニンの活
性を保持している限り、そのような変化した形もまた含
まれる。特に、多くのタンパク質の場合と同様に、成熟
のアミノ酸配列のほんの一部が活性に必要であることが
理解されている。
“プロレニン”と“プレプロレニン”は同様に第1図を
参照として定義される。(その図で指示される対応する
数字は、アミノ酸残基の下に括弧のある。なしで示され
る。)よって、プレプロレニンは示された全アミノ酸配
列により、そしてプロレニンは21番目の残基から40
606番目基までのものにより表示されている。1番目
から20番目までの残基の20アミノ酸のリーダー・プ
レ配列は。
参照として定義される。(その図で指示される対応する
数字は、アミノ酸残基の下に括弧のある。なしで示され
る。)よって、プレプロレニンは示された全アミノ酸配
列により、そしてプロレニンは21番目の残基から40
606番目基までのものにより表示されている。1番目
から20番目までの残基の20アミノ酸のリーダー・プ
レ配列は。
そのタンパク質が粗面小胞体を通過して移動する時に切
断される。そして21番目から66番目の残基までの“
プロ”配列は、トリプシンのような適当な特異性のタン
パク分解酵素を用いて、インビトロで切断可能である。
断される。そして21番目から66番目の残基までの“
プロ”配列は、トリプシンのような適当な特異性のタン
パク分解酵素を用いて、インビトロで切断可能である。
酵素的に不活性なレニン。
おそらくプロレニン、は実際にプラズマ中(Seale
y+J、 E、、 et at、 Encocrine
Rev (1980) 1 : 365−391)と
腎臓自身中(Chang、 J、 J、、 et al
、 肚匹Ltension (1981)−ジ: 5
09−515)に見出される。ヒトのプラズマ中に見出
されるプロレニンのすべてではないにしてもいくつかは
、腎臓由来であるようである(Derkx+ F、 +
1. M、、 et at、 II ertensi
on(1983) 5 :244−256)。
y+J、 E、、 et at、 Encocrine
Rev (1980) 1 : 365−391)と
腎臓自身中(Chang、 J、 J、、 et al
、 肚匹Ltension (1981)−ジ: 5
09−515)に見出される。ヒトのプラズマ中に見出
されるプロレニンのすべてではないにしてもいくつかは
、腎臓由来であるようである(Derkx+ F、 +
1. M、、 et at、 II ertensi
on(1983) 5 :244−256)。
ヒトのアンジオテンシノーゲンを加えて保温し。
生成したアンジオテンシン! (^りを標準的な免疫検
定法を用いて測定することによりレニンの活性を測定す
ることができる。
定法を用いて測定することによりレニンの活性を測定す
ることができる。
“精製した”または“純粋な”は、自然な状態で見られ
るような通常共存する物質が存在しない物質のことを示
す。よって例えば、“純粋な”レニンはヒトのプラズマ
または腎臓中のin 5ituの周囲に通常関連して
いる物質を含まないレニンを示す、もちろん“純粋な”
レニンは、そのグリコシド残基のような、それに特別縁
関連を持つ物質を含みうる。
るような通常共存する物質が存在しない物質のことを示
す。よって例えば、“純粋な”レニンはヒトのプラズマ
または腎臓中のin 5ituの周囲に通常関連して
いる物質を含まないレニンを示す、もちろん“純粋な”
レニンは、そのグリコシド残基のような、それに特別縁
関連を持つ物質を含みうる。
“作動可能なように連結した”とは、成分がその通常の
機能を発揮するために、隣接することを示す。よって、
コード配列に作動可能なように連結した制御配列すなわ
ちプロモーターは、コード配列の発現に作用することが
可能である。
機能を発揮するために、隣接することを示す。よって、
コード配列に作動可能なように連結した制御配列すなわ
ちプロモーターは、コード配列の発現に作用することが
可能である。
“制御配列”とは、 DNA配列、すなわち、目的のコ
ード配列に適当に連結した時に、それらの配列と和合す
る宿主中で、その発現に作用することができる配列のこ
とを示す。そのような制御配列は、原核および真核の両
方の宿主中のプロモーターを含み、そして原核生物中で
は2.リポソーム結合部位配列を、そして真核生物中で
は終結信号をも含む。発現に作用することにおいて必要
な、もしくは有用な、さらに付加的な因子もまた同定さ
れうる。ここで使われる場合“制御配列”は単に。
ード配列に適当に連結した時に、それらの配列と和合す
る宿主中で、その発現に作用することができる配列のこ
とを示す。そのような制御配列は、原核および真核の両
方の宿主中のプロモーターを含み、そして原核生物中で
は2.リポソーム結合部位配列を、そして真核生物中で
は終結信号をも含む。発現に作用することにおいて必要
な、もしくは有用な、さらに付加的な因子もまた同定さ
れうる。ここで使われる場合“制御配列”は単に。
使用される特定の宿主中で発現に作用するために必要な
どの゛ようなりNA配列をも示す。
どの゛ようなりNA配列をも示す。
“発現系”とは、コード配列の発現に作用するために必
要なあらゆる調節配列に作動可能なように連結した。目
的生産物をコードするDNAを含むDNA配列である。
要なあらゆる調節配列に作動可能なように連結した。目
的生産物をコードするDNAを含むDNA配列である。
“細胞”または“細胞培養”または“組換え宿主細胞”
または“宿主細胞”は文脈から明らかとなるように、し
ばしば交換可能的に用いられる。
または“宿主細胞”は文脈から明らかとなるように、し
ばしば交換可能的に用いられる。
これらの用語には、直接に問題の細胞、そしてもちろん
それらの子孫が含まれる。すべての子孫が。
それらの子孫が含まれる。すべての子孫が。
突然変異または環境の相違によって、親細胞と全く同じ
であるわけではないことが理解される。しかし、子孫が
最初の形質転換細胞に与えられたものと関連した特質を
保持する限り、それらの変わった子孫もこれらの用語に
含まれる。
であるわけではないことが理解される。しかし、子孫が
最初の形質転換細胞に与えられたものと関連した特質を
保持する限り、それらの変わった子孫もこれらの用語に
含まれる。
(以下余白)
旦−:」I壇ロヒ遵 ・
一般的に9本発明は実用的な量の、そして自然の環境で
このタンパク質に伴っている不純物のない、精製された
形のレニン(またはプロレニン)の生産を目指している
。組換え技術は、この目標を達成するための理想的な手
法を提供する。目的のレニンまたはプロレニン生産物を
コードするDNA配列を、適当なベクターに連結し、原
核または真核の宿主で発現させることにより、これらの
タンパク質のほぼ無限の供給源を提供しうる。プレ配列
も、特に真核生物中において目的生産物を分泌させるた
めに、有効に使用されうる。単に細胞から培地を除くこ
とから成る簡単で直裁な精製の第一段階を可能にするの
で、もちろん分泌は望ましい。多(の組換え宿主細胞に
おいて分泌されるタンパク質の数は制限されており、よ
って分泌タンパク質では最初の混入物の量が大幅に低く
なるであろう。
このタンパク質に伴っている不純物のない、精製された
形のレニン(またはプロレニン)の生産を目指している
。組換え技術は、この目標を達成するための理想的な手
法を提供する。目的のレニンまたはプロレニン生産物を
コードするDNA配列を、適当なベクターに連結し、原
核または真核の宿主で発現させることにより、これらの
タンパク質のほぼ無限の供給源を提供しうる。プレ配列
も、特に真核生物中において目的生産物を分泌させるた
めに、有効に使用されうる。単に細胞から培地を除くこ
とから成る簡単で直裁な精製の第一段階を可能にするの
で、もちろん分泌は望ましい。多(の組換え宿主細胞に
おいて分泌されるタンパク質の数は制限されており、よ
って分泌タンパク質では最初の混入物の量が大幅に低く
なるであろう。
CHO細胞はレニンをほとんどすべて不活性な前駆体と
して分泌し、トリプシンはプロレニンをレニンに変換す
るので、 C)10細胞に代表される動物細胞の集まり
から分泌されたタンパク質は、レニン活性を検定するた
めにトリプシンを加えて、または加えずに保温する必要
がある。検定前に分泌プロレニンのトリプシン処理によ
り、 CFIO細胞の上澄液中のレニン活性を25倍上
昇させることができる。多種の宿主および調節系が使用
可能であるが、望ましい調節系にはメタロチオネインの
プロモーターを使用する。メタロチオネインのプロモー
ターの制御下にあるプレプロレニン配列を含むこれらの
細胞を2〜?、5X10−SMのZn5O,存在下で培
養することにより、レニンの分泌が2〜3倍上昇する。
して分泌し、トリプシンはプロレニンをレニンに変換す
るので、 C)10細胞に代表される動物細胞の集まり
から分泌されたタンパク質は、レニン活性を検定するた
めにトリプシンを加えて、または加えずに保温する必要
がある。検定前に分泌プロレニンのトリプシン処理によ
り、 CFIO細胞の上澄液中のレニン活性を25倍上
昇させることができる。多種の宿主および調節系が使用
可能であるが、望ましい調節系にはメタロチオネインの
プロモーターを使用する。メタロチオネインのプロモー
ターの制御下にあるプレプロレニン配列を含むこれらの
細胞を2〜?、5X10−SMのZn5O,存在下で培
養することにより、レニンの分泌が2〜3倍上昇する。
10−’Hのデキサメタシンを培養液に加えることによ
り、レニン生産はざらに3〜5倍上昇する。プロレニン
とレニン生産物のこの系を使っての血清を含まない培地
中への分泌も、鉄のような誘導活性化物質の存在により
可能である。
り、レニン生産はざらに3〜5倍上昇する。プロレニン
とレニン生産物のこの系を使っての血清を含まない培地
中への分泌も、鉄のような誘導活性化物質の存在により
可能である。
分泌のための調節された経路(構成的経路−概説はKe
口y等の5cience (19B ) 230 :
25−32を見よ−に相対するもの。)を利用する動物
細胞中で調製する場合、プロレニンよりも成熟タンパク
質の方の分泌が1分泌促進物質を使用することにより上
昇する。例えば下記の図において、そのような分泌促進
物質、サイクリックA?IPアナログが。
口y等の5cience (19B ) 230 :
25−32を見よ−に相対するもの。)を利用する動物
細胞中で調製する場合、プロレニンよりも成熟タンパク
質の方の分泌が1分泌促進物質を使用することにより上
昇する。例えば下記の図において、そのような分泌促進
物質、サイクリックA?IPアナログが。
プレプロレニンの分泌系を用いて形質転換した分泌細胞
系から、レニンを成熟した形で分泌させる能力を持つ。
系から、レニンを成熟した形で分泌させる能力を持つ。
成熟した組換えレニンは1通常それらの細胞から分泌さ
れる他の成熟したホルモンと同様に分泌小粒中に貯蔵さ
れ、培養上澄液に内容物を放出することにより分泌促進
物質に応答する。
れる他の成熟したホルモンと同様に分泌小粒中に貯蔵さ
れ、培養上澄液に内容物を放出することにより分泌促進
物質に応答する。
と考えられている。
本発明ば1例えば視床下部、副甲状腺、心房などの内分
泌腺と外分泌腺、または神経細胞、好塩基球、そして血
小板などのような調節された分泌経路を利用する組織中
で生成する適当な形質転換細胞から、成熟したレニンを
分泌させる方法を含む。分泌させるために、適当な時間
の間組換えタンパク質の生産を′a続させた後に、成熟
した形で放出させるために細胞を分泌促進物質で処理す
る。
泌腺と外分泌腺、または神経細胞、好塩基球、そして血
小板などのような調節された分泌経路を利用する組織中
で生成する適当な形質転換細胞から、成熟したレニンを
分泌させる方法を含む。分泌させるために、適当な時間
の間組換えタンパク質の生産を′a続させた後に、成熟
した形で放出させるために細胞を分泌促進物質で処理す
る。
分泌促進物質は一般的に当業者に知られており。
サイク°リックへMPアナログ、カルシウムイオノフオ
ア、そしてノルエピネフリンを含む。これらの化合物を
、用いる分泌促進物質により、放出させるのに効果的な
量で加える。
ア、そしてノルエピネフリンを含む。これらの化合物を
、用いる分泌促進物質により、放出させるのに効果的な
量で加える。
cDNA配列、ゲノム配列、またはそれらの混成体のい
ずれも、用いられる組換え宿主と調節系の性質に従属し
て発現しうる。下記の図で+ cDNAは腎臓細胞のm
RNAから調製し、適当なゲノム配列により試験される
。cDNAはまたMurakamiによっても調製され
ている(Imai (前出)参照)。しかし動物細胞宿
主では9例えば、イントロンを含むゲノム配列の発現と
、正しくスプライシングされたmRNAの生成が可能で
ある。
ずれも、用いられる組換え宿主と調節系の性質に従属し
て発現しうる。下記の図で+ cDNAは腎臓細胞のm
RNAから調製し、適当なゲノム配列により試験される
。cDNAはまたMurakamiによっても調製され
ている(Imai (前出)参照)。しかし動物細胞宿
主では9例えば、イントロンを含むゲノム配列の発現と
、正しくスプライシングされたmRNAの生成が可能で
ある。
組換え培養からのし°ニンの成熟した形、または前駆体
を得るための精製方法もまた開示される。
を得るための精製方法もまた開示される。
レニンでは1手順は疎水性相互作用クロマトグラフィー
(IIIc)、ペプスタチンクロマトグラフィー。
(IIIc)、ペプスタチンクロマトグラフィー。
そして陰イオン交換から成る。プロレニンでは。
成熟したタンパク質への変換が起きるのでHICは不適
当である。よって、ペプスタチンクロマトグラフイー、
分子量篩い、そして陰イオン交換の順に適用することに
より調製する。
当である。よって、ペプスタチンクロマトグラフイー、
分子量篩い、そして陰イオン交換の順に適用することに
より調製する。
レニンでは、細胞の破片を除(ために培養上澄液を処理
し、その後、塩溶液中のフェニル52−のような疎水性
カラムに充填し、そしてρ1(8の緩衝液での塩の勾配
の減少により溶出させる。いくつかの適当な吸着剤1例
えばシンクロパック・プロピル(Synchrom、
Linden、 IN)そしてフェニル・スーパロース
(Pharmas ia)が市販されている。プロレニ
ン(またはレニン)を含む両分を回収し。
し、その後、塩溶液中のフェニル52−のような疎水性
カラムに充填し、そしてρ1(8の緩衝液での塩の勾配
の減少により溶出させる。いくつかの適当な吸着剤1例
えばシンクロパック・プロピル(Synchrom、
Linden、 IN)そしてフェニル・スーパロース
(Pharmas ia)が市販されている。プロレニ
ン(またはレニン)を含む両分を回収し。
(例えばセファロースビーズに付着した)トリプシンで
処理し、そしてペプスタチンカラムに充填する。ペプス
タチンはレニンと活性化プロレニンに効果的に結合する
ことができる阻害剤であり。
処理し、そしてペプスタチンカラムに充填する。ペプス
タチンはレニンと活性化プロレニンに効果的に結合する
ことができる阻害剤であり。
これはアフィニティ一段階に不可欠である。ペプスタチ
ンを用いるためには、いろいろな支持体を用いることが
できる。希薄な酸でレニンを溶出させ、そして約p11
7で陰イオン交換クロマトグラフィーにかける;レニン
は非吸着画分で純粋な形で得られる。DEARまたはそ
の多くが市販の他のイオン交換体のような1便利な陰イ
オン交換樹脂のどれをも使用しうる。Beckman
SAX Llltrasilと5ynchror@AX
300がその例である。
ンを用いるためには、いろいろな支持体を用いることが
できる。希薄な酸でレニンを溶出させ、そして約p11
7で陰イオン交換クロマトグラフィーにかける;レニン
は非吸着画分で純粋な形で得られる。DEARまたはそ
の多くが市販の他のイオン交換体のような1便利な陰イ
オン交換樹脂のどれをも使用しうる。Beckman
SAX Llltrasilと5ynchror@AX
300がその例である。
プロレニンでは、清澄させた培養上澄液をペプスタチン
・カラムに充填し、上記と同様に酸で溶出させ、そして
プロレニンを含む両分を9例えばTSK 4000 S
W 、またはToyo 5odaμmSpheroge
l TSKやBeck+man Biosil 250
のような高・低分子量の混入物を排除する能力のある他
の同等な大きさによる分別ゲルを用いた大きさによる排
除のII P L Cにかけ、その後陰イオンにかけて
プロレニンを上記と同様に非吸着画分に得る。
・カラムに充填し、上記と同様に酸で溶出させ、そして
プロレニンを含む両分を9例えばTSK 4000 S
W 、またはToyo 5odaμmSpheroge
l TSKやBeck+man Biosil 250
のような高・低分子量の混入物を排除する能力のある他
の同等な大きさによる分別ゲルを用いた大きさによる排
除のII P L Cにかけ、その後陰イオンにかけて
プロレニンを上記と同様に非吸着画分に得る。
純粋な組換えヒトレニンとヒトプロレニンを得ることの
望ましいことには、いくつかの面がある。
望ましいことには、いくつかの面がある。
最初に、この手順を用いることによりミリグラムの量の
物質を得ることが可能である。ミリグラムの量で、X線
回折とコンピューター解析を用いた3次元の研究を可能
にする結晶化が可能である。
物質を得ることが可能である。ミリグラムの量で、X線
回折とコンピューター解析を用いた3次元の研究を可能
にする結晶化が可能である。
これにより1分子の形に関する推論、よって、レニンが
普通に示す酵素活性の阻害剤として使用可能な物質の適
当な形を明らかにすること、を可能にする。アンジオテ
ンシン■のアンジオテンシン■への続いて起こる変換の
触媒である。“変換酵素”に対して阻害剤がすでに設計
されている。一般的に、これらの拮抗阻害剤は“ジペプ
チド”であり、変換酵素とそれとの相互作用は“ジペプ
チド”が変換酵素と特異的に相互作用する能力を高める
ために、ペプチド結合に関わっている“残基′を修飾す
ることにより安定化される。よってペプチド結合は、特
異的に選択したカルボン酸とアミン(アミノ酸である必
要はない)に加えられる。
普通に示す酵素活性の阻害剤として使用可能な物質の適
当な形を明らかにすること、を可能にする。アンジオテ
ンシン■のアンジオテンシン■への続いて起こる変換の
触媒である。“変換酵素”に対して阻害剤がすでに設計
されている。一般的に、これらの拮抗阻害剤は“ジペプ
チド”であり、変換酵素とそれとの相互作用は“ジペプ
チド”が変換酵素と特異的に相互作用する能力を高める
ために、ペプチド結合に関わっている“残基′を修飾す
ることにより安定化される。よってペプチド結合は、特
異的に選択したカルボン酸とアミン(アミノ酸である必
要はない)に加えられる。
これらの“ジペプチド”を、意図する目標である変換酵
素の輪郭を相補するように3次元的に並べて配列させる
。同様な錠と鍵の空間的配置が2本発明の結晶化レニン
の表面輪郭に相補するように設計された分子により得ら
れる。“表面”には内側に面している回転部が含まれ、
そして明確に活性部位が含まれることが理解される。さ
らに、“相補的な”は、“適合する”空間的構造に加え
。
素の輪郭を相補するように3次元的に並べて配列させる
。同様な錠と鍵の空間的配置が2本発明の結晶化レニン
の表面輪郭に相補するように設計された分子により得ら
れる。“表面”には内側に面している回転部が含まれ、
そして明確に活性部位が含まれることが理解される。さ
らに、“相補的な”は、“適合する”空間的構造に加え
。
タンパク質とその表面輪郭に適合する分子との相互作用
が吸引的で陽性であることを意味することが理解される
。これらの相互作用は、水素結合。
が吸引的で陽性であることを意味することが理解される
。これらの相互作用は、水素結合。
イオン的または疎水的親和力であろう。
従って1本発明では1組換えレニン(またはプロレニン
)の表面の3次元の輪郭に相補的な3次元の輪郭により
特徴づけられる。レニンに対する類似の安定化ペプチド
拮抗阻害剤(2から15のアミノ酸)を意図している。
)の表面の3次元の輪郭に相補的な3次元の輪郭により
特徴づけられる。レニンに対する類似の安定化ペプチド
拮抗阻害剤(2から15のアミノ酸)を意図している。
これに関連するペプチドにより、その拮抗阻害剤は、残
基の数より1つ少ない数に対応するカルボン酸・アミド
結合を含むことが示される。関与するカルボン酸とアミ
ンは、α−アミノ酸である必要はない。そのペプチドの
特に望ましい起源はプロレニンの“プロ”部分のアミノ
酸部分である。
基の数より1つ少ない数に対応するカルボン酸・アミド
結合を含むことが示される。関与するカルボン酸とアミ
ンは、α−アミノ酸である必要はない。そのペプチドの
特に望ましい起源はプロレニンの“プロ”部分のアミノ
酸部分である。
第2に、ヒトのレニンは極めて特異的酵素活性を有する
が、しかし、それは非霊長類のレニンの活性とは著しく
異なる。ヒトのレニンは、ヒトのアンジオテンシノーケ
ン中のLeu−Val結合を、そして非霊長類のアンジ
オテンシノーケン中のLeu −Leu結合を切断する
。他の既知の基質は存在しない。非霊長類のレニン、例
えばネズミの顎下腺レニンは、ヒトのアンジオテンシノ
ーゲンを切断しない。それゆえ、ヒトのレニンは非霊長
類のレニンとは異なった独自の特異性を有している。
が、しかし、それは非霊長類のレニンの活性とは著しく
異なる。ヒトのレニンは、ヒトのアンジオテンシノーケ
ン中のLeu−Val結合を、そして非霊長類のアンジ
オテンシノーケン中のLeu −Leu結合を切断する
。他の既知の基質は存在しない。非霊長類のレニン、例
えばネズミの顎下腺レニンは、ヒトのアンジオテンシノ
ーゲンを切断しない。それゆえ、ヒトのレニンは非霊長
類のレニンとは異なった独自の特異性を有している。
第3に、たとえ3次元の構造決定の補助がなくても1本
発明の精製レニンは、評価に対する新しい手法としての
、インビトロでのレニン阻害剤の選別における試薬とし
て重要である。最近使用可能となった純粋でないレニン
の標品は、試験結果におよぼす不純物の影響により混乱
した情報を生ずる。例えば、それ自身がレニンに対する
阻害剤。
発明の精製レニンは、評価に対する新しい手法としての
、インビトロでのレニン阻害剤の選別における試薬とし
て重要である。最近使用可能となった純粋でないレニン
の標品は、試験結果におよぼす不純物の影響により混乱
した情報を生ずる。例えば、それ自身がレニンに対する
阻害剤。
活性化剤または基質であることがわかっている混入物は
、評価を妨げる。よって、レニンの阻害剤に関する最近
の選別技術における実質的な進歩は。
、評価を妨げる。よって、レニンの阻害剤に関する最近
の選別技術における実質的な進歩は。
精製したヒトのレニンタンパク質が使用可能であること
により効果が出るであろう。
により効果が出るであろう。
さらに、タンパク質の組換え生産のための物質が使用可
能となることは、配列の修飾を可能にするので5例えば
部位特異的突然変異処理により。
能となることは、配列の修飾を可能にするので5例えば
部位特異的突然変異処理により。
基質特異性のような生産タンパク質の特徴の修飾が可能
である。よって1本発明の組換えベクターは、プロセッ
シング変換の範囲に対する。一連の活性化プロテアーゼ
を得るための出発物質を提供する。
である。よって1本発明の組換えベクターは、プロセッ
シング変換の範囲に対する。一連の活性化プロテアーゼ
を得るための出発物質を提供する。
最後に1本発明の組換えレニンは、生物学的な試料中の
ヒトのレニンの特異的および敏感な診断検定を提供する
ことにおいても有用である。免疫的検定は研究では用い
られているが、現在、市販されているような血液中のレ
ニンの直接的な免疫的検定はない。レニンまたはプロレ
ニンの標準量を知ることは、適切な治療を決定する上で
非常に重要である(Laraph、 J、 H,、肚匣
圓凱旦憇」閃uti A the An 1otension System :
Thera e c roaches(198
4) Raven Press pp 46−69)、
−現在用いられている臨床検定は、レニン活性に基づい
ており、即ち酵素検定であり、相当な誤りを生じやすい
。臨床医に、現在では研究のみに使用可能な直接的な免
疫的検定の手法を提供するためには、精製したヒトレニ
ンの適当な標準物を提供することが必要nationa
l 5ociet If ertension
(1984) 10 : 152;0jihara
、 J、、 et al、 (同書) (1984
) 10 : 47 ;Ga1en、F、x、l e
t al、 J、C11n Endocrino
l Metab(1979)亙: 1041−104
3)。精製した組換えプロレニンとレニンの有用性は、
この物質を、゛直接的免疫検定と現在用いられているレ
ニン活性の検定の両方の標準化と測定に対して提供する
であろう。
ヒトのレニンの特異的および敏感な診断検定を提供する
ことにおいても有用である。免疫的検定は研究では用い
られているが、現在、市販されているような血液中のレ
ニンの直接的な免疫的検定はない。レニンまたはプロレ
ニンの標準量を知ることは、適切な治療を決定する上で
非常に重要である(Laraph、 J、 H,、肚匣
圓凱旦憇」閃uti A the An 1otension System :
Thera e c roaches(198
4) Raven Press pp 46−69)、
−現在用いられている臨床検定は、レニン活性に基づい
ており、即ち酵素検定であり、相当な誤りを生じやすい
。臨床医に、現在では研究のみに使用可能な直接的な免
疫的検定の手法を提供するためには、精製したヒトレニ
ンの適当な標準物を提供することが必要nationa
l 5ociet If ertension
(1984) 10 : 152;0jihara
、 J、、 et al、 (同書) (1984
) 10 : 47 ;Ga1en、F、x、l e
t al、 J、C11n Endocrino
l Metab(1979)亙: 1041−104
3)。精製した組換えプロレニンとレニンの有用性は、
この物質を、゛直接的免疫検定と現在用いられているレ
ニン活性の検定の両方の標準化と測定に対して提供する
であろう。
よって、プロレニンまたはレニンの血液中の標準量を、
病気を評価するための予備的な診断として。
病気を評価するための予備的な診断として。
そしてまた治療法の有効性を追跡するための監視系とし
て、の両方に用いることができる。
て、の両方に用いることができる。
且J[鼾モJ京
細胞を形質転換したり、ベクターを作成したり。
メソセンジャーRNAを抽出したり、 cDNAライブ
ラリーを調製したりなどするために用いられているほと
んどの技術は、当分野で広〈実施されているものであり
、そしてほとんどの当業者は、特別の条件や手順を記述
する標準的な由来物質に通じている。しかしながら便宜
上、以下の節は指針として役立つものであろう。
ラリーを調製したりなどするために用いられているほと
んどの技術は、当分野で広〈実施されているものであり
、そしてほとんどの当業者は、特別の条件や手順を記述
する標準的な由来物質に通じている。しかしながら便宜
上、以下の節は指針として役立つものであろう。
C,1,u と、ド装置
原核生物と真核生物の系の両方がレニンをコードする配
列を発現するために使える。もちろん原核生物の宿主は
クローニングの手順に最も便利である。原核生物は通常
、エセリシア・コリー(Escherichia co
lt)の種々の株である。しかし。
列を発現するために使える。もちろん原核生物の宿主は
クローニングの手順に最も便利である。原核生物は通常
、エセリシア・コリー(Escherichia co
lt)の種々の株である。しかし。
他の微生物の株も使用し得る。用いる宿主に和合する種
に由来する複製部位や制御配列を含むプラスミドベクタ
ーを用いる。例えば、エセリシア・コリー(Esche
richia coli)は1代表的には、 Boli
var等ノGene (1977) 2 : 95によ
るエセリシア・コリー (Escherichia c
olt)種に由来するプラスミド。
に由来する複製部位や制御配列を含むプラスミドベクタ
ーを用いる。例えば、エセリシア・コリー(Esche
richia coli)は1代表的には、 Boli
var等ノGene (1977) 2 : 95によ
るエセリシア・コリー (Escherichia c
olt)種に由来するプラスミド。
pBR322の誘導体を用いて形質転換される。pBR
322はアンピシリンやテトラサイクリン耐性の遺伝子
を含み、このように所望のベクターを構築する上で、保
持することができるか破壊することができるかのどちら
かの付加的な目印を供する。リボゾーム結合部位配列に
沿って転写開始のプロモーター、また随意にオペレータ
ー、を含むとここでは定義されているふつうに用いられ
る原核生物の制御配列は、β−ラクタマーゼ(ベニシリ
ナーゼ)やラクトース(lac)プロモーター系(Ch
ang。
322はアンピシリンやテトラサイクリン耐性の遺伝子
を含み、このように所望のベクターを構築する上で、保
持することができるか破壊することができるかのどちら
かの付加的な目印を供する。リボゾーム結合部位配列に
沿って転写開始のプロモーター、また随意にオペレータ
ー、を含むとここでは定義されているふつうに用いられ
る原核生物の制御配列は、β−ラクタマーゼ(ベニシリ
ナーゼ)やラクトース(lac)プロモーター系(Ch
ang。
et al、 Nature (1977) 198
: 1056) 、 )リプトファンDrp)プロ
モーター系(Goeddel、 et al。
: 1056) 、 )リプトファンDrp)プロ
モーター系(Goeddel、 et al。
Nucleic Ac1ds Res (1980)
8 : 4057)、 そしてラムダ由来Pt、プロモ
ーターとN−遺伝子リボゾーム結合部位(ShiIla
take、 et al、 Nature (1981
)292 : 128)のようなふつうに用いられるプ
ロモーターを含む。
8 : 4057)、 そしてラムダ由来Pt、プロモ
ーターとN−遺伝子リボゾーム結合部位(ShiIla
take、 et al、 Nature (1981
)292 : 128)のようなふつうに用いられるプ
ロモーターを含む。
細菌に加えて、酵母のような真核細胞性の微生物をも宿
主として用いることができる。サツカロマイセス・セレ
ビシェ(Saccharomyces cerevis
iae)の実験室株のパン酵母がよく使われるが、数種
の他の株もふつう利用できる。例えば、 Broach
、 J。
主として用いることができる。サツカロマイセス・セレ
ビシェ(Saccharomyces cerevis
iae)の実験室株のパン酵母がよく使われるが、数種
の他の株もふつう利用できる。例えば、 Broach
、 J。
R,、Meth Enz (1983) 101 :3
Q7の2μの複製開始点あるいは他の酵母の和合できる
複製開始点(300を見よ)を用いているベクターを用
いる。酵母ベクターの制御配列は解糖酵素の合成に対す
るプロモーターを含んでし)る(lless、 eL
al、 J Advハ狂肌」町(1968) 7 :
149 ; 1lolland、 et at。
Q7の2μの複製開始点あるいは他の酵母の和合できる
複製開始点(300を見よ)を用いているベクターを用
いる。酵母ベクターの制御配列は解糖酵素の合成に対す
るプロモーターを含んでし)る(lless、 eL
al、 J Advハ狂肌」町(1968) 7 :
149 ; 1lolland、 et at。
肛匹匝畦旦■(1978) 17 : 4900)。当
分野で知られている付加的なプロモーターは、グリセリ
ン酸3−リン酸キナーゼに対するプロモーター(旧tz
eman。
分野で知られている付加的なプロモーターは、グリセリ
ン酸3−リン酸キナーゼに対するプロモーター(旧tz
eman。
et al、 J Biol Chem (1980
) 255 : 2073 )や。
) 255 : 2073 )や。
他の解糖酵素に対するプロモーターも含む。成育条件に
支配される転写の付加的な利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロー
ムC1酸性ホスフアターゼ。
支配される転写の付加的な利益を有する他のプロモータ
ーは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロー
ムC1酸性ホスフアターゼ。
窒素代謝に関連する分解酵素、そしてマルトースやガラ
クトースに関与する酵素、に対するプロモーター領域で
ある。ターミネータ−配列は、コード配列の3゛未滴に
あるのが望ましいということも信じられている。そのよ
うなターミネータ−が。
クトースに関与する酵素、に対するプロモーター領域で
ある。ターミネータ−配列は、コード配列の3゛未滴に
あるのが望ましいということも信じられている。そのよ
うなターミネータ−が。
酵母由来の遺伝子のコード配列に続いて3゛非翻訳領域
内に見られる。
内に見られる。
もちろん、多細胞生物由来の真核性宿主細胞の培養液中
でポリペプチドをコードしている遺伝子を発現させるこ
とも可能である。例えば+ Axel。
でポリペプチドをコードしている遺伝子を発現させるこ
とも可能である。例えば+ Axel。
等、 4,399.216を見よ。これらの系は、イン
トロンを切り出す能力という付加的な利点を持ち、従っ
てゲノム断片を直接発現させるのに用いれる。
トロンを切り出す能力という付加的な利点を持ち、従っ
てゲノム断片を直接発現させるのに用いれる。
有用な宿主細胞系は、 VHRO,l1ela細胞、そ
してチャイニーズハムスター卯巣(CIIO)細胞を含
む。そのような細胞用の発現ベクターは2例えば一般に
用いるシミアンウィルス40 (SV40)由来の初期
および後期プロモーター(Fiers、 et al、
Nature (197B)匠: 113)、あるい
はポリオーマ、アデノウィルス2.牛のパピローマウィ
ルス、あるいはトリ肉腫ウィルスに由来するような他の
ウィルスのプロモーター、のような哺乳動物の細胞に和
合できるプロモーターや制御配列を含む。制御できるプ
ロモーター、 hMTII (Karin、 M、、
et al、Nature(1982)烈9 : 79
7−802)も使える。哺乳動物細胞宿主系の形質転換
の一般的見地はAxel(上述)に述べられている。“
エンハンサ−”領域は最適な発現に重要であるというこ
とも今や明らかになっている。これらは一般的に非コー
ドDNA ?ilT域内のプロモーター領域の上流ある
いは下流に見出されている。複製開始点は、もし必要な
ら、ウィルス起源から得られる。しかし、染色体への組
み込みは、真核生物のDNA複製の共通の機作である。
してチャイニーズハムスター卯巣(CIIO)細胞を含
む。そのような細胞用の発現ベクターは2例えば一般に
用いるシミアンウィルス40 (SV40)由来の初期
および後期プロモーター(Fiers、 et al、
Nature (197B)匠: 113)、あるい
はポリオーマ、アデノウィルス2.牛のパピローマウィ
ルス、あるいはトリ肉腫ウィルスに由来するような他の
ウィルスのプロモーター、のような哺乳動物の細胞に和
合できるプロモーターや制御配列を含む。制御できるプ
ロモーター、 hMTII (Karin、 M、、
et al、Nature(1982)烈9 : 79
7−802)も使える。哺乳動物細胞宿主系の形質転換
の一般的見地はAxel(上述)に述べられている。“
エンハンサ−”領域は最適な発現に重要であるというこ
とも今や明らかになっている。これらは一般的に非コー
ドDNA ?ilT域内のプロモーター領域の上流ある
いは下流に見出されている。複製開始点は、もし必要な
ら、ウィルス起源から得られる。しかし、染色体への組
み込みは、真核生物のDNA複製の共通の機作である。
C12,瓜覧軟換
用いる宿主細胞により、形質転換はその細胞に適当な標
準的な操作を用いて行う。Cohen、 S、 N、。
準的な操作を用いて行う。Cohen、 S、 N、。
Proc Natl Acad Set (I
IsA) (1972) 69 : 2110
で述べているように塩化カルシウムを用いるカルシ
ウム処理、あるいはManiatis等のMo1ecu
larC1onin : A Laborator
Manual (1982) ColdSpriri
g l1arbor Press、 p254内に述べ
られているRhCl、を法は、原核生物あるいは実質的
な細胞壁の障壁を含む他の細胞に対して用いれる。その
ような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、 Gr
ahamとvan der Eb、−■pセn−(19
7B) 52 : 546 、ときにはWigler、
M、、等のCe1l (1979) 16 : 77
7−785で一部変更されているようにリン酸カルシウ
ム沈澱法も使える。酵母への形質転換は、 Van 5
olir+4en+P、1等のJ、 Bact (19
77)130 : 946あるいはHsiao。
IsA) (1972) 69 : 2110
で述べているように塩化カルシウムを用いるカルシ
ウム処理、あるいはManiatis等のMo1ecu
larC1onin : A Laborator
Manual (1982) ColdSpriri
g l1arbor Press、 p254内に述べ
られているRhCl、を法は、原核生物あるいは実質的
な細胞壁の障壁を含む他の細胞に対して用いれる。その
ような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、 Gr
ahamとvan der Eb、−■pセn−(19
7B) 52 : 546 、ときにはWigler、
M、、等のCe1l (1979) 16 : 77
7−785で一部変更されているようにリン酸カルシウ
ム沈澱法も使える。酵母への形質転換は、 Van 5
olir+4en+P、1等のJ、 Bact (19
77)130 : 946あるいはHsiao。
C,L、、等のProc、 Na目、 Acad、 S
ci、(USA) (1979)76 : 3829の
方法により行なえる。
ci、(USA) (1979)76 : 3829の
方法により行なえる。
C13,さ又又二揚莱
望むコード配列や制御配列を含む適当なベクターの構築
は、当業者によく知られている標準的な連結および制限
操作を用いる。単離したプラスミド、 DN八へ列、あ
るいは合成オリゴヌクレオチドを、切断し、API整し
、そして望む形態に再連結する。
は、当業者によく知られている標準的な連結および制限
操作を用いる。単離したプラスミド、 DN八へ列、あ
るいは合成オリゴヌクレオチドを、切断し、API整し
、そして望む形態に再連結する。
ベクターを形成するDNA配列は、多くの供給源より入
手できる。骨格ベクターや制御系は、構築の際の配列の
大半に用いられる入手可能な“宿主”ベクターに一般に
見出される。典型的な配列は上記の第1節に示しである
。適当なコード配列に対して、初期の構築は、 cDN
^あるいはゲノムDNAライブラリー由来の適当な配列
を復活させることであり得るし1通常そうである。しか
し、一度配列が開示されれば1個々のヌクレオシド誘導
体から始めて、インビトロで完全な遺伝子配列を合成す
ることは可能である。手頃な長さ1例えば500〜10
00bpの遺伝子の完全な遺伝子配列は9個々の部分に
一致する相補的なオリゴヌクレオチドを合成して、デオ
キシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメ
ラーゼを用いて一本鎖の部分的に重なり合わない部分を
珈めることにより調製する。
手できる。骨格ベクターや制御系は、構築の際の配列の
大半に用いられる入手可能な“宿主”ベクターに一般に
見出される。典型的な配列は上記の第1節に示しである
。適当なコード配列に対して、初期の構築は、 cDN
^あるいはゲノムDNAライブラリー由来の適当な配列
を復活させることであり得るし1通常そうである。しか
し、一度配列が開示されれば1個々のヌクレオシド誘導
体から始めて、インビトロで完全な遺伝子配列を合成す
ることは可能である。手頃な長さ1例えば500〜10
00bpの遺伝子の完全な遺伝子配列は9個々の部分に
一致する相補的なオリゴヌクレオチドを合成して、デオ
キシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメ
ラーゼを用いて一本鎖の部分的に重なり合わない部分を
珈めることにより調製する。
この手法は既知の配列を有するいくつかの遺伝子を構築
する際に首尾よく用いられている。例えば。
する際に首尾よく用いられている。例えば。
Edge、 M、D、、 Nature (1981)
292 : 756 ; Nambair。
292 : 756 ; Nambair。
K、 P、、 et al、 5cience (19
84) 223 : 1299 ; Jay。
84) 223 : 1299 ; Jay。
Ernest、 J、 Biol、 Chem、(19
84) 259 : 6311を見よ。
84) 259 : 6311を見よ。
合成オリゴヌクレオチドは、 Efimov、 V、A
、、等(Nucleic Ac1ds Res (19
B2) 6875−6894)の方法により調製したり
、市販の自動オーリボヌクレオチド合成機を用いて調製
することができる。アニールさせる前の一本鎖のリン酸
化、あるいは標識化するためのリン酸化は9例えば、
50mM Tris(pH7,6)。
、、等(Nucleic Ac1ds Res (19
B2) 6875−6894)の方法により調製したり
、市販の自動オーリボヌクレオチド合成機を用いて調製
することができる。アニールさせる前の一本鎖のリン酸
化、あるいは標識化するためのリン酸化は9例えば、
50mM Tris(pH7,6)。
10mM MgC1g、 5mMジチオスレイトール、
1〜2mM^TP+ 1.7 pmole 732P
−ATP (2,9mC1/m mole)。
1〜2mM^TP+ 1.7 pmole 732P
−ATP (2,9mC1/m mole)。
O0lllIMスヘルミジン、および0.1mM ED
TA存在下で。
TA存在下で。
In moleの基質に対して約lO単位のポリヌクレ
オチドキナーゼ、という過剰量を用いて達成される。
オチドキナーゼ、という過剰量を用いて達成される。
一度、望むベクターの構成成分がこのように手に入ると
、標準的な制限手順および連結手順を用いて、切り取っ
たり、連結したりすることができる。
、標準的な制限手順および連結手順を用いて、切り取っ
たり、連結したりすることができる。
適当な制限酵素処理を、当分野で一般に理解されている
条件下、およびこれらの市販の制限酵素の製造者により
特定されている明細下で1部位特異的[]NA分解を行
う。例えば、New England Biolabs
。
条件下、およびこれらの市販の制限酵素の製造者により
特定されている明細下で1部位特異的[]NA分解を行
う。例えば、New England Biolabs
。
Product Catalogを見よ。一般的に、約
1.crgのプラスミドあるいはDNA配列を約20μ
lの緩衝液中で1単位の酵素で切断する。この例では、
典型的には過剰量の制限酵素を、 DNA基質の完全分
解を行うために用いる。約37℃で約1時間がら2時間
という保温時間が作用可能であるが、変化は許容できる
。各保温後、フェノール/クロロホルム抽出でタンパク
質を除き2次いでエーテル抽出することもあり、核酸は
水層よリエタノール沈澱で回収する。必要に応じて、切
断した断片の大きさの分離をポリアクリルアミドゲルあ
るいはアガロースゲル電気泳動で標準的な操作を用いて
行う。
1.crgのプラスミドあるいはDNA配列を約20μ
lの緩衝液中で1単位の酵素で切断する。この例では、
典型的には過剰量の制限酵素を、 DNA基質の完全分
解を行うために用いる。約37℃で約1時間がら2時間
という保温時間が作用可能であるが、変化は許容できる
。各保温後、フェノール/クロロホルム抽出でタンパク
質を除き2次いでエーテル抽出することもあり、核酸は
水層よリエタノール沈澱で回収する。必要に応じて、切
断した断片の大きさの分離をポリアクリルアミドゲルあ
るいはアガロースゲル電気泳動で標準的な操作を用いて
行う。
大きさの分離の一般的な記述はMethods in
Enz mol。
Enz mol。
(1980)的: 499−560に見られる。
制限分解断片は、保温時間約15〜20分、 20〜2
5”C,50mM Tris(pt(7,6)、 50
mM NaC1,6mM hgcl、。
5”C,50mM Tris(pt(7,6)、 50
mM NaC1,6mM hgcl、。
6mM DTT 、および5〜10μM dNTP中で
、4種のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の
存在下。
、4種のデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の
存在下。
エセリシア・コリー(Escherichia col
i) DNAポリメラーゼI (クレノー)の大断片を
用いて処理することにより平滑末端にする。クレノー断
片は4種のdNTPが存在しさえすれば、5°の粘着末
端を埋めるが、3゛の突き出した一本鎖は削って戻す。
i) DNAポリメラーゼI (クレノー)の大断片を
用いて処理することにより平滑末端にする。クレノー断
片は4種のdNTPが存在しさえすれば、5°の粘着末
端を埋めるが、3゛の突き出した一本鎖は削って戻す。
望むなら1選択的な修復を、粘着末端の性質により示さ
れる限度内でdNTPのうちの1つだけあるいは選択し
たdNTPを供給することにより行なえる。クレノー処
理後、混合液をフェノール/クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させる。
れる限度内でdNTPのうちの1つだけあるいは選択し
たdNTPを供給することにより行なえる。クレノー処
理後、混合液をフェノール/クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させる。
S1ヌクレアーゼあるいはBat−31で適当な条件下
で処理すると、どんな一本鎖部分も加水分解される。
で処理すると、どんな一本鎖部分も加水分解される。
連結は、以下の標準的な条件や温度の下で15〜50μ
lの体積中で行う。例えば、2抛M Tris−CI(
all 7.5)、 10mM MgCh、
10mM ロTT、 33/Jg /1ailB
SA 、 10mM−50mM NaC1,そして“粘
着末−5fI”連結用には40,17M ATP、 0
.01〜0.02 (Weiss)単位T4DNAリガ
ーゼ、0℃、あるいは“平滑末端”連結用には1mM
ATP、 0.3〜0.6(Weiss)単位T4 D
NAリガーゼ、14℃、のいずれかである。分子間“粘
着末端”連結はふつう33〜100.cfg/mA全D
NA濃度(5〜1100n全末端濃度)で行う。分子間
“平滑末端”連結は1μに全末端濃度で行う。
lの体積中で行う。例えば、2抛M Tris−CI(
all 7.5)、 10mM MgCh、
10mM ロTT、 33/Jg /1ailB
SA 、 10mM−50mM NaC1,そして“粘
着末−5fI”連結用には40,17M ATP、 0
.01〜0.02 (Weiss)単位T4DNAリガ
ーゼ、0℃、あるいは“平滑末端”連結用には1mM
ATP、 0.3〜0.6(Weiss)単位T4 D
NAリガーゼ、14℃、のいずれかである。分子間“粘
着末端”連結はふつう33〜100.cfg/mA全D
NA濃度(5〜1100n全末端濃度)で行う。分子間
“平滑末端”連結は1μに全末端濃度で行う。
“ベクター断片”を用いるベクター構築では。
5° リン酸を除去してベクターの再連結を防ぐために
、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)あるいは子牛
小腸のアルカリホスファターゼ(CIP)でベクター断
片をふつう処理する。分解は、約150mMTris
(pH8)中で、 μgベクターあたり約1単位のBA
PあるいはCIPを用いて60℃、約1時間、 Na”
とHg+gの存在下で行う。核酸断片を回収するため。
、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)あるいは子牛
小腸のアルカリホスファターゼ(CIP)でベクター断
片をふつう処理する。分解は、約150mMTris
(pH8)中で、 μgベクターあたり約1単位のBA
PあるいはCIPを用いて60℃、約1時間、 Na”
とHg+gの存在下で行う。核酸断片を回収するため。
フェノール/クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱
させて調製する。他には、付加的な制限酵素分解と不必
要な断片の分離により二重に消化されたベクターでは、
再連結を防ぐことができる。
させて調製する。他には、付加的な制限酵素分解と不必
要な断片の分離により二重に消化されたベクターでは、
再連結を防ぐことができる。
配列の修飾を要求するcDNAあるいはゲノムDNA由
来のベクタ一部分に対して1部位特異的プライマー指向
変異が用いられる。これは、限定したミスマツチを除い
て変異をかけられるべき一本積ファージDNAに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、
所望の変異を示す。簡単に言うと、ファージに相補的な
鎖を直接合成させるために合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用い、生じた二本鎖DNAでファージ支
持宿主細菌を形質転換する。形質転層した細菌の培養液
を上層寒天にプレートし、ファージを保持する単一細胞
からのプラーク形成を促す。
来のベクタ一部分に対して1部位特異的プライマー指向
変異が用いられる。これは、限定したミスマツチを除い
て変異をかけられるべき一本積ファージDNAに相補的
なプライマー合成オリゴヌクレオチドを用いて行われ、
所望の変異を示す。簡単に言うと、ファージに相補的な
鎖を直接合成させるために合成オリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして用い、生じた二本鎖DNAでファージ支
持宿主細菌を形質転換する。形質転層した細菌の培養液
を上層寒天にプレートし、ファージを保持する単一細胞
からのプラーク形成を促す。
理論的には、新しいプラークの50%は、一本積として
変異のかかった形を持つファージを含む。
変異のかかった形を持つファージを含む。
50%はもとの配列である。正確な対のハイブリダイゼ
ーションは起こるが、もとの鎖とのミスマツチによりハ
イブリダイゼーションを防ぐのに充分な温度で、リン酸
化した合成プライマーと生じたプラークをハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズするプラークを選
び取り、培養し。
ーションは起こるが、もとの鎖とのミスマツチによりハ
イブリダイゼーションを防ぐのに充分な温度で、リン酸
化した合成プライマーと生じたプラークをハイブリダイ
ズさせる。プローブとハイブリダイズするプラークを選
び取り、培養し。
DNAを回収する。
C94,盪築東確認
以下に示した構築で、プラスミドの構築の正確な連結は
、叶、 M、Ca5adaban (Ca5adaba
n、 M、+et al、 J、 Mo1. Bio
l (1980) 138 : 179−207)から
得たエセリシア・コリー(Hscherichia c
oli)株MC1061をまず形質転換するか、あるい
は他の適当な宿主を連結混合液で形質転換することによ
り確かめる。成功した形質転換体は、当分野で理解され
ているように、アンピシリン、テトラサイクリン、ある
いは他の抗生物質耐性、あるいはプラスミド構築の仕方
により他のマーカーを用いて。
、叶、 M、Ca5adaban (Ca5adaba
n、 M、+et al、 J、 Mo1. Bio
l (1980) 138 : 179−207)から
得たエセリシア・コリー(Hscherichia c
oli)株MC1061をまず形質転換するか、あるい
は他の適当な宿主を連結混合液で形質転換することによ
り確かめる。成功した形質転換体は、当分野で理解され
ているように、アンピシリン、テトラサイクリン、ある
いは他の抗生物質耐性、あるいはプラスミド構築の仕方
により他のマーカーを用いて。
選択する。形質転換体からのプラスミドは、Clewe
ll。
ll。
D、 B、、等のProc Natl Acad Sc
i (USA) (1969) 62 :1159の方
法に従って1時にはクロラムフェニコール増幅(Cle
well、 D、 B、+ J、 Bacteriol
(1972)110 :667)に続いて、調製する
。単離したDNAを。
i (USA) (1969) 62 :1159の方
法に従って1時にはクロラムフェニコール増幅(Cle
well、 D、 B、+ J、 Bacteriol
(1972)110 :667)に続いて、調製する
。単離したDNAを。
制限酵素で分析し、および/もしくはSanger+
F、r等のProc Natl Acad Sci (
USA) (1977) 74 : 5463゜さらに
はMessing+等のNucleic Ac1ds
Res (1981)9 : 309のジデオキシ法、
あるいはMaxam等のMethods in Enz
molo (1980)65 : 499の方法に
より、配列決定する。
F、r等のProc Natl Acad Sci (
USA) (1977) 74 : 5463゜さらに
はMessing+等のNucleic Ac1ds
Res (1981)9 : 309のジデオキシ法、
あるいはMaxam等のMethods in Enz
molo (1980)65 : 499の方法に
より、配列決定する。
C・5・貫丞旦亙逍土
ここでクローニングや発現に用い、た宿主株は以下のと
おりである。
おりである。
クローニングやシーフェンシング用に、そしてほとんど
の細菌のプロモーター制御下での構築物の発現用に、エ
セリシア・コリー(Escherichiacoli)
株MC1061を用いた。
の細菌のプロモーター制御下での構築物の発現用に、エ
セリシア・コリー(Escherichiacoli)
株MC1061を用いた。
哺乳動物の発現に用いた細胞は、チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞あるいはALT−20と表される
ヒトの脳下垂体の細胞系である。
ー卵巣(CHO)細胞あるいはALT−20と表される
ヒトの脳下垂体の細胞系である。
(以下余白)
(実施例)
次の実施例は、実例を示すものであり1本発明を限定す
るものではない。プレプロレニンをコードしているDN
Aおよびそのプロセッシングされた生産物は、腎臓細胞
のmRNAから作成したcDNAライブラリーを検索す
る事により、得られる。しかし。
るものではない。プレプロレニンをコードしているDN
Aおよびそのプロセッシングされた生産物は、腎臓細胞
のmRNAから作成したcDNAライブラリーを検索す
る事により、得られる。しかし。
その配列は既知であり、そして、修飾されたヒトのシグ
ナル配列を前にもつヒトのプロレニンの完全なコード配
列を含む一つのベクターを保持する細胞がAmeric
an Type Cu1ture Co11ectio
nに寄託されているので、この手順を繰り返す必要はな
いであろう。pPP14を保持するCBI−285は、
1985年3月26日にATCCに寄託され、その受
理番号はCRL8758である。完全な遺伝子配列を得
るための方法は、一度その目的の配列が知られていれば
、現在使用可能である。例えば、 Edge、 M、D
、等のNature(1981) 292ニア56 N
ambiar、 K、P、等の5cience (19
84)223 :1299あるいはJay、 E、等の
J Biol Chem(1984) 2承:6311
を参照せよ。
ナル配列を前にもつヒトのプロレニンの完全なコード配
列を含む一つのベクターを保持する細胞がAmeric
an Type Cu1ture Co11ectio
nに寄託されているので、この手順を繰り返す必要はな
いであろう。pPP14を保持するCBI−285は、
1985年3月26日にATCCに寄託され、その受
理番号はCRL8758である。完全な遺伝子配列を得
るための方法は、一度その目的の配列が知られていれば
、現在使用可能である。例えば、 Edge、 M、D
、等のNature(1981) 292ニア56 N
ambiar、 K、P、等の5cience (19
84)223 :1299あるいはJay、 E、等の
J Biol Chem(1984) 2承:6311
を参照せよ。
施例1 プロレニンをコードする配列の調製cDNAラ
イブラリーは、事故犠牲となった人の腎臓から精製した
。オリゴdTを付加したポリA”RNAから調製した。
イブラリーは、事故犠牲となった人の腎臓から精製した
。オリゴdTを付加したポリA”RNAから調製した。
cDNAライブラリーは、バクテリオファージ ベクタ
ーAgtlo中で作成し、そして。
ーAgtlo中で作成し、そして。
マウスの下顎腺のレニンcDNA断片で検索することに
より、ヒトの遺伝子ライブラリーから得たCharon
−4ヒトレニン遺伝子クローンの適当な断片をプローブ
として検索した。そのライブラリーはmRNAから二本
鎖のcDNAを得るための標準的手順、 cDN^のD
NAポリメラーゼ■ (クレノー)による平滑末端化。
より、ヒトの遺伝子ライブラリーから得たCharon
−4ヒトレニン遺伝子クローンの適当な断片をプローブ
として検索した。そのライブラリーはmRNAから二本
鎖のcDNAを得るための標準的手順、 cDN^のD
NAポリメラーゼ■ (クレノー)による平滑末端化。
商業的に入手可能なHco RIリンカ−の添加、 E
co R1による切断、そして+ 1Eco R1で切
断したλgtloベクターに断片を連結する事、によっ
て調製した。
co R1による切断、そして+ 1Eco R1で切
断したλgtloベクターに断片を連結する事、によっ
て調製した。
2つの有意に反応したcDN^クローンは、2つとも。
Sangerのジデオキシ法(前出)を用いて配列決定
したところ、シグナル配列の5゛末端で欠失した7塩基
対を除いて、完全なレニンをコードする配列と3′の翻
訳されない領域を含んでいることが示された。その2つ
のクローンは、コーF 領域(7)1211 bp、そ
れに続いて完全な3゛の198 bpの翻訳されない領
域、その次に続いてポリA末尾を含んでいる。配列の、
適当なプレプロレニンのコドンと読み取り枠への割り当
ては、すでに報告されているImai等(前出)の配列
と比較することにより行なった。2つのクローン化され
た断片は、第1図に示したように、762の位置の特有
のEco R1部位から生成した。(ゲノム構造は複雑
であり、 10のエキソンを含んでいることが、ヒトの
遺伝子ライブラリーを検索することによってさらに示さ
れている。ゲノムのクローンは以下の構築には用いられ
なかった)。
したところ、シグナル配列の5゛末端で欠失した7塩基
対を除いて、完全なレニンをコードする配列と3′の翻
訳されない領域を含んでいることが示された。その2つ
のクローンは、コーF 領域(7)1211 bp、そ
れに続いて完全な3゛の198 bpの翻訳されない領
域、その次に続いてポリA末尾を含んでいる。配列の、
適当なプレプロレニンのコドンと読み取り枠への割り当
ては、すでに報告されているImai等(前出)の配列
と比較することにより行なった。2つのクローン化され
た断片は、第1図に示したように、762の位置の特有
のEco R1部位から生成した。(ゲノム構造は複雑
であり、 10のエキソンを含んでいることが、ヒトの
遺伝子ライブラリーを検索することによってさらに示さ
れている。ゲノムのクローンは以下の構築には用いられ
なかった)。
プレプロレニンタンパク
配列を2つのEco RI挿入として, pUc9に移
入しクローン化したベクターpHR1とpHR2を得た
。pHl11は5゛部分を含んでおり, pHR2は3
゛部分を含んでいる。pHR1とpHR2は,λgtl
oがらEco RIを用いてcDNAを切り取り,生じ
た断片の各々をEco R1で切断したpUc9に連結
することによって調製した。
入しクローン化したベクターpHR1とpHR2を得た
。pHl11は5゛部分を含んでおり, pHR2は3
゛部分を含んでいる。pHR1とpHR2は,λgtl
oがらEco RIを用いてcDNAを切り取り,生じ
た断片の各々をEco R1で切断したpUc9に連結
することによって調製した。
施伺2 プレプロレニンの哺乳動物発 ベクタ二至盪策
哺乳動物宿主と和合性であり,そしてヒトのメタロチオ
ネイン−II (hMT−If)プロモーターの制御下
にあるコード配列を持っているプレプロレニンの発現ベ
クターpPP14の構築を第2図に示す。
ネイン−II (hMT−If)プロモーターの制御下
にあるコード配列を持っているプレプロレニンの発現ベ
クターpPP14の構築を第2図に示す。
pPP14を構築するためにpMT.PROを宿主発現
ベクターとして用いた。pMT. PROは1985年
2月13日に登録されている米国特許番号701,29
6に記述されているp II S 1と米国特許番号6
16.4B8と622,639 (それぞれ1984
年6月1日と. 1984年6月20日に登録)に記述
されているpMT401に類似している。既述の米国特
許出願のすべてが本願の出願人に譲渡され,本願に開示
されている。
ベクターとして用いた。pMT. PROは1985年
2月13日に登録されている米国特許番号701,29
6に記述されているp II S 1と米国特許番号6
16.4B8と622,639 (それぞれ1984
年6月1日と. 1984年6月20日に登録)に記述
されているpMT401に類似している。既述の米国特
許出願のすべてが本願の出願人に譲渡され,本願に開示
されている。
pl(StとpM7401両方のプラスミドはp841
1 (Karin。
1 (Karin。
M.、et al, Nature(1982)29
9 :297−802)からのhMT− n配列の84
0 bpを含んでおり,それはhMT− II遺伝子の
−765の旧ndllr部位から+70番目の塩基にわ
たっている。pMT.PROは,類似のhMT−II断
片を含んでいる。しかし6それはさらにptlc8に連
結した時にATG開始コドンを含んでいる。3つのベク
ターすべては, pUC8に適当なhMT− IIn配
列連結して得た。(Vieira、 J、、et al
、 Gene (1982)19: 259−268
)。pMT、PROを構築するために、 hMT−カ配
列をpMTII−BPV (Karin、 M、、e
t al、 ProcNatl Acad Sci
(USA) (1983)80:4040−40
44) からHind m / I(ind m断片
として切り出し、それからプロモーターと5°転写部分
を得るためにBamHIで切断した。hMT−II配列
を含む旧nd m / Bam1l I断片を旧ndm
/BamHIで切断したpUc8に挿入しpMr:pp
。
9 :297−802)からのhMT− n配列の84
0 bpを含んでおり,それはhMT− II遺伝子の
−765の旧ndllr部位から+70番目の塩基にわ
たっている。pMT.PROは,類似のhMT−II断
片を含んでいる。しかし6それはさらにptlc8に連
結した時にATG開始コドンを含んでいる。3つのベク
ターすべては, pUC8に適当なhMT− IIn配
列連結して得た。(Vieira、 J、、et al
、 Gene (1982)19: 259−268
)。pMT、PROを構築するために、 hMT−カ配
列をpMTII−BPV (Karin、 M、、e
t al、 ProcNatl Acad Sci
(USA) (1983)80:4040−40
44) からHind m / I(ind m断片
として切り出し、それからプロモーターと5°転写部分
を得るためにBamHIで切断した。hMT−II配列
を含む旧nd m / Bam1l I断片を旧ndm
/BamHIで切断したpUc8に挿入しpMr:pp
。
を得た。
pPP14を構築するために、 pMT、PRoをBa
m1lIで切断し、4種のdNTP存在下でDNAポリ
メラーゼ(クレノー)を用いて埋め、それからEco
RIで切断した。Eco R1はATG開始コドンに続
く特有のBamHI部位のすぐ下流を切断する。プレプ
ロレニン遺伝子の5°部分をpHR1からEco RI
で切断して切り出し、開環したpMT、PROベクター
のEco Rr末尾に粘着末端条件下で連結した。挿入
のおよそ50%が正しい方向で挿入されるだろう。それ
から連結混合液を4種のdNTP存在下でDNAポリメ
ラーゼ■ (クレノー)で処理して残存する未連結Ec
o RI部位を平滑にした。最終的に、ベクターを連結
によって再環化し、その混合液でE、coli MC1
061をAmp’に形質転換した。hMT−nのプロモ
ーター領域と5°転写部分から供給されたATGと読み
取り枠に合うように、プレプロレニンのコード配列の5
°部分が入った。正しい構築物を持つコロニーを選び培
養した。中間体プラスミドの構築は制限酵素分析と配列
決定により確かめた。
m1lIで切断し、4種のdNTP存在下でDNAポリ
メラーゼ(クレノー)を用いて埋め、それからEco
RIで切断した。Eco R1はATG開始コドンに続
く特有のBamHI部位のすぐ下流を切断する。プレプ
ロレニン遺伝子の5°部分をpHR1からEco RI
で切断して切り出し、開環したpMT、PROベクター
のEco Rr末尾に粘着末端条件下で連結した。挿入
のおよそ50%が正しい方向で挿入されるだろう。それ
から連結混合液を4種のdNTP存在下でDNAポリメ
ラーゼ■ (クレノー)で処理して残存する未連結Ec
o RI部位を平滑にした。最終的に、ベクターを連結
によって再環化し、その混合液でE、coli MC1
061をAmp’に形質転換した。hMT−nのプロモ
ーター領域と5°転写部分から供給されたATGと読み
取り枠に合うように、プレプロレニンのコード配列の5
°部分が入った。正しい構築物を持つコロニーを選び培
養した。中間体プラスミドの構築は制限酵素分析と配列
決定により確かめた。
得られた中間体プラスミドは、 pHR−2より得たE
co R1で切り出した3°部分を正しい方向で組み込
み得ないようであった。この問題は、 pUc8由来の
中間体のバックボーンベクターをpUc9の対応する配
列と取り換えることで打開した。これをなすために、中
間体ベクターを旧ndlI[−とEco R1で処理し
、hMT−nプロモーター/プレプロレニン5°部分を
含む断片を旧ndnI/Eco RIで切断したpUc
9に挿入した。それにより生成する修飾された中間体を
Eco RIで切断し、 pHR−2から単離したEc
o R1/Eco R1断片と連結して、完全なプレプ
ロレニンコード配列を含んでいるpPP14を作った。
co R1で切り出した3°部分を正しい方向で組み込
み得ないようであった。この問題は、 pUc8由来の
中間体のバックボーンベクターをpUc9の対応する配
列と取り換えることで打開した。これをなすために、中
間体ベクターを旧ndlI[−とEco R1で処理し
、hMT−nプロモーター/プレプロレニン5°部分を
含む断片を旧ndnI/Eco RIで切断したpUc
9に挿入した。それにより生成する修飾された中間体を
Eco RIで切断し、 pHR−2から単離したEc
o R1/Eco R1断片と連結して、完全なプレプ
ロレニンコード配列を含んでいるpPP14を作った。
pMT、r’RoのATG 開始コドンと、プレプロレ
ニンのコード配列の5°末端部分の間の接合領域は。
ニンのコード配列の5°末端部分の間の接合領域は。
Bam IIIとEco RIで切断した部位をそれぞ
れ修復した後平滑末端結合によって接合されているので
。
れ修復した後平滑末端結合によって接合されているので
。
接合領域の配列は5’−CC工σπITTTCCG A
T G Gで。
T G Gで。
このように下線の引かれたATG開始コドンがコード配
列の残りと共に、読み取り枠にあって位置している。上
線は、 Bam III(!:ECOR1部位を埋めた
接合を示している。こうして、シグナル配列のプレプロ
ティンのN末のコード配列はMet−asp−gln−
phe−arg−trpで、もとの対応するN未配列で
あるMet−asp−gln−trpと比較して、2つ
のアミノ酸が付加している。
列の残りと共に、読み取り枠にあって位置している。上
線は、 Bam III(!:ECOR1部位を埋めた
接合を示している。こうして、シグナル配列のプレプロ
ティンのN末のコード配列はMet−asp−gln−
phe−arg−trpで、もとの対応するN未配列で
あるMet−asp−gln−trpと比較して、2つ
のアミノ酸が付加している。
結果としてできたベクターpPP14を、チャイニーズ
ハムスター卵巣(CIIO)とALT−20細胞を含む
宿主補乳動物細胞でのプレプロレニンの発現のために、
下記のように用いた。
ハムスター卵巣(CIIO)とALT−20細胞を含む
宿主補乳動物細胞でのプレプロレニンの発現のために、
下記のように用いた。
“チャイニーズハムスター卵巣” (CIIO)細胞は
標準細胞系統ATCCCCL−61とその誘導体ばかり
でなく、同じ組織から単離された関連細胞も含んでいる
。誘導体は、もとの系統と遺伝子的に、あるいは表現的
に、異なるであろうその系統変異株であるが、故意ある
いは偶然の変異により、それから得られたものである。
標準細胞系統ATCCCCL−61とその誘導体ばかり
でなく、同じ組織から単離された関連細胞も含んでいる
。誘導体は、もとの系統と遺伝子的に、あるいは表現的
に、異なるであろうその系統変異株であるが、故意ある
いは偶然の変異により、それから得られたものである。
同様にAtT−20細胞は、 ATCC細胞系統CCL
−89と。
−89と。
上記の関連細胞と誘導体を含んでいる。
pPP14構築は、また、 5v40 (塩基5171
−1046)からの1120bpのtlindI[[/
旧ndn[断片を、そのプロモーターの上流の旧ndl
llr部位に挿入することによって修飾した。挿入断片
はSV40エンハンサ−領域を含んでいる。
−1046)からの1120bpのtlindI[[/
旧ndn[断片を、そのプロモーターの上流の旧ndl
llr部位に挿入することによって修飾した。挿入断片
はSV40エンハンサ−領域を含んでいる。
2種の細菌発現ベクターを調製した;1つは成熟レニン
に対しくpLF5と称する)、もう1つはプロレニンに
対する(pAA6と称する)ものである。
に対しくpLF5と称する)、もう1つはプロレニンに
対する(pAA6と称する)ものである。
両方の場合において、宿主プラスミドはpKT52で。
ATGの続く″trc’プロモーターを含む。pKT5
2の構築はU、S、通し番号616.488と622.
639 (前出)に記述されている。簡単に言えば、
“trc”プロモ−ターはtrcプロモーターの上流部
分とlacプロモーターのオペレーターを含んだ下流領
域を含んでおり、これらのプロモーターを含む2つの簡
単に入手可能なプラスミドから独自に調製した。Bam
l11/HindI[rカセットとしてtrcプロモー
ターを構築するために、ハイブリッドプロモーターを含
む中間体プラスミドpKK10−0を調製した。
2の構築はU、S、通し番号616.488と622.
639 (前出)に記述されている。簡単に言えば、
“trc”プロモ−ターはtrcプロモーターの上流部
分とlacプロモーターのオペレーターを含んだ下流領
域を含んでおり、これらのプロモーターを含む2つの簡
単に入手可能なプラスミドから独自に調製した。Bam
l11/HindI[rカセットとしてtrcプロモー
ターを構築するために、ハイブリッドプロモーターを含
む中間体プラスミドpKK10−0を調製した。
pKKlo−0を調製するため、 pEA300(Am
man、E 、etal、 Gene (1983)
25:167−178) をPvu IIとC1a
!で切断し、 DNAポリメラーゼ(クレノー)存
在下で、 dCTPのみを用いて埋め1次にマングビー
ンヌクレアーゼで処理し、大きい方のベクター断片を単
離した。このベクター断片はtrpプロモーターの上流
部分を含んでいる。この断片にpGLlol (Lau
er、 G、et al、 J、Mo1. A 1.
Genet(1981) 1:139−147)から
切り取った5sbpの平滑末端のHpa II/Pvu
II切断物、これはpGLlolをPvu IIおよ
び11pa IIで切り続いてdGTヒおよび放射能標
識したdCTPの存在下で修復して調製したものである
が、これを断片に連結した。この断片はlacオペレー
ター領域を含んでいる。これら2つの平滑末端断片を連
結して生成したものがpKKlo−0である。
man、E 、etal、 Gene (1983)
25:167−178) をPvu IIとC1a
!で切断し、 DNAポリメラーゼ(クレノー)存
在下で、 dCTPのみを用いて埋め1次にマングビー
ンヌクレアーゼで処理し、大きい方のベクター断片を単
離した。このベクター断片はtrpプロモーターの上流
部分を含んでいる。この断片にpGLlol (Lau
er、 G、et al、 J、Mo1. A 1.
Genet(1981) 1:139−147)から
切り取った5sbpの平滑末端のHpa II/Pvu
II切断物、これはpGLlolをPvu IIおよ
び11pa IIで切り続いてdGTヒおよび放射能標
識したdCTPの存在下で修復して調製したものである
が、これを断片に連結した。この断片はlacオペレー
ター領域を含んでいる。これら2つの平滑末端断片を連
結して生成したものがpKKlo−0である。
Eco R1で切断し、クレノー断片で埋め、そこにB
am旧のリンカ−5’−CCGGATCCGGを挿入す
ることにより、 Bam 111部位をpKKlo−0
のtrp/1ac(trc)プロモーター/オペレータ
ーの上流に挿入した。
am旧のリンカ−5’−CCGGATCCGGを挿入す
ることにより、 Bam 111部位をpKKlo−0
のtrp/1ac(trc)プロモーター/オペレータ
ーの上流に挿入した。
生じたプラスミドpKK10−1をPvu IFで切断
し、そこにNco Iリンカ−5゛−八CCATGG
Tを連結し、 Nc。
し、そこにNco Iリンカ−5゛−八CCATGG
Tを連結し、 Nc。
■で切断し、埋めて、その後5°−GCTGCAGCC
八八GCTTGG−3″とその相補鎖の2つの相補的な
オリゴヌクレオチドとして調製したPst Iおよび
1lindn1部位を含む二本鎖のリンカ−を連結した
。この連結混合液でE、coliを静p′に形質転換し
た。単離したプラスミドI)NAをBam旧と旧ndI
[[で切断し、電気泳動して得られた小さいBam旧/
Hindl[I断片はtrcプロモーターを含んでいる
。
八八GCTTGG−3″とその相補鎖の2つの相補的な
オリゴヌクレオチドとして調製したPst Iおよび
1lindn1部位を含む二本鎖のリンカ−を連結した
。この連結混合液でE、coliを静p′に形質転換し
た。単離したプラスミドI)NAをBam旧と旧ndI
[[で切断し、電気泳動して得られた小さいBam旧/
Hindl[I断片はtrcプロモーターを含んでいる
。
pKT52を完成させるため、 trcプロモーターを
含むRam旧/Hindl[r断片を、 Amp’遺
伝子と複製開始点を含むpXKlo−2(Brosiu
s、 J、、Gene (1984)27:161−1
72)のBam旧/旧ndI[[切断で得られた大きい
断片に連結した。生じたプラスミドpKK233−1を
Pvu 1で完全に分解し、そしてBgl Iで部
分分解し、 pUc8由来で、 Pst 1部位を欠
いているがアンピシリン耐性遺伝子に相当する部分を含
む、360bpのPvu I/Bgl 1断片を連
結した。この連結混合液でE、coliを形質転換し、
trcプロモーターの次にPst 1部位が唯一存在
することで、形質転換体を選択した。この正しい構築物
、ρにに233−2.をEco R1とPvu IIで
切断し、 dATPとdTTPで埋め、正しい構築物p
KT52を得るために再連結した。
含むRam旧/Hindl[r断片を、 Amp’遺
伝子と複製開始点を含むpXKlo−2(Brosiu
s、 J、、Gene (1984)27:161−1
72)のBam旧/旧ndI[[切断で得られた大きい
断片に連結した。生じたプラスミドpKK233−1を
Pvu 1で完全に分解し、そしてBgl Iで部
分分解し、 pUc8由来で、 Pst 1部位を欠
いているがアンピシリン耐性遺伝子に相当する部分を含
む、360bpのPvu I/Bgl 1断片を連
結した。この連結混合液でE、coliを形質転換し、
trcプロモーターの次にPst 1部位が唯一存在
することで、形質転換体を選択した。この正しい構築物
、ρにに233−2.をEco R1とPvu IIで
切断し、 dATPとdTTPで埋め、正しい構築物p
KT52を得るために再連結した。
pKT52は、目的のtrcプロモーター、下流のAT
G開始コドン、および下流のNco 1部位とPst
1部位と旧ndI[[部位を含んでいる。
G開始コドン、および下流のNco 1部位とPst
1部位と旧ndI[[部位を含んでいる。
pLf’ 5を得るために(第3図aに示す)、レニン
のコード配列を次のように調製した。pHR1をEc。
のコード配列を次のように調製した。pHR1をEc。
RIで分解し、 698bρの断片を単離することによ
ってレニンのcDNAの5″部分を切り取った。その断
片を5au3AIで分解し、成熟レニンのコード配列の
9個のコドンから始まっている472 bpの下流側の
断片を得た。この断片を、 Bam III/Eco
R1で分解したp8R322に連結した。結果として得
られた中間体プラスミドをBam III/Pvu I
Iで分解し、欠失コドンを供給する一対の合成相補オリ
ゴヌクレオチド 5’ −CTGACCCTTGGCAACACCAC
CTCTTCTGTGACTGGGAACCGTTGT
GGTGGAGAAGACACTAG−5”をその分解
プラスミドと連結した。上流末端に近接したPvu U
部位をこの方法により造り直す。この結果として得られ
た中間体プラスミドをEco R1とPvu Ifで分
解して、成熟レニンの5”側をコードする配列を含む5
01bpの断片を得た。
ってレニンのcDNAの5″部分を切り取った。その断
片を5au3AIで分解し、成熟レニンのコード配列の
9個のコドンから始まっている472 bpの下流側の
断片を得た。この断片を、 Bam III/Eco
R1で分解したp8R322に連結した。結果として得
られた中間体プラスミドをBam III/Pvu I
Iで分解し、欠失コドンを供給する一対の合成相補オリ
ゴヌクレオチド 5’ −CTGACCCTTGGCAACACCAC
CTCTTCTGTGACTGGGAACCGTTGT
GGTGGAGAAGACACTAG−5”をその分解
プラスミドと連結した。上流末端に近接したPvu U
部位をこの方法により造り直す。この結果として得られ
た中間体プラスミドをEco R1とPvu Ifで分
解して、成熟レニンの5”側をコードする配列を含む5
01bpの断片を得た。
3′末端の配列は、 pHR2をSac Iで切断し、
T4ポリメラーゼで平滑末端にし、旧ndI[Iリン
カ−を加え、そして旧ndl[rで切断したpHR2誘
導体のIEco RI/旧ndll1分解による645
bpの断片として得た。このEco R1/l1ind
m分解物をIEco R1と旧ndllFで分解した
pUc9ヘクローン化した。
T4ポリメラーゼで平滑末端にし、旧ndI[Iリン
カ−を加え、そして旧ndl[rで切断したpHR2誘
導体のIEco RI/旧ndll1分解による645
bpの断片として得た。このEco R1/l1ind
m分解物をIEco R1と旧ndllFで分解した
pUc9ヘクローン化した。
この2つの部分を、 pKT52のNeo I (修
復)/11indl[[分解物に連結した。このことに
より、 pKT52はLrcプロモーターの下流に平滑
のATGを供給する(第3図a参照)。この結果生成す
る発現プラスミドpLF 5は、 trcプロモーター
の制御下で。
復)/11indl[[分解物に連結した。このことに
より、 pKT52はLrcプロモーターの下流に平滑
のATGを供給する(第3図a参照)。この結果生成す
る発現プラスミドpLF 5は、 trcプロモーター
の制御下で。
ATG開始コドンと読み取り枠の合ったレニンの全コー
ド配列を含んでいる。
ド配列を含んでいる。
プロレニンの原核生物発現ベクターpAA6 (第3図
b)を得るため、 pHR1をAva IとEco
RIで分解し、 171 bpのEco R1/Ava
I断片および527bpの八νa I /Eco
RI断片を得た。5%のアクリルアミドゲルで分離し
、電気的に溶出した後、 171 bpの断片をさらに
プロレニンの開始部位で切断するRsa■で制限酵素処
理して、 112 bpの断片を生成した。
b)を得るため、 pHR1をAva IとEco
RIで分解し、 171 bpのEco R1/Ava
I断片および527bpの八νa I /Eco
RI断片を得た。5%のアクリルアミドゲルで分離し
、電気的に溶出した後、 171 bpの断片をさらに
プロレニンの開始部位で切断するRsa■で制限酵素処
理して、 112 bpの断片を生成した。
上述の527bpと112bpの断片を連結し、下流の
コード配列を得るため、 pLF 5のEco R1/
Hind m分解によって生成する645bpの断片
を連結し、これを上述のpKT52のNeo I (修
復) /l1indll1分解物に連結した。結果とし
て生成したベクターであるpAA6はtrcプロモータ
ーの制御下にあり、 pKT52(7) ATG開始コ
ドンと読み取り枠の合ったプロレニンの配列を含んでい
る(第3図す参照)。
コード配列を得るため、 pLF 5のEco R1/
Hind m分解によって生成する645bpの断片
を連結し、これを上述のpKT52のNeo I (修
復) /l1indll1分解物に連結した。結果とし
て生成したベクターであるpAA6はtrcプロモータ
ーの制御下にあり、 pKT52(7) ATG開始コ
ドンと読み取り枠の合ったプロレニンの配列を含んでい
る(第3図す参照)。
−11胸中でのプレプロレニン配
列!すし啜
哺乳動物発現ベクターであるpPP14は10%の牛胎
児血清を添加した50%ダルベツコ変更イーグル培地1
50%クーンF12培地中で生育するCHO細胞を形質
転換するのに用いた。20μgのプラスミド(pPP1
4 DN八)を2μgのマーカープラスミドのpSV2
: Neoと共に、標準的なリン酸カルシウム沈澱法(
前出)を用いて、 101)+mの皿中の細胞に加え
、 DNA添加3時間後に15%グリセロールショック
を与えた。感染後24時間目に、細胞を0.4■/1m
l G418抗生物質で処理しG418耐性コロニーを
拡がらせ、そして目的のタンパク質の生産について分析
した。
児血清を添加した50%ダルベツコ変更イーグル培地1
50%クーンF12培地中で生育するCHO細胞を形質
転換するのに用いた。20μgのプラスミド(pPP1
4 DN八)を2μgのマーカープラスミドのpSV2
: Neoと共に、標準的なリン酸カルシウム沈澱法(
前出)を用いて、 101)+mの皿中の細胞に加え
、 DNA添加3時間後に15%グリセロールショック
を与えた。感染後24時間目に、細胞を0.4■/1m
l G418抗生物質で処理しG418耐性コロニーを
拡がらせ、そして目的のタンパク質の生産について分析
した。
6418耐性コロニーを、タンパク質を生産させるため
に1〜5X10−’MのZnSO4で誘導した。合成さ
れるタンパク質を放射能標識するために、誘導細胞を含
む培地に358−メチオニンを加え、培地を取り除き、
一部を天然のレニンに対して調製した抗体(抗レニン抗
体)、またはプロペプチド配列のC末端12アミノ酸に
相当する合成ペプチドに対する抗体(抗“プロ”抗体)
と反応させた。免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にかけ
、バンドをオートラジオグラフィーにより検出した。抗
レニン抗体と抗“プロ”抗体の両方ともプロレニンに一
致する適当な分子量のバンドを生成した。
に1〜5X10−’MのZnSO4で誘導した。合成さ
れるタンパク質を放射能標識するために、誘導細胞を含
む培地に358−メチオニンを加え、培地を取り除き、
一部を天然のレニンに対して調製した抗体(抗レニン抗
体)、またはプロペプチド配列のC末端12アミノ酸に
相当する合成ペプチドに対する抗体(抗“プロ”抗体)
と反応させた。免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にかけ
、バンドをオートラジオグラフィーにより検出した。抗
レニン抗体と抗“プロ”抗体の両方ともプロレニンに一
致する適当な分子量のバンドを生成した。
列りの放射能標識した培地を、まずトリス緩衝液中50
.ljg/1lllのトリプシン(pH8)で25℃で
60分間、処理した。トリプシン処理した培地を次に。
.ljg/1lllのトリプシン(pH8)で25℃で
60分間、処理した。トリプシン処理した培地を次に。
上記のように、抗レニン抗体、または抗“pro”抗体
で処理し、免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にがけた。
で処理し、免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にがけた。
抗レニン抗体は、今度は、成熟レニンの分子量をもつこ
とを示すタンパク質を免疫沈澱させ゛た。抗プロ抗体は
、この成熟型を免疫沈澱させなかった。
とを示すタンパク質を免疫沈澱させ゛た。抗プロ抗体は
、この成熟型を免疫沈澱させなかった。
第4図にこの結果を示す。レーン1〜3は対照プラスミ
ドで形質転換した細胞からの培地の免疫沈澱物を表す。
ドで形質転換した細胞からの培地の免疫沈澱物を表す。
レーン4〜6はpPP14で形質転換した細胞からの培
地の免疫沈澱物である。レーン1および4.そしてレー
ン2および5はそれぞれ。
地の免疫沈澱物である。レーン1および4.そしてレー
ン2および5はそれぞれ。
抗プロ抗体および抗レニン抗体を用いた免疫沈澱物を表
す。(Dzau、 V、 J、、 et al、−リj
L−シ徂Hertension (1983)A5(7
−8):120?−1220に記述されている抗ヒトレ
ニン抗体は、叶、 Victor Dzau+(バーバ
ード メディカル スクール)により供与された)。レ
ーン3および6はトリプシン処理した培地から抗レニン
抗体を用いて得られた免疫沈澱物のゲルである。
す。(Dzau、 V、 J、、 et al、−リj
L−シ徂Hertension (1983)A5(7
−8):120?−1220に記述されている抗ヒトレ
ニン抗体は、叶、 Victor Dzau+(バーバ
ード メディカル スクール)により供与された)。レ
ーン3および6はトリプシン処理した培地から抗レニン
抗体を用いて得られた免疫沈澱物のゲルである。
一般に、 pPP14で形質転換した後G418耐性で
選択しりCHO細胞のプールは、 5 Xl0−’M
(7)ZnSO。
選択しりCHO細胞のプールは、 5 Xl0−’M
(7)ZnSO。
および0.02〜0.2μg7mlの程度の10− ’
F! のデキサメタシンで誘導した後、レニンを生産す
る。こうして生産されたレニンはエンドFで処理、また
は未処理の 3BS−メチオニンで放射能標識した分泌
レニンを流したSDSゲルと比較して、グリコジル化し
ていることが示された。
F! のデキサメタシンで誘導した後、レニンを生産す
る。こうして生産されたレニンはエンドFで処理、また
は未処理の 3BS−メチオニンで放射能標識した分泌
レニンを流したSDSゲルと比較して、グリコジル化し
ていることが示された。
適当な選択により、さらに高レベルのレニンの生産を得
ることが可能である。一つの方法として。
ることが可能である。一つの方法として。
形質転換プールの細胞を5 Xl0−’MのZnSO4
存在下で、無血清培地で増殖させ、これらの条件下で生
育したコロニーをひろい、血清を含む培地にまき、そし
て、上述の標準の誘導条件下でレニン生産の検定を行な
った。この過程の後に得られた。
存在下で、無血清培地で増殖させ、これらの条件下で生
育したコロニーをひろい、血清を含む培地にまき、そし
て、上述の標準の誘導条件下でレニン生産の検定を行な
った。この過程の後に得られた。
もっとも高いレニンの生産性をもつクローンは。
平均0.8μg7ml生産し、このクラスのクローンの
うちの1つは、 CBI−285(前出)と称し、受理
番号CRL 8758 ATTCで保管された。
うちの1つは、 CBI−285(前出)と称し、受理
番号CRL 8758 ATTCで保管された。
放射能標識物なしで生育した。 CBI−285と称す
る。ρPP14で形質転換したC110細胞の培地はま
た。
る。ρPP14で形質転換したC110細胞の培地はま
た。
直接にレニン活性を調べた。上記の条件下でトリプシン
で前処理した試料を検定に用いた。レニン配列を含まな
いプラスミドで惑染した細胞の培地を対照として用いた
。この検定において、基質として、レニン存在下でアン
ジオテンシンIに変換するヒトのアンジオテンシンノー
ゲンを供給する。
で前処理した試料を検定に用いた。レニン配列を含まな
いプラスミドで惑染した細胞の培地を対照として用いた
。この検定において、基質として、レニン存在下でアン
ジオテンシンIに変換するヒトのアンジオテンシンノー
ゲンを供給する。
生成したアンジオテンシン■を、トレーサーとして12
5■で標識したアンジオテンシン■を用いて。
5■で標識したアンジオテンシン■を用いて。
ジェネンティクートラベノール(社)によって販売され
ているコンペティティブイムノアソセイキットを用いて
測定する。トリプシン処理したCBI−細胞の培地は、
この検定において、25%の最大限の基質濃度で検定し
た結果、30〜50 X 10″ngアンジオテンシン
/hr/ml培養液上澄の程度のレニン活性を示した。
ているコンペティティブイムノアソセイキットを用いて
測定する。トリプシン処理したCBI−細胞の培地は、
この検定において、25%の最大限の基質濃度で検定し
た結果、30〜50 X 10″ngアンジオテンシン
/hr/ml培養液上澄の程度のレニン活性を示した。
対照プラスミドで形質転換した細胞の培地をトリプシン
処理したものは、検出可能な活性を持たなかった。
処理したものは、検出可能な活性を持たなかった。
もう1つの高生産細胞系統は次のようにして得た。プー
ルからの細胞をプレートにまき、ポリエステルの布の上
にレプリカした。そのレプリカ布は次いで1分泌された
細胞のタンパク質を結合させるためにニトロセルロース
フィルターに置いた。
ルからの細胞をプレートにまき、ポリエステルの布の上
にレプリカした。そのレプリカ布は次いで1分泌された
細胞のタンパク質を結合させるためにニトロセルロース
フィルターに置いた。
フィルターは次に抗プロレニン抗血清で反応させ。
次に′2SI−Q標識したプロティンAで処理した。
この検定により、最も高レベルでレニンを分泌すると思
われるクローンをひろい、血清を含む培地にまき、標準
的な条件下で、活性を再検定した。
われるクローンをひろい、血清を含む培地にまき、標準
的な条件下で、活性を再検定した。
クローンは、1〜4μg7mllのレニンを生産するも
のが得られ、任意に選んだそのうちのただ1つのクロー
ン、 CBI−AA2を下記のように、生産条件下の研
究に選んだ。
のが得られ、任意に選んだそのうちのただ1つのクロー
ン、 CBI−AA2を下記のように、生産条件下の研
究に選んだ。
A tT −2(はむlたl生
ALT−20細胞は、5%CO2空気でなく15%CO
□空気を用いたことを除いては、 CHO細胞の形質転
換するための調製で上述したように生育させた。形質転
換および成功した形質転換体の6418耐性による選択
は、下に示すことを除き、 Cll0細胞で記述した通
りであり2選択された細胞は、血清を含む培地を用いた
ことだけを除いては、レニンを生産するCll0細胞に
おいて上述したようなプレート検定を用いて、上澄液中
のレニンの生産により選別した。
□空気を用いたことを除いては、 CHO細胞の形質転
換するための調製で上述したように生育させた。形質転
換および成功した形質転換体の6418耐性による選択
は、下に示すことを除き、 Cll0細胞で記述した通
りであり2選択された細胞は、血清を含む培地を用いた
ことだけを除いては、レニンを生産するCll0細胞に
おいて上述したようなプレート検定を用いて、上澄液中
のレニンの生産により選別した。
高生産系統は、培地中にレニンおよびプロレニン両方を
分泌した;レニンの分泌は細胞を8−ブロモcAMPで
処理することによって、劇的に増加させることができた
。ヒトレニン抗血清で沈澱可能な分泌物の比較を、下記
の第6図に示す。
分泌した;レニンの分泌は細胞を8−ブロモcAMPで
処理することによって、劇的に増加させることができた
。ヒトレニン抗血清で沈澱可能な分泌物の比較を、下記
の第6図に示す。
細胞は上記のように生育させ、プレート当たり10”個
の細胞をまき、翌日、10%FC5のDME21 、で
洗浄した。細胞を125μgのpPP14および25μ
gのpsV2NEoで感染させ、 2508g /ml
のG418で選択した。上記のように発現させるために
誘導し。
の細胞をまき、翌日、10%FC5のDME21 、で
洗浄した。細胞を125μgのpPP14および25μ
gのpsV2NEoで感染させ、 2508g /ml
のG418で選択した。上記のように発現させるために
誘導し。
組換え生産物を蓄積させた後、培地を5mMの8−ブロ
モcAMPで処理、または未処理により、3時間後、ト
リプシン存在下、および非存在下において。
モcAMPで処理、または未処理により、3時間後、ト
リプシン存在下、および非存在下において。
上澄をレニン活性について検定した゛(トリプシンなし
ての活性は成熟レニンのものを表し、トリプシン存在下
での活性はレニンとプロレニンの合計のものを表す)。
ての活性は成熟レニンのものを表し、トリプシン存在下
での活性はレニンとプロレニンの合計のものを表す)。
結果は次に示す通りである。
このように分泌促進物質の添加により、レニン活性にお
いて、約30ng Al/m A’ /hrの分泌の上
昇が得られる。
いて、約30ng Al/m A’ /hrの分泌の上
昇が得られる。
第6図は1次に示すように、35S−メチオニンで放射
能標識した細胞の上澄から得た免疫沈澱したタンパク質
のSDSゲルを示す。細胞は、惑染していないAtT−
20細胞、 pPP14で感染したALT−20細胞。
能標識した細胞の上澄から得た免疫沈澱したタンパク質
のSDSゲルを示す。細胞は、惑染していないAtT−
20細胞、 pPP14で感染したALT−20細胞。
およびpPP14で形質転換したCll0細胞である。
細胞は上記のように誘導させた後、35S−メチオニン
で15時間、放射能標識した。培地を集め、上澄をウサ
ギの抗ヒトレニン抗血清およびプロティンAセファロー
スで免疫沈澱させ、10%5O5−PAGEにかけた。
で15時間、放射能標識した。培地を集め、上澄をウサ
ギの抗ヒトレニン抗血清およびプロティンAセファロー
スで免疫沈澱させ、10%5O5−PAGEにかけた。
レーン2は形質転換していない細胞の初発の上澄からの
免疫沈澱物を表し、レーン7は形質転換したへtT−2
0細胞から、レーン13は形質転換したC410細胞か
らのものである。示すように、感染させたALT−20
細胞はプロレニンとレニンの両方を分泌し。
免疫沈澱物を表し、レーン7は形質転換したへtT−2
0細胞から、レーン13は形質転換したC410細胞か
らのものである。示すように、感染させたALT−20
細胞はプロレニンとレニンの両方を分泌し。
感染させたCHO細胞はプロレニン型のみを分泌する。
ウェルを非標識培地で洗浄し、新しい非標識培地で3時
間保温した。3時間後に、この培地を集めた(レーン3
.9および15)。同じウェルを5mMの8−ブロモc
AMP (レーン4.10および16)または、OmM
の8−ブロモcAMP (レーン5,11および17)
のいずれかを含む新しい培地で3時間処理した。
間保温した。3時間後に、この培地を集めた(レーン3
.9および15)。同じウェルを5mMの8−ブロモc
AMP (レーン4.10および16)または、OmM
の8−ブロモcAMP (レーン5,11および17)
のいずれかを含む新しい培地で3時間処理した。
第6図に示したように、35S−メチオニンを取り除い
た後には1期待したように標識したレニンまたはプロレ
ニンの分泌は低下した(レーン9および15)。続けて
培養を行うと、さらに低下した(レニン11および17
)が、5mMのブロモcAMPで処理するとALT−2
0細胞から標識されたレニンが分泌された(レーン10
)。しかしCHO細胞からのプロレニンの分泌はなかっ
た(レーン16)。
た後には1期待したように標識したレニンまたはプロレ
ニンの分泌は低下した(レーン9および15)。続けて
培養を行うと、さらに低下した(レニン11および17
)が、5mMのブロモcAMPで処理するとALT−2
0細胞から標識されたレニンが分泌された(レーン10
)。しかしCHO細胞からのプロレニンの分泌はなかっ
た(レーン16)。
成功した形質転換体を含むALT−20の培養をまた。
血清なしの条件下で維持可能な細胞について選択した。
培養を10%のFCS中で172の濃度まで増殖させ、
そして血清なしの培地に変えた。培養プレートに、全て
ではないがほとんどの細胞が死ぬまで血清なしの培地を
加え、その後、生き残っている細胞の***ができるよう
に、10%FC5を含む培地を加えた。生き残った細胞
をひろい、再びプレートにまき、1日間10%のFCS
で培養した後、血清なしの培地に再び変えた。2週間生
き残った細胞を、10%のFCSを含む培地を加えて増
殖させ。
そして血清なしの培地に変えた。培養プレートに、全て
ではないがほとんどの細胞が死ぬまで血清なしの培地を
加え、その後、生き残っている細胞の***ができるよう
に、10%FC5を含む培地を加えた。生き残った細胞
をひろい、再びプレートにまき、1日間10%のFCS
で培養した後、血清なしの培地に再び変えた。2週間生
き残った細胞を、10%のFCSを含む培地を加えて増
殖させ。
限界の希釈度でクローン化し、上記のように誘導仲介物
質として亜鉛イオンおよび鉄を用いて誘導させた後、レ
ニン生産を検定した。
質として亜鉛イオンおよび鉄を用いて誘導させた後、レ
ニン生産を検定した。
(以下余白)
レニンlft 生産レベル
凍結培地1 mj2に〜1.OX 107細胞を含んで
いる貯蔵細胞の1ガラス瓶を37℃で、攪拌することに
よって、すばやく解凍する。細胞を均等に分けて、各々
10m!!ずつの完全培地を含む100u+の組織培養
皿2枚にまいた(完全培地は、コーンF−12と、4.
5■7mlのグルコースを含むダルベツコ、変更イーグ
ル培地(DMEM21)の、1:1混合に10%牛脂児
血清を含んでいる)。50ユニット/meのペニシリン
、50μg7mlのストレプトマイシン、あるいは40
0μg7m!!のG418.から成る抗生物質を必要に
応じて加えてもよい。2週間よりも古い貯蔵培地には、
2mMのグルタミンを添加する。解凍した細胞は、細胞
が付着してしまうまで(〜30分間)5%CO□恒温器
で37℃で保温した。培地を吸い出し、細胞に新鮮な完
全培地を再び加える。
いる貯蔵細胞の1ガラス瓶を37℃で、攪拌することに
よって、すばやく解凍する。細胞を均等に分けて、各々
10m!!ずつの完全培地を含む100u+の組織培養
皿2枚にまいた(完全培地は、コーンF−12と、4.
5■7mlのグルコースを含むダルベツコ、変更イーグ
ル培地(DMEM21)の、1:1混合に10%牛脂児
血清を含んでいる)。50ユニット/meのペニシリン
、50μg7mlのストレプトマイシン、あるいは40
0μg7m!!のG418.から成る抗生物質を必要に
応じて加えてもよい。2週間よりも古い貯蔵培地には、
2mMのグルタミンを添加する。解凍した細胞は、細胞
が付着してしまうまで(〜30分間)5%CO□恒温器
で37℃で保温した。培地を吸い出し、細胞に新鮮な完
全培地を再び加える。
細胞をある程度まで増殖させ、標準的な方法によってト
リプシンで処理して拡張させる。必要な場合は、細胞を
10より高り40より低い希釈で処理する。長期間保存
するために拡張した貯蔵細胞は。
リプシンで処理して拡張させる。必要な場合は、細胞を
10より高り40より低い希釈で処理する。長期間保存
するために拡張した貯蔵細胞は。
標準的な方法に従って凍結させる。
850 cdの回転瓶に、ある濃度のT−150フラス
コ(〜4X10’細胞)からの細胞をまくコーニング製
回転瓶が好ましい。細胞は、標準的な方法によりトリプ
シンで処理し、 10mMヘペス(pH7,2)を加え
た完全培地20011 Aにまく。細胞は、1回転につ
き〜6〜7分間で回転する回転ラックで37℃の部屋で
ある程度まで増殖させる。
コ(〜4X10’細胞)からの細胞をまくコーニング製
回転瓶が好ましい。細胞は、標準的な方法によりトリプ
シンで処理し、 10mMヘペス(pH7,2)を加え
た完全培地20011 Aにまく。細胞は、1回転につ
き〜6〜7分間で回転する回転ラックで37℃の部屋で
ある程度まで増殖させる。
CBI−285によってレニン生産を増加させるための
無血清誘導培地(SFIM)は、以下のものから成る。
無血清誘導培地(SFIM)は、以下のものから成る。
10mMヘペス(pH7,2) (I M貯蔵ヘペスは
、殺菌するために0.20のフィルターを通して濾過し
、4℃で保存する) 、 3 Xl0−’M Fe
504(100OX貯蔵硫酸鉄は、水で調製し、ただち
にフィルター殺菌をし、 1.5mA’ずつ細胞凍結瓶
に分けて、−80℃で保存する) 、 5 Xl0−
’M Zn5Oa(2000X貯蔵液は。
、殺菌するために0.20のフィルターを通して濾過し
、4℃で保存する) 、 3 Xl0−’M Fe
504(100OX貯蔵硫酸鉄は、水で調製し、ただち
にフィルター殺菌をし、 1.5mA’ずつ細胞凍結瓶
に分けて、−80℃で保存する) 、 5 Xl0−
’M Zn5Oa(2000X貯蔵液は。
水で調製し、フィルター殺菌をし、小分けして°4℃で
保存する) 、 10−’Mデキサメタシン(1000
x貯蔵液は、100%エタノールで調製し、4℃で保存
する)、ターンのF12/DMEM21 (1: 1
) 、必要に応じてグルタミンを、要求に応じて抗生物
質を加える。
保存する) 、 10−’Mデキサメタシン(1000
x貯蔵液は、100%エタノールで調製し、4℃で保存
する)、ターンのF12/DMEM21 (1: 1
) 、必要に応じてグルタミンを、要求に応じて抗生物
質を加える。
細胞は、以下のようにして、無血清培地に移す。
完全培地を回転瓶から吸い出し、 200m I DM
EM21を加える。瓶を10分間回転ラックに戻した後
、培地を吸い出して100〜200m l SFIMを
再び加える。
EM21を加える。瓶を10分間回転ラックに戻した後
、培地を吸い出して100〜200m l SFIMを
再び加える。
細胞によって培地の組成が、ブラッドフォード分析法で
測定した場合〜100mcg/m 1総タンパク質の分
泌タンパク質になった時に、培地を再び加える(回転を
はじめた初期では、 CRI−285において100I
litあたり約2日間であるが、細胞によって培地がそ
の状態となるのに必要な時間は、培地の変換以後の時間
と共に減少しうる)。−非常にゆるやかに、培地を吸い
出すか、あるいはピペットで取り除き(細胞は、やがて
瓶に非常にゆるく付着するようになる)、そして、
100〜200m j2 SFIMを加え直すことによ
り、培地を再び加える。
測定した場合〜100mcg/m 1総タンパク質の分
泌タンパク質になった時に、培地を再び加える(回転を
はじめた初期では、 CRI−285において100I
litあたり約2日間であるが、細胞によって培地がそ
の状態となるのに必要な時間は、培地の変換以後の時間
と共に減少しうる)。−非常にゆるやかに、培地を吸い
出すか、あるいはピペットで取り除き(細胞は、やがて
瓶に非常にゆるく付着するようになる)、そして、
100〜200m j2 SFIMを加え直すことによ
り、培地を再び加える。
CBI−AA2と称するC1(0形質転換細胞を、10
mfの完全培地(50U/mA ヘニシ’) 7.50
.czg/ ml ストレプトマイシン、あるいは40
0μg/+aj!G418を含んだF12/DMEM2
1の10%FC5”)を含む100鶴組織培養皿で1回
転瓶培養増殖用に調製した。細胞が付着するまで増殖さ
せ(30分間)、培地を回収し。
mfの完全培地(50U/mA ヘニシ’) 7.50
.czg/ ml ストレプトマイシン、あるいは40
0μg/+aj!G418を含んだF12/DMEM2
1の10%FC5”)を含む100鶴組織培養皿で1回
転瓶培養増殖用に調製した。細胞が付着するまで増殖さ
せ(30分間)、培地を回収し。
細胞に新鮮な完全培地を再び加える。゛細胞は、ある程
度まで増殖させ8拡張するための標準的な方法を用いて
トリプシンによって処理した。850cmノ四角回転瓶
ニ、 10mMべべ、2. (pH7,2)を加えた2
00m1完全培地のある濃度のフラスコ(4X10’細
胞)からの細胞をまいた。その細胞をある程度まで37
℃で回転して増殖させた。
度まで増殖させ8拡張するための標準的な方法を用いて
トリプシンによって処理した。850cmノ四角回転瓶
ニ、 10mMべべ、2. (pH7,2)を加えた2
00m1完全培地のある濃度のフラスコ(4X10’細
胞)からの細胞をまいた。その細胞をある程度まで37
℃で回転して増殖させた。
無血清培地でレニンの生産を誘導するために。
完全培地を回転瓶から吸い取り、そして細胞を200m
f DMEM21で洗浄した。それから細胞に約10
0〜200m Il無血清誘導培地(SFIM)を加え
た。SFIM&:II:。
f DMEM21で洗浄した。それから細胞に約10
0〜200m Il無血清誘導培地(SFIM)を加え
た。SFIM&:II:。
IIwMヘペスを含んだF12/口MEM21(1:
1)、 3 Xl0−’MFe”Oa r 5 X
l0−’M Zn5Oa 、および10−’Mデキサメ
タシンからなる。細胞は1分泌タンパク質の量によって
決められた周期で1例えば、ブラッドフォード分析法に
よって決定した場合では、約100μg7mlの総タン
パク質が分泌された時に、 SFIMを再び加える。一
般的に、このレベルの総タンパク質生産量は、約2日間
で生じる。CBI−AA2は。
1)、 3 Xl0−’MFe”Oa r 5 X
l0−’M Zn5Oa 、および10−’Mデキサメ
タシンからなる。細胞は1分泌タンパク質の量によって
決められた周期で1例えば、ブラッドフォード分析法に
よって決定した場合では、約100μg7mlの総タン
パク質が分泌された時に、 SFIMを再び加える。一
般的に、このレベルの総タンパク質生産量は、約2日間
で生じる。CBI−AA2は。
111g/1ml!7日あるいは約0.5μg7ml1
口のレニン生産レベルを示した。
口のレニン生産レベルを示した。
上玉ヱ■簾l
レニンを、疎水性相互作用クロマトグラフィー。
ペプスタチンアフィニティークロマトグラフィー。
および陰イオン交換クロマトグラフィーを連続的に適用
することによって、無血清CHO細胞上澄液から精製し
た。
することによって、無血清CHO細胞上澄液から精製し
た。
…虹
特別に、 1.5M NaC1をC110上澄液に加え
、そして室温でゆるやかに振とうすることにより溶解し
た。その溶液を、ペリスタルチックポンプ付きのザルト
リウス限外濾過装置を使用し、8μmプレフィルタ−(
ザルトリウス サルトピュアーカプセル)および0.4
5μmフィルター(ザルトリウス硝酸セルロース)を通
して濾過した。そのフィルターは、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー(IIIC)の用意ができるまで4℃で
保存した。各々のHIC操作において、 0.02%の
アジ化ナトリウムを加えた濾過済上澄液を41用いた。
、そして室温でゆるやかに振とうすることにより溶解し
た。その溶液を、ペリスタルチックポンプ付きのザルト
リウス限外濾過装置を使用し、8μmプレフィルタ−(
ザルトリウス サルトピュアーカプセル)および0.4
5μmフィルター(ザルトリウス硝酸セルロース)を通
して濾過した。そのフィルターは、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー(IIIC)の用意ができるまで4℃で
保存した。各々のHIC操作において、 0.02%の
アジ化ナトリウムを加えた濾過済上澄液を41用いた。
使用したカラムは。
7 エニJL/ 5 PW調製用HPLCカラム(7,
5X 2.1cm、東洋ソーダ株式会社製9日本)で、
LCC−500クロマトグラフイ一調節器で調節され
る2つのP−500FPLCを含むファルマシアFPL
Cクロマトグラフィーシステム中に装備した。1.5M
NaC1と50mM Tris−CIを含むA緩衝液
(pH8,0)で平衡化後、試料を6ml/分の流速で
直接カラムに注入した。溶出液の吸光度は、ファルマシ
アUV−1吸光度検出器を用いて280mmで測定し、
ポンプAの溶媒切り換えはモーター弁MV−8で行なっ
た。上澄液1.51を充填し、A緩衝液でカラムを再平
衡化後、結合しているタンパク質を減少塩勾配、すなわ
ち95% B緩衝液(50mM Tris−CI、
pH8,0) ヘの15分間直線勾配に次いで100%
Bへの15分間直線勾配、によって溶出させた。プロレ
ニンを含む分画(トリプシンにより活性化可能なレニン
活性によって判定する)を集め、別の上澄液1.51を
充填した。
5X 2.1cm、東洋ソーダ株式会社製9日本)で、
LCC−500クロマトグラフイ一調節器で調節され
る2つのP−500FPLCを含むファルマシアFPL
Cクロマトグラフィーシステム中に装備した。1.5M
NaC1と50mM Tris−CIを含むA緩衝液
(pH8,0)で平衡化後、試料を6ml/分の流速で
直接カラムに注入した。溶出液の吸光度は、ファルマシ
アUV−1吸光度検出器を用いて280mmで測定し、
ポンプAの溶媒切り換えはモーター弁MV−8で行なっ
た。上澄液1.51を充填し、A緩衝液でカラムを再平
衡化後、結合しているタンパク質を減少塩勾配、すなわ
ち95% B緩衝液(50mM Tris−CI、
pH8,0) ヘの15分間直線勾配に次いで100%
Bへの15分間直線勾配、によって溶出させた。プロレ
ニンを含む分画(トリプシンにより活性化可能なレニン
活性によって判定する)を集め、別の上澄液1.51を
充填した。
ペプスタチン カラム
1(ICから集めた分画を、セファローズ4Bビーズに
接合したトリプシン(結合手順は、ファルマシア文献の
概説に従い、ベーリンガーマンハイムの約20■/1m
lトリプシンを用いた)を加えることによって、プロレ
ニンからレニンにトリプシン活性化した。ビーズを取り
除くために遠心分離した後。
接合したトリプシン(結合手順は、ファルマシア文献の
概説に従い、ベーリンガーマンハイムの約20■/1m
lトリプシンを用いた)を加えることによって、プロレ
ニンからレニンにトリプシン活性化した。ビーズを取り
除くために遠心分離した後。
レニン溶液を、 20mM酢酸ナトリウム(pH5,7
) (充填緩衝液)で透析し、そして、生じたあらゆる
沈澱を2回目の遠心分離で取り除いた。この試料(41
HICの2回の操作からの500m l )を、充填緩
衝液で平衡化した40++ j!ペプスタチンカラム(
カラムは、 Murakami、 k、 et al
Brochem Bro h 5Res Caras+
(1975)62ニア57−763の毛順によって調製
し、担体としてアミノへキシル セファロースを用いた
)に(約1ml/分で)充填した。カラムをI M N
aC1を含む充填緩衝液で洗浄し1次に充填緩衝液のみ
で洗浄した後、レニンを0.IN酢酸で。
) (充填緩衝液)で透析し、そして、生じたあらゆる
沈澱を2回目の遠心分離で取り除いた。この試料(41
HICの2回の操作からの500m l )を、充填緩
衝液で平衡化した40++ j!ペプスタチンカラム(
カラムは、 Murakami、 k、 et al
Brochem Bro h 5Res Caras+
(1975)62ニア57−763の毛順によって調製
し、担体としてアミノへキシル セファロースを用いた
)に(約1ml/分で)充填した。カラムをI M N
aC1を含む充填緩衝液で洗浄し1次に充填緩衝液のみ
で洗浄した後、レニンを0.IN酢酸で。
中性化に必要な量の2M Tris−CI (pH8,
0)を含む管の中に直接溶出させた。
0)を含む管の中に直接溶出させた。
賂Δ」じこえ艮
ペプスタチンカラムからの溶出物を、保護のためのブロ
ンリー ニューガードIIPLcガードホルダーの陰イ
オンカートリッジ、および分析カラムとしてのDEAE
5PW(7,5Xo、75cm、東洋ソーダ株式会社製
)、を用いてイオン交換HPLCによってさらに精製し
た。11 P L C装置は、421調節器装備の2つ
のベックマン/アルチフス110A ポンチ、エルデ
ソクスポンプ検出器、および280mmにセットしキッ
プとゾーネンBD 40チヤート記録計につないだタラ
トス スペクトロフロ−757可変波長吸光度検出器か
ら成っていた。1.00mM )リエチルアンモニウム
アセテート(p)17.0)で平衡化後、試料(4回の
ベブスクチン操作からの約100ts l )を1 m
127分でカラムにポンプ注入した。280mmの吸光
を示す通過物質を集めたところ、それは比活性400〜
900ゴ一ルドプラント単位/■の実質的に純粋な活性
レニンを含んでいた。
ンリー ニューガードIIPLcガードホルダーの陰イ
オンカートリッジ、および分析カラムとしてのDEAE
5PW(7,5Xo、75cm、東洋ソーダ株式会社製
)、を用いてイオン交換HPLCによってさらに精製し
た。11 P L C装置は、421調節器装備の2つ
のベックマン/アルチフス110A ポンチ、エルデ
ソクスポンプ検出器、および280mmにセットしキッ
プとゾーネンBD 40チヤート記録計につないだタラ
トス スペクトロフロ−757可変波長吸光度検出器か
ら成っていた。1.00mM )リエチルアンモニウム
アセテート(p)17.0)で平衡化後、試料(4回の
ベブスクチン操作からの約100ts l )を1 m
127分でカラムにポンプ注入した。280mmの吸光
を示す通過物質を集めたところ、それは比活性400〜
900ゴ一ルドプラント単位/■の実質的に純粋な活性
レニンを含んでいた。
1旦y三/■猜l
■ICカラムを通す間にプロレニンはレニンに実質的に
活性化されるために、プロレニンの精製において、 l
lIC工程を用いずにCll0上澄液を使用した。精製
の手順は、ペプスタチアフィニティー。
活性化されるために、プロレニンの精製において、 l
lIC工程を用いずにCll0上澄液を使用した。精製
の手順は、ペプスタチアフィニティー。
分子量篩い、イオン交換クロマトグラフィーを用いる。
不活性レニンはレニン阻害剤に結合することができない
ので、ペプスタチンに充填する前に酸によって上澄液を
活性化する。pH3,3の溶液になるまで、上澄液の攪
拌溶液に1Mグリシン(pH3,3)を4℃で18時間
滴下して加える。この活性化プロレニンを、 2On+
M酢酸ナトリウム(pH5,7)で前もって平衡化した
ペプスタチンカラムに充填する。開始緩衝液、緩衝液+
IMNaC+、次いで緩衝液だけで、連続的に洗浄した
後、プロレニンを0.1M酢酸で溶出させる。プロレニ
ンを含むものを集めた分画を真空下で乾燥し、少量の1
00mM )リエチルアンモニウムアセテート(pH
7,0)で再懸濁する。
ので、ペプスタチンに充填する前に酸によって上澄液を
活性化する。pH3,3の溶液になるまで、上澄液の攪
拌溶液に1Mグリシン(pH3,3)を4℃で18時間
滴下して加える。この活性化プロレニンを、 2On+
M酢酸ナトリウム(pH5,7)で前もって平衡化した
ペプスタチンカラムに充填する。開始緩衝液、緩衝液+
IMNaC+、次いで緩衝液だけで、連続的に洗浄した
後、プロレニンを0.1M酢酸で溶出させる。プロレニ
ンを含むものを集めた分画を真空下で乾燥し、少量の1
00mM )リエチルアンモニウムアセテート(pH
7,0)で再懸濁する。
その分画は高分子量と低分子量の両不純物を含むので、
前のプロレニン精製物からこれらの不純物を取り除くこ
とが示されているHPLCクロマトグラフィーが次の2
つの段階に含まれる。最初に、上記緩衝液中でのTSK
4000 SWカラム(東洋ソーダ株式会社製)による
分子量篩いクロマトグラフィー、次に、 I M T
ris−C1(pH7,0)を加え(最終濃度を0.1
M Trisにする)、そして活性レニンに対して上に
述べたように口EAEクロマトグラフィーを行う。この
カラムの流出分画は純粋なプロレニンを含んでいるはず
である。
前のプロレニン精製物からこれらの不純物を取り除くこ
とが示されているHPLCクロマトグラフィーが次の2
つの段階に含まれる。最初に、上記緩衝液中でのTSK
4000 SWカラム(東洋ソーダ株式会社製)による
分子量篩いクロマトグラフィー、次に、 I M T
ris−C1(pH7,0)を加え(最終濃度を0.1
M Trisにする)、そして活性レニンに対して上に
述べたように口EAEクロマトグラフィーを行う。この
カラムの流出分画は純粋なプロレニンを含んでいるはず
である。
−5° でのレニンとプロレニンの主則
細菌での発現のために、 pLF5あるいはpAA6を
用いてE、coli MC1061菌体をAmp’に形
質転換し。
用いてE、coli MC1061菌体をAmp’に形
質転換し。
そして形質転換した細胞を1mMIPTGを含む旧培地
で3〜5時間、 00が0.2〜0.5になるまで増殖
させた。(IPTGは、 Iacオペレータによって制
御される制御配列に対する標準的な誘導物質である。)
それから、細胞を35S−メチオニンでパルスラベルし
、集菌し、超音波または5%のトリクロロ酢酸処理によ
り溶菌させ、細胞抽出液について。
で3〜5時間、 00が0.2〜0.5になるまで増殖
させた。(IPTGは、 Iacオペレータによって制
御される制御配列に対する標準的な誘導物質である。)
それから、細胞を35S−メチオニンでパルスラベルし
、集菌し、超音波または5%のトリクロロ酢酸処理によ
り溶菌させ、細胞抽出液について。
SDSゲル電気泳動により、目的のタンパク質の分析を
行なった。
行なった。
抽出液は、抗レニン抗体あるいは抗“プロ”抗体で処理
し、そしてその免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にかけ
た。pAA6で形質転換した細胞では。
し、そしてその免疫沈澱物をSDSゲル電気泳動にかけ
た。pAA6で形質転換した細胞では。
ゲル上でプロレニンの正確な分子量に相当する位置に移
動する。抗“プロ”抗体との免疫沈澱物が生じた。pL
F5で形質転換した細胞では生じなかった。pLF5と
pAA6からのどちらの抽出物も、抗レニン抗体で免疫
沈澱するタンパク質は生じなかった。
動する。抗“プロ”抗体との免疫沈澱物が生じた。pL
F5で形質転換した細胞では生じなかった。pLF5と
pAA6からのどちらの抽出物も、抗レニン抗体で免疫
沈澱するタンパク質は生じなかった。
このように沈澱しなかったのは、使用した抗レニン抗体
の立体的依存性によるものであると考えられる。
の立体的依存性によるものであると考えられる。
上記の結果は、概要的に第5図に示しである。
レーン1.3.5と6はそれぞれpKT52 、 pA
A6゜pLF5とpKT52でE、coliに形質転換
したものからの5%TCA沈澱総タンパク質を表してい
る。レーン3には約42kDの分子量のバンド、レーン
5には約37kDの分子量のバンド、というレーン1と
6には見られないバンドが存在するのが明白に見られる
。
A6゜pLF5とpKT52でE、coliに形質転換
したものからの5%TCA沈澱総タンパク質を表してい
る。レーン3には約42kDの分子量のバンド、レーン
5には約37kDの分子量のバンド、というレーン1と
6には見られないバンドが存在するのが明白に見られる
。
レーン2と4は、それぞれρKT52とpa^6を保持
する細胞の抽出液から抗プロ抗体で免疫沈澱したものを
流したゲルである。pAA6で形質転換した細菌からの
免疫沈澱タンパク質は、全抽出物中のプロレニンと推定
されるバンドと同じ分子量に相当する移動度である。
する細胞の抽出液から抗プロ抗体で免疫沈澱したものを
流したゲルである。pAA6で形質転換した細菌からの
免疫沈澱タンパク質は、全抽出物中のプロレニンと推定
されるバンドと同じ分子量に相当する移動度である。
上記で示した37kDに相当するタンパク質は、遠心分
画と調製用ゲル電気泳動によってpLI’5を含む細菌
から精製し、溶出し、その結果回収されたタンパク質を
N末端配列決定に用いた。このようにして得られたタン
パク質のN末端配列は+ Met−1eu−thr−1
eu−gly−asn−thr−thrで、それはMe
t−レニンの正確なN末端配列に対応する。
画と調製用ゲル電気泳動によってpLI’5を含む細菌
から精製し、溶出し、その結果回収されたタンパク質を
N末端配列決定に用いた。このようにして得られたタン
パク質のN末端配列は+ Met−1eu−thr−1
eu−gly−asn−thr−thrで、それはMe
t−レニンの正確なN末端配列に対応する。
(発明の概要)
組換えレニン、組換えプロレニン、および組換えプレプ
ロレニンの生産を行う発現ベクターと方法を開示する。
ロレニンの生産を行う発現ベクターと方法を開示する。
このようにして、高血圧のような過剰なレニンレベルに
より起こる疾患の治療に有用な薬剤を供するに充分な量
が、得られる。細胞上澄液からのレニンおよびプロレニ
ンの精製、および成熟レニン分泌の増加の方法もまた開
示される。
より起こる疾患の治療に有用な薬剤を供するに充分な量
が、得られる。細胞上澄液からのレニンおよびプロレニ
ンの精製、および成熟レニン分泌の増加の方法もまた開
示される。
4、 文 の ゛なi゛■
第1図はプレプロレニンをコードするDNAの全塩基配
列、それに沿って導かれたアミノ酸配列を示す。
列、それに沿って導かれたアミノ酸配列を示す。
第2図はプレプロレニンをコードし、そして哺乳動物細
胞培養からプロレニンの分泌をもたらす。
胞培養からプロレニンの分泌をもたらす。
発現ベクターの構築を示す。
第3図aとbはレニン関連タンパク質についての細菌発
現ベクターの構築を示す。
現ベクターの構築を示す。
第4図はレニンをコードするプラスミドで形質転換され
、そして35S−メチオニン存在下で生育したC]10
細胞の上澄液中の免疫沈澱したタンパク質の5DS−ポ
リアクリルアミドゲルを示す。
、そして35S−メチオニン存在下で生育したC]10
細胞の上澄液中の免疫沈澱したタンパク質の5DS−ポ
リアクリルアミドゲルを示す。
第5図はレニンをコードするベクターで形質転換された
エセリシア・コリーから抽出され3S3−メチオニンで
ラベルされたタンパク質の5OS−ポリアクリルアミド
ゲルを示す。
エセリシア・コリーから抽出され3S3−メチオニンで
ラベルされたタンパク質の5OS−ポリアクリルアミド
ゲルを示す。
第6図は抗レニンで免疫沈澱した。 ALT−20細胞
の培地の385−メチオニンでラベルされたタンパク質
の5O5−ポリアクリルアミドゲルを示す。
の培地の385−メチオニンでラベルされたタンパク質
の5O5−ポリアクリルアミドゲルを示す。
−ロ ロ 0600 ロ ロ
666611 = 寞 シ g ス ;
; ス S = =−= ヨ # ズ 巨
妄 ジ ジ ス 巨 ヨ6 (50el
O’ M N宕 g 8 。
Ng+4 。 −。
666611 = 寞 シ g ス ;
; ス S = =−= ヨ # ズ 巨
妄 ジ ジ ス 巨 ヨ6 (50el
O’ M N宕 g 8 。
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ミ ピ i 巨 i 奨 二 呂 」 当且、:嗜
FJG。5
ど・・−一−−−−−−−ノーーーーーーー−・・−・
・Nt2 3 4 5 6 □□□□□□ ”00” 200 =寸
寸 l11 +1 8 9 10 11 1213 14 151617
1SFIG、 6
・Nt2 3 4 5 6 □□□□□□ ”00” 200 =寸
寸 l11 +1 8 9 10 11 1213 14 151617
1SFIG、 6
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、ヒトレニン、ヒトプロレニン、またはヒトプレプロ
レニンをコードするDNA配列を含み、該ヒトレニン、
該ヒトプロレニン、または該ヒトプレプロレニンは組換
え宿主細胞と和合し得かつ該組換え宿主細胞内で該DN
A配列の表現を行い得る制御配列に作動可能に連接した
発現系。 2、前記制御配列が哺乳動物宿主細胞と和合しうる特許
請求の範囲第1項に記載の発現系。 3、前記制御配列が細菌宿主と和合しうる特許請求の範
囲第1項に記載の発現系。 4、レニン、プロレニン、またはプレプロレニンをコー
ドする組換えDNA配列で形質転換された組換え宿主細
胞。 5、前記組換えDNA配列がさらに、レニン、プロレニ
ン、またはプレプロレニンをコードするDNAに作動可
能に連接した制御配列を含む特許請求の範囲第4項に記
載の宿主細胞。 6、哺乳動物細胞である特許請求の範囲第4項に記載の
宿主細胞。 7、細菌細胞である特許請求の範囲第4項に記載の宿主
細胞。 8、ヒトレニンまたはヒトプロレニンの調製法であって
、レニン、プロレニン、またはプレプロレニンをコード
する組換えDNA配列で形質転換された組換え宿主細胞
を培養すること、および該培養物からレニンまたはプロ
レニンを回収すること、を含む調製法。 9、結晶組換えレニンの表面の一部の3次元表面輪郭を
相補する3次元表面輪郭を有し、レニン活性の阻害剤で
あるペプチド(2から15のアミノ酸残基)。 10、組換えにより生産され不純物を含まないヒトレニ
ンまたはヒトプロレニンを含む物質の組成物。 11、哺乳動物細胞を処理することを含む分泌培養成熟
組換えレニンを生産する方法であって、該細胞は制御さ
れた分泌系路をそのまま用い、プレプロレニンに対する
発現系を含むようにすでに修飾され、そしてプレプロレ
ニン遺伝子を分泌促進物質で発現させるようすでに誘導
されているものである方法。 12、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、
ペプスタチンクロマトグラフィーおよび陰イオン交換を
含む、細胞培養上澄からのレニン精製方法。 13、ペプスタチンクロマトグラフィー、分子量篩い、
および陰イオン交換を含む、細胞培養上澄からのプロレ
ニン精製方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71941485A | 1985-04-03 | 1985-04-03 | |
US719414 | 1985-04-03 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62282A true JPS62282A (ja) | 1987-01-06 |
Family
ID=24889982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61077502A Pending JPS62282A (ja) | 1985-04-03 | 1986-04-03 | 組換えヒトレニン |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0196921A3 (ja) |
JP (1) | JPS62282A (ja) |
KR (1) | KR860008282A (ja) |
AU (1) | AU5559786A (ja) |
DK (1) | DK152886A (ja) |
ES (1) | ES8800723A1 (ja) |
FI (1) | FI861428A (ja) |
GR (1) | GR860847B (ja) |
HU (1) | HUT40698A (ja) |
IL (1) | IL78314A0 (ja) |
NO (1) | NO861302L (ja) |
PT (1) | PT82311B (ja) |
ZA (1) | ZA862479B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03175994A (ja) * | 1989-07-13 | 1991-07-31 | Merck & Co Inc | 治療上活性のある組換え体酸性繊維芽細胞成長因子の精製方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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DE3438545A1 (de) * | 1984-10-20 | 1986-04-24 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Peptide |
EP0258401A4 (en) * | 1986-02-20 | 1989-06-13 | California Biotechnology Inc | EUKARYOTIC EXPRESSION OF STEROID RECEPTOR PROTEINS. |
GB2200118A (en) * | 1987-01-23 | 1988-07-27 | Allelix Inc | Synthetic chymosin-and prochymosin-encoding DNA segments |
DE4136443A1 (de) * | 1991-11-06 | 1993-05-13 | Boehringer Ingelheim Int | Expression der reifen proteinase 2a, ihre partielle reinigung und bereitstellung kompetitiv wirkender substrate |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0783715B1 (ja) * | 1981-11-23 | 1995-09-13 | ||
JPH0683670B2 (ja) * | 1983-08-12 | 1994-10-26 | 第一製薬株式会社 | デオキシリボ核酸 |
EP0161866B1 (en) * | 1984-05-03 | 1992-07-01 | Kazuo Murakami | Human renin genomic dna |
ATE89314T1 (de) * | 1985-02-13 | 1993-05-15 | Scios Nova Inc | Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen. |
-
1986
- 1986-03-28 IL IL78314A patent/IL78314A0/xx unknown
- 1986-03-31 GR GR860847A patent/GR860847B/el unknown
- 1986-04-01 PT PT82311A patent/PT82311B/pt unknown
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