CN101238220A - 回收经过裂解的生物质作为对核黄素的发酵生产的营养培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在发酵过程中再循环生物质的方法,其中通过一种特殊方法处理在发酵产物生产过程中形成的生物质,并将其再循环到该***中。在发酵生产维生素特别是维生素B2的过程中,所处理的生物质可以再次用作发酵的培养基成分。
Description
本发明涉及一种在发酵过程中再循环生物质的方法,其中通过一种特殊方法处理在发酵产物生产过程中形成的生物质,并将其再循环到该***中。在发酵生产维生素特别是维生素B2的过程中,所处理的生物质可以再次用作发酵的培养基成分。
包括维生素在内的许多有商业价值的产品现在都是通过发酵生产的。例如被认为是所有细菌、动物和植物的必需维生素的维生素B2(核黄素)。与可以自身合成核黄素的植物和细菌相反,高等动物(例如脊椎动物)必须通过食物来补充核黄素。
在发酵结束之后,通常首先将发酵产物与其他成分分离,并且有可能进一步将其纯化,这会导致发酵产物产量的损失。形成的生物质,尽管非常富能,但通常还是作为副产物未加利用,并且必须在花费相当大的成本和资源的情况下才能处理(贮存、堆肥、焚烧)。
已知的发酵方法的另一个缺点是发酵本身的成本高,这是由向培养基中供给原料造成的。例如使用酵母抽提物以使微生物更好地生长。
本发明的目的是开发一种改进的发酵方法,该方法一方面能节约成本和资源,另一方面还保证发酵产物的最佳产量和纯度。
现在令人惊奇地发现,通过在发酵期间使用处理过的生物质(“生物质再循环”)作为培养基成分,可以不必添加酵母抽提物。此外,还可以通过所选择的处理过程中的条件来提高发酵产物的纯度和产量。
本发明尤其涉及一种在发酵过程中再循环生物质的方法。
术语“再循环生物质”和“再循环的生物质”在这里是指处理过的和再循环的和/或再次使用的生物质。在适宜的条件下处理在发酵过程中形成的生物质,以便可以将其再次补给(再循环)到***即发明过程中。其中所述处理包括分离和分解,以及必要的话进一步纯化、浓缩的步骤。再循环的生物质可以替代其他通常添加到培养基中以使微生物更好地生长的培养基成分。此类可以被再循环的生物质替代的成分的例子是酵母抽提物。
本发明还涉及一种通过/使用再循环的生物质来发酵生产发酵产物例如维生素的方法。
本方法可以用于所有可以发酵生产的维生素。优选的维生素是B族(B-Komplex)维生素或生物素。优选的B族维生素是核黄素、泛酸、硫胺素、叶酸和吡哆醇,包括它们的盐形式和衍生物。特别优选的是核黄素,包括其盐和衍生物例如核黄素-磷酸盐。在本发明中产物即通过发酵生产的核黄素也称作“发酵产物”。
根据本发明的用于生产维生素的发酵方法可以以分批、补料分批、连续或半连续的方式来实施。该方法可以包括在适宜的生长条件下培养微生物尤其是重组微生物的细胞,例如通过在含有微生物生长和生成发酵产物所必需的所有底物的适宜的培养基中接种微生物。接种培养基受一定的物理-化学参数影响,例如温度、pH和通风,它们允许生物质的最佳生长和发酵产物的积累。这些参数可根据所使用的微生物和要生产的产品有很大变化。例如发酵可以在好氧或厌氧条件下进行。经验地确定这些参数的方法对于专家来说是已知的。
在发酵结束之后,可以将含有生物质和所期望(未纯化)的发酵产物等的细胞抽提物与发酵液分离并进一步分解,例如在所谓的“下游处理”中进一步处理。用于分离和纯化的方法对于专家是已知的。因此可以将发酵产物与培养基和其他成分例如微生物分离。在本申请中“分离”是指,例如产物是通过过滤、离心和/或萃取来纯化或至少部分纯化的。随后对产物的纯化可以例如通过从水性溶剂向有机溶剂中重结晶或通过使用另外的对于专家来说已知的方法例如离子交换、尺寸排除(大小排除)或疏水色谱来进行。
在发酵生产核黄素的情况下,核黄素以晶体的形式从培养基中离析出来,可以通过离心来实现其从发酵液中的分离。然后以已知的方式纯化核黄素,也可参见EP 730034 A1或Bretzel et al.,Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology(1999)22,19-26。
在本申请中,与包括发酵产物和生物质在内的细胞抽提物相关的术语“再纯化”、“分解”和“处理”是被同义使用的。
用于处理来自发酵的细胞抽提物的公知的方法是例如物理的、化学的或生物的分解法。化学分解包括例如用强酸或碱、溶剂或表面活性剂处理。对于物理分解,有机械法例如超声波或压力(高压均质)和非机械法例如渗透压冲击、质壁分离、冷冻/融化或热分解之分。生物法包括用酶、抗生素、噬菌体处理或自溶。
根据本发明的对于发酵之后对细胞抽提物的处理可以通过物理、化学或生物分解来实施。自溶是优选的。在本发明中术语“细胞抽提物”是指由发酵形成的细胞的抽提物,其可以以未经纯化的形式存在并且可以含有生物质和发酵产物等。
对细胞抽提物的处理,例如通过自溶,可以紧接着发酵进行,即分解直接源于发酵液。在这种情况下,处理的细胞抽提物含有生物质和发酵产物等。也可以在发酵结束后首先通过本领域的技术人员已知的方法从发酵液中分离和/或浓缩生物质,然后再对生物质进行处理,例如通过自溶。
在本发明的一个优选实施方案中,对细胞抽提物的处理可以直接在发酵之后进行,即先前并不对发酵产物例如核黄素进行分离。在发酵之后紧接着诱导处理,优选自溶。例如可以通过温度的变化来进行诱导。
在本发明的一个实施方案中,通过自溶来实施对细胞抽提物的处理。取决于微生物和条件,自溶时间可以为约1小时~数天,尤其是约8小时、16小时或24小时。通过测定细胞干重(ZTM)可以确定溶菌度(Lysegrad),当ZTM的值保持恒定时可以终止自溶。测定的ZTM越低,溶菌度越高。用于测定ZTM的方法对于本领域的技术人员是已知的。优选自溶进行约24小时。
自溶期间的适宜pH值可以为约6.0~约9.0,优选为约6.0~约8.5,特别是约6.5~约8.0。特别优选pH值为约6.5~约7.5。在pH值6.5~7.5时获得最佳结果。
自溶期间的适宜温度可以在约30摄氏度~约60摄氏度的范围内变化,优选约30摄氏度~约50摄氏度,特别优选约35摄氏度~约45摄氏度。在温度为约40摄氏度~约45摄氏度时获得最佳结果。
在本发明的一个实施方案中,通过在约6.5~约8.0的pH值和约35摄氏度~约45摄氏度的温度下自溶约24小时来进行对细胞抽提物的处理。
在本发明的另一个实施方案中,通过在约6.5~约7.5的pH值和约40摄氏度~约45摄氏度的温度下自溶约24小时来进行对细胞抽提物的处理。
为了优化细胞抽提物的处理,可以在另外的酶例如水解酶或蛋白酶(内切蛋白酶和外切蛋白酶)存在下进行自溶。酶的量可以例如为ZTM的1.5%,酶的添加可以例如在自溶开始之后的约1~5小时进行。在其他条件保持不变的情况下,通过添加这些酶可以将ZTM降低多达50%。此外,这还导致溶菌度提高多达50%、自溶时间缩短和产品质量的提高,即发酵产品的纯度更高(假如如上所述的那样在发酵之后紧接着就进行自溶的话)。这样的蛋白酶的非限制性例子为Alcalase(Calbiochem),Amano N、Umimazyme、Amano P、Pepdidase R(均为Amano Enzymes Europe Ltd.产品),或Promod(BiocatalystsLtd.)。
在本发明的一个实施方案中,通过在约6.5~约7.5的pH和约40摄氏度~约45摄氏度的温度、在使用所认可的蛋白酶的情况下自溶约24小时来进行所述处理。优选内切和外切蛋白酶的混合物。
可以在维生素的发酵生产中使用再循环的生物质(处理过的生物质抽提物)。
因此本发明涉及一种用于维生素尤其是核黄素的发酵生产的方法,其包括(a)在允许发酵产物生产的条件下、在适宜的培养基中发酵微生物,和(b)对生物质的处理,尤其是通过自溶。
可以将生物质从如上所述的那样制备的细胞抽提物中分离出来,或将其与剩余生物质和发酵产物分开,并随后对其进行进一步纯化和/或浓缩。对溶菌产物的纯化可以通过例如错流过滤进行,浓缩可以通过例如降流蒸发器(Fallstromverampfer)进行。这样制备的经过处理的生物质抽提物可以在发酵过程中用作或再次用作培养基成分。在本发明中,通过自溶处理的(生物质)抽提物也称为“溶菌产物”。经过处理的生物质抽提物或溶菌产物可以在发酵过程中用做酵母抽提物的替代品,酵母抽提物通常在发酵中被添加到培养基中以促进生长。这意味着在上述适当的处理之后生物质的一次再循环。基于酵母抽提物的碳含量,其为本领域技术人员所公知,测定所处理的生物质抽提物的碳含量,例如通过CHN-元素分析仪。这样在培养基(发酵培养基)中用经处理的生物质抽提物按1∶1(基于碳含量)的比例替代酵母抽提物。
因此本发明涉及一种用于维生素特别是核黄素的发酵生产的方法,其包括下列步骤:
(a)在允许维生素产生的条件下和适宜的培养基中,用于生产维生素的微生物发酵;
(b)细胞抽提物的处理,尤其是通过自溶,其中所述处理紧接着发酵进行;
(c)从含有维生素和剩余生物质的发酵液中分离经处理的生物质;
(d)所处理的生物质的纯化和浓缩;和
(e)在重复步骤(a)~(b)的情况下将(经处理的)生物质抽提物反馈到发酵过程中,其中在没有在培养基中添加酵母抽提物的情况下进行发酵。
涉及步骤(a)~(e)的优选实施方案如上所述。
适用于实施本发明的微生物可以是所有适合于发酵生产上面所指出的产物的微生物,例如用于生产核黄素的微生物。所述微生物可以选自埃希氏菌(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、蓝藻菌(Cyanobacter)、链霉菌(Streptomyces)和棒状杆菌(Corynebakterien)。重组的和非重组的微生物都可以使用。
适合于核黄素生产的微生物的一个例子是杆菌。优选杆菌属的不产芽胞微生物,特别是枯草杆菌(B.subtilis),尤其优选B.subtilis RB 50。最优选B.subtilis RB50::(pRF69)n::(pRF93)m(Perkins et al.,J.Ind.Microbiol Biotechnol 22:8-18,1999)。
B.subtilis RB 50被于1989年5月23日按照布达佩斯条约以No.NRRL B-18502保藏在农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research Culture Collection(NRRL),Peoria,IL,USA)。质粒pRF69被于1990年6约6日按照布达佩斯条约以No.ATTCC 68338保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection(ATCC),Rockville,MD,USA)。质粒pRF93描述在EP 0,821,063中。
在一个实施方案中,本发明涉及一种用于生产核黄素的方法,其包括:
(a)在允许生产核黄素的条件下和适宜的培养基中,用枯草杆菌属微生物进行发酵;
(b)在约6.5~约7.5的pH值和约45摄氏度的温度自溶约24小时;
(c)从含有核黄素和其他生物质的发酵液中分离出经处理的生物质;
(d)对所处理的生物质进行纯化和浓缩;和
(e)在重复步骤(a)~(b)的情况下将枯草杆菌溶菌产物反馈到发酵过程中,其中在没有在培养基中添加酵母抽提物的情况下进行发酵。
在本发明的另一个方面中要求了一种生产核黄素的方法,其中通过借助于如上所述的自溶来处理发酵液可以提高所获得的核黄素的产量和纯度。
本发明尤其涉及一种生产核黄素的方法,其包括:
(a)在允许生产核黄素的条件下和适宜的培养基中,用枯草杆菌属微生物进行发酵,
(b)令在步骤(a)中形成的含有发酵生成的核黄素的发酵液自溶,
(c)对核黄素的分离,和必要时,
(d)对核黄素的纯化。
用于分离和纯化核黄素的方法如上所述,并且对于本领域的技术人员是已知的。在如上所述的条件下进行自溶。通过该方法可以获得高达2%、4%、6%、10%、20%或30%,的产量提高,其中在步骤(b)之前和之后测定核黄素的浓度。因此优选在发酵之后紧接着进行自溶的方法。
在一个优选的实施方案中,要求了一种用于生产核黄素的方法,其包括:
(a)在允许生产核黄素的条件下和适宜的培养基中,用枯草杆菌属微生物进行发酵;
(b)将在步骤(a)中形成的发酵液在约6.5~约7.5的pH值和约45摄氏度的温度自溶约24小时;
(c)将经处理的生物质和核黄素与其余的成分分离;
(d)对核黄素的纯化以及对经处理的生物质的纯化和浓缩;和
(e)在重复步骤(a)~(b)的情况下将枯草杆菌溶菌产物反馈到发酵过程中,其中在没有在培养基中添加酵母抽提物的情况下进行发酵。
如上所述,可以任选使用不同的酶来帮助自溶。
本发明的另一方面涉及核黄素合成酶,该酶催化枯草杆菌中生物合成生产的最后一步,即6,7-二甲基-8-ribityllumazine(DMRL)向核黄素的转化。上述方法导致核黄素合成酶酶活的提高。例如该酶的酶活可以通过DMRL向核黄素的转化速率来测定。
以上所述的生产核黄素的方法还进一步导致发酵产物纯度的提高,这可以例如通过核黄素晶体中的DNA含量的减少来测量。在通过重组微生物来生产核黄素时这尤其重要。测定DNA含量的方法,例如PCR,对于本领域的技术人员来说是已知的。
实施例
实施例1:培养技术和分析方法
为了制备核黄素,通过流加发酵的方式将枯草杆菌菌株RB50::(pRF69)n::(pRF93)m在葡萄糖受限的培养基中培养48小时(Perkins et al.,J.Ind.MicrobiolBiotechnol 22:8-18,1999)。
根据生物干重(BTM)测定生物质的生长。通过在RT(室温)冷却发酵液,测定生物干重。然后将10ml放入先前称过重量的试管中并且于11000g进行离心。除去上清液并将沉淀于95摄氏度干燥至少24小时直到重量恒定为止。BTM为所测定的GTM(总干重)减去核黄素的含量(通过HPLC测定核黄素的含量)。
实施例2:通过压力制备抽提物(物理分解)
在核黄素发酵结束之后(见实施例1),将获得的发酵液于4250g离心并分离生物质。用50mM磷酸钾钠缓冲液(pH7.0)洗涤三次并测定蛋白质含量以及BTM。将生物质在高压均质机(Microfluidizer M110-EH,Microfluidcs,Newton,MA,USA)于1900巴分解,共通过3次(两种喷嘴***,1.喷嘴:200μm;2.100μm)。
实施例3:通过自溶制备抽提物(生物分解)
为了确定自溶的最佳温度,将由实施例1获得的核黄素含量>20g/l的发酵液在搅拌而没有引入空气的情况下于恒定pH值7.0和表1中所示的温度诱导24小时。然后基于BTM测定溶菌度(见表1)。在40~45摄氏度的温度获得最佳自溶。
表1:自溶与温度的关系
温度[摄氏度] | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 |
BTM[%] | 56.9 | 53.2 | 43.5 | 51.2 | 68.8 | 74.4 | 86.5 |
为了确定自溶的最佳pH值,将由实施例1获得的核黄素含量>20g/l的发酵液在搅拌而没有引入空气的情况下于恒定温度40摄氏度和表2中所示的pH值诱导24小时。然后基于BTM测定溶菌度(见表2)。在6.5~7.5pH值的温度获得最佳自溶。
表2:自溶与pH值的关系
pH | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 | 8.5 | 9.0 |
BTM[%] | 100 | 91.9 | 62.7 | 44.5 | 45.9 | 43.5 | 46.1 | 69.9 | 69.1 |
由这些结果可以得出,对于最佳自溶在温度为40~45摄氏度时pH值调节为6.5~7.5。为了减小污染危险而又不使用防腐剂,可使用45摄氏度之上的温度。
在另外的试验系列中,试验了在不同蛋白酶存在下的自溶,并且考察了不同蛋白酶对于溶菌度的影响。
使用了下列蛋白酶:Alcalase(Calbiochem,San Diego,CA,USA)、Amano N,Amano P,Umimazyme,Peptidase R(均来自Amano Enzyme Europe Ltd,ChippingNorton,U.K.)以及Promod 194P(Biocatalysts Ltd,Treforest,U.K)。
如上所述的那样在pH6.5和/或7.5(45摄氏度,24小时)进行自溶,按照表3使用或不使用上述酶。然后基于BTM测定溶菌度。在自溶过程中通过添加内切蛋白酶,溶菌度最高可提高20%(见表3)。
实施例4:通过反馈生物质抽提物制备核黄素
通过错流过滤(截取分子量10kDa)从悬浮物中纯化由实施例3制得的抽提物,并且如实施例1中的那样使用之,其中基于碳平衡按1∶1使用酵母抽提物。获得如下结果(见表3)。
表3:通过反馈生物质的核黄素生产
核黄素浓度[%] | 产率[%] | |
对照(酵母抽提物) | 100 | 100 |
杆菌菌体分解产物(由经洗涤的生物质制得) | 90.7 | 93.6 |
杆菌菌体分解产物(由未经洗涤的生物质制得) | 78.7 | 77.7 |
Claims (14)
1. 在发酵过程中再循环生物质的方法,所述方法包括,处理在发酵形成的细胞抽提物,以将所处理的生物质反馈到发酵过程中。
2. 发酵生产维生素的方法,所述方法在使用根据权利要求1制备的再循环的生物质的情况下进行。
3. 根据权利2的方法,其中所述维生素选自核黄素、泛酸、生物素、吡哆醇和叶酸,特别是核黄素。
4. 根据上述权利要求之一的方法,其中通过物理、化学或机械溶解特别是通过自溶对细胞抽提物进行处理。
5. 根据权利要求4的方法,其中所述自溶在pH值约6.0~约9.0特别是约6.0~约8.5、在温度约30摄氏度~约60摄氏度特别是约30摄氏度~约50摄氏度进行约24小时。
6. 根据权利要求5的方法,其中所述自溶在pH值约6.5~约7.5和温度约40摄氏度~约45摄氏度进行约24小时。
7. 根据上述权利要求之一的方法,其中在给定蛋白酶的存在下通过自溶进行对生物质的处理。
8. 根据上述权利要求之一的方法,其中对所述生物质的处理紧接着发酵进行,中间不***纯化步骤。
9. 根据上述权利要求之一的方法,其包括下列步骤:
(a)在允许维生素产生的条件下和适宜的培养基中,用用于生产维生素特别是核黄素的微生物进行发酵;
(b)生物质的处理,尤其是通过自溶,其中所述处理紧接着发酵进行;
(c)从含有维生素和剩余生物质的发酵液中分离经处理的生物质;
(d)所处理的生物质的纯化和浓缩;和
(e)在重复步骤(a)~(b)的情况下将经处理的生物质抽提物反馈到发酵过程中,其中在没有在培养基中添加酵母抽提物的情况下进行发酵。
10. 根据权利要求9的用于生产核黄素的方法,其中步骤(b)中的所述处理通过在约6.5~约7.5的pH值和约45摄氏度的温度自溶约24小时来进行。
11. 根据前述权利要求之一的方法,其中在发酵期间所使用微生物选自埃希氏菌(Escherichi)、杆菌(Bacillus)、蓝藻菌(Cyanobacter)、链霉菌(Streptomyces)和棒状杆菌(Corynebakterien),特别是杆菌。
12. 根据权利要求11的方法,其中在发酵中所使用的微生物是枯草杆菌,特别是不产芽胞的枯草杆菌。
13. 根据权利要求12的方法,其中在发酵中所使用的微生物是枯草杆菌RB50,特别是RB5::(RF69)n::(pRF93)m。
14. 根据前述权利要求2~13之一所述的方法,其包括:
(a)在允许产生核黄素的条件下和适宜的培养基中,进行对微生物枯草杆菌的发酵;
(b)用由步骤(a)形成的发酵液在约6.5~约7.5的pH和约45摄氏度的温度自溶约24小时;
(c)将所处理的生物质和核黄素与其他成分分离;
(d)对核黄素的纯化以及对经处理的生物质的纯化和浓缩;和
(e)在重复步骤(a)~(b)的情况下将枯草杆菌菌体溶菌产物反馈到发酵过程中,其中在没有在培养基中添加酵母抽提物的情况下进行发酵。
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