JP7198263B2 - Ask1阻害ピロロピリミジン及びピロロピリジン誘導体 - Google Patents
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Description
(式中、
R1は、H、CH3、F、またはClであり、
Xは、N、CH、またはC-CNであり、
R2は、CH3またはハロゲンである)。
定義
以下の用語は、下記に提示される意味を有するように意図されており、本発明の説明及び意図される範囲を理解するのに有用である。
(式中、
R1は、H、CH3、F、またはClであり、
Xは、N、CH、またはC-CNであり、
R2は、CH3またはハロゲンである)。
2-アミノ-5-フルオロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド(化合物1)、
2-アミノ-5-メチル-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド(化合物2)、
2-アミノ-5-クロロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-ピリジン-4-カルボキサミド(化合物3)、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド(化合物4)、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド(化合物5)、
2-アミノ-N-[1-(5-シアノ-3-メチル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド(化合物6)、及び
2-アミノ-N-[1-(3-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド(化合物7)。
本発明化合物は、薬として用いられる場合、典型的には薬学的組成物の形態で投与される。このような組成物は、薬学分野で周知されている方式で調製することができ、式Iに従う、少なくとも1つの本発明の活性化合物を含む。概して、本発明化合物は、薬学的に有効な量で投与される。実際に投与される化合物の量は、典型的には、治療の対象となる状態、選択された投与経路、投与される実際の本発明化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答、患者の症状の重症度などを含めた関連する状況に照らし、医師により決定される。
式Iに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ1:2の重量比で混合することができる。滑沢剤として少量のステアリン酸マグネシウムを添加してもよい。混合物を、錠剤プレスにおいて240-270mgの錠剤(式Iに従う本発明の活性化合物は1錠当たり80-90mg)に形成することができる。
式Iに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、デンプン希釈剤とおよそ1:1の重量比で混合することができる。混合物を、250mgのカプセル(式Iに従う本発明の活性化合物は1カプセル当たり125mg)に充填することができる。
式Iに従う本発明化合物(125mg)を、スクロース(1.75g)及びキサンタンガム(4mg)と混合し、得られた混合物をブレンドし、No.10メッシュU.S.ふるいに通し、次いで事前に作製した微結晶性セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウム(11:89、50mg)の水中溶液と混合することができる。安息香酸ナトリウム(10mg)、香味料、及び着色料を水で希釈し、撹拌しながら添加することができる。次いで、十分な水を撹拌しながら添加することができる。さらに、次いで十分な水を添加して、5mLの総量を得ることができる。
式Iに従う本発明化合物を、乾燥粉末として、乾燥ゼラチン結合剤とおよそ1:2の重量比で混合することができる。滑沢剤として少量のステアリン酸マグネシウムを添加してもよい。混合物を、錠剤プレスにおいて450-900mgの錠剤(式Iに従う本発明の活性化合物は150-300mg)に形成することができる。
式Iに従う本発明化合物を、緩衝無菌食塩水注射用水性媒体に溶解または懸濁して、およそ5mg/mLの濃度とすることができる。
ステアリルアルコール(250g)及び白色ワセリン(250g)を約75℃で融解し、次いで、式Iに従う本発明化合物(50g)、メチルパラベン(0.25g)、プロピルパラベン(0.15g)、ラウリル硫酸ナトリウム(10g)、及びプロピレングリコール(120g)の水(約370g)に溶解した混合物を添加し、得られた混合物を凝結するまで撹拌することができる。
一実施形態において、本発明は、医薬における使用のための、本発明化合物、または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。特定的な実施形態において、本発明は、疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び/または線維性疾患の予防及び/または処置における使用のための、本発明化合物または本発明化合物を含む薬学的組成物を提供する。
追加的な処置方法態様において、本発明は、炎症状態に罹患している哺乳類の予防及び/または処置の方法であって、有効量の、本発明化合物、または当該状態の処置もしくは予防のための本明細書に記載の薬学的組成物のうちの1つ以上を投与することを含む、方法を提供する。特定的な実施形態において、炎症状態は、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、及び炎症性腸疾患から選択される。より特定的には、炎症状態は、変形性関節炎である。
全般
本発明のさらなる態様によれば、式Iの化合物を調製するためのプロセスが提供される。本明細書におけるスキームは、本発明化合物の合成に使用され得る合成スキームの例である。本明細書のスキームにおいて、反応性基は、保護基を用いて保護され、十分に確立された技法に従って脱保護され得る。
(a)式IIの化合物:
を式IIIの化合物:
またはその保護誘導体と反応させることと、
(b)式Iの化合物の保護誘導体を脱保護することと、
(c)式Iの化合物またはその保護誘導体を、さらなる式Iの化合物またはその保護誘導体に相互転換することと、
(d)任意選択で、式Iの化合物の薬学的に許容される塩を形成することと
を含む、プロセスが提供される。
実験セクションで使用される略語リスト:
適用可能な場合、以下の装置及び条件を用いて質量指向型自動化HPLCによる精製を行った。
ハードウェア:
Waters 2525 Binary Gradient Module
Waters 515 Makeup Pump
Waters Pump Control Module
Waters 2767 Inject Collect
Waters Column Fluidics Manager
Waters 2996 Photodiode Array Detector
Waters ZQ Mass Spectrometer
Gilson 202 fraction collector
Gilson Aspec waste collector
ソフトウェア: Waters MassLynx version 4 SP2
カラム:使用カラムはWaters Atlantisとした。寸法は19mm×100mm(スモールスケール)及び30mm×100mm(ラージスケール)である。固定相の粒子サイズは5μmである。
酸性法:
溶媒:
A:水性溶媒=水+0.1%ギ酸
B:有機溶媒=アセトニトリル+0.1%ギ酸
メイクアップ溶媒=メタノール:水 80:20
ニードルリンス溶媒=メタノール
方法:
ラージ/スモールスケール 1.0-1.5(HPLC)、0.4-0.6(UPLC)=5-30% B
ラージ/スモールスケール 1.5-2.2(HPLC)、0.6-0.9(UPLC)=15-55% B
ラージ/スモールスケール 2.2-2.9(HPLC)、0.9-1.2(UPLC)=30-85% B
ラージ/スモールスケール 2.9-3.6(HPLC)、1.2-1.4(UPLC)=50-99% B
ラージ/スモールスケール 3.6-5.0(HPLC)、1.4-2.0(UPLC)=80-99% B(これを6分、この後に7.5分のフラッシュ及び再平衡化)
流量:上記方法の全てにおいて、流量は20mL/分(スモールスケール)または40mL/分(ラージスケール)のいずれかである。
高pH法:
カラム:HPLC分析は、周囲温度にてXBridge C18カラム(内径100nm×19nm、パッキング直径5μm)で行った。
溶媒:
A:水中10mMの重炭酸アンモニウム、アンモニア溶液でpH10に調整。
B:アセトニトリル。
目的化合物の分析的保持時間に応じて5つの方法を使用した。これらの方法の実行時間は15分で、10分のグラジエントと、その後の5分のカラムフラッシュ及び再平衡化ステップとが含まれた。
ラージ/スモールスケール 1.0-1.5(HPLC)、0.4-0.6(UPLC)=1-30% B
ラージ/スモールスケール 1.5-2.2(HPLC)、0.6-0.9(UPLC)=15-55% B
ラージ/スモールスケール 2.2-2.9(HPLC)、0.9-1.2(UPLC)=30-85% B
ラージ/スモールスケール 2.9-3.6(HPLC)、1.2-1.4(UPLC)=50-99% B
ラージ/スモールスケール 3.6-5.0(HPLC)、1.4-2.0(UPLC)=80-99% B(これを6分、この後に7.5分のフラッシュ及び再平衡化)
流量:上記方法の全てにおいて、流量は20ml/分(スモールスケール)または40ml/分(ラージスケール)のいずれかである
下記に示す方法で指定されている装置及び条件を用いて、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)による上記実施例の分析を行った。
液体クロマトグラフィー:
方法の説明:ギ酸一般的分析UPLCオープンアクセスLC/MS
2分間法
LC/MSシステム:Acquity UPLC及びSQD質量分析計の併用
LC条件
カラム:Acquity UPLC BEH C18(内径50mm×2.1mm、パッキング直径1.7μm)
カラム温度:40℃
溶媒:A=水中ギ酸0.1% v/v溶液
B=アセトニトリル中ギ酸0.1% v/v溶液
注入量:2μl
勾配表:
UV条件
PDA範囲:210nm-350nm
取得レート:40Hz
MS条件
イオン化モード:交互(正及び負のエレクトロスプレー(ES+/ES-)のスキャン)
スキャン範囲:100から1000AMU
スキャン時間:0.15
インタースキャン遅延:
MSインタースキャン(inter-scanan):0.02秒
極性/モードスイッチインタースキャン:0.02秒
方法の説明:重炭酸アンモニウム一般的分析UPLCオープンアクセスLC/MS 2分間法
LC/MSシステム:Acquity UPLC及びSQD質量分析計の併用
LC条件
カラム:Acquity UPLC BEH C18(内径50mm×2.1mm、パッキング直径1.7μm))
カラム温度: 40℃
溶媒:A=NH4HCO3の10mM水性溶液(アンモニアでpH10に調整)
B=アセトニトリル
注入量:1μl
勾配表:
UV条件
PDA範囲:210nm-350nm
UV検出は210nmから350nmの波長からのシグナルの和とした
取得レート:40Hz
MS条件
イオン化モード:交互(正及び負のエレクトロスプレー(ES+/ES-)のスキャン)
スキャン範囲:100から1000AMU
スキャン時間: 0.15
インタースキャン遅延:
MSインタースキャン:0.02秒
極性/モードスイッチインタースキャン:0.02秒
本発明化合物の合成的調製
スキーム1A 中間体Aの合成
1.1.1 ステップ1:2-ブロモ-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボン酸メチルの合成
0℃に冷却した2-ブロモ-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボン酸(10.0g、45.5mmol)のメタノール(35mL)及びトルエン(65mL)中溶液に、(トリメチルシリル)ジアゾメタン(ジエチルエーテル中2.0Mの溶液;45.5mL、90.9mmol)を30分かけて滴下添加した。反応混合物を周囲温度にて撹拌した。2時間後、反応混合物を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、これを酢酸エチル(50mL)に溶解し、水(100mL)及びブライン(50mL)でそれぞれ洗浄し、相分離フィルターで濾過し、減圧下で蒸発させて、2-ブロモ-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボン酸メチル(10.46g)を得た。LCMS: MW (計算値): 232.9;MS (ES+, m/z): 234, 236 (M+H)+.
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ = 1.59 - 1.70 (m, J = 12.3, 3.7 Hz, 2 H), 1.93 (dd, J = 12.6, 2.7 Hz, 2 H), 2.34 (s, 3H), 3.06 (t, J = 11.4 Hz, 2 H), 3.94 (d, J = 13.2 Hz, 2 H), 3.95 - 4.03 (m, J = 11.2, 11.2, 7.5, 4.2, 4.2 Hz, 1 H), 6.02 (s, 2 H), 6.51 (d, J = 4.8 Hz, 1 H), 7.05 (s, 1 H), 7.91 (d, J = 1.5 Hz, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 7.7 Hz, 1 H), 11.51 (br. s., 1 H) ppm.
1.2.1 ステップ1:2-アミノ-5-メチル-ピリジン-4-カルボン酸メチルの合成
凍結乾燥後、混合物をアセトンに溶解し、濾過し、母液を蒸発させて2-アミノ-5-メチル-ピリジン-4-カルボン酸(55mg)を得た。LCMS: MW (計算値): 152.06;MS (ES+, m/z): 153.02 (M+H)+.
1.3.1 ステップ1:3-クロロ-1-オキソ-ピリジン-4-カルボン酸の合成
1.4.1 ステップ1:4,5-ジクロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジンの合成
(1.42g)を得た。LCMS: MW (計算値): 351.15;MS (ES+, m/z): 352.22 (M+H)+.
1.6.1 3-ブロモ-4-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b〕ピリジン-5-カルボニトリルの合成
1.7.1 N-[1-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]カルバミン酸tert-ブチルの合成
2.in vitroアッセイ
2.1 ASK1/2生化学アッセイ(IMAPテクノロジー)
IMAP(登録商標)テクノロジーは、基質ペプチド配列を考慮することなく幅広い種類のキナーゼ、ホスファターゼ、及びホスホジエステラーゼに適用可能な均一アッセイを提供する。本アッセイは、シンプルな混合及び読取りの手順であり、これにより酵素活性の的確な定量が可能になる。IMAPは、ホスホ基と三価金属含有ナノ粒子(ビーズ)との特定の高親和性相互作用に基づいた、キナーゼ、ホスファターゼ、及びホスホジエステラーゼ活性を査定するための包括的な非抗体ベースプラットフォームである。酵素反応は、蛍光標識基質を用いて実施する。IMAP結合システムの追加によって酵素反応は停止し、ビーズとリン酸化基質との結合が開始する。酵素活性と相互関連する基質とビーズとの結合は、FPまたはTR-FRETのいずれかを読出しとして用いて検出することができる。
KIT IMAP FP、カタログ番号R8127;反応バッファー-Tween(5倍濃縮)、Molecular Devices、カタログ番号R7436;H2Oで1:5希釈、DTT含有(1Mのストックから1mM);プログレッシブ結合バッファー(PBB)A(5倍濃縮)、Molecular Devices、カタログ番号R7282;プログレッシブ結合試薬(PB試薬)、Molecular Devices、カタログ番号R7284;酵素溶液(反応バッファー中2倍のAsk1);基質溶液(反応バッファー中2倍のペプチド基質、及び反応バッファー中2×150μMのATP);ビーズバッファー(H2Oで1:5希釈したプログレッシブ結合バッファーA);ビーズ溶液(1:200のプログレッシブ結合試薬(2倍)を含有するビーズバッファー)
100% DMSO中100nLの試験化合物を384ウェルプレートに添加した。用量応答実験用に、化合物の4分の1希釈物(25μMのトップ最終濃度)を使用した。対照ウェル以外の各ウェルに3μlのhASK1(6nM)、hASK2(25nM)、またはrASK1(15nM)を添加し、対照ウェルに3μlのバッファーを添加した。3μLの基質溶液を各ウェルに添加し、プレートを室温で4時間インキュベートした。この後、6μLのIMAP(商標)ビーズ溶液(プログレッシブ結合バッファーA+PB試薬;最終希釈1:100)を各ウェルに添加し、1000rpmにて1分間スピンした。次いでプレートを室温にて2時間インキュベートし、その後にプレートをPerkin Elmer EnVisionプレートリーダーで読み取った。
IC50データの計算、曲線及びQC分析は、Excelツール及びGraphPad Prismソフトウェアv.5.03を使用することにより行った。簡潔に述べると、個々の濃度-効果曲線は、最小二乗(通常)適合を用いて試験化合物の試験濃度(X)vs.対応する阻害パーセント値(Y)の対数をプロットすることにより生成する。値が平均±1*SDより大きい場合のみ、高/低対照からの最大1/4ポイントが除外可能である。IC50計算に使用した適合式=log(阻害剤)vs.応答-可変傾斜(variable slope)(4つのパラメーター)。計算結果:計算1:FP測定におけるmP値=1000*(S-G*P)/(S+G*P)[式中、S=<detector 2またはFP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-optimized(1) channel 2>、P=<detector 1またはFP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-optimized(1) channel 1>、G=G-factor]。Gain=100。トップ制約(top constrain)は、トップ値が正しく計算されない場合のみ使用する。
AlphaScreenテクノロジーの説明
タンパク質基質(MKK7)におけるリン酸化の程度を測定するAlphaScreenテクノロジーを用いて、ASK1及びASK2の生化学的活性も定量化した。AlphaScreenテクノロジーは、基質と2つのタイプのビーズ(アクセプター及びドナー)との結合に基づく。1つのビーズとの結合は、基質タンパク質のタグを通じて行われる。第2のビーズとの結合は、抗体と基質のリン酸化部位とのリン酸化部位特異的結合を通じて行われる。これにより、アクセプタービーズ及びドナービーズが近接したサンドイッチが形成される。ドナービーズが680nm範囲の光に励起された場合、一重項酸素が放出され、620nm範囲のアクセプターからの発光を引き起こし、この発光は好適なプレートリーダーを用いて検出することができる。
ASK1/2 AlphaScreenアッセイは、GSTタグの使用を通じて、全長の不活性MKK7タンパク質をグルタチオンドナービーズに結合することにより可能になる。次いで、MKK7上のリン酸化部位(Ser271/Thr275)がリン酸化部位特異的抗体に認識される。リン酸化部位特異的抗体は、プロテインA相互作用を通じてAlphaScreenアクセプタービーズに結合する。ASK1及びASK2によるMKK7のリン酸化は、次にドナービーズ及びアクセプタービーズが近接するのを促進し、その結果一重項酸素がAlphaScreenシグナルの生成をもたらす。
ASK1/2 AlphaScreen試薬、条件、及びプロトコル
・N末端6His-Aviタグ付き全長ヒトASK1タンパク質。
・N末端6His-Aviタグ付き全長ASKタンパク質の2量体(リジン709がメチオニンで置き換えられた不活性酵素)及び6His-FLAGタグ付き全長ASKタンパク質。
・ヒトMKK7不活性(Carna Bioscience、カタログ番号:07-147-10)。
・Phospho-MKK7(Ser171/Thr275)抗体(Cell Signalling Technologies カタログ番号:4171)。
・プロテインAアクセプタービーズ(Perkin Elmer、カタログ番号:6760137)。
・グルタチオンドナービーズ(Perkin Elmer、カタログ番号:6765301)。
・アデノシン三リン酸、ATP(Promega、カタログ番号:V915B)。
・反応バッファー:50mM Hepes、150 mM NaCl、10mM MgCl2、1mM CHAPS、pH7.2。
・停止バッファー:50mM Hepes、150mM NaCl、60mM EDTA、1mM CHAPS、pH7.2。
100% DMSO中100nLの試験化合物(出発濃度6μM、3倍系列希釈による11通りの濃度)を少量用384ウェルプレートに添加した。対照ウェル以外の各ウェルに2.5μlのASK1またはASK2を添加し、対照ウェルに2.5μlのバッファーを添加した。2.5μlのMKK7溶液を全てのウェルに添加した。プレートを室温にて60分間インキュベートした。プロテインAアクセプタービーズ及びリン酸特異的抗体を30分間インキュベートし、次いで2.5μlのプロテインAアクセプタービーズ/リン酸特異的抗体混合物(2.5μg/mlのアクセプタービーズ最終濃度及び1/800抗体最終希釈)を各ウェルに添加した。プレートを室温にて30分間インキュベートし、次いで2.5μlのGSHドナービーズ(10μg/mlのアクセプタービーズ最終濃度)を各ウェルに添加した。プレートを室温にてさらに60分間インキュベートし、その後にプレートをPerkin Elmer Enspireプレートリーダーで読み取った。
IC50データの計算、曲線及びQC分析は、Excelツール及びGraphPad Prismソフトウェアv.5.03を使用することにより行った。簡潔に述べると、個々の濃度-効果曲線は、最小二乗(通常)適合を用いて試験化合物の試験濃度(X)vs.対応する阻害パーセント値(Y)の対数をプロットすることにより生成した。IC50計算に使用した適合式=log(阻害剤)vs.応答-可変傾斜(variable slope)(4つのパラメーター)。
in vitroのASK1/2活性は、ウェスタンブロット法を用いてH2O2刺激PBMC中のホスホ-MKK3タンパク質の量を定量することによりアッセイした。MKK3は、p38活性化経路におけるASK1/2触媒リン酸化の直接的基質であることが示された。
2.3.1 材料及びアッセイ条件
・Lymphoprep(Axis-Shield、カタログ番号:1114545)
・塩化アンモニウムライセートバッファーpH7.4(10倍濃縮)
-NH4Cl - 最終濃度1.5M(Kemika、カタログ番号0137407)
-NaHCO3 - 最終濃度100mM(Kemika、カタログ番号1411007)
-Na2EDTA - 最終濃度10mM(Sigma Aldrich;カタログ番号E-4884)
・RPMI 1640(Lonza カタログ番号BE12-115F/U1)
・FBS(Sigma カタログ番号F7524、熱不活化30分/56℃)
・ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma、カタログ番号D2650)
・細胞溶解バッファー(pH7.4):PBS+1% Triton X-100(Sigma Aldrich;カタログ番号X100) - 10ml
-Phospho-Stop - 1錠(Sigma、カタログ番号4693124001)
プロテアーゼ阻害剤 - 1錠(Sigma、カタログ番号4906837001)
・過酸化水素溶液 3% w/w(Sigma Aldrich、カタログ番号H-6520)
・PBS(Sigma Aldrich、カタログ番号P4417-100TAB)
・マイクロプレート、96ウェル、pp、v底、透明(Greiner bio-one;カタログ番号651201)
・組織培養プレート、6ウェル、平底、低蒸発蓋付き(Falcon、カタログ番号353224)
・50mLファルコンチューブ(TPP、カタログ番号91050)
・Pierce BCAタンパク質アッセイキット(Thermo Scientific、カタログ番号23225)
・Immulon(登録商標)Microtiter(商標)96ウェルプレート1B(Thermo Scientific、カタログ番号3355)
・Wes 12-230kDaマスターキット(Protein Simple、カタログ番号PS-MK14)
・MKK3(D4C3)ウサギmAb(Cell Signaling、カタログ番号8535)
・Phospho-MKK3(Ser189)/MKK6(Ser207)(D8E9)ウサギmAb(Cell Signaling、カタログ番号12280)
PBMCをバフィーコートから単離するため、バフィーコートをPBSに1:1希釈し、次いで希釈バフィーコート(25mL)をファルコンチューブ内の20mLのLymphoprepの上面に慎重にピペットで移した。次いでチューブを400xgにて35分間スピンさせた。次いで上方の血漿層を慎重に除去し、MNC含有層を残した。次いでMNC含有層を新たなチューブに移し、PBSを添加して50mLの総量とし、次いでチューブを10分間スピンする(200xg、25℃)。次いで得られたペレットを2mLのPBSに再懸濁し、洗浄ステップを繰り返した。最終ペレットを最大50mLの塩化アンモニウムライセートバッファーに再懸濁し、穏やかに混合し、10分間遠心処理し(200xg、25℃)、2-3mLの細胞培地に再懸濁し、細胞培地中で最大50mLに希釈した。自動セルカウンターを用いて細胞培地中1/20希釈の細胞密度を定量した。
[(試料-低対照)/(高対照-低対照)]*100
ELISAを用いて、LPSで刺激したヒト全血中で産生されるCCL2サイトカインの量を定量することにより、in vitroのASK1/2活性をアッセイした。文献には、非刺激及びLPS刺激条件下において、ASK1ノックアウトマウスからの血清中でCCL2産生が減少することが記載されている。
2.4.1 材料及びアッセイ条件
・RPMI 1640(Lonza カタログ番号BE12-115F/U1)
・ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma、カタログ番号D2650)
・E.coli由来リポ多糖(LPS)(Sigma、カタログ番号L4391)
・マイクロプレート、96ウェル、pp、v底、透明(Greiner;カタログ番号651201)
・Master block 96ウェル、2ml(Greiner、カタログ番号780271)
・Microplateマイクロプレート、96ウェル、ps、u底、透明、蓋付き(Greiner、カタログ番号650180)
・50mLファルコンチューブ(TPP、カタログ番号91050)
・Immulon 2HB 96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific、カタログ番号3455)
・スクロース(Kemika、カタログ番号1800408)
・ストレプトアビジン-HRP(Calbiochem、カタログ番号OR03L)
・硫酸(Kemika、カタログ番号1816501)
・抗hCCL2抗体(R&D Systems、カタログ番号MAB679)、1mlのPBSに溶解
・抗hCCL2検出抗体(R&D Systems、カタログ番号BAF279)、1mlのPBSに溶解
・組換えhCCL2(標準、R&D Systems、カタログ番号366-6C)
・洗浄バッファー(PBS+0.05% Tween-20)
-PBS(Sigma、カタログ番号P4417)
-Tween-20(Sigma、カタログ番号P2287)
・20mlの基質:18ml H2O+2 ml 1M酢酸ナトリウム+200μl TMBミックス+2.5μl 30% H2O2
-酢酸ナトリウム(Kemika、カタログ番号1441908)
-TMBミックス(Sigma、カタログ番号T2885)
-過酸化水素(Merck、カタログ番号1.08597)
・コーティングバッファー(15mM Na2CO3(×H2O)+35mM NaHCO3)
-炭酸ナトリウム(Sigma、カタログ番号S-2127)
-重炭酸ナトリウム(Kemika、カタログ番号1411007)
・アッセイバッファー(PBS+0.05% Tween-20+1% BSA)
-ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma、カタログ番号A2153)
クエン酸塩抗凝固剤を用いて全血を収集した。100μLを、自動セルカウンターを用いた細胞数の定量に使用した。
ELISA結果(450nmにおける吸光度)をMicrosoft Excelソフトウェアを用いて分析した。全ての値からブランクの平均値を差し引いた。標準物質の系列希釈(pg/mL)をx軸、これに対し対応する吸光度の値をy軸として、標準曲線をプロットした。試料中のサイトカイン量(pg/mL)を標準曲線から計算した。以下の式を用いて対照を基準にデータを正規化することにより、阻害パーセンテージを計算した。
[(試料-低対照)/(高対照-低対照)]*100
3.1 荷重法を用いて査定した、ラットにおけるCFA(完全フロイントアジュバント)誘発性過感受性
完全フロイントアジュバント(CFA)の足底注射は、過感受性及び浮腫を誘発する炎症性反応を引き起こし、臨床的な炎症性疼痛のいくつかの態様を模倣する。荷重を測定する装置及びプレチスモメーターを用いて3つの効果を調べた。
ナイーブなラットは、2本の後肢間で体重を均等に分配する。しかし、注射を受けた(左)後肢が炎症及び/または有痛性である場合、罹患肢に加わる体重が少なくなるように体重が再分配される(損傷肢にかかる重量の減少)。ラット両足圧力差痛覚測定器(incapacitance tester)(Linton Instruments,UK)を用いて、各後肢にかかる荷重を測定した。
ヨード酢酸一ナトリウム(MIA)をスプレーグドーリーラットの同側の膝に関節内投与すると、最初に炎症性応答を伴うロバストで持続性の痛覚過敏及びアロディニアがもたらされる。この動物モデルにおけるこれらの徴候の発生は、臨床的に意義があると考えられており、変形性関節炎(OA)またはリウマチ性関節炎などの基礎的状態に関連する慢性炎症性疼痛を呈する患者が示す症状を反映していると考えられている(Bove SE et al.,Osteoarthritis Cartilage 2003;11(11):821-30;Fernihough J,et al.,Pain 2004;112(1-2):83-93;Kalbhen DA.J Rheumatol 1987;14 Spec No:130-1)。
ナイーブなラットは、2本の後肢間で体重を均等に分配する。しかし、注射を受けた(左)後膝が炎症及び/または有痛性である場合、罹患肢に加わる体重が少なくなるように体重が再分配される(損傷肢にかかる重量の減少)。ラット両足圧力差痛覚測定器(Linton Instruments,UK)を用いて、各後肢にかかる荷重を測定する。
この試験の目的は、CCl4中毒による肝線維症のモデルを査定することであった。組織診断、生化学、イメージング、及び異なる時点における遺伝子発現の探索による肝線維症の査定により、この疾患の発症及び見込みのある陽性参照物質の効果を評価する。Starkel P.,Animal models for the study of hepatic fibrosis,Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25:319-333,2011
本試験は、5週齢のオスBalbC Jマウス(Janvier Lab)を用いて実施する。
・CCl4:四塩化炭素ACROS 99.8%、CAS=56-23-5、ロットA0293900
・オリーブ油、SIGMA O1514-500mL、ロット番号BCBQ4885V
・colF(ImmunoChemistry Technologies)、ref 6346、ロット13Y39、使用期限05/2017
ストック溶液は、100μLのDMSOに希釈し(6.8mM)4℃にて保管
イメージングの15分前にppi水中1:170希釈を動物に注射(100μL、静脈洞内)
・CCl4をオリーブ油で1/2に希釈し、週当たり2回0.6mL/kgにて腹腔内投与した。
血液を血清チューブに収集し、試料を3000t/分にて5分間遠心処理し、AST、ALT、ALP、及び総ビリルビン評価用に-20℃にて凍結させた。肝臓右中葉の試料も採取し、速やかに1mLのRNAlaterと共にエッペンドルフチューブ(2mL丸底)に入れ(安全ロックチューブ)4℃にて保管する。
この試験の目的は、CCl4中毒による肝線維症のモデルを査定することであった。組織診断、生化学、イメージング、及び異なる時点における遺伝子発現の探索による肝線維症の査定により、この疾患の発症及び見込みのある陽性参照物質の効果を評価する。Starkel P.,Animal models for the study of hepatic fibrosis,Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25:319-333,2011
本試験は、8週齢のオスBalb/Cマウス(Charles River,Italy)を用いて実施する。
・CCl4(液体)を0.06mL/mlの濃度にてオリーブ油に添加する。溶液を0.6mL/kgの用量にて腹腔内投与する。適用体積は10mL/kgとする。
・試験化合物をメチルセルロース(MC 0.5%)に溶解/懸濁する。
定常状態PKの試料採取用に、血液をHe-リチウムチューブに収集して血漿を生成する。全ての血液試料を、収集から30分以内に遠心分離(5,000rpm、4℃にて10分間)により処理して血漿を得る。次いで、分析を行うまで試料を-80℃にて保管する。
MCDは、脂肪性肝炎及び線維症における新規のマウスモデルであり、食餌:メチオニン及びコリン欠乏(MCD)により誘発される。(Wehr et al 2013 J immunol,190(10):5226-36;Baeck et al.,2014 Hepatology,59(3):1060-72;Gautheron et al,2014 EMBO,6(8):1062-74).
C57BL/6マウス(Janvier Labs(France))を以下に示すような群に分ける。マウスは誘発フェーズ開始時点で8週齢(>20グラム)である。
・MCD食餌(コリン及びメチオニンなし) Ref EFTD.90262 MCD mod.batch 8206423、Ssniff,Soest,Germany-
・メチルセルロース0.5%、VWR、
・PEG400:P3265,Sigma
・Cryomold(登録商標)Standard 25×20×5mm(Sakura Finetec,4557)
・O.C.T.(商標)化合物クリオモルド(Sakura Finetec,4583)
・試料保存用ホルマリン(メタノールで4%緩衝)
化合物を、撹拌下で適切なビヒクル(上の表を参照)に溶解/懸濁する。調製後、溶液/懸濁液を一定の磁気撹拌下、暗中室温にて保つ。投薬の際は10mL/kgの量を使用し、溶液の濃度を動物の体重に応じて調整する。
誘発フェーズは3週間とする。空腹時グルコースは提供しない。マウスにMCD対照食餌またはMCD食餌を与える。
この試験の目的は、マウスにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症の14日モデルにおいて、3つの異なる用量における試験化合物の有効性を試験することである。
この試験は、Charles River,Italyが供給するC527BL/6Nオスマウスに対し行う。マウスを少なくとも5日間、12時間の明期サイクル下、22℃、55%相対湿度、1時間当たり15~20回の換気に維持された環境に順化させる。マウス用ペレット飼料及び水は自由に摂取させる。
試験溶液用の溶媒は、0.5gのヒドロキシエチルセルロース(Natrosol)を500mLの蒸留水(Aqua distillate)に添加し(0.1%)、磁気スターラーで5時間、加熱を伴わずに持続的に撹拌することにより調製する。
動物は1日2回臨床検査を受ける。臨床徴候及びパラメーターのリストはヒトのエンドポイント表に示される。0日目から毎日動物を秤量する。
MS Excelを用いて体重データ及び肺重量データを処理する。GraphPad Prismソフトウェア(バージョン5.04)を用いて統計的分析及びグラフ提示を実施する。
3.6.6.1 プロトコル
第7群の動物(n=10)はPK試験のみに含め、臨床徴候スコア付けに供さない。
LC-MS/MSを介し、血漿及び肺の濃度を測定する。タンパク質沈殿を介し、試料をLC-MS/MS分析用に調製する。定量下限未満(LLOQ)で測定された血漿濃度は定量限界未満(BLQ)として報告する。
3.7.1 材料
完全フロイントアジュバント(CFA)及び不完全フロイントアジュバント(IFA)をDifcoから購入する。ウシII型コラーゲン(CII)、リポ多糖(LPS)、及びEnbrelを、Chondrex(L’Isle-d’Abeau,France)、Sigma(P4252,L’Isle-d’Abeau,France)、Wyeth(25mg注射用シリンジ、France)、Acros Organics(Palo Alto,CA)からそれぞれ入手する。使用する他の全ての試薬は試薬グレードとし、全ての溶媒は分析グレードとする。
Dark Agoutiラット(オス、7-8週齢)をHarlan Laboratories(Maison-Alfort,France)から入手する。ラットを12時間明期/暗期サイクル(0700-1900)で飼育する。温度を22℃に維持し、飼料及び水を自由に摂取させる。
実験の1日前に、0.05Mの酢酸を用いてCII溶液(2mg/mL)を調製し、4℃にて保管する。免疫化の直前に、等体積のアジュバント(IFA)及びCIIを、氷水浴中で予冷したガラス瓶内でホモジナイザーにより混合する。エマルジョンが形成されない場合は付加的なアジュバント及び均質化持続が必要となる場合がある。1日目に、各ラットの尾の基部に0.2mLのエマルジョンを皮内注射し、9日目に、2回目のブースター皮内注射(CFA 0.1mL食塩水中2mg/mLのCII溶液)を実施する。この免疫化法は、公表された方法(Jou et al.2005;Sims et al.2004)から改変したものである。
化合物の治療効果をラットCIAモデルにおいて試験する。ラットを均等な群にランダムに分け、各群が10匹のラットを含むようにする。全てのラットを1日目に免疫化し、9日目にブーストする。治療的投薬は16日目から30日目まで続ける。陰性対照群をビヒクルで処置し、陽性対照群をEnbrelで処置する(10mg/kg、3回/週、皮下)。典型的には、目的化合物の試験は4回用量、例えば、0.3、1、3、及び10mg/kg、経口で行う。
関節炎を文献に記載の方法に従ってスコア化する(Khachigian 2006 Nat Protoc.2006;1(5):2512-6;Lin et al. 2007,Br J Pharmacol,150,pp862-872;Nishida et al.2004,Arthritis and Rheumatism,50(10),pp3365-3376)。4本の足の各々の膨脹を以下のような関節炎スコアでランク付けする:0-症状なし;1-軽度、ただし明確な赤み及び1つのタイプの関節(例えば、足首もしくは手首)の膨脹、または明らかな赤み及び個々の指に限定された膨脹(罹患した指の数にかかわらず);2-中等度の赤み及び2つ以上のタイプの関節の膨脹;3-重度の赤み及び指を含めた足全体の膨脹;4-複数の関節を伴って最大限に炎症化した肢(動物当たりの最大累積臨床関節炎スコアは16)(Nishida et al.2004)。
臨床的には、体重損失は関節炎に関連する(Rall & Roubenoff 2004 Rheumatology(Oxford);43(10):1219-23;Shelton et al.2005 Pain;116(1-2):8-16;Walsmith et al.2004 J Rheumatol.;31(1):23-9)。そのため、関節炎発症後の体重変化は、ラットモデルにおける治療効果を評価するための非特異的エンドポイントとして使用することができる。関節炎発症後の体重変化(%)は以下のように計算する:
各個々の動物の後肢に対し、X線写真を撮影する。ランダムな盲検的識別番号を各写真に割り当て、2名の独立した採点者が以下のような放射線医学的Larsenスコアシステムを用いて骨のびらんの重症度をランク付けする:0-正常、非損傷の骨輪郭及び正常な関節空間;1-わずかな異常、外側の中足骨のうちの任意の1つまたは2つがわずかな骨のびらんを示す;2-明らかな早期異常、外側の中足骨のうちの任意の3つから5つが骨のびらんを示す;3-中間の破壊性異常、全ての外側の中足骨が明らかな骨のびらんを示し、さらに内部の中足骨のうちの任意の1つまたは2つが明らかな骨のびらんを示す;4-重度の破壊性異常、全ての中足骨が明らかな骨のびらんを示し、内側の中足骨関節の少なくとも1つが完全にびらん状態であり、いくつかの骨関節輪郭は部分的に保存されている;4-断節性の異常、骨の輪郭を伴わない。このスコア付けシステムは、文献のプロトコル(Bush et al.2002,Arthritis and Rheumatism,46(3),802-805;Jou et al.2005,Arthritis Rheum,52(1),339-44;Salvemini et al.2001,Arthritis Rheum,44(12),2909-21;Sims et al.2004,Arthritis Rheum,50(7),2338-46)からの改変である。
放射線医学的分析の後、マウスの後肢を10%リン酸緩衝ホルマリン(pH7.4)に固定し、精細な組織診断のために迅速な骨脱灰剤(EUROBIO,Les Ulis,France)で脱灰し、パラフィン包埋する。関節炎関節の広範な評価を確実に行うため、少なくとも4つの連続切片(5μm厚さ)を切り、各連続切片の間を100μmとする。切片をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色する。滑膜の炎症ならびに骨及び軟骨の損傷に対する組織学的検査を二重盲検で実施する。各足において、4点尺度を用いて4つのパラメーターを査定する。このパラメーターは、細胞浸潤、バンヌスの重症度、軟骨のびらん、及び骨のびらんである。スコア付けは以下のように実施する。1-正常、2-軽度、3-中等度、4-著明。4つのスコアを合計し、追加的スコア、すなわち「RA総スコア」として表す。
RAで観察される骨の分解は、特に皮質骨で生じ、μCT分析によって明らかになり得る(Oste et al. 2007;Sims et al.2004)。踵骨のスキャン及び3Dボリューム再構築の後に、骨分解を、in silicoで骨の縦軸に対し垂直に分離している、スライドごとに存在する不連続的な物体の数として測定する。骨が分解するほど、より多くの不連続的な物体が測定される。踵骨に沿って均等に分配した(約10.8μm間隔)1000枚の切片を分析する。
7日目以降、後眼窩洞にて、抗凝固剤としてのリチウムヘパリンを用いて、以下の時点にて血液試料を収集する:用量前、1、3、及び6時間。全血試料を遠心処理し、得られた血漿試料を未定の分析に-20℃にて保管する。LC-MS/MS法により、各試験化合物の血漿濃度を定量する。質量分析計は正エレクトロスプレーモードで操作する。WinNonlin(登録商標)(Pharsight(登録商標),United States)を用いて薬物動態パラメーターを計算し、用量前血漿レベルは24時間血漿レベルに等しいと想定する。
MABモデルは、治療薬によるRA類似炎症性応答の調節に対する迅速な査定を可能にする。Khachigian,2006.DBA/Jマウスに、コラーゲンIIに対し向けられたmAbのカクテルを静脈内注射する。1日後、化合物の処置を開始する。3日後、マウスは腹腔内LPS注射(50μg/マウス)を受け、急速な炎症発生がもたらされる。化合物処置は、mAb注射から10日後まで継続する。炎症は、足の膨脹を測定し、各足の臨床スコアを記録することにより読み取る。炎症の重症度を示すために、四肢の累積臨床関節炎スコアが提示される。各肢に対し、0-4の尺度(4が最も重度の炎症)を用いたスコア付けシステムを適用する。
0 症状なし
1 軽度、ただし明確な赤み及び1つのタイプの関節(例えば、足首もしくは手首)の膨脹、または明らかな赤み及び個々の指に限定された膨脹(罹患した指の数にかかわらず)
2 中等度の赤み及び2つ以上のタイプの関節の膨脹
3 重度の赤み及び指を含めた足全体の膨脹
4 複数の関節を伴って最大限に炎症化した肢
3.9.1 MNXラットモデルにおけるin vivo有効性
メスのLewis半月板切除ラット(MNX)モデルにおいてin vivo有効性を試験した。MNXラットモデルは、十分に検証された変形性関節炎の疾患モデルである(Bendele,2001,J Musculoskel Neuron Interact,1(4),377-85;Janusz et al.,2002,Osteoarthr Cartilage,10,785-91;Pritzker et al.,2006,Osteoarthr Cartilage,14,13-29)。
0日目に各ラットの右足に対し、内側側副靭帯の横断による半月板切除によって変形性関節炎を誘発し、4mmの靭帯を除去する。半月板の内部部分を垂直方向に横断して2つのフラップにし、これを滑膜腔の前及び後に向かって押す。シャム動物は麻酔のみを受け、皮膚及び筋肉を切開し、次いで縫合する。1日目に、均質な分配を行うため、ラットを体重に応じてランダムに処置群(群当たりn=20)に割付ける。C2から21日目まで、ラットに経口(po)で1日1回(qd)または1日2回(bid)、メチルセルロース(MC)0.5%またはHPβCD 10% pH3.0で製剤化した化合物を投与する。
処置から少なくとも7日後、定常状態血漿曝露を定量するために、投与後の4つの時点:0、1、3、及び6時間(24時間は、用量前試料に等しいと想定する)で血液を試料採取する。
屠殺時に、各ラットの右脛骨を収集し、組織学的解析用に処理する。4%ホルムアルデヒド中の固定から48時間後、脛骨をOsteosoft中で7日間脱灰し、半分に切って2つの部分にしてから向かい合わせてパラフィン包埋する。5つの連続切片を200μm間隔で切り、約1.5mmの骨の中央部を網羅する。1つの連続スライドを、形態学的評価及びOARSIスコア付けのためにサフラニンO及び薄緑色で染色する。他の連続スライドは、軟骨細胞密度測定のためにDAPIと共にマウントする。
このモデルは、NASHを誘発するために、60kcal%脂肪及び0.1%メチオニンからなるコリン欠乏L-アミノ酸規定高脂肪食(CDAHFD)を使用する。
C57/BL6マウス(Charles River)を以下に示すような群に分ける。マウスは誘発フェーズ開始時点で8週齢(>20グラム)である。
・CDAHFD;Research Diets Inc.,Ref.No.A06071302
・対照食餌:normal diet(VRF 1,P),Special Diets Services
誘発フェーズ:4週間
非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)を誘発するため、動物にコリン欠乏L-アミノ酸規定高脂肪食(CDAHFD)を与える。
マウスを処置群にランダムに割付け、評価フェーズまで、上記の表に提示されるスケジュールに従って処置する。
定常状態PKの試料採取:血液をK2-EDTAチューブに収集して血漿を生成する。全ての血液試料を、収集から30分以内に遠心分離(5,000rpm、4℃にて10分間)により処理して血漿を得る。各血液試料からの血漿を液体窒素で迅速に凍結し、分析を行うまで-80℃にて冷凍庫で保管する。
化合物1は、このモデルで試験した場合、少なくとも試験対象の最高用量において、線維症遺伝子パネルにおけるPai1、TIMP1、CTGF、及びTGFβの発現レベル(図3)に対し、ならびに炎症パネルにおける3つの遺伝子全て(図4)に対し、有意な効果を示した。加えて、化合物1は、15mg/kg/1日1回及び15mg/kg/1日2回におけるヒドロキシプロリンレベルに対する有意な効果(図5)、15mg/kg/1日1回及び15mg/kg/1日2回におけるシリウスレッドの線維症定量化に対する有意な効果(図6)、ならびに15mg/kg/1日2回におけるF4/80定量化に対する有意な効果(図7)を示した。
ヒトシトクロームP450アイソエンザイム(CYP1A2、2C9、2C19、2D6、及び3A4)に対する試験化合物の阻害潜在可能性を、cDNA発現ヒトシトクロームP450アイソエンザイム及び経口代謝産物に代謝される非蛍光基質を用いて査定する。
試験した各CYP450アイソエンザイムに使用した阻害アッセイ条件
BFC:7-ベンジルオキシ-4-トリフルオロメチルクマリン
CEC:3-シアノ-7-エトキシクマリン
DBF:ジベンジルフルオレセイン
プールされたHLMにおいて査定される、化合物による時間依存的CYP3A4阻害を、Grimm et al.Drug Metabolism and Disposition 2009,37,1355-1370及びdraft FDA Guidance for Industry(Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis,Implications for Dosing,and Labeling Recommendations),2006(http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm)に従ってIC50定量を介して定量する。テストステロンをプローブ基質として使用し、トロレアンドマイシンを陽性対照として使用する。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
(態様1)
式I:の化合物:
(化1)
(式中、
R 1 は、H、CH 3 、F、またはClであり、
Xは、N、CH、またはC-CNであり、
R 2 は、CH 3 またはハロゲンである)
またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物、もしくは溶媒和物の薬学的に許容される塩、またはその生物学的に活性な代謝産物。
(態様2)
R 1 がFである、態様1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
(態様3)
R 2 がCH 3 である、態様1または2に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
(態様4)
XがCHである、態様1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
(態様5)
XがC-CNである、態様1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
(態様6)
XがNである、態様1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
(態様7)
前記化合物が以下から選択される、態様1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩:
2-アミノ-5-フルオロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-5-メチル-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-5-クロロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-シアノ-3-メチル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド、及び
2-アミノ-N-[1-(3-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド。
(態様8)
態様1-7のいずれか1項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
(態様9)
医薬における使用のための、態様1-7のいずれか1項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または態様8に記載の薬学的組成物。
(態様10)
疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び/または線維性疾患の予防及び/または処置における使用のための、態様1-7のいずれか1項に記載の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または態様8に記載の薬学的組成物。
(態様11)
態様1に記載の式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物、もしくは溶媒和物の薬学的に許容される塩、またはその生物学的に活性な代謝産物を調製するためのプロセスであって、
(a)式IIの化合物:
(化2)
(式中、X及びR 2 は、態様1で定義されている通りである)
を式IIIの化合物:
(化3)
(式中、R 1 は、態様1で定義されている通りである)
またはその保護誘導体と反応させることと、
(b)式Iの化合物の保護誘導体を脱保護することと、
(c)式Iの化合物またはその保護誘導体を、さらなる式Iの化合物またはその保護誘導体に相互転換することと、
(d)任意選択で、式Iの化合物の薬学的に許容される塩を形成することと
を含む、前記プロセス。
Claims (11)
- R1がFである、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- R2がCH3である、請求項1または2に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- XがCHである、請求項1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- XがC-CNである、請求項1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- XがNである、請求項1、2、または3に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
- 前記化合物が以下から選択される、請求項1に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩:
2-アミノ-5-フルオロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-5-メチル-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-5-クロロ-N-[1-(5-メチル-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-クロロ-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド、
2-アミノ-N-[1-(5-シアノ-3-メチル-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド、及び
2-アミノ-N-[1-(3-クロロ-1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4-ピペリジル]-5-フルオロ-ピリジン-4-カルボキサミド。 - 請求項1~7のいずれか1項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、薬学的組成物。
- 医薬における使用のための請求項8に記載の薬学的組成物。
- 疼痛、炎症状態、心血管疾患、神経変性疾患、神経疾患、糖尿病の合併症、がん、及び/または線維性疾患の予防及び/または処置における使用のための、請求項8に記載の薬学的組成物。
- 請求項1に記載の式Iの化合物、またはその薬学的に許容される塩、もしくは溶媒和物、もしくは溶媒和物の薬学的に許容される塩を調製するためのプロセスであって、
(a)式IIの化合物:
を式IIIの化合物:
またはその保護誘導体と反応させることと、
(b)式Iの化合物の保護誘導体を脱保護することと、
(c)式Iの化合物またはその保護誘導体を、さらなる式Iの化合物またはその保護誘導体に相互転換することと、
(d)任意選択で、式Iの化合物の薬学的に許容される塩を形成することと
を含む、前記プロセス。
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