KR20200028436A - Ask1 저해성 피롤로피리미딘 및 피롤로피리딘 유도체 - Google Patents

Ask1 저해성 피롤로피리미딘 및 피롤로피리딘 유도체 Download PDF

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KR20200028436A
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밀란 메식
고르돈 색스티
탄자 폴작
이네스 부자시노빅
딘코 지헤르
데이비드 위티
칼 리차드 깁슨
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갈라파고스 엔.브이.
칼찬 리미티드
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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I에 따른 피롤로피리미딘 화합물, 및 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, I형 당뇨병의 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다. 특정 양상에서, 본 화합물은 ASK 저해제, 특히 ASK1 저해제이다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 생산 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, I형 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에서의 상기 화합물의 용도를 제공한다. (화학식 (I))
Figure pct00113

Description

ASK1 저해성 피롤로피리미딘 및 피롤로피리딘 유도체
본 발명은 피롤로피리미딘 화합물 및 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병의 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에서의 그들의 용도에 관한 것이다. 특정 양상에서, 본 화합물은 ASK 저해제, 특히 ASK1 저해제이다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 생산 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에서의 상기 화합물의 용도를 제공한다.
세포자멸사 신호-조절 키나제(Apoptosis signal-regulating kinase: ASK1)는 전염증 분자, 예컨대 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)를 비롯한, 스트레스 자극, 소포체 스트레스, 산화적 스트레스, 유전자독성 스트레스, 유리 라디칼, Fas 리간드 및 칼슘 과부하에 대한 반응을 유도하는 미토겐-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinase: MAPK) 신호전달 경로 상에 편재하여 발현되는 Ser/Thr 키나제이다(Takeda K et al (2008) Annu Rev Pharacol Toxicol 248 pp199-225; Nagai H et al (2007) J Biochem Mol Biol 40 pp1-6).
ASK1은 MAP 키나제 키나제(MKK)를 통해 신호를 전달하는 다수의 MAP 키나제 키나제 키나제(MAP3K) 중 하나이다. ASK1 신호전달의 경우에, MKK3 및 MKK6은 p38 경로를 활성화시키고, MKK4 및 MKK7은 JNK 경로를 활성화시킨다(Davis RJ (2000) Cell 103 pp239-252; Ichijo H et al (1997) Science 275 pp90-94). 따라서 ASK1의 저해제는 p38과 JNK 둘 다를 통해 신호전달 경로를 억제할 잠재력을 가진다.
가용성 TNF 수용체: Fc 융합 단백질 엔브렐(Enbrel)(에타너셉트)의 사용은 염증성 통증에 대한 임상에서 그리고 또한 신경병성 통증에 대한 전임상 모델에서 효능이 있는 것으로 나타났는데(Hao S et al (2007) Gene Therapy 14 pp1010-1016) 이는 TNF-α가 통증 반응에서 중요한 매개체라는 것을 나타낸다. IL-6은 TNF-α 신호전달의 중요한 하류 매개체이며, 류마티스 관절염에 대한 유효한 치료적 접근으로서 항-IL-6 요법을 뒷받침하는 임상 증거가 있다(로슈(Roche)는 2008년 5월에 악템라(Actemra)/토실리주맙(Tocilizumab)에 대한 긍정적인 III상 결과를 공개하였다).
기능성 ASK1을 갖지 않는 다수의 세포(ASK1 넉아웃 마우스로부터 또는 유전자 침묵 후에 단리됨)는 TNF-α 유도된 세포자멸사에 대해 내성이 있다(Tobiume K, et al (2001) EMBO Rep 2 pp222-228). 따라서 ASK1은 TNF-α 경로에서 중심축이 되며, ASK1 저해를 통한 TNF-α 신호전달 경로의 붕괴가 통증으로부터의 경감과 같은 유리한 하류 효과를 야기한다는 가설을 뒷받침한다. p38 및/또는 JNK의 활성화를 전염증 매개체 및 후속적 통증 반응의 생산과 연결하는 강한 증거가 있다(Ji R-R and Suter MR (2007) Molecular Pain 3 pp33-41; Cheng HT et al (2008) Neuroscience 155 pp948-958; Ji R-R and Gao Y-J (2008) Neurosci Lett 437 pp180-183). ASK1 활성화는 p38과 JNK 둘 다의 활성화를 야기할 수 있기 때문에, ASK1의 저해는 p38 저해제 단독보다 더 강력하게 될 잠재력을 가지며, 신호전달 캐스케이드에서 그것이 더 상승됨에 따라, 원치않는 법적책임의 가능성을 제한할 수 있다.
섬유증은 세포외 기질(extracellular matrix: ECM)의 과도한 침착이 있는 상처-치유 과정이다. ECM은 콜라겐, 비콜라겐 당단백질, 기질 결합 성장 인자, 글리코사미노글리칸, 프로테오글리칸 및 모세포 단백질로 구성되는데, 이는 정상 조직과 섬유증 조직 둘 다의 스캐폴딩을 제공한다.
비알코올성 지방간 질환(Non-alcoholic fatty liver disease: NAFLD)은 선진국에서 만성 간 질환의 가장 흔한 원인이다(Younossi ZM, et al., Clin Gastroenterol Hepatol 2011; 9: 524-30 및 Cohen JC, et al., Science, 2011; 332: 1519-23). 이는 광범위하게 2가지 범주: 비-알코올성 지방간(또는 단순 지방간) 및 비-알코올성 지방간염(NASH)으로서 분류될 수 있다. 지방증은 대체로 비진행성인 반면 NASH는 NAFLD의 진행성 형태인 것으로 이전에 생각되었지만, 일련의 생검 연구로부터의 최근의 증거는 지방증 또는 NASH를 가진 환자가 진행된 섬유증 및 간경변으로의 후속적 질환 진행의 증가된 위험을 가진다는 것을 입증한다(Singh S, et al, Clin Gastroenterol Hepatol 2015; 13: 643-54 및 McPherson S, et al., J Hepatol 2015; 62: 1148-55).
산화적 스트레스는 NASH에서 간성상세포(hepatic stellate cell: HSC)의 활성화에 중요한 역할을 하며(Bian Z, & Ma X. Front Physiol 2012; 3: 248 및 Koek GH, et al., Clin Chim Acta 2011; 412: 1297-305), 항산화제는 간세포 손상에 대한 예방적 효과를 발휘할 뿐만 아니라 섬유조직성장의 감소(Serviddio G et al., Free Radic Biol Med 2013; 65: 952-68), 즉, 세포의 항산화제 방어 효능에 영향을 미치는 변이체가 NAFLD 섬유증의 위험에 영향을 미치는 경우의 유전자 연관 연구에 의해 뒷받침되는 효과(Al-Serri A, et al., J Hepatol 2012; 56: 448-54)에 직접적으로 기여할 수 있다는 것이 알려져 있다.
세포자멸사-신호-조절 키나제 1(ASK1)은 과혈당증, TGF-β 및 ROS를 포함하는 다양한 자극에 의해 활성화되는 키나제이다(Karnik S, Charlton MR, Li L, et al., The Liver Meeting 2015, San Francisco, CA, November 13-17, American Association for the Study of Liver Diseases, 2015). ASK1은 p38 및 JNK1 경로를 활성화시킴으로서 세포자멸사, 섬유증 및 대사 장애를 유도한다. ASK1 경로는 인간 NASH 간 생검에서 활성화되는 것으로 나타났다(Karnik S, The Liver Meeting 2014, Boston, Massachusetts, November 7-11, American Association for the Study of Liver Diseases, 2014). 더 나아가, 6개월의 NASH 인간 임상 연구에서, ASK1 저해제 셀론서팁은 간 섬유증 병기, 간경변으로의 진행, 간 경직도 및 간 지방 함량의 감소를 야기하는 것으로 나타났다(Loomba et al. The liver meeting 2016, Boston, Massachusetts, November 11-15, American Association for the Study of Liver Diseases, 2016).
WO 2008/016131은 당뇨병 및 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 축합된 복소환식 ASK1 저해제를 개시한다. WO 2004/048565는 암 및 퇴행성 질환의 치료에 유용할 수 있는 ASK1 활성을 갖는 신규한 펩타이드를 기재한다. WO 2009/123986과 WO 2009/027283은 둘 다 ASK1 저해제를 기재한다. WO 2008/075172는 h-PGDS의 저해제로서 니코틴아마이드 유도체 및 프로스타글란딘 D2 매개 질환을 치료하기 위한 이들의 용도를 개시한다. WO 2001/39777은 아데노신 A1 A2a 및 A3 수용체에 특이적인 화합물을 개시한다. EP 2058309는 축합된 복소환식 화합물을 개시한다.
본 발명은 ASK1 키나제의 저해제이고 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 일련의 피롤로피리미딘 유도체를 기재한다.
본 발명은 신규한 피롤로피리미딘 및 통증 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 피롤로피리딘 화합물의 동정에 기반한다. 특정 양상에서, 본 화합물은 ASK 저해제, 특히 ASK1 저해제이다. 본 발명은 또한 이들 화합물의 생산 방법, 이들 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에서의 상기 화합물의 용도를 제공한다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물이 제공된다:
Figure pct00001
식 중,
R1은 H, CH3, F 또는 Cl이고;
X는 N, CH 또는 C-CN이며; 그리고
R2는 CH3 또는 할로겐이다.
특정 양상에서, 본 발명의 화합물은 ASK 키나제 패밀리에 대해, 특히 ASK1에 대해 선택성을 나타낼 수 있다. 추가 특정 양상에서, 본 발명의 화합물은 다른 키나제 효소, 특히 JAK2에 대해 낮은 활성을 나타낼 수 있다. 이러한 선택성은 개선된 약물 안전성을 초래하고/하거나 비표적(off-target) 연관 위험을 감소시킬 수 있다.
추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 양상에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 화합물과 병용하여 사용하기에 적합한 추가적인 치료적 활성 성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 더 특별한 양상에서, 추가적인 치료적 활성 성분은 통증 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제이다.
게다가, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물 및 치료 방법에서 유용한 본 발명의 화합물은 제조되고 사용되는 것과 같이 약제학적으로 허용 가능하다.
본 발명의 추가 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 열거된 것 중에서 선택되는 병태, 및 특히 통증 및/또는 섬유증 질환에 걸린 포유류, 특히 인간을 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 약제학적 조성물 또는 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 의학에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 및 적합한 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 양상에서, 약제학적 조성물은 통증 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
특정 양상에서, 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물이 제공된다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 대표적인 합성 프로토콜 및 본 명세서에서 이후에 개시되는 경로로 본 발명의 화합물을 합성하는 방법을 제공한다.
다른 목적 및 이점은 뒤이어 상술하는 설명을 고려하여 당업자에게 분명하게 될 것이다.
본 발명의 화합물은 대사되어 생물학적 활성 대사물질을 수득할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
정의
다음의 용어는 이하에 함께 제시하는 의미를 갖는 것으로 의도되며, 본 발명의 설명 및 의도된 범주를 이해하는 데 유용하다.
화합물, 이러한 화합물을 함유하는 약제학적 조성물 및 이러한 화합물 및 조성물의 이용 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 설명할 때, 다음의 용어는, 제시된다면, 달리 표시되지 않는 한 다음의 의미를 가진다. 또한 본 명세서에 기재할 때 이하에 정의하는 모이어티 중 어느 것은 다양한 치환체로 치환될 수 있고, 각각의 정의는 이하에 제시하는 이들의 범주 내에서 이러한 치환된 모이어티를 포함하는 것으로 의도된다는 것이 이해되어야 한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "치환된"은 이하에 제시하는 바와 같이 정의될 것이다. 추가로 용어 "기" 및 "라디칼"은 본 명세서에서 사용될 때 상호 호환 가능한 것으로 고려될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
단수의 항목은 본 명세서에서 물품의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, '유사체'는 하나의 유사체 또는 하나 초과의 유사체를 의미한다.
'아미노'는 라디칼 -NH2를 지칭한다.
'할로' 또는 '할로겐'은 플루오로(F), 클로로(Cl), 브로모(Br) 및 아이오도(I)를 지칭한다. 특정 할로기는 플루오로 또는 클로로 중 하나이다.
'약제학적으로 허용 가능한'은 연방 또는 주정부의 규제 기관 또는 미국 이외의 국가에서의 대응하는 규제기관에 의해 승인되거나 또는 승인 가능한 것, 또는 동물에서, 더 구체적으로는 인간에서 사용하기 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
'약제학적으로 허용 가능한 염'은 약제학적으로 허용 가능하고 모 화합물의 목적하는 약학적 활성을 갖는 본 발명의 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 이러한 염은 비독성이며, 무기 또는 유기산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 이러한 염은 하기를 포함한다: (1) 무기산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산 등으로 형성되거나; 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캠퍼설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3차 뷰틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프톤산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등으로 형성된, 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온으로 대체되거나; 또는 유기 염기, 예컨대 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, N-메틸글루카민 등으로 배위될 때 형성된 염. 염은 추가로, 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등; 그리고 화합물이 염기성 작용기를 함유할 때, 비-독성 유기산 또는 무기산의 염, 예컨대 염산염, 브로민화수소산염, 타타르산염, 메실산염, 아세트산염, 말레산염, 옥살산염 등을 포함한다. 용어 '약제학적으로 허용 가능한 양이온'은 산성 작용기의 허용 가능한 양이온성 반대이온을 지칭한다. 이러한 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등에 의해 예시된다.
'약제학적으로 허용 가능한 비히클'은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
'프로드러그'는 절단 가능한 기를 갖고 가용매분해에 의해 또는 생리적 조건 하에 생체내에서 약제학적으로 활성인 본 발명의 화합물이 되는, 본 발명의 화합물의 유도체를 포함하는 화합물을 지칭한다. 이러한 예는 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬몰폴린 에스터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
'용매화물'은 보통 가용매분해 반응에 의해 용매와 관련된 화합물의 형태를 지칭한다. 이 물리적 연관은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매는 물, EtOH, 아세트산 등을 포함한다. 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 결정질 형태로 제조될 수 있고, 용매화되거나 또는 수화될 수 있다. 적합한 용매화물은 약제학적으로 허용 가능한 용매화물, 예컨대 수화물을 포함하고, 추가로 화학량론적 용매화물과 비화학량론적 용매화물을 둘 다 포함한다. 소정의 예에서, 용매화물은, 예를 들어, 1종 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 혼입될 때 단리될 수 있을 것이다. '용매화물'은 고체상과 단리 가능한 용매화물을 둘 다 포함한다. 대표적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.
'대상체'는 인간을 포함한다. 용어 '인간', '환자' 및 '대상체'는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용된다.
'유효량'은 질환을 치료하기 위해 대상체에게 투여될 때, 질환에 대해 이러한 치료를 달성하기에 충분한 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. "유효량"은 화합물, 질환 및 그의 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중 등에 따라서 다를 수 있다.
'예방하는' 또는 '예방'은 질환 또는 장애를 획득하거나 또는 발생될 위험(즉, 질환-원인 제제에 노출되거나, 또는 질환 개시에 앞서 질환의 성향이 있을 수 있는 대상체에서 발생되지 않은 질환의 임상적 증상 중 적어도 하나를 야기함)의 감소를 지칭한다.
용어 '예방'은 '방지'에 관련되며, 질환을 치료 또는 치유하기보다는 방지할 목적의 측정 또는 절차를 지칭한다. 예방적 측정의 비제한적 예는 백신의 투여; 예를 들어, 고정화기술(i㎜obilization)에 기인하여 혈전증의 위험에 있는 입원 환자에 대한 저분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아가 풍토성이거나 또는 말라리아와의 접촉 위험이 높은 지리학적 지역에 대한 방문 전에 항-말라리아제, 예컨대 클로로퀸의 투여를 포함할 수 있다.
임의의 질환 또는 장애를 '치료하는' 또는 이의 '치료'는 일 실시형태에서 질환 또는 장애의 개선(즉, 질환의 저지 또는 이의 임상 증상 중 적어도 하나의 징후, 정도 또는 중증도의 감소)을 지칭한다. 다른 실시형태에서, '치료하는' 또는 '치료'는 대상체에 의해 식별되지 않을 수도 있는 적어도 하나의 신체적 변수의 개선을 지칭한다. 또 다른 실시형태에서, '치료하는' 또는 '치료'는 질환 또는 장애, 신체적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리학적으로(예를 들어, 신체적 변수의 안정화) 중 하나, 또는 둘 다를 조절하는 것을 지칭한다. 추가 실시형태에서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 진행의 늦춤에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '통증'은 질환 변형 특성 및 관절 구조 보존을 포함하는 염증성 통증, 특히 만성 관절의 통증(예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염, 류마티스 척추염, 통풍성 관절염(통풍) 및 연소성 관절염); 근골격 통증; 허리 및 목 통증; 염좌 및 염좌; 신경병성 통증; 교감신경이 관여하고 있는 통증; 근염; 암 및 섬유근육통과 관련된 통증; 편두통과 관련된 통증; 인플루엔자 또는 다른 바이러스 감염, 예컨대 감기와 관련된 통증; 류마티스열; 기능성 장질환, 예컨대 비궤양성 소화불량증, 비심인성 흉통 및 과민성 장 증후군과 관련된 통증; 심근허혈과 관련된 통증; 수술후 통증; 두통; 치통; 및 월경통을 지칭한다. 더 구체적으로는, 상기 용어는 만성 관절의 통증을 지칭한다. 더 구체적으로는 상기 용기는 류마티스 관절염, 골관절염 및 통풍성 관절염(통풍)을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "심혈관계 질환(들)"은 심장 또는 혈관 또는 둘 다에 영향을 미치는 질환을 지칭한다. 특히, 심혈관계 질환은 부정맥(심방 또는 심실 또는 둘 다); 죽상동맥경화증 및 그의 후유증; 협심증; 심장 리듬 장애; 심근허혈; 심근경색증; 심장 또는 혈관 동맥류; 혈관염, 뇌졸중; 사지의 말초 폐쇄성 동맥질환, 기관 또는 조직; 뇌의 허혈 후 재관류 손상, 심장, 신장 또는 다른 기관 또는 조직; 동맥 혈압의 현저한 하락과 관련된 쇼크 상태(예를 들어, 내독소, 수술, 외상성 쇼크 또는 패혈성 쇼크); 폐동맥 고혈압(PAH), 고혈압, 심장 판막 질환, 심부전, 혈압 이상; 쇼크; 혈관 수축(편두통과 관련된 것을 포함); 혈관 이상, 정맥류 요법, 단일 기관 또는 조직으로 제한된 부전, 기능성 또는 기관의 정맥 부전,; 심장 비대, 심실 섬유증, 및 심근 재형성을 포함한다. 더 구체적으로는, 상기 용어는 죽상동맥경화증, 폐동맥 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥 증후군, 심장 비대, 심실 섬유증 및 심근 재형성을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '신경병성 통증' 또는 '신경병성 통증을 수반하는 증후군'은 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 중심 신경병성 통증과 말초 신경병성 통증을 둘 다 포함하고, 상기 용어는 당뇨병성 신경병증; 좌골신경통; 비특이적 요통; 다발성 경화증 통증; 섬유근육통; HIV-관련 신경병증; 대상포진 후 신경통; 삼차 신경통; 및 신체적 외상, 절단, 암, 독소, 화학요법 유도된 신경병증 또는 만성 염증성 병태로부터 초래된 통증을 포함한다. 신경병성 통증의 증상은 자발적 전격통증 및 난자통(lancinating pain), 또는 진행성, 작열통을 포함한다. 추가로, 정상적으로 비통증성 감각과 관련된 통증, 예컨대 "저리는 느낌"(지각 이상증 및 촉각 장애), 접촉에 대해 증가된 감각(지각과민증), 무해 자극 후 통증성 감각(동적, 정적 또는 열적 이질통증), 유해한 자극에 대해 증가된 감각(열적, 한랭 또는 기계적 통각 과민), 자극의 제거 후 통증 감각의 지속(통각과민) 또는 선택적 감각 경로의 부재 또는 결여(통각저하증)가 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 '염증성 병태(들)'는 류마티스 관절염, 골관절염, 소아 특발성 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 피부 병태(예를 들어, 일광 화상, 화상, 습진, 피부염, 건선), 안질환(예를 들어, 녹내장, 망막염, 망막병증, 포도막염 및 눈 조직에 대한 급성 손상(예를 들어, 결막염)), 폐 장애(예를 들어, 알레르기성 기도 질환(예를 들어, 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 기관지염, 폐기종, 호흡곤란증후군, 비둘기 사육가 병 및 농부 폐증), 위장관 장애(예를 들어, 염증성 장 질환, 예컨대 크론병 또는 궤양성 대장염, 혓바늘, 아토피성 위염, 위염 마마양, 소아 지방변증, 국소회장염, 과민성 장 증후군, 위식도역류증, 설사 및/또는 변비), 내독소-유도 질환 상태(예를 들어, 만성 심부전에 기여하는, 예를 들어, 혈관우회로술 또는 만성 내독소 상태 후 합병증), 기관 이식 및 염증 성분이 있는 다른 병태, 예컨대 맥관병, 지방간염, 편두통, 결절성 동맥주위염, 갑상선염, 무력성 빈혈, 호지킨병, 피부경화증, 중증근무력증, 다발성 경화증, 사르코이드증, 신증후군, 베체트병, 다발근염, 치은염, 심근허혈, 발열, 전신 홍반 루푸스, 다발근염, 건염, 윤활낭염 및 쇼그렌 증후군을 포함하는 병태의 군을 지칭한다. 특히 상기 용어는 류마티스 관절염, 골관절염, 알레르기성 기도 질환(예를 들어, 천식), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 장 질환을 지칭한다. 더 구체적으로 상기 용어는 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 장 질환을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '천식'은 어떤 원인이든 (내재성, 외인성 또는 둘 다; 알레르기성 또는 비알레르기성) 기도 협착과 관련된 폐 기체 유동의 변화를 특징으로 하는 폐의 임의의 장애를 지칭한다. 용어 천식은 원인을 나타내는 하나 이상의 형용사와 함께 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '신경퇴행성 질환'은 치매, 특히 퇴행성 치매(노인성 치매, 알츠하이머병, 픽병, 헌팅턴 무도증, 파킨슨병 및 크로이츠펠트-야콥병, ALS 및 운동신경원병을 포함); 혈관성 치매(다발 경색성 치매를 포함);뿐만 아니라 두개내 공간 점유 병변과 관련된 치매; 외상; 감염 및 관련된 병태(HIV 감염을 포함); 말초신경병증, 다발성 경화증, 망막병증, 녹내장, 황반변성, 뇌경색 및 외상성 뇌 손상 및 노화와 관련된 경증 인지 손상, 특히 노화 관련 기억 손상을 포함하는 신경퇴행으로부터 초래되거나 또는 이를 포함하는 병태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '당뇨병 합병증'은 I형 또는 II형 당뇨병과 관련된 병태를 지칭하며, 이들 병태는 혈관 또는 미세혈관 변화, 예를 들어, 당뇨망막병증, 당뇨병성 미소혈관증, 당뇨병성 신장 질환(또한 당뇨병성 신장 질환(DKD)으로서 지칭됨), 황반변성, 녹내장, 신증후군, 당뇨병성 심근증, 무력성 빈혈, 포도막염, 가와사키병 및 사르코이드증과 관련된 것;뿐만 아니라 당뇨병 또는 비만, 예를 들어 간 지방증과 관련될 수 있는 지방 대사의 장애를 포함한다. 더 구체적으로는, 상기 용어는 당뇨망막병증, 당뇨병성 미소혈관증, 당뇨병성 신장 질환 및 간 지방증을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '암'은 피부 또는 신체 기관, 예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장에서의 악성종양 또는 세포의 양성 성장을 지칭한다. 암은 인접한 조직으로 침윤하고, 원위 기관으로, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)되는 경향이 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 암은 전이성 종양 세포 유형(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종 및 비만세포종)과 조직 암종의 유형(예컨대, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 결장직장암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교아세포종, 원발성 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁평활근육종)을 둘 다 포함한다. 특히, 용어 '암'은 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신 피질 암종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양, 기저 세포 암종, 담관암, 방광암, 골암(골육종 및 악성 섬유성 조직구종), 뇌 줄기 신경교종, 뇌 종양, 뇌 및 척수 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T -세포 림프종, 배아성 종양, 자궁내막암, 상의모세포종, 상의세포종, 식도 암, 종양의 유잉육종 패밀리, 안암, 망막아세포종, 담낭암, 위(복부) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양(GIST), 위장 기질 세포 종양, 배세포종양, 신경교종, 모발세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간) 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 안구내 흑색종, 섬 세포 종양(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모발세포 백혈병, 간암, 비소세포 폐암, 소 세포 폐암, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 림프종, 발텐스트롬마크로글로불린혈증, 수모세포종, 속질상피종, 흑색종, 중피종, 구강암, 만성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 비인두암, 신경아세포종, 비호지킨 림프종, 비소 세포 폐암, 구강암, 구강인두암, 골육종, 뼈의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피암, 난소 신경 세포 종양, 난소 저급 악성도 종양, 췌장암, 유두종증, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 중간 분화의 송과체 실질성 종양, 송과체아세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 아세포종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포(신장) 암, 망막아세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 종양의 유잉 육종 패밀리, 육종, 카포시, 세자리 증후군, 피부암, 소세포폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 복부(위) 암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 종양, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발텐스트롬마크로글로불린혈증 및 윌름 종양을 지칭한다. 다른 특정 실시형태에서, 용어 암은 췌장암, 간암, 간세포암종(HCC), 유방암 또는 결장암을 지칭한다. 특히, 이는 간세포 암종, 흑색종, 위암, 지방육종 및 산화적 스트레스에 의해 야기된 암, 예를 들어 경추성 척수증을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '섬유증 질환'은 세포외 기질의 과도한 생산, 침착 및 수축에 기인하는 과도한 반흔화, 및 세포 및/또는 피브로넥틴 및/또는 콜라겐의 비정상적 축적과 관련된 것 및/또는 증가된 섬유아세포 보충을 특징으로 하는 질환을 지칭하고, 개개 기관 또는 조직, 예컨대 심장, 신장, 간, 관절, 폐, 늑막 조직, 복막 조직, 피부, 각막, 망막, 근골격 및 소화관의 섬유증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특히, 용어 섬유증 질환은 특발성폐섬유증(IPF); 낭성 섬유증, 의원성 약물 유도 섬유증, 직업 및/또는 환경 유도된 섬유증, 육아종 질환(사르코이드증, 과민성 폐렴), 콜라겐 맥관병, 폐포단백질증, 랑게르한스 세포 조직구증, 림프관평활근종증, 유전성 질환(헤르만스키 푸들라크 증후군, 결절성 경화증, 신경섬유종증, 대사 저장 장애, 가족성 장 폐 질환)을 포함하는 상이한 병인의 다른 미만성 실질 폐 질환; 방사선 유도된 섬유증; 만성 폐쇄성 폐질환(COPD); 피부경화증; 블레오마이신 유도 폐 섬유증; 만성 천식; 규폐증; 석면 유도 폐 섬유증; 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS); 신장 섬유증; 요세관사이질 섬유증; 사구체 신장염; 초점성 분절성 사구체 경화증; IgA 신장병증; 고혈압; 알포트 증후군; 장 섬유증; 간 섬유증; 간경변; 알코올 유도된 간 섬유증; 독성/약물 유도된 간 섬유증; 혈색소증; 비알코올성 지방간염(NASH); 담관 손상; 원발 담즙성 간경변; 감염 유도된 간 유증; 바이러스 유도된 간 섬유증; 및 자가면역 간염; 각막 흉터; 비후성 반흔; 듀피트렌병, 켈로이드, 피부 섬유증; 피부경화증; 전신경화증, 척수 손상/섬유증; 골수섬유증; 혈관 재협착; 죽상동맥경화증; 동맥경화증; 베게너 육아종증; 페이로니병 또는 만성 림프구 백혈병을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 개개 기관 또는 조직, 예컨대 간 섬유증, 폐 섬유증 또는 신장 섬유증을 가진다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF), 당뇨병성 신장 질환(DKD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로부터 선택된다.
'본 발명의 화합물(들)', 및 동등한 표현은 본 명세서에 기재된 바와 같은 화학식(들)의 화합물을 포괄하는 의미이며, 이 표현은 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 용매화물, 예를 들어, 문맥이 허용하는 경우에 약제학적으로 허용 가능한 염의 수화물 및 용매화물을 포함한다. 유사하게, 중간체에 대한 언급은 그들 자체가 청구되든 또는 아니든, 문맥이 허용하는 경우에 그들의 염 및 용매화물을 포괄하는 것을 의미한다.
본 명세서에 범위가 언급될 때(예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, C1-8 알킬), 범위의 인용은 상기 범위의 각각의 구성원의 표현을 고려하여야 한다.
본 발명의 화합물의 다른 유도체는 그들의 산과 산 유도체 형태 둘 다에서 활성을 갖지만, 산 민감 형태에서 종종 포유류 유기체에서의 용해도, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '동위원소 변이체'는 이러한 화합물을 구성하는 원자 중 하나 이상에서 비정상적 비율의 동위원소를 함유하는 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 화합물의 '동위원소 변이체'는 하나 이상의 비방사성 동위원소, 예를 들어, 중수소(2H 또는 D), 탄소-13(13C), 질소(15N) 등을 함유할 수 있다. 이러한 동위원소 치환이 만들어진 화합물에서, 다음의 원자는 존재한다면, 다를 수 있고, 따라서, 예를 들어, 임의의 수소는 2H/D일 수 있거나, 임의의 탄소는 13C일 수 있거나, 또는 임의의 질소는 15N일 수 있다는 것과, 이러한 원자의 존재 및 배치는 당업계의 기술 내에서 결정될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 마찬가지로, 본 발명은 방사성동위원소에 의한 동위원소 변이체의 제조를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 얻어진 화합물이 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구를 위해 사용될 수 있다. 방사성 동위원소 삼중수소, 즉, 3H 및 탄소-14, 즉, 14C는 그들의 혼입의 용이함 및 준비된 검출 수단을 고려하여 본 목적에 특히 유용하다. 추가로, 양전자 방출 동위원소, 예컨대 11C, 18F, 15O 및 13N으로 치환되고, 기질 수용체 점유를 시험하기 위한 양전자방출 단층촬영술(Positron Emission Topography: PET)에서 유용한 화합물이 제조될 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 특정 화합물의 설명 또는 명명은 이의 개개 거울상 이성질체와 혼합물 둘 다, 이의 라세미체 또는 기타 포함하는 것으로 의도된다. 입체화학의 결정 및 입체이성질체의 분리를 위한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 발명의 화합물은 대사되어 생물학적 활성 대사물질을 수득할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
도 1은 실시예 3.1의 래트 모델에서 CFA-유도 통각과민증에 p.o.로 제공한 두 상이한 용량의 화합물 1의 효과를 도시한 도면.
도 2는 실시예 3.2의 래트 모델에서 MIA-유도 통각 과민증에 p.o.로 제공한 10㎎/㎏의 화합물 1의 효과를 도시한 도면.
도 3은 섬유증의 CFAHFD 모델로부터의 마우스 간 샘플에서 섬유증 관련 유전자 패널의 발현 수준에 대한 5㎎/㎏/QD, 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID에서의 화합물 1의 효과를 도시한 도면(실시예 3.10). 도 3A: PAI1, 도 3B: TIMP1, 도 3C:COL1A1, 도 3D: CTGF, 도 3E: ACTA2 및 도 3F: TGFβ데이터는 제73일로부터 얻었고, 평균 ± SEM으로서 제시한다, CDAHFD 규정식 + 비히클, 맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test)에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001.
도 4는 섬유증의 CFAHFD 모델로부터의 마우스 간 샘플에서 염증 관련 유전자 패널의 발현 수준에 대한 5㎎/㎏/QD, 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID에서의 화합물 1의 효과를 도시한 도면(실시예 3.10). 도 4A: TNFα, 도 4B: IL10, 및 도 4c: CCL2. 데이터는 제73일로부터 얻었고, 평균 ± SEM으로서 제시한다, CDAHFD 규정식 + 비히클, 맨-휘트니 검정에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001.
도 5는 섬유증의 CFAHFD 모델로부터의 마우스 간 조직의 하이드록시프롤린 수준에 대한 5㎎/㎏/QD, 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID에서의 화합물 1의 효과를 도시한 도면(실시예 3.10). 데이터는 제73일로부터 얻었고, 평균 ± SEM으로서 제시한다, CDAHFD 규정식 + 비히클, 맨-휘트니 검정에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001.
도 6은 섬유증의 CFAHFD 모델로부터의 시리우스 레드 섬유증 정량화를 이용하는 5㎎/㎏/QD, 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID에서의 화합물 1의 효과를 도시한 도면(실시예 3.10). 데이터는 제73일로부터 얻었고, 평균 ± SEM으로서 제시한다, CDAHFD 규정식 + 비히클, 맨-휘트니 검정에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001.
도 7은 섬유증의 CFAHFD 모델로부터의 F4/80 정량화에 대한 5㎎/㎏/QD, 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID에서의 화합물 1의 효과를 도시한 도면(실시예 3.10). 데이터는 제73일로부터 얻었고, 평균 ± SEM으로서 제시한다, CDAHFD 규정식 + 비히클, 맨-휘트니 검정에 대해 * p<0.05, ** p<0.01, ***p<0.001, ****P<0.0001.
본 발명은 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 신규한 피롤로피리미딘 및 피롤로피리딘 화합물의 동정에 기반한다. 특정 양상에서, 본 화합물은 ASK 저해제, 특히 ASK1 저해제이다.
본 발명은 또한 이들 화합물의 생산 방법, 이들 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 본 발명의 화합물을 투여함으로써 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에서, 하기 화학식 I을 갖는 본 발명의 화합물이 제공된다:
Figure pct00002
식 중,
R1은 H, CH3, F 또는 Cl이고;
X는 N, CH 또는 C-CN이며; 그리고
R2는 CH3 또는 할로겐이다.
일 실시형태에서, R1은 F이다.
일 실시형태에서, R1은 F이고, R2는 CH3이다.
일 실시형태에서, X는 CH이다. 대안의 실시형태에서, X는 C-CN이다. 대안의 실시형태에서, X는 N이다.
일 실시형태에서, X는 N이고, R1은 F이다. 특정 실시형태에서, X는 N이고, R1은 F이며, R2는 CH3이다. 추가 실시형태에서, R2는 CH3 또는 Cl이다. 또한 추가 실시형태에서, R2는 CH3이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 하기로부터 선택된다:
2-아미노-5-플루오로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(화합물 1),
2-아미노-5-메틸-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(화합물 2),
2-아미노-5-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-피리딘-4-카복스아마이드(화합물 3),
2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(화합물 4),
2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(화합물 5),
2-아미노-N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(화합물 6), 및
2-아미노-N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(화합물 7).
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 동위원소 변이체가 아니다.
일 양상에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 유리 염기로서 존재한다.
일 양상에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 염이다.
일 양상에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 화합물의 용매화물이다.
일 양상에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이다.
구체적 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 구조적으로 유사한 화합물에 비해 ASK1 활성에 대해 시험관내 세포 분석에서 개선된 활성을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 본 명세서의 실시예 2.3에 기재한 바와 같이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서의 ASK1 활성에 대한 세포 분석에서 개선된 활성을 나타낸다.
대안의 실시형태에서, 본 명세서의 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 Cyp 활성의 감소된 유도를 나타낼 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 구조적으로 유사한 화합물에 비해 Cyp3A4 활성의 감소된 유도를 나타낼 수 있다.
대안의 실시형태에서, 본 명세서의 실시형태 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 Cyp 활성의 감소된 저해를 나타낼 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 구조적으로 유사한 화합물에 비해 Cyp3A4 활성의 감소된 저해를 나타낼 수 있다. 더 구체적으로, 본 발명의 화합물은 10μM 초과의 Cyp 저해에 대한 IC50을 나타낼 수 있다.
각각의 실시형태에 대한 구체화된 그룹은 일반적으로 상기에 별개로 열거되었지만, 본 발명의 화합물은 상기 화학식에서 몇몇 또는 각각의 실시형태뿐만 아니라 본 명세서에 제시된 다른 화학식이 각각의 변수에 대해 각각 표기된 특정 구성원 또는 그룹 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 그의 범주 내에서 이러한 실시형태의 모든 조합을 포함하는 것으로 의도된다.
각각의 실시형태에 대한 구체화된 그룹은 일반적으로 상기에 별개로 열거되었지만, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 변수(예를 들어, R 기)가 상기 열거한 화학식(e) 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 실시형태로부터 선택되는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 그의 범주 내에서 개시된 실시형태 중 어느 것으로부터의 변수의 모든 조합을 포함하도록 의도된다.
대안적으로, 그룹 또는 실시형태 또는 이의 조합으로부터의 구체화된 변수 중 하나 이상의 제외가 또한 본 발명에 의해 상정된다.
소정의 양상에서, 본 발명은 상기 화학식에 따른 화합물의 프로드러그 및 유도체를 제공한다. 프로드러그는 대사에 의해 절단 가능한 기를 갖고 가용매분해에 의해 또는 생리적 조건 하에 생체내에서 약제학적으로 활성인 본 발명의 화합물이 되는, 본 발명의 화합물의 유도체이다. 이러한 예는 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬몰폴린 에스터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 화합물의 다른 유도체는 그들의 산과 산 유도체 형태 둘 다에서 활성을 갖지만, 산 민감 형태에서 종종 포유류 유기체에서의 용해도, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다(Bundgaard, 1985). 프로드러그는 당업자에게 잘 공지된 산 유도체, 예를 들어, 모체 산의 적합한 알코올과의 반응에 의해 제조된 에스터, 또는 모체 산 화합물의 치환 또는 비치환 아민, 산 무수물, 또는 혼합된 무수물과의 반응에 의해 제조된 아마이드를 포함한다. 본 발명의 화합물에 현수된 산성기로부터 유래된 단순 지방족 또는 방향족 에스터, 아마이드 및 무수물은 바람직한 프로드러그이다. 일부 경우에, 이중 에스터 유형 프로드러그, 예컨대 (아실옥시)알킬 에스터 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스터를 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, 아릴, C7-C12 치환된 아릴 및 C7-C12 아릴알킬 에스터가 특히 유용하다.
약제학적 조성물
약제로서 사용될 때, 본 발명의 화합물은 전형적으로 약제학적 조성물의 형태로 투여된다. 이러한 조성물은 약제학적 분야에 잘 공지된 방식으로 제조될 수 있고, 화학식 I에 따른 본 발명의 적어도 1종의 활성 화합물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물은 약제학적 유효량으로 투여된다. 실제로 투여되는 본 발명의 화합물의 양은 전형적으로 치료될 병태, 선택된 투여 경로, 투여되는 본 발명의 실제 화합물, 개개 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상 등을 포함하는 적절한 환경에 비추어 의사에 의해 결정될 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 경피, 피하, 관절내, 정맥내, 근육내 및 비강내를 포함하는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 의도된 전달 경로에 따라서, 본 발명의 화합물은 바람직하게는 모두 경피 투여용의 주사 가능한 또는 경구 조성물 중 하나로서 또는 연고로서, 로션으로서 또는 패치로서 제형화된다.
경구 투여용 조성물은 벌크 액체 용액 또는 현탁액, 또는 벌크 파우더의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 더 통상적으로는, 조성물은 정확한 투약을 용이하게 하기 위한 단위 투약 형태로 제시된다. 용어 '단위 투약 형태'는 인간 대상체 및 다른 포유류에 대한 단위 투약량으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 적합한 약제학적 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 목적하는 치료적 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 사전 결정된 양을 함유한다. 전형적인 단위 투약 형태는 액체 조성물 또는 고체 조성물의 경우에 알약, 정제, 캡슐 등의 사전 충전, 사전 측정된 앰플 또는 주사기를 포함한다. 이러한 조성물에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 보통 소량의 성분(약 0.1 내지 약 50중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40중량%)이며, 나머지는 목적하는 투약 형태를 형성하는 데 도움을 주는 다양한 비히클 또는 담체 및 가공 보조제이다.
경구 투여에 적합한 액체 형태는 완충제, 현탁제 및 분산제, 착색제, 향미제 등과 함께 적합한 수성 또는 비수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는, 예를 들어, 다음의 성분 중 어느 것, 또는 유사한 특성의 본 발명의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예컨대 미정질 셀룰로스, 트래거캔스 검 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘; 활택제, 예컨대 콜로이드 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린; 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트 또는 오렌지향.
주사용 조성물은 전형적으로 주사용 멸균 식염수 또는 인산염 완충 식염수 또는 당업계에 공지된 다른 주사용 담체에 기반한다. 앞에서와 같이, 이러한 조성물 중에서 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물은 전형적으로 부수적 성분이며, 종종 약 0.05 내지 10중량%이고, 나머지는 주사 가능한 담체 등이다.
경피 조성물은 전형적으로 활성 성분(들)을 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서, 일반적으로 약 0.01 내지 약 20중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10중량%, 및 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15중량% 범위의 양으로 제형화된다. 연고로서 제형화될 때, 활성 성분은 전형적으로 파라핀 또는 수혼화성 연고 베이스 중 하나와 조합될 것이다. 대안적으로, 활성 성분은, 예를 들어 수중유 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화될 수 있다. 이러한 경피 제형은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 활성 성분 또는 제형의 안정성의 피부 침투성을 향상시키기 위해 추가적인 성분을 포함한다. 모든 이러한 공지된 경피 제형 및 성분은 본 발명의 범주 내에 포함된다.
본 발명의 화합물은 또한 경피 장치에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 경피 투여는 저장소 또는 다공성 막 유형 중 하나, 또는 고체 기질 다양성을 갖는 패치를 이용하여 달성될 수 있다.
경구로 투여 가능한, 주사용 또는 국소로 투여 가능한 조성물에 대해 상기 기재한 성분은 단지 대표적이다. 다른 물질뿐만 아니라 가공 기법 등은 본 명세서에 참고로 편입된 문헌[Part 8 of Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 제시되어 있다.
본 발명의 화합물은 또한 지속 방출 형태로 또는 지속 방출 약물 전달 시스템으로부터 투여될 수 있다. 대표적인 지속 방출 물질의 설명은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.
다음의 제형예는 본 발명에 따라 제조될 수 있는 대표적인 약제학적 조성물을 예시한다. 그러나, 본 발명은 다음의 약제학적 조성물로 제한되지 않는다.
제형 1 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 건조 젤라틴 결합제와 대략 1:2 중량비로 건조 분말로서 혼합될 수 있다. 소량의 스테아르산마그네슘은 윤활제로서 첨가될 수 있다. 혼합물은 정제기(tablet press)에서 240 내지 270㎎의 정제(정제마다 화학식 I에 따른 80 내지 90㎎의 본 발명의 활성 화합물)로 형성될 수 있다.
제형 2 - 캡슐
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 전분 희석제와 대략 1:1 중량비로 건조 분말로서 혼합될 수 있다. 혼합물은 250㎎의 캡슐(캡슐마다 화학식 I에 따른 본 발명의 125㎎의 활성 화합물)에 채워질 수 있다.
제형 3 - 액체
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(125㎎)은 수크로스 (1.75g) 및 잔탄검(4㎎)과 혼합될 수 있고, 얻어진 혼합물은 배합된 다음, 10번 메쉬 U.S. 시브를 통과하고, 이어서, 수 중에서 미정질 셀룰로스 및 카복시메틸 셀룰로스 나트륨(11:89, 50㎎)의 사전에 준비된 용액과 혼합될 수 있다. 벤조산나트륨(10㎎), 향 및 색은 물로 희석될 수 있고, 교반시키면서 첨가될 수 있다. 이어서, 교반시키면서 충분한 물이 첨가될 수 있다. 이어서, 추가적인 충분한 물이 첨가되어 총 5㎖ 용적을 생성할 수 있다.
제형 4 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 건조 젤라틴 결합제와 대략 1:2 중량비로 건조 분말로서 혼합될 수 있다. 소량의 스테아르산마그네슘은 윤활제로서 첨가될 수 있다. 혼합물은 정제기에서 450 내지 900㎎의 정제(화학식 I에 따른 150 내지 300㎎의 본 발명의 활성 화합물)로 형성될 수 있다.
제형 5 - 주사
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 대략 5㎎/㎖의 농도로 완충 멸균 식염수 주사 가능 수성 배지에 용해되거나 또는 현탁될 수 있다.
제형 6 - 국소
스테아릴 알코올(250g) 및 백색 바셀린(250g)은 약 75℃에서 용융될 수 있고, 이어서, 물(약 370g)에 용해된 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(50g) 메틸파라벤(0.25g), 프로필파라벤(0.15g), 라우릴황산나트륨(10g) 및 프로필렌 글리콜(120g)의 혼합물은 굳을 때까지 교반될 수 있다.
치료 방법
일 실시형태에서, 본 발명은 의학에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물, 및 다른 치료제를 제공한다. 특정 실시형태에서, 다른 치료제는 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 제제이다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 병태의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 병태의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 통증은 만성 관절의 통증으로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 만성 관절의 통증은 골관절염, 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 통풍성 관절염(통풍) 및/또는 연소성 관절염의 통증이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 통증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 통증은 만성 관절의 통증으로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 만성 관절의 통증은 골관절염, 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 통풍성 관절염(통풍) 및/또는 연소성 관절염의 통증이다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 통증의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 병태의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 통증은 만성 관절의 통증으로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 만성 관절의 통증은 골관절염, 류마티스 관절염, 류마티스 척추염, 통풍성 관절염(통풍) 및/또는 연소성 관절염의 통증이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 염증성 병태의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 염증성 병태는 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 장 질환으로부터 선택된다. 더 구체적으로는, 염증성 병태는 골관절염이다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 염증성 병태의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 염증성 병태는 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 장 질환으로부터 선택된다. 더 구체적으로는, 염증성 병태는 골관절염이다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 염증성 병태에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 병태의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 염증성 병태는 류마티스 관절염, 골관절염, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 장 질환으로부터 선택된다. 더 구체적으로는, 염증성 병태는 골관절염이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 심혈관계 질환은 죽상동맥경화증, 폐동맥 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥 증후군, 심장 비대, 심실 섬유증 및 심근 재형성으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 심혈관계 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 심혈관계 질환은 죽상동맥경화증, 폐동맥 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥 증후군, 심장 비대, 심실 섬유증 및 심근 재형성으로부터 선택된다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 심혈관계 질환에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 질환의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 심혈관계 질환은 죽상동맥경화증, 폐동맥 고혈압, 심부전, 급성 관상동맥 증후군, 심장 비대, 심실 섬유증 및 심근 재형성으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 퇴행성 치매, 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 퇴행성 치매, 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 질환의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 신경퇴행성 질환은 퇴행성 치매, 알츠하이머병, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 신경학적 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 신경학적 질환은 신경병성 통증, 치매, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 신경학적 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 신경학적 질환은 신경병성 통증, 치매, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 신경학적 질환에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 질환의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 신경학적 질환은 신경병성 통증, 치매, 다발성 경화증 및 망막병증으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 당뇨병 합병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 합병증은 당뇨망막병증, 당뇨병성 미소혈관증, 당뇨병성 신장 질환 및 간 지방증으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 당뇨병 합병증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 합병증은 당뇨망막병증, 당뇨병성 미소혈관증, 당뇨병성 신장 질환 및 간 지방증으로부터 선택된다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 당뇨병 합병증에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 합병증의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 합병증은 당뇨망막병증, 당뇨병성 미소혈관증, 당뇨병성 신장 질환 및 간 지방증으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 암의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 암의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 개개 기관 또는 조직, 예컨대 간 섬유증, 폐 섬유증 또는 신장 섬유증을 가진다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF), 당뇨병성 신장 질환(DKD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 본 발명은 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 개개 기관 또는 조직, 예컨대 간 섬유증, 폐 섬유증 또는 신장 섬유증을 가진다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF), 당뇨병성 신장 질환(DKD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로부터 선택된다.
치료 양상의 추가적인 방법에서, 본 발명은 섬유증 질환에 걸린 포유류의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 질환의 치료 또는 예방을 위하여 유효량의 본 발명의 화합물 또는 본 명세서에 기재된 1종 이상의 약제학적 조성물의 투여를 포함한다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 개개 기관 또는 조직, 예컨대 간 섬유증, 폐 섬유증 또는 신장 섬유증을 가진다. 특정 실시형태에서, 섬유증 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF), 당뇨병성 신장 질환(DKD) 및 비알코올성 지방간염(NASH)으로부터 선택된다.
주사 용량 수준은 약 0.1㎎/㎏/h 내지 적어도 10㎎/㎏/h, 또는 약 1 내지 약 120시간 그리고 특히 24 내지 96시간의 범위이다. 적합한 정적 상태 수준을 달성하기 위해 약 0.1㎎/㎏ 내지 약 10㎎/㎏ 이상의 사전부하 볼루스가 또한 투여될 수 있다. 최대 총 용량은 40 내지 80㎏의 인간 환자에 대해 약 1g/일을 초과하는 것으로 예상되지 않는다.
장기간 병태, 예컨대 퇴행성 병태의 예방 및/또는 치료를 위해, 치료요법은 보통 여러 달 또는 여러 해에 걸쳐 신장되고, 따라서 환자 편의성 및 내약성을 위해 경구 투약이 바람직하다. 경구 투약에 의해, 1일당 일 내지 사(1 내지 4)의 규칙적 용량, 특히 1일당 일 내지 삼(1 내지 3)의 규칙적 용량, 전형적으로는 1일당 일 내지 이(1 내지 2)의 규칙적 용량, 가장 전형적으로는 1일당 일(1)의 규칙적 용량이 대표적인 요법이다. 대안적으로 장기 지속적인 효과를 위해 격주에 1회, 매주 1회 및 1일 1회로 경구 투약에 의한 약물이 대표적인 요법이다. 특히, 투약 요법은 1 내지 14일마다, 더 구체적으로는 1 내지 10일마다, 훨씬 더 구체적으로는 1 내지 7일마다, 가장 구체적으로는 1 내지 3일마다일 수 있다.
이들 투약 패턴을 이용하여, 각각의 용량은 약 1 내지 약 1000㎎의 본 발명의 화합물을 제공하며, 특정 용량은 각각 약 10 내지 약 500㎎ 및 특히 약 30 내지 약 250㎎을 제공한다.
경피 용량은 일반적으로 주사 용량을 이용하여 달성되는 것과 유사한 또는 더 낮은 혈액 수준을 제공하도록 선택된다.
병태의 개시를 방지하기 위해 사용될 때, 본 발명의 화합물은 전형적으로 의사의 권고 및 감독 하에, 상기 기재한 투약 수준에서 병태가 발생할 위험에 있는 환자에게 투여될 것이다. 특정 병태가 발생할 위험에 있는 환자는 일반적으로 병태의 가족력을 갖는 환자, 또는 특히 병태가 발생할 여지가 있는지를 유전자 검사 또는 선별함으로써 동정된 환자를 포함한다.
본 발명의 화합물은 유일한 활성제로서 투여될 수 있거나, 또는 동일 또는 유사한 치료적 활성을 보이고 이러한 병용 투여에 대해 안전하고 효능있는 것으로 결정된 본 발명의 다른 화합물을 포함하는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 구체적 실시형태에서, 2(이상의) 제제의 공동 투여는 각각의 상당히 더 낮은 용량이 사용되도록 함으로써, 보이는 부작용을 감소시킨다.
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물은 의약으로서 투여된다. 구체적 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 추가적인 활성 성분을 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 염증 병태의 치료 및/또는 예방을 위한 다른 치료제와 공동 투여되고, 특정 제제는 면역조절제, 예를 들어, 아자티오프린, 코르티코스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 사이클로포스파마이드, 사이클로스포린 A, 타크롤리무스, 마이코페놀레이트, 모페틸, 뮤로모납-CD3(OKT3, 예를 들어, 오쏘콜론(Orthocolone)(등록상표)), ATG, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센 및 피록시캄을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 관절염(예를 들어, 류마티스 관절염)의 치료 및/또는 예방을 위해 다른 치료제와 공동투여되고, 특정 제제는 진통제, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDS), 스테로이드, 합성 질환-변경 항류마티스 약물(DMARDS)(예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 설파살라진, 오라노핀, 오로티오말레산나트륨, 페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 토파시티닙, 바리시티닙, 포스타마티닙 및 사이클로스포린) 및 생물학적 DMARDS(예를 들어, 이하로 제한되는 것은 아니지만, 이플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 리툭시맙 및 아바타셉트)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
공동 투여는 당업자에게 명백한 바와 같이 동일한 치료 요법의 부분으로서 환자에게 2종 이상의 치료제를 전달하는 임의의 수단이 포함된다. 2종 이상의 제제가 단일 제형으로, 즉, 단일 약제학적 조성물로서 동시에 투여될 수 있지만, 이는 필수적이지 않다. 제제는 상이한 제형으로 그리고 상이한 횟수로 투여될 수 있다.
화학적 합성 절차
일반
본 발명의 추가 양상에 따르면, 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 제공된다. 본 명세서의 반응식은 본 발명의 화합물을 합성하기 위해 사용될 수 있는 합성 반응식의 예이다. 본 명세서의 반응식에서, 반응기는 보호기로 보호되고 잘 확립된 기법에 따라 탈보호될 수 있다.
본 발명의 추가 양상에 따라, 하기 단계들을 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물의 제조 방법이 제공된다:
(a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물 또는 이의 보호된 유도체와 반응시키는 단계:
Figure pct00003
(식 중 X 및 R2는 본 명세서에 명시된 바와 같음)
Figure pct00004
(식 중, R1은 본 명세서에 명시된 바와 같음);
(b) 화학식 I의 화합물의 보호된 유도체의 탈보호 단계;
(c) 화학식 I의 화합물 또는 이의 보호된 유도체의 화학식 I의 추가적인 화합물 또는 이의 보호된 유도체로의 상호 전환 단계; 및
(d) 화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 선택적 형성 단계.
화학식 II 및 III의 화합물은 반응식 1A, 1B, 1C에서 본 명세서에 기재된 절차 및 화합물 1 내지 7을 제조하기 위한 절차에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 다음의 일반적 방법 및 절차를 이용하여 용이하게 이용 가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 전형적 또는 바람직한 공정 조건(즉, 반응 온도, 시간, 반응물의 몰 비, 용매화물, 압력 등)이 주어지는 경우에, 달리 언급되지 않는 한 다른 공정 조건이 또한 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 최적의 반응 조건은 변할 수 있지만, 이러한 조건은 일상적인 최적화 절차에 의해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
추가적으로, 당업자에게 명백할 바와 같이, 특정 작용기가 원치않는 반응을 겪는 것을 방지하기 위해 통상적인 보호기가 필수적일 수 있다. 특정 작용기에 대한 적합한 보호기뿐만 아니라 보호 및 탈보호를 위한 적합한 조건의 선택은 당업계에 잘 공지되어 있다.
다음의 방법은 본 명세서에서 상기에 그리고 비교예에 정의한 바와 같은 본 발명의 화합물의 제조로서 상세하게 제시되어 있다. 본 발명의 화합물은 유기 합성의 당업자에 의해 공지된 또는 상업적으로 입수 가능한 물질 및 시약으로부터 제조될 수 있다.
모든 시약은 상업적 등급을 가지며, 달리 언급되지 않는 한 추가적인 정제 없이 받은 그대로 사용된다. 상업적으로 입수 가능한 무수 용매는 비활성 분위기 하에 수행되는 반응에 대해 사용된다. 시약 등급 용매는 달리 구체화되지 않는 한, 모든 다른 경우에 사용된다. 실리카겔 60(35 내지 70㎛) 상에서 칼럼 크로마토그래피가 수행된다. 박막 크로마토그래피는 사전 코팅된 실리카겔 60F-254 플레이트(두께 0.25㎜)를 이용하여 수행된다. NMR 스펙트럼은 5㎜ BBI 프로브를 구비한 브루커(Bruker) DPX 300 MHz, 5㎜ PABBO 프로브를 구비한 브루커 AV400 MHz, 5㎜ PABBI 프로브를 구비한 브루커 DRX 500 MHz 및 5㎜ RT BBI 프로브를 구비한 브루커 어드밴스 III(Bruker Avance III) 600 분광계 상에서 기록된다. 샘플은, 달리 언급되지 않는 한, 용매로서 DMSO-d6 또는 CDCl3을 이용하여 25℃에서 기록된다. 1H NMR 스펙트럼에 대한 화학적 이동(δ)은 내부 기준으로서 테트라메틸실란(δ0.00)에 대해서 백만분율(ppm)로 보고된다.
워터스 액퀴티(Waters Acquity) PDA 검출기 및 SQD 질량분석계가 있는 워터스 액퀴티 UPLC 상에서 전기분무 MS 스펙트럼을 얻는다.　 사용한 칼럼: UPLC BEH C18 1.7㎛, 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7㎛, 2.1Х50㎜ 칼럼이 있는 2.1Х5㎜ 반가드 전치칼럼(VanGuard Pre-column) 또는 액퀴티 UPLC CSH C18 1.7㎛, 2.1Х50㎜ 칼럼. 모든 방법은 MeCN/H2O 구배를 이용한다. MeCN 및 H2O는 0.1% 폼산 또는 10mM NH4HCO3 중 하나를 함유한다.
분취 정제를 위해, HPLC 워터스 질량 직접 자정 시스템(Mass Directed Autopurification System)이 사용된다. 시스템은 워터스 샘플 매니저 2767, 워터스 시스템 유체 오가나이저(Waters System Fluid Organizer), 워터스 이원 구배 모듈 2545, 워터스 515 HPLC 펌프, 워터스 포토다이오드 어레이 검출기 2998 및 워터스 마이크로매스 ZQ MS 검출기로 구성된다. 사용한 소프트웨어: FractionLynx 및 MassLynx v4.1. 일반적 HPLC 방법 매개변수: H2O 및 MeCN 중의 0.1% 폼산의 구배 이동상 또는 10mM NH4HCO3 pH=10 및 MeCN. 칼럼 XBridge 30Х150㎜, 5㎛. PDA 검출기 설정: 파장: 210 내지 400㎚, 분해능: 1.2㎚, 샘플링 속도: 1.0 포인트/초, 필터 반응: 1. 바이오티지 개시제(Biotage Initiator)를 이용하여 마이크로웨이브 가열을 수행한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
질량 기반 자동화 HPLC
적용 가능한 경우, 다음의 장치 및 조건을 이용하여 질량 기반 자동화 HPLC에 의한 정제를 수행하였다:
하드웨어:
워터스 2525 이원 구배 모듈
워터스 515 구성 펌프
워터스 펌프 제어 모듈
워터스 2767 인젝트 수집기
워터스 칼럼 유체 관리자
워터스 2996 포토다이오드 어레이 검출기
워터스 ZQ 질량분석계
길손(Gilson) 202 분획 수집기
길손 아스펙(Aspec) 폐기물 수집기
소프트웨어: 워터스 MassLynx 버전 4 SP2
칼럼: 사용한 칼럼은 워터스 아틀란티스(Waters Atlantis), 이의 치수는 19㎜Х100㎜(소규모) 및 30㎜Х100㎜(대규모)이다. 정지상 입자 크기는 5㎛이다.
산성 방법:
용매:
A: 수성 용매 = 물 + 0.1% 폼산
B: 유기 용매 = 아세토나이트릴 + 0.1% 폼산
용매 구성 = 메탄올:물 80:20
니들(Needle) 린스 용매 = 메탄올
방법:
관심 대상의 화합물의 분석 체류 시간에 따라 5가지 방법을 사용하였다. 각각은 실행시간이 13.5분이었는데, 이는 10분 구배 다음에 3.5분 칼럼 플러쉬 및 재평형상태 단계를 포함하였다.
대규모/소규모 1.0 내지 1.5(HPLC), 0.4 내지 0.6(UPLC) = 5 내지 30% B
대규모/소규모 1.5 내지 2.2(HPLC), 0.6 내지 0.9(UPLC) = 15 내지 55% B
대규모/소규모 2.2 내지 2.9 (HPLC), 0.9 내지 1.2(UPLC) = 30 내지 85% B
대규모/소규모 2.9 내지 3.6(HPLC), 1.2 내지 1.4(UPLC) = 50 내지 99% B
대규모/소규모 3.6 내지 5.0(HPLC), 1.4 내지 2.0(UPLC) = 80 내지 99% B(6분 다음에 7.5분 플러쉬 및 재평형상태)
유속: 상기 방법은 모두 유속이 20㎖/분(소규모) 또는 40㎖/분(대규모)이다.
고 pH 방법:
칼럼: 주위 온도로 XBridge C18 칼럼(100㎚Х19㎚ 내경, 5㎛ 패킹 직경) 상에서 HPLC 분석을 수행하였다.
용매:
A: 암모니아 용액으로 pH 10으로 조절한 수 중 10mM 중탄산암모늄.
B: 아세토나이트릴.
방법:
관심 대상의 화합물의 분석 체류 시간에 따라 5가지 방법을 사용하였다. 그들은 실행시간이 15분이었는데, 이는 10분 구배 다음에 5분 칼럼 플러쉬 및 재평형상태 단계를 포함하였다.
대규모/소규모 1.0 내지 1.5(HPLC), 0.4 내지 0.6(UPLC) = 1 내지 30% B
대규모/소규모 1.5 내지 2.2(HPLC), 0.6 내지 0.9(UPLC) = 15 내지 55% B
대규모/소규모 2.2 내지 2.9 (HPLC), 0.9 내지 1.2(UPLC) = 30 내지 85% B
대규모/소규모 2.9 내지 3.6(HPLC), 1.2 내지 1.4(UPLC) = 50 내지 99% B
대규모/소규모 3.6 내지 5.0(HPLC), 1.4 내지 2.0(UPLC) = 80 내지 99% B(6분 다음에 7.5분 플러쉬 및 재평형상태)
유속: 상기 방법은 모두 유속이 20㎖/분(소규모) 또는 40㎖/분(대규모)이다.
액체 크로마토그래피/질량 분석법
이하에 나타내는 방법에 표시된 장치 및 조건을 이용하여 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS)에 의한 상기 실시예의 분석을 수행하였다:
액체 크로마토그래피:
방법 설명: 폼산 일반적 분석 UPLC 개방 접근 LC/MS
2분 방법
LC/MS 시스템: SQD 질량분석계와 결합된 액퀴티 UPLC
LC 조건
칼럼: 액퀴티 UPLC BEH C18(50㎜Х2.1㎜ 내경, 1.7㎛ 패킹 직경
칼럼 온도: 40℃
용매: A = 수 중에서 폼산의 0.1% v/v 용액
B = 아세토나이트릴 중에서 폼산의 0.1% v/v 용액
주입 용적: 2㎕
Figure pct00009
UV 조건
PDA 범위: 210㎚ 내지 350㎚
UV 검출은 210㎚ 내지 350㎚ 파장을 합친 신호였다
획득률: 40㎐
MS 조건
이온화 방식: 교번 - 스캔 양성 및 음성 전기분무(ES+/ES-)
스캔 범위: 100 내지 1000 AMU
스캔 시간: 0.15
인터스캔 지연:
MS 인터-스캔: 0.02초
극성/모드 스위치 인터 스캔: 0.02초
방법 설명: 중탄산암모늄 일반적 분석 UPLC 개방 접근 LC/MS 2분 방법
LC/MS 시스템: SQD 질량분석계와 결합된 액퀴티 UPLC
LC 조건
칼럼: 액퀴티 UPLC BEH C18(50㎜Х2.1㎜ 내경, 1.7㎛ 패킹 직경)
칼럼 온도: 40℃
용매: A = NH4HCO3의 10mM 수용액(암모니아를 이용하여 pH 10으로 조절)
B= 아세토나이트릴
주입 용적: 1㎕
Figure pct00010
UV 조건
PDA 범위: 210㎚ 내지 350㎚
UV 검출은 210㎚ 내지 350㎚ 파장을 합친 신호였다
획득률: 40㎐
MS 조건
이온화 방식: 교번 - 스캔 양성 및 음성 전기분무(ES+/ES-)
스캔 범위: 100 내지 1000 AMU
스캔 시간: 0.15
인터스캔 지연:
MS 인터-스캔: 0.02초
극성/모드 스위치 인터 스캔: 0.02초
본 발명의 화합물의 합성 제조
Figure pct00011
Figure pct00012
1.1 화합물 1: 2-아미노-5-플루오로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드
1.1.1 단계 1: 메틸 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트의 합성
Figure pct00013
0℃로 냉각시킨 메탄올(300㎖) 중의 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(10.0g, 45.5m㏖)의 용액에 염화티오닐(16.5㎖, 227.3m㏖)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 24시간 동안 교반시켰다. 톨루엔(40㎖)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 메탄올의 증발 후에, 염화티오닐을 증류시켰다. 남아있는 톨루엔을 회전 증발기에서 증발시켜 조질의 생성물을 얻었고, 이를 감압 하에 증발된 다이클로로메탄(30㎖)에서 용해시켜 메틸 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(10.3g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 232.9; MS (ES+, m/z): 234, 236 (M+H)+.
1.1.2 대안의 합성 절차:
0℃로 냉각시킨 메탄올 (35㎖) 및 톨루엔(65㎖) 중의 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(10.0g, 45.5m㏖)의 용액에 (트라이메틸실릴)다이아조메탄(다이에틸 에터 중의 2.0M 용액; 45.5㎖, 90.9m㏖)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반시켰다. 2시간 후에, 반응 혼합물을 감압 하에 증발시켜 조질의 생성물을 얻었고, 이를 에틸 아세테이트(50㎖) 중에 용해시키고 나서, 물(100㎖) 및 염수(50㎖)로 각각 세척하고, 상 분리기 필터를 통해 여과시키고 나서 감압 하에 증발시켜 메틸 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(10.46g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 232.9; MS (ES+, m/z): 234, 236 (M+H)+.
1.1.3 단계 2: 메틸 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트의 합성
Figure pct00014
1,4-다이옥산(150㎖) 중의 메틸 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(10.3g, 44.0m㏖) 용액에 tert-뷰틸 카바메이트(6.18g, 52.8m㏖), 트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0)(0.86g, 0.88m㏖), 4,5-비스(다이페닐포스피노)-9,9-다이메틸잔탄(1.02g, 1.76m㏖) 및 탄산세슘(20.08g, 61.6m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 퍼지시키고 나서, 초음파처리하고, 캡핑하고 나서, 90℃에서 24시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고 나서, 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 에틸 아세테이트로 세척하였다. 모액을 물(2Х100㎖) 및 염수(100㎖)로 세척하고, 감압 하에 증발시켜 조질의 생성물을 얻었고, 이를 에틸 아세테이트와 분쇄시켜 메틸 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(8.43g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 270.1; MS (ES+, m/z): 215.41 (M+H-56)+.
1.1.4 대안의 합성 절차(메틸 2-((다이페닐메틸렌)아미노)-5-플루오로아이소니코티네이트 중간체):
Figure pct00015
아르곤으로 탈기 및 퍼지한 1,4-다이옥산(6㎖) 중의 메틸 2-브로모-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(308㎎, 1.32m㏖)의 현탁액에 벤조페논이민(0.266㎖, 1.58m㏖), 트리스(다이벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0) (24.1㎎, 0.026m㏖), 4,5-비스(다이페닐포스피노)-9,9-다이메틸잔탄(30.5㎎, 0.053m㏖) 및 탄산세슘(602.0㎎, 0.053m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 아르곤으로 플러쉬시키고 나서, 초음파처리하고, 캡핑하고 나서, 100℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고 나서, 에틸 아세테이트(15㎖)로 희석시키고, 물(15㎖), 염수(15㎖)로 세척하고 나서, 감압 하에 증발시켜 메틸 2-((다이페닐메틸렌)아미노)-5-플루오로아이소니코티네이트(230㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 334.1; MS (ES+, m/z): 335.34 (M+H)+.
1.1.5 단계 3: 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실산의 합성
Figure pct00016
테트라하이드로퓨란(100㎖) 중의 메틸 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실레이트(8.43g, 31.19m㏖)의 현탁액에 수산화리튬(2.98g, 124.76m㏖) 및 물(50㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 주위 온도에서 교반시켰다. 다음날 테트라하이드로퓨란을 감압 하에 증발시키고, 수층의 pH를 4로 조절하였다. 형성된 침전물을 여과시키고 나서, 톨루엔(4Х20㎖)과 공동 증발시키고, 진공 오븐 내 40℃에서 5시간 동안 건조시켜 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(7.79g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 256.08; MS (ES+, m/z): 201.4 (M+H-56)+.
1.1.6 단계 4: 4-클로로-5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘의 합성
Figure pct00017
5-브로모-4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(10.0g, 43.0m㏖)을 건조 THF(350㎖) 중에 용해시키고 나서, 아르곤 분위기 하에 -78℃로 냉각시켰다. n-BuLi(헥산 중의 2.5 M, 38㎖, 94.6m㏖)를 1시간에 걸쳐 적가하였다. 완전한 첨가 후에, 용액을 40분 동안 교반시키고 나서, 아이오도메탄(4.3㎖, 68.8m㏖)을 첨가하였다. 용액이 서서히 실온에 도달하게 하였다. 물(20㎖)을 첨가하고 나서, 용매를 진공 하에 제거하여 갈색 슬러리를 수득하였고, 이를 물(200㎖)에 용해시키고 나서, 에틸 아세테이트(3Х100㎖)로 추출하였다. 합한 유기물을 염수(150㎖)로 세척하고 나서, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 농축시켜, 조질의 화합물을 얻었고, 이를 에틸 아세테이트와 분쇄시켜 4-클로로-5-메틸-7H-피롤로[2,3-d](5.32g)를 수득하였다. LCMS: MW(계산치): 167.03; MS (ES+, m/z): 168.37 (M+H)+.
1.1.7 단계 5: tert-뷰틸 N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-카바메이트의 합성
Figure pct00018
1-메틸-2-피롤리딘온(40㎖) 중의 4-클로로-5-메틸-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘(10.0g, 59.7m㏖) 용액에 tert-뷰틸 N-(4-피페리딜)카바메이트(17.95g, 89.6m㏖), 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(25.2㎖, 149.3m㏖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 150℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 이어서, 찬물(300㎖)에 부었다. 혼합물에 에틸 아세테이트(40㎖)를 첨가하고 나서, 30분 동안 주위 온도에서 교반시켰다. 형성된 침전물을 여과시키고 나서, 물 및 다이에틸 에터로 세척하고, 진공 오븐 내 40℃에서 밤새 건조시켰다. 건조시켜 tert-뷰틸 N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-카바메이트(19.91g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 331.2; MS (ES+, m/z): 332.7 (M+H)+.
1.1.8 단계 6: 1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민의 합성
Figure pct00019
0℃로 냉각시킨 1,4-다이옥산(200㎖) 중의 tert-뷰틸 N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(38.9g, 117.3m㏖)의 현탁액에 HCl(다이옥산 중의 4M 용액)(290㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반시켰다. 23시간 후에, 반응 혼합물을 감압 하에 증발시키고, 톨루엔(200㎖)과 함께 공동증발시키고 나서, 진공 오븐 내 40℃에서 밤새 건조시켰다. 건조시켜 HCl 염으로서 1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민(47.68g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 231.15; MS (ES+, m/z): 232.6 (M+H)+.
1.1.9 단계 7: tert-뷰틸 N-[5-플루오로-4-[[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]카바모일]-2-피리딜]카바메이트의 합성
Figure pct00020
N,N-다이메틸폼아마이드(130㎖) 중의 2-(tert-뷰톡시카보닐아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(14.25g, 55.6m㏖)의 현탁액에 HATU(19.03g, 50.1m㏖)를 첨가하였다. 1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민Х2HCl(16.92g, 55.6m㏖) 및 N,N-다이아이소프로필에틸아민(47.56㎖, 278.1m㏖)을 첨가하였을 때 반응 혼합물을 주위 온도에서 20분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 교반시켰다. 3시간 후에 반응이 완료되었다. 반응 혼합물을 얼음물(1.2ℓ)에 부었다. 형성된 침전물을 여과시키고, 이어서, 아세토나이트릴로 세척하였고 진공 오븐 내 40℃에서 4시간 동안 건조시켜 tert-뷰틸 N-[5-플루오로-4-[[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]카바모일]-2-피리딜]카바메이트(19.26g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 469.22; MS (ES+, m/z): 470.7 (M+H)+.
1.1.10 단계 8: 2-아미노-5-플루오로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜] 피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00021
0℃로 냉각시킨 다이클로로메탄(300㎖) 중의 tert-뷰틸 N-[5-플루오로-4-[[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]카바모일]-2-피리딜]카바메이트(25.76g, 54.9m㏖)의 현탁액에 HCl(다이옥산 중의 4M 용액)(130㎖)을 적가하였다. 몇 분 후에, 고무같은 잔여물이 형성되었다. 추가량의 다이클로로메탄(200㎖)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 고무같은 잔여물을 초음파처리에 의해 분쇄하였다(45분 후). 반응 혼합물을 밤새 주위 온도에서 교반시켰다. 다음날 침전물을 여과시키고 나서, 물, 아세토나이트릴 및 메탄올로 세척하고, 진공 오븐 내 40℃에서 5시간 동안 건조시키고, 이어서, 밤새 주위 온도에서 건조시켰다. 건조시켜 2-아미노-5-플루오로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(13.65g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 369.17; MS (ES+, m/z): 370.77 (M+H)+.
1H NMR (600 MHz, DMSO-d6): δ= 1.59 - 1.70 (m, J = 12.3, 3.7㎐, 2 H), 1.93 (dd, J = 12.6, 2.7㎐, 2 H), 2.34 (s, 3H), 3.06 (t, J = 11.4㎐, 2 H), 3.94 (d, J = 13.2㎐, 2 H), 3.95 - 4.03 (m, J = 11.2, 11.2, 7.5, 4.2, 4.2㎐, 1 H), 6.02 (s, 2 H), 6.51 (d, J = 4.8㎐, 1 H), 7.05 (s, 1 H), 7.91 (d, J = 1.5㎐, 1 H), 8.19 (s, 1 H), 8.46 (d, J = 7.7㎐, 1 H), 11.51 (br. s., 1 H) ppm.
1.2 화합물 2: (2-아미노-5-메틸-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드)
1.2.1 단계 1: 메틸 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실레이트의 합성
Figure pct00022
메틸 2-아미노-5-브로모-피리딘-4-카복실레이트(200㎎, 0.87m㏖), S-Phos (4.6㎎, 3.2m㏖), 인산삼칼륨(369.3㎎, 1.74m㏖) 및 다이아세톡시팔라듐(19.5g, 0.011m㏖)을 합하고, 탈기시키고 나서, N2로 다시 채우고, 이어서, 실온에서 DMSO(4㎖) 및 트라이메틸보록신(467.5㎕, 3.2m㏖)에서 용해시켰다. 이어서, 혼합물을 80℃로 가열하고 나서, 밤새 교반시켰다. 16시간 후에, 혼합물을 EtOAc로 희석시키고 나서, H2O로 세척하였다. 유기상을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 셀라이트 상에 흡착시키고 나서, 진공에서 농축시켜 조질의 생성물을 얻었고, 유속 9㎖/분, 용매 A로서 DCM 및 용매 B로서 DCM:MeOH = 20:1을 이용하여 4 g KP-Sil 인터킴(Interchim) 칼럼 상에서 바이오티지(Biotage) 정제 키트를 통해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하여 메틸 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실레이트(167.03㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 166.07; MS (ES+, m/z): 167.03 (M+H)+.
1.2.2 단계 2: 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실산의 합성
Figure pct00023
메틸 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실레이트(125㎎, 0.75m㏖)를 MeOH/H2O(2/2) 중에 용해시키고 나서, NaOH(1M 용액, 0.75㎕)를 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 60℃로 가열하고 나서, 1시간 동안 교반시켰다. 1시간 후에 MeOH를 증발시키고 나서, 수성 잔사를 EtOAc로 추출하였다. 목적하는 생성물이 수층에 남았는데, 이를 밤새 동결건조시켰다.
동결건조 후에, 혼합물을 아세톤 중에 용해시켰고, 모액을 증발시켜 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실산(55㎎)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 152.06; MS (ES+, m/z): 153.02 (M+H)+.
1.2.3 단계 3: 2-아미노-5-메틸-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00024
0℃에서 DMF(1㎖) 중의 2-아미노-5-메틸-피리딘-4-카복실산(33㎎, 0.22m㏖) 용액에 EDCХHCl(54.8㎎, 0.29m㏖) 및 DIPEA(111.1㎕, 0.64m㏖)를 첨가하고, 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(35.6㎎, 0.26m㏖) 및 1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민(50.2㎎, 0.22m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 다음날 반응 혼합물을 물(5㎖)로 희석시키고 나서, EtOAc(3Х5㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(10㎖)로 세척하고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공에서 농축시켜, 조질의 생성물을 얻었고, 이를 유속 9㎖/분, 약한 용매로서 DCM 및 강한 용매로서 DCM:MeOH:NH4OH = 90:1.5:0.15로 4g KP-Sil 인터킴 칼럼 상에서 바이오티지(Biotage) 정제 장치를 통해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하여 2-아미노-5-메틸-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(8㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 365.20; MS (ES+, m/z): 366.23 (M+H)+. 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ11.51 (br. s., 1H), 8.35 (d, J=8.01㎐, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 5.81 (s, 2H), 3.95 (m, 3H), 3.05 (t, J=11.41㎐, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.92 (d, J=9.58㎐, 2H), 1.56-1.70 (m, 2H) ppm.
1.3: 화합물 3: 2-아미노-5-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-피리딘-4-카복스아마이드
1.3.1 단계 1: 3-클로로-1-옥소-피리딘-4-카복실산의 합성
Figure pct00025
3-클로로피리딘-4-카복실산(620㎎, 3.94m㏖)을 아세트산(2㎖) 중에 용해시키고, 30% aq H2O2(6㎖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 38시간 동안 80℃에서 가열하였다. 완료 후에, 이를 절반 용적으로 농축시켰다. 형성된 결정을 여과시키고, 진공 하에 건조시켜 3-클로로-1-옥소-피리딘-4-카복실산(420㎎)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 172.99; MS (ES+, m/z): 174.33 (M+H)+.
1.3.2 단계 2: 3-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-1-옥소-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00026
0℃에서 DMF(1㎖) 중의 3-클로로-1-옥소-피리딘-4-카복실산(52㎎, 0.30m㏖) 용액에 EDCХHCl(74.8㎎, 0.39m㏖) 및 DIPEA(161㎕, 0.87m㏖)를 첨가하고 나서, 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(55.1㎎, 0.36m㏖) 및 1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민(69.4㎎, 0.30m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 다음날, 반응 혼합물을 증발 건조시켰다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(약한 용리액: DCM, 강한 용리액: DCM:MeOH:NH4OH=90:5:0.1)에 의해 유성의 잔사를 정제하여 3-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-1-옥소-피리딘-4-카복스아마이드(87㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 386.13; MS (ES+, m/z): 387.49 (M+H)+.
1.3.3 단계 3: 2-아미노-5-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00027
0℃에서 클로로폼(10㎖)과 벤조트라이플루오라이드(1㎖)의 혼합물 중의 3-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-1-옥소-피리딘-4-카복스아마이드(87㎎, 0.23m㏖)와 tert-뷰틸아민 (0.160㎖, 1.53m㏖)의 용액에 p-톨루엔설폰 무수물(260㎎, 0.57m㏖)을 한번에 첨가한 한편, 온도를 5℃로 유지하였다. 반응은 10분 후에 완료되었다. 트라이플루오로아세트산(5㎖) 용액과 반응 혼합물을 3시간 동안 80℃에서 교반시켰다. 용매를 진공 하에 감소시키고 나서, 잔사를 다이클로로메탄으로 희석시키고, 40% NaOH를 이용하여 pH 9 내지 10으로 퀀칭시켰다. 다이클로로메탄(4Х15㎖)을 이용하여 수층을 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 농축 후, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(약한 용리액: DCM, 강한 용리액: DCM:MeOH:NH4OH=90:9:0.5)에 의해 정제하여 2-아미노-5-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드(9.05㎎)를 제공하였다. LCMS: MW(계산치): 385.14; MS (ES+, m/z): 386.54 (M+H)+. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ11.52 (br. s., 1H), 8.52 (d, J=7.63㎐, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.91 (d, J=4.88㎐, 1H), 7.06 (s, 1H), 6.52 (d, J=4.88㎐, 1H), 6.42 (s, 2H), 3.94 (m, 3H), 3.08 (t, J=11.44㎐, 2H), 2.34 (s, 3H), 1.95 (d, J=9.77㎐, 2H), 1.57-1.71 (m, 2H) ppm.
1.4: 화합물 4: 2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드
1.4.1 단계 1: 4,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘의 합성
Figure pct00028
DCM(80㎖) 중의 4-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(2.0g, 13.04m㏖)의 용액에 N-클로로석신이미드(1.7g, 13.04m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3일 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 수 중에 용해시키고 나서, EtOAc(3Х50㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 증발시켜 4,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1.08g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 186.97; MS (ES+, m/z): 187.98 (M+H)+.
1.4.2 단계 2: tert-뷰틸 N-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)카바메이트의 합성
Figure pct00029
Tert-뷰틸 N-(4-피페리딜)카바메이트(895.3㎎, 4.47m㏖)와 4,5-다이클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘(1080㎎, 5.36m㏖)을 NMP(8㎖) 중에 용해시키고 나서, DIPEA(2.33㎖, 13.4m㏖)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반시켰다. 혼합물을 수 중에 용해시키고 나서, EtOAc(3Х15㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고 나서, 농축시켜 조질의 생성물을 얻었고, 이를 아세토나이트릴로 재결정화하여 tert-뷰틸 N-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)카바메이트(1.42g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 351.15; MS (ES+, m/z): 352.22 (M+H)+.
1.4.3 단계 3. 1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민의 합성
Figure pct00030
DCM(10㎖) 중의 tert-뷰틸 N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(2.0g, 5.69m㏖)의 용액에 트라이플루오르아세트산(3.3㎖)을 첨가하고 나서, 얻어진 용액을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 완료 시, 용매를 증발시키고, 조질의 생성물을 이전의 조건화시킨(40㎖ MeOH) SCX 칼럼(20g)에 넣었다. 칼럼을 MeOH(2Х40㎖)로 세척하고, 이어서, 7 N NH3/MeOH (100㎖)로 세척하였다. 용매를 증발시켜 1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민 (1.3g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 251.09; MS (ES+, m/z): 252.10 (M+H)+.
1.4.4 단계 4. 2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00031
0℃에서 DMF(4㎖) 중의 2-아미노피리딘-4-카복실산(200㎎, 1.45m㏖) 용액에 EDCХHCl(362.3㎎, 1.89m㏖) 및 DIPEA(732㎕, 4.21m㏖)를 첨가하고, 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(266.4㎎, 1.74m㏖)와 1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민(546.23㎎, 2.17m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시키고, 물(10㎖)로 희석시키고 나서, EtOAc(3Х10㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수(20㎖)로 세척하고 나서, Na2SO4로 건조시키고, 여과 후, 진공에서 농축시켰다. 조질의 물질을 약한 용매로서 DCM 및 강한 용매로서 DCM:MeOH:NH4OH = 90:1.5:0.15로 12g의 KP-Sil 인터킴 칼럼 상에서 바이오티지 정제 장치를 통해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하여 생성물을 얻었고, 이를 아세토나이트릴과 함께 분쇄시켜 2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-피리딘-4-카복스아마이드(162.1㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 371.13; MS (ES+, m/z): 372.18 (M+H)+. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ12.15 (br. s., 1H), 8.39 (d, J=7.32㎐, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.97 (d, J=4.88㎐, 1H), 7.49 (s, 1H), 6.77-6.87 (m, 2H), 6.09 (br. s., 2H), 4.21 (d, J=12.21㎐, 2H), 4.05 (d, J=7.32㎐, 1H), 3.10 (t, J=12.36㎐, 2H), 1.91 (d, J=10.68㎐, 2H), 1.74 (m, 2H) ppm.
1.5 화합물 5: 2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00032
0℃에서 DMF(5㎖) 중의 2-(벤즈하이드린리덴아미노)-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(43.0㎎, 0.13m㏖)의 용액에 EDCХHCl(32.6㎎, 0.17m㏖) 및 DIPEA(66.1㎕, 0.38m㏖)를 첨가하고 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(24.5㎎, 0.16m㏖) 및 1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)피페리딘-4-아민(50.3㎎, 0.20m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 용매를 증발건조시켰다. 분취 LC-MS를 통해 조질의 물질을 정제하였다. 적절한 분획을 수집하고 나서, 밤새 동결건조시켜 2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(17㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 389.12; MS (ES+, m/z): 390.39 (M+H)+. 1H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ12.15 (br. s., 1H), 8.47 (d, J=7.70㎐, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.51 (d, J=4.40㎐, 1H), 6.02 (s, 2H), 4.14 (d, J=12.65㎐, 2H), 4.02 (m, 1H), 3.13 (t, J=11.83㎐, 2H), 1.93 (d, J=10.82㎐, 2H), 1.67 (m, 2H) ppm.
1.6 화합물 6: 2-아미노-N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
1.6.1. 3-브로모-4-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴의 합성
Figure pct00033
DMF(20㎖) 중의 4-클로로-1H-피롤로(3,2-b)피리딘-5-카보나이트릴(3g, 16.89m㏖)의 교반 용액에 N-브로모석신이미드(3.3g, 18.582m㏖)를 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 20분 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(50㎖)로 희석시키고 나서, 에틸 아세테이트(2Х25㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고 나서, 황산마그네슘으로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 얻어진 분말을 EtOAc와 함께 분쇄시키고 나서, 건조시켜 3-브로모-4-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(1.5g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 256.49; MS(ES+, m/z): 257.93 (M+H)+.
1.6.2. 4-클로로-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴의 합성
Figure pct00034
-78℃에서 아르곤 하에 THF(48㎖) 중의 3-브로모-4-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(1.5g, 5.85m㏖)의 용액에 뷰틸리튬 용액(5.2㎖, 12.87m㏖)을 첨가하였고, 반응물을 20분 동안 교반시켰다. 이어서, 요오도메탄(590㎕, 9.36m㏖)을 적가하고 나서, 반응물을 빙욕에서 실온으로 가온시켰다. 반응물을 물(30㎖)로 퀀칭시키고 나서, pH를 7로 조절하였다. THF를 증발시키고 나서, 물을 첨가하였다. 얻어진 고체를 여과시키고 나서, 물로 세척하고, EtOAc와 함께 분쇄하여 4-클로로-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(813㎎)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 191.6; MS (ES+, m/z): 192.05 (M+H)+.
1.6.3. tert-뷰틸 N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트의 합성
Figure pct00035
NMP(5㎖) 중에서 4-클로로-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(813㎎, 4.24m㏖), 4-boc-아미노피페리딘(1.27g, 6.36m㏖)과 DIPEA(1.85㎖, 10.61m㏖)의 혼합물을 150℃에서 3시간 동안 교반시키고, 주말에 걸쳐 실온에서 교반을 지속하였다. 반응 혼합물을 물(110㎖) 및 다이에틸 에터로 희석시켰다. 얻어진 고체를 여과시키고 나서, 물 및 다이에틸에터로 세척하고, 건조시켜 tert-뷰틸 N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(1.28g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 355.43; MS (ES+, m/z): 356.30 (M+H)+.
1.6.4. 4-(4-아미노-1-피페리딜)-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴의 합성
Figure pct00036
DCM(40㎖) 중의 tert-뷰틸 N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(1.28g, 3.6m㏖)의 용액에 트라이플루오로아세트산(5.5㎖, 72.03m㏖)을 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 SCX 칼럼(20g, 100㎖의 MeOH로 사전 조건화) 상에 장입시켰다. MeOH(200㎖)를 칼럼에 통과시키고 나서, 화합물을 MeOH:MeOH = 1:4(300㎖) 중의 7N NH3로 용리시켰다. 여과액을 시험관 내에서 농축시켜 4-(4-아미노-1-피페리딜)-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(1.06g)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 255.32; MS (ES+, m/z): 256.21 (M+H)+.
1.6.5. 2-아미노-N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00037
0℃에서 DMF(1㎖) 중의 2-아미노-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(66.0㎎, 0.30m㏖) 용액에 EDCХHCl(50.0㎎, 0.26m㏖)과 DIPEA(101㎕, 0.58m㏖)를 첨가하고 나서 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(37.0㎎, 0.24m㏖) 및 4-(4-아미노-1-피페리딜)-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-카보나이트릴(108.0㎎, 0.30m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 용매를 증발건조시켰다. 조질의 물질을 약한 용매로서 DCM 및 강한 용매로서 DCM:MeOH = 10:1로 4g의 KP-Sil 인터킴 칼럼 상에서 바이오티지 정제 장치를 통해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하여 2-아미노-N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(1.27㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 393.42; MS (ES+, m/z): 394.53 (M+H)+. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ11.82 (br. s., 1H), 8.55 (d, J=7.32㎐, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 6.54 (d, J=4.27㎐, 1H), 6.04 (br. s., 2H), 3.97 (br. s., 1H), 3.62 (d, J=12.21㎐, 2H), 3.40 (m, 2H), 2.41 (s, 3H), 1.97 (d, J=11.29㎐, 2H), 1.72-1.83 (m, 2H) ppm.
화합물 7: 2-아미노-N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
1.7.1. tert-뷰틸 N-[1-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트의 합성
Figure pct00038
NMP(28㎖) 중의 4-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘(4.0g, 26.20m㏖), tert-뷰틸 N-(4-피페리딜)카바메이트(7.8g, 39.30m㏖)와 DIPEA(11.4㎖, 65.50m㏖)의 혼합물을 150℃에서 72시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고 나서, EtOAc(4x)로 추출하였다. 합한 유기층을 건조시키고 나서, 농축시켜 조질의 생성물을 얻었고, 이를 아세토나이트릴로 재결정화하여 tert-뷰틸 N-[1-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(1.88g)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 316.41; MS (ES+, m/z): 317.22 (M+H)+.
1.7.2. tert-뷰틸 N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트의 합성
Figure pct00039
tert-뷰틸 N-[1-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(316㎎, 1m㏖)를 건조 DCM(10㎖) 중에 용해시키고 나서, N-클로로석신이미드(147㎎, 1.1m㏖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 교반시켰다. 16시간 후에, 반응 혼합물에 물을 첨가하였고, DCM(3x)으로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 나서, 상 분리기를 통해 여과시킨 후, 증발시켜 조질의 화합물을 얻었고, 이를 유속 10㎖/분, 용매 A로서 DCM 및 용매 B로서 DCM:MeOH = 7:3을 이용하는 4 g KP-Sil 인터킴 칼럼 상에서 바이오티지 정제 장치를 통해 정제시켰다. 방법: 0-5 %B 4 CV; 20% 4 CV; 20-40 %B 5 CV; 40 %B 5 CV; 40-60 %B 4 CV; 60 %B 4 CV. 적절한 분획을 모아서 tert-뷰틸 N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]카바메이트(150㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 350.85; MS (ES+, m/z): 351.43 (M+H)+.
1.7.3. 1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)피페리딘-4-아민의 합성
Figure pct00040
0℃에서 DCM(10㎖) 중의 tert-뷰틸 N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜] 카바메이트(320㎎, 1.8m㏖)의 혼합물에 TFA(1.5㎖)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 완료 후, 용매를 증발시키고, 조질의 생성물을 이전의 조건화시킨(MeOH를 이용) SCX 칼럼(5g)에 넣었다. 칼럼을 MeOH(2Х5㎖)로 세척하고, 이어서, 7N NH3/MeOH(10㎖)로 세척하여 1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)피페리딘-4-아민(108㎎)을 얻었다. LCMS: MW(계산치): 250.73; MS (ES+, m/z): 251.38 (M+H)+.
1.7.4. 2-아미노-N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드의 합성
Figure pct00041
0℃에서 DMF(1㎖) 중의 2-아미노-5-플루오로-피리딘-4-카복실산(66.0㎎, 0.43m㏖) 용액에 EDCХHCl(70.0㎎, 0.36m㏖)과 DIPEA(141㎕, 0.81m㏖)를 첨가하고 나서 30분 동안 교반시켰다. 이어서, HOBtХH2O(52.0㎎, 0.34m㏖)와 1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)피페리딘-4-아민(108.0㎎, 0.43m㏖)을 첨가하였다. 반응물을 밤새 실온에서 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(10㎖)로 희석시키고 나서, 생성물을 침전시켰다. 결정을 여과시키고 나서, 65℃에서 3시간 동안 진공 건조기에서 건조시켰다. 여과액을 EtOAc(4x5㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 나서, 여과 후, 진공 하에 농축시켜 조질의 생성물을 얻었다. 조질의 물질을 약한 용매로서 DCM 그리고 강한 용매로서 E1으로 4 g KP-Sil 인터킴 칼럼 상에서 바이오티지 정제 장치를 통해 정제하였다. 적절한 분획을 수집하여 2-아미노-N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드(7.77㎎)를 얻었다. LCMS: MW(계산치): 388.8; MS (ES+, m/z): 389.47 (M+H)+. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ11.81 (br. s., 1H), 8.51 (d, J=7.63㎐, 1H), 8.06 (d, J=5.19㎐, 1H), 7.92 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 6.47-6.64 (m, 2H), 6.03 (s, 2H), 3.94 (m, 1H), 3.50-3.64 (m, 2H), 2.87 (t, J=11.44㎐, 2H), 1.96 (d, J=10.38㎐, 2H), 1.72-1.87 (m, 2H) ppm.
생물학적 실시예
2. 시험관내 분석
2.1 ASK1/2 생화학적 분석(IMAP 기법)
IMAP(등록상표) 기법은 기질 펩타이드 서열에 관련 없이 매우 다양한 키나제, 포스파타제 및 포스포다이에스터라제에 적용 가능한 균질한 분석을 제공한다. 분석은 효소 활성의 정확한 결정을 허용하는 단순한 혼합과 판독 절차이다. 3가 금속-함유 나노입자(비드)의 특정, 고친화도 상호작용에 기반하여, IMAP는 키나제, 포스파타제 및 포스포다이에스터라제 활성을 평가하기 위한 일반적, 비-항체 기반 플랫폼이다. 효소 반응은 형광 표지된 기질을 이용하여 수행된다. IMAP 결합 시스템의 첨가는 효소 반응을 중단시키고, 포스포릴화된 기질에 대한 비드의 결합을 개시한다. 효소 활성과 상관 관계가 있는 비드에 대한 기질의 결합은 판독으로서 FP 또는 TR-FRET 중 하나를 이용하여 검출될 수 있다.
MAP3K5로도 알려진 세포자멸사 신호-조절 키나제(ASK1)는 키나제의 미토겐-활성화 단백질 키나제 키나제 키나제(MAP3K) 패밀리의 구성원이다. MAP2K, MKK4/7 및 MKK3/6(각각)을 통해 Jnk 및 p38 경로를 활성화시킨다. 이는 ASK1 IMAP 분석은 다음의 IMAP 펩타이드를 사용한다: RP7140-T2(5TAMRA-GTFRAAIRRLAARRR-OH, 서열번호 1). 상기 분석은 ATP-경쟁적 저해제에 민감하도록 ATP에 대한 Km(150mM)에서 실행하도록 구성되었다. 최종 분석 조건은 150mM ATP, 1mM DTT, 200nM 펩타이드 및 6nM ASK1(총 단백질)이다. 결합 시약은 1:200의 최종 희석 시 100% A로 구성된다.
용액:
KIT IMAP FP, 카탈로그 번호 R8127; 시약 완충제-트윈(Tween)(5Х 농도), 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices), 카탈로그 번호 R7436; H2O 및 함유하는 DTT(1M 저장액으로부터 1mM)를 이용하여 1:5로 희석; 진행성 결합 완충제(PBB) A(5x 농도), 몰레큘러 디바이시즈, 카탈로그 번호 R7282; 진행성 결합 시약(Progressive Binding Reagent)(PB 시약), 몰레큘러 디바이시즈, 카탈로그 번호 R7284; 효소 용액(시약 완충제 중에 2Х Ask1을 함유함); 기질 용액(시약 완충제 중에 2Х 펩타이드 기질, 및 시약 완충제 중에 2Х 150μM ATP를 함유); 비드 완충제(H2O를 이용하여 1:5로 희석된 진행성 결합 완충제 A); 비드 용액(1:200 진행성 결합 시약(2x)을 함유하는 비드 완충제)
실험
100% DMSO 중의 100nL의 시험 화합물을 384-웰 플레이트에 첨가하였다. 용량 반응 실험에 대해, 화합물의 4분의 1희석(25μM의 상위 최종 농도)을 사용하였다. 3㎕ 완충제를 첨가한 대조군 웰을 제외하고 3㎕의 hASK1(6nM), hASK2(25nM) 또는 rASK1(15nM)을 각각의 웰에 첨가하였다. 3㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 플레이트를 실온에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 6㎕의 IMAP(상표명) 비드 용액(진행성 결합 완충제 A + PB 시약; 최종 희석 1:100)을 각각의 웰에 첨가한 후에 1분 동안 1000rpm에서 교반시켰다. 이어서, 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고, 이후에 플레이트를 퍼킨 엘머 엔비전(Perkin Elmer EnVision) 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
데이터 분석
엑셀(Excel) 툴 및 그래프패드프리즘(GraphPadPrism) 소프트웨어, v. 5.03를 이용함으로써 IC50 데이터, 곡선 및 QC 분석을 계산하였다. 간략하게, 최소 제곱(보통의) 적합도를 이용하여 시험한 화합물의 시험 농도(X) 대 대응하는 저해값 백분율(Y)의 로그를 플롯팅함으로써 개개 농도-효과 곡선을 생성하였다. 값이 평균±1*SD 초과인 경우를 제외하고, 고/저 대조군으로부터의 ¼까지의 지점은 제외시킨다. IC50 계산 = log(저해제) 대 반응 - 가변 기울기(4개의 매개변수)에 대해 적합화 식을 사용하였다. 계산 결과: 계산 1: FP 측정에 대한 mP 값 = 1000 * (S - G * P)/(S + G * P), 여기서 S = <검출기 2 또는 FP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-최적화된(1) 통로 2> P = <검출기 1 또는 FP-BodipyTAMRA_Ex531-Em579-최적화된(1) 통로 1> G = G-인자. 이득(Gain)=100. 상위 제한은 상위 값이 정확하게 계산되지 않는 경우만을 사용한다.
-30%I 미만 또는 30%I 초과라면 최소값이 제한된다. 70%I 미만 또는 130%I 초과라면 최대값이 제한된다. Z'-인자 표적 ≥0.4. 힐 기울기는 0.5 내지 5의 범위이다.
본 발명의 예시적 화합물을 실시예 2.1의 방법에 따라 시험하였다. 결과를 이하에 나타낸다:
Figure pct00042
2.2 ASK1/2 생화학적 분석(알파스크린(AlphaScreen) 기술)
알파스크린 기술 설명
단백질 기질(MKK7)의 인산화 정도를 측정하는 알파스크린 기술을 이용하여 ASK1 및 ASK2 생화학적 활성을 정량화하였다. 알파스크린 기술은 두 유형의 비드, 수용자 및 공여자에 대한 기질의 결합에 기반한다. 하나의 비드에 대한 결합은 기질 단백질의 태그를 통한다. 제2 비드의 결합은 기질의 포스포자리에 대한 항체의 포스포특이적 결합을 통한다. 이는 수용자 및 공여자 비드가 근위로 샌드위치를 형성한다. 공여자 비드가 680㎚ 범위에서의 광에 의해 여기될 때, 단일선 산소가 방출되고, 적합한 플레이트 판독기를 이용하여 검출될 수 있는 620㎚ 범위에서의 수용자로부터의 광의 방출을 야기한다.
ASK1/2 알파스크린 분석 설명
ASK1/2 알파스크린 분석은 GST-태그의 사용을 통해 글루타티온 공여자 비드에 대한 전장 비활성 MKK7 단백질의 결합에 의해 가능하게 되었다. 이어서, MKK7(Ser271/Thr275)에 대한 인산화 부위는 포스포특이적 항체에 의해 인식된다. 포스포특이적 항체는 단백질-A 상호작용을 통해 알파스크린 수용자 비드에 결합된다. ASK1 또는 ASK2에 의한 MKK7의 인산화는 후속적으로 단일선 산소의 전달이 알파스크린 신호의 생성을 야기하는 경우에 공여자 및 수용자 비드를 근위로 함께 가져오는 것을 용이하게 한다.
ASK1/2 알파스크린 시약, 조건 및 프로토콜
Figure pct00043
N-말단의 6His-Avi 태그를 갖는 전장 인간 ASK1 단백질.
Figure pct00044
N-말단의 6His-Avi 태그를 갖는 전장 ASK1 단백질(라이신 709가 메티오닌으로 대체된 비활성 효소) 및 6His-FLAG 태그를 갖는 전장 ASK2 단백질의 이형이량체.
Figure pct00045
인간 MKK7 비활성(카르나 바이오사이언스(Carna Bioscience), 카탈로그 번호 07-147-10).
Figure pct00046
포스포-MKK7(Ser171/Thr275) 항체(셀 시그널링 테크놀로지즈(Cell Signalling Technologies) 카탈로그 번호 4171).
Figure pct00047
단백질 A 수용자 비드(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 카탈로그 번호 6760137).
Figure pct00048
글루타티온 공여자 비드(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6765301).
Figure pct00049
아데노신 삼인산염, ATP(프로메가(Promega), 카탈로그 번호 V915B).
Figure pct00050
반응 완충제: 50mM 헤페스(Hepes), 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM CHAPS, pH 7.2.
Figure pct00051
중단 완충제: 50mM 헤페스, 150mM NaCl, 60mM EDTA, 1mM CHAPS, pH 7.2.
분석은 다음의 조건(최종 농도)를 이용하여 실행하도록 구성하였다: 150μM ATP; 400nM MKK7; 0.8nM ASK1 및 2nM ASK2.
실험
100% DMSO 중의 100nL의 시험 화합물(시작 농도 6 μM, 3배 연속 희석물을 이용하여 11개의 농도)을 저용적 384 웰 플레이트에 첨가하였다. 2.5㎕ 완충제를 첨가한 대조군 웰을 제외하고 각각의 웰에 2.5㎕의 ASK1 또는 ASK2를 첨가하였다. 2.5㎕의 MKK7 용액을 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 단백질-A 수용자 비드 및 포스포-특이적 항체를 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 2.5㎕의 단백질-A 수용자 비드/포스포-특이적 항체 혼합물(2.5㎍/㎖ 수용자 비드 최종 농도 및 1/800 항체 최종 농도)을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 이어서, 2.5㎕의 GSH 공여자 비드(10㎍/㎖ 수용자 비드 최종 농도)를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 추가 60분 동안 인큐베이션시키고, 이후에, 플레이트를 퍼킨 엘머 인스파이어(Perkin Elmer Enspire) 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
데이터 분석
엑셀(Excel) 툴 및 그래프패드프리즘(GraphPadPrism) 소프트웨어, v. 5.03를 이용함으로써 IC50 데이터, 곡선 및 QC 분석을 계산하였다. 간략하게, 최소 제곱(보통의) 적합도를 이용하여 시험한 화합물의 시험 농도(X) 대 대응하는 저해값 백분율(Y)의 로그를 플롯팅함으로써 개개 농도-효과 곡선을 생성하였다. IC50 계산 = log(저해제) 대 반응 - 가변 기울기(4개의 매개변수)에 대해 적합화 식을 사용하였다.
본 발명의 예시적 화합물을 실시예 2.2의 방법에 따라 시험하였다. 결과를 이하에 나타낸다:
Figure pct00052
2.3 ASK1/2 세포 분석
웨스턴 블롯 방법을 이용하여 H2O2-자극된 PBMC 내 포스포-MKK3 단백질의 양을 결정함으로써 시험관내 ASK1/2 활성을 분석하였다. MKK3은 p38 활성화 경로에서 ASK1/2 촉매화된 인산화의 직접 기질인 것으로 나타난다.
2.3.1 물질 및 분석 조건
Figure pct00053
림포프렙(Lymphoprep)(액시스-쉴드(Axis-Shield), 카탈로그 번호 1114545)
Figure pct00054
염화암모늄 용해물 완충제 pH 7.4(10Х 농축됨):
- NH4Cl - 최종 농도 1.5M(케미카(Kemika), 카탈로그 번호 0137407)
- NaHCO3 - 최종 농도 100mM(케미카, 카탈로그 번호 1411007)
- Na2EDTA - 최종 농도 10mM(시그마 알드리치(Sigma Aldrich); 카탈로그 번호 E-4884)
Figure pct00055
RPMI 1640(론자(Lonza) 카탈로그 번호 BE12-115F/U1)
Figure pct00056
FBS (시그마 카탈로그 번호 F7524, 열 비활성화된 30'/56℃)
Figure pct00057
다이메틸 설폭사이드(DMSO)(시그마, 카탈로그 번호 D2650)
Figure pct00058
세포 용해 완충제(pH 7.4): PBS + 1% 트리톤(Triton) X-100(시그마 알드리치; 카탈로그 번호 X100) - 10㎖
- 포스포-정지 - 1 정제(시그마, 카탈로그 번호 4693124001)
프로테아제 저해제 - 1 정제(시그마, 카탈로그 번호 4906837001)
Figure pct00059
과산화수소 용액 3% w/w(시그마, 카탈로그 번호 H-6520)
Figure pct00060
PBS(시그마, 카탈로그 번호 P4417-100TAB)
Figure pct00061
마이크로플레이트, 96웰, pp, v자 바닥, 클리어(v-bottom, clear)(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one); 카탈로그 번호 651201)
Figure pct00062
조직 배양 플레이트, 6웰, 낮은 증발 리드를 갖는 편평한 바닥(팔콘(Falcon), 카탈로그 번호 353224)
Figure pct00063
50㎖ 팔콘 관(TPP, 카탈로그 번호 91050)
Figure pct00064
피어스(Pierce) BCA 단백질 분석 키트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 카탈로그 번호 23225)
Figure pct00065
이뮬론(I㎜ulon)(등록상표) 마이크로타이터(Microtiter)(상표명) 96-웰 플레이트 1B(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 3355)
Figure pct00066
Wes 12-230 kDa 마스터 키트(프로테인 심플(Protein Simple), 카탈로그 번호 PS-MK14)
Figure pct00067
MKK3(D4C3) 토끼 mAb(셀 시그널링(Cell Signaling), 카탈로그 번호 8535)
Figure pct00068
포스포-MKK3(Ser189)/MKK6(Ser207)(D8E9) 토끼 mAb(셀 시그널링, 카탈로그 번호 12280)
분석은 다음의 조건을 이용하여 실행하도록 구성하였다: 시험한 화합물 농도 범위: 1 내지 0.0014μM(7가지의 3배 연속 희석물); H2O2 농도: 3mM
2.3.2 실험
버피코트(buffy coat)로부터 PBMC를 단리시키기 위해, 버피 코트를 PBS 중에서 1:1로 희석시키고, 이어서, 희석시킨 버피-코트(25㎖)를 팔콘 관 내 20㎖의 림포프렙(Lymphoprep) 상부에 조심해서 피펫팅하였다. 이어서, 관을 35분 동안 400Хg에서 교반시켰다. 이어서, 상부 혈장층을 조심해서 제거하여 MNC를 함유하는 층을 남긴다. 이어서, MNC를 함유하는 층을 새로운 관에 옮기고 나서, PBS를 50㎖까지의 총 용적으로 첨가하고, 이어서, 관을 10분 동안 교반시킨다(200Хg, 25℃). 이어서, 얻어진 펠릿을 2㎖의 PBS 중에서 재현탁시키고 나서, 세척 단계를 반복하였다. 최종 펠릿을 50㎖까지 염화암모늄 용해물 완충제 중에 재현탁시켰고, 부드럽게 교반시킨 다음, 10분 동안 원심분리시키고(200Хg, 25℃), 2 내지 3㎖의 세포 배지에서 재현탁시키고 나서, 세포 배지에서 50㎖까지 희석시켰다. 세포 배지 내 1/20 희석물의 세포 밀도를 자동화 세포 계수기를 이용하여 결정하였다.
6-웰 플레이트 중에서 10% FBS로 보충한 1㎖의 RPMI 1640 세포 배지에서 웰마다 10Х106개의 PBMC를 파종하였다. 96-웰 v자 바닥 플레이트에서 1mM로부터 시작해서 DMSO 중에서 화합물의 3배 연속 희석물의 7개 세트를 제조하였다. DMSO 화합물 용액을 세포 배지에서 100Х로 희석시켰다. 200㎕의 100Х 희석 화합물 용액을 웰마다 첨가하였고, 대조군 웰은 세포 배지에서 제조한 200㎕의 1% DMSO를 함유하였다. 세포 배지에서 7.5mM H2O2를 제조하였고, 800㎕의 세포 배지를 첨가한 음성 대조군을 제외하고 800㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 30분 동안 37℃ 5% CO2, 95% 습도에서 인큐베이션시켰다. 세포를 2㎖ 에펜도르프 관에 옮기고 나서, 10분 동안 300Хg으로 4℃에서 원심분리시키고, 이어서, 그들을 1㎖ PBS로 세척하고, 세포 펠릿을 100㎕의 용해 완충제 중에서 재현탁시키고 나서, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 이후에 세포 용해물을 5분 동안 10000Хg으로 4℃에서 원심분리시키고, 이어서, 상청액을 -20℃에서 저장하였다.
샘플을 세포 용해 완충제 중에서 5Х 희석시키고, 제조업자의 설명서에 따라 BCA 단백질 키트를 이용하여 총 단백질 농도를 96-웰 이뮬론 1B 플레이트에서 결정하였다.
제조업자의 설명서에 따라 프로테인 심플 Wes 마스터 키트(Protein Simple Wes Master Kit) 및 장치를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 0.5㎎/㎖의 총 단백질을 샘플마다 장입하였고; 포스포-MKK3 및 MKK3 항체를 300Х 희석시켰다.
콤패스(Compass) 2.7.1 소프트웨어를 이용하여 웨스턴 블롯 결과를 분석하였고, 각각의 샘플에 대해 포스포-MKK3 양을 MKK3 양으로 나누었다. 다음의 식을 이용하여 대조군에 대해 데이터를 정규화시킴으로써 저해 백분율을 계산하였다:
[(샘플 - 낮은 대조군)/(높은 대조군 - 낮은 대조군)]*100
그래프패드 프리즘 소프트웨어, 비선형 회귀(곡선 적합도), log(저해제) 대 반응 - 가변 기울기(4개의 매개변수)를 이용하여 화합물 농도의 로그 및 저해 백분율을 플롯팅함으로써 화합물의 IC50 값을 결정하였다.
본 발명의 예시적 화합물을 실시예 2.3의 방법에 따라 시험하였다. 결과를 이하에 나타낸다:
Figure pct00069
2.4. ASK1/2 인간 전혈 분석
ELISA를 이용하여 LPS로 자극된 인간 전혈에서 생성된 CCL2 사이토카인을 결정함으로써 시험관내 ASK1/2 활성을 분석하였다. 비자극된 그리고 LPS-자극된 조건 하에 ASK1 넉아웃 마우스로부터의 혈청에서 CCL2 생성이 감소되었다는 것은 문헌에 기재되어 있다.
2.4.1 물질 및 분석 조건
Figure pct00070
RPMI 1640(론자 카탈로그 번호 BE12-115F/U1)
Figure pct00071
다이메틸 설폭사이드(DMSO)(시그마, 카탈로그 번호 D2650)
Figure pct00072
이콜라이(E.coli)로부터의 지질다당류(LPS)(시그마(Sigma), 카탈로그 번호 L4391)
Figure pct00073
마이크로플레이트, 96웰, pp, v자 바닥, 클리어(그레이너; 카탈로그 번호 651201)
Figure pct00074
마스터 블록 96웰, 2㎖(그라이너, 카탈로그 번호 780271)
Figure pct00075
마이크로플레이트, 96웰, 뚜껑이 있는, u자 바닥, 클리어(그라이너, 카탈로그 번호 650180)
Figure pct00076
50㎖ 팔콘 관(TPP, 카탈로그 번호 91050)
Figure pct00077
이뮬론 2HB 96-웰 플레이트(써모 피셔 사이언티픽, 카탈로그 번호 3455)
Figure pct00078
수크로스(케미카(Kemika), 카탈로그 번호 1800408)
Figure pct00079
스트렙타비딘-HRP(칼바이오켐(Calbiochem), 카탈로그 번호 OR03L)
Figure pct00080
황산(케미카, 카탈로그 번호 1816501)
Figure pct00081
1㎖의 PBS 중에 용해시킨 항-hCCL2 항체(알앤디 시스템즈(R&D Systems), 카탈로그 번호 MAB679)
Figure pct00082
1㎖의 PBS 중에 용해시킨 항-hCCL2 검출 항체(알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 BAF279)
Figure pct00083
재조합 hCCL2(표준, 알앤디 시스템즈, 카탈로그 번호 366-6C)
Figure pct00084
세척 완충제(PBS + 0.05% 트윈-20)
- PBS(시그마, 카탈로그 번호 P4417)
- 트윈-20(시그마, 카탈로그 번호 P2287)
Figure pct00085
20㎖에 대한 기질: 18㎖ H2O + 2㎖ 1M 아세트산 나트륨 + 200㎕ TMB 혼합물 + 2.5㎕ 30% H2O2
- 아세트산나트륨(케미카, 카탈로그 번호 1441908)
- TMB 혼합물(시그마, 카탈로그 번호 T2885)
- 과산화수소(머크, 카탈로그 번호 1.08597)
Figure pct00086
코팅 완충제(15mM Na2CO3(ХH2O) + 35mM NaHCO3 )
- 탄산나트륨(시그마, 카탈로그 번호 S-2127)
- 중탄산나트륨(케미카, 카탈로그 번호 1411007)
Figure pct00087
분석 완충제(PBS + 0.05% 트윈-20 + 1% BSA)
- 소 혈청 알부민(BSA)(시그마, 카탈로그 번호 A2153)
2.4.2 실험
시트르산염 항응고제 상에서 전혈을 수집하였다. 자동 세포 계수기를 이용하여 세포 계수의 결정을 위해 100㎕를 사용하였다.
2㎖ 마스터 블록 96-웰 플레이트에 300㎕의 전혈을 첨가하였다. 96-웰 v자 바닥 플레이트에서 10mM로부터 시작해서 DMSO 중에서 화합물의 6가지 3배 연속 희석물을 제조하였다. v자 바닥 플레이트로부터의 0.6㎕의 제조 화합물 또는 0.6㎕의 DMSO(양성 및 음성 대조군 웰)를 혈액이 있는 마스터 블록 플레이트에 첨가하였다. 혈청이 있는 배양 배지 내 2ng/㎖ LPS를 제조하고 나서, 300㎕를 시험 웰에 대해 혈액이 있는 마스터 블록 플레이트에 웰마다 첨가하였다. 300㎕의 배양 배지를 음성 대조군 웰에 첨가하였다. 플레이트를 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2, 95% 습도)에서 밤새 전혈과 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 1500Хg으로 7분 동안 원심분리시키고, 상청액을 CCL2 사이토카인의 결정을 위해 96-웰 u자 바닥 플레이트에 옮기거나 또는 상청액을 장래의 시험을 위해 -20℃에서 저장하였다.
ELISA를 수행하기 전날에, 이뮬론 2HB 플레이트를 코팅 완충제에서 250Х 희석된 항-hCCL2 항체의 웰마다 100㎕로 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충제의 웰당 300㎕로 3회 세척하였고, 각각의 단계 후에 이를 반복하였다. 200㎕의 차단(분석 완충제 + 5% 수크로스)을 각각의 웰에 첨가하였고, 60분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분석 완충제에서 hCCL2 표준의 2배 연속 희석물의 7개 세트를 2000pg/㎖로부터 시작해서 2회 중복하여 제조하였다. 분석 완충제만을 함유하는 블랭크 웰을 제조하였다. 분석 완충제 중에서 10배 희석시킨 시험 샘플(상청액)을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트에서 모든 최종 용적은 모두 100㎕였다. 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 분석 완충제에서 500Х 희석된 항-hCCL2 검출 항체의 웰마다 100㎕를 첨가하였고, 플레이트를 45분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분석 완충제 중에서 50ng/㎖ 스트렙타비딘-HRP의 웰마다 100㎕를 첨가하였고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 제조한 기질 용액의 웰마다 100㎕를 첨가하였고, 플레이트를 실온에서 인큐베이션시키고 나서, 웰에서 청색이 발생될 때까지 광으로부터 보호하였다. 색 발생을 중단시키기 위해, 1M 황산의 웰마다 100㎕를 첨가하였다. 플레이트 흡광도를 플레이트 판독기 상에서 450㎚에서 판독하였다.
2.4.3 데이터 분석
마이크로소프트 엑셀 소프트웨어를 이용하여 ELISA 결과(450㎚에서의 흡광도)를 분석하였다. 모든 값으로부터 블랭크의 평균을 차감하였다. x-축 상의 표준의 연속 희석(pg/㎖) 대 y축 상의 대응하는 흡광도 값으로 표준 곡선을 플롯팅하였다. 샘플 중의 사이토카인의 양(pg/㎖)을 표준 곡선으로부터 계산하였다. 다음의 식을 이용하여 대조군에 대해 데이터를 정규화시킴으로써 저해 백분율을 계산하였다:
[(샘플 - 낮은 대조군)/(높은 대조군 - 낮은 대조군)]*100
그래프패드 프리즘 소프트웨어, 비선형 회귀(곡선 적합도), log(저해제) 대 반응 - 가변 기울기(4개의 매개변수)를 이용하여 화합물 농도의 로그 및 저해 백분율을 플롯팅함으로써 화합물의 IC50 값을 결정하였다.
3. 생체내 분석
3.1 체중 부하 방법을 이용하여 평가한 래트에서의 CFA(완전 프로인트 아쥬반트) 유도 과민증
완전 프로인트 아쥬반트(CFA)의 족부 주사는 과민증 및 부종을 유도하는 염증 반응을 야기하며, 임상적 염증성 통증의 일부 양상을 모방한다. 이들 효과는 체중 부하를 측정하기 위한 장비 및 부종측정기(plethysmometer)를 이용하여 연구할 수 있다.
3.1.1 체중 부하
미경험 래트는 2개의 뒷발 사이에 체중을 동일하게 분포시켰다. 그러나, 주사한(좌측) 뒷발에 염증 및/또는 통증이 있을 때, 체중을 재분포시켜서, 영향받은 발에 더 적은 체중을 부여하였다(주사한 발에 대한 체중 부여의 감소). 래트 체중부하 측정기(incapacitance tester)(영국에 소재한 린톤 인스트루먼츠(Linton Instruments))를 이용하여 각각의 뒷발을 통한 체중 부하를 측정하였다.
별개의 센서 상에서 뒷발을 이용하여 체중부하 측정기에 래트를 두었고, 뒷발 둘 다에 의해 발휘되는 평균 힘을 4초에 걸쳐 기록하였다.
기준선 체중 부하 및 발 용적 판독을 취하였고, CFA의 주사를 통해 과민증을 유도하였다(발작의 유도 전에 기준 체중 부하 및 발 용적을 기록하였다). 래트 좌측 뒷발에 대한 족부의 CFA(100㎕의 1㎎/㎖ 용액)의 족부 주사에 의해 염증 과민증을 유도하였다.
동물(수컷, 스프래그 돌리 래트(영국 찰스 리버에 소재), 212 내지 260g)에 순위를 부여하고 나서, 라틴 방진(Latin square) 설계에서 체중 부하 CFA 창에 따라 처리군으로 무작위화하였다. CFA 후 24시간에 동물을 비히클, 화합물 1 10㎎/㎏ 또는 인도메타신 10㎎/㎏(10Ll/㎏ 용량 용적) 중 하나로 처리하였다. 치료 후 1, 2, 및 4시간에 체중 부하를 측정하였다. 우측과 좌측 뒷발 둘 다에 대해 체중부하(g)를 판독하고 나서, 차이를 계산하였다. 데이터를 통증에 대한 과민증의 역수%로서 표현한다(평균 ± s.e.m.). 좌측 뒷발에 대해 발 용적(mLl) 판독을 취하였다. 데이터를 부종의 역수%로서 표현한다(평균 ± s.e.m.). 반복 측정 ANOVA 다음에 InVivoStat(invivostat.co.uk, Clark et al., 2012), p<0.05 고려한 유의도를 이용하는 계획 비교 검정을 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
투여 후 검사한 모든 시점에 화합물 1 및 인도메타신(10㎎/㎏)은 과민 반응을 유의하게 저해하였다.
3.2 래트-생체내 만성 통증 모델에서의 MIA 유도된 통각 과민증
스프래그 돌리 래트의 동측성 무릎에서 요오도아세트산일나트륨(MIA)의 투여는 초기에 염증 반응과 관련되는 강하고 지속적인 통각 과민증 및 이질통의 발생을 야기한다. 이 동물 모델에서 이들 징후의 발생은 임상적으로 적절한 것으로 여겨지며; 근본적인 병태와 관련된 만성 염증성 통증, 예컨대 골관절염(OA) 또는 류마티스 관절염이 존재하는 환자에 의하 나타나는 증상을 반영한다(Bove SE et al., Osteoarthritis Cartilage 2003; 11 (11): 821-30; Fernihough J, et al., Pain 2004; 112 (1-2): 83-93; Kalbhen DA. J Rheumatol 1987; 14 Spec No: 130-1).
체중 부하
미경험 래트는 2개의 뒷발 사이에 체중을 동일하게 분포시켰다. 그러나, 주사한(좌측) 뒤쪽 무릎에 염증 및/또는 통증이 있을 때, 체중을 재분포시켜서, 영향받은 무릎에 더 적은 체중을 부여하였다(주사한 무릎에 대한 체중 부여의 감소). 래트 체중부하 측정기(영국에 소재한 린톤 인스트루먼츠)를 이용하여 각각의 뒷발을 통한 체중 부하를 측정한다.
좌측 뒷발 무릎 관절에 MIA 용액(시그마, I2512), 25㎕의 80㎎/㎖, (2㎎)의 주사를 통해 래트(스프래그 돌리, 수컷, 10마리의 그룹)에서 골관절염(OA)을 유도하였다. 만성 통증의 발생을 위해 MIA의 주사 후 제3일, 제5일, 제7일, 제9일, 제12일 및 제16일에 체중 부하를 평가하였다. 제3일에 체중 부하 측정을 취하고 나서, 동물에 순위를 부여하고, 라틴 방진 설계에서 그들의 MIA 창에 따라 처리군으로 무작위화하였다.
제3일에 0.5% 메틸셀룰로스 또는 비히클(0.5% 메틸셀룰로스) 10㎖/㎏ p.o.에 의해 동물을 화합물 1 10㎎/㎏로 처리하고, 이어서, 제16일까지 매일 상승시켰다. 제3일에 투약 후 1, 2 및 4시간에 그리고 제5일, 제7일, 제9일, 제12일 및 제16일에 투약 후 2시간에 체중 부하 측정을 하였다.
우측과 좌측 뒷발 둘 다에 대해 체중부하(g)를 판독하고 나서, 차이를 계산하였다. 데이터를 동측성/대측성 비%((WB 좌측/WB 우측)*100)로서 표현한다(평균 ± s.e.m.).
계산: 동측성 판독/대측성 판독Х100. 미경험 WB 차이 - 사전 투약 WB 차이를 MIA 창으로서 나타낸다.
통계학적 분석: InVivoStat(invivostat.co.uk), (p<0.05 고려된 유의도)를 이용하는 반복 측정 ANOVA 다음에 계획 비교 검정. 각각의 시점에 처리군을 비히클 대조군에 비교함으로써 데이터를 분석하였다.
투약 후 1시간으로부터 10㎎/㎏으로 투약할 때, 제12일까지(투약 후 9일) 화합물 1에 의한 과민증의 유의한 그리고 현저한 반전이 보였다. 10㎎/㎏으로 주어진 화합물 1은 각각의 시점에 비히클과 비교할 때 유의한 반전을 나타내었는데, 이는 양성 대조군 셀렉콕십과 비슷하였다.
3.3 간 섬유증의 CCl 4 모델 - 프로토콜 1
본 연구의 목적은 CCl4 중독에 의한 간 섬유증 모델을 평가하는 것이었다. 상이한 시점에 조직학, 생화학, 영상화 및 유전자 발현을 연구함으로써 간 섬유증을 평가하여 질환의 개시 및 잠재적 양성 기준의 효과를 평가하였다. 문헌[Starkel P., Animal models for the study of hepatic fibrosis, Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25: 319-333, 2011]
3.3.1 연구 그룹:
5주령 수컷 BalbC J 마우스(잔비어 랩(Janvier Lab))을 이용하여 연구를 수행한다.
Figure pct00088
3.3.2 물질:
Figure pct00089
CCl4: 사염화탄소 ACROS 99.8% CAS = 56-23-5 로트 A0293900
Figure pct00090
올리브유, 시그마 O1514-500㎖ 로트 #BCBQ4885V
Figure pct00091
colF(이뮤노케미스트리 테크놀로지즈(I㎜unoChemistry Technologies)), 참조번호 6346 로트 13Y39 Exp 05/2017
o 저장액을 100㎕의 DMSO(6.8mM) 중에서 희석시키고 4℃에서 저장함
o 영상화 15분 전에 동물에 ppi 수 중의 1:170 희석물의 주사(100㎕, 부비강 i.v.)
Figure pct00092
올리브유 중의 1/2에서 CCl4를 희석시켰고, 0.6㎖/㎏으로 주당 2회 IP로 투여하였다.
3.3.2 샘플 및 결과
혈청 관에서 혈액을 수집하고 나서, 샘플을 3000t/분으로 5분 동안 원심분리시키고, AST, ALT, ALP 및 총 빌리루빈 평가를 위해 -20℃에서 냉동시켰다. 또한 간 우측 중간엽의 샘플을 취하고 나서, 4℃에서 저장한 1㎖의 RNAlater(안전 잠금관)를 이용하여 에펜도르프 관(2㎖ 둥근 바닥)에 빠르게 넣었다.
간을 채취하고 나서, 무게를 쟀다. 간에서 colF 결합의 생체외 영상화를 즉시 수행하였다(브루커 엑스트림(Bruker Xtreme)). aSMA 및 col I IHC 정량화를 위한 조직학적 평가를 위해 간을 폼알데하이드(바이알 25㎖ 내지 60cc)에 넣는다.
장래의 분석을 위해 비장의 무게를 쟀다.
유전자 발현 분석을 위해 9가지 섬유증 유전자의 패널을 사용한다.
3.4 간 섬유증의 CCl 4 모델 - 프로토콜 2
본 연구의 목적은 CCl4 중독에 의한 간 섬유증 모델을 평가하는 것이었다. 상이한 시점에 조직학, 생화학, 영상화 및 유전자 발현을 연구함으로써 간 섬유증을 평가하여 질환의 개시 및 잠재적 양성 기준의 효과를 평가하였다. 문헌[Starkel P., Animal models for the study of hepatic fibrosis, Best practice & Research Clinical Gastroenterology 25: 319-333, 2011]
3.4.1 연구 그룹:
8주령의 수컷 BALB/c 마우스(이탈리아에 소재한 찰스 리버)를 이용하여 연구를 수행한다.
Figure pct00093
3.4.2 물질:
Figure pct00094
CCl4(액체)를 0.06㎖/㎖의 농도로 올리브유에 첨가할 것이다. 용액을 0.6㎖/㎏의 용량으로 IP로 투여할 것이다. 적용 용적은 10㎖/㎏일 것이다.
Figure pct00095
시험 화합물을 메틸셀룰로스(MC 0.5%) 중에 용해/현탁시킬 것이다.
3.4.3 샘플 및 결과
정상 상태 PK를 위해, He-리튬관에서 샘플링 혈액을 수집하여 혈장을 생성할 것이다. 수집 30분 내에 원심분리(4℃에서 10분 동안 5,000rpm)에 의해 모든 혈액 샘플을 혈장에 대해 가공할 것이다. 이어서 샘플을 분석까지 -80℃에서 저장한다.
경정맥신경을 절단함으로써 최종 혈액 샘플을 K2EDTA 마이크로관에 수집할 것이다. 수집 30분 내에 원심분리(4℃에서 10분 동안 3500rpm)에 의해 모든 혈액 샘플을 혈장에 대해 가공할 것이다. 각각의 혈액 샘플로부터의 혈장을 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
간을 채취하고 나서, 좌측엽의 일부를 RNA 유전자 발현 분석을 위해 저장하고, OH 프롤린 측정의 절편, 및 나머지를 조직병리학적 평가를 위해 10% 포말린에 넣는다.
유전자 발현 분석을 위해 5가지 섬유증 유전자(Col1, Timp1, Pai1, Snail1, Acta2)의 패널을 사용한다.
3.5 지방간염 및 섬유증의 메티오닌 및 콜린 결핍 모델
MCD는 식이요법에 의해 유도된 지방간염 및 섬유증의 새로운 마우스 모델이다: 메티오닌 및 콜린-결핍(MCD). (Wehr et al 2013 J i㎜unol, 190(10):5226-36; Baeck et al., 2014 Hepatology, 59(3):1060-72; Gautheron et al, 2014 EMBO, 6(8):1062-74).
3.5.1 연구 그룹 및 용량 요법:
(잔비어 랩스(프랑스))로부터의 C57BL/6 마우스를 이하에 제시하는 바와 같이 그룹으로 나누고, 마우스는 유도기의 개시 시 8주이다(20그램 이상)
Figure pct00096
3.5.2 물질 및 화합물
Figure pct00097
MCD 식이요법 w/o 콜린 및 메티오닌 Ref EFTD.90262 MCD mod. 배취 8206423, 독일 수스트에 소재한 스니프(Ssniff) -
Figure pct00098
메틸 셀룰로오스 0.5%, VWR,
Figure pct00099
PEG 400: P3265, 시그마
Figure pct00100
크라이오몰드(Cryomold)(등록상표) 표준 25Х20Х5㎜(사쿠라 피네텍(Sakura Finetec), 4557)
Figure pct00101
O.C.T.(상표명) 화합물 크라이오몰드(사쿠라 피네텍, 4583)
Figure pct00102
샘플 보존용 포말린 - MetOH를 이용하여 4%로 완충
3.5.3 화합물 제조:
적절한 비히클(상기 표 참조) 중에서 교반 하에 화합물을 용해/현탁시킨다. 제조 후에, 용액/현탁액을 일정한 자기 교반 하에 암실 내 실온에서 유지시킨다. 투약하였을 때, 10㎖/kg 용적을 사용하고, 동물 체중에 따라 용액을 농도를 조절한다.
3.5.4 프로토콜:
유도기는 3주이다. 공복혈당은 제공하지 않는다. 마우스에 MCD 대조군 식이요법 또는 MCD 식이요법 중 하나를 제공한다.
치료기 동안에, 마우스를 MCD 대조군 식이요법 또는 유도기에서와 같은 MCD 식이요법에서 유지시킨다. 균질한 분배를 보장하기 위하여 마우스를 그들의 체중에 따라 처리군에 무작위로 할당한다. 평가기 동안 마우스에 시험 화합물로 1일 1회 또는 2회 투약한다.
3.6 예방적 블레오마이신 유도 폐 섬유증 14일 마우스 모델
본 연구의 목적은 마우스에서 블레오마이신 유도 폐 섬유증의 14일 모델에서 3가지 상이한 용량으로 시험 화합물의 효능을 시험하는 것이다.
3.6.1 동물
22℃로, 55% 상대습도에서 유지시킨 환경에서 적어도 5일 동안 순응시킨 이탈리아 찰스 리버에 의해 공급된 C5²7BL/6N 수컷 마우스에 대해 본 연구를 수행하며, 12시간의 명주기 하에 시간당 15 내지 20회로 공기를 바꾼다. 마우스에 펠릿화된 사료 및 물을 임의량으로 제공한다.
실험 시작의 적어도 1일 전에, 이하의 표에 나타내는 바와 같이 모든 동물을 그룹에 무작위로 할당한다.
모든 동물 관련 연구를 과학적 연구에서 그리고 다른 목적을 위해 실험 동물의 사용을 규제하는 2010/63/EU 및 국가적 법률(관보 55/13)에 따라 수행한다.
3.6.2 연구 그룹:
Figure pct00103
3.6.3 물질
0.5 g의 하이드록시에틸셀룰로스(나트로졸)를 500㎖ 아쿠아 증류물(0.1%)에 첨가함으로써 시험 화합물에 대한 용매를 5시간 동안 자기 교반기 상에서 가열 없이 지속적 교반 하에 제조하였다.
1㎖의 나르케탄(Narketan)(나르케탄 10, 스위스 베른 03605877535982에 소재한 베토퀴놀(Vetoquinol)) 및 0.5㎖의 롬푼(Rompun)(롬푼, 2%: 독일 레버쿠젠에 소재한 바이엘(Bayer))을 9㎖ 식염수에 첨가함으로써 마취 용액을 제조한다. 얻어진 용액을 10㎖/㎏으로 투여한다.
비강내 시험감염(i.n.) 도전을 위한 용액을 제조하기 위해, 블레오마이신(블레오마이신 설페이트(Bleomycin sulphate), 미국에 소재한 엔조 라이프 사이언시즈 인코포레이티드(Enzo Life Sciences, Inc.); CAS 번호 9041-93-4; 카탈로그 번호 BML-AP302-0010)의 0.8㎎/㎖ 저장액을 해동시키고, 330㎕의 식염수 중에서 희석시켰다.
i.n 투여 전에, 마우스를 i.p.로 마취시켰는데 마취 용액은 상기 기재하였다.
새로운 피르페니돈 제형을 0.1% 나트로졸 제형 중에서 매일 5㎎/㎖의 최종 농도로 제조하였다. 투약 전에, 동물의 무게를 재고, 10㎖/㎏ 체중에 대응하는 개개 체중에 따라 투여하는 피르페니돈 양을 조절하고, p.o.에 의해 1일 2회, 두 투여 사이에 7.5시간의 간격이다.
최종적으로, PEG 400(최종 용적의 20%) 중에 시험 화합물의 적합한 양을 용해시키고, 이어서, MC 0.5%(최종 용적의 80%)는 1㎎/㎖, 0.3㎎/㎖ 및 0.1㎎/㎖의 최종 농도에 도달시킴으로써 시험 화합물 용액을 제조하고, 따라서 10㎎/㎏, 3㎎/㎏ 및 1㎎/㎏의 용량에 대한 화합물을 수득하였다. 투약 전에, 동물의 무게를 재고, 개개 체중에 따라 투여하는 양을 조절하였다.
시험 용량의 적용 용적은 10㎖/㎏ 체중에 대응하며, 시험 화합물을 1일 2회 p.o.로 투여하였으며 두 투여 사이의 간격은 7.5시간이다.
3.6.4 연구
동물을 임상적으로 1일 2회 시험한다. 임상 징후 및 매개변수의 목록을 인간 종점표에 나타낸다. 동물을 제0일에 시작해서 매일 체중을 잰다.
제14일에, 피르페니돈 또는 시험 화합물에 의한 투약 2시간 후에, 과용량의 마취제에 의해 마우스를 희생시킨다.
폐를 절단하고, 개개로 무게를 잰다. 모든 그룹에 대해: 전체 상부 우측 폐엽을 실리카 비드를 함유하는 프레셀리(Precelly) 관에 넣고 액체 질소에서 즉시 순간 냉동시키고 나서, 유전자 발현 분석을 실시한다.
모든 남아있는 폐를 추가 조직병리학적 평가를 위해 10% 완충 포말린을 함유하는 표시한 보틀에 넣는다.
3.6.5 샘플 분석, 데이터 처리 및 통계학적 평가
MS 엑셀을 이용하여 체중 및 폐 중량 데이터를 처리한다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(버전 5.04)를 이용하여 통계학적 분석 및 그래프 제시를 수행한다.
폐 중량에 대해 일원 ANOVA 또는 맨-휘트니 검정을 사용한다.
체중 변화에 대해 이원 ANOVA를 사용한다.
그룹 간의 차이는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 고려할 것이다.
조직병리학적 평가를 위해, 전체 폐(샘플링한 상부 우측 폐를 제외)를 파라핀에 포매시키고, 말로리 삼중염색(Mallory's trichrome)으로 염색한다.
애쉬크로프트(Ashcroft) 스코어 마츠서스(Matsuse) 변형을 이용하여 폐의 조직학적 변화를 평가하였다(Ashcroft et al., 1988; Matsuse et al., 1999). 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(버전 5.04)를 이용하여 통계학적 분석 및 그래프 제시를 수행한다. 맨-휘트니 검정을 사용한다.
그룹 간의 차이는 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 고려할 것이다.
Figure pct00104
3.6.6 PK 분석 - 그룹 7
3.6.6.1 프로토콜
그룹 7의 동물(n=10)은 PK 연구 단독에 포함시키고, 임상 징후 스코어링을 실시하지 않는다.
이들 동물은 제0일에 치료의 시작 시 질환을 유도하며, 시험 화합물의 초회 투여 후 제7일 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, 24시간에 순차적으로 희생시킨다.
꼬리 정맥으로부터의 혈액 샘플(50㎕)을 각각의 시점에 Li-헤파린 항응고제 관에 수집하고 나서, 분리까지 얼음 상에 유지시킨다. 수집 후 최대 30분 내에, 혈액 샘플을 2000　g으로 10분 동안 4℃에서 원심분리시키고, 얻어진 혈장 샘플을 폴리프로필렌 관으로 분취시킨다(1Х25㎕). 분석까지 샘플을 -20℃에서 냉동 저장한다.
각각의 동물에 대한 혈액 샘플링 후 희생 시 폐 조직을 수집하고, 이어서, 중량을 재고, 냉동 전에 폴리프로필렌관에 넣는다. 분석까지 샘플을 -80℃에서 냉동 저장한다.
3.6.6.2 혈장 농도 및 약물동태학적 분석
LC-MS/MS를 통해 혈장 및 폐 농도를 측정한다. 단백질 침전을 통해 LC-MS/MS 분석을 위해 샘플을 제조한다. 정량 하한(LLOQ) 미만에서 측정한 혈장 농도를 정량 한계 미만(BLQ)으로서 보고한다.
혈장 중의 시험 화합물 농도를ng/㎖로 표현한다.
평균 혈장 농도를 계산한다. 평균 계산을 위해, LLOQ 미만의 농도를 0으로 설정한다. 따라서, 평균값은 BLQ일 수 있다. 적어도 3가지 혈장 농도 값이 LLOQ 초과일 때 표준 편차(SD), 평균의 표준 오차(SE) 및 변동 계수(CV, %)를 표로 만든다.
적어도, 다음의 약물동태학적 매개변수를 결정하기 위해 포이닉스(Phoenix)(상표명) 윈놀린(WinNonlin)(등록상표) 6.3(파르사이트 코포레이션(Pharsight Corporation))을 이용하여 개개 혈장 농도에 대한 비구획 분석을 수행한다:
대응하는 시간, tmax(h)에 의한 최대 혈장 농도, Cmax(㎍/㎖),
마지막 정량 가능한 농도까지의 시간 곡선에 대한 혈장 농도하 면적인 AUC0-t 또는 24시간까지의 AUC0-24h(㎍.h/㎖)(화합물이 투약 후 24시간까지 정량 가능하다면), 그리고/또는 무한대까지의 AUC0-Δ(㎍.h/㎖)를 선형 업/로그 다운(up/log down) 사다리꼴 공식에 따라 계산한다. 필요하다고 여겨지면 부분적 AUC를 계산할 수 있다. 정량 한계 미만(BLQ)의 농도를 0으로 설정한다. 3회 미만의 정량 가능한 시점이 있다면, AUC를 계산하지 않는다. AUC여분%가 20% 미만이라면 AUC0-Δ로 고려한다.
tmax를 제외하고 3회 이상의 시점이 선형 회귀에 대해 사용된다면, 그리고 R² > 0.80으로 조절된다면, 겉보기 최종 제거 반감기인 t1/2(h)만이 보고된다.
정규화된 AUC 및 Cmax 용량.
평균 약물동태학적 매개변수를 계산한다. 적어도 3개의 값을 이용 가능하다면, 표준 편차(SD) 및 변동 계수(CV, %)를 표로 만든다.
3.7 CIA 모델
3.7.1 물질
완전 프로인트 아쥬반트(CFA) 및 불완전 프로인트 아쥬반트(IFA)를 디프코(Difco)로부터 구입한다. 소 콜라겐 II형(CII), 지질다당류(LPS) 및 엔브렐을 콘드렉스(Chondrex)(프랑스에 소재한 릴 다보(L'Isle-d'Abeau)), 시그마(P4252, 프랑스에 소재한 릴 다보), 와이어스(Wyeth)(25㎎의 주사 가능한 주사기) 아크로스 오가닉스(Acros Organics)(캘리포니아주 팔로알토에 소재)로부터 각각 얻는다. 사용한 모든 다른 시약은 시약 등급을 가지며, 모든 용매는 분석 등급을 가진다.
3.7.2 동물
검은 아구티 래트(수컷, 7 내지 8주령)를 할란 래버러토리즈(Harlan Laboratories)(메디슨-알포트(Maison-Alfort), 프랑스)로부터 얻는다. 래트를 12시간 명암 주기(0700 내지 1900)로 유지시킨다. 온도를 22℃에서 유지시키고, 사료와 물을 임의량으로 제공한다.
3.7.3 콜라겐 유도된 관절염(CIA)
실험 하루 전에, 0.05M 아세트산으로 CII 용액(2㎎/㎖)을 제조하고, 4℃에서 저장한다. 면역화 직전에, 얼음물 욕에서 사전냉각시킨 유리 보틀 내 균질기에 의해 동일 용적의 아쥬반트(IFA)와 CII를 혼합한다. 에멀션이 형성되지 않는다면, 여분의 아쥬반트 및 장기간의 균질화가 필요할 수 있다. 제1일에 각각의 래트의 꼬리 기저부에 0.2㎖의 에멀션을 진피내로 주사하고, 제2 부스터 진피내 주사(CFA 0.1㎖ 식염수 중에서 2㎎/㎖으로 CII 용액)를 제9일에 수행한다. 이 면역화 방법을 공개된 방법으로부터 변형시킨다(Jou et al. 2005; Sims et al. 2004).
3.7.4 연구 설계
래트 CIA 모델에서 화합물의 치료적 효과를 시험한다. 래트를 동일한 그룹으로 무작위로 나누고 나서, 각각의 그룹은 10마리 래트를 포함한다. 모든 래트를 제1일에 면역화시키고 나서, 제9일에 부스팅한다. 치료적 투약은 제16일로부터 제30일까지 지속되었다. 음성 대조군을 비히클로 치료하고, 양성 대조군을 엔브렐로 치료한다(10㎎/㎏, 3Х/주, s.c.). 관심 대상의 화합물을 전형적으로 4회 용량, 예를 들어, 0.3, 1, 3 및 10㎎/㎏, p.o로 시험한다.
3.7.5 관절염의 임상 평가
문헌에 기재된 방법에 따라 관절염을 스코어링한다(Khachigian 2006 Nat Protoc. 2006;1(5):2512-6; Lin et al. 2007, Br J Pharmacol, 150, pp862-872; Nishida et al. 2004, Arthritis and Rheumatism, 50(10), pp3365-3376). 4개의 발 각각의 부종을 다음과 같은 관절염 스코어로 순위를 매긴다: 0-증상 없음; 1-경증이지만, 발목 또는 손목과 같은 한 가지 관절 유형의 분명한 홍반 및 부종, 또는 영향받은 발가락의 수와 상관없이, 개개 손가락으로 제한된 분명한 홍반 및 부종; 2- 2가지 이상의 관절 유형의 중등증의 홍반 및 부종; 3-발가락을 포함하는 전체 발의 중증의 홍반 및 부종; 4-다중 관절의 연루와 함께 최대 염증의 사지(동물당 최대 누적 임상 관절염 스코어 16) -(Nishida et al. 2004).
다중 연구의 메타-분석을 허용하기 위해, 임상 스코어 값을 다음과 같이 정규화시킬 수 있다:
임상 스코어의 AUC(AUC 스코어): 제1일 내지 제14일의 곡선하면적(AUC)을 각각의 개개 래트에 대해 계산한다. 각각의 동물의 AUC를 해당 동물에 대한 데이터를 얻은 연구에서 비히클에 대해 얻은 평균 AUC로 나누고, 100을 곱한다(즉, AUC를 연구당 평균 비히클 AUC의 백분율로서 표현함).
제1일로부터 제14일까지 임상 스코어는 증가한다(종말점 스코어): 각각의 동물에 대한 임상 스코어 차이를, 해당 동물에 대한 데이터를 얻은 연구에서 비히클에 대해 얻은 평균 임상 스코어 차이로 나누고, 100을 곱한다(즉, 차이를 연구당 비히클에 대한 평균 임상 스코어 차이의 백분율로서 표현한다).
3.7.6 관절염의 개시 후 체중(%)의 변화
임상적으로, 체중 손실은 관절염과 관련된다(Rall & Roubenoff 2004 Rheumatology (Oxford); 43(10):1219-23; Shelton et al. 2005 Pain ;116(1-2):8-16; Walsmith et al. 2004 J Rheumatol. ;31(1):23-9). 따라서, 관절염의 개시 후 체중의 변화를 래트 모델에서 치료 효과를 평가하기 위한 비특이적 종말점으로서 사용할 수 있다. 관절염의 개시 후 체중 변화(%)를 다음과 같이 계산한다:
Figure pct00105
3.7.7 방사선학
각각의 개개 동물의 뒷발의 X-선 사진을 촬영한다. 각각의 사진에 무작위 맹검 식별 번호를 부여하고, 뼈 부식의 중증도를 다음과 같은 방사선학적 라센 스코어(Larsen's score) 시스템을 이용하여 두 독립적 기록원에 의해 순위를 부여한다: 0- 무손상 뼈 윤곽 및 정상 관절 열극을 갖는 정상; 1- 약간의 뼈 부식을 나타내는 외부 중족골뼈 중 임의의 하나 또는 둘에 의한 약간의 이상; 2- 뼈 부식을 나타내는 외부 중족골뼈 중 임의의 3 내지 5개에 의한 분명한 조기 이상; 3- 모든 외부 중족골뼈뿐만 아니라 분명한 뼈 부식을 나타내는 내부 종족골 뼈 중 임의의 하나 또는 둘에 의한 중간의 파괴적 이상; 4- 분명한 뼈 부식을 나타내는 모든 종족골 뼈 및 부분적으로 보존된 일부 뼈 관절 윤곽을 남기고 완전히 부식된 내부 중족골 관절 중 적어도 하나에 의한 중증의 파괴적 이상; 5-뼈 윤곽이 없는 훼손된 이상. 이 스코어링 시스템은 문헌 프로토콜로부터의 변형이다(Bush et al. 2002, Arthritis and Rheumatism, 46(3), 802-805; Jou et al. 2005, Arthritis Rheum, 52(1), 339-44; Salvemini et al. 2001, Arthritis Rheum, 44(12), 2909-21; Sims et al. 2004, Arthritis Rheum, 50(7), 2338-46).
3.7.8 조직학
방사선학적 분석 후에, 마우스의 뒷발을 10% 인산염 완충 포말린(pH 7.4) 중에 고정시키고, 만족할 만한 조직학을 위한 빠른 뼈 석회제거제(유로바이오(EUROBIO), 프랑스 레 율리에 소재)로 석회질을 제거하고 나서 파라핀 중에 포매시킨다. 관절의 광범위 평가를 보장하기 위해, 적어도 4개의 일련의 절편(5㎛ 두께)을 절단하고 나서, 각각의 일련의 절편은 중간치가 100㎛이다. 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 절편을 염색한다. 활액막 염증 및 뼈 및 연속 손상에 대한 조직학적 시험을 이중 맹검으로 수행한다. 각각의 발에서, 4점 규모를 이용하여 4개 매개변수를 평가한다. 매개변수는 세포 침윤, 판누스 중증도, 연골 부식 및 뼈 부식이다. 다음과 같이 스코어링을 수행한다: 1-정상, 2-경증, 3-중등증, 4-현저함. 4개의 스코어를 함께 합치고 나서, 추가적인 스코어, 즉, 'RA 총 스코어'로서 표현한다.
3.7.9 종골(뒤꿈치 뼈)의 마이크로-컴퓨터 단층촬영(μCT) 분석
RA에서 관찰한 뼈 분해는 특히 골피질에서 나타내며, μCT 분석으로 나타낼 수 있다(Oste et al. 2007; Sims et al. 2004). 종골의 스캐닝 및 3D 용적 재구성 후에, 뼈 분해를 슬라이드당 별개의 물체 수로서 측정하고, 뼈의 세로축에 수직인 인실리코로 단리시킨다. 더 많은 뼈가 분해될 수록, 더 많은 별개의 물체가 측정된다. 종골을 따라서 균일하게 분포되는(약 10.8㎛ 간격) 1천개의 슬라이스를 분석한다.
3.7.10 정적 상태 PK
제7일 또는 이후에, 다음의 시점에 항응고제로서 리튬 헤파린을 이용하여 안구뒤 공간에서 혈액 샘플을 수집한다: 투약전, 1, 3 및 6시간. 전혈 샘플을 원심분리시키고 나서, 얻어진 혈장 샘플을 분석할 때까지 -20℃에서 저장한다. 각각의 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법으로 결정하고, 이때 질량분석계는 양의 전기분무 방식으로 작동한다. 윈놀린(WinNonlin)(등록상표)(파르사이트(Pharsight)(등록상표), 미국)을 이용하여 약물동태학적 매개변수를 계산하고, 투약전 혈장 수준이 24시간 혈장 수준과 동일하다는 것을 추정한다.
3.8 MAB 모델
MAB 모델은 치료제에 의한 RA-유사 염증 반응 조절의 빠른 평가를 허용한다 문헌[Khachigian, 2006]. DBA/J 마우스에 콜라겐 II에 대한 mAb의 칵테일을 i.v.로 주사한다. 1일 후에, 화합물 치료를 개시한다. 3일 후에, 마우스는 LPS 주사(50㎍/마우스)를 받아서, 염증의 빠른 개시를 초래한다. mAb 주사 후 10일까지 화합물 치료를 계속한다. 발 부종을 측정함으로써 그리고 각각의 발의 임상 스코어를 기록함으로써 염증을 판독한다. 염증의 중증도를 나타내기 위해 4개의 사지의 누적 임상 관절염 스코어를 제시한다. 0 내지 4의 규모를 이용하여 각각의 사지에 스코어링 시스템을 적용하며, 4는 가장 중증의 염증이다.
0 무 증상
1 경증이지만, 발목 또는 손목과 같은 한 가지 관절 유형의 분명한 홍반 및 부종, 또는 영향받은 발가락의 수와 상관없이, 개개 손가락으로 제한된 분명한 홍반 및 부종
2 2가지 이상의 관절 유형의 중등증의 홍반 및 부종
3 발가락을 포함하는 전체 발의 중증의 홍반 및 부종
4 다중 관절의 연루와 함께 최대 염증의 사지
3.9 생체내 반월상연골절제된(menisectomized: MNX) 래트 모델
3.9.1 래트 MNX 모델에서의 생체내 효능
암컷 루이스 반월상연골절제된 래트(MNX) 모델에서 생체내 효능을 연구하였다. MNX 래트 모델은 골관절염의 잘-입증된 질환 모델이다(Bendele, 2001, J Musculoskel Neuron Interact, 1(4), 377-85; Janusz et al., 2002, Osteoarthr Cartilage, 10, 785-91; Pritzker et al., 2006, Osteoarthr Cartilage, 14, 13-29).
3.9.2 수술 및 투약
의학적 측부 결찰의 횡단면에 의해 각각의 래트의 우측 다리에서 제0일(D0)에 반월상연골절제술로 골관절염을 유도하고 4㎜의 결찰을 제거한다. 반달연골의 내부 부분을 수직으로 2개의 플랩으로 쪼개고, 이를 활액강의 앞과 뒤에 밀어넣는다. 모의 동물은 마취, 피부 및 근육 절개, 이어서, 봉합을 겪는다. 제1일에, 균질한 분포를 갖기 위해 래트를 그들의 체중에 따라 처리군(그룹 당 n=20)에 무작위 할당한다. 제2일로부터 제21일까지, 래트에 os(po) 1일 1회(qd) 또는 1일 2회(bid)로 메틸셀룰로스(MC) 0.5% 중에서 또는 HPβCD 10% pH3.0 중에서 제형화한 화합물로 투약한다.
3.9.3 정적 상태 PK 결정(ssPK)
적어도 7일의 치료 후에, 투여 후 4개의 시점에서 혈액을 샘플링한다: 정적-상태 혈장 노출을 결정하기 위해 0, 1, 3 및 6시간(24시간은 투약전 샘플과 동일하다고 가정함).
3.9.4 조직학
희생 시, 각각의 래트의 우측 경골을 수집하고 나서, 조직학적 분석을 위해 처리한다. 4% 폼알데하이드 중에서 48시간의 고정 후에, 경골을 7일 동안 탈회시키고, 그리고 2등분으로 절단한 후 맞대어 파라핀에 포매시킨다. 5개의 일련의 절편을 200㎛ 간격으로 절단하여, 뼈의 중간 부분의 약 1.5㎜를 뒤덮는다. 하나의 일련의 슬라이드를 형태학적 평가 및 OARSI 스코어링을 위해 사프라닌 O(Safranin O) 및 밝은 녹색으로 염색한다. 연골세포 밀도 측정을 위해 다른 일련의 슬라이드에 DAPI를 장착한다.
경골 고평부에서 골관절염을 반영하는 연골 손상 정도를 평가하고, 연골 병변의 등급 및 단계에 기반한 OARSI 방법을 이용하여 스코어링한다(Pritzker et al, 2006). 두 상이한 판독기에 의해 맹검 방식으로 OARSI 스코어링을 평가한다. 각각의 경골에 대해, 하나의 스코어는 5개 절편의 OARSI 스코어의 중위로 본다.
통계학적 분석을 위해, 그룹의 중위를 계층화된 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정 다음에 던넷 다중 비교 사후 검정과 비교한다.
유의도 수준: ns: 통계학적으로 유의하지 않음; MNX-비히클에 대해 *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001. 모든 연구 그룹에 대해 통계학적 분석을 행한다.
3.10 - 비-알코올성 지방간염(NASH)의 식이요법-유도 마우스 모델
이 모델은 NASH를 유도하기 위해 60kcal% 지방 및 0.1% 메티오닌으로 이루어진 콜린-결여, L-아미노산-한정된, 고지방식(CDAHFD)을 사용한다.
3.10.1 연구 그룹 및 용량 요법:
C57/BL6 마우스(찰스 리버)를 이하에 제시하는 바와 같이 그룹으로 나누고, 마우스는 유도기의 개시 시 8주이다(20그램 이상).
Figure pct00106
3.10.2 물질 및 화합물
Figure pct00107
CDAHFD; 리서치 다이어츠 인코포레이티드(Research Diets Inc.), 참조 번호 A06071302
Figure pct00108
대조군 식이요법: 정상 식이요법(VRF 1, P), 스페셜 다이어츠 서비스(Special Diets Services)
3.10.3 치료 프로토콜:
유도기: 4주 동안
비-알코올성 지방간염(NASH)를 유도하기 위해, 동물에 콜린-결여, L-아미노산-한정된, 고지방식(CDAHFD)을 공급할 것이다.
치료기: 6주 동안
마우스를 처리군에 무작위로 할당하고 나서, 평가기까지 상기 표에 제시된 스케줄에 따라 치료하였다.
3.10.4 - 샘플링
정상 상태 PK 샘플링 - 혈장을 생성하기 위해 K2-EDTA 관에서 혈액을 수집할 것이다. 수집 30분 내에 원심분리(4℃에서 10분 동안 5,000rpm)에 의해 모든 혈액 샘플을 혈장에 대해 가공할 것이다. 각각의 혈액 샘플로부터의 혈장을 액체 질소에서 빠르게 냉동시키고, 분석까지 -80℃에서 유지시킨 냉동기에 저장하였다.
최종 혈액 샘플 - 프로테아제 저해제를 함유하는 혈청 제제에 대해 혈액을 관에 수집할 것이다. 모든 혈액 샘플을 원심분리에 의해 처리할 것이다(4℃에서 15분 동안 3,500rpm). 얻은 혈청 샘플의 분취액을 추가 분석까지 -80℃에서 냉동저장할 것이다.
조직 샘플: 간을 채취하고 나서, 좌측엽의 일부를 RNA 유전자 발현 분석, TG 분석을 위해 저장하고, OH 프롤린 측정을 위해 절편화하고 나서, 나머지를 조직병리학적 평가를 위해 10% 포말린에 넣는다. 조직병리학적 평가는 섬유증 정도를 평가하기 위해 시리우스 레드로 염색한 절편, 및 대식세포 축적을 평가하기 위해 F4/80으로 염색한 절편을 포함한다.
유전자 발현 분석을 위해 6가지 섬유증 유전자(Col1A1, Timp1, Pai1, CTGF, TGFβ 및 Acta2), 염증 유전자(TNFα, IL10 및 CCL2) 및 2가지의 하우스키핑 유전자 패널을 사용한다.
3.10.5 결과
이 모델에서 시험할 때 화합물 1은 섬유증 유전자 패널에서 Pai1, TIMP1, CTGF 및 TGFβ의 발현 수준에 대해, (도 3) 그리고 염증 패널에서 모든 3가지 유전자에 대해(도 4) 적어도 가장 높은 용량에 대해 유의한 효과를 나타내었다. 추가적으로 이는 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID으로 하이드록시 프롤린 수준에 대해 유의한 효과(도 5), 15㎎/㎏/QD 및 15㎎/㎏/BID로 시리우스 레드 섬유증 정량화에 대해 유의한 효과(도 6), 및 15㎎/㎏/BID로 F4/80 정량화에 대해 유의한 효과(도 7)를 나타내었다.
4 CYP 저해
cDNA-발현된 인간 사이토크롬 P450 동종효소 및 형광 대사물질로 대사되는 비형광 기질을 이용하여 인간 사이토크롬 P450 동종효소(CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 및 3A4)에 대한 시험 화합물의 저해 잠재력을 평가한다.
화합물을 3.3 및 10μM로 시험하며, 최종 DMSO 농도는 0.3%이다. 화합물을 15분 동안 효소와 함께 인큐베이션시킨 후에 보조인자-기질 혼합물을 첨가한다. CYP3A4(BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 456202), CYP2C9(BD 바이오사이언시즈, 456258), CYP2C19(BD 바이오사이언시즈, 456259) 및 CYP1A2(BD 바이오사이언시즈, 456203) 분석을 위한 보조인자 혼합물에서의 최종 반응 농도는 다음과 같다: 0.4U/㎖ 글루코스-6-포스페이트-탈수소효소(G6PDH, 로슈, 10165875001), 3.3mM MgCl2(시그마, M2670), 3.3mM D-글루코스-6-포스페이트(시그마, G7879) 및 1.3mM NADP+ (시그마, N0505). CYP2D6(BD 바이오사이언시즈, 456217)에 대해, 분석에서 최종 반응 농도는 0.4U/㎖ G6PDH, 0.41mM MgCl2, 0.41mM D-글루코스-6-포스페이트 및 8.2μM NADP+이다. 효소 및 기질의 농도는 0으로 보고한다. 인큐베이션 기간 후에, 중단 용액을 첨가함으로써 반응을 중단시킨다. 기질로서 DBF에 의한 실험을 위해, 2N NaOH 중단 용액을 사용하는 한편, 모든 다른 기질에 대해, 중단 용액은 80% MeCN/20% 0.5M 트리스 염기이다.
형광은 적절한 여기 및 방출 파장에서 퍼킨엘머 엔비전(PerkinElmer EnVision)(등록상표) 판독기 상에서 즉시(CEC, AMMC, BFC에 대해), 또는 20분 후에(기질로서 DBF를 사용하여 CYP2C9 및 CYP3A4에 대해) 판독한다(cf. 0).
이어서, 데이터를 블랭크 샘플에 정규화시킴으로써 시험 화합물에 의한 CYP의 저해 백분율을 계산한다: 100% 저해는 효소/기질 혼합물의 첨가 전의 블랭크 샘플이고, 0% 저해는 효소 반응이 일어난 후(50분)의 중단된 블랭크 샘플이다.
Figure pct00109
5 시간-의존적 CYP3A4 저해
풀링한 HLM에서 평가되는 화합물에 의한 시간-의존적 CYP3A4 저해는 문헌[Gri㎜ et al. Drug Metabolism and Disposition 2009, 37, 1355-1370] 및 문헌[draft FDA Guidance for Industry (Drug Interaction Studies - Study Design, Data Analysis, Implications for Dosing, and Labeling Reco㎜endations), 2006, http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm]에 따른 IC 50 결정을 통해 결정한다. 프로브 기질로서 테스토스테론을 사용하고, 트롤레안도마이신을 양성 대조군으로서 사용한다
SEQUENCE LISTING <110> Galapagos NV Calchan Limited <120> PYRROLOPYRIMIDINE AND PYRROLOPYRIDINE DERIVATIVES <130> GAL-C-P2188PCT (CALCH-232-WO-PCT) <150> GB1711234.3 <151> 2017-07-12 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Peptide <400> 1 Gly Thr Phe Arg Ala Ala Ile Arg Arg Leu Ala Ala Arg Arg Arg 1 5 10 15

Claims (11)

  1. 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물, 또는 용매화물의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는 생물학적 활성 대사물질:
    Figure pct00110

    식 중,
    R1은 H, CH3, F 또는 Cl이고;
    X는 N, CH 또는 C-CN이며; 그리고
    R2는 CH3 또는 할로겐이다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 F인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2가 CH3인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X가 CH인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X가 C-CN인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X가 N인, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 하기로부터 선택되는, 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
    2-아미노-5-플루오로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드,
    2-아미노-5-메틸-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드,
    2-아미노-5-클로로-N-[1-(5-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-피리딘-4-카복스아마이드,
    2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]피리딘-4-카복스아마이드,
    2-아미노-N-[1-(5-클로로-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드,
    2-아미노-N-[1-(5-사이아노-3-메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드, 및
    2-아미노-N-[1-(3-클로로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)-4-피페리딜]-5-플루오로-피리딘-4-카복스아마이드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 약제학적으로 허용 가능 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  9. 의학에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물.
  10. 통증, 염증성 병태, 심혈관계 질환, 신경퇴행성 질환, 신경학적 질환, 당뇨병 합병증, 암 및/또는 섬유증 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 제8항에 따른 약제학적 조성물.
  11. 하기 단계들을 포함하는 제1항에 따른 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물, 또는 용매화물의 약제학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 생물학적 활성 대사물질의 제조 방법:
    (a) 하기 화학식 II의 화합물을 하기 화학식 III의 화합물 또는 이의 보호된 유도체와 반응시키는 단계:
    Figure pct00111

    (식 중 X 및 R2는 제1항에 명시된 바와 같음)
    Figure pct00112

    (식 중, R1은 제1항에 명시된 바와 같음);
    (b) 화학식 I의 화합물의 보호된 유도체의 탈보호 단계;
    (c) 화학식 I의 화합물 또는 이의 보호된 유도체의 화학식 I의 추가적인 화합물 또는 이의 보호된 유도체로의 상호 전환 단계; 및
    (d) 화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 선택적 형성 단계.
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