JPS6291187A - ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコードしているｄｎａを発現し得る組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト血清及び／又はヒト組織中に見い出され
るものに相当Ｊるヒ１−プラスミノーゲン話性化因子及
びその新規な形態、並びに該活性化因子を含有する組成
物、並びに特に均質な該活性化因子を治療に適用する上
で意義のあるｍで製造りるための手段及び方法に係る。

本発明は、ヒトプラスミノーゲン活性化因子をコードし
ているＤＮＡ配列及びそれからＪｆｔ定される該活性化
因子のアミノ酸配列を知見したことに部分的に起因する
ものである。この知見に基づき、１１１％　Ｄ　Ｎ　Ａ
技術を適用してヒトプラスミノーゲン活性化因子を製造
することが可能になり、しかも（−大Ｖ：′余日） この製造方法にＪ：ると、現存Ｊる細胞培養物に於（プ
る産生及び該細胞１８養物からの単離という工程を含む
従来のｊｌｌ−１１１Ｆ方法に固有のある秤の制約を受
けることがなく、更に、市場認可に先立って必要どされ
る動物実験及び臨床試験に着手し且つこれを遂行するに
充分な質及び位で該活性化因子を製造することが可能に
なったのである。

本発明は、あらゆる点で、これらの関連する具体例に係
る。

本発明の詳細な説明し且つある場合にはその実施のため
の詳細を補うために使用する文献及びその他の資料は、
水明ｍ出中参照Ｍ９を付して引用し、更に便宜のため本
明細書末尾に参考文献として列挙する。

Ａ、ヒトｌブラスミノーノ５ン　性　　−線維素溶解系
は凝固系と動的平衡状態にあり、自然な開放性血管床を
維持する。凝固系は線維前をマトリックスとして沈着さ
せ、これにより止血状態を回復する。線維素溶解系は、
止血状態が達成された後、線維青用を除去する。この線
維前溶解過程は、血漿タンパク前駆体であるプラスミノ
ーゲンから生ずるタンパク分解酵素、プラスミンによっ
てもたらされる。プラスミノーゲンは活性化剤によって
活性化されてプラスミンに変換される。現在、２種の活
性化剤、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼが市販さ
れている。この両者の効能は、急性血管病例えば心筋梗
塞、脳卒中、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞
症及びその他の静脈血栓症の治療とされている。総じて
、これらの病気は重大な健康上の危険の要因となる。

これらの疾病の１１を末的原因は、訝血塊（血栓又は血
栓塞栓）による血管の部分的又は重度の場合には全体的
閉塞にある。例えばヘパリン及びクマリンを用いるよう
な従来の凝固防止療法では、血栓又は血栓塞栓の溶解を
直接には何ら促進しない。

上述した血栓溶解剤即ちストレプトキナーゼ及びウロキ
ナーゼは実際に有効に使用されてきている。

黙しながら今日まで、これらの薬剤には夫々厳しい限界
があった。さらに、これらの薬剤は線維前に対する高度
の親和性も有していない。従って、これらの薬剤は、循
環しているプラスミノーゲン及び線維前に結合している
プラスミノーゲンを比較的無差別に活性化する。循環血
液中で形成したプラスミンは、比較的急速に中和され、
有効な血栓溶解能を失う。残留するプラスミンは、数種
の血液凝固因子タンパク例えばフィブリノーゲン、第Ｖ
因子及び第■囚子を分解して出血の可能性をもたらす。

さらに、ストレプトキナーゼは張度に抗原性であり、高
抗体力価を有する患者は治療に対し効果を示さず又継続
して投与することもてきない。ウロキナーゼににる治療
法は、該ウロキナーゼの製造工程が人間の尿又は組織培
養物から単＃Ｉ　ｇ’る工程を含むため高価であり、従
って一般に臨床的実用性に劣る。このような状況下で、
ウロキナーゼは多くの研究の主題であった（例えば文献
１乃至６参照）。

いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は種々のヒト組織
例えば子宮組織、血液、血清（文献１乃至１１参照ン並
びに細胞培差物（文献９４参照）から単離されていた。

これらの組成及び／又はこれらをＳｎする組成物につい
ては文′ｌｌＸ１２及び１３に記載されている（文献１
４乃至１８参照）。これらの起源を右するプラスミノー
ゲン活性化因子は、それらの免疫学的特性の差違に基づ
いて２つの主なグループ、即ちウロキナーゼ型プラスミ
ノーゲン話性化囚子（ｕ−ＰＡ）及び組織型プラスミノ
ーゲンｈＳ性化囚子＜ｔ−ＰＡ）に分類される。（略号
ｔ−ＰＡ及びｕ−１〕Δは、ＸＸ■　Ｍｅａｔｉｎｏ　
ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉ　ｒｌ−ｔｃｒｎａｔｉｏｎａｌ　　
Ｃ０ｎ１ｍ１ｔｔＱｅ　Ｏｎ　　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ
　ａｎｄｌ−１ｃｍｏｓｔａｓｉｓ、　　Ｂｃｒｇａｍ
ｏ、　　ｌ　ｔａｌｙ、　　２７　　Ｊｕｌｙ１９８２
に於いて提唱されたちのひある。）近イ［、・ヒ１−メ
ラノーマ（黒色腫）セルライン（１０胞株）がｔ−ＰＡ
を分泌づること、が確認された。

このメラノーマ由来プラスミノーゲン活性化囚子は、免
疫学的に及びアミノ酸組成に於いて、正常。

ヒト組織から１１１　＃ｔされたプラスミノーゲン活性
化因子と区別し得ない特性を有ツ゛ることが示されてい
る（文献１９及び８８参照）。

比較的純粋な形態で単離されたこの物質の特性を検討し
た結果、高い活性を有する線１１ｆ素溶解因子であるこ
とが知見されたく文献２０参照）。

メラノーマレルラインから精製したｔ−１）Ａを使用し
て行なわれたいくつかの研究の結果、ｔ−１）Ａがウロ
ートナーゼ型プラスミノーゲン活性化囚子に比較してＦ
Ｉｌ維索に対しでより高い親和力を有することが示され
たく例えば文献９５乃至９８参照）。然しながら、ｔ−
ｐΔは血液、組織抽出物、血管潅流液及び細胞ｊＦ’ｔ
　ａ物中に非常に低温度でしか存在しｔｒいため、ヒ１
−ｔ−ＰΔの血栓溶解剤としての可能性を更に深く研究
することは困難であった。

ヒ１〜山来の伯のタンパクを実質的に含まない高品質の
ヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子（これは初期に
はヒトプラスミノーゲン活性化因子と呼ばれていた）を
必要充分なｍｒ”ａ造するために最も有効な方法は、組
換ＤＮＡ技術及びそれに関連ザる技術の適用であろうと
いうことは既に考えられていたことである。このような
物質が得られれば、それは恐らく種々の心血管障害又は
心血管病の治療に対して臨床応用できるＪ、うな生物活
性を示すであろう。

充分量のヒトｔ−ＰＡが細胞培養に於いて産生されるが
、第二のコード配列を用いて更に改良することにより産
生レベルを更に向上することが可能である。この第二の
コード配列はジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄ　Ｉ−（Ｆ　Ｒ
）を含み、Ｉ）　ｌ−Ｉ　Ｆ　Ｒは外部制御パラメータ
ー例えばメ１〜トレキセート（ｍａｔハ〇−ｔｒｃｘａ
ｔａ、　　Ｍ　’ｌ−Ｘ　）の作用を受け、従って、Ｍ
　Ｔ　Ｘ潤度の調整によって発現を制ｉｌｌ　Ｌ　ｌ！
７る。

Ｂ０組組換）ＮＡ技術 組換ＤＮＡ技術は、かなり？！２雑な応用の段階に達し
ている。分子生物学者は、種々のＤＮＡ配列をかなり容
易に組１ｇ！え、形質転換された微生物又は細胞中で大
宿の外来タンパク産物を産生し得る新たなりＮＡ体を作
成し得る。種々の平滑末端又は粘着末端を右するＤＮＡ
断片をｉｎ　ｖｉｔｒｏ結合し、特定生物を形質１転換
するのに石川な発現ベクターを作成し、かくして所望の
外来性産物の効率的な合成を行＜Ｋうだめの一般的手段
及び方法は、既に開発されてＪ３り自由に使用Ｊ゛るこ
とができる。然しながら、個々の産物については、その
製造工程はまだ若干複’ｄｔであり、常に成功を予測し
得る段階にＪ：では和学は進歩していない。事実、実験
的男付りをＬずに成功結果を予告する者もいるが、この
ような予Ｓには実施不能という著しい危険が伴っている
。

基本的要素、即ち複製のオリジン、１種又はそ・・れ以
上の表現型選択特性、発現プロモーター、異種遺伝子イ
ンサート及び残りのベクターのＤＮＡ組換は、一般に宿
主細胞の外部で行なわれる。得られる？！Ｊ製可能な組
換発現ベクター″すなわちプラスミドを形質転換により
細胞中へ導入し、１げられる形質転換体を増殖させるこ
とにより大ｋＵの組換ベクターを得ることができる。コ
ードされているＯＮ△メツセージの転写および翻訳を支
配する部分に対して遺伝子が適切に挿入されていれば、
得られた発現ベクターを使用して挿入遺伝子がコードし
ているポリペプチド配列を実際に産生ずることがひき、
この、過程を発現と呼ぶ。微生物系で必要に応じて宿主
細胞を溶菌し、旦つ適当な方法により他のタンパクから
精製して目的産物を回収することができる。

実際、組４１Ｊｒ　Ｄ　ＮＡ技術を用いることにより、
全く異種のポリペプチドを発現させることができ（いわ
ゆる直接的発現）、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸
配列の一部と融合した異種ポリペプチドを発現させるこ
ともできる。後者の場合、目的とする生物活性産物は、
しばしば、細胞外環境に於いて開裂されるまで、融合し
た同種／異種ポリペプチド中で生物的に不活性の形態で
存在する（文献２１及び２２Ｂ照）。

同様に、遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培
！（セル力ルヂャー）又は組織培養の技術は充分に確立
されている。単離した正常細胞から継代処理にＪ：り永
久セルラインを調製しこれを維持する手段及び方法も公
知である。研究に使用するためには、これらのセルライ
ンを液体培地中の固体支持体上に維持づるか、又は栄養
物を含有する懸濁液中で増殖させる。大母生産のために
は機械的問題が残るのみであろう（その他の背景につい
ては、文献２３及び２４参照）。

又、生物工学にＪ３いてはタンパク貿生化学が有用且つ
実際上必要な手段である。所望のタンパクを産生ずる細
胞は、多数の他のタンパク、即ち細胞１２Ｊ有の代謝産
物をも産生ずる。これらの夾雑タンパク及びその他の化
合物は、所望タンパクから除去されないと、所望タンパ
クによる治療処置の過程で動物又はヒトに投与した揚台
有毒どなる危険性がある。タンパク質生化学の技術によ
り、目的どする特定システムに適する分離方法を使用し
て目的用途に対し安全で均質な最終産物を得ることがで
きる。更に、タンパク質生化学により、所望産物の特ゼ
ｌを明らかにし、細胞が何ら変化せず又は突然変異する
ことなく所望産物を確実に産生じたことを確認覆ること
ができる。臨床研究及び市場開光に成功するために必要
とされるバイオアッセイ、安定性試験及びその伯の０１
究過程には上記の科・子分性も含まれる。

本発明は、組換ＤＮＡ技術の使用により、ヒト組織プラ
スミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）を好丈しくは直接
的形態で製造し、しかも市場認可を（りるための必須要
件である動物実験及び臨床試験を開始し且つ椹続するの
に十分な吊で右利に製造しくｑるという知見に基く、製
造されたヒトｔ−ＰＡは、ヒトの様々な心血管Ｖ５舎又
は心血管病の予防処置又は治療処置での使用に適してい
る。従って、１つの角度から見た本発明の重要な目的は
、ｔ−ｐΔを使用するヒトの心血管疾患の治療方法及び
ｔ−ＰＡを使用する薬剤組成物を提供することである。

本発明は、更に、実質的に純粋なヒト相関プラスミノー
ゲン活性化因子を提供する。、３！Ｉｉ伝子工学的に処
理された微生物又は細胞系により、従来にりも道かに有
効にヒト組ｔＪプラスミノーゲン活性化因子を産生し１
す、これにより従来は確信しくｑなかった産業利用の機
会が得られる。更に１．宿主細胞次第でヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子は天然物質に比較して異なった程
度でグリコジル化を伴い得る。いずれにしても、このよ
うに産生されるｔ−ＰＡは、非組換細胞に於いては伴わ
れるのが苗通である夾雑物を含まないであろう。

本発明は、又、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を
発現し得る形態でコードしている遺伝子配列を会む複製
可能なりＮＡ発現ベクター、該ベクターで形質φ入換さ
れた微生物菌株又は細胞、並びにヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子を産生しく！する前記の如き形質転換さ
れた微生物菌株又は細胞株の培養及びそれらの培養物に
係る。更に別の角度から見た本発明の目的は、前記の遺
伝子配列、ＤＮＡ発現ベクター、微生物菌株及び細胞の
製造に１．ｊ用な種々の方法及びその具体例を提供する
ことである。更に本発明は、前記の微生物の発酵ｊ８養
及び細胞の培養の調製に係る。

Δ、Ｌ１ 木切ＨＪｍに於いて、「ヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子」又は［ヒトｔ−ＰＡＪ又はｒｔ−ＰＡＪは、微
生物培養系又は細胞培養系により産生され、プロテアー
ゼ部分を含み且つヒト組織に天然に存在する相ｆＪプラ
スミノーゲン活性化因子に対応する生物活性形態のヒ１
〜外囚性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子を意味
する。本発明により産生されるヒト組織プラスミノーゲ
ン活性化因子タンパクは、決定されたＤＮＡ３ｍ！ｌ伝
子及び推定ア、ミノ酸の配列決定によって定義されてい
る。各個体毎に天然の相同変異（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａ
ｒｉａｔｉｏｎ　）が存在し及び／又は発生ずることは
理解されよう。これらの変異は、全配列に於ける１個以
上のアミノ酸の相違、又は配列中の１個以上のアミノ酸
の欠失、置換、挿入、転位もしくは付加によって示され
る。更にグリコジル化の位置及び程度は宿主細胞環境の
性質に依存するであろう゛。

組換ＤＮΔ技術を使用して、例えば、基本となるＤＮＡ
の特定の部位に突然変異を誘発する。ことににす、１個
又は多重のアミノ酸の置換、欠失、付加又は転位によっ
て種々変性された種々のヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子誘導体を製造することが可能である。本明細書中
で特にび２明するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
の一般的特性である必須のクリングル（ｋｒｉｎｇｌｃ
　）　ｍ域とセリンプロテアーゼ領域とを維持している
が池の部分は前記の如く変哲された誘導体の製造も可、
能である。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、中の
＋ｉ＆記の如き相１ｒＱ変異及び変性は、全て本発明の
範囲内に包含される。更に、ヒト１１！プラスミノ−。

ゲン活性化因子の木質的特徴である活性が実質的に維持
されている限り、物理的及び生物学的に類似した他の近
縁のヒト外因性（組織型）プラスミノーゲン活性化因子
も本発明のｆｒｒ！囲内に包含される。

本発明のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子は、 （１）第一アミノ酸としてのメチオニンを右する（描込
遺伝子の平面にＡＴＧ聞始コドンを挿入して（ｑられる
）か、又は、 （２）メチオニンが細胞内又は細胞外で１１；１裂され
ている場合は、正常の第一アミノ酸を右するか、又は、 （３）細胞内又は細胞外環境で特異的開裂可能なシグナ
ルポリペプチド又は従来のシグナルポリペプチド以外の
共役タンパク（ｃｏｎｊｕ−ｇａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉ
ｎ　＞を伴う（文ＮＸ２１参照）か、又は、 （４）外来の余分なポリペプチドの開裂が不要な成熟形
態で直接的に発現する。

発現ベクターが組織プラスミノーゲン活性化因子をシグ
ナルペプチドと共に発現すべく設計されており、所！ｊ
の宿主がシグナルペプチドを除去又は有効に除去し１り
ない場合、特に最後のものが１要である。いずれにして
も前記の如き種々の形態で産生じたヒトｔ−ＰＡを回収
し、種々の血管障害又は血管病の治療用に適するレベル
まで精製する。

更に、ｔ−ＰＡには、−末鎖タンパクと二本鎖タンパク
との双方、の形態がある。二本鎖タンパクは一重鎖化合
物のタンパク分解により誘導される。

Ｉ！Ｉ！論的には、二本鎖タンパクは産生線ｍ素と関連
し、タンパク分解による一本鎖物質から二本鎖物質への
変換はプラスミノーゲンからプラスミンへの転換部位で
生じると想定される。本発明は、前記の如＜　ｉｎ　ｖ
ｉｖｏで転換される一重鎖タンパクの投与、及び活性を
有することがすでに証明されている二本鎖タンパクの投
与の双方を含む。二本鎖タンパクは、−末鎖物質の産生
後にｉｎ　ＶｉｔｒＯタンパク分解変換によって製造さ
れ得る。所謂クリングル領域は、セリンプロテアーゼ部
分より上流に位置しており、本発明の組織プラスミノー
ゲン活性化因子を線帷素マトリックスに結合させ、これ
により、実際に存在する血栓に対して組織プラスミノー
ゲン活性化因子の特異的活性を発揮せしめるために重要
な役割を果す。本発明により製造される組織プラスミノ
ーゲン活性化因子は天然物質に相当する酵素活性部分を
合んでいる。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子なる
用語は、このような部分を単独で合むか、又は完全な長
さの分子にｉ２するまでの付加アミノ酸配列と共に含む
産生物と定義される。

要約すれば、本発明ににるヒトｔ−ＰＡは、以下の如く
別面的に定性し得る。即ち、ヒトｔ−ＰＡは、プラスミ
ノーゲンからプラスミンへの転換を触媒し４！？、ＦＡ
維素に結合し、前記の如き免疫学的特性に基いてｔ−Ｐ
Ａと分類される。従って、ｔ−Ｐ　Ａの別面的誘導体は
本発明の範囲内に包含される。

本発明により産生されるヒトｔ−ＰΔの状態を形容１べ
く用いた「実質的に純粋な形態」とは、非組換細胞によ
り産生されたとぎ即ち「天然」環境で産生されたとぎヒ
トｔ−ＰＡに通常伴うタンパク又は他の物質を含まない
ことを意味する。

ｒ　Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパク」とは、ジヒドロ葉酸
還元酵素（ＤＨＦＲ）に関連する活性を有し得、従って
、ヒボキ勺ンチン、グリシン及びチミジンを含まない培
地（−）（ＧＴ培地）に於いて生存し得る細胞によって
産生される必要があるタンパクを意味する。通常、ＤＨ
ＦＲタンパクを欠く細胞は該培地では増殖できないが、
ＤＨＦＲタンパクを有する細胞は該培地で増殖できる。

ｒ　Ｍ　Ｔ　Ｘ感受性細胞」とは、ＤＨＦＲ阻害剤メト
トレキセ−１−（ＭＴＸ）を含む培地で増殖し得ない細
胞を意味する。従ってｒＭＴＸ感受性細胞」とは、遺伝
的に変化しているか又は他の方法で補足されていない場
合、Ｍ　Ｔ　Ｘ　Ｃ度が０．２μｇ／ｍ１以上になると
周囲及び培地が細胞のタイプに適した条件であっても増
殖できない細胞を意味する。

細菌の如く成る種の細胞は、ＭＴＸに感受性を示す筈の
Ｄ）（ＦＲを含んでいるにも拘らず、細胞膜内部へＭＴ
Ｘを透過させないのでＭＴＸ感受性を示さない。一般に
、Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクとして野生型ＤＩ−ＩＦ
Ｒを含む細胞は、ＭＴＸを透過し得るか又は摂取し得る
限り、メトトレキセートに感受性であろう。

「野生型ＤＩ−ＩＦＲＪとは、使用する特定生物に通常
見出されるようなジヒドロ葉酸還元酵素を意味する。野
生型ＤＨＦＲは通常ｉｎ　ｖｉｔｒｏで低温度のメトト
レキセートに感受性である。

ｒＭＴＸに対する結合親和力の低いＤＨＦＲタンパク」
なる用語もｉ能的な定義である。これは、細胞内部で生
成されたときには、０．２μＱ　７ｍ１以上のＭＴＸを
含む培地でＭＴＸ感受性細胞を増殖せしめるＤＨＦＲタ
ンパクを意味する。このような機能的定義は、生物のｒ
ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ　ＨＦ　Ｒタンパク
」を産生ずる能力及び産生されたタンパク自体に依存す
ることは明らかである。然じながら、本明細書中でこの
用語を使用する場合には、前記の双方のメカニズム間の
平衡は問題にならない。即ち本発明では、前記の如きＭ
ＴＸレベルで生存する能力を付与することが操作の目的
であり、産生したＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ固有の性質に加え
て多足の発現が前記の如き能力を強化したか否かはｍ要
でない。前記の定義に適合する適当な［）　ＨＦ　Ｒタ
ンパクの例としては、１９８３年１月１９１］付出願の
米国特許出願第４５９，１５１号明細ｕ３に１ハ１示さ
れたものがあり、該特許出願明細出を本明細１１中に引
用して包含する。

「発現ベクター」とは、内包するＤＮＡ配列が該配列を
発現させ（ｑる別の配列に有効に（発現し１５るように
）結合されている場合、該配列を発現させ（ｑるベクタ
ーを意味する。これらの発現ベクターは、本明細１中必
ずしも明確に記述しなくても、宿主生体中で、エビソー
ムとして又は染色体ＤＮＡに組込まれた部分として複製
可能でなければならない。複製能が欠如するとベクター
は有効に作用しくｑない。

要するに、「発現ベクター」なる用語も機能的定義であ
り、内包する特定のＤＮＡコードを発現させ得る任意の
ＤＮＡ配列も、それが特定の配列に適用されるとき、発
現ベクターと指称され得る。

一般には、組換ＤＮＡ技術で使用される発現ベクターは
、しばしば「プラスミド」の形態にある。

「プラスミド」とは、環状二重鎖ＤＮＡループの呼称で
あり、ベクター形態のときには染色体に結合しない。プ
ラスミドの形ｆ）のベクターが最もよく使用されるので
、本明細書中では「プラスミド」及び「ベクター」なる
用語を方換的に使用している。黙しながら、本発明は、
勿論、同等の機能を果すことができ当業界で公知となる
別の形態の発現ベクターをも包含する。

「組換宿主細胞」とは、組換ＤＮＡ技術を用いて構築さ
れたベクターで形質転換された細胞を意味する。前記の
如く、このような形質転換によって多ｍのｔ・−ＰＡが
産生され１９る。対照的に形質転換されていない宿主を
用いるとｔ−ＰＡの産生量は遥かに少なく、円通の場合
には検出不能なｍでさえある。前記の如き細胞により産
生されたｔ−ＰＡは［組Ｊ！ｊ！ｔ−ＰＡＪと指称され
得る。

Ｂ、宿主細胞及びベクタ一 本発明で用いるベクター及び方法は、広範囲に口る原核
生物及び真核生物の宿主細胞中での使用に適している。

一般に、本発明に有用なベクターを構築するためのＤＮ
Ａ配列のクローン化には原核生物が好ましい。例えば、
旦、刈比　Ｋ１２株２９４（ΔＴＣＣＮｏ、３１４４０
　）が特に有用である。使用可能な別の微生物菌株とし
て、旦−、ニ　Ｂ及び旦−１性■Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、３１５３７　）の如き旦、性肚菌株がある。これ
らは勿論代表例であり限定的なものではない。

原核生物は、又、発現のためにも使用され得る。

前記の菌株及びり、姐肚Ｗ３１１０（Ｆ−、λ−。

プロトトロフ、　ＡＴＣＣＮｏ、２７３２５　）　、並
びに桿菌類例えば３　ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｕ
ｓ、並びに他の腸ナス種が使用され得る。

一般には、宿主細胞と適合性の種から誘導されたレプリ
コン及び制御配列を含むプラスミドベクターが、宿主と
関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位と、
形質転換された細胞中での表現型選択を可能にしくりる
マーカー配列とを担持している。例えば、［：、ｃｏｌ
ｉは、典型的には、旦−６ｃｏｌｔ種から誘導されるプ
ラスミドＩ）ＢＲ３２２を用いて形質転換される（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　、Ｇｅｎｅ。

２　：　９５　（１９７７）　）。Ｉ）ＢＲ３２２は、
アンぐシリン及びテトラ１ノイクリン耐性遺伝子を含ん
でおり、従って形質転換された細胞の簡単な同定手単と
なり４！ｌる。＋）８Ｒ３２２プラスミド又は他の微生
物プラスミドは、微生物が自身のタンパクを発現すべ。

く使用しくりるプロモーターを含有するか又は含有すべ
く変性されていなければならない。組換１）　ＮΔの構
築に最もよく使用ざ′れるブし１モーターとしては、β
−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）及びラフ１〜−スプ
ロモーターシステム（ＣＩ＋ａｎｇ。

０℃ａｔ、、　Ｎａｔｕｒｅ、ニア５　：　　６１５　
（１９７Ｂ）　：　ｌ　ｔａｋｕｒａ。

ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８　：　１０
５Ｇ（１９７７）　；Ｑｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ′ａ１．
、　Ｎａｔｕｒｅ、　　岨１　　：　　５１１４（１９
７９）　）　、並びにトリプトファン（セ四−）プロモ
ーターシスデム（Ｑｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　
ＮｕｃｌｅｉｃΔｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４０５
７（１９８０）　：欧州特許出願公１１を第００３Ｇ７
７６号明ｍ　！ｉ　）がある。前記のプロモーターが最
もＪ：り使用されるが、他の微生物プロモーターも発見
され且つ利用されてＪ３す、それらのヌクレオチド配列
に関する詳細も既に公表されているため、当業者はこれ
らのプロモーターをプラスミドベクターに機能的に結合
し得る（Ｓｉａｂｃｎｌｉｓｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　　
Ｃｅ１ｌ、　　２０：　　２［ｉ９＜１９８０）　）。

原核１物以外に、酵母の如ぎ真核微生物の使用も可能で
ある。Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ又は普通のパン酵母が最もに＜使用される真核微
生物であるが、多くの他の菌株も使用され４ｑる。

５ａｃｃｌｌａｒｏｌｎ　ＣｅＳ中での発現のためには
、例えばプラスミドＹ　Ｒ’１１７　（Ｓ　ｔｉｎｃｈ
ｃｏｍｂ、　Ｃｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ。

ユ８２：　３０　（１９７９）　：　Ｋ　ｉｎｇｓｍａ
ｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｇｅｎｅ、７：　　１４１　
（１９７９）　　：　Ｔｓｃｈｅｍｐｃｒ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　　Ｇｅｎｅ。

１０　：　　１５７　（１９８０）　）が常用される。

このプラスミドは江Ｌ１遺伝子を既に含有しており、同
道伝子は、トリプトファン中での増殖能力が欠如した酵
母突然変異株［例えば、ΔＴ　ＣＣＮ　Ｏ，４４０７（
＞又はＰ　Ｅ　Ｐ　４−１　（Ｊ　０ｎｅＳ、　Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ、８５　：　１２゜（１９７７）　）　］の
選択マーカーとなる。従って、酵母宿主細胞ゲノムの特
徴としてのｔｒｐ　ｉの損傷の存在は、形質転換を１〜
リブトフアンの不在下での増殖ににつて検出りるための
効果的な環境を提供する。

酵母ベクター中の適当なプロモーター配列として、例え
ば、３−ホスホグリセレートキナーゼ（１−ｌｉｔｚｃ
ｍａｎ、　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ、３ｉｏ１．　　Ｃｈ
ｃｍ、。

２￥５　　：　２０７３　（１９８０）　）　又ハ他ノ
ｗ？糖ＭＩＰ’ｊｍ（１−１ａｓｓ、　ｅｔ　ａ’ｌ、
、　　Ｊ　、　Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｅ　ＲＯＱ、、ユニ
１４９　（１９６８）　：　ｌ−１ｏｌｌａｎｄ、　ｅ
ｔ　ａｔ、、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ、　　１
７　：　４９００　（１９７Ｂ＞　）に対するプロモー
ターがある。後者の例に、エノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ
、３−ホスボグリセレートムタービ、ピルベートキナー
ゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ・及びグルコキナーゼがある。適当
な発現プラスミドを構築するには、これらの遺伝子に伴
う停止配列を、発現ベクター中で発現したい配列の３′
末端に結合して、ｍＲＮＡのポリアデニル化及び停止を
行なわせる。増殖条件によって転写が制御されるという
付加的利点を有する別のプロモーターとしては、アルコ
ールデヒドロゲナーゼ２、イ′ソチトクロムＣ，酸性ホ
スファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、前記グリ
セルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ並
びにマルトース及びガラクトースの資化に関係する酵素
（Ｈｏｌｌａｎｄ。

上掲）に対する。プロモーター領域がある。１３ｍ適合
性のプロモーター、複製のオリジン及び停止配列を含む
いかなるプラスミドベクターも適当に利用できる。

微生物以外に、多ｍ胞生物から誘導されたｍ胞も宿主と
して使用し得る。原則として、このような細胞はを椎動
物又は無を椎動物のいずれから得てもＪ：い。黙しなが
ら、を椎動物細胞の方が有利であり、近年では組織培養
でのを８Ｉ動物細胞の増殖がルーチンプロセスになって
いる（　Ｔｉ５ｓｕｅＣｔｌｌｔＬｌｒＯ，Δｃａｄａ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄｐａｔｔｅ
ｒｓｏｎ、　　（１９７３）　）　。前記の如き有用な
宿主細胞のセルラインの例として、ＶＥＲＯ及びＨｅＬ
ａｌｌｌｌｌｉ株、チャイニーズハムスターの卵巣（Ｃ
ＨＯ）セルライン並びにＷ　１３８．ＢＨＫ。

ＣＯＳ−７及びＭＤＣＫセルラインがある。前記の如き
細胞のための発現ベクターは、通常、（必要に応じて）
複製のオリジン、発現すべき遺伝子の前方に位置するプ
ロモーター、任意のリポソーム結合部位、ＲＮΔスプラ
イス（５ｐｌｉｃｅ＞部位、ポリアデニル化部位及び転
写終了配列を必要なものとして含む。

ｒ４１１乳動物細胞中で使用する場合、発現ベクターに
対づる制御機能は、しばしば、ウィルス性物質にＪ、っ
て与えられる。例えば常用のプロモーターは、ポリオ−
７１クイルス、アデノウィルス２から　・ＨＬ９され、
更に多くの場合リルウィルス４０（Ｓ　１ｍ１ａｎ　Ｖ
　１ｒｕｓ　／１０．　　Ｓ　Ｖ　４０）からＭＳされ
る。

ＳＶ４０ウィルスの初期（ｅａｒｌｙ　）プロモーター
及び後期（１ａｔｅ）プロモーターが特に有用である。

これは、いずれもＳＶ４０ウィルスの複製のオリジンを
併せて合む断片として、ウィルスから容易に得られるか
らである（　１”　１１３ｒｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎ
ａｔＬＩｒｅ。

ニア３　：　　１１３　（１９７８）参照）。断片がウ
ィルスの複製のオリジン中に位置するＬＬＬＩ部位に向
って１−１ｉｎｄｌ１１部位から伸びる約２５０　ｂｐ
の配列を含む限り、Ｓ　Ｖ　４０ｆｔｌｉ片の長さの長
短は問わない。更に、所望の遺伝子配列が通常伴ってい
るプロモーター又は制御配列の使用も可能であり、この
ような配列の使用が好ましい場合もしばしば見られる。

、但し、前記の如き制御配列は宿主細胞系と適合しなけ
ればならない。

複製のオリジンは、５Ｖ４Ｇ又は他のウィルス（例えば
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）起源から誘導
され得る外来性オリジンを含むようにベクターを構築し
て得てもよく、又は宿主細胞染色体複製メカニズムによ
って得てもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組込まれ
る場合は、後者が良い場合もしばしばある。

ｔ−ＰΔ及びＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクの双方をコー
ドしているＤＮＡ配列を含む本発明のベクターによって
トランスフェクションを行なう好ましい宿主細胞を選択
する際には、使用するＤＨＦＲタンパクのタイプによっ
て宿主を選択するのが適当である。

野生型ＤＨＦＲタンパクの場合には、ＤＨＦＲが欠如し
た宿主細胞を選択し、これにより、０ＨＦＲコ一ド配列
を、ヒボキサンチン、グリシン及びチミジンを含まない
選択培地でのトランスフェクションの成功を示すマーカ
ーとして使用するのが好ましい。この場合の適当な宿主
細胞としては、ＤＨＦＲ活性が欠如したチャイニーズハ
ムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラインがある。該セルライ
ンは、Ｕ　ｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ、　　Ｐ　ｒＯ
ｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳＡ）
、７７：４２１６（１９８０）に記載の方法で調製され
増殖させたものである。該文就を引用して水切ＩＱ書中
に包含する。

他方、ＭＴＸに対する結合親和力の低いＤ　ＨＦ　Ｒタ
ンパクを制御配列として使用する場合には、Ｄ　）−Ｉ
　Ｆ　Ｒ耐性細胞を使用する必要がない。

突然変異ＤＨＦＲはメトトレキセートに耐性であるから
、宿主細胞自体がメトトレキセート感受性であれば、Ｍ
ＴＸ含有培地を選択の手段として使用し得る。ＭＴＸを
取込み得る多くの真核細胞はメトトレキセート感受性で
あると考えられる。このような有用なセルラインの１例
として、ＣＨ０株、ＣＨＯ−ＫＩ　　ＡＴＣＣＮｏ、Ｃ
ＣＬ６１がある。

後述の実施例では、ｔｒｐプロモーターシスデムを用い
るＦ−０ｃｏｌｉｏ使用、宿主細胞としてＣＨＯ綱胞の
使用、及びプロモーターとしてのＳＶ４０の複製のオリ
ジンを含む発現ベクターについて記載する。然しながら
、原核生物又は真核生物宿主細胞のＪｓ養物中で所望の
タンパク配列を発現する発現ベクターを構築するために
類似の技術を使用することは当業界で十分に公知の事実
である。

Ｃｏｉ皿２ＬＬ 堅固な１［ＩＪ泡壁ｌｉ？！壁を持たない細胞を宿主細
胞として使用するとぎは、トランスフェクションは、Ｑ
　ｒａｈａｌ及びＶ　ａｎ　ｄｅｒ　　Ｅ　ｂ、　　Ｖ
　１ｒｏｌｏｏｙ、　　５２　：５４Ｂ　　（１９７８
）に記載のリン酸カルシウム沈減法で、行なわれる。然
しながら、ＤＮＡの細胞内導入のためには、核注入又は
プロトプラスト融合の如き他の方法も使用し得る。

原核ａ１１ｊ又は堅固なｍｖａ壁障壁を有する細胞を使
用するとき、好ましいトランスフェクションの方法は、
Ｆ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＬＪＳＡ
）　、　６９：２１１０（１９７２）に記載の塩化カル
シウムを用いたカルシウム処理である。

所望のコード配列及び制御配列を有する適当なベクター
の溝築には、標準的な結合方法を使用する。単離された
プラスミド又はＤＮＡ断片を開裂し、末端処理し、所望
形態で再結合して所要プラスミドを形成する。

開裂を行なうためには、適当な！！ｉ液中で１種（又は
複数種）の制限酵素で処理する。一般には、約１μＱの
プラスミド又はＤＮＡ断片に対し約１ユニツトの酵素を
含む緩衝溶液的２０μｍを使用する（特定の制限酵素に
対する適正な緩衝液及び基質）はメーカーによって処方
されている）。インキュベーション時間は３７℃で約１
時間である。インキュベーション後、フェノール及びク
ロロホルム抽出でタンパクを除去し、エタノール沈澱に
より水性画分から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合、生成物を１０ユニツトのポリメ
ラーゼＩ　（Ｋ　ｌｅｎｏｗ　）により１５℃テ１５分
間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、エタノー
ル沈澱する。

Ｇ１裂した断片のサイズによる分離は、Ｄ。

Ｇｏｅｄｄｅｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、、　８：４０５７　（１９８
０）に記載された６％ポリアクリルアミドゲルを用いて
行なう。この文献を引用して本町細書中に包含する。

結合を行なうためには、正しく整合すべく末端を適当に
処理したほぼ等モル量の所望成分を、０．５μ９のＤＮ
Ａに対し約１０ユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼで処理す
る。（開裂されたベクターを成分として使用する場合、
開裂されたベクターの再結合を阻止するために細菌のア
ルカリ性ホスファターゼによる予備処理を行なうとよい
。）溝築したプラスミドの正しい配列を確認すべく行な
う解析のためには、結合混合物を用いてり。

組■　Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６）を
形ｉ″ｊｊ転換通産な性質例えばアンピシリン耐性を利
用して所望の形質＠換株を選択する。形質転換株からプ
ラスミドを調製し、制限解析し及び／又は配列決定する
（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｃｌｓ　　Ｒｅｓ、、　９：　　３０９（１９８
１）又はＭａＸａｍ、　ｅｔａｔ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　ｌ：ｎｚｙｉｏｌｏｇｙ、　　Ｇ５：　　４９
９（１９８０）　）。

ＤＨＦＲタンパクをコードしている配列の増幅を行なう
には、ＤＨＦＲ活性の競合阻害剤であるメトトレキセー
トを温度約２０−５００，０００　ｎＭで存在させて宿
主細胞を増殖させる。有効濃度範囲は、勿論、Ｄ　ｔ（
Ｆ　Ｒ遺伝子の性質、タンパク及び宿主の特性に依存す
る。従って、上記の上限値及び下限値は確定値ではない
。Ｄ　ＨＦ　Ｒを阻害し得る他のＭＦｌｉ類又は他の化
合物を適正濃度で使用することも可能である。然しなが
らやはりＭＴＸが便利で入手し易く有効である。

Ｄ、ＬＬ１１１悲１１ ヒ１−組織ブラスミノーゲン活性化因子を以下のように
製造した。

１、組織プラスミノーゲン活性化因子を有効に産生ずる
ヒトメラノーマ細胞をコンフルエントな状態（ｃｏｎｆ
ｌｕａｎｃｙ）になるまで培養した。

２、リボヌクレアーゼ阻害剤の存在下で前記の細胞培養
物から得た細胞ペレットを抽出し細胞質ＲＮＡ全部を単
離した。

３、ＡリゴーｄＴカラムを用い全メッセンジ１シーＲＮ
Ａ　（ｍ１ｌＪＡ）をポリアデニル化形態で１１１　＃
ｌ　した。酸性尿素アガロースゲル電気泳動にかけてｌ
ｌＲＮＡを１ノ゛イズ分画した。

４、組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＲＮＡを含
むゲル画分を以下の方法で同定した。即ら、各ゲル画分
のＲＮＡをイヌのスイ臓ミクロソームを補充したウサギ
網状赤血球ライゼー１”　（１ｙｓａｔｃ）系中ｉｎ　
ＶｉｔｒＯで翻訳した。（ｑられた翻訳産物を次にヒト
組織プラスミノーゲン活性化因子特異的ＩｇＧ抗体で免
疫沈降した。

５、適ツなＲＮＡ（２１乃至２４Ｓ）を対応する一重鎖
相補ＤＮＡ　（（ｉＤＮＡ）に転換し、該ＣＤＮＡから
二重鎖ＣＤ　Ｎ　Ａを製造した。

ポリ−ｄＣを末端につなぎ、１種以上の表現型マーカー
を含むプラスミドの如きベクター内に挿入した。

６、前記の如く調製されたベクターを使用して細菌細胞
を形質転換し、クローン化ｃＤ　Ｎ　Ａライブラリーを
調製した。ｔ−ＰＡ中の既知のアミノ酸配列のコドンと
相補的な放射活性標識−合成デオキシオリゴヌクレオチ
ドのプールを調製しコロニーライブラ゛リーのプローブ
に用いた。このようなプールの例として、例えば、（既
知（後記）のアミノ酸配列：トリプトフ７ンーグルタミ
ン酸−チロジン−システィン−アスパラギン酸（Ｗ−Ｅ
−Ｙ−Ｃ−Ｄ）をコードする配列と相補的な）　８種の
１４ヌクレオチド体（１４−ａｖｅｒ）　、５’−ｄＴ
Ｃ（Ａ）　ＣＡ（Ａ）ＴＡ　（’）ＴＣＣＣＡ−３’の
プールがＧ　　　　　　　　　　　Ｔ ある。

７、ポジティブな（プローブに対して陽性反応を示した
）ＣＤＮＡクローンからプラスミドＤＮＡを単離し配列
決定した。

８、次に、配列決定したＤＮＡを適当な発現ベクターに
挿入すべく　ｉｎ　ＶｉｔｒＯで末端処理し、該発現ベ
クターを適当な宿主細胞に形質転換し、宿主細胞を培養
により増殖させ、所望のヒト［ｌ織プラスミノーゲン活
性化因子を産生させた。

９、前記の如く産生されたヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子は、セリンプロテアーゼ酵素部分に約２５１個
のアミノ酸を有しており、その上流にクリングルを含む
配列を有する。現在では該配列が線維素結合の主因であ
ると理解されている。成熟タンパク及びそのシグナルプ
レ配列とは全部で５６２個のアミノ酸を含む。

前記の方法によって実質的に純粋なｔ−ＰＡ＠産生じ得
る。メトトレキセート感受性の付加的コード配列を用い
る本発明方法によれば、抗原的に活性なｔ−Ｐ　Ａタン
パクを、宿主細胞の培養物中で１日に細胞当り０．Ｉｐ
Ｏより多いｍで産生し得る。適当な増幅条件を使用する
と、２０ｐ（ｌより多いｍを得ることも可能である。換
言すれば、９Ｘ１０＝Ｐ　Ｉｏｕｏｈユニットより多い
か、又は適当な増幅によりＴ　１８Ｘ　１Ｇ−’　Ｐ　
ｌｏｕｇｈ　ｌ　二ｙトより多いｔ−ＰＡ活性を産生す
るような遺伝子発現レベルが達成される。

この点に於いて、本発明では、薬剤としてメトトレキセ
ートを用いる。メトトレキセートは、これを摂取し得る
ｍ胞には普通致死性を有するが、制御されたＭ　Ｔ　Ｘ
レベルではＤ　ＨＦ　Ｒコード配列をコードしている遺
伝子の増幅により細胞が増殖することを可能にするとい
う性質を有している（Ｓｃｈｉｍｋｅ、　Ｔ、　Ｒｏｂ
ｅｒｔ、　ａｔ　ａｔ、、　　５ｃｉｅｎｃｅ。

２０２　　：　１０５１　（１９７８）　　：　Ｊ　、
　　Ｌ　、　Ｂ　１ｅｄｌｃｒ、員ａ１゜Ｃａｎｃｅｒ
　　Ｒｅｓ、、　　　　３２：　　　１５３（１９７２
）　　　：Ｓ、　　　Ｅ。

ＣＩＩａｎＯ，Ｑｔ　ａｌ、、　Ｃａ１ｌ、ユニ　　３
９１　（１９７Ｇ）参照）。

本発明のこの点の重要性は、Ｄ　Ｉ−＋　Ｆ　Ｒ遺伝子
の増幅が、他のタンパクをコードしている関連配列の増
幅をも生起し得ることにある。ＰＡＭタンパクが、Ｂ型
肝炎表面抗原（）（ａｓ　Ａ（＋　）（Ｊ。

ＣＩ＋ｒｉｓＬｍａｎ、　ｅｔ　ａｌｌＰｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　　７９：　１８１５（１９８２）　）　、
Ｅ、　Ｃｏｌ＋タンパクＸＧＰＲＴ　（Ｒｉｎｇｏｌｄ
、　Ｇｏｒｄｏｎ、　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｊ。

Ｍｏ１ｅｃ、ａｎｄ　Ａ１１ｌ）１．　　Ｇｅｎ、、　
　１：　　１６５（１９８１）　　）　　、及び結合Ｄ
Ｉ−ＩＦＲ／ＳＶ４０プラスミド由来内在性配列（Ｒ，
Ｆ、Ｋａｕｆｍａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１
ｅｃ。

Ｂｉｏｌ、、　１５９　：　　ＧＯｌ（１９８２）　）
の場合に、前記の増幅現象が生じる。

メトトレキセート耐性を与える別のメカニズムは、メト
トレキセートに対するＤＨＦＲタンパクの結合親和力の
低下従ってメトトレキセート感受。

性の低下を含む（Ｗ、　Ｆ、　Ｆｌｉｎｔｏｆｆ、　ａ
ｔ　ａｔ、。

ｓｏｍａｔ、　Ｃａ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、　２：　２４
５　（１９７６）　）　。しかしこの１１３３合にも増
幅は同様に生じるであろう。

野生型ＤＨＦＲ，及び自身の結合親和力の低下によりＭ
ＴＸ耐性になっているＤ　ＨＦ　Ｒに対する遺伝子は、
どちらもＭＴＸの存在により増幅されるＪ、うである。

即ち、基本的に、本発明は、ＭＴＸの存在下で、又は形
質転換された細胞をＭＴＸで予備処理することにより、
ｔ−ＰＡ配列の発現レベルを向上ｕしめる制御メカニズ
ムを得るために、Ｄｌ・１１−Ｒ配列の増幅が関連タン
パクをコードしている配列に与えるインパクトを利用し
ている。

Ｅ、実施例 以下の実施例は本発明の代表例として示されたちのであ
り限定的な性質を持たない。以下に記載の実施例に於い
ては、旦０皿細胞及び）９人されるＩ’）　ｌＩＦ　ｆ
ｌタンパクのコード配列の型に’＋８　シたＣ　＋−＋
　Ｏｔ＝ニルライン宿主細胞として使用した。然しなが
ら、他の真核ｍＩｒ！！及び原核細胞ら同様に本発明方
法に適している。

ｌミ、１．Ｅ、　ｃｏｌｉでのヒトｔ−ＰΔ渭伝子の発
現１巳、１．△０図の説明 第１図は、プロテアーゼインヒビター、アブロヂニンの
存在下（レーンｂ）又は不在下（レーンａ）で、ヒトメ
ラノーマ細胞から３時間のパルスの間にｉｎ　ｖｉｖｏ
で分泌され免疫沈降させたｒ　３Ｊ　Ｓ　］−メチオニ
ンで４Ｈｙｌされた（　１種以上の）タンパクを示す１
０％ＳＤＳアクリルアミドゲルのオートラジオグラムで
ある。組織プラスミノーゲン活性化因子特異的１（ＩＧ
による免疫沈降後、分子ｍ約６５．０００．６３，００
０及び３５，０００を有する３つのバンドが観察された
（レーンａ）。然しながら、プロテア−げインヒビター
の存在下では、分子ｆｆｉ　３５，０００の種は？ｌ！
１２察されなかった（レーンｂ）。免疫性血清を使用す
るといかなる産生物も免疫沈降しなかった（レーンＣ）
。標準物質として使用した１４ｃで標識したタンパクの
移動及び分子門をレーンａの左方に示す。即ち、２００
，０００　　ミオシン（Ｈｍ）　：　　９２，５００　
　ホスホリラ−ｆＢ　：　　６８，０００牛血清アルブ
ミン：　　４３，０００　　オバルブミン（ｏｖａｌｂ
ｕｍｉｎ　）　：　　２５，７００　　ａ−キモトリプ
シノーゲン；　　１８，４００　　β−ラクトグロブリ
ン・第２図は、酸性尿素アガロースゲルから単殖された
ＲＮＡ画分を翻訳した産物の免疫沈降物をゲル電気泳動
にかけた結果を示ず。イヌのスイ臓ミクロソームの存在
下で翻訳後に組織プラスミノーゲン活性化因子特異的１
ｇＧで免疫沈降すると画分Ｎ００７及び８で主バンドが
観察された。このバンドは分子量約６３．０００ダルト
ンを有する。画分Ｎｏ、７及び８に移動するｆｆ１ＲＮ
Ａのサイズは約２１乃至２４Ｓである。ＲＮＡ尿素ゲル
電気泳動後に決定され且つ見易いように臭化エチジウム
で染色されたリボソームＲＮＡマーカーの位置が適当な
ゲルレーンの上方に示されている。

第３図は、３２Ｐ−ｄＴＣ（）ＣＡ　（Ａ）ＴＡＧ　　
　　　Ｇ （’）ＴＣＣＣＡ　（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プローブ、
を用いた９６個のコロニーのハイブリダイゼーションパ
ターンを示す。９６個の形質転換株の各々をマイクロタ
イタープレート上で増殖させ、レプリカ平板法で処理し
、ニトロセルロース膜上で増殖さＩ！　／、：　ｎ次に
コロニーを溶解し、細菌性ＤＮＡを固定し、フィルター
を　Ｐ−１４ヌクレオチド体（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）プ
ローブとハイブリダイズした。フィルターを洗浄してハ
イブリダイズしなかったプローブを除去し、ＸＦ１１フ
ィルムに露光した。このオートラジオグラムは４８個の
フィルター（／Ｉｆ３００個の独立コロニー）の各々に
よって１ｑられたパターンを示す。Ｎ　ｏ、２５のフィ
ルター上のポジティブな組織プラスミノーゲン活性化因
子ｃＤＮＡを有するクローンの例をＥｌｏ（矢印）で示
ず。

第４図は、全長（ｆｕｌｌ　Ｉｃｒ＋ｏｔｈ　）ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子ｃＤＮＡの制限エンドヌ
クレアーゼマツプである。制限エンドヌクレアーピ開裂
にＪ、り生成した断片の数及びサイズの測定には、６％
アクリルアミドゲル電気泳動を用いた。

（第５図の）核酸配列ににって部位の位置を確認した。

最大のＡ−ブレリーディングフレーム（０ｐｅｎ　ｒｅ
ａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ、停止：１トンに至るまでの一
最艮のＤＮＡ配列）のコード領域を長方形（゛示し、斜
綜領域はＪｌｔ定されるシグナルペプチド配列を示ず。

点描領域は推定される成熟組織プラスミノーゲン活性化
因子配列（５２７個のアミノ酸）を示り゛。

ｍ１ｌＮΔの５′末端は左方、３末９ｉ（は右方に示ず
。

第５８．！＋ｂ及び５０図は、全長じ！−組ＤＡプラス
ミノーゲン活性化囚因子ＤＮΔのヌクレオチド配列及び
１１【定されるアミノ酸配列を示ず。成熟配列に先ｆｒ
ｔ　６３５個（１）　７　ミ／　Ｍ　（−３５乃至−１
）　ハ連続り、　タ配列として示されている。この３５
個のアミノ前記９１１は、成熟タンパクのセリン（＋１
）に先行する約１２乃至１５個のアミノ酸の親水性゛プ
ロ″配列を含み、該プロ配列の前に″゛従来″゛疎水性
シグナルが存在する（５末端から−３５まで伸びる）。

分泌されたタンパクに於けるこの種のブレープロ構造は
、既に、例えばプレプロアルブミンに関して記載されて
いる。この理論に基く場合、分泌された組織プラスミノ
ーゲン活性化因子の分子は全て、アミノ末端としてのセ
リン（＋１）から始まるであろう。第２の理論によれば
、親水性配列が組織プラスミノーゲン活性化因子の別能
に関与すると考えられてＪ３す、この様能は、ｉｏ、ｏ
ｏｏダルトンのペプチドが天然プラスミノーゲンのアミ
ノ末端部分（アミノ末端残基に囚んで名付けられたＧｌ
ｕ−プラスミノーゲン）から開裂されて、Ｌｙｓ−プラ
スミノーゲンとＪ：ばれる新しいアミノ末端を有するよ
り小さい分子となるとぎにプラスミノーゲンで観察され
るのと同様な別面であると考えられる。

１１Ｓ−プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲ
ンよりも活性化されてプラスミンになり易く、またＦｉ
Ｈｆｆ素に対する親和力もより大きい。プラスミンはＧ
ｌｕ−プラスミノーゲンからＬｙｓ−プラスミノーゲン
への転換を触媒することが判明している。この種のコン
トロールメカニズムは゛ポジティブフィードバックパメ
カニズムとなる。最初に形成されたプラスミンは、線維
素を分解し同時に天然プラスミノーゲンよりも活性化し
易く基質にＪ：り堅く結合し易いプラスミノーゲン分子
を生成する。その結果、線維素の分解が促進される。組
織プラスミノーゲン活性化因子の親水性ペプチドは同様
なメカニズムにより、その開裂によって線雑索への酵素
の結合をｒｉ飾し得る。いずれにしても、３５個のアミ
ノ酸配列は、成熟タンパクのプレ配列と、考えられる。

第６図は、組織プラスミノーゲン活性化因子発現プラス
ミドｐΔＲＩＰＡ”の溝築を示す概ｆ８説明図である。

出発プラスミドｐｐ　Ａ　２５Ｅ　１０を先ずＰＳｔＩ
で消化して３７６　ｂ１１断片を１０離し、次に該断片
を図示の如く消化する。

第７図は、ｐΔＲＩＰＡ”によって形質転換されたＩｌ
ｌ胞中で得られた発現産物の線維素溶解能のノイブリン
プレートアツセイの結果を示ず。

第８図は、（本発明の）組織プラスミノーゲン活性化因
子トリプシン消化によるペプチドの）ＩＰＬｃ（高速液
体クロマ１−グラフィー）トレース（２１０ｎｎ＋　、
に於【）る吸収）を示ず。矢印は、コロニーライブラリ
ーに用いるヌクレオチドプローブを段目ずべく使用され
たペプチドに対応するピークを示ず。このピークで示さ
れるペプチドの完全配列は、Ｌ−Ｔ−Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−
Ｄ−Ｖ−Ｐ−８−Ｃ−Ｓ　−Ｔ　−Ｃ−Ｇ　−Ｌである
ことが知見された。ヒト組織プラスミノーゲン活性化因
子の正しいアミノ酸配列を確認ずべく、曲の主たるピー
クの配列も同様にして決定され知見された。アミノ酸を
示すペプチドの文字コードを以下に示す。

ＡＳｌ’ｌ　　　Ｄ　　　アスパラギン酸１１ｅ　　　
Ｉ　　　イソロイシン Ｔｈｒ　　　Ｔ　　　スレオニン ＬＱＵ　　　Ｌ　　　ロイシン ３ｅｒ　　　Ｓ　　　セリン Ｔｙｒ　　　Ｙ　　　ヂロシン Ｇｌｕ　　　Ｅ　　　グルタミン酸 ｐ、ｈｃ　　　Ｆ　　　フェニルアラニンｐｒｏ　　　
Ｐ　　　プロリン ト１ｉｓ　　　ｌ−１ヒスチジン Ｇｌｙ　　　Ｇ　　　グリシン Ｌｙｓ　　　Ｋ　　　リジン Ａｌａ　　　Ａ　　　アラニン Ａｒｏ　　　Ｒアルギニン Ｃｙｓ　　　ｃ　　　システィン Ｔｒｌｌ’Ｗ＋−リブトフ７ン Ｖａｔ　　　Ｖ　　　バリン Ｇｌｎ　　　Ｑ　　　グルタミン Ｍｅｔ　　　Ｍ　　　メチオニン Ａｓｎ、Ｎ　　　アスパラギン ！−リブチックペプチド解析（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｐｅｐ
ｔｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓ）用のサンプルは以下の如く
￥Ａ製した。

１ｍｇのｔ−Ｐ　Ａを１００倍容の　１％ＮＨ４ＨＣｏ
３　に対して透析し、凍結乾燥した。乾燥サンプルに、
尿素０．３６１（１、Ｅ　ＯＴ　Ａ溶液（Ｎａ２　ＥＤ
ＴＡ５０ｍｏ／ｍｌ）　　０．０３ｍ１　、トリス緩田
液（１００＋ｎｌ中に１７．３！］のトリスＪＷ基及び
２９．７ｍｌの　１Ｎ　　ＨＣｌを含有する）　　０．
３ｍｌ及び２−メルカプトエタノール０．０１ｍ１を添
加した。

１）　　Ｏを添加して容積＠　０．７５ｍ１に調整し、
すンプルを１１の気密性バイアルに入れた。バイアルを
８〜１尿素で上端部に５０μｍの空間を残すように充填
し、乾燥Ｎ　′？−置換し、密、封した。Ｖ温で４時間
インキュベートし、５０μｍのヨード酢酸（１Ｎ　　Ｎ
ａ　０ｆ−１中５４０＋ｎｏ　／ｌｌ）を添加し、暗所
で１５分間インキュベートした。次いで、１％Ｎ１・ｌ
　　ＨＣＯを含浸しフォイルで包んだプシンをｔ−Ｐ　
Ａに対して重量比１：１００で添加し、３７℃で１６時
間インキュベートした。次いでサンプルを凍結した。Ｓ
　ｖｎｃｈｒｏｎ　ＲＰ−４カラム逆相りロマトグラフ
ィーを使用して５ｐｅｃｔｒａ　　Ｐ　ｈｙｓｉｃｓＳ
Ｐ　８０００　ＨＰＬＣ系で１−ＩＰＬｃ解析した。０
．１％トリフルオロ酢酸水溶液中アセトニトリル密度勾
配（０〜７０％）を使用してペプチドを溶出した。

２１０ｐｍ及び２８０　ｎ　ｍに於ける吸収をモニター
した。

第９図は、五−８二での成熟ヒト組織プラスミノーゲン
活性化因子の直接発現をコードするプラスミドの構築を
示す。５０μｇのプラスミドｐＰ　Ａ　１７をＳａｕ　
３Ａ１．　Ｈｉｎｃ　］ＩＩびＨｈａＩで消化し、６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。約ｏ、ｓμ
すのｓｓ　ｂｐ影阻３ＡＩ−比匝工断片を回収した。同
様にして、８０μ９のプラスミドＤＰ　Ａ　２５Ｅ　１
０から先ず３００　ｂｏ　Ｐ　ｓｔＩ　−Ｎ　ａｒＩ断
片を単離し次にこの断片をＨｈａｌで消化することによ
り約３ｕ（Ｊ　ｆ７）　２６３　ｂＯＨｈａＩ−Ｎａｒ
工断片を私製した。全ての消化は３７℃にて　１時間を
要して行なわれ、反応産物を溶解し、６％ポリアクリル
アミドゲルから電気溶出した。図示の２種のデオキシオ
リゴヌクレオチド５’ｄＡＡＴ丁ＣＡ丁Ｇ丁ＣＴＴＡＴ
ＣＡＡＧＴ　（Ｉ　）と５　ｄ　ＧＡＴＣＡＣＴ丁ＧＡ
ＴＡＡＧＡＣＡＴＧ　（ＩＩ）とを固相ホスホトリエス
テル法により合成した（文猷５１参照）。

Ｇｏ　ｍＭの１−リス（ＩＩＨ８）　、１０　ｆｆ１Ｍ
のＭＯＣＩ□　、１５　ｍＭのβ−メルカプトエタノー
ルの［γ３２Ｐ　Ｉ　Ａ　Ｔ　Ｐ　（　Ａ　ｍｅｒｓｈ
ａｍ，　　５，ＯＯＯＣｉｍｍｏｌ　　）を含む３０μ
＋の反応容旦中で１００ｐｍｏｌｅのオリゴヌクレオチ
ド■をリン酸化し、１２ユニツトのＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼを添加し、３７℃で１５分間反応させた。次
に、１μｍの１０　ｍＭＡＴＰ及び１２ユニツトのＴ４
キナーゼを添加し更に３００分間反応せた。フェノール
／ＣＨＣｌ　　抽出接、リン酸化オリゴマー■及び５′
−ヒドロキシオリゴマー■を、０．５μ０の溶出５５　
ｂＤ二匹３ＡＩ−土巨１断片及び２μ９の２６３　ｂｐ
）−１ｈａニ一凡ａｒＪ断片と合せてエタノール沈澱し
た。

これらの断片を、２０　ｍＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）　、１０　ｍＭのＭ（ＩｃＩ　　、１０ｍＭのジ
チオスレイトール、０．５　ｍＭのＡＴＰ及び１０００
ユニツトの７４　ＤＮＡリガーゼを含む６０μｍの反応
液中で、ヱ温にて４時間を要して結合した。混合物を、
４８ユニツトのＮＪ■−工、２０ユニツトのＥＣ０ＲＩ
及び４０ユニツトのＢ（ＩＩＩＩで１時間消化して（粘
着性３ａｕ３ＡＩ末端相互の結合による１合を阻止し）
、６％グル電気２１ｋ動さヒだ。３３８　ｂｐの産物（
約０．１μり）を電気溶出にＪ二つて回収した。プラス
ミドｏＰΔ２５Ｅ１０を又旺■及び艶旺■により消化し
て、１６４Ｓ　ｂｐ　１μｍ片どしてｔ−ＰＡコード配
列の残部（アミノＭ　１１１−５２８）を単離した。プ
ラスミド１）Ｌ　ＯＩ　Ｆ　Ａ　ｔｒＤ　１０３は、Ｌ
ｃｌＦＡＷ伝子に対し°Ｃ遠位のＥＣｏＲＩ部位が除去
されたく文献５３）プラスミドｐＬｅｌＦＡ２ｓの誘導
体（文Ｍ５２）である。３μ９のｐＬ　ｅ　Ｉ　ｒ”Ａ
ｔｒｐ　１０３を、２０ユニットのＥＣ０ＲＩ及び２０
ユニツトのＢａ１ｌＴを用いて３７℃で９０分間消化し
、６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、大きい（〜
４，２００　ｂｐ）ベクター断片を電気溶出によって回
収した。最終的な構築のために、８０ｎｇのＥｃｏＲＩ
一旦Ｊ土■１）ＬＯＩ　ＦＡｔｒｐ　１０３断片を、１
１００ｎの１６４５　ｂｐＮ　ａｒＩ　−Ｂ　ａｌｌｌ
断片及び°２０ｎｇの３３８　ｂｐ　Ｅ　ｃｏＲＩ−１
’Ｊｆｌｒ工断片と、室温で１０時間か【プて結合した
。

この結合混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ−１２株２
９４を形質転換したｎ３８個の形質転換株からプラスミ
ドＤ　ＮＡを調製しＩＥｃｏＲＩで消化した。このうち
１０個のプラスミドが所望の６ｏｏ　ｂｐ及び４７２　
ｂｐＥＣＯＲＩｒＦＩ片を含有していた。ＤＮＡ配列解
析にＪ、り確認するど、これらのプラスミドの１つ（ｐ
Ｌ−ＰＡ江Ｌ１２）がユしプロモーター、合成り　Ｎ　
Ａ及びｃＤ　Ｎ　Ａ聞の接合部に所望のヌクレオ゛ブ〜
ド配列を有していた。

第１０図は、本発明の組織プラスミノーゲン胚性化因子
発現産物の線維水溶解能のフィブリンプレ−トアッレイ
の結果を示ず。（ｉμｇ　／ｍｌのテトラサイクリンを
含むルリアブロス（Ｌ　ｕｒｉａ　ｂｒｏｔｈ）で　１
晩ｊ８養したＥ　、ｃｏｌｉ　　Ｗ３１１０／Ｄｔ−Ｐ
ＡＡｏ　１２を、０．２％のグルコース、０．５％の力
１アミノ酸及び５μＯ／ｍｌのテトラサイクリンを含む
Ｍ９ｊ３地中に１：１００に一８１Ｒした。細胞を３７
℃でＡｏ、２になるまで増殖させ、インド−ル酢酸を最
終濃度が２０μｇ　／ｍｌになるまで添加した。遠心に
よりサンプルを０．５−０．６（〜２Ｘ１０８ｍ２Ｘ１
０８Ａ３５ｏ　　で採取し直ちに凍結した。細胞ベレッ
トを６Ｍの塩酸グアニジンに５Ｘ１０８．ｉ［ｌ胞／１
で懸濁させ、１０秒間超音波処理し、２４℃で３０分間
インキュベートし、次いで２５　ｍＭのトリス−ＨＣｌ
　　（ＤＨ８，０）　、２５０ｍＭのＮａＣ＋、０．２
５ｍＭのＥＤＴＡ及び０．０１％のＴｗｅＣｎ　８０に
対して４時間透析した。透析後、サンプルを１３．０Ｏ
ＯＸ　ｇで２分間遠心し、１０μｍの上清を解析して組
織プラスミノーゲン活性化因子の活性を定Ｍした。Ｇ　
ｒａｎｅｌｌｉ−Ｐ　１ｐｃｒｎｏ及びＲｅｉｃｈの方
法（文献８１）を準用し、プレートを３７℃で３．５時
間インキュベートし溶解ゾーンを測定した。精製メラノ
ーマ組織プラスミノーゲン活性化因子溶液の希釈液と比
較して定Ｍした。

Ｅ、１．Ｂ、組織プラスミノーゲン活性化因子ヒ１〜メ
ラノーマ細胞（３ｏｗｅｓ）を使用したくこのｉｌｌ　
Ｉｌｌは、例えばしｃｕｖｃｎ　Ｒｃｓｃａｒｃｈ　ａ
ｎｄ　Ｄ　ｅｖｃ−１ｏｐｍｃｎｔ　ｖｚｂ、　　Ｌ　
ｅｕｖｅｎ、　　Ｂ　ｅｌａｉｕｍ　（Ｄ　ｒ、　　Ｄ
　。

Ｃｏ１１ｃｎ　）等から制限なく自由に入手可能である
。

文献８８参照）。炭酸水素ナトリウム（最終濃度０．１
２％）　％　２ｍＭのグルタミン及び１０％の熱失活＝
ル゛エンドな状態になるまで単層培養した。メラノーマ
細胞がヒト組織プラスミノーゲン活性化囚−子を有効に
産生じたことを確認すべく、２４ウェル斗ルエントな状
態になるまで培養した。０．３３μＭのプロテアーゼイ
ンヒビター、アプロチニンの存在下又は不在下で、細胞
をリン酸ｔｊｉ訂生理食塩水（ＰＢＳ）で１度洗浄し、
血清及びメチオニンを含まない築％　０．３ｍｌを添加
した。７５μＣｉの［３５Ｓ］−メチオニンを添加し細
胞を３７℃で３時間かけて標識した。３時間で標識した
後、培地を細胞から除去し、免疫沈降のために粗織プラ
スミノーゲン活性化因子特異的１ｇＧ又は免疫性血清で
処理した（文献５４）。免疫沈降産物を１０％ＳＯＳア
クリルアミドゲル電気泳動させ（文献６３）、平板ゲル
を固定し、乾燥し、Ｘ線螢光測定した（文献６４．第１
図参照）。

Ｅ、１．Ｃ，メツセンジャーＲＮＡの単離及びサイズ分
画 メラノーマ輻胞培養物から得た全ＲＮＡを、Ｗａｒｄ　
ｅｔ　ａｔ、の方法（文献５５）を準用して抽出した。

ａ胞を遠心によりペレットにし、次に１０１１１ＭのＮ
ａ　Ｃ１、Ｔｏ　ＩＱＭのトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７
，５）つ 遠心して核をベレット化した。全ＲＮＡを含む上清を多
数回のフェノール／クロロホルム抽出により更に精製し
た。水相を０，２ＭＮａＣｌ溶液にし、次に２倍容のエ
タノールを添加して全ＲＮＡを沈澱させた。オリゴ−ｄ
Ｔセルロースクロマトグラフィーを用い、全ＲＮＡ調製
物からｌＲＮＡを′＃を製した（文１５４）　、　曲型
的な収量としては、１０（ｌの培養メラノーマ細胞から
５乃至１　ｏＩｍｇの全ｒ（ＮＡ及び５０乃至２００μ
０のポリ（Ａ）プラスＩＩＩＲＮ　Ａが１ｇられた。

尿素−アガロースゲル泪気泳動を用いてポリＡ＋ｍＲＮ
Ａ　（２００μ＋１　）　　（文Ｍ５６）の分画を行な
った。　　１．７５％９アガロース、０−０２５Ｍのク
エン酸ナトリウム（ＤＨ３，８）及び６Ｍの尿素から成
る平板アガロースゲル（文献５１及び５８）を用いた。

電気泳動は２５ミリアンペア、４℃で７時間実施し、次
にゲルをカミソリの刃で分割した。各スライスを７０℃
で融解し、フェノールで２回、クロロホルムで１回抽出
した。次に両分をエタノール沈澱し、引続いてイヌのス
イ臓ミクロソーム（文献６１）を補充したウサギ網状赤
血球ライゼート系（３ｅｔｈｃｓｄａ　Ｒｅ５ｃａｒｃ
ｈ　１−ａｂ、、文献５９及び６０）中ｉｎ　Ｖｉｔｒ
Ｏで、以下の如く翻訳してアッセイを実施した。２５　
ｍＭの１−ＩＥＰＥＳ　（Ｎ、２−ヒドロキシエヂルピ
ベラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸緩衝液）　、４８
．３　ｍＭの塩化カリウム、１０　ｍＭのリン酸りレア
ヂン、各５０１１１Ｍの１９Ｆｌｉのアミノ酸、１．１
　ｍＭの塩化マグネシウム、１１３．６　ｍＭのＥＤＴ
△、０．１６ＦｌｉＭのジチオスレイトール、８．３ｍ
Ｍのヘミン、１１３．、Ｇμσ／１のクレアチンキナー
ゼ、０．３３１１Ｍ７の塩化カルシウム、０．６６ｍＭ
のＥＧＴＡ　（エチレングリコール−ビス−（β−アミ
ノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラ酢酸緩衝
液）及び２３．３　＋ｎｊｙｌの塩化ナトリウムを含む
最終容母３０μｍの溶液中で２５μＣ１の［３５Ｓ］−
メチオニン及び５００ｎｇの各ゲルスライスＲＮＡを用
いてｖＡ訳した。

３０℃で９０分間インキュベートした。リポソーム（文
献６１）を除去ずべくＥＤＴＡを用いて粗ミクロソーム
から［Ｊしたイヌのスイ臓ミクロソーム膜を、文献６２
に記載の如くヌクレオチドで処理し、Ｑ終濃度７Ａ２６
ｏ　ユニット／ｆｆｌ＋で翻訳混合物中に存在させた。

翻訳産物又は免疫沈降翻訳産物を、文献６３に記載の如
く、ドデシル硫酸ナトリウム中の１０％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動にか（ブて解析した。未染色の平板ゲ
ルを固定し、乾燥して螢光測定したく文献６４）。

各ゲル画分から得られた翻訳産物をウサギの抗ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子特異的１ｏＧで免疫沈降さ
せた。主な免疫沈降ポリペプチドバンドは、分子旦約６
３，０００ダルトンのＲＮＡ画分Ｎ００７及び８（２１
乃至２４３の移動度）の翻訳産物中に見られた。免疫沈
降の際に免疫前１ｑＧを使用すると前記のバンドが見ら
れなかった。このことは、これらのポリペプチドが組織
プラスミノーゲン活性化因子特異的であることを意味す
る。

５μｇのゲル分画＋１１ＲＮＡ（ゲルスライス７のｍＲ
Ｎ　Ａ　）を使用し、標準法（文献５２．６５及ヒ６６
）で二重鎖、ＣＤＮＡを調製した。ｃ［）　Ｎ　Ａを６
％ポリアクリルアミドゲルでサイズ分画し、３５０　ｂ
ｐより長いＣＤＮＡ　（１２５ｎｇ）を電気溶出した。

ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ
（文献６７）を用いて３０ｎｇのｃＤＮＡにデオキシ（
Ｃ）残基をつなぎ、同様に已肚工部位にデオキシ（Ｇ）
残基（文献６７）を末端に結合したプラスミドＤＢＲ３
２２（文献６８）　３００ｎＯとアニールした。

アニールした混合物を次に３．ｃｏｌｉ　　Ｋ１２株２
９４（ＡＴＣＣＮｏ、３１４４６　）に形質転換し、得
られ′たテトラサイクリン耐性コロニーを、５μ（１／
ｍｌのテトラサイクリン含有し一ブロス（文献９３）を
入れたマイクロタイタープレートの個々のウェルに接種
した。４６００個の形質転換株のｃＤ　Ｎ　Ａライブラ
リーをニトロセルロースフィルター上で増殖させ、各コ
ロニーのＤＮＡをフィルターに固定した（文献６９）。

８種のデオキシオリゴヌクレオチドｄＴＣ（Ａ）ＣＡ（
Ａ）ＴＡ（’）ＴＣＣＣＡＧ　　　　　　　　Ｇ　　　
　　　　　　Ｔを、４種の１４ヌクレオチド体の２種の
プール中で固相ホスホトリエステル法（文献５１）によ
って化学的に合成した。　Ｐ−標識プローブを前記８種
の１４ヌクレオチド体（文献５２）のプールからＷＭし
た。４６００個の形質転換株を含有するフィルターのセ
ットを、リン酸ナトリウム（ｐｌ−Ｉ　Ｇ、８）５０　
ｍＭ、５ｘ　ｓ　ｓ　ｃ、超音波処１ｊＪＩＪ−り鞘子
ＤＮＡ１５０μ（１／１１１１．５Ｘデンハルト溶液及
び１０％ホルムアミド中で、前記標識プローブ５Ｘ１０
７ｃ、ｐｏｍ。

とハイブリダイズした。室温に１６時間放置した後、フ
ィルターを室温でｅｘ　ｓ　ｓ　ｃ及び０．１％ＳＤＳ
中で良く洗浄し、次いでＸ−線フイルムに露光した。

Ｅ、１．Ｅ、ＤＮ△ブ１コープの調製 文献１９及び２０に記載の方法で蹟製ヒト組織プラスミ
ノーゲン活性化因子を１５だ。

合成１０−ブの作製の最適領域を見い出ずべく分子を以
下の如く検査した。

タンパクをトリプシン消化し易くするために還元及びカ
ルボ−１＝ジメチル化した。組織プラスミノーゲン活性
化因子２ｍｇのナンブルを先ず０．０１％７ｗｃｃｎ　
８０に対して室温で１晩透析した。凍結乾燥したタンパ
クを次に０．５ｔ３１ｙｌの１〜リス−ＨＣｌ緩衝液（
１）Ｉ−１８，６）、８Ｍの尿素及び５ｍＭのＥＤＴＡ
を含む液１２ｍ１に溶解した。０．１ｍ１（ｒ）β−メ
ルカプｌ〜：［タノールを添加してジスルフィド結合を
還元した。反応は窒素下４５℃で２時間行なった。１．
４Ｍのヨード！’ｉｉＭのＩＮ　　Ｎａ０ｌ−Ｉ溶液１
．０ｍｌを添加して還元ジスルフィドをアルギル化しカ
ルボキシメチル化誘導体を得た。室温に２０分間放置後
、０．０１％ＴｗＯａｎ　８０に対して室温で１８時間
透析して反応を停止し、凍結乾燥した。

得られた凍結乾燥カルボキシメチル化クンバクを　３ｍ
ｌの０．１Ｍリン酸リプトリウム緩衝液　　ｐＨ７，５
）に再度溶解した。トリプシン（ＴＰＣＫ。

Ｌ−１−１−シルアミド−２−フェニルエチルクロロメ
チルケトンで処理したトリプシン）を（１：５０の割合
で）添加し、３７℃で消化した。３時間、６時間及び１
２時間後にサンプル（０，１ｍ１）を取出した。

１２時間後にｉ〜リブシンを再度添加した。２４時間後
にシンブルを凍結して反応を停止し、Ｈｌ）　Ｌ　Ｃに
注入できるまで保存した。ＳＤＳゲルによりサンプルの
消化の程度を測定した。３時間後のリンプルでかずかな
バンドが見られる以外、全てのゲルに変化はなかった。

このことは、２４時間で完全な消化が行なわれ、大ぎい
ペプチドが残存しないことを示ず。

約０．５ｍｌの１ナンブルを２系列操作型の高分解能Ａ
ｌｔｃｘ　　Ｃ−８ウルトラスフエア（ｕｌｔｒａｓｐ
ｈｃｒｅ）５μカラムに注入した。ア１．？１−二１〜
リルの勾配を徐々に与えた（　５分で１乃至５％、１０
０分で５乃至３５％、３０分で３５乃至５０％）。２系
列操作のうちの１系列の探作で溶出液を２つの波長（２
１０ｎｍ及び２８０ｎｍ　）でモニターした。２つの波
長での吸収比を用いてトリプトファンを含むペプチドを
検出し　１こ　。

最も多くのトリプトファンを含むと思われるペプチドピ
ーク、又は他の理由で有用と考えられたペプチドピーク
の配列決定を最初に行なった。これににり大部分の１−
リブトフ７ンの周辺の配列を決定しくｑた。約２５個の
最良と思われるペプチドピークの配列決定後、−列に並
べた全部の配列データをプールして組織プラスミノーゲ
ン話性化因子の一次構造の予備：［デルが得られた。、
このデータ。

及びモデルからいくつかの可能なプローブの位置を決定
した。

ｎ　７ｔ ５μ（＋／＋０１のテトラ゛リイクリンを含むＬ［３（
文献９３）を入れたマイクロタイタープレートの各ウェ
ルにコロニーを１個ずつ接種し、７％までＤＭＳＯを添
加して一２０℃に保存した。コロニーライブラリーの２
個のコピーをニトロセルロースフィルター上で増殖させ
、各コロニーから得たＤＮＡをＱ　ｒｕｎｓｔｅｉｎ　
　Ｈ０（ＪｎｅＳＳ法（文献６９）でフィルターに固定
した。

３２Ｐ−標識−ｒｃ　（：＞　ＧＡ　＜合）　ＴＡ　（
寵ＴＣＣＣＡプローブを、前記の如く１合成オリゴマー
から調製した（前記（Ｗ−Ｅ−Ｙ−Ｃ−Ｄ）１４ヌクレ
オチド体プール）。５０　ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｄ
Ｉ−１６，８）、５ＸＳＳＣ（文献８０ン、１５０μＯ
／ｍｌの超音波処理サケ***ＤＮＡ、５ｘデンハルト溶
液（文Ｍ８５）及び１０％ホルムアミド中、４．６００
個の形質転換株を含むフィルターを、空温で２時間ブレ
ハイブリダイズし、次に同じ溶液中で５０Ｘ　１０　　
カラ２８フ分の標識プローブとハイブリダイズした。空
温で　１晩インキユベートし、フィルターをｓｘ　ｓ　
ｓ　ｃ及び０．１％ＳＤＳ中至温で３０分間３回洗浄し
、２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで１回洗浄し、次にＤ　ｕｏｏｎｔ
　Ｌ　１ａｈｔｎｉｎａ　　Ｐ　Ｉｕｓ増感スクリーン
でＫ　ｏｄａｋ　　Ｘ　Ｒ−５Ｘ線フィルムに１６時間
露光した。

ポジティブなハイブリダイゼーション反応を示した１２
個のコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した（文献１
１）。次に、断片をＭ１３ベクターｍｐ７（文献７３）
中でサブクローン化した後、クローンから（ｑたＣＤ　
Ｎ　Ａインサートの配列を、ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ法（文献７２）及びＭ　ａｘａｍ　　Ｇ　１ｌ
ｂａｒｔ化学法（文献７４）により決定した。第３図は
、ポジティブな組織プラスミノーゲン活性化因子クロー
ンのハイブリダイゼーションパターンを示すフィルター
Ｎ　Ｏ，２５の図である。コロニー２５Ｅ１０中のＣＤ
ＮＡインサートのアミノ酸配列と、精製組織プラスミノ
ーゲン活性化因子から得られたベプヂド配列（前記）と
の比較、及びＥ、ｃｏｌｉ中で産生される発現産物（詳
細は後記）とから、このｃＤ　Ｎ　Ａインサートが組織
プラスミノーゲン活性化因子をコードづるＤＮＡである
ことが判明した。

プラスミドＯＰ　Ａ　２５Ｅ　１０のＣＤＮ△インザー
ｊへは、（第５図に示ずようにヌクレオチド２４３から
始まる）　　２３０４　ｂｐの長さを右しており、その
最良のオーブンリーディングフレームは５０８個のアミ
ノ酸からなるタンパク（ＭＷ　５６，７５Ｇ　）をコー
ドしており、７４５　ｂｐの３′非翻訳領域を含む。こ
のｃＤ　Ｎ　ＡクローンにはＮ−末端をコードする配列
が欠如している。

第６図に示ず如く、５０μｇのｌ）Ｐ　Ａ　２５Ｅ　１
０　（前記）をＰｓｔ工で消化し、６％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で３７６　ｂｐの断片を単離した。こ
の断片的３μｇを電気溶出でゲルから単離し、３０ユニ
ツトのＤｄ（３Ｉを用いて３７℃で１時間消化し、フェ
ノール−クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱させた
。これによりＤｄＣＩ粘着末端が得られる。

反応混合物に５ユニツトのＤＮＡポリメラーゼエ（Ｋ　
Ｉｃｎｏｗ断片）並びに各０．１１１１ＭのｄΔＴＰ。

ｄＣＴ　Ｐ　、　　ｄＧ　Ｔ　Ｐ及びｄｌ−ＴＰを添加
し４℃で８時間インキュベー１−シて、前記の１）ｄａ
Ｉ粘着末端を伸ばして平滑末端とした。フェノール−ク
ロロホルム抽出後、ＤＮＡを１５ユニツ１−のＮａｒＩ
で２時間消化し、反応混合物を６％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動にか（）た。約０．５μＱの所望の１２５
　ｂｐ平滑末端−１肛１断片を回収した。この断片は、
成熟全長組織プラスミノーゲン活性化因子タンパクのア
ミノ酸のうちＮ　Ｏ，Ｇ９からＮｏ、１１０までのアミ
ノ酸をコードしている。

１Ｂ４Ｓ　ｂｐ座肛■−艶旺■断片を単離するために、
３０μｇのＤＰ　Ａ　２５Ｅ　１０を３０ユニツトの凰
旺工及び３５ユニツトの１旺■により３７℃で２時間消
化し、反応混合物を６％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけた。約６μ０の所望のｌＧ４５　ｂｐ　Ｎ　ａ
ｒ■−３ａｌ■断片を回収した。

プラスミドｐΔＲＩ　ｅｘｓｒｃはプラスミドｐＳ　Ｒ
Ｃｅｘ１６　（文ＹＩＸ７９）の誘導体であり、後者に
於いては、ｔｒｐプロモーターに近位で５ＲＣＩ伝子に
遠位のＥＣｏＲＩ部位がＤＮＡポリメラーゼエ（文献２
８）で修復することにより除去されており、ホスホ１−
リエステル法（文献７５）で合成された自己相補的オリ
ゴデオキシヌクレオチド　ＡＡＴＴΔ丁ＧΔΔ１’　Ｔ
　ＣＡ　ＴがＸｂａＩ部位の直ぐ隣りの残存ｌＥＣ０Ｒ
Ｉ部位に挿入されている。２０μＱのｐΔＲＩ　Ｓ　Ｒ
ＣをＥｃｏＲＩで完全に消化し、フェノール−クロロホ
ルム抽出し、エタノール沈澱した。次に、２５１１１Ｍ
の酢酸ナトリウム（１）Ｉ−１４，６）、１ｍＭのＺｎ
０Ｉ：ｚ　　及び０．３ＭのＮａＣｌの中でプラスミド
を１００ユニツトのヌクレアーゼＳ１で１６℃、３０分
間消化し、配列ＡＴＧをもつ平滑末端を形成シた。フェ
ノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱後、ＤＮ
Ａを［３μｍｌ−ＩＩで消化し、６％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ、大ぎい（４，３００ｂＥｌ）ベ
クター断片を電気溶出で回収した。

０．２μ（Ｊのベクター、０．０６１１０の１２５　ｂ
ｐ平滑末端−凡１Ｊ断片及び０．６μｇの１０４５　ｂ
ｐ胆ニ一旦（ＩＩＩＩ断片とを、１０ユニツトのＴ４Ｄ
Ｎ△リガーゼで、室温で１時間を要して互いに結合して
発現プラスミドを構築し、旦−、ｃｏｌｉ　２９４株（
ΔＴ　ＣＣＮ　ｏ、３１４４６　）をアンピシリン耐性
に形質転換すべく使用した。プラスミドＤＮＡを２６個
のコロニーから調製しＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩｒＷ化し
た。そのうち１２１１Ｍ＋のプラスミドが所望の４１５
ｂｐ凰匝ニ一旦阻Ｒ１断片及び４７２　ｂｐ旦阻ＲＩ−
断片を含んでいた。ＤＮＡの配列解析により、これらの
プラスミドのいくつかが、出発点であるアミノＭ　Ｎ　
Ｏ，６９（セリン）に対して正しく配首されたＡＴＧ開
始コドンを有することが確認された。

これらのプラス、ミドの１つ、ｐΔＲＩＰＡ’を試験し
たところ、所望の組織プラスミノーゲン活性化因子を産
生じていた（第７図）。

Ｅ、１．Ｈ，全長組織プラスミノ−ｌ°ン活性化囚因子
Ｄ　Ｎ　Ａ ０．４μＱの合成オリゴヌクレオヂド　５　ＴＴＣＴＧ
ＡＧＣＡＣΔＧＧＧＣＧ３’（これはｔ−ＰＡｍＲＮ　
Ａのヌクレオチド２５６−２７１に相補的である）を合
成しく文献５１）、これをプライマーとして使用し、標
準法（文献６５及び６Ｇ）により、７．５μ９ノケル画
分Ｎｏ、８　（Ｄ　ｍＲＮＡ　（前記）カラ、二重鎖ｃ
Ｄ　Ｎ　Ａを調製した。ｃＤ　Ｎ　Ａを６％ポリアクリ
ルアミドゲルでサイズ分画した。　３００　ｂｐより大
ぎいサイズ画分（３（ｉｎｇ　）を電気溶出した。ター
ミナルデ第４ニジシチジルトランスフェラーゼ（文献６
７）ヲ用いて５ｎｇのＣＤＮＡにデオキシ（Ｃ）残基を
つなぎ、同様にＰｓｔＩ部位（文献６７）にデオキシ（
Ｇ）残基をつないだ５０．ｎｇのプラスミドｐＢ　Ｒ３
２２（文献６８）とアニールした。次にアニ□−ルした
混合物を旦、ｃｏｌｔ　　Ｋ１２株２９４に形質転換し
た。約１，５００個の形質転換株が１！７られた。

ｂ）ヒトゲノムＤＮＡのサザンハイプリ　イゼーション ＣＤ　Ｎ　Ａのブライミング反応が、クローンｐＰ　Ａ
　２５Ｅ　１０のＮ−末端から１３　ｂｐとハイブリダ
イズした合成断片を用いて行なわれたので、（１６ヌク
レオチド体配列を含む）この２９　ｂｐ領領域は、ｃＤ
Ｎ△クローンをスクリーニングするための適当な制限断
片は得られなかった。従って、Ｎ−末端組織プラスミノ
ーゲン活性化因子をコードしている配列を含みブライマ
ーぐ伸延したｃＤ　Ｎ　Ａクローンを同定するためには
、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子ゲノムのクロー
ン（文献７６）を単゛離することが必要であった。

このプロセスの第１段階では、唯一の相ｎ１紺織プラス
ミノーゲン活性化囚子の遺伝子がヒトゲノムＤＮＡ中に
存在することをＭ１認した。このためにサザンハイプリ
ダイゼーションを実施した。この方法に於いては、５μ
ｇの高分子Ｄヒトリンパ球ＤＮＡ　（文献８０の如く調
Ｍ）を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全に消化し、
１．０％アガロースゲル電気泳動（文献８１）にかけ、
ニトロセルロースフィルターにブロン１−シた（文献７
７）。

ｃＤＮ△クローンｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０のＣＤ　Ｎ　
Ａインサート（２３２ｂｐ凪■−圧肚■断片）の５′末
端から７１〕−標識ＤＮＡプローブを調製しく文献７６
）、前記ニトロセルロースフィルターとハイプリダイズ
した（文献８２）。３５Ｘ１０　　カワ２１〜フ分のプ
ローブを４０時間ハイブリダイズし次に洗浄した（文献
８２参照）。２種のエンドヌクレアーゼ消化パターンか
ら唯一のハイブリダイズＤＮＡ断片二比旺Ｈ（５，７Ｋ
ｂｐ）及び匡Ｉｆ　（４，２Ｋｂｐ）が１７られた。２
種のハイブリダイズＤＮＡ断片が１組ｃ　ｌ［（５，１
）（ｂｐ及び４．３Ｋ　Ｉ）Ｉ））で観察された。

両者を総合したデータによれば、ヒトゲノム中に唯一の
組織プラスミノーゲン活性化因子が存在すること、及び
該遺伝子が少なくとも１個の介在遺伝子を有することが
判明した。

１ｆｌｌプラスミノーゲン活性化因子道伝子を担うλフ
アージ組換体を同定づ°るために、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子クローン１ｌＰＡ　２５Ｅ　１０から調製
された放射性プローブとのヌクレオチド相同性を検出す
る方法を用いた。１００万個の組換λファージを１０，
０ＯＯｐｒｕ　／　１５ｃｍプレートの密度でＤＰ　５
０５ＩＪＤ　、Ｆを宿主としてプレートアウトし、ｓ　
ｅｎｔｏｎ及び［）ａｖｉｓの方法（文献７８）１．：
ヨリ、各プレート毎にニトロセルロースフィルターレプ
リカを調製した。標準法（文献８３）を使用し、プラス
ミドｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０の５′末端から３４　ｂＤ
に位置す＊２３２．ｂｐ江エー二扛工断片を用いて、　
Ｐ−標ｌＤＮＡプローブを調製した。５０ＩＩＩＭのリ
ン酸ナトリウム（ＩＩＨ６，５）、５ＸＳＳＧ、、（文
献７７）、０．０５ｍａ　／ｍｌの超音波処理サケ***
ＤＮＡ、５Ｘデンハルト溶液（文献８４）及び５′０％
ホルムアミド中で、各ニトロセルロースフィルターを４
２℃で２時間ブレハイブリダイズしこ次に、１０％デキ
ストラン＠酸ナトリウム（文献８５）を含む同じ澄液中
で、５０Ｘ１０６力ウント／分の標識プローブとハイブ
リダイズした。４２℃で　１晩インキユベートし、フィ
ルターを０．２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ及び０．１％ＳＤＳ中５
０℃、３０分間で４回洗浄し、２Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで室温
で１回洗浄し、次に［）ｕｐｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ増感
スクリーンでＸＲ−５Ｘ−線フイルムに１晩露光した。

全部で１９個のクローンがプローブとハイブリダイズし
た。６個の組換体から文献８６に記載の方法でファージ
ＤＮＡをｌ［した。コロニースクリーニング用のｐｖｕ
［断片を調製するために、これらのポジティブなハイブ
リダイゼーションを示す組換体の中からλクローンＣを
選択した。３０ｐｇのＤＮＡをＰｖｕＩ［を用いて３１
℃で１時間消化し　１．０％アガロースゲル電気泳動に
かけた。組織プラスミノーゲン活性化因子をコードする
配列を含＋ｌＴすることが既に判明した４、２Ｋ　ｂｐ
の断片を電気溶出して精製した。後述の如きコロニーハ
イブリダイピージョンを行なうために標準法（文献８３
）を用いて５ｌｐ−標識プローブをｒＡ製した。

ｄ）５′−組織プラスミノーゲン活性化因子配列のコロ
ニーをプレートからニトロセルロースフィルターに移し
て壜殖させ、各コロニーから得たＤＮＡをＧ　ｒｕｎｓ
ｔｅｉｎ　−Ｈｏａｎｅｓｓ法（文献６９）でフィルタ
ーに固定した。単離した粗織プラスミノーゲン活性化因
子λゲノムのクローンから４．２Ｋｂ。

ｐｖｕＪ［断片をプライムする仔牛胸腺（文献８３）に
よって　Ｐ−標識プローブを製造した。１，５００個の
形質転換株を含むフィルターを１１２Ｘ１０６ｃｐｍの
３２ｐ−ゲノムＰｖｕＩ［断片とハイブリダイズした。

Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ｅｔ　ａｔ、により記載された条件
（文献８２）を用いてハイブリダイゼーションを１６時
間継続した。フィルターをよく洗い次にＯｕｐｏｎｔｌ
　ｉｇｈｔｎｉｎ（１−Ｐ　ｌｕｓ増感スクリーンと共
にＫ　ｏｄａｋＸＲ−５Ｘ−線フィルムに１６乃至４８
時間露光した。

１８個のコロニーが明らかにゲノムプローブとハイブリ
ダイズした。プラスミドＤＮＡをこれらのコロニーの各
々から単離し、ニトロセルロースフィルターに固定し、
最初のブライミング反応に使用した３２ｐ−標識合成オ
リゴヌクレオチド（１６ヌクレオチド体）とハイブリダ
イズした。１８個のクローンのうちの７個がキナーゼに
よって活性化した１６ヌクレオチド体とハイブリダイズ
した。ｍ１３ベクタ−ｍｐ７　　（文献７３）中での断
片のサブクローン化後に配列を解析すると、１種類のり
Ｏ−ン（１）ＰＡ１７）が１１織プラスミノーゲン活性
化因子の正しい５′末端領域、シグナルリーダー配列及
び８４　ｂｌ）　５’非翻訳領域を含むことが判明した
。

ｏＰ　Ａ　１７のＣＤ　Ｎ　Ａインサートの良さは２７
１　ｂｐである。これはその合成にブライマーとして使
用したヘキザデ力ヌクレオチド配列を含んでおり、これ
によりそのＤＮＡ配列をｐＰ　Ａ　２５Ｅ　１０の配列
と合わばて整列することが可能になった。これら２種の
ｃＤ　Ｎ　ＡクローンｐＰ△２５Ｅ１０及びＩｌｒ’Ａ
１７から、ヌクレオチド配列及びそれに対応するｔ−ｐ
Δのアミノ酸配列を決定した（第５図）。２種のクロー
ン１ｌＰＡ２５ε１０及びｐＰ　Ａ　１７から、第５図
の完全ヌクレオチド配列及び全長組織プラスミノーゲン
活性化因子クローンの制限パターン（第４図）を決定し
た。

完全な２５３０　ｂｐ　ｃＤ　Ｎ　Ａ配列は単一のオー
ブンリーディングフレームを含ｌυでおり、これはヌク
レオチド８５〜８７のＡＴＧコドンで始まっている。

この△Ｔ　Ｇを合めて５６２個のコドンがあり、その後
ヌクレオチド１７７１〜１７７３にＴＧＡ停止トリブレ
ットがある。このＡ　Ｔ　Ｇは、恐らく、それが最初に
遭遇される場合、翻訳開始部位として作用し、このＡＴ
Ｇの前方にはヌクレオチド４〜Ｇの位置に同位相（ｉｎ
　ｐｈａｓｅ）で停止コドンがある。アミノｌＮｏ、１
と印したセリンは、精製メラノーマ細胞ｔ−ＰＡのＮＨ
２７末端の配列決定に基づいている。このセリンの前に
３５個のアミノ酸があり、このうちＮＨ−末端の２０〜
２３個は、分泌ｔ−ＰＡが有する疎水性シグナルペプチ
ドを構成していると思われる。残りの１２〜１５個の親
水性アミノ酸は成熟ｔ−ＰＡの第一アミノ酸の直前にあ
り、血清アルアミンに見られるものに類似する゛プロ″
配グーを構成している。３′−非翻訳領域は７５９個の
ヌクレオチドから成り、ヘキサヌクレオチドＡＡＴＡＡ
Ａ（位ｆｆｉ　２４９６〜２５０１　）を含んである。

このヘキサヌクレオチドは、多くの真核生物ｒＡＲＮ　
Ａのポリアデニル化部位に先行する。

天然の組織プラスミノーゲン活性化因子の分子は、３５
個のシスティン残基を有しており、従って１７個のジス
ルフィド結合により安定化される可能性を有する。第１
２図に示した概略口は、他のセリンプロテアーゼとの相
同性に基いて構成される。

４個の可能なＮ−グリコジル化部位が・あり、このうち
３個はクリングル領域のａｓｎ工□、　　、　　ａｓｎ
工、４゜ａｓｎ２□８　に存在しており、他の可能な部
位はＬｆＪｉ領域のａｓｎ　　　に存在している。構造
上のオリゴ糖リガンドの違いが種々の分子形態（分子量
６５．０００及び６３，０００の秤）の原因である。

アミノ酸分析用のｔ−ＰＡサンプルは、０．１％ＮＨ１
−ＩＧＯに対して充分に透析し減圧乾燥して調製した。

残基を６Ｎ　　ＭＣＩに懸濁し、バイアルを真空密封し
た。加水分解は１１０℃で２４時間実施した。次いで、
得られた加水分解物をＢ　ｅｃｋｍａｎ　　Ｓ　ｙｓｔ
ｅｍ　６３００　　アミノ酸分析器で解析・した。

分子量は、ゲル分析により以下の如く決定した。

Ｌ　ａｅｍｍｌ　ｉの方法（文献６３）を使用してＳＯ
Ｓポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。ゲルは
、１０％アクリルアミド及び０．２７％メチレンビスア
クリルアミドから成っていた。サンプルの還元が必要な
とぎには、メルカプトエタノールの代わりにジチオスレ
イトールを用いて還元し、Ｂｉ。

−Ｒａｄ低分子ｆｆ１ＳＤＳ標準混合物を標準として使
用した。Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、　Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　１１７゜３０７　（１９８１）の方法に従
って銀染色を行なった。

種々の分子ｍを有するｔ−ＰＡを、溶出液としてアルギ
ニンを用いてリジン−セファロース上で分離した。単離
したタンパクは、検出可能な■のＳＤＳゲル電気泳動に
よる交差汚染（ｃｒｏｓｓｃｏｎｔａｎ＋１ｎａｔｉｏ
ｎ　）を含まなかった。各タイプのタンパクを、先ず還
元し、カルボキシメチル化し、前記の如くトリプシン消
化した。この消化生成物を、Ｃｏｎ−Ａ−アガロース（
ｇ　ｉｇｍａ社製）にかけ、０．２Ｍのα−メチルマン
ノシドで溶出した。Ｃｏｎ−へ樹脂に結合しα−メチル
マンノシドで溶出するペプチドを、前記ＨＰＬＣを用い
て解析した。

高分子ｍのｔ−ＰＡは３種の主要なペプチドを含／υで
おり、低分子、ｍのｔ−ＰＡは２種のＣｏｎ−Ａに結合
するペプチドを含／ｖでいた。これらのペプチドをタン
パク質配列分析により同定した。その結果、１）両者の
タイプのｔ−ＰＡで残基１１７及び４４８がグリコジル
化されていること、２）残基１８４が、高分子ｍのタイ
プのｔ−ｒ’Ａではグリコジル化されＣ０ｎ−Ａに結合
するが、低分子分のタイプのｔ−ＰＡは、（グリコジル
化残基１８４を含有し且つ）Ｃｏｎ−Ａに結合するペプ
チドを含んでいないこと、及び、３）残塁２１８のアス
パラギンがグリコジル化されていないようであることが
判明した。

虱韮Ｊ■Ｌ 部分クローンＥＩＰ　Ａ　１７とＯＰ　Ａ　２５Ｅ　１
０との双方に共通の１−１ｈａＩ制限工ンドヌクレアー
ゼ部位を用いることにより、完全コード配列の再構築が
可能であった。アミノ′Ｍ５−２３に対応づ“る５５　
ｂｐＳａｕ３ＡＩ−ＨｈａＩ制限断片をプラスミドｐＰ
　Ａ　１７から単Ｎｔシた。３ａｕ３Δ■制限部位はＪ
ｆｔ定成熟コード配列のコドン４に位置してＪ３す、シ
グナルペプチドをコードする領域を除去すべく使用した
。同様に（アミノ［２４−１１０をコードする）２Ｇ３
　ｂｐｌ−１１＋ａ　Ｉ−ＮシＪ断片をプラスミドｐＰ
△２５Ｅ１０から単離した。アミノ酸１−４のコドンを
再生しＡＴＧ翻訳開始コドンを組込ｌυでＥＣ０ＲＩ粘
着末端を形成する２種の合成デオキシオリゴヌクレオチ
ドを設計した。次に、これら３種の断片を互いに結合し
、アミンＭ　１−１１０をコードする３３８　ｂｐ断片
を形成した。次に該断片及び１）Ｐへ２５Ｅ１０から得
たｌＧ４５　ｂｐたＬ旦Ｂ一旦」１一■断片を、プラス
ミドｐＬｅ　Ｉ　ＦＡｔｒｐ　１０３　　（文献５３）
のＥＯＯＲＩ部位及びＢ（ＩＩＩ［部位の間に結合し、
発現プラスミドｐｔ　−Ｐ　Ａ　ｔｒＤ　１２を調製し
た。ｔｒｐプロモーター、オペレーター及びｔｒｐリー
ダーペプチド（１）　Ｓ　ｈｉｎｅ　−Ｄ　ａｌｏａｒ
ｎｏ配列を含むがリーダーペプチドＡＴＧＩｍ始コドン
（文献５２）を含まないＥ、ｃｏｌｉ　　ｔｒｉ）オペ
ロンの３００　ｂｐ断片の制御下でクローン化ｔ−Ｐ　
Ａ　Ｍ伝子を転写した。

プラスミドｐｔ＝　Ｐ　Ａ　ｔＬＬ１２を含む旦−６皿
　Ｋ１２株　Ｗ３１１０　（Ａ　Ｔ　ＣＣＮ　０．２７
３２５　）を増殖し、線維素溶解能アッセイのための抽
出物を調製した。

組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を測定する１つ
の方法としてフィブリンプレートアッセイ（文献８７）
がある。この方法では、プラスミノーゲン及び線維素を
含むアガロースプレート中でのプラスミンによる線維素
の消化の程度を測定することによってプラスミン生成伍
を測定する。プラスミンはフィブリンプレート中に透明
な溶解ゾーンを形成し、このゾーンの面積をリーンプル
中の組織プラスミノーゲン活性化因子のｍと相関させ得
る。フィブリンプレー１〜アツはイを使用して、ｐｔ−
ＰΔｔｒ１１１２クローンから（ｎた抽出物の組織プラ
スミノーゲン活性化因子の活性を試験すると、透明溶解
ゾーンが明らかである。この線帷累溶解能は抗ｔ−ＰＡ
ＩａＧににつで阻害されるが、免疫前１ａＧ又は抗ウロ
キナーゼＩａＧによっては阻害されない。対照として白
血球インターフェロンプラスミド１）ＬＱ　Ｉ　ＦＡ　
ｔｒｐ　１０３を含む細胞から得られた抽出物について
試験したところ、活性は全く検出されなかった。精製ｔ
−ＰＡについて（ワられた標準曲線によれば、ｉｏ’１
個の細胞当り約２０ユニツトの抽出活性が１募られると
推定し１；する（￥ｉ製ｔ−ＰＡでは、９０，０ＯＯＰ
　Ｉｏｕｏｈユニット＝１ｍｇ）（第１０図）。

Ｅ・１・Ｊ−１乱」也 配列解析はｌ：　ｄｍａｎ分解（文献８３ｂ）に基いて
行なった。サンプルを１３　ｅｃｋｍａｎ　８９０Ｂ又
は８９０Ｃスピンカツプシー、ケンサー（ｓｐｉｎｎｉ
ｎｇ　ｃｕｐｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）のカップに導入した
。カップ内の担体トシテ、ボ！Ｊ７Ｌ’ン”（ボ’！Ｊ
−Ｎ、Ｎ、Ｎ１　。

Ｎ　　−ｒトラメチル−Ｎ−トリメチレンへキサメチレ
ン　ジアンモニウム　ジアセテート）　（文献６３Ｃ）
を使用した。シーケンサ−を寒冷トラップ及びいくつか
のプログラム変化によって変更し、バックグラ、ランド
ビークを低減させた。試薬としては、３　ｅｃｌｖａｎ
’　ｓ　　シーケンスグレード０．１ＭＱ　ｕａｄｒｏ
ｌ！ｆｉ　！ｉ液、フェニルインチオシアネート及びヘ
プタフルオロ酪酸を用いた。

収集したＥ　ｄｆｆｌａｎサイクルをマニュアルに従っ
て２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体に転換した。

１−クロロブタンを窒素下で乾燥した。次いで、１、Ｏ
ＮのＨＣＩ水溶液を２−アニリノ−５−チアゾリノンに
添加し、７０℃で１０分間加熱して３−フェニル−２−
ヂＡヒダントイン（Ｐ　Ｔ　Ｈｇ導体）に転換した。次
に、ＰＴ）ｌ−アミノ酸残基を５０％アＩ？１゛二ｊ・
プル及び水に溶解し、逆相高圧液体クロマトグラフに注
入した。次に、転換バイアル内に導入されシーケン′す
−からのサイクルと同様にして処理された１丁１−（−
アミノ酸の標準混合物の保持時間との比較によって各２
丁１（−アミノ酸を同定した。

ａ、理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の感受性アッセイは、
組織プラスミノーゲン活性化因子が触媒するプラスミノ
ーゲンからプラスミンへの転換をモニターして行なうこ
とができる。プラスミンは色素原岳質アッセイが可能な
酵素である。これらのアッセイは、発色団の１−リペブ
チドのタンパク分解的開裂に基く。開裂速度は、被検プ
ロテアーゼの特異性及び濃度の双方に直接関連する。組
織プラスミノーゲン活性化因子を含む溶液をプラスミノ
ーゲン溶液とインキュベートした後に形成されるプラス
ミンのｍの測定がアッセイのベースとなる。活性化因子
の母が多い程、形成されるプラスミンの最も多い。（）
（ａｂｉ　Ｑｒｏｕｐ、　　Ｉ　ｎｃ、。

Ｇ　ｒｅｃｎｗｉｃｈ、　ＣＴから購入した）色素原基
質５２２５１の１７ｆｌ裂をモニターすることによりプ
ラスミンを測定する。

ｂ１手順 サンプルを（０，０１２ＭのＮａ　Ｃ１を含む０．０５
Ｍのトリス−ＨＣｌ、　Ｉ）Ｈ７，４中の）　　０．７
ｍｃ＋／ｍｌのプラスミノーゲン０．１０ｍ１と混合し
容量を０．１５ｍ１に調整する。混合物を３７℃で１０
分間インキユベートシ、０．３５ｍ１の８２２５１（上
記Ｗｍ液中のｉ、。

１１Ｍ溶液）を添加し、３７℃で反応を３０分間継続す
る。氷酢酸（２５μｍ）を添加して反応を停止さじる。

サンプルを遠心し４０５ｎｍでの吸収を測定づる。

標準ウロキナーゼ溶液との比較により活性最が定ｍでき
る。溶液にフィブリノーゲン（０，２ｍ０）を添加し、
これにより全長組織プラスミノーゲン活性化因子を検出
すべくアッセイ条件を変更した。

フィブリノーゲンは検出される１１１ｗｔプラスミノー
ゲン活性化因子の活性を刺激し、従って活性レベルをや
や上界させる。活性をＰ　ｔｏｕｇｈユニツ１−で記録
した。９０，０ＯＯＰ　ｌａｕｇｈユニツｈは、精製組
織プラスミノーゲン活性化因子１ｍｇが示す活性に等し
い。

２、プラスミン形成の間接アッセイ ａ、理論 組織プラスミノーゲン活性化因子の活性の感受性アッセ
イが開発されたく文献８７）。このアッセイは、線維素
及びプラスミノーゲンを合む寒天プレート中でのプラス
ミンにＪ：る線帷素消化の程度を測定することによって
プラスミン形成を決定することに基く。プラスミンはフ
ィブリンプレー１〜中に透明な溶解ゾーンを形成する。

この溶解ゾーンの面積をサンプル中の組織プラスミノー
ゲン活性化因子の缶と相関させ（７る。

−ＬＬ Ｇｒａｎｅｌｌｉ−ｐ　１ｐｏｒｎｏ及びＲｅ１ｃｈの
方法（文献８７）に準じて、プレートを３７℃で３．５
時間インキュベートして溶解ゾーンを測定した。標準ウ
ロキナーゼ溶液との比較によって定岱をおこなった。

２０μ０／１のアンピシリンを含む５１のＬＢ増殖培地
を入れた試験管にプラスミド ｐΔＲＩ　ＰＡ”を含むＥ、ｃｏｌｉコロニーを接種し
た。細胞を３７℃で１晩増殖させた。この培養物の゛リ
ーンプルを、２０μｇ／ｌｌ１１のアンピシリンを含む
３００ｍ　ｌのＭ９培地にｉ：ｉｏｏで希釈した。細胞
を３７℃の振盪フラスコ中で４時［１ｕ増殖したところ
、５５０ｎｍの吸光度が０．４１９になった。トリブト
フッ１ンに類似のインドールアクリル酸を濃度３０μｇ
／ｍ１まで添加した。細胞を９０分間インキュベートし
たところ、５５０ｎｍの吸光度が０．６２８になった。

遠心により細胞を回収し、０．０１　ＭのＥＤＴＡを含
む０．８ｍｌの０．０１　Ｍ　トリス（１）Ｈ８，０）
に再懸濁ざＵた。得られた懸濁液を空温で１８時間急激
に撹拌した。サンプルを遠心し、上滑を用いて組織プラ
スミノーゲン活性化因子の活性をアッセイした。

ｐｔ−Ｐ　Ａ　ｔｒｉ）　１２の発現に関しては、Ｅ、
１．Ａ。

第１０図の説明に於ける詳細な記載を参照されたい。

２、活性検出 表１および表２は、アッセイに用いた［、Ｃ０Ｉｉ抽出
物の各々が示したプラスミノーゲンの活性化の結果を示
ず。活性はプラスミノーゲンの存在に依存して発生ずる
（表１参照）。この活性は、つｉナギの免疫前血清の影
響を受【プないが、蹟装メラノーマ細胞から誘導された
ＩＩＨプラスミノーゲン活性化囚子因子献８８）に対す
る抗血清により顕著に阻害される（表１及び表２参照）
。これは、旦。

ｃｏｌｉ抽出物がプラスミノーゲンを活性化する活性を
生成し、この活性が組織プラスミノーゲン活性化因子１
対プる抗体ににって阻害されることを示９°。

第７図は線賄：累溶解能に関するフィブリンプレートア
ッセイの結果を示す。中央の縦列の下から」、に向かっ
て濃度０．２４．０，１４．０．１０．０．０５及び０
　、０２　　ｒ’　１ｏｕｖ、ｈ　ユニーｊトて標ｉｆ
、ｆ（蛍のウロキナーゼを添加した。右側の縦列は、各
つ工ルに同■の酵素を添加した天然組織プラスミノーゲ
ン活性化因子のサンプルであり、同縦列の下から上に向
って組織プラスミノーゲン活性化因子、組れ゛１プラス
ミノーゲン活性化因子＋免疫ｉ′Ｉζｊ＋ｆ＋を清、組
織プラスミノーゲン活性化因子十組織プラスミノーゲン
活性化因子抗体が各ウェルに収容されている。左側の縦
列の各ウェルは８　μＱの組換組織プラスミノーゲン活
性化因子図、刈旦抽出物を収容しており、下から上へ向
かって、第１ウエルは抽出物のみ、第２ウエルは免疫的
血清か添加された抽出物及び第３ウエルは組織プラスミ
ノーゲン活性化因子抗体が添加された抽出物をそれぞれ
含む。免疫的血清が天然及び組換組織プラスミノーゲン
活性化因子に影響を与えないこと、並びに組織プラスミ
ノーゲン活性化因子抗体が天然抽出物及びＥ、ｃｏｌｉ
抽出物の双方の活性をｌ１ｆｔ害することが明らかであ
る。ウロキナーゼ１５Ｔｑ　ｆｊ、ｊｌ、に基いて、抽
出物は２　、５　　Ｐ　ｌｏｕｇｈユニット／ｍｌより
やや少ない活性を含有している。この値は表１の１．３
Ｐ　ｌｏｕｇｈユニット／ｎ＋１より有利である。

以下の表１及び表２は前記のＪＥ、１．に、１．ｈに記
載の如〈実施されたアッセイの結果を示４゛。

表１ｐΔＲＩ　ＰＡ”を含むｌ：、ｃｏｌｉ培養抽出物
パーセント　　　計算価 抽出物 （プラスミノーゲン非含有）　　　０．０４３　　　（
０）抽出物　　　　　　　　　　　　０．４５１　　（
１００）　　　　　　　１．３抽出物十免疫前血清　　
　　　０．４７７　　１０６　　　　　　　Ｌ４抽出物
＋抗ｔ−ＰＡ抗体　　　　０．０７９　　　９注）１．
得られた値からブランク（０，０４３）を減算し抽出物
で得られた値で除算したパーセント活性。

表２　０ｔ−ＰＡｔｒｐ　１２のＥ、ｃｏｌｉ培養抽出
物によるプラスミノーゲン活性化 サンプル　　　　　　　　Ａ　　　　　　　　パーセン
ト活性抽出物　　　　　　　　　　　　　０．６５７　
　　　　　　　（１００）抽出物＋免疫性血清　　　　
　　０．６６５　　　　　　　　１０１抽出物＋抗ｔ−
ＰΔ抗体　　　　　０．０５９　　　　　　　　　９第
１０図は、組織プラスミノーゲン活性化因子発現プラス
ミドを含む、ξ−０皿のＩＯＬ発酵Ｊａ益物からの抽出
物を用いて実施したフィブリンブレートアッセイの結果
を示ず。組織プラスミノーゲン活性化因子を含む抽出物
の線維素溶解能が第１０図のウェルａで示される。この
線Ｎ素溶解能は抗ｔ−ＰＡ　　ＩｏＧ（ウェルＣ）にＪ
：り阻害されるが免疫前ＩＣＪＧ　（ウェルｂ）又は抗
ウロキナーゼＩ（ｌ　Ｇ　（ウェルｄ）では阻害されな
い。また、対照としての白血球インターフェロンプラス
ミドｐＬｃ　Ｉ　ＦＡ　　ｔｒｐ１０３（ウニ／ｌｚｔ
＋）を含む細胞で調製された抽出物では活性が全く検出
されない。

ウェルｅ１ウェルｒ及びウェルｇはそれぞれ０．２．０
　］及び００２ユニツ！・の精製されたメラノーマｔ−
ＰＡを含む。

Ｅ、２　　ＭＴＸに対する結合親和　の低いＤ　Ｉ−Ｉ
　Ｆ　Ｒタンパクを使用するｔ−ＰＡの産生 ＋Ｅ、２．Ａ、ベクターの構築 ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｌ−ＰＡ）をコ
ードする配列をＭ　ｉ’　Ｘに対する結合？見和力の低
い突然変異１）　Ｉ−Ｔ　ＦＲを含む発現プラスミドに
以下の手順で挿入する（第１１図）。

オーバーラツプするｔ−ＰＡプラスミド、１）ＰＡ２５
Ｅ１０．　１ｌＰＡ１７及ヒＩ）Δｆｌ　Ｉ　ＰＡ’　
　（＋）ｒｉ記）から３種の断片を以下の如く調製した
。プラスミドｐＰ　Ａ　１７を工蛙工で消化し、Ｋ　Ｉ
ｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼエを用いて充填し、Ｐ　Ｓ
ｔＩで再度切断した。その結果生成された５末端ｔ−Ｐ
　Ａ配列を含む約２００　ｂｐの断片を単離した。、第
２のｔ−ＰＡ断片を得るために、ｐΔＲＩ　ＰＡ’をＰ
ＳｔＩ及び［ａｔ工で消化し、約３１Ｑｂｐの断片を単
離した。第３のｔ−ＰΔ断片を得るために、ｐＰ　Ａ　
２５Ｅ　１０を辻シＪ及び江■で消化し、約１（＋４５
　ｂｐの断片を単離した。最後の断片はｔ−ＰＡをコー
ドする領域の殆んどを含んでおり更にいくらかの３°非
翻訳配列を含んでいる。

ＨＢ　Ｖ表面抗原を発現するプラスミドｐＥ３４２（ｐ
ｉ〜１Ｂｓ３４８−［Ｅとら指称される）は、１つ８３
年３月９日付で公開された！、ｅｖｉｎｓｏｎ　ｅＬ　
ａｌ。

約すれば、サルウィルスＳＶ４０のオリジンを単離スル
タメニ、ＳＶ４０　　ＤＮＡを）−１ｉｎｄｌ［［で消
化してコンバーター＜ＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を添加し
てｌ−１ｉｎｄｌｆｆ末端をＥｃｏＲＩ末端に変換した
。このＤＮＡをＰｖｕＩｒで切断しＲＩクリンカを添加
した。ＥＣ０ＲＩで消化後、オリジンを含む３４８　ｂ
ｐ断片をポリアクリルアミドゲルＮ　’Ａ泳動及び電気
溶出で単離し、１）ＢＲ３２２中でクローン化した。

１−ＩＢＭ　（Ａｎｉｍａｌ　Ｖｉｒｕｓ　　Ｇｅｎｃ
ｔｉｃｓ、　（Ｏｈ、５　）Ａｃａｄ、Ｐｒａｓｓ、　
Ｎ、　Ｙ、　　（１９８０）　）のＥＣ０ＲＩ及び［３
ｏ１ｆｆによる消化で得られた１９８６　ｂｐ　１１７
ｉ片（これはＨＢＳ　ＡＵをコードする遺伝子を含Ｉυ
でいる）を、ＥＣＯＲ工部位及びＢａｍ１−１工部位で
プラスミドｐＭＬ　（Ｌｕｓｋｙ　Ｏｔ　ａｔ、、　　
Ｎａｔｕｒｅ、二ニア９（１９８１）　）にクローン化
して発現プラスミドＤＨＢ　Ｓ　３４８−Ｅを構築した
。（１１ＭＬは、゛サル細胞中でのプラスミド複製を阻
害する配列が除去された欠失を有するＩ）ＢＲ３２２の
誘導体である）。

得られたプラスミド（ｐＲＩ−Ｂａｌ）を次に旦ｃｏＲ
Ｉで直線化し、ＳＶ４０のオリジン領域を示ず３４８　
ｂｐｖｆＴ片をｐＲＩ−ＢａｔのＥｃｏｌｌＩ部位に導
入した。オリジン断片はいずれの配向でも挿入され（！
）る。この断片は複製のオリジン以外に初期及び後期の
ＳＶ４０プロモーターをコードしているので、オリジン
の配向次第でどちらかのプロモーターが作用し該プロモ
ーターの制御下でＨＢＶ遺伝子が発現し得た。（＋１１
−Ｉ　Ｂ　８３４８−［：は初期プロモ−ターの制御下
で発現したＩ−ｌ　Ｂ　ｓを示ず）。

ＤＥ３４２を修飾するために、Ｉ）Ｅ３４２を１竺Ｒ■
で部分消化し、Ｋ　Ｉｃｎｏｖ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラー
ゼエを用いて開裂部位を充填し、プラスミドを再結合し
、これにより、ｌ）Ｅ　３４２中のＳＶ４０オリジンに
先行するＥＣｏＲＩ部位を除去する。（Ｊられたプラス
ミド即ち　Ｉ）Ｅ３１１２ΔＲ１をＬ性ＲＩで消化し、
Ｋ　ｌｅｎｏｗ　Ｄ　Ｎ　Ａボリメラーゼエを用いて充
填し、Ｂａｍ１−ＩＩで再度切断する。アクリルアミド
ゲル電気泳動後、約３５００　ｂｐ断片を電気溶出し、
フェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈澱させ
る。

前記の如く調製されたｐ３４２Ｅ　　３５００　ｂｐベ
クター及び約２１６０　ｂｐの前記ｔ−Ｐ　Ａ　Ｉｇｉ
片を標準法により互いに結合した。ｔ−ＰΔをコードす
る３！！Ｉの断片を適正方向で含むプラスミドを単離し
、特性決定し、Ｉ）Ｅ　３４２−ｔ−Ｐ　Ａと命名した
。このプラスミドを５ａｃｌ′Ｃ″消化し細菌性アルカ
リ性ホスファターぎ（ＢｌマＬ礼製）で処理した。Ｄ　
Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒ配列を（該配列の発現用制９１１配列と
共に）与えるために、ρＥＩ−ＩＥＲ（１）Ｓａｃ７Ｉ
消化に：にッＴ約１７００　ｂＤ　１７］ｆＪｉ片を生
成した。（１）Ｅ　Ｉ−Ｉ　Ｅ　）＜は前記米国特許出
願第４５９，１５１号明細出に記載の突然変異Ｄ　ＨＦ
　Ｒを発現するプラスミドである）。即ち、ｐＥ　ＩＩ
　Ｅ　ｆｌは第１３図に示す如＜　：Ｊ、−１製された
プラスミドであり、５６号に記載されており、ｐ［ｌｌ
３Ｖ−１’−１Δ及びｐＳＶＲはＬｉｕ等のＤＮＡ、　
　１　：２１３（１９８２）に記載されたおり、ｐＦＲ
４００は以下の如く調製されろ。

ＳＶ４０　複製オリジンを含む　５／１ｏｂｐの１−１
　ｉｎｄ　ｌ［−ＩＩ　１ｎｒｌ　Ｉｌｌ　断片（Ｌｉ
ｕ等、ｌ）　Ｎ△　１：２１３　　（１り８２）　）を
ＥＣｏＲＴ部位とｌ−１ｉｎｄｌ［部位との間でプラス
ミドｐＭＬ（Ｍ。

Ｌ　ｕｓｋｙ及びＭ、　　Ｂｏｔｃｈａｎ、　　Ｎａｔ
ｕｒｅ　　２９３ニア’ｌ　（１９８１）　）　ｌ、：
結合した。ｌ−１ｉｎｄＩ［［で消化する前に４ｄＮ１
’Ｐの存在下ｔ’　Ｋ　ＩｅｎｏｗＤＮΔボリメラーゼ
エを添加己て該プラスミドのＥｃｏＲ１部位とＳＶ４０
のｌ−１ｉｎｄ［部位とを平滑末端化した。得られたプ
ラスミドｐＥ　Ｓ　Ｖをｌ−１ｉｎｄｌＩ［及びＢａｍ
ｔ−ＩＩにより消化し、２９００１１１１のベクター断
片を単離した。

該断片に対し、ＥＣＯＲ工部位にポリリンカー（多数制
限部位を合むＤＮＡ断片）を含むように修飾されたＨＢ
、Ｖからの２０２５１１１）の１−１　ｉｎｄ　ｌ１ｌ
−Ｂ　（Ｉｆ　Ｉ［断片を結合した。ｌ−Ｉ　Ｂ　Ｍ断
片は表面抗原遺伝子を含ｌυでｊ３す、前出のｌｊｕ等
、　ＤＮＡ　１：２１３　、１９８２に記載の如くクロ
ーン化した１−（ＢＶＤＮ△のＥｃｏＲＩ−ＢａｌｌＴ
消化によって１ｑられる。

二重鎖リンカ−ＤＮＡ断片（５’ｄＡＡＧＣＴＴΔＴＣ
ＧＡＴＴＣＴＡＧＡＡＴＴＣ３’　・’）をｌ−１ｉｎ
ｄｌ［［及びＥＣ０ＲＩによって消化シ、ＨＢＶ断片に
付７Ｊ［’ｌ　Ｌ、ＥｃｏＲＩ−８ｇＩｆｆ断片を）−
１ｉｎｄ　ｍ−ＢａｌＴｌ断片に転換した。リンカ−と
ＨＢＶ断片とベクターとから成る三部分を同時に結合す
ることも可能であるが、先ず１４　ｉｎｄ　ｍ　−Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−をクローン化したＨＢＶ　　ＤＮＡに付
加し、次に制限酵素を用いるプラスミドの同時消化によ
ってＩ−１ｉｎｄ　ＩＩＩ　−Ｂ　ＯＩＩ［断片を切除
する方法がより有利であるためこの方法を使用した。（
Ｓられたプラスミド ｐｃＶＥｓＶＨ［３Ｖは、ｐＢ　ｒ（３２２由来の１］
ＭＬからの細菌性複製オリジンと同じくＤＭＬからのア
ンピシリン耐性マーカーと、消化ＨＢＶ断片の転写を初
期プロモータが指示するように配向された５ｖ４０断片
と１−Ｉ　Ｂ　Ｍからの表面抗原遺伝子とを含む。

ＨＢＶ断片はまた咄乳類細胞の細胞質に通常形成される
如ぎポリアデニル化ｍＲＮＡを産生するためのポリアデ
ニル化シグナルを与える。１−ＩＢｓＡａコード領域は
、ＥＣ０ＲＩによる消化と前記の如きＫＩｅｎｏｗＤＮ
Ａポリメラーゼによる末端充填と３ｑｍＨＩによる部分
消化とによって除去される。

Ｄ　ＨＦ　ＲをコードするｃＤＮＡからのＦｎｕ　４Ｈ
Ｉ−ＢｏｌＩＩ断片が該領域に挿入される。得られたプ
ラスミドは第１４図に示されている。１）ＦＤｌｌは野
生型Ｄ　ＨＦ　Ｒｃ［）　Ｎ　ＡプラスミドＣＩＤｔ−
ＩＦＲ−１１（Ｎｕｎｂｅｒｇ等、　　Ｃｅ１ｌ　１９
：３５５　　（１９ａＯ）　）のＦＤｌｌ−ＩＩ−８ｇ
ｌｌｒ断片を用いて構築されたものであり、ｐＦＲ４０
０はＤＲ４００，１２からの同様の断片を用いて構築さ
れたものである。

ｏｎ　４００．１２は、メトトレキヒート耐性Ｄ　ＨＦ
　ＲをコードするＯＮΔ配列を含む組換プラスミドであ
り、突然変異３丁６Ｒ４００細胞（Ｄ、　Ａ、　ｌ−１
ａｂｅｒ及びＲ，Ｔ、　Ｓｃｈｉｍｋｅ。

Ｃｅ１ｌ　、　２６：　３５５　　（１９８１）　）か
らＩＩＩＲＮΔを単離し、）１１ｍｍＲＮＡからｃＤＮ
Δライブラリを調製し、ｐｓｔ：［開裂１）ＢＲ３２２
にｃＤ　Ｎ　Ａを結合し、Ｅ、Ｃｏ１１株２９４　（Ａ
　ＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、ネズミのＤ　ＨＦ
ＲｃＤＮＡ　（Ｊ、　ｌ−１，Ｎｕｎｂｅｒｏ等、前出
）からのｃＤＮＡインザートのＰＳｔＩ−Ｂ（Ｊｌ■消
化物を用いて形質転換体をプローブし、適正な突然変異
Ｄ　ＨＦ　Ｒコード配列を有するプラスミドを含むコロ
ニーを選択することによって調製される。　　　この断
片をＩＩＥ　３４２−ｔ−Ｐ　Ａプラスミドに結合し、
ρＥ’ｒ−ＰＡｒＲａｏｏを作製した。該プラスミドは
ｐＥＨＥＲに類似しているがｌ−１１３３Ａ（＋をコー
ドする領域がｔ−ｐΔからのＣＤＮ△配列で置換されて
いる。

］三、２．１３　　ｔ−ｒ’Ａ配列の発現２′び増幅Ｑ
ｒａｔ＋ａｍ及びＶａｎｄａｒ　　Ｅｈの方法（前記）
でｐｅ−ｒｐΔＥＲ４００（ＩＩＥＴＰＥＲ）をｄＭｒ
ＣＨＯ−Ｄ　ｔＪ　Ｘ　　１３１１■１胞及びＤ　Ｉ−
Ｉ　Ｉ”　Ｉ’＜＋ＣＩＩ　０−Ｋｌ　　（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ６１）細胞にトランスフ（以Ｆｅリ エクトした。グリシン、ヒボキサンチン及びチミジンを
含まない培地で増殖し形質転換されたｄＭｒ細胞を選択
した。１１００ｎ以上のＭＴＸ中で増殖して形質転換さ
れたＤＨＦＲ細胞を選択した。適当な選択培地上に発生
したコロニーを、クローン化リングで単離し同じ培地中
で数世代まで増殖した。

増幅のために、コロニーから細胞を分割して５４ｓ　　
　　　　５　　　　５　　　６ｘ１０　　、１０　　、
　２．５ｘ１０　　、　５ｘ１０　　及び１０ｎＭのＭ
ＴＸを含む培地に入れ、この操作を数回繰返した。極め
て低い細胞密度（１０−１０３細胞／プレート）で細胞
を１０ｃｍの■にブレー１〜し、冑られたコロニーをｔ
Ｉｉ離した。

Ｅ、２．０　　アッセイ方法 トランスフェクトされ増幅されたコロニー中のｔ−ＰＡ
の発現は、Ｉ：、１．ｌ（，１，ｂで説明した方法（前
記）と同様の方法で簡便に検定され１ｑる。

Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　＋？及びｔ−ＰΔ配グＪの同時増幅は
、増幅されたコロニーのコンフルエントな単層から下記
の如＜ＤＮＡを単離してアラレイする。１５０ｍｍプレ
ートのコンフルエントな単層を５０ｍ１の無菌ＰＢＳで
洗浄し、５ｍｌの０．１％Ｓ　ＯＳ　、　　Ｏ，／ＩＭ
ＣａＣＩ□　及び０．ＩＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐｌ−１８
）　全添加して溶解づる。、５乃至１０分後、混合物を
取出し、フェノール抽出し、り［１０ボルム抽出し、エ
タノール沈澱ざ「る。０．１ｍす／ｍｌよでＲＮ　ａｓ
Ｏを添加した１０ｍＭ１−リス−１−ＩＣＩ　　（ｐＨ
８）及び１ｍＭＥ　Ｄ　ＴΔ（１’　Ｅ　）からなる液
１ｍｌ　（１５０ｍｍ　７　Ｌ／　−ト当り）にＤＮＡ
を再懸濁させ、溶液を３７℃で３０分間インキュベート
する。次にＳＯ８を０．１％まで添加し、プロナーゼ（
シグマ社製）をｏ、ｓｍｔｙｍｌまで添加する。３７℃
で３乃至１Ｇ時間インキュベー１〜した後、溶液を再度
フェノール抽出、クロロホルム抽出し、エタノール沈澱
させる。ＤＮＡベレッ１−を０．５ｍｌの水に再懸濁さ
せ、制限ｎ？索ｉ１′消化づる。約５乃至１０μりの消
化ＤＮＡをアガロースゲル［１％のアガロースを含むト
リス−酢［％ｊｉ液（４０ｍＭｔ−リス、１ｍＭ　　Ｅ
　Ｄ　Ｔ　Ａ、酢酸で１）Ｉ−１８，２に調整）Ｊの電
気泳動にかＣブる（Ｃｒｏｕｓｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
、　３ｉｏ１．　　Ｃｈａｍ、、　２５７　ニア８８７
　（１９８２）　）。ブロモフェノールブルー染料がゲ
ルの厚み２／３まで移行した後、ゲルを取出し臭化エチ
ジウムで染色する。紫、外線でＤＮＡを見えるＪ：うに
し、ザザン法ＬＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　９８：
５０３　（１９７５）　）ににすＤＮＡをゲルからニト
ロセルロースフィルターに移行させる。次にフィルター
を、（前記の如く調製されハイブリダイズされた）ｐＥ
ＨＥＲの１７００　ｂｐ注■断片又はｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｅ
　Ｒの約１９７０　ｂＤのｌ旺■断片から製造されたニ
ック翻訳プローブとハイブリダイズさせる。

Ｅ、３！Ｉ！７生型Ｄ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｒタンパクを使用
するｔ−ｐΔの産生 Ｅ、３．Δ　ベクターの構築 ｐＥＴＰＥｆｌの構築に使用した方法と同様の方法Ｃ１
野イＬ型Ｄ　ＨＦ　ＲをコードづるＤＮＡ配列を含むプ
ラスミドｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒを溝築した。実施例（二
、２．八に記載の如＜イ１４榮するが、Ｄ　１１　Ｆ　
Ｒタンパク遺伝子配列の起源としてプラスミドＯＥ　Ｈ
Ｅ　Ｒの代わりに１．Ａ井嘲−中ミ≠噂；丼陣事中枳廿
ローｐＥ　　３４２．　ｌ＋［３Ｖ、　［Ｅ、１００．
１）２２を使用した１、野生型Ｄ　ＨＦ　Ｒと突然変異
株Ｄ　ＩＩ　Ｆ　＋≧との間の１個の塩括対の相違以外
はプラスミド Ｉ３Ｖ．Ｅ４　０　０．Ｏ２　２はｐＥＨＥｌｌと同様
テｌつろ。、核プラスミド（Ｊ：ｐＦ　Ｉ）　ｌ　Ｉを
ｐＦＩ’ｔ４００に置きかえてｐｅｇ　Ｈ　Ｅ　１１と
同様にして（、１り築されろ（第１３図及び第１４図参
照）。又は、第１５図のｐＥ３／１２．Ｏ２２はｐｌ）
　＋ｒ　Ｆ　Ｉｔ　−　［　１　（Ｎｕ＋＋ｂ〔！ｒｇ
．　ｉＦｒ！Ｉｔ）から由来しており、（ｐ３４２Ｅの
初期プ〔！モータノ上流のＥｃｏＲ１部位の欠失により
得られた）ｐＥ３４２△ｌ”１１は第１６図に記載され
ている。従って、（ｑられるプラスミドｐＥＴＰＦｎは
全ての点てｐＥ’ｒＰＦｊｌと類似しているが、突然変
異Ｄ　ｔｌＦ　ＲをコードするＤＮＡ （＼・ＡＦ全白ン 配列の代わりに、野生型Ｄ　ＨＦ　ＲをコードづるＤＮ
△配列が合まれでいる。

Ｅ、３．［３ｔ−・ＰΔ配列の発現 Ｇ　ｒａｈａｍ及びＶａｎ　ｄｃｒ　　Ｅｂ　（７）Ｉ
Ｊ　ンＨカルシウム沈澱法によりｐＥ　Ｔ　Ｐ　Ｆ　Ｒ
を使用してＤ　Ｉ−１１′：Ｒが欠如したＣ　ｉ（Ｏ細
胞（Ｕ　ｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ（前記））をトラ
ンスフェクトした。選択用培地（−ＨＧ　Ｔ　）で発生
した２１個のコロニーをアッセ−！’るために、Ｇｒａ
ｎｃｌｌｉ−ｐ　１ｐｃｒｎｏ、　ａｔ　ａｔ、、　Ｊ
　。

Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、ユ４８　：　　２２３　（１り７
８）に記載の如く、ＦＡＮ素及びプラスミノーゲンを含
む寒天プレート中のｆｌ　ｇ（Ｃ素の消化によって測定
されるプラスミン形成を検出した。

次にＥ、１．に、に記載の方法により、最もポジティブ
なりローンのうち４個の細胞当りのプラスミン形成を定
ｍ的に検定した。・ 前記の如ぎ窓口的測定により、４個の被検クローンが、
ユニット／細胞７日で示すと、等しいか又は同等の培地
内ｔ−ｐΔ分泌を示すことが知見された。２個のクロー
ンからの接種物を−ＨＧ　Ｔ　ｆＱ地を含む別のブレー
Ｉ・に移してり・ブクローンを調製した。得られたサブ
クロー、ンのうちの２種、１８Ｂ及び１を使用して更に
解析を進めた。

Ｅ、３．Ｃ増幅及びｔ−ＰＡ産生レベル増幅を促進すべ
く前記ザブクローンを５０　ｎＭのＭＴＸ中で１００ｍ
ｍプレート当り２Ｘ１０９の細胞を含むようにプレート
した。生存した細胞を前記の如くアッセイすると、全て
の場合に、未増幅の組織プラスミノーゲン活性化因子の
活性の約１０倍の活性が検出された。これらのり［１−
ンの２個を選択して１−１５及び１８Ｂ−９と命名し更
に研究を進めた。

す゛アクローン１−１５を更に増幅するために、５００
ｎＭのＭＴＸを含む１００ｍ１ｌプレートに２Ｘ１０５
″個の細胞を接種した。このようにして増幅された細胞
のアッセイによれば、ｔ−ｐΔ産生伍は更に増加してい
た（約３倍）。Ｅ、１．にの方法で定団的に検定すると
レベルは７Ｘ１０’ユニット／細胞／日であった。次に
、これらの増幅細胞の一部分を１０．０００　ｎＭのＭ
ＴＸの存在下に移して維持した。

サブクローン１−１５及び１８Ｂ−９を表３に示した条
件で約１乃至２ｈ月維持した侵に再度検査した。

表　　３ セルライン　　　　　　　増殖条件　　　　、　　　　
ｎ（Ｊ　　ｔ−ＰＡ／細胞／日１−１５　　　　５００
ｎＭ　ＭＴＸ　　　　　　　　　　　２８，５ｘ１０−
３１−１５　　　　　５００ｎＭ　　ＭＴＸ　　　　　
　　　　　　　　　２６．０ｘｌＯ−３１−１５５８ｏ
（−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし＞８．３Ｘ１０−３１−１
５　　　　　　（−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　　
　　　１８，０ＸＩＯ−３１−１５１０ＢＭ　　ＭＴＸ
　　　　　　　　　　　　　　２９４３Ｘ１０＝ｔｏ、
ｏｏ。

１−１５□。、ｏｏ。１０ＢＭ　ＭＴＸ　　　　　　　
　　４９，０ＸＩＯ−３１８８−９５０ｎＭ　　ＭＴＸ
　　　　　　　　　　　　　　１４，３ｘ１０−３１８
Ｂ−９５０ｎＭ　　ＭＴＸ　　　　　　　　　　　　　
　１４．４Ｘ１０−３１８３−９　　　　　（−ＨＧＴ
培地、ＭＴＸなし＞　　　　　　　１４，３Ｘ１０−３
１８Ｂ−９（−１−ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし）　　　　
　　　１４，４Ｘ　１０−３１　　　　　　　（−１−
ＩＧＴ培地、ＭＴＸなし＞　　　　　　　　１，０ＸＩ
Ｏ−３１（−ＨＧＴ培地、ＭＴＸなし）０．７刈０−３
表　３　　　？主；１： 培地中のｔ−ＰＡを以下の如くラジオイムノアッセイで
定■的にアッセイした。ｙ’ｆ製ｔ−Ｐ　Ａ及びメラノ
ーマｍ胞から誘導された精製ヨード化ｊ−レーザー【−
ＰＡを、燐酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，３）、０．５％
牛血漬アルブミン、０．０１％Ｔｗｃｃｎ　８０及び０
．０２％ＮａＮ３を含む緩衝液中で濃度１２．５乃至４
００ｎＯ／ｍｌまで順次希釈した。適当な希釈度の被検
定培地ナンブルを放射活性１識トレーリ°−タンパクに
添加した。１　：　１０，０００希釈の「クナギ抗ｔ−
ｐ△抗血清のＮ０画分の存在下で抗原を室温で１晩イン
キュベ−１〜した。ヤギ抗つサギＩＣＩＧイムノビーズ
（ＢｉｏＲａｄ社！！Ａ）に室温で２時間吸収さμて抗
体−抗原コンプレックスを沈澱さ「た。

希生理食塩水を添加してビーズを洗浄し、次に４℃、２
０００Ｘ　Ｑで１０分間遠心した。上清を捨て、沈澱物
中の放射活性をモニターした。参照４！準との比較によ
って濃度を決定した。

セルラインは以下の如くである。セルライン。

“１′′は、４■・のオリジナルセットから選択された
未履幅クローンである。“”１−１５　　　”は最初に
５０　ｒ＋ＭのＭＴＸ中で増幅されて１−１５を生じ次
に５００ｎＭのＭＴＸに移されて更に増幅されたセルラ
イン゛１ｎの増幅サブクローンである。１−１５１０．
０００ は１０，０００　ｎＭのＭ　Ｔ　Ｘの存在下で更に増幅
された１−１５５ｏｏのサブクローンである。セルライ
ン１８Ｂ−９は４個のオリジナルクローンの１１ＩＩｉ
ｌから選択され５０　ｎＭのＭＴＸで増幅されたナブク
ローンである。

全ての増幅細胞は、未増幅細・胞が示したよりも増加し
たｔ−Ｐ　Ａ産生レベルを示す。未増幅培養物でも０．
５ｐｇ／細胞／日より高いｔ−ＰＡ産生ｍを示すが、贈
幅の結果として５０１）！Ｉｔ／　Ｉｌｌ胞／日に近い
レベルが得られる。

Ｆ、薬剤組成物 本発明の化合物は、本発明のヒ１−組織ブラスミノーグ
ン活性化因子産物が薬剤上許容され得るキャリアごヒク
ルに混合されて成る４５剤的に有用な組成物を調装すべ
く公知方法で処方され得る。他のヒ１−タンパク例えば
ヒ１−血清アルブミンを包含する適当なビヒクル及びそ
の処方は、例えばＥ。

Ｗ、　ＭａｒｔｉｎにＪ：るＲｃｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　
　ｌ）ｈａｒｍａｃｃｕ−ｔｉＣａｌ　３０＋ｅｎＣＱ
Ｓに記載されている。該文献を引用して木ｆｇ１創出中
に包含する。前記の如き組成物は、宿主への有効投与に
適した薬剤上許容され１！′７る組成物を調製Ｊるため
の適当ｍのビヒクルと共に有効間の本発明タンパクを含
有するであろう。

例えば、本発明のヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
は、心血管病又は心血管障害に苦しむ患者に非杼口的に
投与され得る。ｍｍ及び投与速度は現在臨床に用いられ
ている他の心血管血栓溶解剤と同様でよい。例えば、肺
塞栓症の患者には、初回に約４４０　Ｉ　Ｕ　／ｋ（］
を静注し、以後約４４０１Ｕ／に０７時ずつ１２時間静
注する。

本発明の実質的に均質なヒト組織プラスミノーゲン活性
化因子を、非経口的に投与するための適当な剤形の一例
としては、２５０００１ＬＩの組織プラスミノーゲン活
性化因子活性、２５ｍｇのマンニトール及び４ＳｒＡＱ
のＮａ　Ｃ＋を含むバイアルを５ｍｌの注射用無菌水で
復元し、静脈内投与のために適正伍−の０．９％食周温
注射剤は５％デキストロース注射剤と混合すればよい。

Ｇ、　組換ヒトｔ−ＰＡの詳細な説明 水明１ｆｆｌｆｌ中では、実施例に於いて調製されたヒ
トｔ−ＰＡの特定具体例の構造を遺伝子をコードする配
列の解明及びタンパク質生化学技術の双方により、ある
程度詳細に説明した。一般に理解されているタンパク構
造を第１２図に示ず。

Ｃｏ１１ｃｎ及び彼の共同ω］究者（文献８８）にＪ：
つで、二本鎖ヒトｔ−ＰΔは一本鎖分子がタンパク分解
的開裂により、ジスルフィド結合で接続された２個のポ
リペプチドになる結果形成されることはりでに明らかに
されていた。本発明にＪ：つて、ト１鎖（分子量３０８
８２　）がＮ１−１□−末端部から誘導され、１−鎖（
分子量２８１２６）がＣＯＯｌ−１−末端領域からなる
という結論が得られる。二本鎖分子のＮ−末端配列決定
によれば、二本鎖形態は１個のフルギニルーイソロイシ
ン結合（第１２図の矢印）の開裂により生成されると思
われる。

と１−ｔ−ＰＡ（第１２図）の１−１鎖領域の１部分の
一次構造は、プラスミノーゲン（文献８９）及びプロト
ロンビン（文献４０及び４１）のクリングル領域に対し
て高度の配列相同性を示す。クリングル領域とは、プロ
トロンビンのプロ断片中で最初に発見された特徴的トリ
プルジスルフィド構造を意味しており、これに関しては
ＭａＯｎｌｌＳＳＯｎ　ｅｔ　ａｌ、　　（文献９１及
び９２）が初めて詳細に記載した。ｔ−ＰＡの一次配列
から２個の所謂クリングル領域が明らかになる。これら
の領域は、各々が８２個のアミノ酸を含んでおり、プラ
スミノーゲンの５個のクリングル領域と高度の相同性を
有する。残りのＮ−末端の９１個のアミノ酸は従来のク
リングル領域との相同性を殆んど有していない。然しな
がら、１１個の付加的システィン残基が検出されるので
、この領域も多数のジスルフィド結合を含む構造を有し
得ると推測し得る。

ヒトｔ−ＰＡのし鎖の触媒部位、所謂セリンプロテアー
ゼ領域は、他のセリン酵素同様に、ヒスチジン３□２　
、アスパラギン酸３７□及びセリン。７８　　残基から
形成されている可能性が大きい。更に、これらの残基を
包囲するアミノ酸配列は、トリプシン、プロトロンビン
及びプラスミノーゲンの如き他のセリンプロテアーゼの
対応する部分に極めて良く相同している。

本発明を好ましい特定具体例に関して説明してきたが、
本発明は前記具体例だけに限定されるべきでないことが
理解されよう。

参考文献 １、米国特許Ｎ　ｏ、３３５５３［３１゜２、米国特許
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ｈａｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ。　　Ｎ　　ａｔｕｒｃ、　
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２８、　　Ｉ　ｔａｋ（Ｉｒａ　　ａｔ　　ａｌ、、　
　ＳＣ；１ｅｎｃＱ、　　１９８．　１０５６（１’１
７７）。

２９、Ｇｏｃｄｄｃｌ　　Ｏｔ　　ａｔ、、　　　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　８．
　４０５７　　（１９８０）　。

３０、欧州特許出願公開Ｎ　Ｏ，００３６７７６゜３１
、　　Ｓ　１ｅｂｃｎｌｉｓｔ　　ａｔ　　ａｔ、、　
　Ｃｅ１ｌ　　２０　　、　２Ｇ９（１９８０）。

３２、　　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ　　ａｔ　　ａｔ、、
　　Ｎａｔｕｒｅ、　　　２８２．　３９（１９７９）
　　。

３３、　　Ｋ　ｉｎｇｓｍａｎ−ｃｔ　ａｌ、、　　Ｇ
ｅｎｅ、　　７．　１４１　（１９７９）　。

３４、ＴｓｃｈｕｎＨｅｒ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｇｅｎ
ｅ、　　１０．　１５７（１９８０）　　。

３５、　Ｍｏｒｔｉｍｅｒ　ａｔ　ａｔ、、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｏｉｃａｌＲｃｖｉｃｗｓ、リー、　５１
’Ｊ　　（１９８０）　。

３Ｇ、　　Ｍ　ｔＯＺＺａｒｌ　　ａｔ　ａｔ、、　　
Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢａｃｔｃｒｉｏｌｏｏｙ、
　　１３４．４８　　（１９７８）　。

３７、　　Ｊｏｎｅｓ、　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　８
５．２３（１９７７）　。

３Ｂ、　　）−１ｉｔｚｅｍａｎ、　　ａｔ　ａｌ、、
Ｊ、　　［３ｉｏ１．　　Ｃｈｅｍ、。

旦、　　１２０７３　　（１９８０）　。

３９、　　Ｈｅ５ｓ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ　、Ａｄｖ
、Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｒｃｇｕｌ、。

７、　１．４９　（１９６８）　。

４０、　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１７゜／１９００　（１９７
８）。

４１、Ｂｏｓｔｉａｎｅｔａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、　　
Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　（ＵＳＡ）　　、　　７７、　４５０４＜
１９８０）　　。

４２、　　ｌ−１１ＣＭｏｌａ１−１１Ｃ３ｉｏｌｏｇ
ｙ　ｏｆ　　Ｙｅａｓｔ（Δｕｇ　　１１−１８．　１
９８１）　　、　　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｒ＋ｒｉｒ＋。

１−（ａｒｂｏｒ　　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｑ
ｏｌｄ　　ＳｇｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　　　Ｎ　ｃｗ
　　Ｙ　ｏｒｋ。

４３、Ｃｈａｍｂｏｎ、　　△ｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　４４゜（ｉ１３　（１
９７５）。

４４゜Ｔ　１ｓｓｕｅ　　ＣｕｌＬｕｒｃ、　　Δｃａ
ｄｃｍｉｃ　　ｌ）Ｉ’（！ＳＳ。

Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄ　　Ｐａｔｔｃｒｓｏｎ　ｅｄｓ、
、　（１９７３）　　。

４５、　Ｇｌｕｚｍａｎ、　　Ｃｅ１ｌ、　　２３．１
７５　　（１９８１）　。

４Ｇ、　　Ｂｏｌｉｖａｒ　Ｑｔａｌ、、　　Ｇｏｎｅ
、　　２．９５　　（１９７７）　。

４７；　　１−ｕｓｋｙ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　　２９３　７’Ｊ、＋＋Ｌ （１９８１）。

４８、　　Ｇｌｕｚｍａｎ　ｃｔ　ａｌ、、　　Ｃｏ１
ｄ　　５ｐｒｉｒ＋ｏ　　Ｈａｒｌ＋ｏｒＳｙｍｐ、　
　Ｑｕａｎｔ、　　Ｂｉｏｌ、、　４４．　２９３　　
（１９８０）　。

４９、　　Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕｒ
ｅ、　　２７３．　１．１３（＋９７８） ５０、　　Ｒａｄｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２００．　４９４（１９７８）　　。

５１、Ｃｒｃａ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｎｕｃｌｃｉｃ　
　ＡａｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、　　８．２３３１　　
（１９８０）　。

５２、　　Ｇｏｃｄｄｅｌ　　ａｔ　ａｌ、、、　　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　　２８７．　４１１（１９８０）　。

５３、　Ｇｒ８Ｖ　Ｑｔ　ａｌ、、　Ｎ、１ｌｔｔｌｒ
（！、　　２９５．５０３（１９８２）　。

５４、Ｏｆ）ｌ）Ｑｒｍａｎｎ　ｅｔ　ａｔ。　Ｖ　ｉ
ｒｏｌｏｇｙ、　　１０８　４７（１９８１）　　。

５５、　　Ｗａｒｄ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｖｉ
ｒｏｌ、、　　９．　６１（１９７２）。

５６、　　Ａｖｉｖ　ａｔ　ａｔ□ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、＜ＵＳＡ）、組、　　１４０８　（１９７２
）　。

５７、　１−ｅｈｒａｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　ＩＪ４７４３　（１９７７）
。

５８、　　Ｌｙｎｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｖｉｒｏｌ
ｏ（ＩＶ、　　９８．　２５１（１９７９）。

５９、　１−ｏｄｉｓｈ、　　Ａｍ、　　Ｒｅｖ、ｏｆ
　　Ｂ！０ＣｈＯＩＩ１．、　４５゜４０　＜　１９７
（ｉ）。

ＧＯ，ｐｃＨ＋ａｍ　ａｔ　ａｔ、、　　［ｕｒ、Ｊ　
、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　　４３゜２４７　　（１！３７
６）。

（ｉｌ、　　Ｂ　Ｉｏｂｅｌ、　　Ｃｔ　ａｌ、、Ｊ　
、　　Ｃ０１ｌ　　Ｂ　１ｏＩＱ！ＩＶ、　　Ｇ７゜８
５２　（１９７５）。

１３２、　３ｉｉｃｌｄｓ　　ａｔ　　ａｔ、、　　Ｊ
、　　３ｉｏ１．　　ＣＩ＋ｃｍｉｓｔｒｙ。

２５３．３７５３　　（１９７８）　　。

Ｇ３．　　Ｌ　ａｅｍｍｌｉ、　　Ｎａｔｕｒｅ、　　
２２７．　Ｇ３０（１９７０）　。

Ｇ４．［３ｏｎｎｃｒ　　ｃｔ　　ａｌ、、　　Ｅｕｒ
、Ｊ　、３１ｏｃｈｃａ＋、、　　４Ｇ。

８３　（１９７４）　　。

６５、　　Ｇｏｃｄｄｅｌ　　ａｔ　ａｌ、、　　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　　２８１　５４４（１９７９）。

ＧＧ、Ｗｉｃｋｃｎｓ　ｅｔ　　ａｌ、、　　　Ｊ、　
　［３ｉａｌ、　　　Ｃｈｅｍ、。

２５３．２４８３　　（１９７８）。

６７、　　Ｃｈａｎ（ｌ　ａｔ　ａｌ、、　　Ｎａｔｕ
ｒｅ、　　２７５．　Ｇ１７（１９７８）。

（ｉ８．　　Ｂｏｌｉｖａｒ　ａｔ　ａｔ、、　　Ｇｅ
ｎｅ、　　２．　９５　　（１９７７）　　。

（ｉ９．　ＱｒＵｎＳｔＯｉｎ　Ｑｔ　ａｔ、、　　Ｐ
ｒｏｃ、　　Ｎａ口。

Ａｃａｄ、　　Ｓ、ｃｔ、、　Ｕ　ＳＡ、　　７２．　
３９６１　（［１７５）　　。

７０、　　Ｎａｎａｈａｎ　ａｔ　　ａｔ、、　　Ｇｅ
ｎｅ、　　１０．　６３（１９８０）　　。

７１、［３ｉｒｎｂｏｉｍ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓＲｅＳ、、　　７．　１５１３
　　（１９７９）　。

７２、　Ｓｍ１ｔｈ、　　ＭｅｔｈＯｄＳ　　　［：ｎ
ｚｙｍｏｌ、、　　　ａｓ、　　４９９（１９８０）。

７３、Ｍｅｓｓｉｎｏ　　ａｔ　　ａｔ、、　　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　　ΔｃｉｄｓＲｃｓ、、　　　９．　３０９
（１９８１）　　。

７４、Ｍａｘａｍ　ａｔ　ａｌ。　Ｍｃｔｈｏｄｓ　　
ｉｎ　　［：ｎｚｙｍｏｌ□眩、　　ＩＩ９’ｌ　　（
１９８０）　。

７５、Ｃｒｃａ　　ａｔ　　ａｔ、、　　１）ｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓ　Ｃｉ、、　　７５．　５７６５　（１９７Ｂ）　。

７６、　　Ｌａｗｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　ｃｅｌｌ、　
　１５．　１１５７（１９７８）　　。

７７、　５ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｊ、　　Ｍｏｌ、　　
３ｉｏｌ、、　　９８．　５０３（１９７５）。

７８、　３ｅｌｌｔＯｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　３Ｃｉｅ
ｎＣｅ、　月３６．　１８０（１９７７）　　。

７９、　　ＭＣＧｒａｔｈ　ａｎｄ　　１−ｅｖｉｎｓ
ｏｎ、　　ＮａｔＬｌｒｏ。

２９５、　４２３　（１９ｇ２）　　。

１３０、［３ｔｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎｕｃｌｃｉ
ｃ、　　Δｃｉｄ　Ｒｅｓ、、　　３゜２３０３　　（
１９７６）。

８１、　　ｌ　ａｗｎ　ａｔ　ａｌ、、　　５ｃｉｅｎ
ｃｅ、　　２１２　１１５９（１９８１）。

８２、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ　ａｔ　ａｔ、、　　Ｃｅ１ｌ
、　　１９．　９５９（１９８０）。

８３、　　Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　　３　ｉｏ
ｃｈｃｍ、　　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　　４４２．　３２４（１９７６）　　。

８３ｂ、Ｅｄｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｅｕｒｏｐｅ
ａｎ　　Ｊ　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、。

１．８０　　（１９６７）。

８４、　　Ｄｃｎｈａｒｄｔ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、、２３，６４１　　（１９６６）。

８５、　　Ｗａｈｌ　　Ｃｔ　ａｌ、、　　Ｐｒｏｃ、
　　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　（ＵＳＡ）　、　７６、３６８３（１９７
９）　。

８Ｇ、　　［）ａｖｉｓ　’ｅｔ　ａｌ、、　　Ａｄｖ
ａｎｃｅｄ　　［３ａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ
、　　　　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｒ＋ｏ　　Ｈａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　　Ｎｅｖ　　Ｙｏｒｋ　
　（１９８０）　。

８７　、　　Ｑｒａｎｅｌｌ＋−Ｐ　　１ｐｅｒｎｏ　
　ａｔ　　ｉｌｌ　、、　　　　Ｌノ　、Ｅｘｐ。

Ｍａｄ、、　　　１４８，２２３゜ ８８、　　Ｒ１ｊｋｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｊ　、　
　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　　２５６゜７０３５　　
（１９８１）　　。

８９．５ｏｔｔｒｕｐ−ＬＪ　ｃｎｓｃｎ　　ｅｔ　　
ａｌ、、Ｐ　ｒｏｇｒｃｓｓ　　１ｎＣＩ＋ｅｍｉｃａ
ｌ　　Ｆ　１ｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　　ａｎｄ］゛ハｒ
ｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、　　　Ｖｏｌ、３．　　Ｒａｖｅ
ｎ　　　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、Ｙ、０．１９１　　（１９１８）。

９０、　Ｓ　ｏＬｈｒｕｐ−Ｊ　ｃｎｓｃｎ　　ａｔ　
　ａｌ。　Ｐ　ｒＯｃ、　　　Ｎ　ａＮ。

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９１、Ｍａｇｎｕｓｓｃｎ　　ａｔ　　ａｌ、、　　　
ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　　ａｎｄＰ　ｌ＋ｙｓｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　ＲＨｕｌａｔ；ｏｎ、　　Ｒｉｂｂｏ
ｎｓＱｔ　ａｔ、、　　Ｅｄｓ、、　　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　　Ｐｒｅｓｓ。

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９２、　Ｍａａｎｕｓｓｅｎ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｐｒ
ｏｔｅａｓｅｓ　ａｎｄ３　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳＩｌｒｉｎｇｌ−１ａｒｂ
ｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　　Ｎ、　　’／、、
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ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、　　ｐ、
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ｒ　　Ｌａｂ、、　　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏ　　ｆ−
ｌａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９７２）。

９４、　　Ｒｃｉｃｈ、　　Ｅ、、　　　　Ｐｒｏｔｅ
ａｓｅｓ　　ａｎｄＢｉｏｌｏｏｉｃａｌ　　Ｃｏｎｔ
ｒｏｌ、　　（Ｉｂ１ｄ　　）Ｄ、３３３−３４１゜ ９５、　　Ｍａｔｓｕｏ、　　Ｏ，、ｅｔ　ａｔ、、　
　Ｔｈｒｏｍ。

Ｈａｃｍｏｓｔａｓｉｓ、　　４５．　２２５（１９８
１）　　。

９Ｇ、　　　Ｋｏｒｉｒ＋ａｅｒ、　　　　Ｃ，、員　
ａｔ　、、　　　　Ｔ　　ｈｒｏｍ。

ｌ−１ａｅｍｏｓ１−１ａｅ、　　４６．　５６１．　
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９７、　　ト１ｏｙｌａｃｒｔｓ、　　　Ｍ、、　　　
ｅｔ　　ａｔ、、　　　　Ｊ、　　　Ｂｉｏｌ。

ｃｈｅｍ、’、二２９１２　　（１９８２）　。

９８、　　Ｋｏｒｉｎａｅｒ＝　　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、
、　　Ｔｈｒｏｍｂ。

Ｈａｃｍｏｓｔａｓｉｓ、　４６６８５　（１９８１）
　。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテアーゼインヒビターの存在下及び不在
下での、メラノーマ刊胞から抽出した抗ｔ−ＰＡｔＣＪ
Ｇにより沈降し得る３５Ｓ−標識タンパクの１０％ＳＤ
Ｓ　　ＰＡＧＥの結果を示す図である。 第２図は、メラノーマ細胞から誘導されたｍＲＮ　Ａ画
分の免疫沈降した翻訳産物の電気泳動の結果を示す図で
ある。 第３図は、ヒトｔ−ＰＡの５個のアミノ酸配列に基いて
調製した　Ｐ−標識１４ヌクレオチド体のプールをプロ
ーブとして用いたとぎの、ｃＤ　Ｎ　Ａで形質転換され
た９６個のコロニーのハイブリダイゼーションパターン
を示す図である。 第４図は、全長と１−Ｌ−ＰＡ　ｃＤＮＡの制限エンド
ヌクレアーゼマツプである。 第５ａ図、第５ｂ図及び第５Ｃ図は、仝長ヒＩ−ｔ−Ｐ
Ａ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びそれから推定され
たアミノ酸配列を示ず図である。 第６図は、発現プラスミドｐΔＲＩＰΔ°の構築工程図
である。 第７図は、ｐΔＲＩ　Ｉ）Δ°で形質転換された邦１胞
のＦｉｌ維素溶解能のフィブリンプレー１−アッセイの
結果を示ず図である。 第８図は、ヒトトＰ△のトリプシン消化ににって１ｑら
れたペプチドの１−１１）　Ｌ　Ｃの結果を示ザトレー
ス図である。 第９図は、旦−０皿中での成熟ヒＩ−ｔ−ＰＡの直接発
現をコードするプラスミドの構築工程図である。 第１０図は、ｐｔ−Ｐ　Ａ　ｔｒｌ）　１２で形質転換
された旦。 Ｃ０１１により産生されるヒトｔ−Ｐ　Ａの線維素溶解
能に対するフィブリンブレートアッセイの結果を示す図
である。 第１１図は、ＤＨＦＲ（突然変異体又は野生型）／１−
ＰＡをコードしている吐乳類組織培養細胞を形質転換す
るのに適したプラスミドの構築工程図である。 第１２図は、水明ｔｉＡｌＸｉ中のＥ、１．に例示した
方法で調製されたヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
の概略図である。 第１３図１は、ｐｉしｌ−Ｉ　Ｅ　ｌ”ｔの構築工程図
である。 第１４図は、ｐｉ”＋１１００及びｐＦＤｌｌの′２．
１製説明図である。 第１５図は、ｐｒＥ３４２．１Ｉ１３Ｖ、Ｅ４００゜Ｄ
２２の構築工程図である。 第１６図は、ｐＥ３４２．Ｄ２２の＋１４築工程図であ
る。 ａ　　　　　ｂ　　　　　ｃ Ｌ惹住り　ユ゛ミフ一’：Ｃ’、”′シ：’　ｌ　：、
Ｓ＋疼冴なし）〜・２・ ＧＴ丁ＣＴＧＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡ
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ＧＧ　　ＡＴＴ　　ＣＴＣＰＨＥ　　ＰＲＯＰＲＯＨＩ
Ｓ　　ＨＩＳ　　ＬＥＤＴＴＴ　　ＣＣＧ　　ＣＣＣＣ
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ＡＧ　　ＧＡＧＩＬＥ　　ＶＡＬ　　ＨＩＳ　　ＬＹＳ
　　ＧＬＵ　　ＰＨＥＡＴＴ　ＧＴＣＣＡＴ　ＡＡＧ　
　ＧＡＡ　　ＴＴＣＡＬＡ　　ＬＥＵ　　ＬＥＬＩ　　
ＧＬＮ　　ＬＥＤ　　ＬＹＳＧＣＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴ
Ｇ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡＳＥＲＳＥＲＶＡＬ
　　ＶＡＬ　　ＡＲＧ　　ＴＨＲＡＧＣＡＧＣＧＴＧ　
ＧＴＣＣＧＣＡＣＴＬＥＵ　　ＰＲＯＡＳＰ　ＴＲＰ　
　ＴＨＲＧＬＵＣＴＧ　　ＣＣＧ　　ＧＡＣＴＧＧ　　
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ＣＡＡＣＡＴＧ　　ＣＧＡ　　ＣＣＧ　　ＴＧＡ図面の
浄ご（内容に変更なし）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコードし
   ている配列を含有するＤＮＡ配列。
2. （２）形質転換微生物又は形質転換細胞に於いて、ヒト
   組織プラスミノーゲン活性化因子をコードしている配列
   を含有するＤＮＡ配列を発現させ得る複製可能なベクタ
   ー。
3. （３）プラスミドｐ△ＲＩＰＡ°又はｐｔ−ＰＡｔｒｐ
   １２である特許請求の範囲第（２）項に記載のベクター
   。
4. （４）形質転換微生物又は形質転換細胞に於いてヒト組
   織プラスミノーゲン活性化因子をコードしている配列を
   含有するＤＮＡ配列を発現し得る複製可能な発現ベクタ
   ーで形質転換された微生物または細胞培養。
5. （５）哺乳動物のセルラインを形質転換することにより
   得られる特許請求の範囲第（４）項に記載の細胞培養。
6. （６）大腸菌を形質転換することにより得られる特許請
   求の範囲第（４）項に記載の微生物。
7. （７）発現ベクターがプラスミドｐ△ＲＩＰＡ°または
   ｐｔ−ＰＡｔｒｐ１２である第（４）項に記載の微生物
   。