JP7327944B2 - ラテックス凝集法による目的物質の測定方法、およびその試薬 - Google Patents
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Description
本発明は、ラテックス凝集法による目的物質の測定方法、およびその試薬に関する。さらに詳しくは、散乱光強度測定と吸光度測定を組み合わせたラテックス粒子増強免疫凝集測定方法、およびその試薬に関する。
ラテックス粒子を利用した免疫測定法は、血清、血漿、尿などの体液に含まれる測定対象の目的物質の定量方法として臨床検査に応用され、自動分析装置を用いることにより簡便・迅速に測定が行えるため広く普及している。
近年は、さらなる測定性能の向上を目的とした応用技術が提案されている。例えば、目的物質が低濃度域の測定では強いシグナルが得られる短い波長で、高濃度域の測定では分析装置のシグナル検出範囲の上限を超えないよう長い波長を用いてシグナルの絶対値を抑制するというものである（特許文献１）。しかしながら、ラテックス微粒子溶液の濁度には波長依存性があり、長波長になるほどシグナルが低下することは公知の事実であり、ある光学的変化に対し、波長の選択によってシグナルの大小を調整して分析装置に適合させているにすぎない当該方法では、粒子増強免疫凝集測定方法における精度ならびにダイナミックレンジに関する欠点を補うほどの劇的な改善効果は期待できない。
また、粒子増強免疫凝集測定法において、一つの測定に散乱光強度測定と吸光度測定を併用することにより高感度かつダイナミックレンジの広い測定ができるというものもある（特許文献２）。しかしながら、散乱光強度測定は低濃度域の範囲を増大させられるが、効果を得る為には正しい粒子径を選択しなければならないことが文献内で記述されている（特許文献３）。粒子径が３００ｎｍ以下になると散乱光強度測定の効果が得られないことが記述されている。つまり、該手法の様に低濃度域の範囲を増大可能な散乱光強度測定の特徴を活かす粒子径を選択することは、高濃度域の測定が可能な吸光度測定の設計範囲を狭めることとなり、ダイナミックレンジの増大と言えるほどの劇的な効果が達成できないこととなる。
更に、平均粒径の異なる２種類以上のラテックス粒子に抗体を感作して用いる測定法（特許文献４）によれば広い濃度範囲に及ぶ測定が可能となる。平均粒子径が単一のラテックス粒子にポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を併せて用いる方法（特許文献５）によれば、同様な効果が得られる。また、低反応性の抗体をコーティングさせた小さい粒径の粒子と高反応性の抗体をコーティングさせた大きい粒径の粒子を用いる測定法（特許文献６、特許文献７）などが提案されている。しかしながら、これらの文献に記載された方法は、吸光度測定のみを対象とした設計であり、低濃度域の範囲を増大させる散乱光強度測定に適したものとなっていない。つまり、低濃度域の範囲増大が可能な散乱光強度測定の利点、および高濃度域の測定が可能な吸光度測定の利点の双方を享受可能な、ダイナミックレンジを増大させる真の試薬設計は明示されていない。
また、ラテックス粒子増強免疫凝集法で所望の低濃度領域の測定を達成する為、試薬量に対する検体量比（本明細書及び特許請求の範囲において「検体量濃度」と呼ぶ）を増加する傾向が問題点として指摘されている。検体量濃度を増すと、見掛け上、反応試薬中の抗原濃度を増すことが出来る。これにより、低濃度検体の測定精度を高める効果が得られる。しかしながら、検体量濃度を増すと目的物質以外の成分も増加することから、目的物質以外を測定してしまう（非特異）反応が生じる可能性が増し、誤った判定（偽陽性）を下す原因となりうる。
本発明の目的は、低濃度領域及び高濃度領域のいずれにおいても正確な測定を可能とする、ラテックス凝集法による目的物質の測定方法、およびその試薬を提供することである。
本願発明者は、鋭意研究の結果、吸光度測定と散乱光測定を併用するとともに、特定の範囲の体積平均粒子径を持ち、かつ、小さなラテックス粒子の濃度が所定値以下であるラテックス粒子を特定の濃度範囲で用いることにより、低濃度領域及び高濃度領域のいずれにおいても正確な測定を可能となることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1) 感作ラテックス粒子の浮遊液と前記目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、光学的変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定方法であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下であり、前記光学的変化量が、吸光度変化量と散乱光変化量である、方法。
(2) 前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定を、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径の１～１０倍の範囲の波長の光を用いて行う、(1)記載の方法。
(3) 前記吸光度変化量の測定波長は、５００～９００ｎｍの範囲内で選択された２つの波長を用い、更に選ばれた２つの測定波長は主波長と、該主波長よりも長い副波長を用い、更に、前期散乱光変化量は５００～９００ｎｍの範囲内で選択された１つの波長を用いる(1)又は(2)記載の方法。
(4) 前記目的物質について、達成すべき測定値の下限値と上限値が規定により定められている場合、吸光度測定のみで該下限値を達成するために必要な最小の検体量濃度の０．７倍以下の検体濃度で行う、(1)～(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5) 前記散乱光変化量の測定における散乱角が１０°～３０°の範囲内で少なくとも１種の散乱が測定される、(1) ～(4)のいずれか１項に記載の方法。
(6) 感作ラテックス粒子の浮遊液と前記目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、吸光度変化量と散乱光変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定試薬であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下である、試薬。
(7) 感作前の前記感作ラテックス粒子の体積平均粒子径が前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定波長の１～１／１０の範囲である、(6)に記載の試薬。
(1) 感作ラテックス粒子の浮遊液と前記目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、光学的変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定方法であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下であり、前記光学的変化量が、吸光度変化量と散乱光変化量である、方法。
(2) 前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定を、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径の１～１０倍の範囲の波長の光を用いて行う、(1)記載の方法。
(3) 前記吸光度変化量の測定波長は、５００～９００ｎｍの範囲内で選択された２つの波長を用い、更に選ばれた２つの測定波長は主波長と、該主波長よりも長い副波長を用い、更に、前期散乱光変化量は５００～９００ｎｍの範囲内で選択された１つの波長を用いる(1)又は(2)記載の方法。
(4) 前記目的物質について、達成すべき測定値の下限値と上限値が規定により定められている場合、吸光度測定のみで該下限値を達成するために必要な最小の検体量濃度の０．７倍以下の検体濃度で行う、(1)～(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5) 前記散乱光変化量の測定における散乱角が１０°～３０°の範囲内で少なくとも１種の散乱が測定される、(1) ～(4)のいずれか１項に記載の方法。
(6) 感作ラテックス粒子の浮遊液と前記目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、吸光度変化量と散乱光変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定試薬であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下である、試薬。
(7) 感作前の前記感作ラテックス粒子の体積平均粒子径が前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定波長の１～１／１０の範囲である、(6)に記載の試薬。
本発明のラテックス凝集法によれば、自動分析装置を用いて、低濃度領域及び高濃度領域のいずれにおいても正確な測定を可能となる。
本発明の方法は、基本的に、ラテックス凝集法と呼ばれる周知の方法の一種であり、本発明の方法では、ラテックス粒子の凝集の程度の測定を吸光度変化量と、散乱光変化量の測定により行うものである。例えば、本発明の一実施形態では、これは次のようにして行うことができる。
すなわち、一実施形態の方法では、測定対象の目的物質を含む試料溶液と、目的物質との結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む溶液とを混合して混合液を調製する工程と；
第１、第２の時点間の散乱光強度差から混合液の（イ）散乱光強度の変化量を測定する工程と；
第３、第４の時点間の吸光度差から混合液の（ロ）吸光度の変化量を測定する工程と；
測定された（イ）散乱光強度の変化量および（ロ）吸光度の変化量を、散乱光強度変化量に基づく検量線および吸光度変化量に基づく検量線を用いて試料中の目的物質の存在量と関連付ける工程と；を有する。本実施形態によれば、このような工程を有することから、実質的に低濃度から高濃度までを包含する検量線を得ることができ、高感度かつダイナミックレンジの広い粒子増強免疫凝集測定を行うことができる。
第１、第２の時点間の散乱光強度差から混合液の（イ）散乱光強度の変化量を測定する工程と；
第３、第４の時点間の吸光度差から混合液の（ロ）吸光度の変化量を測定する工程と；
測定された（イ）散乱光強度の変化量および（ロ）吸光度の変化量を、散乱光強度変化量に基づく検量線および吸光度変化量に基づく検量線を用いて試料中の目的物質の存在量と関連付ける工程と；を有する。本実施形態によれば、このような工程を有することから、実質的に低濃度から高濃度までを包含する検量線を得ることができ、高感度かつダイナミックレンジの広い粒子増強免疫凝集測定を行うことができる。
ここで、第１、第２、第３、第４の時点は混合液の調製開始から１０００秒後までの間からそれぞれ選ばれることが好ましい。混合液の調製開始から１０００秒以内とすることにより、測定試薬設計の自由度を確保しながら所望の感度と所望のダイナミックレンジの両方を満たすことが可能となるからである。また、（イ）散乱光強度の変化量および（ロ）吸光度の変化量の測定は、５００から９００ｎｍの波長の範囲内でおこなうことが好ましい。
以下に、本実施形態に用いられるラテックス粒子や目的物質等の説明を交えながら、実施形態にかかるラテックス粒子増強免疫凝集測定法について詳しく説明していく。なお、以下の説明において、「一つの測定」とは、一つの反応槽において行われる一連の反応と測定を意味する。自動分析装置における測定を例にとれば、第一試液と試料との混合と、それに引き続く第二試液（目的物質との結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む溶液）の添加混合、散乱光強度の変化量の測定および吸光度の変化量の測定を一つの反応槽で行うことを意味する。また、本発明における「目的物質を含む試料溶液」には、上記のように第一試液（緩衝液）と混合され希釈された検体溶液も含まれるものとする。
（ラテックス粒子）
本発明の方法に用いられるラテックス粒子は、従来から広く用いられている、例えばポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体などを用いることができる。このようなラテックス粒子は市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。市販品は、ラテックス粒子の粒径が極めて均一に揃っており、粒子径を明記して市販されているラテックス粒子は、全粒子が、明記された粒子径を持つと近似的に考えることができ、粒子径が異なる２種以上のラテックス粒子を用いる場合の、下記の体積平均粒子径の計算も、この近似に基づき計算することができる。
本発明の方法に用いられるラテックス粒子は、従来から広く用いられている、例えばポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、スチレン－スチレンスルホン酸塩共重合体などを用いることができる。このようなラテックス粒子は市販されているので、市販品を好ましく用いることができる。市販品は、ラテックス粒子の粒径が極めて均一に揃っており、粒子径を明記して市販されているラテックス粒子は、全粒子が、明記された粒子径を持つと近似的に考えることができ、粒子径が異なる２種以上のラテックス粒子を用いる場合の、下記の体積平均粒子径の計算も、この近似に基づき計算することができる。
用いるラテックス粒子は、複数の粒子径で構成されるもので構わないが、結合パートナーを感作する前（本明細書及び特許請求の範囲において、単に「感作前」と呼ぶことがある）の体積平均粒子径ａが８０～３３５ｎｍの範囲であり、好ましくは１００～３００ｎｍの範囲である。体積平均粒子径ａは、下記の数式１で求められ、第１成分の粒子径ａ１（ｎｍ）と同成分の粒子内比率ｎ１（％）、第２成分の粒子径ａ２（ｎｍ）と同成分の粒子内比率ｎ２（％）、第ｎ成分の粒子径ａｎ（ｎｍ）と同成分の粒子内比率ｎｎ（％）から求められる。体積平均粒子径ａが８０ｎｍ未満だと抗原抗体反応によって生じるラテックス粒子の凝集塊の大きさが小さくなり、目的物質の低濃度域の測定で十分な精度が得られなくなる。また、体積平均粒子径が３３５ｎｍを超えると、凝集塊が大きくなり過ぎて、粒子の沈降等を生じてしまい、高濃度域の測定が困難になる。
また、反応系中の感作ラテックス粒子の終濃度は、０．００５～０．１０w/v%の範囲、好ましくは、０．０１０～０．０９０w/v%の範囲である。０．００５w/v%未満となると、粒子数が不足し、高濃度域の想定が難しくなる。逆に、粒子濃度が０．１０w/v%を超えると、初期状態の光学量（吸光度）が大きくなり、光学変化量の測定上限との差が取り難くなるため、高濃度域の測定が難しくなる。
更に、感作前のラテックス粒子の粒子径が８０ｎｍ以下のラテックス粒子は０．０９w/v%以下、好ましくは、０．０５w/v%以下である。８０ｎｍ以下の粒子が０．０９w/v%を超えると、多重散乱を発生し、散乱光変化量の測定精度を低下させてしまう。
（検体）
本発明の方法は、種々の生体試料を測定対象とすることが可能であり、特に限定されないが、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液である。
本発明の方法は、種々の生体試料を測定対象とすることが可能であり、特に限定されないが、例えば血液、血清、血漿、尿などの体液である。
目的物質の測定下限値と上限値は、臨床的な意義だけでなく、各測定方法（免疫比濁法、ラテックス凝集法、化学発光免疫法、蛍光免疫法、等）の技術的な理由からある種の業界標準的な測定範囲として決定されている場合がある。例えば、下記実施例で測定しているラテックス凝集法のＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）では、下限値０．０１mg/dL、上限値３２mg/dLが業界標準となっている。各社が販売している各検査キットを用いて測定を行う場合、測定値がこの下限値以上で且つ上限値を満足するように、検体量濃度を設定する必要がある。本発明の方法により目的物質を測定する場合、吸光度測定のみで該下限値を達成するために必要な最小の検体量濃度（検体量濃度Ｂ）の０．７倍以下の検体量濃度（検体量濃度Ａ）で行うことが好ましい。下限値の達成と上限値の達成は相反的であり、下限値は、検体量濃度を高くすることにより達成し易くなるが、下限値を達成するために検体濃度を高くすると、検体によっては上限値を満足しないものが出てくる可能性が高くなる。本発明の方法によれば、従来の吸光度測定のみによって下限値を達成するのに必要な最小の検体量濃度Ｂの０．７倍以下の検体量濃度Ａで測定を行うことが可能であり、このように検体量濃度を下げると、上限値を向上させることができるので有利である。すなわち、検体量濃度を０．７倍以下とすることで、高感度な散乱光検出による最小検出感度向上の効果を享受しつつ、高濃度測定域上限を大幅に向上させるという効果を達成出来る。０．７倍超とすると、最小検出感度は向上するが、高濃度測定域上限の向上効果が十分に得られなくなることがある。
（測定対象の目的物質）
本発明の方法の測定対象となる目的物質は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなど、理論的にラテックス粒子増強免疫凝集測定法により測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）（リポプロテイン（ａ））、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗原抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ－６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
本発明の方法の測定対象となる目的物質は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなど、理論的にラテックス粒子増強免疫凝集測定法により測定可能な分子であれば特に制限はない。例としてＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、Ｌｐ（ａ）（リポプロテイン（ａ））、ＭＭＰ３（マトリクスメタロプロテイナーゼ３）、抗ＣＣＰ（環状シトルリン化ペプチド）抗体、抗リン脂質抗体、抗梅毒抗原抗体、ＲＰＲ、ＩＶ型コラーゲン、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＢＮＰ（脳性ナトリウム利尿ペプチド）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンＣ、ＲＦ（リウマチ因子）、ＣＡ―ＲＦ、ＫＬ－６、ＰＩＶＫＡ―ＩＩ、ＦＤＰ、Ｄダイマー、ＳＦ（可溶性フィブリン）、ＴＡＴ（トロンビン-アンチトロンビンＩＩＩ複合体）、ＰＩＣ、ＰＡＩ、ＸＩＩＩ因子、ペプシノーゲンＩ・ＩＩや、フェニトイン、フェノバルビタール、カルバマゼピン、バルプロ酸、テオフィリンなどが挙げられる。
（結合パートナー）
本発明の粒子増強免疫凝集測定法に供される結合パートナーとしては、対象の目的物質に結合する物質としてタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、特異性および親和性から抗体、その抗原結合性断片や、抗原の利用が一般的である。また分子量の大小、天然や合成といった由来に特に制限はない。
本発明の粒子増強免疫凝集測定法に供される結合パートナーとしては、対象の目的物質に結合する物質としてタンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖、核酸、ハプテンなどが挙げられるが、特異性および親和性から抗体、その抗原結合性断片や、抗原の利用が一般的である。また分子量の大小、天然や合成といった由来に特に制限はない。
（測定試薬）
本発明の方法に供される測定試薬の構成に関して特に制限はないが、臨床検査の分野で汎用される自動分析装置での使用を考慮した場合、緩衝液からなる第一試液（Ｒ１）と目的物質に対する結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む第二試液（Ｒ２）の２液で構成された測定試薬が一般的である。
なお、本発明の測定試薬は吸光度変化量と散乱光変化量をそれぞれ単独で測定することもできる。
本発明の方法に供される測定試薬の構成に関して特に制限はないが、臨床検査の分野で汎用される自動分析装置での使用を考慮した場合、緩衝液からなる第一試液（Ｒ１）と目的物質に対する結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む第二試液（Ｒ２）の２液で構成された測定試薬が一般的である。
なお、本発明の測定試薬は吸光度変化量と散乱光変化量をそれぞれ単独で測定することもできる。
（測定試薬の成分）
本発明の方法に用いられる測定試薬の成分は、反応の主成分である結合パートナーを感作（担持）したラテックス粒子の他に、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでもよい。また凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでもよい。また、凝集の形成をコントロールする成分として高分子物質、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組合せて含んでもよい。また消泡成分を含んでもよい。
本発明の方法に用いられる測定試薬の成分は、反応の主成分である結合パートナーを感作（担持）したラテックス粒子の他に、試料のイオン強度や浸透圧などを緩衝する成分として、例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリス、グリシン、ホウ酸、炭酸、及びグッドの緩衝液や、それらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などを含んでもよい。また凝集形成を増強する成分としてポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、リン脂質ポリマーなどの高分子を含んでもよい。また、凝集の形成をコントロールする成分として高分子物質、タンパク質、アミノ酸、糖類、金属塩類、界面活性剤類、還元性物質やカオトロピック物質など汎用される成分を１種類、または複数の成分を組合せて含んでもよい。また消泡成分を含んでもよい。
（分析装置）
本発明の方法には、測定に要する総反応時間が１０分以内と迅速かつ簡便な自動分析装置の利用が適しており、特に特開２０１３－６４７０５号公報に開示されるような、散乱光強度と吸光度をほぼ同時に測定できる自動分析装置が好適である。もっとも、本発明の方法は、自動分析装置を用いる方法に限定されるものではない。
本発明の方法には、測定に要する総反応時間が１０分以内と迅速かつ簡便な自動分析装置の利用が適しており、特に特開２０１３－６４７０５号公報に開示されるような、散乱光強度と吸光度をほぼ同時に測定できる自動分析装置が好適である。もっとも、本発明の方法は、自動分析装置を用いる方法に限定されるものではない。
本発明の方法に用いることができる、自動分析装置の好適な一例の全体概略構成を図１に示す。図１中、自動分析装置１は、検体ディスク１０、反応ディスク２０、試薬ディスク３０、検体分注機構４１、試薬分注機構４２、コンピュータ１００、インタフェース回路１０１等を備える。検体ディスク１０には駆動部１２を備える。反応ディスク２０には駆動部２２を備える。試薬ディスク３０には駆動部３２を備える。また、反応ディスク２０には、吸光光度計４４と散乱光度計４５との２種類の光度計が設置されている。また、反応ディスク２０には、恒温槽２８を備える。また、反応ディスク２０には、撹拌部４３や洗浄部４６等が設置されている。
コンピュータ１００は、分析制御部５０、記憶部７０、出力部７１、入力部７２等を備える。分析制御部５０は、信号線等を含むインタフェース回路１０１を通じて、各駆動部や各機構と接続されている。コンピュータ１００は、例えばＰＣで構成されるが、これに限らず、ＬＳＩ基板等の回路基板で構成されてもよいし、それらの組み合わせで構成されてもよい。記憶部７０は、ＲＯＭ、ＲＡＭ、不揮発性記憶装置等の記憶装置で構成される。
検体ディスク１０には、複数の検体カップ１５が設置され保持されている。検体カップ１５は、検体２を収容する検体容器である。各検体カップ１５は、検体ディスク１０のディスク本体１１上に、周方向に沿って相互に離間させて並設されて保持されている。
検体ディスク１０の駆動部１２は、分析制御部５０からの制御に従って検体ディスク１０を駆動制御する。その際、駆動部１２は、ディスク本体１１を回動させて、複数の検体カップ１５を周方向に沿って移動させる。検体ディスク１０は、駆動部１２の駆動制御によって、ディスク本体１１に設置されている複数の検体カップ１５のうちの１つの検体カップ１５を、周方向に沿った所定位置に配置する。所定位置は、例えば検体分注機構４１による検体吸入位置等である。
なお、図１の構成例では、検体ディスク１０は、複数の検体カップ１５がディスク本体１１上に周方向に沿って一列の円周に配置されている。これに限らず、ディスク本体１１の同心円状に複数列に検体カップ１５が配置される構成としてもよい。また、図１の構成例では、ディスク方式の検体ディスク１５を有するが、これに限らず、ラック方式としてもよい。ラック方式では、複数の検体容器が１次元または２次元で配列されて保持される検体ラックを用いる。
試薬ディスク３０は、反応ディスク２０の隣に設置されている。試薬ディスク３０のディスク本体３１には、複数の試薬ボトル３５が設置され保持されている。試薬ボトル３５は、試薬４を収容する試薬容器である。各試薬ボトル３５は、ディスク本体３１の周方向に沿って相互に離間させて並設されて保持されている。試薬ボトル３５には、自動分析装置１での検査項目の目的成分物質に応じた種類の試薬４が収容されている。試薬４の種類毎に、別々の試薬ボトル３５に収容されている。
試薬ディスク３０の駆動部３２は、分析制御部５０からの制御に従って、ディスク本体３１を回動させて、複数の試薬ボトル３５を周方向に沿って移動させる。試薬ディスク３０は、駆動部３２の駆動制御によって、ディスク本体３１に設置されている複数の試薬ボトル３５のうちの使用する１つの試薬ボトル３５を、試薬ディスク３０の所定位置に配置する。所定位置は、例えば試薬分注機構４２による試薬吸入位置等である。
試薬ディスク３０には、冷却機構を備えた試薬保冷庫３８が設けられている。ディスク本体３１上に配置されている複数の試薬ボトル３５は、ディスク本体３１が回動しても、試薬保冷庫３８の冷却環境に常時保持された状態で冷却される。これにより、試薬４の劣化防止が図られている。試薬保冷庫３８の冷却機構としては、例えば、低温水を循環する方式、あるいはペルチェ素子により気相中にて冷却する方式等が用いられる。
反応ディスク２０は、検体ディスク１０と試薬ディスク３０との間に設置されている。反応ディスク２０のディスク本体２１には、複数の反応容器２５が設置され保持されている。反応容器２５は、反応液３が作製される容器である。反応液３は、検体２と試薬４との混合液である。検体分注機構４１によって反応容器２５内に検体２が分注され、試薬分注機構４２によって試薬４が分注され、その検体２と試薬４との混合液によって反応液３が作製される。各反応容器２５は、ディスク本体２１の周方向に沿って相互に離間させて並設されて保持されている。反応容器２５は、吸光光度計４４および散乱光度計４５による測定のために、透光性材料により構成されている。反応ディスク２０の駆動部２２は、分析制御部５０からの制御に従って、ディスク本体２１を回動させて、複数の反応容器２５を周方向に沿って移動させる。反応ディスク２０は、ディスク本体２１の回動によって、複数の反応容器２５のうちの１つの反応容器２５を、周方向に沿って設けられた所定位置に配置する。所定位置は、例えば検体分注機構４１による検体吐出位置や、試薬分注機構４２による試薬吐出位置等である。
反応ディスク２０のディスク本体２１上に配置されている複数の各々の反応容器２５は、恒温槽２８内の恒温槽水（恒温流体ともいう）に常時浸漬されている。これにより、反応容器２５内の反応液３が一定の反応温度（例えば３７℃程度）に保たれる。恒温槽２８内の恒温槽水は、分析制御部５０によって、温度および流量が制御され、反応容器２５に供給される熱量が制御される。
反応ディスク２０の周上および周付近には、検体分注機構４１および試薬分注機構４２に加え、互いの位置を異ならせて、撹拌部４３、吸光光度計４４、散乱光度計４５、洗浄部４６等が配置されている。
検体分注機構４１は、検体ディスク１０と反応ディスク２０との間に設置されている。検体分注機構４１は、検体ディスク１０の検体吸入位置の検体カップ１５から検体２を吸入し、反応ディスク２０の検体吐出位置の反応容器２５に吐出する動作である検体分注動作を行う。検体分注機構４１は、可動アームや分注ノズルを備える。分注ノズルは、可動アームに取り付けられたピペットノズルから成る。検体分注機構４１は、検体分注動作の際、分注ノズルを検体ディスク１０上の検体吸入位置に移動させ、検体吸入位置に配置された検体カップ１５から、分注ノズル内に所定量の検体２を吸入して収容する。その後、検体分注機構４１は、分注ノズルを反応ディスク２０上の検体吐出位置に移動させて、検体吐出位置に配置された反応容器２５内に、分注ノズル内の検体２を吐出する。
試薬分注機構４２は、試薬ディスク３０と反応ディスク２０との間に設置されている。試薬分注機構４２は、試薬ディスク３０の試薬吸入位置の試薬ボトル３５から試薬４を吸入し、反応ディスク２０の試薬吐出位置の反応容器２５に吐出する動作である試薬分注動作を行う。分注される試薬４は、対象の検体２に対応して設定された分析項目（検査項目等とも呼ばれる）である目的成分物質の定量に用いられる試薬である。試薬分注機構４２は、同様に、可動アームや分注ノズルを備える。試薬分注機構４２は、試薬分注動作の際、分注ノズルを試薬ディスク３０上の試薬吸入位置に移動させ、試薬吸入位置に配置された試薬ボトル３５から分注ノズル内に所定量の試薬４を吸入して収容する。その後、試薬分注機構４２は、分注ノズルを反応ディスク２０上の試薬吐出位置に移動させて、試薬吐出位置に配置された反応容器２５内に、分注ノズル内の試薬４を吐出する。
検体分注機構４１および試薬分注機構４２には、異なる種類の検体２あるいは試薬４の分注に備えて、それぞれ、洗浄槽４６が設けられている。洗浄槽４６は、分注ノズルを洗浄するための機構である。各分注機構は、各分注ノズルを、分注動作の前後に洗浄槽４６で洗浄する。これにより、検体２同士あるいは試薬４同士のコンタミネーションが防止される。また、各分注機構の分注ノズルには、検体２あるいは試薬４の液面を検知するセンサが備え付けられている。これにより、検体２あるいは試薬４の不足による測定異常が監視および検知可能である。加えて、検体分注機構４１には、分注ノズルの詰まりを検知する圧力センサが備え付けられている。これにより、検体２に含まれるフィブリン等の不溶性物質が分注ノズルに詰まることで発生する分注異常が監視および検知可能である。分析制御部５０は、それらのセンサを含む機構を通じて、測定時の各種の異常等を監視および検知可能である。
撹拌部４３は、反応ディスク２０上の所定位置である撹拌位置に配置された反応容器２５内の検体２と試薬４との混合液を撹拌する。これにより、反応容器２５内の混合液は、均一に攪拌されて、その反応が促進され、反応液３として作製される。撹拌部４３には、例えば攪拌翼を備える攪拌機、あるいは超音波を用いた攪拌機構を備える。
２種類の光度計における、第１種光度計として１つの吸光光度計４４を有し、第２種光度計として１つの散乱光度計４５を有する。吸光光度計４４および散乱光度計４５の各光度計は、基本的な構造として、光源および受光部を有する。各光度計の光源は、例えば、反応ディスク２０の内周側に配置されており、各光度計の受光部は、反応ディスク２０の外周側に配置されている。各光度計は、分析制御部５０と接続されている。
吸光光度計４４は、反応ディスク２０上の所定位置である測定位置（特に第１測定位置）に配置された反応容器２５の反応液３についての測定を行う。散乱光度計４５は、反応ディスク２０上の所定位置である測定位置（特に第２測定位置）に配置された反応容器２５の反応液３についての測定を行う。図１の構成例では、吸光光度計４４および散乱光度計４５の２つの光度計は、反応ディスク２０の周上で、反応ディスク２０の回動中心を通る対角線上に対向する所定位置に設置されている。第１測定位置に対して吸光光度計４４が、第２測定位置に対して散乱光度計４５が配置されている。なお、周上、第１測定位置と第２測定位置との間の所定位置には、撹拌部４３や洗浄部４６が配置されている。
吸光光度計４４は、光源から第１測定位置の反応容器２５の反応液３に光を照射する。その際、吸光光度計４４は、反応液３から得られる透過光を、受光部によって検出し、単一または複数の波長の透過光の光量または光強度の少なくとも一方（光量／光強度と記載する場合がある）を測定する。また、吸光光度計４４は、その測定値に基づいて、所定の計算によって、濃度等の定量値を得てもよい。吸光光度計４４は、測定値または計算値を含む信号を出力する。
散乱光度計４５は、光源から第２測定位置の反応容器２５の反応液３に光を照射する。その際、散乱光度計４５は、反応液３から得られる散乱光を、受光部によって検出し、散乱光の光量または光強度の少なくとも一方（光量／光強度）を測定する。また、散乱光度計４５は、その測定値に基づいて、所定の計算によって、濃度等の定量値を得てもよい。散乱光度計４５は、測定値または計算値を含む信号を出力する。
洗浄部４６は、反応ディスク２０上の洗浄位置に配置された反応容器２５についての洗浄を行う。洗浄部４６は、測定および分析が終了した反応容器２５から、残っている反応液３を排出し、その反応容器２５を洗浄する。洗浄された反応容器２５は再使用可能となる。すなわち、その反応容器２５には、再び、検体分注機構４１から次の検体２が分注され、試薬分注機構４２から次の試薬４が分注されることになる。
（散乱角度）
本発明に用いられる散乱光強度測定の散乱角度に特に制限はないが、１０°～３５°にするのが望ましく、より好ましくは２０°～３０°である。散乱角度を前記の範囲にすることによって、散乱光を検知するための受光部において透過光の影響を強く受けず、また散乱光を受光する能力に関しても有利となる。
本発明に用いられる散乱光強度測定の散乱角度に特に制限はないが、１０°～３５°にするのが望ましく、より好ましくは２０°～３０°である。散乱角度を前記の範囲にすることによって、散乱光を検知するための受光部において透過光の影響を強く受けず、また散乱光を受光する能力に関しても有利となる。
（散乱光強度測定）
本発明に用いられる散乱光強度測定の光源や照射光波長には特に制限はないが、ラテックス粒子の上記体積平均粒子径ａの１～１０倍が好適である。より好適な範囲としては１．５～５倍である。１倍未満だと、高濃度検体の測定精度が大幅に低下することがある。また１０倍より大きくなると散乱光強度測定の利点である最小検出感度能が大幅に低下してしまうことがある。散乱光強度の変化量を測定する２時点の測光間隔に特に制限はなく、一般的には間隔が長い方がより高感度となる。前述の自動分析装置においては、測定対象の目的物質を含む試料溶液と、目的物質との結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む溶液との混合直後から、最大１０００秒までの任意の２時点における散乱光強度測定と吸光度測定の変化量を、それぞれ測定できるが、混合直後から３００秒以内の２時点の散乱光強度の変化量と吸光度の変化量の両方をそれぞれ測定することにより、第一試液、第二試液を通じた一つの測定（一試料）あたりの総測定時間を１０分以内とすることができ、市販されている各種自動分析装置の最大検体処理速度の利益を享受することができる。
本発明に用いられる散乱光強度測定の光源や照射光波長には特に制限はないが、ラテックス粒子の上記体積平均粒子径ａの１～１０倍が好適である。より好適な範囲としては１．５～５倍である。１倍未満だと、高濃度検体の測定精度が大幅に低下することがある。また１０倍より大きくなると散乱光強度測定の利点である最小検出感度能が大幅に低下してしまうことがある。散乱光強度の変化量を測定する２時点の測光間隔に特に制限はなく、一般的には間隔が長い方がより高感度となる。前述の自動分析装置においては、測定対象の目的物質を含む試料溶液と、目的物質との結合パートナーを担持したラテックス粒子を含む溶液との混合直後から、最大１０００秒までの任意の２時点における散乱光強度測定と吸光度測定の変化量を、それぞれ測定できるが、混合直後から３００秒以内の２時点の散乱光強度の変化量と吸光度の変化量の両方をそれぞれ測定することにより、第一試液、第二試液を通じた一つの測定（一試料）あたりの総測定時間を１０分以内とすることができ、市販されている各種自動分析装置の最大検体処理速度の利益を享受することができる。
（吸光度測定）
本発明に用いられる吸光度測定の波長に特に制限はないが、散乱光強度の測定と同様に、用いられるラテックス粒子の体積平均粒子径ａの１～１０倍が好適である。より好適な範囲としては１．４～８倍である。１倍未満だと、高濃度検体の測定精度が大幅に低下することがある。また１０倍より大きくなると最小検出感度能が低下してしまうことがある。また、本発明に用いられる吸光度測定の波長としては、前記の範囲内において１波長測定あるいは、散乱光強度測定に用いる波長と比較して短波長側の主波長と、長波長側の副波長とを組合せた２波長測定を利用することができ、後者の方がより正確で好ましい。吸光度の変化量を測定する２時点の測光間隔に特に制限はなく、一般的には間隔が長い方がより高感度となる。
本発明に用いられる吸光度測定の波長に特に制限はないが、散乱光強度の測定と同様に、用いられるラテックス粒子の体積平均粒子径ａの１～１０倍が好適である。より好適な範囲としては１．４～８倍である。１倍未満だと、高濃度検体の測定精度が大幅に低下することがある。また１０倍より大きくなると最小検出感度能が低下してしまうことがある。また、本発明に用いられる吸光度測定の波長としては、前記の範囲内において１波長測定あるいは、散乱光強度測定に用いる波長と比較して短波長側の主波長と、長波長側の副波長とを組合せた２波長測定を利用することができ、後者の方がより正確で好ましい。吸光度の変化量を測定する２時点の測光間隔に特に制限はなく、一般的には間隔が長い方がより高感度となる。
（変化量）
本発明に用いられる光量（散乱光強度および吸光度）の変化量は、２時点間の差や比、単位時間あたりの換算値など、ラテックス粒子増強免疫凝集測定法に適用可能な算出法であれば特に制限はない。
本発明に用いられる光量（散乱光強度および吸光度）の変化量は、２時点間の差や比、単位時間あたりの換算値など、ラテックス粒子増強免疫凝集測定法に適用可能な算出法であれば特に制限はない。
（目的物質の存在量と関連付ける工程）
本発明のラテックス粒子増強免疫凝集測定法においては、既知濃度の目的物質含有試料を用いて、散乱光強度測定、吸光度測定それぞれの検量線を個別に作成し、目的物質の低濃度域、つまり最小検出感度は高感度な散乱光強度測定の検量線、目的物質の高濃度域測定上限はダイナミックレンジの広い吸光度測定の検量線に基づき濃度を算出する。ダイナミックレンジが広い吸光度測定では、より広い濃度範囲で検量線を作成することができる。
本発明のラテックス粒子増強免疫凝集測定法においては、既知濃度の目的物質含有試料を用いて、散乱光強度測定、吸光度測定それぞれの検量線を個別に作成し、目的物質の低濃度域、つまり最小検出感度は高感度な散乱光強度測定の検量線、目的物質の高濃度域測定上限はダイナミックレンジの広い吸光度測定の検量線に基づき濃度を算出する。ダイナミックレンジが広い吸光度測定では、より広い濃度範囲で検量線を作成することができる。
（検出変動係数比）
検出変動係数比は低値標準物質の再現性測定におけるバラツキ度（変動係数）を吸光度測定値と散乱光測定値の比で導出したものとなる。
検出変動係数比は低値標準物質の再現性測定におけるバラツキ度（変動係数）を吸光度測定値と散乱光測定値の比で導出したものとなる。
（高濃度域測定上限）
高濃度域測定上限とは測定可能な最大の目的物質量を意味する。本発明の方法の高濃度域測定上限は、目的物質濃度に比例した光量変化が検出できる範囲となる。必要な場合には、検体を適宜希釈することにより、適切な濃度とすることができる。
高濃度域測定上限とは測定可能な最大の目的物質量を意味する。本発明の方法の高濃度域測定上限は、目的物質濃度に比例した光量変化が検出できる範囲となる。必要な場合には、検体を適宜希釈することにより、適切な濃度とすることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１～３、および比較例１～９）
（調製例：単一粒子径によるＣＲＰ測定試薬の調製）
１．第２試液（Ｒ２）：抗体結合ラテックス溶液の調製
抗ＣＲＰウサギポリクローナル抗体（特異抗体量（ｍｇ/ｍＬ）が抗体液中の総タンパク量（ｍｇ/ｍＬ）に対して１７％含有される抗体液）をポリスチレンラテックス粒子に感作し、グリシン緩衝液中に分散浮遊し試薬を調製した。すなわち、試薬は、緩衝液（グリシン １７０ｍＭ pH ６．０)中で抗体とポリスチレンラテックス粒子の規定量を混合し、室温で６０分間十分に撹拌することにより感作を行い、その後、遠心操作により上清を除き、ウシ血清アルブミンを含むグリシン緩衝液によりポリスチレンラテックス粒子表面の抗体未感作部分のブロッキングを施し再び遠心操作により抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を集め、グリシン緩衝液中にラテックス粒子を、ソニケーションを行って充分に分散浮遊させることにより調製し、第２試薬（抗体結合ラテックス溶液：Ｒ２）を得た。
（調製例：単一粒子径によるＣＲＰ測定試薬の調製）
１．第２試液（Ｒ２）：抗体結合ラテックス溶液の調製
抗ＣＲＰウサギポリクローナル抗体（特異抗体量（ｍｇ/ｍＬ）が抗体液中の総タンパク量（ｍｇ/ｍＬ）に対して１７％含有される抗体液）をポリスチレンラテックス粒子に感作し、グリシン緩衝液中に分散浮遊し試薬を調製した。すなわち、試薬は、緩衝液（グリシン １７０ｍＭ pH ６．０)中で抗体とポリスチレンラテックス粒子の規定量を混合し、室温で６０分間十分に撹拌することにより感作を行い、その後、遠心操作により上清を除き、ウシ血清アルブミンを含むグリシン緩衝液によりポリスチレンラテックス粒子表面の抗体未感作部分のブロッキングを施し再び遠心操作により抗体感作ポリスチレンラテックス粒子を集め、グリシン緩衝液中にラテックス粒子を、ソニケーションを行って充分に分散浮遊させることにより調製し、第２試薬（抗体結合ラテックス溶液：Ｒ２）を得た。
２．第一試液（Ｒ１）の調製
２００ｍＭの塩化ナトリウム、１．０％のＢＳＡを含む１７０ｍＭ グリシン緩衝液を調製し、第一試液とした。
２００ｍＭの塩化ナトリウム、１．０％のＢＳＡを含む１７０ｍＭ グリシン緩衝液を調製し、第一試液とした。
３．標準試料
測定用試料として、ヒトＣＲＰ精製抗原を正常ヒト血清で希釈して調製したＣＲＰ標準品を用いた。ＣＲＰ標準品は、血漿蛋白国際標準品ＣＲＭ４７０に準拠して値付けされたもので、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６、３２、４８、６７、１００ｍｇ／ｄＬを用意した。０ｍｇ／ｄＬとして生理食塩液を使用した。
測定用試料として、ヒトＣＲＰ精製抗原を正常ヒト血清で希釈して調製したＣＲＰ標準品を用いた。ＣＲＰ標準品は、血漿蛋白国際標準品ＣＲＭ４７０に準拠して値付けされたもので、０．２５、０．５、１、２、４、８、１６、３２、４８、６７、１００ｍｇ／ｄＬを用意した。０ｍｇ／ｄＬとして生理食塩液を使用した。
（分析装置と測定条件）
特開２０１３－６４７０５号公報記載の自動分析装置を用いて一つの測定について散乱光強度と吸光度両方の測定をおこなった。散乱光強度測定の各条件は、照射波長７００ｎｍ、散乱角度２０°、および３０°とし、吸光度測定の各条件は、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２波長として測定した。ＣＲＰを含む試料１．５μＬにＲ１ １２２μＬを添加撹拌して３７℃で約３００秒間インキュベーション後、Ｒ２ １２２μＬを添加撹拌し、３７℃で約３００秒間インキュベーションしている間の任意の２時点間の光量の差から散乱光強度ならびに吸光度の変化量を算出した。
特開２０１３－６４７０５号公報記載の自動分析装置を用いて一つの測定について散乱光強度と吸光度両方の測定をおこなった。散乱光強度測定の各条件は、照射波長７００ｎｍ、散乱角度２０°、および３０°とし、吸光度測定の各条件は、主波長５７０ｎｍ、副波長８００ｎｍの２波長として測定した。ＣＲＰを含む試料１．５μＬにＲ１ １２２μＬを添加撹拌して３７℃で約３００秒間インキュベーション後、Ｒ２ １２２μＬを添加撹拌し、３７℃で約３００秒間インキュベーションしている間の任意の２時点間の光量の差から散乱光強度ならびに吸光度の変化量を算出した。
（検量線と試料測定）
ＣＲＰキャリブレーター（デンカ生研社製）を用いてスプライン演算した散乱光強度、吸光度それぞれに基づく検量線を用いて試料中のＣＲＰ濃度をそれぞれ算出した。なお検量線の濃度範囲は各測定条件下におけるダイナミックレンジに応じて都度選択した。
ＣＲＰキャリブレーター（デンカ生研社製）を用いてスプライン演算した散乱光強度、吸光度それぞれに基づく検量線を用いて試料中のＣＲＰ濃度をそれぞれ算出した。なお検量線の濃度範囲は各測定条件下におけるダイナミックレンジに応じて都度選択した。
（測定中のラテックス粒子濃度と検体量濃度）
本測定では表１に示す様な粒子径、粒子濃度のラテックス粒子を使用した。また、検体量濃度は、０．６２ｖ％であった。
本測定では表１に示す様な粒子径、粒子濃度のラテックス粒子を使用した。また、検体量濃度は、０．６２ｖ％であった。
実施例１～３、および比較例１～９で用いた原料および得られた試薬を、以下の方法で評価した。結果を表２に示す。
［検出変動係数比］
測定の精度管理に用いるＣＲＰのコントロール血清（デンカ生研製）の低値側試料を１／２０に生理食塩水で希釈したものを検体として吸光度、並びに散乱光強度それぞれを、各ｎ＝２０測定した。得られたｎ＝２０の標準偏差から変動係数（ＣＶ）を測定方法別に求め、吸光度の変動係数（ＣＶabs）を基準に、散乱光強度の変動係数（ＣＶsc）の割合を求め、同値を検出変動係数比とした（式２）。検出変動係数比が１以下であれば、散乱光強度の変動係数が吸光度の変動係数よりも小さいことを表し、散乱光強度の利点である検出感度の向上が期待される指標となる。
測定の精度管理に用いるＣＲＰのコントロール血清（デンカ生研製）の低値側試料を１／２０に生理食塩水で希釈したものを検体として吸光度、並びに散乱光強度それぞれを、各ｎ＝２０測定した。得られたｎ＝２０の標準偏差から変動係数（ＣＶ）を測定方法別に求め、吸光度の変動係数（ＣＶabs）を基準に、散乱光強度の変動係数（ＣＶsc）の割合を求め、同値を検出変動係数比とした（式２）。検出変動係数比が１以下であれば、散乱光強度の変動係数が吸光度の変動係数よりも小さいことを表し、散乱光強度の利点である検出感度の向上が期待される指標となる。
その結果、比較例１～８のラテックス粒子径６０ｎｍ、および７０ｎｍを用いた試薬では、調整した何れの粒子濃度（０．０７４～０．３５０ｗ／ｖ％）でも検出変動係数比が１以上となり、散乱光検出系の利点である低値感度の向上が期待されない試薬組成であることが示唆された。
２１０ｎｍのラテックス粒子を用いた試薬では、粒子濃度が０．００８～０．０３３ｗ／ｖ％（実施例１～３）の範囲において、検出変動係数比が１以下となり、同粒子径、および濃度範囲においては散乱光検出系の利点である低値感度の向上が期待される試薬組成であることが示唆された。しかしながら、同じ２１０ｎｍのラテックス径を用いても、粒子濃度が０．００４ｗ／ｖ％（比較例９）では、検出変動係数比が１以上となった。
（実施例４～７）
実施例１～３、および比較例１～９で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目で同様評価を行った。
実施例１～３、および比較例１～９で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目で同様評価を行った。
（実施例４）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗シスタチンＣ（Ｃｙｓ－Ｃ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗シスタチンＣ（Ｃｙｓ－Ｃ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（実施例５）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ミオグロビン（Ｍｂ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ミオグロビン（Ｍｂ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（実施例６）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）モノクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）モノクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（実施例７）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表３に示す通りに変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表４に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例１～３、および比較例１～９）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（実施例８～１２、比較例１０～１７）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ＣＲＰポリクローナル抗体にして、２種の異なる粒子径のラテックス粒子を用い、且つ表５に示す通りに各粒子濃度を変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表６に示す。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗ＣＲＰポリクローナル抗体にして、２種の異なる粒子径のラテックス粒子を用い、且つ表５に示す通りに各粒子濃度を変更した以外は、実施例１と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表６に示す。
用いた２種のラテックス粒子の小粒子径（６０、７０ｎｍ）側の濃度が０．３５～０．１５ｗ／ｖ％の範囲（比較例１０～１５）では、検出変動係数比が１以上となり、単一粒子系の場合（比較例１～９）と同様に散乱光計測の利点が発揮されない試薬組成であることが示唆された。
ラテックス粒子の小粒子径が１００ｎｍで、且つ粒子濃度が０．３５～０．１５ｗ／ｖ％の場合（比較例１６～１７、実施例１２）、短波長５７０ｎｍ側の吸光度測定値が、測定上限の吸光度３．０を超えてしまい、測定不可（吸光度の変動係数は「ＥＲＲＯＲ」と表記）となった。よって、同範囲の検出変動係数比は算出不可となった。但し、同吸光度は、測定波長と反比例の関係が成り立ち、測定波長を５７０ｎｍよりも長い波長で測定することで測定上限の３．０以下となり、検出変動係数比を算出することが可能となる可能性がある。小粒子径の粒子濃度が０．１５ｗ／ｖ％の実施例１２の散乱光計測の変動係数は、４．２％と十分低い値で有り、吸光度の波長選択により、検出変動係数比が１以下となる可能性は十二分に有ると見なせる。また、小粒子径（６０、７０、１００ｎｍ）の粒子濃度が０．０７４ｗ／ｖ％（実施例８～１１）では、検出変動係数比が１以下となり、散乱光検出系の利点が発揮される試薬設計であることが示唆された。
（実施例１３、比較例１８）
実施例８～１２、および比較例１０～１７で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目で同様評価を行った。
実施例８～１２、および比較例１０～１７で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目で同様評価を行った。
（実施例１３）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗フェリチン（ＦＥＲ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表７に示す通りに変更した以外は、実施例９と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表８に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例８～１２、および比較例１０～１７）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗フェリチン（ＦＥＲ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表７に示す通りに変更した以外は、実施例９と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表８に示す。検出変動係数比は１以下であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例８～１２、および比較例１０～１７）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（比較例１８）
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗β２－ミクログロブリン（ＢＭＧ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表７に示す通りに変更した以外は、実施例９と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表８に示す。検出変動係数比は１以上であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例８～１２、および比較例１０～１７）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
ラテックス上に担持する結合パートナーを抗β２－ミクログロブリン（ＢＭＧ）ポリクローナル抗体に変更し、且つ表７に示す通りに変更した以外は、実施例９と同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。得られた結果は表８に示す。検出変動係数比は１以上であり、粒子径、および粒子濃度共にＣＲＰ測定試薬中の評価（実施例８～１２、および比較例１０～１７）で得られた範囲と同等であり、矛盾しないことを確認した。
（比較例１９、実施例１４）
実施例９の試薬を基準に、表９に示す通りに検体濃度を変更した以外は、同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。ただし、比較例１９では、散乱光測定を行わず、吸光度測定のみを行った。本評価では追加の評価項目として、以下を追加した。得られた結果は表１０に示す。
実施例９の試薬を基準に、表９に示す通りに検体濃度を変更した以外は、同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。ただし、比較例１９では、散乱光測定を行わず、吸光度測定のみを行った。本評価では追加の評価項目として、以下を追加した。得られた結果は表１０に示す。
[高濃度域測定上限]
高濃度域測定上限は、検量線を得るために測定する目的物質の最大濃度とした。
高濃度域測定上限は、検量線を得るために測定する目的物質の最大濃度とした。
その結果、実施例１４では、比較例１９から検体量を０．６８割に減量しても、検出変動係数比は１以下であり、且つ高濃度域測定上限が、比較例１９（３２ｍｇ／ｄＬ）と比較し１．５倍の４７ｍｇ／ｄＬ相当に増大するという臨床試薬として良好な結果を得た。
（比較例２０、実施例１５）
実施例１４で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目としてＦＥＲ測定試薬で同様評価を行った。実施例１３試薬を基準に、表９に示す通りに検体量を変更した以外は、同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。ただし、比較例２０では、散乱光測定を行わず、吸光度測定のみを行った。得られた結果は表１０に示す。
実施例１４で得られた結果が、ＣＲＰ測定試薬に特有な結果であるかとの検証を目的に、異なる試薬項目としてＦＥＲ測定試薬で同様評価を行った。実施例１３試薬を基準に、表９に示す通りに検体量を変更した以外は、同様に第２試薬（Ｒ２）を作製し、測定を行った。ただし、比較例２０では、散乱光測定を行わず、吸光度測定のみを行った。得られた結果は表１０に示す。
その結果、比較例２０から検体濃度を０．２９割に減量しても、検出変動係数比は１以下であり、且つ高濃度域測定上限が、比較例２０（１０００ｎｇ／ｍＬ）と比較し３．５倍の３５００ｎｇ／ｍＬ相当に増大すると言う臨床試薬として良好な結果を得た。
表１～表１０の結果から、本発明のラテックス粒子増強免疫凝集測定方法とその試薬は、感度（検出感度比）およびダイナミックレンジ（高濃度域測定上限）に優れることが分かった。
２ 検体
３ 反応液
４ 試薬
１０ 検体ディスク
１１ ディスク本体
１２ 駆動部
１５ 検体カップ
２０ 反応ディスク
２１ ディスク本体
２２ 駆動部
２５ 反応容器
２８ 恒温槽
３０ 試薬ディスク
３１ ディスク本体
３２ 駆動部
３５ 試薬ボトル
３８ 試薬保冷庫
４１ 検体分注機構
４２ 試薬分注機構
４３ 撹拌部
４４ 吸光光度計
４５ 散乱光度計
４６ 洗浄部（槽）
５０ 分析制御部
７０ 記憶部
７１ 出力部
７２ 入力部
１００ コンピュータ
１０１ インタフェース回路
３ 反応液
４ 試薬
１０ 検体ディスク
１１ ディスク本体
１２ 駆動部
１５ 検体カップ
２０ 反応ディスク
２１ ディスク本体
２２ 駆動部
２５ 反応容器
２８ 恒温槽
３０ 試薬ディスク
３１ ディスク本体
３２ 駆動部
３５ 試薬ボトル
３８ 試薬保冷庫
４１ 検体分注機構
４２ 試薬分注機構
４３ 撹拌部
４４ 吸光光度計
４５ 散乱光度計
４６ 洗浄部（槽）
５０ 分析制御部
７０ 記憶部
７１ 出力部
７２ 入力部
１００ コンピュータ
１０１ インタフェース回路
Claims (7)
- 感作ラテックス粒子の浮遊液と目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、光学的変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定方法であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１７０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下であり、前記光学的変化量が、吸光度変化量と散乱光変化量である、方法。
- 前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定を、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径の１～１０倍の範囲の波長の光を用いて行う、請求項１記載の方法。
- 前記吸光度変化量の測定波長は、５００～９００ｎｍの範囲内で選択された２つの波長を用い、更に選ばれた２つの測定波長は主波長と、該主波長よりも長い副波長を用い、更に、前期散乱光変化量は５００～９００ｎｍの範囲内で選択された１つの波長を用いる請求項１又は２記載の方法。
- 前記目的物質について、達成すべき測定値の下限値と上限値が規定により定められている場合、吸光度測定のみで該下限値を達成するために必要な最小の検体量濃度の０．７倍以下の検体量濃度で行う、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記散乱光変化量の測定における散乱角が１０°～３０°の範囲内で少なくとも１種の散乱が測定される、請求項１～４のいずれか1項に記載の方法。
- 感作ラテックス粒子の浮遊液と前記目的物質とを反応させ、次いで、前記感作ラテックス粒子の凝集を、吸光度変化量と散乱光変化量から測定することを含む、ラテックス凝集法による目的物質の測定試薬であって、前記感作ラテックス粒子の感作前の体積平均粒子径が８０nm～３３５nmであり、反応系中の前記感作ラテックス粒子の終濃度が０．００５～０．１０w/v%であり、前記感作ラテックス粒子の感作前の粒子径が８０nm以下の粒子の反応系中の終濃度が０．０９w/v%以下である、試薬。
- 感作前の前記感作ラテックス粒子の体積平均粒子径が前記吸光度変化量及び前記散乱光変化量の測定波長の１～１／１０の範囲である、請求項６に記載の試薬。
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-
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000046828A (ja) | 1998-05-28 | 2000-02-18 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫学的測定試薬及び免疫学的測定試薬の製造方法 |
| JP4704662B2 (ja) | 2000-05-30 | 2011-06-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 免疫学的ラテックス比濁分析方法及びその試薬 |
| JP2005069891A (ja) | 2003-08-25 | 2005-03-17 | Sekisui Chem Co Ltd | 測定試薬用担体粒子及び測定試薬 |
| WO2010058860A1 (ja) | 2008-11-18 | 2010-05-27 | 株式会社シノテスト | 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 |
| JP2015078933A (ja) | 2013-10-17 | 2015-04-23 | 株式会社フジクラ | イムノアッセイ方法 |
| WO2017126227A1 (ja) | 2016-01-22 | 2017-07-27 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 自動分析装置及びその散乱光測定光学系評価用標準液 |
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