CN111718415B - 一种抗tigit纳米抗体及其应用 - Google Patents

一种抗tigit纳米抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗TIGIT纳米抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种抗抗TIGIT纳米抗体及其序列。本发明还提供了编码上述纳米抗体或其VHH链的编码序列、相应的表达载体和能够表达该纳米抗体的宿主细胞，以及本发明纳米抗体的生产方法。本发明纳米抗体能够阻断TIGIT与CT26细胞表面CD155的相互作用，且能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白；本发明纳米抗体能够识别人和食蟹猴TIGIT；本发明纳米抗体阻断活性显著优于对照抗体Tiragolumab；本发明纳米抗体对T细胞具有显著的激活作用，且激活作用显著优于对照抗体Tiragolumab。

Description

一种抗TIGIT纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，更具体地涉及一种抗TIGIT纳米抗体及其应用。
背景技术
近年来TIGIT的免疫检查点蛋白成为癌症免疫疗法研发领域的热点之一。TIGIT的全称是T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(Tcell immunoreceptor with Ig and ITIMdomains)。它是一种抑制性受体，在多种类型的T细胞表面表达。T细胞表面表达着许多种不同的激活性受体和抑制性受体，这些受体经常两两配对，对T细胞的活性进行微调。TIGIT和激活性受体CD226是一对，它们的共同配体是PVR(CD155)。TIGIT通过与CD226竞争和PVR的结合，扰乱CD226的激活等机制，抑制T细胞的激活。TIGIT在多种癌症类型的肿瘤浸润T细胞中高度表达。
研究发现，大多数肿瘤的NK细胞都有表达TIGIT，TIGIT在肿瘤免疫抑制中的作用和PD-1/PD-L1类似，TIGIT抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂可发挥协同抗肿瘤作用。2018年6月18日，国际顶级期刊《自然》子刊《自然-免疫学》(Nature Immunology)杂志在线发表了中国科学技术大学生命科学与医学部、中科院天然免疫与慢性疾病重点实验室和合肥微尺度物质科学国家研究中心教授田志刚、孙汭课题组的研究论文Blockade of the checkpointreceptor TIGIT prevents NK cell exhaustion and elicits potent anti-tumorimmunity，研究成果揭示了肿瘤发展过程中抑制性受体TIGIT可导致NK细胞耗竭，并证明抗TIGIT单抗可逆转NK细胞耗竭并用于多种肿瘤的免疫治疗。全球已有多家药企投入到TIGIT抗体的研发，例如罗氏的tiragolumab、百时美施贵宝(BMS)的BMS-986207、OncoMedPharmaceuticals公司的OMP-313M32、基因泰克的MTIG7192A、默沙东(MSD)旗下的MK-7684、以及ArcusBiosciences的AB154、百济神州在研TIGIT单克隆抗体BGB-A1217、复宏汉霖HLX53、君实生物的JS006和思坦维生物的mAb-7等。
目前，已公布的有CN109734806A、US20200062859A1、WO2019168382A1、WO2020020281A1、CN110997720A、CN110818795B、WO2019129221A1等专利报道了TIGIT的抗体及相关应用。其中，专利WO2019129221A1中公开了一种包含了特异性识别TIGIT的单域抗体(纳米抗体)的TIGIT构建体，专利CN110818795B公开了一种包含与TIGIT结合的单结构域抗体的抗TIGIT抗体。目前有不少于12款TIGIT抗体进入临床，但是全球尚无TIGIT抗体获批上市，因此仍然需要开发新的、差异化显著的、更适用于临床应用的TIGIT抗体，尤其是TIGIT纳米抗体。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供一种抗TIGIT纳米抗体及其应用，它的目的在于提供一种差异化显著的、更适用于临床应用的TIGIT抗体。
本发明所要解决的技术问题采取以下技术方案来实现：
本发明的第一方面，提供了一种抗TIGIT纳米抗体VHH链的互补决定区CDR，所述互补决定区CDR包含以下组合中的一种或多种：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、以及SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1、SEQ ID NO:11所示的CDR2、以及SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1、SEQ ID NO:20所示的CDR2、以及SEQ ID NO:21所示的CDR3。
所述的CDR1、CDR2和CDR3被框架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
本发明的第二方面，提供了一种抗TIGIT纳米抗体VHH链，所述VHH链包括框架区FR和本发明的第一方面所述的互补决定区CDR，所述的框架区FR包括FRl、FR2、FR3和FR4，框架区FR包含以下组合中的一种或多种：
(a)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、和SEQ ID NO:7所示的FR4；
(b)SEQ ID NO:13所示的FR1、SEQ ID NO:14所示的FR2、SEQ ID NO:15所示的FR3、和SEQ ID NO:16所示的FR4；
(c)SEQ ID NO:22所示的FR1、SEQ ID NO:23所示的FR2、SEQ ID NO:24所示的FR3、和SEQ ID NO:25所示的FR4。
作为优选，所述的抗TIGIT纳米抗体的VHH链选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30中的一种或多种。
本发明的第三方面，提供了一种抗TIGIT纳米抗体，所述抗TIGIT纳米抗体是针对TIGIT表位的纳米抗体，并且具有本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体包括一条或多条具有如SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体包括任意两条如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链，且VHH链之间通过连接子进行连接。
作为优选，所述连接子选自以下序列：(GaSb)x—(GmSn)y，其中a，b，m，n，x，y＝0或1或2或3或4或5或6或7或8或9或10(较佳地，a＝4而b＝1，m＝3而n＝1)。
作为优选，所述连接子选自下组：GGGGSGGGS。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体能够识别两种不同的TIGIT表位。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36所示
本发明的第四方面，提供了一种抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
A-L-B (Ia)；
B-L-A (Ib)；
其中，
A为权利要求4所述的抗TIGIT纳米抗体；
B为IgG的Fc片段；和
L为无或柔性接头。
作为优选，所述的柔性接头为肽接头。
作为优选，所述的肽接头具有1-50个氨基酸，较佳地1-20个氨基酸。
作为优选，所述IgG的Fc片段包括人的IgG的Fc片段。
作为优选，所述IgG的Fc片段选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc片段，或其组合。
作为优选，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示。
作为优选，所述融合蛋白为针对TIGIT表位的纳米抗体Fc融合蛋白。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
本发明的第五方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：本发明的第一方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链的互补决定区CDR，或本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链，或发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
作为优选，所述多核苷酸序列为组合形式，所述多核苷酸的核苷酸序列包含SEQID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33中的一种或多种。
作为优选，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36所示的核苷酸序列。
作为优选，所述的多核苷酸包括RNA、DNA或cDNA。
本发明的第六方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明的第五方面所述的多核苷酸。
作为优选，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移***，或其组合。
作为优选，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒，或其组合。
本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明的第六方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明的第五方面所述的多核苷酸。
作为优选，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
作为优选，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、噬菌体，或其组合
本发明的第八方面，提供了一种产生抗TIGIT纳米抗体的方法，包括步骤：
(a)在适合产生如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体的条件下，培养如本发明的第七方面所述的宿主细胞，从而获得含如本发明的第三方面所述抗TIGIT纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗TIGIT纳米抗体；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗TIGIT纳米抗体。
以及，一种产生抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的方法，包括步骤：
(a)在适合产生如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而获得含如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体包括一条或多条具有如SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链。
作为优选，所述抗TIGIT纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36所示。
本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
(a)如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
作为优选，所述的放射性核素包括：
(i)诊断用同位素，所述的诊断用同位素选自下组：Tc-99m、Ga-68、F-18、I-123、I-125、I-131、In-111、Ga-67、Cu-64、Zr-89、C-11、Lu-177、Re-188，或其组合；和/或
(ii)治疗用同位素，所述的治疗用同位素选自下组：Lu-177、Y-90、Ac-225、As-211、Bi-212、Bi-213、Cs-137、Cr-51、Co-60、Dy-165、Er-169、Fm-255、Au-198、Ho-166、I-125、I-131、Ir-192、Fe-59、Pb-212、Mo-99、Pd-103、P-32、K-42、Re-186、Re-188、Sm-153、Ra223、Ru-106、Na24、Sr89、Tb-149、Th-227、Xe-133、Yb-169、Yb-177，或其组合。
作为优选，所述偶联部分为药物或毒素。
作为优选，所述的药物为细胞毒性药物。
作为优选，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱，或其组合。
作为优选，特别有用的细胞毒性药物的例子包括，例如，DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepinecontaining drugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs)，吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))、长春花生物碱(vincaalkaloids)，或其组合。
作为优选，所述的毒素选自下组：耳他汀类(例如，耳他汀E、耳他汀F、MMAE和MMAF)、金霉素、类美坦西醇、篦麻毒素、篦麻毒素A-链、考布他汀、多卡米星、多拉司他汀、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、顺铂、cc1065、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒素、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素(retstrictocin)、酚霉素、依诺霉素、麻疯树毒蛋白(curicin)、巴豆毒素、卡奇霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、糖皮质激素，或其组合。
作为优选，所述偶联部分为可检测标记物。
作为优选，所述偶联部分选自下组：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))或任何形式的纳米颗粒。
作为优选，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链、如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或本发明第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
作为优选，所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明的第二方面所述抗TIGIT纳米抗体VHH链、如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或本发明第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
本发明的第十方面，提供了本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的用途，用于制备诊断或***的药物。
作为优选，所述肿瘤包括但不限于：血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃肿瘤。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有：
(i)如本发明的第一方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链的互补决定区CDR区、如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如本发明的第九方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
作为优选，所述的免疫偶联物的偶联部分为药物、毒素、和/或治疗用同位素。
作为优选，所述的药物组合物为注射剂型。
作为优选，所述的药物组合物用于制备诊断或***的药物。
作为优选，所述肿瘤包括但不限于：血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃肿瘤。
本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链的互补决定区CDR，或本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的一种或多种的用途：
(a)用于诊断或***的药物；
(b)用于检测人TIGIT分子。
作为优选，所述用途为诊断性和/或非诊断性的，和/或治疗性和/或非治疗性的。
本发明的第十三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体的VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；以及
(ii)任选的，协助表达和/或纯化的标签序列。
作为优选，所述的标签序列包括Fc标签、HA标签和6His标签。
作为优选，所述的重组蛋白特异性结合于TIGIT蛋白。
在本发明的第十四方面，提供了如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体的VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如本发明的第九方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中TIGIT蛋白；
其中，所述药剂用于诊断或***。
作为优选，所述肿瘤包括但不限于：血液肿瘤、实体瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、胃肿瘤。
作为优选，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明的第二方面所述的抗TIGIT纳米抗体的VHH链，或如本发明的第三方面所述的抗TIGIT纳米抗体，或如本发明的第四方面所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如本发明的第九方面所述的免疫偶联物。
本发明的有益效果是：
(a)本发明能够阻断TIGIT与CT26细胞表面CD155的相互作用；
(b)本发明能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白，且与对照抗体Tiragolumab的结合活性相近；
(c)本发明能够识别人和食蟹猴TIGIT，无法识别小鼠TIGIT；
(d)本发明阻断活性显著优于对照抗体Tiragolumab；
(e)本发明对T细胞具有显著的激活作用，且激活作用显著优于对照抗体Tiragolumab。
附图说明
图1是hTIGIT(ECD)-Fc蛋白的SDS-PAGE检测结果。结果表明：hTIGIT(ECD)-Fc蛋白纯度大于90％。
图2是噬菌体展示TIGIT纳米抗体文库的库容检测结果。结果表明：构建的文库库容为1.9x109CFU。
图3是噬菌体展示TIGIT纳米抗体文库的抗体基因片段***率检测结果。结果表明：构建的文库片段***率为95.8％。
图4是噬菌体展示技术筛选TIGIT纳米抗体的阳性菌落富集结果。其中“+”代表阳性克隆噬菌体富集情况，“-”代表阴性克隆噬菌体富集情况，ratio为“+/-”的计算结果。结果表明：经过三轮筛选，阳性抗体富集176倍。
图5和图6是流式细胞术筛选能够阻断TIGIT与CD155相互作用的纳米抗体的鉴定结果。结果表明：在10个候选抗体中，其中Nb49、Nb66和Nb100抗体能够阻断TIGIT与CT26细胞表面CD155的相互作用。
图7是流式细胞术检测候选抗体对细胞表面TIGIT结合能力的结果。结果表明：Nb49、Nb66、Nb100能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白，且与对照抗体Tiragolumab的结合活性相近。
图8是流式细胞术检测候选抗体与对照抗体Tiragolumab的抗原识别表位差异的结果。结果表明：Nb49与对照抗体Tiragolumab识别不同的抗原表位；Nb66和Nb100与对照抗体Tiragolumab识别相同或相近的抗原表位。
图9是流式细胞检测候选人源化抗体的阻断活性的结果。结果表明：Nb49、Nb66和Nb100三株抗体人源化后的阻断活性与人源化前抗体的活性相当。
图10是ELISA检测候选抗体与不同种属TIGIT交叉结合的结果。结果表明：三株抗体均能识别人和食蟹猴TIGIT，而无法识别小鼠TIGIT。
图11是流式细胞术检测双表位抗体对TIGIT/CD155的阻断活性的结果。结果表明：双表位抗体Nb49-Nb66和Nb49-Nb100的阻断活性较单独抗体及对照抗体均有显著提升。
图12是双表位二价抗体对T细胞激活的功能检测结果。结果表明：双表位抗体Nb49-Nb66和Nb49-Nb100均显示出显著的对T细胞的激活作用，且激活作用显著强于单独的TIGIT纳米抗体和对照抗体Tiragolumab。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得多个抗TIGIT纳米抗体。具体地，本发明利用人源的TIGIT胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将TIGIT蛋白分子偶联在酶标板上，展示TIGIT蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了TIGIT特异性的纳米抗体基因。此外，相关实验结果表明，本发明获得的抗TIGIT纳米抗体能够有效地与细胞表面TIGIT结合，同时阻断与其配体的相互作用。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“本发明抗体”、“本发明的抗体”、“本发明的抗TIGIT纳米抗体”、“本发明TIGIT纳米抗体”、“抗TIGIT纳米抗体”、“TIGIT纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于TIGIT(包括人TIGIT)的抗体。优选地，本发明的纳米抗体的VHH链的氨基酸序列选自SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29、SEQ ID NO:30中的一种或多种。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“单域抗体”、“VHH”、“纳米抗体(nanobody)”、“单域抗体”(single domain antibody,sdAb，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIHPubl.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗TIGIT纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合TIGIT的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有TIGIT结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
Figure GDA0002875537860000131
Figure GDA0002875537860000141
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))等。
TIGIT(T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白)
TIGIT的全称是T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptorwith Ig and ITIM domains)。它是一种抑制性受体，在多种类型的T细胞表面表达。T细胞表面表达着许多种不同的激活性受体和抑制性受体，这些受体经常两两配对，对T细胞的活性进行微调。TIGIT和激活性受体CD226是一对，它们的共同配体是PVR(CD155)。TIGIT通过与CD226竞争和PVR的结合，扰乱CD226的激活等机制，抑制T细胞的激活。TIGIT在多种癌症类型的肿瘤浸润T细胞中高度表达。
VHH链组合
本发明还包含了一种纳米抗体VHH链的组合。其中，所述组合至少含有一组以下CDR区：
(1)SEQ ID NO:1所示的CDR1，SEQ ID NO:2所示的CDR2，SEQ ID NO:3所示的CDR3；
(2)SEQ ID NO:10所示的CDR1，SEQ ID NO:11所示的CDR2，SEQ ID NO:12所示的CDR3；
(3)SEQ ID NO:19所示的CDR1，SEQ ID NO:20所示的CDR2，SEQ ID NO:21所示的CDR3；
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
抗TIGIT纳米抗体
在本发明中，所述抗TIGIT纳米抗体包括单体、二价体(二价抗体)、四价体(四价抗体)、和/或多价体(多价抗体)。
在本发明的一个优选例中，所述抗TIGIT纳米抗体包括一条或多条具有如SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链。
典型的，所述抗TIGIT纳米抗体包括任意两条如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链，且VHH链之间通过连接子进行连接。
在本发明的一个优选例中，所述连接子选自以下序列：(GaSb)x—(GmSn)y，其中a，b，m，n，x，y＝0或1或2或3或4或5或6或7或8或9或10(较佳地，a＝4而b＝1，m＝3而n＝1)。
在本发明的一个优选例中，所述连接子选自下组：GGGGSGGGS。
在本发明的一个优选例中，所述抗TIGIT纳米抗体能够识别两种不同的TIGIT表位。
在本发明的一个优选例中，所述抗TIGIT纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:36所示。
标记的抗体
在本发明的一个优选例中，所述抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，TIGIT的抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的抗体。
本发明的抗TIGIT纳米抗体能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白。
检测方法
本发明还涉及检测TIGIT蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中TIGIT蛋白的水平。
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明还提供了用于检测TIGIT水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别TIGIT蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
应用
如上所述，本发明的抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与TIGIT相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对TIGIT的临床诊断和治疗。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明抗体能够阻断TIGIT与CT26细胞表面CD155的相互作用。
(b)本发明抗体能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白，且与对照抗体Tiragolumab的结合活性相近。
(c)本发明抗体能够识别人和食蟹猴TIGIT，无法识别小鼠TIGIT。
(d)本发明抗体阻断活性显著优于对照抗体Tiragolumab。
(e)本发明抗体对T细胞具有显著的激活作用，且激活作用显著优于对照抗体Tiragolumab。
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(Sambrook和Russell等人，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)(第三版)(2001)CSHL出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：人TIGIT胞外段蛋白表达及骆驼免疫文库构建
利用哺乳动物细胞HEK293F瞬转表达人TIGIT胞外段蛋白：将已经克隆有人TIGIT胞外段基因的pFUSE-IgG重组质粒与转染试剂PEI混合后，转染至HEK293F细胞；37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5天；随后收集细胞上清，与ProteinA珠子在室温下结合1h；再用磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤珠子后，用0.1MpH3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白；再将洗脱的蛋白超滤至PBS溶液中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测。检测结果如图1所示，表达纯化的hTIGIT(ECD)-Fc蛋白纯度大于90％，可用于骆驼免疫及抗体筛选。
将纯化的hTIGIT(ECD)-Fc蛋白免疫1只新疆双峰驼，7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total RNA，经反转录和PCR扩增出VHH基因，再将VHH基因克隆至噬菌体载体pMECS上，转化至TG1宿主细胞中构建成噬菌体展示文库。经检测，构建的文库库容为1.9×109CFU(图2)，文库***率为95.8％(图3)。
随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，经3轮“吸附-洗涤-富集”的筛选过程最终获得含抗体基因的噬菌体富集176倍(图4)。从以上富集的噬菌体克隆中随机挑选600颗进行PE-ELISA鉴定，将获得的阳性克隆全部进行测序鉴定，将所有序列不同的抗体均作为候选对象，利用大肠杆菌表达纯化出各种抗体用于后续鉴定。
实施例2：流式细胞术筛选阻断型TIGIT纳米抗体
将以上株序列不同的纳米抗体基因克隆至pFUSE-IgG载体上，然后将重组质粒与转染试剂PEI1:3混合后，转染至HEK293F细胞；37℃，6％CO2摇床培养箱中培养5天；随后收集细胞上清，与ProteinA珠子在室温下结合1h；再用磷酸盐缓冲液pH7.0洗涤珠子后，用0.1M、pH3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白；再将洗脱的蛋白超滤至PBS溶液中，用于候选功能活性研究。
将培养好的CHOZEN/TIGIT稳转细胞分装至96孔板中，每孔3E5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的各抗体(Nb5、Nb10、Nb14、Nb16、Nb49、Nb66、Nb72、Nb86、Nb96、Nb100)及CD155-Biotin蛋白孵育20min，抗体浓度梯度为2ug/mL、1ug/mL、0.5ug/mL。离心弃上清，加入稀释的SA-PE抗体，4℃孵育20min。再次离心弃上清，每孔加入200uLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测样本PE信号。结果如图5、图6所示，表明：候选抗体Nb49、Nb66和Nb100能够阻断TIGIT与CT26细胞表面CD155的相互作用。
实施例3：TIGIT纳米抗体与细胞表面抗原的结合活性检测
利用高表达TIGIT的稳转细胞CHOZN/TIGIT进行抗体结合功能验证：将培养的CHOZN/TIGIT细胞用胰酶消化并用完全培养基中和后，用PBS洗涤细胞一次，然后收集细胞；平均分装至96孔板中，加入稀释好的抗体(每组抗体稀释浓度分别为40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL、0.625ug/mL、0.313ug/mL、0.156ug/mL、0.078ug/mL、0.039ug/mL、0.019ug/mL)于4℃孵育20min；离心后用PBS洗涤细胞一次，再加入goatanti human IgG-FITC(按照1：200稀释)，4℃孵育20min；用PBS洗涤一次细胞后，3000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入200uLPBS/孔，重悬细胞，转移至流式管中，流式检测每个样本FITC信号。结果如图7所示，三株纳米抗体(Nb49、Nb66、Nb100)能够有效结合细胞表面的TIGIT蛋白，且与对照抗体Tiragolumab的结合活性相近。三株纳米抗体序列编号见表2。
表2 TIGIT纳米抗体序列编号
抗体编号 Nb49 Nb66 Nb100
CDR1氨基酸序列 SEQ ID NO：1 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：19
CDR2氨基酸序列 SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：11 SEQ ID NO：20
CDR3氨基酸序列 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：21
FR1氨基酸序列 SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：13 SEQ ID NO：22
FR2氨基酸序列 SEQ ID NO：5 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：23
FR3氨基酸序列 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：24
FR4氨基酸序列 SEQ ID NO：7 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：25
全长氨基酸序列 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：17 SEQ ID NO：26
全长碱基序列 SEQ ID NO：9 SEQ ID NO：18 SEQ ID NO：27
实施例4：候选抗体的抗原识别表位测定
利用流式细胞术检测候选抗体与对照抗体的抗原识别表位差异：将培养好的CHOZN/TIGIT细胞分装至至96孔板中，每孔3E5个细胞，离心弃上清。将50uL4ug/mL对照抗体Tiragolumab分别与50uL40ug/mL候选纳米抗体Nb49、Nb66、Nb100(E.coli表达)混合加入细胞中，4℃孵育20min。随后用PBS洗涤细胞，再加入goat anti human IgG-FITC(按照1：200稀释)，4℃孵育20min；用PBS洗涤一次细胞后，3000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入200uLPBS/孔，重悬细胞，转移至流式管中，流式检测每个样本FITC信号。结果如图8所示，Nb49不能阻断对照抗体与细胞表面TIGIT的结合，表明该抗体与对照抗体Tiragolumab识别不同的抗原表位；而Nb66和Nb100能够阻断对照抗体与细胞表面TIGIT的结合，表明这两株抗体与对照抗体Tiragolumab识别相同或相近的抗原表位。
实施例5：候选抗体的种属特异性检测
利用ELISA检测候选抗体能否与其他种属TIGIT发生交叉反应。将1ug/mL人TIGIT、小鼠TIGIT和食蟹猴TIGIT抗原蛋白加入酶标板中包被过夜，4℃，100uL/孔；用PBST洗涤5次后，每孔加入300uL1％BSA室温封闭2小时；用PBST洗涤5次后，分别加入100uL10ug/mL生物素标记的Nb49、Nb66、Nb100于37℃下孵育1小时；再用PBST洗涤5次，加入100uL稀释的SA-HRP(1:2000稀释)于37℃下孵育1小时；用PBST洗涤5次，加入显色液，酶标仪450nm波长下测定吸收值。结果如图10所示：三株抗体均能识别人和食蟹猴TIGIT，而无法识别小鼠TIGIT。
实施例6：抗体人源化设计及活性检测
将以上三株纳米抗体的氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索，取其中序列等源性较高的结构，对这些结构进行比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的蛋白，进行目标纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构；然后对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化TIGIT纳米抗体，人源化后抗体序列对应如下表3：
表3人源化TIGIT纳米抗体序列编号
抗体编号 氨基酸序列编号 碱基序列编号
HuNb49 SEQ ID NO.28 SEQ ID NO.31
HuNb66 SEQ ID NO.29 SEQ ID NO.32
HuNb100 SEQ ID NO.30 SEQ ID NO.33
将以上人源化抗体氨基酸序列按照人密码子优化后，将其碱基序列合成至pFUSE载体上，然后将重组质粒转染HEK293F细胞，转染方法见实施例1。
将以上表达纯化的抗体进行流式细胞术检测其阻断活性，检测方法与实施例2相同，结果如图9所示：三株抗体人源化后的阻断活性与人源化前抗体的活性相当，因此认为抗体人源化成功。
实施例7：双表位二价抗体的构建
为了进一步提高候选抗体的功能活性，尝试进行双表位抗体的构建。分别将HuNb49/HuNb66以及HuNb49/HuNb100进行串联设计，结构式如下：
HuNb49-GGGGSGGGS-HuNb66-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示，碱基序列如SEQID NO:35所示)
HuNb49-GGGGSGGGS-HuNb100-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示，碱基序列如SEQ ID NO:37所示)
按照以上结构排列抗体氨基酸序列，然后将其按照人密码子偏好进行密码子优化，随后将该优化的碱基序列合成至pCDNA3.1载体上。将构建好的质粒转化HEK293F细胞中，转染及培养方法同实施例1。然后从上清液中纯化出候选抗体用于后续活性检测。
实施例8：双表位二价抗体的阻断活性检测
利用流式细胞术检测双表位抗体的阻断活性：将培养好的CHOZEN/TIGIT稳转细胞分装至96孔板中，每孔3E5个细胞，3000rpm离心3min去掉上清液，加入稀释好的各抗体(Nb49、Nb66、Nb100、Nb49-Nb66、Nb49-Nb100、对照抗体Tiragolumab)及CD155-Biotin蛋白于4℃孵育20min，每组抗体稀释浓度分别为40ug/mL、20ug/mL、10ug/mL、5ug/mL、2.5ug/mL、1.25ug/mL、0.625ug/mL、0.313ug/mL、0.156ug/mL、0.078ug/mL、0.039ug/mL、0.019ug/mL。离心弃上清，加入稀释的SA-PE抗体，4℃孵育20min。再次离心弃上清，每孔加入200uLPBS重悬细胞，流式细胞仪检测样本PE信号。结果如图11所示：双表位抗体Nb49-Nb66和Nb49-Nb100的阻断活性较单独抗体及对照抗体均有显著提升。
实施例9：双表位二价抗体对PBMCs的激活检测
在对应的96孔细胞培养板中分别加入新鲜的50uLPBMCs细胞，每孔1E5个细胞。再将100uL抗体(终浓度：20ug/mL)和50ulSEB(终浓度：1ug/mL和0.1ug/mL)分别加入到对应的孔中，在37℃，5％CO2，培养72h。培养结束后用BDIL-2ELISA试剂盒检测上清中IL-2的含量。结果如图12所示，两种双表位抗体均显示出显著的对T细胞的激活作用，且激活作用显著强于单独的TIGIT纳米抗体和对照抗体Tiragolumab。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明序列信息：
SEQ ID NO:1
GYAYSSNYIG
SEQ ID NO:2
IYPGVGRI
SEQ ID NO:3
AAEVVPALRGGQWYAGRYFSY
SEQ ID NO:4
QVQLQESGGGSAQAGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:5
WFRQAPGKEREGVAT
SEQ ID NO:6
YYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMTSLKPEDSAMYYC
SEQ ID NO:7
WGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:8
QVQLQESGGGSAQAGGSLRLSCAASGYAYSSNYIGWFRQAPGKEREGVATIYPGVGRIYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMTSLKPEDSAMYYCAAEVVPALRGGQWYAGRYFSYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:9
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGCGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATACGCTTACAGTAGCAACTACATAGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAAGGCGTCGCAACTATTTATCCTGGTGTTGGTAGAATATATTATGCCGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGACAAGCCTGAAACCTGAGGACTCTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGAAGTTGTCCCAGCCTTACGAGGTGGTCAATGGTACGCCGGTCGGTACTTTAGTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:10
GFSFSMSVMY
SEQ ID NO:11
INSGGRT
SEQ ID NO:12
ARDSRGTF
SEQ ID NO:13
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:14
WVRQAPGKELEWVSF
SEQ ID NO:15
YYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQLNSLTTEDTALYYC
SEQ ID NO:16
RGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:17
QVQLQESGGGSVQPGGSLRLSCAASGFSFSMSVMYWVRQAPGKELEWVSFINSGGRTYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQLNSLTTEDTALYYCARDSRGTFRGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:18
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGCCTGGGGGATCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTATGTCGGTCATGTACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGAACTCGAGTGGGTCTCATTTATTAATAGTGGTGGTAGGACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAATTGAACAGCCTGACAACTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAGAGATTCGCGTGGGACGTTCAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:19
GYSICMG
SEQ ID NO:20
IAGLSSK
SEQ ID NO:21
AARGVGYCGIAAGMDY
SEQ ID NO:22
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAAS
SEQ ID NO:23
WFRQAPGKEREGVAT
SEQ ID NO:24
TYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC
SEQ ID NO:25
WGKGTQVTVSS
SEQ ID NO:26
QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYSICMGWFRQAPGKEREGVATIAGLSSKTYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCAARGVGYCGIAAGMDYWGKGTQVTVSS
SEQ ID NO:27
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCCTCTGGATACAGTATTTGTATGGGTTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCCACTATTGCTGGTCTTAGTAGCAAGACCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCTCGTGGTGTGGGGTACTGCGGAATCGCCGCCGGCATGGACTACTGGGGCAAAGGAACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:28
EVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAASGYAYSSNYIGWFRQAPGKGLEGVATIYPGVGRIYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMTSLKPEDSAMYYCAAEVVPALRGGQWYAGRYFSYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:29
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSMSVMYWVRQAPGKGLEWVSFINSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARDSRGTFRGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:30
EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSICMGWFRQAPGKGLEGVATIAGLSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAARGVGYCGIAAGMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:31
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGCCCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTACGCCTACTCCTCCAACTACATCGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGGGCGTGGCCACCATCTACCCCGGCGTGGGCAGGATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGACCTCCCTGAAGCCCGAGGACTCCGCCATGTACTACTGCGCCGCCGAGGTGGTGCCCGCCCTGAGGGGCGGCCAGTGGTACGCCGGCAGGTACTTCTCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:32
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCTCCTTCTCCATGTCCGTGATGTACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTTCATCAACTCCGGCGGCAGGACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGACCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGGGACTCCAGGGGCACCTTCAGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:33
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTACTCCATCTGCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGGGCGTGGCCACCATCGCCGGCCTGTCCTCCAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCGCCAGGGGCGTGGGCTACTGCGGCATCGCCGCCGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCC
SEQ ID NO:34
EVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAASGYAYSSNYIGWFRQAPGKGLEGVATIYPGVGRIYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMTSLKPEDSAMYYCAAEVVPALRGGQWYAGRYFSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSMSVMYWVRQAPGKGLEWVSFINSGGRTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLRTEDTALYYCARDSRGTFRGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:35
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGCCCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTACGCCTACTCCTCCAACTACATCGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGGGCGTGGCCACCATCTACCCCGGCGTGGGCAGGATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGACCTCCCTGAAGCCCGAGGACTCCGCCATGTACTACTGCGCCGCCGAGGTGGTGCCCGCCCTGAGGGGCGGCCAGTGGTACGCCGGCAGGTACTTCTCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCTCCTTCTCCATGTCCGTGATGTACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCTTCATCAACTCCGGCGGCAGGACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGACCGAGGACACCGCCCTGTACTACTGCGCCAGGGACTCCAGGGGCACCTTCAGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG
SEQ ID NO:36
EVQLQESGGGLAQPGGSLRLSCAASGYAYSSNYIGWFRQAPGKGLEGVATIYPGVGRIYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMTSLKPEDSAMYYCAAEVVPALRGGQWYAGRYFSYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSICMGWFRQAPGKGLEGVATIAGLSSKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCAARGVGYCGIAAGMDYWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO:37
GAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGCCCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTACGCCTACTCCTCCAACTACATCGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGGGCGTGGCCACCATCTACCCCGGCGTGGGCAGGATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGACCTCCCTGAAGCCCGAGGACTCCGCCATGTACTACTGCGCCGCCGAGGTGGTGCCCGCCCTGAGGGGCGGCCAGTGGTACGCCGGCAGGTACTTCTCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGCTCCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCCGGCGGCGGCCTGGTGCAGCCCGGCGGCTCCCTGAGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTACTCCATCTGCATGGGCTGGTTCAGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGGGCGTGGCCACCATCGCCGGCCTGTCCTCCAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGGTTCACCATCTCCAGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCGCCGCCAGGGGCGTGGGCTACTGCGGCATCGCCGCCGGCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGAGCCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCCTCCAGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG
SEQ ID NO:38
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入本发明要求保护的范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 上海洛启生物医药技术有限公司
<120> 一种抗TIGIT纳米抗体及其应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Asn Tyr Ile Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Tyr Pro Gly Val Gly Arg Ile
1 5
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Ala Glu Val Val Pro Ala Leu Arg Gly Gly Gln Trp Tyr Ala Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Phe Ser Tyr
20
<210> 4
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Gly Val Gly Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Val Val Pro Ala Leu Arg Gly Gly Gln Trp Tyr Ala Gly
100 105 110
Arg Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 9
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggcgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cgcttacagt agcaactaca taggatggtt ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaagg cgtcgcaact atttatcctg gtgttggtag aatatattat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccaagaca acgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga caagcctgaa acctgaggac tctgccatgt actactgtgc ggcggaagtt 300
gtcccagcct tacgaggtgg tcaatggtac gccggtcggt actttagtta ctggggccag 360
gggacccagg tcaccgtctc ctca 384
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Phe Ser Phe Ser Met Ser Val Met Tyr
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ile Asn Ser Gly Gly Arg Thr
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Arg Asp Ser Arg Gly Thr Phe
1 5
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val Ser Phe
1 5 10 15
<210> 15
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
35
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Met Ser
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Arg Gly Thr Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagc ctgggggatc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt ctccttcagt atgtcggtca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg aactcgagtg ggtctcattt attaatagtg gtggtaggac atactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacgacg ccaagaacac gctgtatctg 240
caattgaaca gcctgacaac tgaggacacg gccttgtatt actgtgcaag agattcgcgt 300
gggacgttca ggggccaggg gacccaggtc accgtctcct ca 342
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Tyr Ser Ile Cys Met Gly
1 5
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Ile Ala Gly Leu Ser Ser Lys
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ala Ala Arg Gly Val Gly Tyr Cys Gly Ile Ala Ala Gly Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr
1 5 10 15
<210> 24
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
35
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Thr Ile
35 40 45
Ala Gly Leu Ser Ser Lys Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gly
85 90 95
Val Gly Tyr Cys Gly Ile Ala Ala Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc tcggtgcagg ctggagggtc cctgagactg 60
tcctgtgcag cctctggata cagtatttgt atgggttggt tccgccaggc tccagggaag 120
gagcgcgagg gggtcgccac tattgctggt cttagtagca agacctacgc agactccgtg 180
aagggccgat tcaccatctc ccgagacaac gccaagaaca ctctgtatct gcaaatgaac 240
agcctgaaac ctgaggacac tgccatgtac tactgtgcgg ctcgtggtgt ggggtactgc 300
ggaatcgccg ccggcatgga ctactggggc aaaggaaccc aggtcaccgt ctcctca 357
<210> 28
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Gly Val Gly Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Val Val Pro Ala Leu Arg Gly Gly Gln Trp Tyr Ala Gly
100 105 110
Arg Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Met Ser
20 25 30
Val Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Asn Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Ser Arg Gly Thr Phe Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 30
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Cys Met Gly
20 25 30
Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Thr Ile
35 40 45
Ala Gly Leu Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
50 55 60
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
65 70 75 80
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gly
85 90 95
Val Gly Tyr Cys Gly Ile Ala Ala Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggcccagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctactcc tccaactaca tcggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccacc atctaccccg gcgtgggcag gatctactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga cctccctgaa gcccgaggac tccgccatgt actactgcgc cgccgaggtg 300
gtgcccgccc tgaggggcgg ccagtggtac gccggcaggt acttctccta ctggggccag 360
ggcaccctgg tgaccgtgtc ctcc 384
<210> 32
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggctt cagcttcagc atgagcgtga tgtactgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcttc atcaacagcg gcggcaggac ctactacgcc 180
gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaaca gcaagaacag cctgtacctg 240
cagatgaaca gcctgaggac cgaggacacc gccctgtact actgcgccag ggacagcagg 300
ggcaccttca ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gc 342
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta ctccatctgc atgggctggt tcaggcaggc ccccggcaag 120
ggcctggagg gcgtggccac catcgccggc ctgtcctcca agtactacgc cgactccgtg 180
aagggcaggt tcaccatctc cagggacaac tccaagaaca ccctgtacct gcagatgaac 240
tccctgaggg ccgaggacac cgccatgtac tactgcgccg ccaggggcgt gggctactgc 300
ggcatcgccg ccggcatgga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtcctcc 357
<210> 34
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Gly Val Gly Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Val Val Pro Ala Leu Arg Gly Gly Gln Trp Tyr Ala Gly
100 105 110
Arg Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Met Ser Val Met Tyr Trp Val Arg Gln
165 170 175
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Asn Ser Gly Gly
180 185 190
Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr
210 215 220
Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Arg Gly Thr Phe
225 230 235 240
Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys
245 250 255
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Pro Gly Lys
<210> 35
<211> 1449
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggcccagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctactcc tccaactaca tcggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccacc atctaccccg gcgtgggcag gatctactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga cctccctgaa gcccgaggac tccgccatgt actactgcgc cgccgaggtg 300
gtgcccgccc tgaggggcgg ccagtggtac gccggcaggt acttctccta ctggggccag 360
ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccggcggc ggcggctccg gcggcggctc cgaggtgcag 420
ctgcaggagt ccggcggcgg cctggtgcag cccggcggct ccctgaggct gtcctgcgcc 480
gcctccggct tctccttctc catgtccgtg atgtactggg tgaggcaggc ccccggcaag 540
ggcctggagt gggtgtcctt catcaactcc ggcggcagga cctactacgc cgactccgtg 600
aagggcaggt tcaccatctc cagggacaac tccaagaact ccctgtacct gcagatgaac 660
tccctgagga ccgaggacac cgccctgtac tactgcgcca gggactccag gggcaccttc 720
aggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc tccgagccca agtcctgcga caagacccac 780
acctgccccc cctgccccgc ccccgagctg ctgggcggcc cctccgtgtt cctgttcccc 840
cccaagccca aggacaccct gatgatctcc aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 900
gacgtgtccc acgaggaccc cgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960
cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagtacaact ccacctacag ggtggtgtcc 1020
gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgtcc 1080
aacaaggccc tgcccgcccc catcgagaag accatctcca aggccaaggg ccagcccagg 1140
gagccccagg tgtacaccct gcccccctcc agggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc 1200
ctgacctgcc tggtgaaggg cttctacccc tccgacatcg ccgtggagtg ggagtccaac 1260
ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggactccga cggctccttc 1320
ttcctgtact ccaagctgac cgtggacaag tccaggtggc agcagggcaa cgtgttctcc 1380
tgctccgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagtccct gtccctgtcc 1440
cccggcaag 1449
<210> 36
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ala Tyr Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Gly Val Gly Arg Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Val Val Pro Ala Leu Arg Gly Gly Gln Trp Tyr Ala Gly
100 105 110
Arg Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
145 150 155 160
Ala Ser Gly Tyr Ser Ile Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
165 170 175
Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Thr Ile Ala Gly Leu Ser Ser Lys Tyr
180 185 190
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
195 200 205
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
210 215 220
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gly Val Gly Tyr Cys Gly Ile Ala
225 230 235 240
Ala Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245 250 255
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
260 265 270
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 37
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggcccagc ccggcggctc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cctccggcta cgcctactcc tccaactaca tcggctggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggaggg cgtggccacc atctaccccg gcgtgggcag gatctactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccaggaca acgccaagaa caccgtgtac 240
ctgcagatga cctccctgaa gcccgaggac tccgccatgt actactgcgc cgccgaggtg 300
gtgcccgccc tgaggggcgg ccagtggtac gccggcaggt acttctccta ctggggccag 360
ggcaccctgg tgaccgtgtc ctccggcggc ggcggctccg gcggcggctc cgaggtgcag 420
ctgcaggagt ccggcggcgg cctggtgcag cccggcggct ccctgaggct gtcctgcgcc 480
gcctccggct actccatctg catgggctgg ttcaggcagg cccccggcaa gggcctggag 540
ggcgtggcca ccatcgccgg cctgtcctcc aagtactacg ccgactccgt gaagggcagg 600
ttcaccatct ccagggacaa ctccaagaac accctgtacc tgcagatgaa ctccctgagg 660
gccgaggaca ccgccatgta ctactgcgcc gccaggggcg tgggctactg cggcatcgcc 720
gccggcatgg actactgggg ccagggcacc ctggtgaccg tgtcctccga gcccaagtcc 780
tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccccg agctgctggg cggcccctcc 840
gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tctccaggac ccccgaggtg 900
acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 960
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caactccacc 1020
tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 1080
aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc 1140
aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc cctccaggga ggagatgacc 1200
aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg aagggcttct acccctccga catcgccgtg 1260
gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 1320
tccgacggct ccttcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 1380
ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1440
tccctgtccc tgtcccccgg caag 1464
<210> 38
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (17)

1.一种抗TIGIT纳米抗体，其特征在于，所述抗TIGIT纳米抗体包括一条或多条具有如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链。
2.如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，其特征在于，所述抗TIGIT纳米抗体是针对TIGIT表位的纳米抗体，所述抗TIGIT纳米抗体包括任意两条如SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VHH链，且VHH链之间通过连接子进行连接。
3.如权利要求2所述的抗TIGIT纳米抗体，其特征在于，所述连接子选自下组：GGGGSGGGS。
4.一种抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
A-L-B (Ia)；
B-L-A (Ib)；
其中，
A为权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体；
B为IgG的Fc片段；和
L为无或柔性接头。
5.如权利要求4所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，其特征在于，所述抗TIGIT纳米抗体包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
6.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求7所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种产生抗TIGIT纳米抗体的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合产生如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而获得含如权利要求1所述抗TIGIT纳米抗体的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗TIGIT纳米抗体；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗TIGIT纳米抗体。
10.一种产生抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合产生如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的条件下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而获得含如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的培养物；以及
(b)从所述培养物中分离和/或回收所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；以及
(c)任选地，纯化和/或修饰步骤(b)中获得的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白。
11.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP，或其组合。
12.如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白的用途，其特征在于，用于制备诊断或***的药物。
13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有：
(i)如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如权利要求11所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
14.如权利要求13所述的药物组合物的用途，其特征在于，所述的药物组合物用于制备诊断或***的药物。
15.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白；以及
(ii)任选的，协助表达和/或纯化的标签序列。
16.如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如权利要求11所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中TIGIT蛋白；
其中，所述药剂用于诊断或***。
17.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有如权利要求1所述的抗TIGIT纳米抗体，或如权利要求4、5中任意一项所述的抗TIGIT纳米抗体Fc融合蛋白，或如权利要求11所述的免疫偶联物。
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