BG60507B2 - човешки тъканен плазминогенен активатор - Google Patents

Abstract

Изобретението се отнася до производството на човешки тъканен активатор (т-па) без контаминантите, скоито обикновено е свързан в неговата естествена клетъчна среда. Човешкият т-па се произвежда в значително количество по методите на рекомбинантната днк (рднк) технология. Изобретението се отнася и до необходимите за произвеждането му методи, експресионни вектори и различни клетки-гостоприемници.

Description

Изобретението се отнася за човешки плазминогенен активатор, съответстващ на този, който се намира в човешки серум и/или тъкани и за нововъведени форми и съединения като заместители, както и за способите и методите за неговото хомогенно получаване в терапевтично значими количества.

Изобретението произлизо отчасти от откриването на секвенциите на ДНК и впоследствие и на аминокиселините на човешки плазминогенен активатор. Това откритие даде възможност за възпроизводството на човешки плазминогенен активатор чрез приложението на технология за рекомбиниране на ДНК, създаваща възможност за получаването на достатъчни количества материал за започването и провеждането на изпитания върху опитни животни и в клинични условия, като необходимо условие за получаване на разрешение за продажба, без ограниченията, характерни за методите за изолиране, използвани досега, включващи добиване и екстрахиране от съществуващи клетъчни култури.

Публикациите и другите материали, използвани за осветяване на произхода на изобретението, както и в отделни случаи за осигуряване на допълнителни детайли за неговото действие, са приложени в библиографията.

А. Човешки тъканен плазминогенен активатор.

Фибринната система на организма е в динамично равновесие с коагулационната система и двете поддържат нормалното състояние на кръвното русло. Коагулационната система отлага фибрин, като матрица служеща за възстановяване на хемостазата. Фибринната система отстранява фибриновата мрежа, след като хемостатичното състояние е постигнато. Фибринните процеси се осъществяват чрез протеолитичния ензим плазмин, който се получава от плазмения протеинов прекурсор плазминоген. Плазминогенът се превръща в плазмин чрез активация с активатор.

Известни са два активатора стрептокиназа и урокиназа. И двата са предназначени за лечение на остри съдови заболявания като миокарден инфаркт, белодробна емболия, тромбоза на дълбоките вени, запушване на периферните артерии и други венозни тромбози. Етиологичната основа на тези заболявания показва при някои случаи частично, а най-често и пълно запушване на кръвоносния съд от кръвен съсирек - тромб или тромбоембол. Традиционната антикоагулантна терапия, като тази с хепарин и кумарин, не води до директно усилване на разтварянето на тромбите или тромбоемболите. Тромболитичните агенти, посочени по-горе, стрептокиназа и урокиназа, имат широко и ефективно приложение. Но всеки един от тях има строги противопоказания. Те нямат висок афинитет към фибрина; следователно и двата антикоагуланта активират циркулиращия и фибриносвързан плазминоген относително индискриминативно. Плазминът (или още фибринолизин), образуван в циркулиращата кръв, се неутрализира твърде бързо и губи тромболитичните си качества. Остатъчният плазмин снижава някои коагулиращи фактори с белтъчен произход, като фибриноген, Фактор V и Фактор VIII, съставящ и хеморагичния потенциал. В допълнение,стрептокиназата е силно антитяло и пациентите с висок тигър на антитела реагират неефективно на третиране и не могат да останат на продължително лечение. Урокиназната терапия е скъпа, дължаща се на нейното изолиране от човешка урина или тъканни култури и това е причина да не е всеобщо възприета в клиничната практика. Урокиназата е била обект на много изследвания /1-6/.

Така наречените плазминогенни активатори са били изолирани от различни човешки тъкани, напр. от маточна тъкан, кръв, серум /7-11/ и от клетъчна култура /94/. Съединенията са известни /12, 13, 14-18/. Плазминогенните активатори, произлезли от тези източници, са класифицирани в две големи групи: урокиназни плазминогенни активатори (у-ПА) и тъканни плазминогенни активатори (т-ПА), основаващи се на разликите в техните имунологични качества. (Абревиатурите у-ПА и т-ПА са предложени на XXVIII Конгрес на Международния комитет по тромбоза и хемостаза, Бергамо, Италия, 27 юли 1982 г.).

Напоследък човешка меланомна клетъчна линия е идентифицирана като секретираща т-ПА. Изучаването на този меланомен плазминогенен активатор показва, че той не се различава имунологично и по състава на аминокиселинните съединения от плазминогенния активатор, изолиран от нормални тъканни клетки /19, 88/.

Продуктът е изолиран в относително чиста форма, изучен и е установено, че притежава качества на високо активен фибринолитичен агент /20/.

Няколко изследвания /95-98/, при които се използва т-ПА, пречистен от меланомна клетъчна линия, доказват неговия висок афинитет към фибрина, в сравнение с урокиназния тип плазминогенни активатори. По-интензивни проучвания на човешкия т-ПА като потенциален тромболитичен агент, обаче са били възпрепятствани от неговата екстремално ниска концентрация в кръвта, тъканните екстракти, съдовите перфузатори и клетъчните култури.

Възприето е, че приложението на рекомбинантна ДНК и свързаните с нея технологии ще бъде най-ефективния начин за осигуряването на необходимите големи количества от висококачествен човешки тъканен плазминогенен активатор, основно пречистен от други човешки протеини. Такива материали ще покажат вероятно биоактивност, даваща достъп до клинично приложение при лечението на различни кардиоваскуларни състояния или болести.

Б. Технология за рекомбиниране на ДНК.

Технологията за рекомбиниране на ДНК е достигнала високи нива. Молекулярните биолози вече са в състояние да рекомбинират различни структури на ДНК с лекота, създавайки нови ДНК молекули, способни да продуцират желани количества от екзогенни белтъчни продукти в преобразувани микроорганизми или клетъчни култури. Общите способи и методи се изразяват в in vitro лигиране на „лепливите“ краища на фрагменти на ДНК, произвеждащи ефективни експресионни носители, пригодни за частично трансформиране на микроорганизма, като по този начин се направлява тяхната синтезираща способност до желан екзогенен продукт. Поради индивидуалните особености на изходните продукти, съществуват трудности и науката все още няма значим напредък. В действителност, този който предзнаменува успешни резултати без солидна експериментална основа, поема риск за провал.

Рекомбинацията на ДНК от есенциални елементи, т.е. локуса на реп3 ликация, една или повече фенотипни селекционни характеристики, експресионния промотор, хетероложния генен инсертор и остатъчния вектор, обикновено се извършва извън клетката гостоприемник. Полученият рекомбинантен репликантен експресионен носител или плазмид се въвежда в клетките чрез трансформация и големи количества от рекомбинантния носител се добиват от растящия трансформант. Където генът е правилно инсертиран със спазване на сегментите, които регулират транскрипцията и транслацията на кодираната информация от ДНК, полученият генен експресор е годен да продуцира полипептидна структура, за която инсертираният ген дава кода, а процесът се определя като експресия на гена. Полученият продукт може да се добие чрез лизиране, ако е необходимо, на клетката гостоприемник, в микробиалната система и последващо пречистване от другите протеини.

В практиката чрез използването на технология за рекомбиниране на ДНК може да се получат изцяло хетероложни полипептиди - т.н. директна експресия - или алтернативно може да се получи хетероложен полипептид, синтезиран като сегмент от аминокиселинна структура на хомоложен полипептид. В последните случаи очакваният биоактивен продукт се оказва биоинактивиран при синтезирането, хомоложният/хетероложният полипептид се раздробява в извънклетъчното пространство /21/.

По един и същи начин са установени правилата на техниката за изследването на генетиката и клетъчната физиология както за клетъчни, така и за тъканни култури. Известни са способите и методите за поддържането на перманентните клетъчни линии, подготвени от успешни серийни тран сфери, изолирани от нормални клетки. За прилагане в изследванията, тези клетъчни линии се запазват върху твърда подложка в течна среда или чрез растеж в суспенсия, съдържаща хранителни съставки. Увеличаването на добива за промишлено производство изглежда поставя за решаване само на механични проблеми /23 и 24/.

По същия начин биохимичните качества на протеините се използват, като се прилагат в биотехнологиите. Клетките, продуциращи желания протеин, произвеждат също стотици други протеини, едногенни продукти на клетъчния метаболизъм. Тези контаминиращи протеини, а също и други съединения, ако не бъдат отстранени от желания протеин, могат да се прояват като токсини, ако се приложат на животни или хора в хода на терапевтичния курс с желания протеин. Техниката на белтъчната биохимия предлага възможност за сепарационни процедури, подходящи за съответните системи за получаването на хомогенни продукти, годни за употреба. Протеинната биохимия потвърждава идентичността на желания продукт и обезпечава достоверността на продукцията, без алтернации или мутации. Този клон на науката включва и създаване на лекарствени средства, предварителни изследвания и други необходими процедури за изпълнение преди успешните клинични изпитания.

Изобретението се базира на откритието, че технологията за рекомбиниране на ДНК може успешно да се използва за производство на човешки тъканен плазминогенен активатор (тПА), за предпочитане по директен способ, и в коричества достатъчни за започване и провеждане на изпитания върху опитни животни, както и клинични тествания, като задължителни преди продажба. Полученият човешки т-ПА е годен за приложение във всички негови форми, за профилактиката или лечението на хора при различни кардиоваскуларни състояния или заболявания. Затова изобретението, в един много важен аспект, е предложено като метод за лечение на съдови болести при хората, чрез приложението на т-ПА и за съответни фармацевтични продукти.

Настоящето изобретение обхваща есенциално чист човешки тъканен плазминогенен активатор. Продуктът се произвежда чрез генно инженерство от микроорганизми или системи от клетъчни култури и осигурява възможност за производството на човешки тъканен плазминогенен активатор по един твърде ефикасен начин. В допълнение, в зависимост от клетката гостоприемник, човешкият тъканен плазминогенен активатор, може да съдържа асоциирани гликосилати в помалка или по-голяма степен сравнен с естествения продукт. Във всеки случай т-ПА не съдържа контаминантите, с които обикновено е свързан в клетъчната среда.

Изобретението се отнася и до репликационни ДНК експресорни носители, носещи генни структури за кода на човешки тъканен плазминогенен активатор в експресивна форма, за колонии от микроорганизми или клетъчни култури, трансформирани с тях или за микробиални или клетъчни култури от така трансформирани колонии или култури, способни да продуцират човешки тъканен плазминогенен активатор. В тези аспекти, изобретението е насочено към различни процеси за получаване на генни структури, ДНК експресивни носители, колонии от микроорганизмови щамове и клетъчни култури и специфични формирования. Освен това изобретението включва и получаване на ферментационни култури от посочените микроорганизми или клетъчни култури.

Изобретението се пояснява от следните фигури, от които:

Фигура I показва 10% натриев додецилсулфатен полиакриламиден гел, електрофорезиран от 35 S-метионин маркирани протеини, преципитиран с анти т-ПА имуноглобулин в секретиран от меланомни клетки с или без протеазен инхибитор;

Фигура 2 - електрофореза на имунопреципитирани транслационни продукти от матрична рибонуклеинова киселина (мРНК) фракции, получени от меланомни клетки;

Фигура 3 - хибридизационен модел на 96 бактериални колонии, трансформирани с ДНК, с помощта на депото от 32 Р маркиран 14-mer като проба, изготвена основно от 5 аминокиселинната структура на човешки т-ПА;

Фигура 4 е карта на ендонуклеазна рестрикция на пълната дължина на човешки т-ПА кДНК;

Фигура 5а, 56 и 5в - нуклеотидната секвенция и извлечената аминокиселинна секвенция на пълната дължина на човешки т-ПА кДНК;

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид р*Р ИПА;

Фигура Ί - резултатите от анализа на фибринов слой за фибринолитична активност на клетки на Е. coli, трансформирани с рР ИПА;

Фигура 8 е ТХВН (четна хроматография с високо налягане) запис на пептидите на човешки т-ПА от храносмилателния ензим трипсин;

Фигура 9 - конструкцията на плазмид, кодиран за директна експресия на зрял човешки т-ПА в Ешерихия коли (Е. coli);

Фигура 10 - резултатите от проба фибринов слой, тествана за фибрино5 литичната активност на човешки тПА, произведен от Е. coli;

Фигура 1 1 - конструкцията на DHFR (мутант/или неповлиян див тип) /т-ПА кодиран плазмид, годен за трансформиране върху клетъчна култура от тъкан от млечна жлеза;

Фигура 12 е схематична диаграма на човешки тъканен плазминогенен активатор, получен чрез илюстрирания метод в Е. coli.

А. Определения

Както е използван тук терминът „човешки тъканен плазминогенен активатор“ или „човешки т-ПА“ или „тПА“ означава неприсъщ човешки (тъканен тип) плазминогенен активатор, произведен от системи от микробиални или клетъчни култури в биоактивни форми, включващи протеазни части и кореспондиращи с тези тъканни плазминогенни активатори, в други случаи естествени за човешка тъкан. Човешкият тъканен плазминогенен активаторен протеин, получен в това изобретение, е бил определен чрез детерминиран ДНК ген и свързаната с това аминокиселинна секвания. Разбираемо е, че природни алелни вариации съществуват и попадат от индивид на индивид. Тези вариации могат да бъдат демонстрирани посредством аминокиселинната/аминокиселинните разлика/и във всеобщите секвенции или чрез делеция, заместване, инсерция, инверсия или прибавяне на аминокиселина/и в гореспоменатите секвенции. В допълнение, локацията и степента на гликозилация ще зависят от природата на средата около клетката гостоприемник.

Потенциалът, който се крие в прилагането на технология за рекомбиниране на ДНК, за получаване на производни на различни човешки тъканни плазминогенни активатори, може да се видоизменя различно, в резул тат на единично или множествено заместване с аминокиселини, делеции, прибавяне или заместване, например, посредством участък с управлявана мутагенеза на ДНК, Това може да бъде осъществено чрез приготвяне на производни, съхраняващи есенциален „Kringle“ участък или от участък на серин. Всички такива алелни вариации или промени, водещи до деривати на човешкия тъканен плазмииогенен активатор, са включени в обхвата на това изобретение, както и други подобни човешки несвойствени (тъканен тип) плазминогенни активатори, с подобни физични и биологични качества. Човешкият тъканен плазминогенен активатор е приготвен (1), като се използва за първа аминокиселина метионина или (2), където метионинът е интра- или екстрацелуларно разграден, за да се използва неговата по правило първа аминокиселина, или (3) заедно с друг негов характерен полипептид или конюгиран проетин, вместо конвенционалния характерен полипептид, като последният и конюгираният специфично се разграждат в интра- или екстрацелуларното пространство /21 или 4/ посредством директна експресия на зряла форма без необходимостта от разграждане на всеки несвойствен и ненужен полипептид. Последният способ е особено важен, когато клетката гостоприемник не може или не може ефикасно да отстрани характерния пептид, когато експресивния носител е насочен да експресира тъканния плазминогенен активатор заедно с неговия характерен пептид. Във всеки случай така произведеният човешки т-ПА, в неговите различни форми, е извлечен и пречистен до ниво, подходящо за приложение за лечение на много съдови състояния и болести.

Освен това, т-ПА притежава фор6 ми. които включват протеин с една верига и двуверижен протеин. Последният е протеолитично произлязъл от едноверижно съединение. От теорията се знае, че двуверижният протеин е асоцииран с получен фибрин и тази протеолитична конверсия от едноверижен до двуверижен компонент се извършва в локуса на конверсията на пламиногена до плазмин. Представяното изобретение изхожда от предположението за изпълнение от 1-верижен протеин, както бе описано, или за изпълнение от 2-верижен протеин, както бе показано, че е възможно. 2верижният протеин може да бъде получен ин витро от конверсия след получаването на 1-верижния протеинов продукт. Така наречената „kringle“ област е позиционирана срещупосочно на участъка на серина и се предполага, че играе важна роля в свързването на тъканния плазминогенен активатор за фибриновата матрица; следователно наблюдаваната специфична активност на представяния тъканен плазминогенен активатор е реално съществуваща по отношение на тромби. Тъканният плазминогенен активатор съдържа ензимно активни участъци, кореспондиращи към природния продукт и терминът човешки тъканен плазминогенен активатор определя продукти, включващи такива самостоятелни участъци или заедно с допълнителни аминокиселинни структури по цялото протежение на молекулата.

Представеният с това изобретение човешки т-ПА има функционална дефиниция: това е способност да катализира конверсията от плазминоген до плазмин, да свързва фибрина и е квалифициран като т-ПА, основаващ се на горепосочените имунологични свойства.

„Есенциална чиста форма“ се из ползва, за да се опише това състояние на т-ПА, получен по способи на изобретението, и очистен от протеин или вещества, обикновено асоциирани с т-ПА, когато е продуциран от нерекомбинантни клетки, т.е. в неговата „естествена“ среда.

„ДХФР-протеин“ означава протеин (белтък), притежаващ свойства за активна асоциация с Ди-Хидро-Фолат Редуктоза, и който се продуцира от клетки, способни да живеят в среда, дефицитна на хипоксантин, глицин и тимидин (-ХГТ среда). Най-общо, клетки изпитващи недостиг на ДХФР протеин са неспособни да растат в такава среда, а клетки, съдържащи ДХФР протеини дават растеж.

„Клетки чувствителни на МТХ“ се отнася за клетки, които са неспособни да растат в среда, съдържаща ДХФР инхибитора метотрексат (МТХ). И така „клетки чувствителни на МТХ“ са клетки, които, освен генетично променените или други добавки, няма да прораснат в среда, подходяща за растеж, когато концентрацията на МТХ е 0,2 pg/ml или повече. Някои клетки, като бактерии, не демонстрират МТХ чувствителност поради непропускливостта си за МТХ през клетъчната мембрана, въпреки че те съдържат ДХФР протеин. Най-общо, клетки, съдържащи подобен ДХФР протеин, ще са чувствителни към метотрексат, ако са проницаеми за МТХ.

„Див тип ДХФР“ се отнася за дихидрофолат редуктоза, която обикновено се среща в отделни организми. Дивият тип ДХФР обикновено е чувствителен in vitro на ниски концентрации на метотрексат.

„ДХФР протеин“ с нисък афинитет на свързване с МТХ“ има функционална дефиниция. Това е ДХФР протеин, който, когато е генериран в клетки, създава възможност за растеж на клетки, чувствителни на МТХ, в среда, съдържаща поне 0,2 pg/ml или повече от МХТ. Известно е, че такава дефиниция зависи от способността, с която организмът продуцира ДХФР протеин“ с нисък афинитет на свързване с МТХ“. Но, както е употребено в контекста на това изобретение, като равновесие между тези два механизма, няма да се поражда безпокойство. Изпълнението на изобретението дава резултати, когато е съобразено с определените нива на МТХ, и не е резултатно, когато е под влияние увеличената експресия, и в допълнение на вродената природа на продуцирания ДХФР. Конвенциалния ДХФР протеин, който е подходящ за тази дефиниция е патентован в U.S. Appl. Ser. Ν 459 151, подадено на 19 януари 1983.

„Експресивен вектор“ се отнася за векторите, които са в състояние да експресират секвенциите на ДНК, където последните са функционално свързани с други секвенции, способни да избират тяхната експресия. Предполага се, въпреки, че не е установено точно, че тези експресионни вектори могат да репликират в организма гостоприемник също като епизомите или като интегрална част от хромозомните ДНК. Ясна неспособност за репликабилност ще ги представя като ефективно бездействащи. Накратко, „експресивен вектор“ има функционална дефиниция и всяка ДНК секвенция, която е способна за ефективна експресия на точно определена ДНК кодова конфигурация е включена в този термин, като се прилага за специфична секвенция. Най-общо казано, експресивните вектори при приложението на техниките за рекомбиниране на ДНК са често под формата на „плазмиди“, което се отнася за двойно спиралните структури на ДНК, които в техните векторни форми не са свързани с хромозомата. В представяната спецификация, „плазмид“ и „вектор“ са използвани взаимозаменяемо, като плазмид е по-често прилаганата форма от вектор. В изобретението се включват и други форми на експресивни вектори, които осигуряват еквивалентни функции и които стават вече достъпни за употреба.

„Рекомбинантни клетки гостоприемници“ се отнася за клетки, които са били трансформирани с конструктивни вектори с прилагането на техника за рекомбинация на ДНК. Както бе дефинирано, т-ПА е произведен в количества, постигнати благодарение на тази трансформация, значително по-малки от количествата, които биха били получени от нетрансформирани гостоприемници. т-ПА, получен от такива клетки, може да бъде определен като „рекомбинантен тПА“.

Б. Култури от клетки-гостоприемници и вектори.

Векторите и методите съгласно изобретението са подходящи за използване в клетки-гостоприемници от широк кръг от прокариотни и еукариотни организми.

Най-общо, прокариотите са за предпочитане, поради клониране на ДНК секвенции в конструирането на векторите, прилагани в изобретението. Например, Е. coli К12 щам 294 (ATSS № 31446) е специално прилаган. Други микробиални щамове, които могат да бъдат използвани, включват Е. coli щамове, като Е. coli В, Е. coli Х1776 (ATSS № 31537). Тези примери илюстрират изобретението, без да го ограничават.

Прокариотите също могат да бъдат използвани за експресия. Горепосочените щамове, а също така и Е. coli

W31 10 (F-, s - прототропен, ATSS N° 27325), бацили като Bacillus subtilus, и други ентеробактерии като Salmonella typhimurium или Serratia marcestens и различни видове pseudomanas също могат да бъдат използвани.

Плазмидите, най-общо, съдържат репликон и контролни структури, са извлечени от видове съвместими с клетката гостоприемник и се използват заедно с тези гостоприемници. Векторът обикновено носи репликационния участък, също като маркираните структури, които са способни да обезпечат фенотипната селекция в трансформираните клетки. Например, Е. coli е типично трансформирана използвайки pBR322, а плазмидът произлиза от разновидност на Е. coli (Bolivar, et al., Gene 2: 95 (1977). pBR322 съдържа гени резистентни на ампицилин и така обезпечава всички способи за идентифициране на трасформирани клетки. Плазмидът pBR 322 или друг микробиален плазмид, трябва също да съдържа или бива видоизменен да съдържа, промотори, които може да бъдат използвани от микробиалния организъм за експресия на неговите собствени протеини. Тези промотори най-често се използват при рекомбинантни ДНК секвенции, включващи β-лактамаза (пеницилиназа) и лактозна промоторна система (Chang et al, Nature, 275: 617 (1978); Itakura et al., Science, 198:1056 (1977); (Goeddel ey al, Nature 281: 544 (1979)) и триптофанова (трп) промоторна система (Goeddel, et al, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980); EPO Appl. Publ. N 0036776). Докато тези са най-често прилаганите, други микробиални промотори са били открити и използвани, подробностите относно техните нуклеотидни структури са били публикувани, давайки възможност на квалифицираните специалисти да ги свържат функционално с плазмидните вектори (Siebenlist, et al. Cell 20:

269 (1980)).

Освен прокариотни и еукариотни микроби също и култури от дрожди могат също да се използват. Saccharomyces cerevisiae или обикновената мая за хляб са най-честите използвани видове сред еукариотните микроорганизми, въпреки че голям брой други щамове са обикновено на разположение. За експресия в Saccharomvces, плазмидът YRp7, например, (Stinchcomb, et al, Nature, 282: 39 (1979); Kingsman et al, Gene, 7: 141 (1979); Tcschemper et al. Gene, 10: 157 (1980) е използван. Този плазмид съдържа τρπΐ ген, който осигурава селекционен маркер за мутантен щам от дрожди, не притежаващ способност за растеж в триптофан, например, АТСС N° 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics. 85: 12 (1977)). Наличието на лезия на τρπΐ като характеристика на генома на приемника-дрожд осигурява ефективна среда за откриване трансформации при растеж в отсъствие на триптофан.

Подходящи структури в дрождени вектори включват промоторите за 3фосфоглицерат киназа (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem., 255: 12073 (1980) или други гликолитични ензими (Hess, et al. J. Adv. Enzyme Reg., 7: 148 (1968); Holand, et al, Biochemistry, 17: 4900 (1978) такива като енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, фосфофруктокиназа, хексокиназа, пируват декорбоксилаза, гликозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват кинеза, триозафосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза, глюкокиназа. В създадените подходящи експресивни плазмиди, определените структури са асоциирани с тези гени, които са свързани в експресионен вектор 3 от конструкцията за екс9 пресиране, за да се постигне полиаденилация на мРНК. Други промотори, които имат допълнителни предимства като транскрипция, контролираща условията на растеж, са промоторните региони за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими имащи отношение към азотния метаболизъм, и гореспоменатите глицералдехид-3-фосфата дехидрогеназа, и ензими, отговорни за усвояването на малтозата и галактозата (Holland). Всеки плазмиден вектор съдържа подходящ за дрожди промотор, локус за репликация и подходящ край на структурата.

В допълнение за микроорганизмите, клетъчни култури, получени от многоклетъчни организми, също могат да бъдат използвани за приемници. По принцип, всяка такава клетъчна култура е подходяща, в зависимост от това дали е вертебрална или инвертебрална култура. Най-голям интерес представляват вертебрални клетки и пропагацията на такива клетки в култура (тъканна култура) е станала рутинна процедура в последните години (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)). Примери за такива използваеми линии от клетки гостоприемници са VERO и HELA клетъчни линии, клетъчни линии от яйчник от китайски хамстер (СНО) и W138, ВНК, COS-7 и MDCK клетъчни линии. Експресионните вектори за такива клетки обикновено включват, ако е необходимо, локус за репликация, промотор локализиран срещу гена за експресиране, места за привързване към съответен рибозом, места за свързване по РНК, подходящ краен участък на структурите.

За приложение в клетки от бозайници, контролните функции на експресионните вектори често се осигуря ват чрез вирусен материал. Например, често прилаганите промотори са извлечени от polyoma, Adenovirus 2 и найчесто Siman Virus (SV40). Ранните и късните промотори от вирус SV40 са спациално използвани, понеже се извличат лесно от вируса като фрагмент, който също съдържа SV40 вирусен локус за репликация (Fiers, et al, Nature, 273: 113 (1978). По-малки или по-големи фрагменти от SV40 също могат да бъдат използвани, получените включват приблизително 250 секвенции, удължени от област Hind III срещу Bg 1, локализирани във вируския локус на репликация. Освен това, също е възможно, а често и желателно, да се използва промотор или контролна секвенция обикновено асоциирана с желаната генна секвенция, като получените така контролни секвенции са съвместими с клетъчните системи на приемника.

Локусът за репликация може да бъде обезпечен също чрез конструкция на вектор с включване на екзогенен вектор, който може да бъде извлечен от SV40 или друг вирусен (Polyoma, Adeno VSV BpV и т.н.) източник, или може да бъде получен от клетка-гостоприемник с хромозомен репликационен механизъм. Ако векторът е интегриран в хромозома на клетката гостоприемник, той е често подходящ.

При избора на предпочитана клетка-гостоприемник за трансфекция от векторите от изобретението, които обхващат ДНК секвенция, кодираща двата протеина на т-ПА и ДХФР, подходящо е да се подбере гостоприемника според типа на използвания протеин ДХФР. Ако е използван „див тип“ ДХФР протеин, за предпочитане е да се избере клетка гостоприемник, която е инсуфициентна по отношение на ДХФР, което позволява използването на ДХФР кодова секвен10 ция като маркер за успешна трансфекция в селектираната среда, която не притежава хипоксантин, глицин и тимидин. Подходяща клетка гостоприемник в тези случаи е клетъчна линия от яйчник от китайски хамстер (СНО), дефицитна на ДХФР, направена и разпространена като описаната от Urlaub and Chasin (Proc. Natl. Sci., USA 77: 4216 1980), вмъкната в библиографската справка.

От друга страна, ако ДХФР протеин с нисък афинитет на свързване с МТХ, се използва като контролна секвенция, не е необходимо да се прилагат клетки, дефицитни на ДХФР. Поради това, че мутантът ДХФР е резистентен на метотрексат, МТХ съдържаща среда може да бъде използвана като средство за селекция, подбрано така, че клетките гостоприемници са сами по себе си сензитивни на метотрексат. Много еукариотни клетки, които са в състояние да абсорбират МТХ, са сензитивни към метотрексат. Една такава клетъчна линия е тази на СНО, СНО-К1 АТСС No CCL 61.

Опити, които са посочени по-нататък, описват използването на Е. coli, с лак и трп промоторни системи и използването на СНО клетки като клетки гостоприемници и експресионни вектори, които включват SV40 локус на репликация като промотор. Подходящо е използването на аналожни техники за конструиране на експресивни вектори за експресия на желаните протеинови структури в алтернативни прокариотни или еукариотни култури на клетки гостоприемници.

Задоволителни количества от т-ПА са произведени от клетъчни култури, но по-късните подобрения, използващи вторични кодови секвенции, предлагат увеличение на нивата на производство. Вторичната кодова секвенция включва дихидрофолат редуктаза (ДХФР), която е третирана с външен контролен параметър, като метотрексат, и това позволява контрол на експресията чрез контрола на концентрацията на метотрексата (МТХ).

В. Прилагани методи

Ако използваните клетки гостоприемници са без труднопропускливи клетъчни мембрани, трансфекцията се осъществява с помощта на метода за преципитация на калциев фосфот, както е описан от Graham u Van der Eb. 52: 456 (1973). Но могат да бъдат прилагани и други методи за интродукция на ДНК като нуклеарно инжектиране или протопластна фузия.

Ако се използват прокариотни клетки или клетки, съдържащи субстанциална клетъчна стена, предпочитаният метод за трансфекция е третиране с калций, чрез калциев хлорид, както е описано от Cohen, F. et al Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69: 2110 (1972).

За конструиране на подходящи вектори, съдържащи желания код и контролни секвенции, се използва стандартна техника за лигиране. Изолирани плазмиди или фрагменти от ДНК се разграждат, прикрепват и повторно лигират в желаните форми към формите, налагани от плазмидите. Разграждането се извършва с рестрикционен ензим (ензими) в подходящ буфер. Изобщо, около 1 pg плазмид или фрагменти от ДНК се прилагат с 1 единица от ензима в около 20 μΐ от буферния разтвор. (Производителите предлагат подходящи буфери и субстрати за специалните рестрикционни ензими). Прието е времето за инкубация да е 1 час при 37°С. След приключването на инкубацията, протеинът се отстранява чрез екстракция с фенол и хлороформ и нуклеиновата киселина се възстановява от водната фракция чрез преципитация с алкохол.

Ако се изискват „Blunt“ краища, препаратът се третира за 15 мин. при 15^1,С с 10 единици полимераза I (Klenow), фенол - хлороформ за екстракция и етанол за преципитация.

Размерите на сепарация на разградените фрагменти се осъществяват с 6%-ен полиакриламиден гел, описан от Goeddel, D. et al, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).

За лигиране на приблизително еквимоларни количества от желаните компоненти, съвместими за обезпечаването на точно съответствие се третират с около 10 единици Т4 ДНК лигаза на 0,5 pg ДНК. (Когато разцепените вектори се използват като компоненти е възможно безпрепятстване на повторното лигиране, на разцепените вектори чрез предварително третиране с бактериална алкална фосфатаза).

За анализа, за утвърждаване коректността на секвенцията на плазмидите, лигиращите микстури се прилагат за трансформация на Е. coli К12 щам 294 (АТСС 31446) и трансформанти, подбрани за ampicillin или tetracycline резистентност, където е подходящо. Получени са плазмиди от трансформанти посредством рестрикция и/или съчетаване на метода на Missing, et al, Nucleic Acids. Res., 9: 309 (1981) или чрез метода на Махат, et al, Methods in Enzymology, 65: 499 (1980).

Амплификацията на ДХФР протеинова кодова секвенция е осъществена от растящи клетъчни култури — приемници в среда приблизително на 20-500000 пМ концентрация на метотрексат, подходящ инхибитор на активността на ДХФР. Ефективната област на концентрация е силно зависима от природата на гена на ДХФР протеина и характеристиките на клетката гостоприемник. Ясно е, че всеобщо де финирани горни или долни лимити не могат да бъдат установени. Подходящи концентрации на други аналози на фолиева киселина или други съединения, които инхибират ДХФР също могат да се прилагат. МТХ обаче е удобна и ефективна за употреба.

Г. Общо описание на предпочитаните изпълнения на изобретението

Човешкият тъканен плазминогенен активатор се получава, съгласно следния протокол:

1. Човешки меланомни клетки, активно продуциращи тъканен плазминогенен активатор се култивират чрез сливане.

2. Клетъчни гранули от такива клетъчни култури се екстрахират в присъствието на рибонуклеазни инхибитори за изолиране на цялата цитоплазматична РНК.

3. Олиго-dT колонът изолира цялата матрична (информационна) РНК (мРНК) в полиаденилна форма. Тази мРНК се фракционира с помощта на гел на кисела урейна агораза с електрофореза.

4. Гел - фракцията, съдържаща специфична РНК за тъканен плазминогенен активатор, се идентифицира по следния способ: РНК от всяка гел фракциите се транслира в заешки ретикулоцитен лизат in vitro с прибавяне на микрозоми от кучешки панкреас. Получените транслационни продукти се имунопреципитират със специфично IgG антитяло.

5. Подходящата РНК /21 до 24S/ се конвертира с кореспондиращата еднонишкова комплиментарна ДНК (кДНК), от която се получава двойнонишкова кДНК. След поли-dC прибавяне, последният се инсертира във вектор, като плазмид носещ един или повече фенотипни маркери.

6. Така получените вектори се използват за преобразуване на бактери12 ални клетки, обезпечаващи клонална кДНК библиотека. Фонд от радиобелязан синтетичен дезокси олигонуклеотиди комплиментарни за кодони за известни аминокиселинни секвенции в т-ПА, като например фондът от 8 14mers

AAA 5-dTC( )СА( )ТА( )ТСССА-3“ G G G (комплиментарна за секвенция, кодираща за известна п- intra-аминокиселинна секвенция: триптофан-глутаминова киселина -тирозин-цистеин-аспарагинова киселина (W-E-Y-O-D) се получава и използва да апробира клоналната библиотека.

7. От позитивна кДНК клонална, се изолира и структурира плазмид ДНК.

8. Структурирана ДНК, кодираща т-ПА след това се прибавя in vitro за инсерция към подходящ експресионен носител, който се използва да трансформира подходяща клетка гостоприемник, която да прорасне в клетъчна култура и да произведе желания човешки тъканен плазминогенен активатор.

9. Така произведен, човешкият тъканен плазминогенен активатор има 251 аминокиселини в неговия ензимен серин - протеаза участък и „kringle“ съдържащ структура, за която се предполага, че има отношение към фибриновото свързване.

Гореописаната процедура е ефективна за получаването на чист т-ПА. Методи от изобретението, използващи допълнителна кодова секвенция, чувствителна на метотрексат, позволяват продукцията в култури от клетки гостоприемници на т-ПА с антигенна активност, в количества по-големи от 0,1 пикограма от клетка на ден. С подходяща апликация на усилващи условия, може да бъде достигнат добив по-го лям от 20 pg на ден от клетка. Поставени в алтернативни условия, гениите експресионни нива постигат продукция от повече от 9 х 10⁶ РЕ (Plough units) от една клетка на ден, а с подходяща амплификация, повече от 18 х 10 ⁴ РЕ от клетка на ден т-ПА може да бъде произведен.

Предимството съгласно изобретението е получаването на метотрексат като препарат, който нормално е фатален за клетъчното усвояване, и прави възможен клетъчния растеж в среда на контролирани нива на МТХ чрез амплификация на гена, кодиран за ДХФР кодова структура (Schimke. Robert Т et al., Science 202: 1051 (1978); Biedler, J.L. et al, Cancer Res. 32: 153 (1972); Chang, S.E. et al. Cell 7: 391 (1976)).

Важността на този аспект на изобретението показва, че амплификацията на гена за ДХФР може да причинява амплификация на асоциирани секвенции, които кодират други протеини. Това се среща в случая, когато асоцииран протеин е хепатит В повърхностен антиген (HBsAg) (Christman, J. et al, Proc. Acad. Sci., 79: 1815 (1982)); протеин от E. coli XGPRT (Ringold, Gordon et al, J. Molec. and Appl. Gen., 1: 165 (1981)); и ендогенни секвенции от ДХФР/5У40 плазмидна комбинация (Kafman, R.F. et al., J. Molec. Biol. 159: 601 (1982)).

Други механизми, отнасящи се за резистентността на метотрексата, включват намаляване на свързващия афинитет на протеина ДХФР така, че той е по-малко възпроемчив към метотрексат (Flintoff, W.F. et al, Somat. Cell Genet. 2: 245 (1976)).

Установено е, че двата гена за „дивия“ тип ДХФР и за протеин ДХФР, който е резистентен към МТХ, благодарение на своя собствен намален капацитет за свързване, са амплифици13 рани от присъствието на МТХ. По принцип, този аспект на изобретението се отнася за използването на амплификационното влияние на структурата на ДХФР върху асоциираните протеинови кодови секвенции за осигуряване на контролен механизъм, който позволява повишаване на експресионните нива на т-ПА секвенции, в присъствието на МТХ или благодарение на предшестващо третиране на трансформирани клетки с МТХ.

Е. Опити

Следващите опити илюстрират изобретението, без да го ограничават. Използвани са култури от Е. coli и СНО клетъчни линии, подходящи за вида на протеина ДХФР кодова секвенция, като клетъчни култури-гостоприемници. Подходящи са също и други еукариотни и прокариотни клетки.

Е.1. Експресия на гена на човешкия т-ПА в Е. coli

Е.1.А. Легенда към фигурите

Фиг. 1 е авторадиограма на SDSp (10% натриев додецилсулфатен полиакриламиден електрофорезиран гел, изразен чрез имунопреципитиран /35 S/ - метионин - маркирани(и) протеини (и), секретиран от човешки меланомни клетки в продължение на 3 часа in vivo, в присъствието (полоса Ь) или при отсъствието (полоса а) на протеазния инхибитор апротинин. След имунопреципитация с тъканен

А А А

P-dTC( )СА( )ТА( G G G проба. 96 индивидуални трансформанти прорастват в микротитрова хранителна среда, микроорганизмов препечатък на нитроцелулозна мембрана. Колониите след това се лизират, бак- 45 териалната ДНК се фиксира и филтрите се хибридизират с проби на 32Рплазминогенен активатор специфичен lg G. се наблюдават три полоси (полоса а), молекулни тегла приблизи5 телно около 65000, 63000 и 35000. В присъствието на протеазен инхибитор. обаче, видове с 35000 молекулно тегло не се наблюдават. Когато се използва преимунен серум (полоса с) продукти не са имунопреципитирани. В 10 ляво от полоса а са показани преходите и молекулните тегла на протеинови стандарти, маркирани с 14С.

Фигура 2 изобразява гел имунофорезата на имунопреципитирани тран15 слационни продукти от РНК фракции, изолирани с гел на кисела урейна агароза. Голяма полоса се наблюдава във фракции с № 7 и 8 след транслация в присъствието на кучешки панкреасни 20 микрозоми, следвана от имунопреципитация с тъканен плазминогенен активатор, специфичен lg G. Тази полоса има молекулярно тегло 63000 далтона.Размерът на мРНК мигрира25 ща във фракции 7 и 8 е приблизително 21 до 248. Позициите на рибозомалните РНК маркери, които са детерминирани след електрофореза на РНК уреа гел и визуализирани чрез 30 етаниден бромид са обозначени над съответната гел-полоса.

Фиг. 4 представя хибридизационния модел на 96 бактериални колонии с )TCCC(W-E-Y-C-D)

14-mer (W-E-Y-C-D). Филтрите се промиват за отстраняване на нехибридизираната проба и се експозират върху рентгенов филм. Тази авторадиограма е представителна за конфигурациите, получени с 48 индивидуални филма (4600 отделни колонии).

Примерът за положителен тъканен плазминогенен активаторен кДНК клон върху филтър 25 е обозначен като Е10 (стрелка).

Фигура 4 е карта на ендонуклеазна рестрикция на човешки т-ПА кДНК. Броят и фрагментите, получени от разцепването от ендонуклеазната рестрикция се установява с електрофореза през 6%-ен акриламиден гел. Позициите на участъците се потвърждават от секвенция на нуклеинова киселина (Фиг.5). Кодиращият регион на най-голямата отворена рамка е заградената област, като защрихованата област представя секвенцията на предполагаемия сигнален пептид, докато гравираният с пунктир район представя секвенцията на предполагаемия зрял тъканен плазминогенен активатор (527 аминокиселини). 5 краят на мРНК е вляво, а 3 - краят е вдясно.

Фиг. 5а, 5б и 5в илюстрират нуклеотидната секвенция и извлечената аминокиселинна секвенция на пълната дължина на човешки тъканен плазминогенен активатор кДНК. Изобразен е запис като непрекъсната секвенция на 35 аминокиселини (-35 до -1), представящ тяхната зряла конфигурация. Приема се, че тази 35-аминокиселинна секвенция се състои от хидрофилна „рго“ структура, запис на серии (+1) на зрелия протеин, от около 12 до 15 аминокиселини, по ред предшестван от „конвенционален“ хидрофобен сигнал (простиращ се от 5 до 35). Този тип на пред- просеквенция на секретирани протеини е описана предварително, т.е. с преалбумин. Според тази теория, всички секретирани молекули на тъканен плазминогенен активатор ще стартират със серии (+1) като аминотерминал. Друга теория предполага, че хидрофилната секвенция може да бъде включена във функцията на тъканния плазминогенен активатор по начин, аналогичен на този, наблюдаван при плазминогена, където пептид от 10000 далтона може да бъде разграден от аминотерминална част на природен плазминоген (Глу-плазминоген), получен в помалки молекули, с нов аминотерминал, моделиран Лиз-плазминоген. Лиз-плазминогенът е по-лесно активиран до плазмин и също има по-голям афинитет за фибрин, отколкото Глу-плазминогена. Плазминът е показан да катализира конверсията на Глуплазминоген до Лиз-плазминоген. Този тип контролен механизъм резултира в механизма на „обратната положителна връзка“. Първите количества плазмин формират, освен деградиран, фибрин също и в резултат на генерирането на плазминоген и молекули, които по-лесно се активират и свързват по-стегнато към тяхната субстанция, отколкото природния плазминоген. Резултатът е по-бърза деградация на фибрин. Хидрофилният пептид от тъканния плазминогенен активатор може да бъде включен в пробен механизъм, неговото разграждане е резултат от модифицирано свързване на ензима с фибрин. Във всеки случай, 35 аминокиселинната секвенция се разглежда като преструктура на зрелия протеин.

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид рАРИПА на тъканния плазминогенен активатор. Стартиращият плазмид рПА 25Е10 първо е разцепен с PstI до изолат 376 Ьр фрагмент, който после е разграден, както е показано на фигурата.

Фигура 7 показва резултатите от анализа на фибринов слой за фибринолитична активност на експресивния продукт, получен via рАРИПА в трансформирани клетки.

Фигура 8 е ТХВН запис (течна хроматография с високо налягане) на пептидите на човешкия тъканен плазминогенен активатор от храносмила- 5 телния ензим трипсин (Абсорбция при 210 пт). Стрелката идентифицира пика, кореспондиращ с пептида, използван за изграждането на нуклеотидната проба, приложена от библиотеката от колонии. Пептидът, предста- 10 вян чрез този пик, е разгадан по отношение на цялата му секвенция: LT-W-E Y-C D-V-P-S-C-S-C-G-L. Последователностите на другите големи пикове също са секвенирани и е установено, че се потвърждава коректността на аминосеквенцията на човешкия тъканен плазминогенен активатор. Еднобуквеният пептиден код за аминокиселините е следният:

Asp	D	Аспарагинова к-на	Пе	I	Изолевцин
Thr	T	Треонин	Leu	L	Левцин
Ser	s	Серин	Туг	Y	Тирозин
Glu	E	Глутаминова к-на	Phe	E	Фенилаланин
Pro	P	Пролин	His	h	Хистидин
Flu	G	Глицин	Lys	K	Лизин
Ala	A	Аланин	Arg	R	Аргинин
Cys	C	Цистеин	Trp	W	Триптофан
Vai	V	Валин	Gin	Q	Глутамин
Met	M	Метионин	Asn	N	Азпарагин

Фигура 9 показва конструкцията на плазмид, кодиран за директна експресия на зрял човешки т-ПА в Ешерихия коли (Е. coli). 50 gg от плазмид рРА17 е разграден с Sau3Al, Hindi u Hhal и елетрофорезиран върху 6%-ен полиакриламиден гел. Подобно, приблизително 3 gg от 263 Ьр Hhal-NarL фрагмент се пречиства от 80 gg от клон рРА25Е10, като първо се изолира 300 bp Pstl-Narl фрагмент. Всички разграждания се извършват при температура 37°С в продължение на един час и продуктите от реакцията се разтварят и електроелюират от 6%-ен полиакриламиден гел. Двата индикирани диоксиолигонуклеотиди 5 dAATTCATGTCTTAT-CAAGT (1) и GATCACTTGATAAGACA TG (I) се синтезират върху твърда фаза фосфотриестер /51/. 100 pmol от олигонуклеотид II се фосфорилират в 30 gl реакционна смес, съдържаща 60 mM Tris (pH 8), 10 mM MgCI₂, 15 тМ Ь-мер каптоетанол и 50 gCi /Р²Р/АТФ (Amersham 5000 Ci mmol'¹), 12 единици от Т4 полинуклеотид киназа се добавят и реакцията се продължава при 37°С 15 мин. lgl от 10 мМ АТФ и 12 единици от Т4 киназа се прибавят и реакцията продължава допълнително 30 мин. След екстракция с фенол/ СНСЦ фосфорилиращият олигомер II и 5 хидроксил олигомер I се комбинират с 0,5 gg елюиран 55 bp Sau3AIHhal фрагмент и етанол и се преципитират. Тези фрагменти се лигират при стайна температура за 4 ч. в 60 gl от 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 тМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТФ и 1000 единици от Т4 ДНК лигаза. Микстурата се разтваря за 1 час с 48 единици от Narl, 20 единици EcoRi и 40 единици от Bglll (за да елиминира полимеризацията чрез лигация, сцеплените Sau3AI термина) и се електрофорезира върху 6%-ен гел. 338 Ьр продукт (приблизително 0,1 mg) се възстановява чрез електроелюиране. Остатъците от т-ПА кодови структури (аминокиселини 111-528) са изолирани на 1645 Ьр фрагмент чрез разграждащ плазмид рРА25Е10 с Narl и Bglll. Плазмидът pLelF AtrplO3 е дериват на плазмида PLel FA25 (52)в който участъкът EcoRl, дистален по отношение на гена LelF А е бил отстранен (53). Три vg от pLelFAtrp 103 се разграждат с 20 единици от EcoRl и 20 единици от Bglll за 90 мин. при 37°С, електрофорезират се върху 6%-ен полиакриламиден гел и големият (=4200 Ьр) векторен фрагмент се отделя чрез електроелюация. За окончателната конструкция. 80 ng от EcoRI-Bglll pLeIFAtrplO3 се лигира със 100 ng от 1645 bp Narl Bglll фрагмент и 20 ng 338 bp EcoRINarl фрагмент за 10 часа при стайна температура. Тази лигиационна микстура се използва, за да трансформира Е. coli К-12 щам 294. ДНК плазмиди се получават от 38 от тези трансформанти и се разграждат с EcoRl. Десет от тези плазмиди съдържат желаните 600 Ьр и 472 bp EcoRl фрагменти. Анализът на ДНК структури верифицира, че един от тези плазмиди (pt-PAtrpl2) има желаната нуклеотидна структура при съединението на trp промотор, синтетична ДНК и кДНК.

Фигура 10 показва резултата от анализа на проба фибринов слой, тествана за фибринолитичната активност на тъканен плазминогенен активаторен експресивен продукт. Престояла една нощ клетъчна култура от Е. coli W3110 (АТСС 27325), съдържаща тПА експресионен вектор в бульон Luria, съдържащ 5 gg mi'¹ tetracycline се разтваря в съотношение 1:100 в среда М9, съдържаща 0,2%-на глюкоза, 0,5%-ни каз(еин)аминокиселини и 5 mg ml'¹ tetracycline. Клетките дават растеж при 37°С с А,_5(| от 0.2 индолакрилова киселина добавени към окончателната концентрация от 20 gg/ ml. Пробите се селектират чрез центрофугиране при А=0,514-0,6 (= 2 х 10^s клетки ml¹) и незабавно се замразяват. Клетъчните центрофугати се суспендират в 6М гуанидинов хидрохлорид при 5 х 108 клетки / ml, разрушават се с ултразвук за 10 сек., инкубират се при 24° за 30 мин. и тогава се диализират за 4 часа през 25 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 тМ NaCl, 0,25 тМ EDTA и 0,01 %-ен Tween 80. След диализата, пробите се центрофугират при 13000 х g за 2 мин. и 10 gl от супернатантите се анализират по отношение за тъканна плазминогенна активаторна активност. Следвайки процедурите според Granelli - Piperno и Reich (87), петритата се инкубират за 3 часа при 37°С и лизираната зона се измерва. Плазминът продуцира чиста лизирана зона във фибринов слой и областта на тази зона може да корелира в количеството тъканен плазминогенен активатор в пробата.

Е.1.Б. Източник на мР НК тъканен плазминогенен активатор

Използват се човешки меланомни клетки (Bowes Melanoma клетъчна линия, АТСС номер CRL9607), които се култивират върху конфлуентна монослойна култура в 100 ml Earles Minimal Essential спеда c прибавен натриев бикарбонат (0,12%-на финална концентрация), 2 мМ глутамин и 10%-ен топлинно инактивиран фетален телешки серум. За да се потвърди, че меланомните клетки активно продуцират човешки тъканен плазминогенен активатор, човешки меланомни клетки се култивират до сливане в 24 гнездова микротитрова паничка. В зависимост от наличието или отсъствието на 0,33 gM протеазен инхибитор апротинин, клетките се промиват веднъж с фосфат буферен физиологичен разтвор и 0,3 μΐ от серопречистен метионин. 75 pCi от /35S/ метионин се прибавя и клетките се маркират за 3 часа при 37°С. В края на тричасовия период на маркиране, средата се отстранява от клетките и се третира с или тъканен плазминогенен активаторен специфичен Ig G или преимунен серум за имунопреципитация (54). Имунопреципитационните продукти се показват чрез електрофореза на 10%ен SDS-акрилов гел. Пластът се фиксира, изсушава и подлага на флуорография.

Е.1.В. Изолиране на информационна РНК и фракциониране по размери

Цялата РНК от културите от меланомни клетки се екстрахира според способа на Ward et al. (55). Клетките се утаяват чрез центрофугиране и след това се суспендират в 10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1,5 mM MgCl₂, лизират се чрез прибавяне на NP-40 (1%-на крайна концентрация) и ядрата се утаяват чрез центрофугиране. Супернатантът съдържа цялата РНК, която по-нататък се пречиства чрез многократно екстрахиране с фенол и хлороформ. Водната фаза е 0,2 М в NaCl и след това цялата РНК се преципитира чрез прибавяне на 2 обема етанол. Олиго- dT целулозна хроматография се използва, за да пречисти мРНК от цялата получена РНК /54/. Типичните добиви от 10 г. от култивираните меланомни клетки са от 5 до 10 мг от цялата РНК и 50-200 мкг от Poly(A)pIus мРНК.

Фракционирането на Ро1уА+мРНК (200 pg) /56/ се осъществява чрез електрофореза през урея-агарозен гел. Пластът агарозен гел /57, 58/ е съставен от 1,75%-на агароза, 0,025 М натриев цитрат, рН 3,8 и М урея. Електрофорезата се провежда за 7 часа при 25 милиампера и 4°С. След то ва гелът се фракционира с острие на бръснач. Отделните слоеве се стопяват при 70°С и двукратно се екстрахират чрез фенол и еднократно - чрез хлороформ. След това фракциите се преципитират с етанол и структурно се анализират чрез in vitro странслация в заешки ретикулацитни лизатни системи, Bethesda Research Lab. /59, 60/, смесени с кучешки панкреасни микрозоми, както следва: Транслациите се извършват с помощта на 25 pCi от /35 S/ метионин и 500 нанограма от всеки гелов слой РНК в завършващ обем от 30 ml, съдържащ 25 мМ HEPES, 43,8 мМ калиев хлорид, 10 мМ креатинин фосфат, 19 аминокиселини 50 мМ всяка, 1,1 мМ магнезиев хлорид, 16,6 мМ етилендиаминтетраоцетна киселина (ЕДТА), 0,16 мМ дитиотреитол, 8,3 мМ хемин, 16,6 pg/ ml креатинин киназа, 0,33 мМ калциев хлорид, 0,66 мМ EGTA, 23,3 мМ натриев хлорид.

Инкубирането е проведено при 30°С за 90 мин. Кучешки панкреасни микрозомални мембрани се получават от сурови микрозоми с помощта ЕДТА за отстраняването от рибозомите /61/ и се третират с нуклеаза /62/ и се поставят в транслационна микстура при крайна концентрация от 7А_26О единици/ml. Транслационните продукти от имунопреципитираните транслационни продукти се анализират чрез електрофореза върху 10%-ен полиакриламиден гел с натриев додецилсулфат /63/. Обезцветените гелови пластове се фиксират, изсушават и подлагат на флуорография /64/.

Получените транслационни продукти от всяка фракция на гела се имунопреципитират със заешки античовешки тъканен плазминогенен активатор специфичен Ig G. Една главна имунопреципитирана полипептидна връзка се наблюдава в транслацията на РНК, фракционни №№ 7 и 8 (миграти от 21 до 24 S), имаща молекулно тегло от приблизително 63000 далтона. Тази връзка не е наблюдавана, когато преимунен Ig G се използва за имунопреципитиране, което подсказва, че тези полипептиди са специфичен тъканен плазминогенен активатор.

Е.1.Г. Получаване на библиотека от колонии, съдържащи тъканни плазминогенни активаторни структури.

Пет gg от гелфракционирана мРНК (гелов слой/мРНК) се използва за получаването на двойнонишкова кРНК чрез стандартни процедури /52, 65, 66/. кРНК се фракционира върху 6%-ен полиакриламиден гел, кРНК с по-голям размер от 350 базови двойки в дължина (125 ng) се електроелюира, 30 ng от кРНК се разширява с деокси (С) остатъци с използването на терминал деоксинуклеотидил трансфераза /67/ и се ренатурира с 300 ng от плазмида pBR322 /68/, който по подобен начин е свързан с деокси (G) остатъци на участъка PsT I /67/. Ренатурираната смес след това се трансформира в E.coli К12 щам 294 (АТСС № 31446). Приблизително 4600 трансформанти се добиват.

Е.1.Д. Получаване на генна сонда от ДНК.

Пречистен човешки тъканен плазминогенен активатор се добива с помощта на известните процедури /19, 20/.

Молекулата се сканира, за да се локализират регионите, най-подходящи за направата на синтетични проби, както следва:

За да стане протеинът подходящ за разграждане от трипсин, той се редуцира и карбоксиметилира. 2 mg от тъканен плазминогенен активатор първо се диализират през 0,01 %-ен Tween 80, през цялата нощ при стайна температура. Лиофилизираният протеин след това се разтваря в 12 ml от 0,56 М Tris-HCl буфер (pH 8,6), 8 моларен в уреа и 5 мМ ЕДТА. Дисулфидните връзки се редуцират чрез прибавянето на 0,1 ml от β-меркаптоетанол. Тази реакция се осъществява под азот за 2 часа при 45^1,С. Редуцираните дисулфиди се акрилират от карбоксиметил дериват с добавянето на 1,0 ml от М йодооцетна киселина в 1N NaOH. След 20 мин. при стайна температура реакцията се преустановява чрез диализа през 0,01 %-ен Tween 80, за 18 часа при стайна температура и се лиофилизира.

Проба (0,5 ml) се инжектира в притежаващата висока разделителна способност ALTEX С-8 ултрасфера 5 μ, с два пробега. Градиент от ацетонитрил се приготвя в постепенен порядък (от 1 до 5% за 5 мин., 5 до 35% за 100 мин., 35-50% за 30 мин.). В един от двата препаратни пробега, елюантът се наблюдава при две дължини на вълната (210 пт и 280 пт). Степента на абсорбция при двете дължини на вълната се използва, за да се индикират съдържащите триптофан пептиди.

Пептидните пикове, най-вероятна заради съдържанието им на триптофан, или поради използването им заради други причини, се секвенират първи. Това позволява детерминирането на секвенцията на повечето от триптофанни пептиди. След секвенирането на около 25 от най-вероятните пептидни пикове, всички данни за секвенции, които подлежат на регулиране, се събират в общ фонд, за да се придобие предварителен модел на първичната структура тъканен плазминогенен активатор. От тези данни и модел, множество възможни генни сонди се локализират.

Е.1.Е. Идентифициране на бактериални клонове, съдържащи кДНК секвенция на тъканен плазминогенен активатор.

Колониите индивидуално се инокулират в гнездата на микротитърните панички, съдържащи LB (93) + 5 pg/ml тетрациклин и се съхраняват

Пробата

А

Р - обозначена - ТС(

G при -20С, след прибавянето на DMSO до 7%. Две копия от библиотеката за колонии дават растеж върху нитроце5 лулозни филтри и ДНК от всяка колония, фиксирани на филтъра, според способа на Grunstein Hogness (69).

A С )СА( ) ТА( ) ТСССА

G Т се получава (от синтетичен олигомер) (W-E-Y-C-D) 14-mer фонд, както е описано по-горе. Филтрите съдържащи 4600 трансформанти се прехибридизират за 2 часа при стайна температура в 50 mm натриев фосфат pH 6,8, 5 х SSC (80), 150 pg разрушена ДНК от сперма на сьомга, 5 х Denhardt’s разтвор (85) 10%-ен формамид и след това се хибридизира с 50 х 10⁶ за минута от обозначената проба в същия разтвор. След инкубация от една нощ при стайна температура в 6 х SSC, 0,1%-ен SDS за 30 мин. веднъж в 2 х SSC и след това се експозира на KODAK XR-5 рентгенов филм с Dupont Lightning Plus усилващи екрани за 16 часа.

ДНК плазмид се изолира чрез бърз метод /71/ от всички колонии, показали положителна хибридизационна реакция. кДНК инсерти от тези клони след това се секвенират след субклонираните фрагменти в М13 вектор тр 7 /73/ и по химическата процедура на Махат Gilbert /74/. Фиг.З излага филтър № 25, показващ хибридизационната конфигурация на положителен тъканен плазминогенен активаторен клон. кДНК инсертът в клон 25Е10 се демонстрира като кодиран от ДНК за тъканен плазминогенен активатор чрез сравняването на неговата аминокиселинна секвенция с пептидна секвенция (виж Supra), получена от пречистен тъканен плазминогенен активатор и чрез експресивен продукт, продуциран от Е. coli, както по-долу е описано по-подробно. кДНК инсертът от клон 25Е10 (плазмид рРА25Е10) има 2304 базови чифта в дължина с най-дългата отворена четяща рамка кодираща протеин от 508 аминокиселини (MW 56 756) и съдържаща 772 ЬрЗ' нетранслирани региона. Този кДНК клон не притежава Nтерминална кодова секвенция.

Бактериален клон Е. coli (ЬРА25 А10) и проба от плазмид рРА25Е10 са депозирани в American Type Culture Colection под № 67587 и 40401 респ.

Е.1.Ж. Директна експресия на човешки тъканен плазминогенен активаторен клон в Е. coli.

Като при фиг.6, 50 pg от рРА25 Е10 (supra) са разградени с Pst I и 375 Ьр фрагмент, изолиран чрез електрофореза върху 6%-ен разтвор на полиакриламиден гел. Приблизително 3 pg от този фрагмент си изолират от гела с помощта на електроелюиране, разградени с 30 единици от Dde I за 1 час при 37°С, екстрахирани с фенол и хлороформ и преципитирани с етанол. Получените DDe I лепливи краища се разширяват до „blunt“ краища с прибавянето на 5 единици ДНК полимераза I (Klenow фрагмент) и 0,1 мМ за всяка от dATP, dCTP, dGTP, dTTP до получаване на реакционна микстура и последващо инкубиране при 4°С за 8 часа. След екстрахиране с фенол и хлороформ, ДНК се разгражда с 15 единици Nar I за 2 часа и реакционната микстура се електрофорезира върху 6%-ен полиакриламиден гел. Приблизително 0,5 pg от желания 125 bp „blunt“ край Nar 1 фрагмент се отделя. Този фрагмент кодира аминокиселини с №№ от 69 до 110 в пълната природна дължина на тъканния плазминогенен активаторен протеин.

За изолирането на 1645 bp Nar I Bal II фрагмент, 30 pg от рРА25Е10 се разграждат с 30 единици от Nar I и 35 единици от Bal II за 2 часа при 37°С и реакционната смес се електрофорезира върху 6%-ен полиакриламиден гел. Приблизително 6 pg от желания 1645 bp Nar - Bal II фрагмент се извлича.

Плазмидът pdeltaRISRC, който е дериватен на плазмида pSRCex 16/79/, в който Ecco R I участък е проксимален по отношение на trp промотор и е дистален по отношение на SRC ген, се отстранява чрез репарация с ДНК полимераза I (28), и комплиментирания на себе си олигодеоксинуклеотид AATTATGAATTCAT (синтезиран чрез фосфотриестерен метод) беше инсертиран в остатъчния Eco RI участък, непосредствено стоящ до ХЬа участък, 20 pg от pdetla RISRC се разграждат до край с Eco RI, екстрахират се с фенол и хлороформ и се преципитират с етанол. След това плазмидът се разгражда със 100 единици от нуклеазата SI при 16°С, за 30 мин. в 25 мМ натриев ацетат (pH 4,6) 1 мМ ZnCl₂ и 0,3 М NaCl, за да се създаде „blunt“ край със секвенция ATG. След екстрахиране с фенол и хлороформ и преципитиране с етанол, ДНК се разгражда с Bam HI, електрофорезирана върху 6%ен полиакриламиден гел, и големия (4300 Ьр) векторен фрагмент се извлича чрез електроелюиране.

Експресивният плазмид се сглобява чрез лигиране заедно с 0,2 от pg вектор, 0,06 pg от 126 bp „blunt“ край - Nar I фрагмент и 0,6 pg от 1645 Ьр Nar I - Bg II фрагмент с 10 единици от Т4 лигаза за 7 часа при стайна температура и при използването за трансформиране на Е. coli щам 294 (АТСС № 31446) за ампицилинова резистентност. ДНК плазмид се получава от 26 от колониите и се разгражда с ХЬа 1 и Eco RI. 12 от тези плазмиди съдържат желания 415 bp ХЬа I-Eco RI и 472 bp Eco R1 - фрагменти. Анализ на ДНК секвенция верифицира това, че няколко от тези плазмиди имат ATG (антитимоцитен глобулин) стимулационен код коректно поставен на старта на аминокиселинния № 69 (серии). Един от тези плазмиди, pdelta RIPA се тестува и произвежда желания тъканен плазминогенен активатор (Фиг. 7).

Бактериалният клон Е. coli „delta RIPA“, а също така проба от плазмида pdelta RIPA са в American Type Culture Collection c № 67585 и 40400.

Е.1.Ж. Пълна верига на тъканна плазминогенна активаторна кДНК

а) Получаване на библиотека от колонии, съдържащи N-терминални тъканни плазминогенни активаторни секвенции.

0,4 pg от синтетичния олигонуклеотид 5’TTCTGAGCACAG GGCG 3 се използва за прайминг на 7,5 pg гел фракция № 8 мРНК (supra) за получаване на двойноверижна кДНК с помощта на стандартни процедури /65, 66/. кДНК размерно се фракционира върху 6%-ен полиакриламидов гел. Фракция с размер, по-голям от 300 базови чифта (36 ng) се електроелюира. 5 ng кДНК се елонгира с деокси (С) радикали при употребата на терминална деоксицитидил трансфераза /67/ и ренатурация с 50 ng от плаз21 мид pBR322 /68/, който е по подобен начин свързан с деокси (G) радикали на участък Pst I /67/. Ренатурираната мекстура след това се трансформира в Е. coli К12 щам 294. Приблизително 1500 трансформанта се добиват.

б) Southern хибридизация на човешка геномна ДНК

Откакто кДНК прайминг реакция е осъществена, с използването на синтетичен фрагмент, който хибридизира 13 базови чифта от N-терминала на клон рРА25Е10, неподходящ рестрикционен фрагмент става достъпен в този район с 29 базови чифта (който включва 16-тег секвенция) за скрийнинг на кДНК клонове. Следователно, необходимо е да се изолира човешки тъканен плазминогенен активаторен геномен клон, за да се идентифицират всички първично разширени кДНК клонове, съдържащи кодови секвенции на тъканен плазминогенен активатор с N-терминал.

Първата стъпка в този процес включва установяването на факта, че единствен хомоложен тъканен плазминогенен активаторен ген е налице в човешката геномна ДНК. За да се детерминира това се извършва Southern хибридизация. В тази процедура/77/, 5 gg от човешка лимфоцитарна ДНК с високо молекулно тегло (получена както в 80), се разгражда напълно в различни рестрикционни ендонуклеази, електрофорезира се на 1,0%-ен агарозен гел /81/ и се изсушава на нитроцелулозен филтър /77/. Проба от Р³²-маркирана ДНК се приготвя от 5' край на кДНК инсерт от рРА25А10 (230 bp Нра II - Rsa I фрагмент) и се инхибира /82/ с нитроцелулозен филтър. 35 χ 10⁶ за минута от пробата се хибридизират за 40 часа и след това се промиват както е описано /82/. Две ендонуклеазни разградни структури осигурява само един хибридизиращ

ДНК фрагмент: Bgl II (5,7 КЬр) и Pvu II (4,2 КЬр). Два хибридизиращи ДНК фрагмента се наблюдават с Hine II (5,1 КЬр и 4,3 КЬр). Взети заедно, тези данни подсказват наличието на един единствен тъканен плазминогенен активаторен ген в човешкия геном, и че този ген съдържа поне една интервенираща секвенция.

в) Скрийнин на библиотека от човешки λ-фаг за тъканни плазминогенни активаторни гени.

Стратегията, използвана за идентифицирането на а-фаг рекомбинанти, носещи тъканни плазминогенни активаторни гени се състои в откриване на хомоложен нуклеотид с радиоактивна проба, приготвена от тъканния плазминогенен активатор CDNA 8 рРА25Е10. Един милион рекомбинанти λ-фага се посяват на Петри = DP 50 Sup F с плътност от 10000 рти/ 15 sm и нитроцелулозен р. филтър се приготвя за всяко блюдо по метода на Benton and Davis /78/. По стандартна процедура /83 / ³²Р маркирана ДНК проба се получава от 230 базови чифта Нра II - Rs I фрагмент локализира 34 базови чифта от 5' край на плазмид рРА25Е10. Всеки нитроцелулозен филтър се прехибридизира при 42°С за 2 часа в 50 мМ натриев фосфат (pH 6,5), 5Х SSC /77/, 0,05 mg/ml подложена на ултразвуково въздействие ДНК от сперма от сьомга, 5х Denhardt разтвор /84/, 50%-ен формамид и след това хибридизиран с 50 χ 10⁶ за минута от маркираната проба в същия разтвор, съдържащ 10%-ен натриев декстран сулфат /85/. След инкубация от една нощ при 42°С, филтрите се промиват 4 пъти при 50°С в 0,2Х SSC, 0,1%-ен SDS за 30 минути, еднократно в 2 х SSC при стайна температура и след това се експонират с Kodak XR-5 рентгенов филм с Dupont Сгопех усилващ екран за една нощ.

Всичко 19 клона се добиват и се хибридизират с пробата. Фаг ДНК се получава, както вече е описано /86/ от 6 рекомбинанта. λ-клон С е селектиран за получаването на фрагмент Pvu II за скрийнинг на колония. 30 pg от ДНК се разграждат с Pvu II за 1 час при 37°С, електрофорезират се на 1,0%-ен агарозен гел. 4,2 КЬр фрагмент с вече доказано съдържание на секвенции на тъканен плазминогенен активатор е електроелюиран и пречистен. Пробата с ³²Р маркер се получава чрез стандартни процедури /83/ за хибридизация на колонии, както е описано по-долу.

г) скрийнинг на библиотека от колонии за 5' тъканни плазминогенни активаторни секвенции.

Колониите се трансформират от петрита и се посяват на нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка колония фиксирана на филтър, според процедурата на Grunstein-Hogness /69/. 32Р-маркирана проба се приготвя от телешки тимусен прайминг /83/ 4,2 kbp Pvu II фрагмент от изолиран тъканен плазминогенен активаторен λгеномен клон. Филтри, съдържащи 1500 трансформанта се хибридизират с 112 х 10⁶ срт от ³²Р-геномен Pvu II фрагмент. Хибридизацията е за 16 часа, ползвайки условията, описани от Frisch et al. /82/. Филтрите екстензивно се промиват и след това се експонират на Kodak XR - 5 рентгенов филм с Dupont Lightning - Plus intensifying екрани за 16-48 часа. 18 колонии отчетливо хибридизират геномната проба. ДНК плазмид се изолира от всяка от тези колонии и се свързва с нитроцелулозни филтри и се хибридизира с Р³²-маркиран синтетичен олигонуклеотид (16-mer), използван за оригинална прайминг реакция. От 18 клона, 7 хибридизират с киназен 16mer. От секвенцията анализ след суб клоналните фрагменти в т13 вектор тр⁷ /73/, един клон (рРА 17) съдържа коректния 5’ N терминален регион от тъканен плазминогенен активатор, сигнална водеща секвенция и 84 Ьр 5' нетранслиран регион. От двата клона рРА25Е10 и рРА17 пълната нуклеотидна секвенция (Фиг.5) и рестрикционната конфигурация (Фиг.4) на пълна дължина на клон на тъканния плазминогенен активатор са детерминирани.

Бактериалният клон Е. coli (рРА17), а също и проба от плазмид рРА17 са депозирани чрез 17 дисулфидни моста, базирани на хомология с други серин протеази. Съществуват четири потенциални N-гликосилиционни участъка, три локализирани „kringle“ регионите на asn_1]7, asn_lg4, asn_2lg и един потенциален участък в регион на леката верига на asn_44g. Вариациите в структурата на олигозахаридните лиганди може би са отговорни за различните молекулни форми (65000 и 63000 мол).

Е. 1.3. Директна експресия в Е. coli на тъканен плазминогенен активаторен кДНК клон в цяла дължина.

Реконструкцията на пълната кодираща секвенция е възможна благодарение на използването на обикновен Hhal рестрикционен ендонуклеазен участък, разделен от двата частични клона рРА17 и рРА25Е10. Рестрикционен фрагмент 55 bp Sau3AI-HhaI, кореспондиращ с аминокиселини 5-23, се изолира от плазмида рРА17. Sau3AI рестрикционен участък се локализира на код четири от предполагаемата зряла кодова секвенция и се прилага, за да отстрани сигналния пептиден кодов регион. 263 bp Hhal-Narl фрагмент (кодиращ за аминокиселини 24110) също се изолира от плазмид рРА25Е10. Два синтетични деоксиолигонуклеотиди се определят с възс23 тановените кодове за аминокиселини 1-4, инкорпорирани на ATG (антимоноцитарен глобулин) транслационен инициален код и създаден на EcoRl свързващ термин. Тези три фрагмента след това се лигират заедно с форма на 338 Ьр фрагмент кодиращ за аминокиселини 1-110. Този фрагмент и 1645 bp NarL-Bglll фрагмент от рРА25Е10 след това се лигират между EcoRl и Bglll участъци от плазмида pLeIFAtrplO3 /53/, за да се получи експресионният плазмид pt PAtrpl2. Клонираният т-ПА ген се транскрибира под контрола на 300 Ьр фрагмент от Е. coli trp оперон, който съдържа trp промотор, оператор the Snine Delgarno секвенция от trp лидерен пептид, но липсва лидерният пептиден ATG инициален код /52/.

Проба от плазмида pt-PAtrpl2 е депозиран в American Type Culture Collection под № 40404.

Е.1.И. Секвенционен анализ

Секвенционният анализ се базира на деградацията на Edman /83Ь/. Пробата се поставя в чаша от Beckman 890В или 890С секвенсер. Polybrene ТМ (поли Ν, N, М'М'-тетраметил-Мтриметиленхексаметиленов диамониев диацетат) се ползва като носител в чашата /63С/. Секвенсерът се модифицира със студен уловител и няколко програмни промени, за да редуцира фоновите пикове. Реагентите са Beckman 0,1 Quadrol буфер, фенилизотиоцианат и хептафлуоробутанова киселина.

Селектираните Едманови цикли ръчно се конвентират до 2-анилино-

5-тиазолинонови деривати. 1-хлорбутанът се изсушава под азот. След това 1,0 N солна киселина във вода се прибавя към 2-анилино-5-тиазолинон и загрети до 70°С за 10 мин., за да конвентират в З-фенил-2-тиохидантоин (ФХТ дериват). ФХТ-аминоки селинният остатък след това се разтваря в 50%-ен ацетонов нитрил и вода и се инжектира в течен хроматограф с високо налягане, реверсивна фаза. Всяка ФХТ-аминокиселина след това се идентифицира чрез сравнение с ретенционните времена на стандартната микстура от ФХТ-аминокиселини, които се въвеждат с конверсионния флакон и се третират по същия начин, както цикъла от секвенсера.

Е.1.Н. Анализи за откриване на експресия на тъканен плазминогенен активатор

1. Директен анализ на плазминова формация

а) Теория

Чувствителен анализ за тъканен плазминогенен активатор може да се получи чрез мониторинг на тъканния плазминогенен активатор, катализиращ конверсията от плазминоген до плазмин. Плазминът е ензим, за който съществуват хроматографски анализи. Тези анализи се основават на протеолитичното разграждане на трипептид от хромофорна група. Степента на разграждане директно зависи както от спецификацията, така и от протеазата, която е разграждана. Основата на анализа е детерминацията на количеството плазмин, формиращ инкубацията на тъканния плазминогенен активатор, съдържащ разтвор с разтвор от плазминоген. Най-голямо количество от активатор формира найголямо количество от плазмин. Плазминът се измерва посредством мониторинг на неговото разграждане от хроматогенния субстрат S2251 (набавен от Kabi Group. Int. Greenwich. Conn.).

б) Процедура

Кратно на пробата количество се смесва с 0,10 ml от 0,7 mgs/ml плазминоген (в 0,05М Tris. HCI, pH 7,4, съдържащ 0,012 М NaCl) и допълнен обем до 0,15 ml. Сместа се инкубира при 37°С за 10 мин. 0,35 мл от S2251 (1,0 тМ разтвор в горния буфер) се добавя и реакцията продължава в продължение на 30 мин. при 37°С. Ледена оцетна киселина (25 μΐ) се прибавя, за да терминира реакцията. Пробите се центрофугират и се измерва абсорбцията на дължина на вълната 405 nm. Количественото определяне на активността се постига посредством сравняването със стандартен урокиназен разтвор. Активността е записана в Plough единици, като 90000 Plough единици са еквивалентни на активността показана от 1 mg от пречистен тъканен плазминогенен активатор.

2. Индиректен анализ на плазминова формация

а) Теория

Предложен е чувствителен анализ на активността на тъканния плазминогенен активатор /87/. Анализът се базира на детерминацията на плазминова формация чрез измерването на размера на плазминовото разграждане от фибрин в агарова среда, съдържаща фибрин и плазминоген. Плазминът продуцира открояваща се зона на лизис във фибриновата подложка. Областта на тази зона на лизис може да корелира с количеството на тъканен плазминогенен активатор в пробата.

б) Процедура

Следвайки процедурата на Granelli-Piperno и Reich /87/, петритата се инкубират 3,5 часа при 37°С и зоната на лизис се измерва. Количеството се определя чрез сравняването със стандартен урокиназен разтвор.

Е.1.Л. Установяване на активността на тъканния плазминогенен активатор.

1. Бактериално развитие и подготовка на проба

Колония от Е. coli, съдържаща плазмида pdeltaRIPA се инокулира в епруветка, съдържаща 5 ml от LB хранителна среда с 20 gg/ml ampicillin. Клетките се оставят за една нощ при 37°С. Аликвотна част от тази култура се разрежда в съотношение 1:100 в 300 ml от М9 среда, съдържаща 20 pg/ml ampicillin. Клетките се оставят в колба при 37°С за 4 часа с абсорбция на 550 nm от 0,419. Триптофановият аналог индолакрилова киселина се добавя до концентрация 30 pg/ml. Клетките се инкубират 90 мин. с протичаща абсорбция на 550 nm от 0,628 и се отделят чрез центрофугиране и ресуспендиране в 0,8 ml от 0,01 М Tris. pH 8.0, съдържаща 0,01 М ЕДТА. Получената суспенсия се разбърква при стайна температура за 18 часа. Пробата се центрофугира и супернатантът се анализира по отношение на активността на тъканния плазминогенен активатор.

2. Установяване на активността

Таблица 1 показва резултата от активацията на плазминоген чрез екстракт от Е. coli. Генерираната активност зависи от присъствието на плазминоген. Тази активност не е повлияна от преимунен серум от заек, но е инхибирана от антисерум, който е създаден срещу тъканен плазминогенен активатор (деривати) от меланомни клетки /88/. Това демонстрира, че екстрактите от Е. coli продуцират плазминоген, повлияващ активността, която е инхибирана от антитела срещу тъканния плазминогенен активатор.

Фиг.7 показва резултата от анализа на фибриново Петри за фибринолитична активност. Стандартно количество от урокиназа се прибавя в централната редица в концентрации от ляво на дясно, от 0,24, 0,14, 0,10, 0,05, 0,02 Plough единици. Долната редица е от проби от натурален тъканен плазминогенен активатор със същото ко личество от ензима във всяко гнездо. Гнездата съдържат от ляво на дясно тъканен плазминогенен активатор, антиплазминогенен активатор плюс тъканни плазминогенни активаторни антитела. Гнездата на горната редица съдържат 8 ul от рекомбинантни тъканни плазминогенни активаторни екстракти от Е. coli. В първото гнездо е само екстракт, във второто има прибавен преимунен серум, и в третото има прибавени тъканни плазминогенни активаторни антитела. Преимунният серум не въздейства на неутралния или на рекомбинантния тъканен плазминогенен активатор и тъканните плазминогенни активаторни антитела 5 инхибират активността на натурални, като екстракти от Е. coli. Основавайки се на урокиназни стандарти, екстрактите съдържат незначително помалко от 2,5 Plough единици за милилитър. Това е благоприятно в срав10 нение със стойността полчена в Таблица I от 1,3 Plough единици за ml.

Таблица 1 показва резултатите от анализите, извършени по начина, описан по-горе в Е.1.К.15.

Таблица 1

ПЛАЗМИНОГЕННА АКТИВАЦИЯ ЧРЕЗ ЕКСТРАКТ ОТ Е. COL1 ОТ КУЛТУРИ, СЪДЪРЖАЩИ PgeltaRIPA

ПРОБА А⁴⁰⁵ Активност¹ в % ИЗЧИСЛЕНИ Plough

ЕДИНИЦИ В ml

Екстракт без

плазминоген	0,043	(0)
Естракт	0,451	(100)	1,3
Екстракт плюс
преимунен серум	0,477	106	-
Екстракт плюс
анти т-ПА антитела	0,079	9	-

Фигура 10 представя резултатите от анализа на проба фибринов слой, извършен с екстракти от 10 L ферментационни култури от Е. coli, съ- 35 държащи тъканен плазминогенен активаторен експресивен плазмид. Фибринолитичната активност на тъканния плазминогенен активатор, съдържащ екстракт, е представен на фиг. 10 40 (гнездо А). Тази фибринолитична активност е инхибирана от анти т-ПА IgG (гнездо С), но не и от преимунен IgG (гнездо В) или антиурокиназен IgG (гнездо D) и не се виждат дока- 45 зателства за активност от акстракта, получен от клетки, съдържащи като контролния левкоцитен интерферонов плазмид pLeIFAtrplO3 (гнездо Н).

Е.2. Получаване на т-ПА с помощта на ДХФР протеин с ниска активност на свързване за МТХ.

Е.2.А. Векторна конструкция

Секвенцията, кодираща човешки тъканен плазминогенен активатор (т-ПА) е инсертирана в експресивен плазмид, съдържащ мутанта ДХФР с ниска активност на свързване за МТХ, описана в компендинг заявка, U.S- Ser. No 459151 подадена на януяари 1983, кореспондираща с EP 117060, осъществена със следната процедура (фиг. 11):

Три фрагмента от отчасти съвпадащите плазмиди, рРА25Е10, рРА17 и pt-PATrpl2 (supra) се приготвят както следва: Плазмид рРА17 се разгражда с Dde I, с използването Klenow ДНК полимераза 1, и с Pst I; Изолира се приблизително 200 Ьр фрагментът, съдържащ 5-терминал т-ПА секвенция. Вторият т-ПА фрагмент се получава чрез разграждането на ptPATrpl2 с Pst и Nar I и изолирайки приблизително 310 Ьр фрагмент. Третият т-ПА фрагмент се добива чрез разграждането на рРА25Е10 с Nar I и Bal 11 и изолирайки приблизително 1645 Ьр фрагмент, който съдържа допълнително повече от т-ПА кодовия регион, няколко 3 не-транслирани секвенции.

Плазмид рЕ342, който експресира HBV повърхностен антиген (също упоменат като pHBs348-E) е описан от Levinson et al., patent application Ser. No 326980, подадена на 3 декември 1981 г., сега изоставена, заради продължението на application Ser. No 603529, подадена на 24 април 1988 г. кореспондираща с ЕР 73656, която е спомената в биллиографската справка. (Накратко, локусът на вируса SV 40 на Simian, се изолира чрез разцепване на SV40 ДНК с Hindlll и конвертирайки краищата на Hindlll до EcoRi краища чрез прибавяне на конвертор (AGCTGAATTC). Тази ДНК се срязва с PviH и RI линкерити се прибавят. Следвайки разцепване с EcoRi, фрагменътт 348 Ьр, обхващащ локуса, се изолира посредством електрофореза и електроелюиране с полиакриламиден гел и се клонира в pBR322. Експресивният плазмид pHBs348-B се конструира чрез клониране на фрагмента 1986 Ьр, получен от EcoRi и Bglll разцепване от HBV (хепатит В вирус) (Animal Virus Genetics, (Ch 5) Acad. Press, N.Y. 1980), (който обхваща гена, кодиращ HBsAg) в плазмида pML (Luskv et al.. Nature, 293: 79 (1981) на участъците EcoRi и BamHI. (pML е дериват на pBR322, който има делеция, елиминираща секвенции, които са инхибитори за плазмидна репликация в маймунски клетки). Полученият плазмид (pRl-Bgl) след това се линеаризира с EcoRi. и фрагментът 348 Ьр, представяйки локусния регион на SV40, се въвежда в EcoRi участък от bRI-Bgl. Локусният фрагмент може да инсертира в друга ориентация. Този фрагмент кодира и двата SV40 промотора - ранният и късният с добавяне към локуса на репликация. HBV гени могат да бъдат експресирани под контрол на единия от промоторите, зависещ от тази ориентация (pHBS348-E представящ HBs експресиран под контрола на ранния промотор) рЬЕ342 е модифициран чрез частично разцепване с EcoRi, запълвайки в разцепвания участък с използването на Klenow ДНК полимераза I, и лигирайки плазмидния гръб заедно с това, като така отстранява Есо RI участъка, записващ SV40 локуса в рЕ42. Полученият плазмид, проектиращ pE342ARI, се разцепва с EcoRi и е запълнен с ползването на Klenow ДНК полимераза I. След електрофореза на акриламиден гел, приблизително 3500 Ьр фрагментът е подложен на електроелюиране, екстрахира се с фенол-хлороформ и се преципитира с етанол както по-горе.

Така полученият р342Е 3500 Ьр вектор, както и по-горе описаните тПА фрагменти, включващи приблизително 2160 Ьр се лигират заедно с използването на стандартни техники. Плазмид, съдържащ трите т-ПА кодиращи фрагмента в собствената ори27 ентация се изолира, характеризира се и се моделира - рЕ342-т-ПА. Този плазмид се разцепва със Sac 11 и се третира с алкална фосфатаза (BRL). За да се постигне секвенцията на ДХФР, приблизително 1700 Ьр фрагмент се генерира чрез SacII разцепване от pEHER. (pEHER е плазмид експресиращ мутант ДХФР, описан в U.S. 459151 (supra). Този фрагмент се легира в рЕ342-т-ПА плазмид, за да създаде pETPAER400, а плазмид, който е аналогичен на pEHER с изключение на HBsAg кодов регион е преместен чрез кДНК от т-ПА.

Е.2.Б. Експресия и амплификация на т-ПА секвенция pbETRAER400 (pETPER) се трансфектира в две dhfr-CHO-DUX В11 клетки и DHER+CHO-K1 (АТСС CCL61) клетки посредством метода на Granam and Van der Eb (supra). Трансформираните dhtr-клетки се селектират чрез прорастване в среда, дефицитна на глицин, хипоксантин и тимидин. Трансформираните DHFR+ клетки се селектират чрез растеж в > 100 пМ МТН. Колониите, които израстват в подходящо подбраната среда са изолирани с използването на клониращи пръстени и пропагирани в същата среда за няколко поколения.

За амплификация, клетки от колониите са разцепени в среда, съдържаща 5 х 10⁴, 5 х 10⁵, 2,5 х 10⁵, 5 х 10^s, 5 х 10⁶ пМ МТХ и пасажирани няколко пъти. Клетките са посети при много ниска (10² - 10³ клетка/среда) плътност в 10 sm паничка и получените колонии се изолират.

Е.2.В. Аналитични методи

Експресията на т-ПА в трансфектирани амплификирани колонии може конвенционално да бъде анализирана посредством методите, подобни на тези, изложени в E.l.K.1.5 (supra).

Коамплификацията на ДХФР и т

ПА секвенции се анализира посредством изолиране на ДНК от съединени монослойни колонии, както следва: съединени монослойно колонии в 1500 mm петрита се промиват с 50 ml стерилен PBS (фосфатно-солеви буферен разтвор) и лизират чрез прибавянето на 5 ml от 0,1% SDS (серно-солеви буферен разтвор). 0,4 М СаС1₂, 0,1 М EDTA, рН8. След 5-10 мин. микстурата се отделя, екстрахира се във фенол и хлороформ и се преципитира в етанол. ДНК е ресуспендирана в 1ml (за 150 mm петри) 10 тМ Tris-HCl рН8, 1 тМ EDTA (ТЕ). Rnase добавени до 0,1 g/ml и разтворът се инкубира 30 мин. при 37°С. SDS след това се добавя до 0,1 % и проназа (на Sigma) също се прибавя до 0,5 mg/ml. След 3-16 часа инкубиране при 37°С разтворът отново се екстрахира с фенол и хлороформ последователно и се преципитира с етанол. Пелетът на ДНК се ресуспендира в 0,5 ml вода, разцепва се с рестрикционни ензими. Приблизително 5-10 gg от разцепената ДНК е електрофорезирана в агоразен гел /1%-на агораза в Trisацетатен буфер (40 MMTris, ImM EDTA, добавена до pH 8,2 с оцетна киселина)/; Crouse, et al, J.Biol.Chem. 257: 7887 (1982). След като бромфенолната синя боя мигрира от пътя надолу по гела, гелът се отстранява и оцветява с етаниден бромид. След визуализирането на ДНК с ултравиолетова светлина, ДНК се трансферира от гела към нитроцелулозните филтри, както е в процедурата на Southern (J.Mol.Biol. 98: 503 (1975)). Филтрите след това се хибридизират с белязана транслационна сонда, направена от 1700 bp SacII фрагмент от pbEHER (получен и хибридизиран като гореописаната), или от приблизително 1970 Ьр Bg-фрагмент от pETPER.

Е.З. Произвеждане на т-ПА в съединение с див тип ДХФР белтък.

Е.З.А. Векторна конструкция

По начин, аналогичен на способа, използван при конструирането на pETPER, се конструира плазмидът PETPER, съдържащ ДНК секвенция, кодираща див тип ДХФР. Конструкцията е подобна на тази, описана в пример Е.2.А. с изключение на това, че плазмидът pEHER като източник на генна секвенция за ДХФР протеин, се замества с плазмида pE342.HBV.E400.D22, описан в копендинг U.S. 459152, подаден на 19 януари 1983 г., сега Pat. No 4713339, издаден на 15 декември 1987 г., кореспондиращ с ЕР 117058, споменат в библиографската справка. Плазмидът pE342.HBV.E400.D22 е същият като pEHER с изключение на един единствено различен базов чифт, като несъвпадение между дивия тип и мутанта ДХФР. Така полученият плазмид pEHER е аналогичен на pEHER, с изключение на това, че ДНК секвенцията, кодирана за дивия тип ДХФР е заместена за тази на мутанта. Проба за плазмида pETPFR е била депозирана в American Type Culture Collection под № 40403.

Е.З.В. Експресия на т-ПА секвенция pETPFR се използва, за да трансфектира ДХФР дефицитните СНО клетки (Urlaub and Chasin (supra)), c използването на преципитацията с калциев фосфат по метода на Graham and Van der Eb. Двадесет и един колонии, които прораснаха върху селективна среда (-HGT), се подлагат на анализ посредством детектиране на плазминови формации, получаващи се при разграждането на фибрин в петри с агар, съдържащ фибрин и плазминоген, както е описано от GranelliPiperno, et al. d.Exp. Med. 148: 223 (1978).

Четири от най-силно позитивните клонове след това се анализират количествено за плазминова формация, според метода, изложен в Е.1.К.1.5.

От такова количествено детерминиране се установява, че четирите тествани клона показват същата или сравнима секреционна способност на т-ПА в средата, изразена чрез единици/клетка/ден. Субклонове се получават посредством трансферен инокулат от два от клоновете в отделни петрита съдържащи -HGT среда. Два от получените субклона, 18В и 1 се ползват за по-нататъшния анализ.

Е.З.В. Амплификация и нива на секреция на т-ПА.

Посочените по-горе клонове се посяват при 2 х 10^s клетки в петрита от 100 ml, в 50 пМ МТХ, за да се подпомогне амплификацията. Преживелите клетки, когато са анализирани по споменатия по-горе начин, дават във всички случаи около 10 пъти неамплифицирани количества, изразяващи активността на тъканния плазминогенен активатор. Два от тези клона се подбират за по-нататъшно изследване и са наименувани 1-15 и 18В-9.

По-нататък, субклонът 1-15 се амплифицира чрез посетите 2 x1ο⁵ клетки в петрита от 100 ml, съдържащи 500 пМ МТХ.Анализът на така амплифицираните клетки показва по-нататъшно увеличаване на добива (от около 3 обхвата) на т-ПА когато се извършва количествено определяне, според метода в Е.1.В. нивата са в обхвата на 7 х 10-4 единици/клетка/ден.

Една част от тези амплифицирани клетки след това се трансферира и поддържа присъствие от 10000 пМ МТХ. Субклоновете 1-15 и 18В-9 се тестват, след като са поддържани за приблизително 1-2 месеца при условията, показани в Табл. 3.

Таблица 3

КЛЕТЪЧНА ЛИНИЯ	УСЛОВИЯ НА РАСТЕЖ	по т-ПА/клетка/ден*
1-15500	500 пМ МТХ	28,5 х 10-3
1-«55оо	500 пМ МТХ	26,0 х 10-3
‘-’55Оо	(-HGT среда без МТХ)	8,3 х 10-3
’-155ОО	(-HGT среда без МТХ)	18,0 х 10-3
15]0000	10 μΜ МТХ	29,3 х 10-3
10000	10 μΜ МТХ	49,0 х 10-3
18В-9	50 пМ МТХ	14,3 х 10-3
18-В-9	50 пМ МТХ	14,4 х 10-3
18В-9	(-HGT среда без МТХ)	14,3 х 0-3
18В-9	(-HGT среда без МТХ)	14,4 х 10-3
1	(-HGT среда без МТХ)	1,0 х 10-3
1	(-HGT среда без МТХ)	0,7 х 10-3

* т-ПА в клетъчната среда е анализиран количествено чрез радиоимунологичен метод, както следва: Пречистен т-ПА и пречистен йодов т-ПА маркер, получен от меланомни клетки, се разлеждат на серии, за да се включват концентрации от 12,5 400 ng/ml в буферен разтвор, съдържащ солен буферен фосфат, pH 7,3, 0,5 волски серумен албумин, 0,01 %-ен Tween 80 и 0,02%-ен NaN₃. Към радиоактивните маркиращи протении, за да бъдат анализирани, се прибавят подходящи разреждания на пробите. Антигените се оставят за инкубация за една нощ при стайна температура в присъствието на 1:10000 разреждане на IgG фракция от заешки анти тПА антисерум. Комплексът антиген/ антитяло се преципитира чрез абсорбция с антизаешки IgG имуногранули (BioRad) от козел за 2 ч. при стайна температура. Гранулите се пречистват с прибавянето на солен разредител, центрофугират се за 10 мин. при 2000 х g при 4°С. Супернатантите се изхвърлят и се измерва радиоактивността на преципитатите. Концентра20 циите се установяват чрез сравняване със стандарт.

Клетъчните линии са както следва: клетъчна линия „1“ е неамплифициран клон от оригиналната група на четирите клона. „1-15₅₀₀“ е амплифициран субклон от клетъчна линия „1“, която се амплифицира инициално в 50 пМ МТХ, за да даде 1-15 и след това се трансферира за по-нататъшно амплифициране в 500 пМ МТХ. 1 -15_|0000 е субклон на 1-15_JOO, който впоследствие е амплифициран в присъствието на 10000 пМ МТХ. Клетъчна линия 18В-9 е субклон на оригиналната група на четирите клона, която е амплифицирана с 50 пМ МТХ.

Пробата с СНО клетъчна линия 115₅₀₀ е депозирана в American Type Culture Collection под № CRL 99606.

Всички от амплифицираните клетки показват увеличени нива на секреция на т-ПА, много над тези, които са показали неамплифицираните клетки. Ако една неамплифицирана култура секретира т-ПА повече от 0,5 pg/ клетка/ден, амплификацията дава 50 pg/клетка/ден.

Ж. Фармакологични структури

Съединенията от настоящото изобретение могат да бъдат формулирани според известните методи за получаване на фармацевтично използваеми структури, където продуктът на човешкия тъканен плазминогенен активатор е комбиниран в микстура с фармацевтично приемливо средство - носител. Подходящи носители и технологията за тяхното получаване, включване на други човешки протеини, включително и човешки серумен албумин, са описани например в Remington’s Pharmaceutical Science от Е.W.Martin, споменат в приложената библиографска справка. Такива структури ще съдържат ефективно количество от протеин, заедно с подходящо количество от носителя, за да бъдат произведени фармацевтично приемливи композиции, подходящи за ефективно приложение.

Например, човешкият тъканен плазминогенен активатор, може да бъде прилаган параентерално на лица, страдащи от кардиоваскуларни заболявания. Определянето на дозата и дозирането може да съпътстват клиничните изследвания на други кардиоваскуларни препарати, тромболитични средства, т.е. около 440 IU/kg телесно тегло, като интравенозната начална доза е последвана от продължителна интравенозна инфузия от около 440 IU/kg/час за 12 часа, при пациенти, страдащи от пулмонарна емболия.

Като пример за подходящо определяне на дозата на есенциалния хомогенен човешки тъканен плазминогенен активатор при параентерална апликация, флакон, съдържащ 25000 Ш активност тъканен плазминогенен активатор, 25 mg mannitol и 45 mg NaCl могат да бъдат реконститюирани с 5 ml стерилна дестилирана вода за инжектиране и смесени с подходящ обем от 0,9%-ен натриев хлорид или 5%-на декстроза за интравенозно приложение.

3. Подобно описание на рекомбинантна човешка т-ПА

Структурата на частичния ембодимент на човешкия т-ПА получена в опитите, описани по-горе, е била подложена на изследване по отношение на някои детайли, както чрез осветяване на генната кодова секвенция, така и чрез известните биохимични техники за анализ на белтъци. Съвременното разбиране за структурата на белтъците е илюстрирано на фиг. 12.

Още Collen и сътр. /88/ демонстрираха, че двойноверижният човешки т-ПА е формиран от протеолитичното разграждане на едноверижна молекула в два полипептида, свързани с дисулфидна връзка. Съвременното ниво на познания ни позволява да заключим, че тежката верига (30882 мол. тегло) е получена от NH терминална част и че леката верига (28126 мол.тегло) включва СООН - терминална област. N-терминал, структуриран от двуверижна молекула, подсказва, че двуверижната форма е генерирана чрез разцепването на единична аргинил-изолевцинова връзка (Фиг. 12; нарисуваната стрелка).

Първичната структура на частта на тежкия верижен участък от човешкия т-ПА (Фиг. 12) разкрива висока степен на секвенционна хомология с т.н. „Krinkle“ региони на плазминоген / 89/ и протромбин /40 и 41/. „Krinkle“ регион се отнася за характеристична триадна дисулфидна структура, оригинално открита в „про“-фрагмент на протромбин, най-първо описана в детайли от Magnusson et al. /91, 92/. От първичната секвенция на т-ПА, два т.н. „Krinkle“ региони, от 82 аминокиселини всеки, е очевидна високата степен на хомология с 5 „Krinkle“ ре31 гиони на плазминоген. Оставащите Nтерминални 91 аминокиселини, разделят висока степен на хомология с „конвенционалния“ „Krinkle“ регион. 5 Обаче някой може да спекулира, че тази област може също да приема структура, съдържаща многократни дисулфидни връзки, като 11 допълнителни цистеинови остатъка, намерени тук. 10

Каталитичният участък на леката верига на човешкия т-ПА, така нареченият серин протеазен участък, както в други серинови ензими е най-ве роятно формиран чрез хистидип,,_г аспарагин ₇₁ и серин«₇₎₍ остатъци. Нещо повече, аминокиселинните секвенции, заобикалящи тези остатъци са много хомоложни към кореспондиращите части на други серинови белтъци, като трипсин, протромбин и плазминоген.

Въпреки, че е направена справка с избрани реализации, следва да се разбира, че настоящото изобретение не се ограничава до тях, а по-скоро представлява обоснован списък от приложените претенции.

Claims (11)

1. Изолат от ДНК, състоящ се предимно от ДНК секвенция, кодираща човешки тъканен плазминогенен активатор.

2. Изолатът от ДНК съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има аминокиселинната секвенция 1-527, изобразена на фигури 5а, 5Ь и 5с.

3. Рекомбинантен експресивен вектор, съдържащ ДНК секвенция, кодиращ човешкия тъканен плазминогенен активатор, характеризиращ се с това, че векторът е способен да експресира човешки тъканен плазминогенен активатор в трансформиран микроорганизъм или клетъчна култура.

4. Рекомбинантен експресивен вектор съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че споменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има аминокиселинната секвенция 1527 изобразена на фигури 5а, 5Ь и 5с.

5. Микроорганизъм, трансформиран посредством вектора съгласно претенция 3, способен да експресира човешки тъканен плазминогенен активатор.

6. Микроорганизъм Е. coli съгласно претенция 5.

7. Микроорганизъм съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че споменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има аминокиселинна секвенция 1-527, изобразена на фигури 5а, 5Ь и 5с.

8. Клетъчна култура способна да експресира човешки тъканен плазминогенен активатор, получена чрез трансформирането на клетъчна линия от бозайник, посредством вектора съгласно претенция 3.

9. Клетъчна култура съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че клетъчната линия е клетъчна линия от яйчник на китайски хамстер.

10. Клетъчна култура съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че споменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има аминокиселинната секвенция 1-527, изобразена на фигури 5а, 5Ь и 5с.

11. Клетъчна култура съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че споменатият човешки тъканен плазминогенен активатор има имунокиселинната секвенция 1-527, от фигури 5а, 5Ь и 5с.