JP7118117B2 - 抗体-薬物コンジュゲートの選択的製造方法 - Google Patents
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Description
(1)
(i)緩衝液中、抗体を還元剤と反応させ、鎖間ジスルフィドを還元する工程;および、
(ii)(i)で得られたチオール基を有する抗体に対して、薬物リンカー中間体を反応させる工程;
を含む、抗体-薬物コンジュゲート組成物の製造方法であって、
(i)の工程の反応温度が、-10~10℃であり、
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上である、
ことを特徴とする、製造方法。
(2)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、平均薬物結合数が4.0~4.1である、(1)に記載の製造方法。
(3)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~90%の範囲である、(1)または(2)に記載の製造方法。
(4)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~80%の範囲である、(3)に記載の製造方法。
(5)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~70%の範囲である、(4)に記載の製造方法。
(6)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~60%の範囲である、(5)に記載の製造方法。
(7)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、(1)~(6)のいずれか1項に記載の製造方法。
(8)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、(7)に記載の製造方法。
(9)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、(1)~(8)のいずれか1項に記載の製造方法。
(10)
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、(1)~(8)のいずれか1項に記載の製造方法。
(11)
(i)の工程の反応温度が、-5~5℃である、(1)~(10)のいずれか1項に記載の製造方法。
(12)
(i)の工程の反応温度が、-3~3℃である、(11)に記載の製造方法。
(13)
(i)の工程の反応温度が、0~2℃である、(12)に記載の製造方法。
(14)
(i)の工程の反応温度が、0~1℃である、(13)に記載の製造方法。
(15)
(ii)の工程の反応温度が、0~2℃である、(1)~(14)のいずれか1項に記載の製造方法。
(16)
還元剤が抗体一分子あたり2~3モル当量で用いられる、(1)~(15)のいずれか1項に記載の製造方法。
(17)
還元剤がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその塩である、(1)~(16)のいずれか1項に記載の製造方法。
(18)
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンの塩がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩である、(17)に記載の製造方法。
(19)
緩衝液が、ヒスチジンバッファーである、(1)~(18)のいずれか1項に記載の製造方法。
(20)
緩衝液が、キレート剤を含む、(1)~(19)のいずれか1項に記載の製造方法。
(21)
キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、(20)に記載の製造方法。
(22)
抗体が、抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、または抗HER2抗体である、(1)~(21)のいずれか1項に記載の製造方法。
(23)
抗体が、抗TROP2抗体である、(22)に記載の製造方法。
(24)
抗体が、抗CD98抗体である、(22)に記載の製造方法。
(25)
抗体が、抗B7-H3抗体である、(22)に記載の製造方法。
(26)
抗体が、抗HER2抗体である、(22)に記載の製造方法。
(27)
薬物リンカー中間体が、N-置換マレイミジル基を有する、(1)~(26)のいずれか1項に記載の製造方法。
(28)
薬物リンカー中間体が、
(29)
薬物リンカー中間体が、
(30)
(1)~(29)のいずれか1項に記載の製造方法によって製造される、抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(31)
平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上である、抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(32)
平均薬物結合数が4.0~4.1である、(31)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(33)
重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~90%の範囲である、(31)または(32)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(34)
重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~80%の範囲である、(33)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(35)
重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~70%の範囲である、(34)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(36)
重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~60%の範囲である、(35)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(37)
重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、(31)~(36)のいずれか1項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(38)
重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、(37)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(39)
重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、(31)~(38)のいずれか1項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(40)
重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、(39)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(41)
抗体が、抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、または抗HER2抗体である、(31)~(40)のいずれか1項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(42)
抗体が、抗TROP2抗体である、(41)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(43)
抗体が、抗CD98抗体である、(41)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(44)
抗体が、抗B7-H3抗体である、(41)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(45)
抗体が、抗HER2抗体である、(41)に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物。
(46)
薬物リンカーが、
(47)
薬物リンカーが、
(48)
(30)~(47)のいずれか1項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物を含有する、医薬組成物。
(49)
腫瘍および/または癌の治療のための、(48)に記載の医薬組成物。
(50)
肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多型神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、子宮体癌、頭頸部癌、食道癌、胆道癌、甲状腺癌、リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、および/または多発性骨髄腫の治療のための、(49)に記載の医薬組成物。
(51)
(30)~(47)のいずれか1項に記載の抗体-薬物コンジュゲート組成物を投与することを特徴とする、腫瘍および/または癌の治療方法。
(52)
肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多型神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、子宮体癌、頭頸部癌、食道癌、胆道癌、甲状腺癌、リンパ腫、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、および/または多発性骨髄腫の治療方法である、(51)に記載の治療方法。
(53)
緩衝液中、抗体を還元剤と反応させ、鎖間ジスルフィドを還元する工程、を含む、チオール基を有する抗体の製造方法であって、
反応温度が、-10~10℃であり、
製造されるチオール基を有する抗体が、平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、
ことを特徴とする、製造方法。
(54)
製造されるチオール基を有する抗体が、平均薬物結合数が4.0~4.1である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(53)に記載の製造方法。
(55)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~90%の範囲である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(53)または(54)に記載の製造方法。
(56)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~80%の範囲である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(55)に記載の製造方法。
(57)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~70%の範囲である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(56)に記載の製造方法。
(58)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~60%の範囲である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(57)に記載の製造方法。
(59)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(53)~(58)のいずれか1項に記載の製造方法。
(60)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(59)に記載の製造方法。
(61)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(53)~(60)のいずれか1項に記載の製造方法。
(62)
製造されるチオール基を有する抗体が、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、抗体-薬物コンジュゲート組成物を製造するために用いられる、(61)に記載の製造方法。
(63)
反応温度が、-5~5℃である、(53)~(62)のいずれか1項に記載の製造方法。
(64)
反応温度が、-3~3℃である、(63)に記載の製造方法。
(65)
反応温度が、0~2℃である、(64)に記載の製造方法。
(66)
反応温度が、0~1℃である、(65)に記載の製造方法。
(67)
還元剤が抗体一分子あたり2~3モル当量で用いられる、(53)~(66)のいずれか1項に記載の製造方法。
(68)
還元剤がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその塩である、(53)~(67)のいずれか1項に記載の製造方法。
(69)
トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンの塩がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩である、(68)に記載の製造方法。
(70)
緩衝液が、ヒスチジンバッファーである、(53)~(69)のいずれか1項に記載の製造方法。
(71)
緩衝液が、キレート剤を含む、(53)~(70)のいずれか1項に記載の製造方法。
(72)
キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、(71)に記載の製造方法。
(73)
抗体が、抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、または抗HER2抗体である、(53)~(72)のいずれか1項に記載の製造方法。
(74)
抗体が、抗TROP2抗体である、(73)に記載の製造方法。
(75)
抗体が、抗CD98抗体である、(73)に記載の製造方法。
(76)
抗体が、抗B7-H3抗体である、(73)に記載の製造方法。
(77)
抗体が、抗HER2抗体である、(73)に記載の製造方法。
本発明に用いられる抗体は、目的抗原、例えば、腫瘍特異抗原(TAA)または腫瘍関連抗原(TSA)に対して産生されうる。かかる抗体は、腫瘍細胞を認識できる特性、かかる腫瘍細胞に結合できる特性、および、かかる腫瘍細胞内に取り込まれて内在化する特性を有する。
本発明に用いられる薬物は、抗腫瘍効果を有する化合物であって、リンカー構造に結合できる置換基、部分構造を有するものであれば特に制限はない。薬物は、リンカーの一部または全部が腫瘍細胞内で切断されて抗腫瘍性化合物部分が遊離されて抗腫瘍効果が発現される。リンカーが薬物との結合部分で切断されれば抗腫瘍性化合物が本来の構造で遊離され、その本来の抗腫瘍効果が発揮される。薬物は、抗体に特定の構造のリンカー部分を介して結合させるが、本明細書では、この薬物とリンカー部分を含めた薬物リンカーを薬物と称することもある。
本発明に用いられる薬物はリンカーを介して抗体に結合されうる。本発明に用いられるリンカーは、好ましくはN-置換マレイミジル基を有する。リンカーは、開裂型リンカーおよび非開裂型リンカーを挙げることができる。開裂型リンカーとしては、例えば、リソソームプロテアーゼ、エンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって開裂するペプチドリンカーを挙げることができる。
本発明に用いられる薬物リンカー中間体は、上記リンカー化合物のカルボキシル基と抗腫瘍化合物のアミノ基とを縮合剤を用いるなどして反応させることにより製造することができる。
5.抗体-薬物コンジュゲート
抗体-薬物コンジュゲートにおいて、抗体1分子への薬物の結合数は、その有効性、安全性に影響する重要因子である。抗体には4つの鎖間ジスルフィドが存在し、ジスルフィドは2つのチオール基から構成されるため、抗体1分子への薬物の結合数は、2個、4個、6個、または8個となる。
薬物リンカーとしては、好ましくは、
抗体-薬物コンジュゲートの製造は、薬物の結合数が制御されるよう、反応させる原料・試薬の使用量などの反応条件を規定して実施されるが、低分子化合物の化学反応とは異なり、異なる数の薬物が結合した混合物として得られるのが通常である。抗体1分子への薬物の結合数は平均値、すなわち、平均薬物結合数として特定され、表記される。
チオール基を有する抗体は、緩衝液中、-10~10℃で抗体を還元剤と反応させることにより製造することができる。
還元剤としては、例えば、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその塩、ジチオトレイトール、2-メルカプトエタノールなどを用いることができ、好ましくはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその塩であり、より好ましくはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩である。
第一工程で得られたチオール基を有する抗体に薬物リンカー中間体を反応させることにより、抗体―薬物コンジュゲート組成物を製造することができる。用いる薬物リンカー中間体の量としては、抗体1分子当たり、2~10モル当量であり、好ましくは4~6モル当量である。
製造した抗体-薬物コンジュゲート組成物は、以下の操作によって濃縮、バッファー交換、精製、抗体濃度および平均薬物結合数の測定を行い、抗体-薬物コンジュゲート組成物の同定を行うことができる。
Amicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)の容器内に抗体または抗体-薬物コンジュゲート溶液を入れ、遠心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter, Inc.)を用いた遠心操作(2000G~3800Gにて5~20分間遠心)にて、抗体または抗体-薬物コンジュゲート溶液を濃縮することができる。
UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行うことができる。その際に、抗体ごとに異なる280nm吸光係数(1.3mLmg-1cm-1~1.8mLmg-1cm-1)を用いる。
Sephadex G-25担体を使用したNAP-25カラム(Cat. No. 17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム(137mM)およびエチレンジアミン四酢酸(5mM)を含むリン酸緩衝液(10mM、pH6.0;本明細書において「PBS6.0/EDTA」という場合がある。)にて平衡化する。このNAP-25カラム一本につき、抗体水溶液2.5mLをのせたのち、PBS6.0/EDTA 3.5mLで溶出させた画分(3.5mL)を分取する。この画分を上記(1)と同様の方法で濃縮し、上記(2)と同様の方法で抗体濃度の測定を行ったのちに、PBS6.0/EDTAを用いて抗体濃度を調整することができる。
Sorbitol(5%)を含む酢酸緩衝液(10mM、pH5.5;本明細書において「ABS」という場合がある。)にてNAP-25カラムを平衡化する。このNAP-25カラムに、抗体-薬物コンジュゲート反応水溶液(2.5mL)をのせ、メーカー規定の量の緩衝液で溶出させることで、抗体画分を分取した。この分取画分を再びNAP-25カラムにのせ、緩衝液で溶出させるゲルろ過精製操作を計2~3回繰り返すことで、未結合の薬物リンカー中間体や低分子化合物(トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、N-アセチル-L-システインおよびジメチルスルホキシド)を除いた抗体-薬物コンジュゲート組成物を得る。
(5-1)HPLC測定方法
HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
検出器:紫外吸光度計(測定波長:280nm)
カラム:TSKgel Butyl-NPR(4.6×100mm、2.5μm;東ソー株式会社)
カラム温度:30℃
移動相A:1.5M硫酸アンモニウムを含む、25mMリン酸バッファー(pH7.0)水溶液
移動相B:25mMリン酸バッファー(pH7.0)を75%とイソプロピルアルコールを25%含む混合溶液
グラジエントプログラム:20%-60%(0分-20分)、20%-80%(20-20.1分)、80%-80%(20.1―23分)、80%-20%(23分―23.1分)、20%-20%(23.1分―40分)
サンプル注入量:2μL
本データは、カラムの特性から、薬物結合数の低い抗体-薬物コンジュゲートから順に塩濃度の差により溶出されるため、その各々の面積値を測定する事により、結合数の分布が推定できる。そのピークは、溶出順にD0(薬物リンカーが結合していない抗体)、D2、D4-1、D4-2、D6、D8となり、その分布状況を把握できる。
抗体-薬物コンジュゲート組成物における結合薬物濃度は、抗体-薬物コンジュゲート水溶液の280nmおよび370nmの二波長におけるUV吸光度を測定したのちに下記の計算を行うことで、算出することができる。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CD+εA,280CA 式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CD+εA,370CA 式(2)
ここで、A280は280nmにおける抗体-薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、A370は370nmにおける抗体-薬物コンジュゲート水溶液の吸光度を示し、AA,280は280nmにおける抗体の吸光度を示し、AA,370は370nmにおける抗体の吸光度を示し、AD,280は280nmにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、AD,370は370nmにおけるコンジュゲート前駆体の吸光度を示し、εA,280は280nmにおける抗体のモル吸光係数を示し、εA,370は370nmにおける抗体のモル吸光係数を示し、εD,280は280nmにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、εD,370は370nmにおけるコンジュゲート前駆体のモル吸光係数を示し、CAは抗体-薬物コンジュゲート組成物における抗体濃度を示し、CDは抗体-薬物コンジュゲート組成物における薬物濃度を示す。
抗体-薬物コンジュゲート組成物における抗体一分子あたりの平均薬物結合数は、前述のUV法に加え、以下の逆層クロマトグラフィー(Reversed Phase Chromatography(RPC))法を用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によっても求めることができる。
抗体-薬物コンジュゲート溶液(約1mg/mL、60μL)をジチオトレイトール(DTT)水溶液(100mM、15μL)と混合する。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体-薬物コンジュゲートの鎖間のジスルフィドを切断したサンプルを、HPLC分析に用いる。
HPLC分析を、下記の測定条件にて行う。
検出器:紫外吸光度計(測定波長:280nm)
カラム:PLRP-S(2.1×50mm、8μm、1000Å;Agilent Technologies、P/N PL1912-1802)
カラム温度:80℃
移動相A:0.04%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液
移動相B:0.04%TFAを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム:29%-36%(0分-12.5分)、36%-42%(12.5-15分)、42%-29%(15分-15.1分)、29%-29%(15.1分-25分)
サンプル注入量:15μL
(7-3-1)薬物の結合していない抗体の軽鎖(L0)および重鎖(H0)に対して、薬物の結合した軽鎖(薬物が一つ結合した軽鎖:L1)および重鎖(薬物が一つ結合した重鎖:H1、薬物が二つ結合した重鎖:H2、薬物が三つ結合した重鎖:H3)は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増し保持時間が大きくなることから、L0、L1、H0、H1、H2、H3の順に溶出される。L0およびH0との保持時間比較により検出ピークをL0、L1、H0、H1、H2、H3のいずれかに割り当てることができる。
本発明により得られる抗体-薬物コンジュゲート組成物は、腫瘍細胞内に移動した後にリンカー部分が切断され、腫瘍細胞内で薬物が遊離される。
(i)ヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)発現ベクターの構築
配列表の配列番号2に示すヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号36~437に示されるヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD-Plus-(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA-G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn-Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA-G1/hTINA1-H1」と命名した。
プライマーセット
5’-agctcccagatgggtgctgagc-3’(配列番号21:プライマー EG-Inf-F)
5’-gggcccttggtggaggctgagc-3’(配列番号22:プライマー EG1-Inf-R)
配列表の配列番号4に示すヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号38~402に示されるヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD-Plus-(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA-LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn-Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA-LK/hTINA1-L1」と命名した。
プライマーセット
5’-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3’(配列番号23:プライマー CM-LKF)
5’-ggagggggcggccaccgtacg-3’(配列番号24:プライマー KCL-Inf-R)
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1.2×109個のFreeStyle 293F細胞(Invitrogen社)を3L Fernbach Erlenmeyer Flask(CORNING社)に播種し、FreeStyle293 expression medium(Invitrogen社)で希釈して1.0×106細胞/mLに調製した後に、37℃、8% CO2インキュベーター内で90rpmで一時間振とう培養した。Polyethyleneimine(Polyscience #24765;3.6mg)をOpti-Pro SFM(Invitrogen社;20mL)に溶解し、次にPureLink HiPure Plasmidキット(Invitrogen社)を用いて調製した軽鎖発現ベクター(0.8mg)および重鎖発現ベクター(0.4mg)をOpti-Pro SFM(Invitrogen社;20mL)に添加した。Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM混合液(20mL)に、発現ベクター/Opti-Pro SFM混合液(20mL)を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。37℃、8% CO2インキュベーターで7日間、90rpmで振とう培養して得られた培養上清をDisposable Capsule Filter(ADVANTEC #CCS-045-E1H)でろ過した。
(iii)で得られた培養上清から抗体を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー(4-6℃)とセラミックハイドロキシアパタイト(室温)の2段階工程で精製した。rProtein Aアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックハイドロキシアパタイト精製後のバッファー置換工程は4-6℃で実施した。最初に、培養上清を、PBSで平衡化したMabSelect SuRe(GE Healthcare Bioscience社製、HiTrapカラム)にアプライした。培養上清がカラムに全て入った後、カラム容量2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液(pH4.0)で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)によりPBSに置換した後、5mMリン酸ナトリウム/50mM MES/pH7.0のバッファーで5倍希釈した抗体溶液を、5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシアパタイトカラム(日本バイオラッド、Bio-Scale CHTType-I Hydroxyapatite Column)にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)によりHBSor(25mM ヒスチジン/5% ソルビトール、pH6.0)への液置換を行った。最後にCentrifugal UF Filter Device VIVASPIN20(分画分子量UF10K,Sartorius社,4℃)にて濃縮し、IgG濃度を20mg/mL以上に調製して精製サンプルとした。
(iv)にて作製したヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)を、Sephadex G-25担体を使用したNAP-25カラム(Cat. No. 17-0852-02、GE Healthcare Japan Corporation)を、メーカー規定の方法に従い、塩化ナトリウム(137mM)およびエチレンジアミン四酢酸(5mM)を含むリン酸緩衝液(10mM、pH6.0;本明細書において「PBS6.0/EDTA」という場合がある。)にて平衡化した。このNAP-25カラム一本につき、抗体水溶液2.5mLをのせたのち、PBS6.0/EDTA 3.5mLで溶出させた画分(3.5mL)を分取した。この画分をAmicon Ultra(50,000 MWCO、Millipore Corporation)の容器内に抗体溶液を入れ、遠心機(Allegra X-15R、Beckman Coulter, Inc.)を用いた遠心操作(2000G~3800Gにて5~20分間遠心)にて、抗体溶液を濃縮した。UV測定器(Nanodrop 1000、Thermo Fisher Scientific Inc.)を用いて、メーカー規定の方法に従い、抗体濃度の測定を行った。その際に、280nm吸光係数(1.54mLmg-1cm-1)を用いて抗体濃度の測定を行ったのちに、PBS6.0/EDTAを用いて21.8mg/mLに抗体濃度を調整した。
(実施例2)薬物リンカー中間体の作製
次式で表される、N-[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキサノイル]グリシルグリシル-L-フェニルアラニル-N-[(2-{[(1S,9S)-9-エチル-5-フルオロ-9-ヒドロキシ-4-メチル-10,13-ジオキソ-2,3,9,10,13,15-ヘキサヒドロ-1H,12H-ベンゾ[de]ピラノ[3’,4’:6,7]インドリジノ[1,2-b]キノリン-1-イル]アミノ}-2-オキソエトキシ)メチル]グリシンアミドを、WO2014/057687の実施例58の方法に従って合成した。
(実施例3-1)従来の方法によるヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1) ADC組成物の作製
(i)抗体の還元
ヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)(15mL:327mg相当、濃度21.8mg/mL;25mM ヒスチジンバッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、25mMヒスチジンバッファー(18mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(0.027mL;抗体に対し6当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20水溶液(0.033mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.12に調整した。24℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩水溶液(1.58mL;抗体一分子に対して2.45当量)を加え、内温を35~36℃になるように3時間加温し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を冷却し、内温16~17℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.67mg/mL 50%アセトン水溶液(1.71mL;抗体一分子に対して5.2当量)を60分かけて加え、同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン水溶液(0.135mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量500mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC組成物を含有する溶液を17.6mL得た。
[共通操作A]抗体-薬物コンジュゲート組成物における抗体一分子あたりの平均薬物結合数の測定
抗体-薬物コンジュゲート組成物における抗体一分子あたりの平均薬物結合数は、以下の方法を用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析によって求めた。
抗体-薬物コンジュゲート溶液(約1mg/mL、60μL)をジチオトレイトール(DTT)水溶液(100mM、15μL)と混合した。混合物を37℃で30分インキュベートすることで、抗体-薬物コンジュゲートの重鎖-軽鎖間および重鎖-重鎖間のジスルフィドを切断したサンプルを、HPLC分析に用いた。
HPLC分析を、下記の測定条件にて行った。
検出器:紫外吸光度計(測定波長:280nm)
カラム:PLRP-S(2.1×50mm、8μm、1000Å;Agilent Technologies)
カラム温度:80℃
移動相A:0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液
移動相B:0.04%TFAを含むアセトニトリル溶液
グラジエントプログラム:29%-36%(0分-12.5分)、36%-42%(12.5-15分)、42%-29%(15分―15.1分)、29%-29%(15.1分―25分)
サンプル注入量:15μL
薬物の結合していない抗体の軽鎖(L0)および重鎖(H0)に対して、薬物の結合した軽鎖(薬物が一つ結合した軽鎖:L1)および重鎖(薬物が一つ結合した重鎖:H1、薬物が二つ結合した重鎖:H2、薬物が三つ結合した重鎖:H3)は、結合した薬物の数に比例して疎水性が増し保持時間が大きくなることから、L0、L1、H0、H1、H2、H3の順に溶出される。L0およびH0との保持時間比較により検出ピークをL0、L1、H0、H1、H2、H3のいずれかに割り当てた。
抗体濃度:16.49mg/mL、抗体収量:290mg(86%)、共通操作A にて測定された抗体一分子あたりの平均薬物結合数(n):4.4であった。各鎖ピーク面積比(%)を表したHPLCクロマトグラフを図5に示す。
1.HPLC測定方法
HPLC分析を、下記の測定条件にて行った。
検出器:紫外吸光度計(測定波長:280nm)
カラム:TSKgel Butyl-NPR(4.6×100mm、2.5μm;東ソー株式会社)
カラム温度:30℃
移動相A:1.5M硫酸アンモニウムを含む、25mMリン酸バッファー(pH7.0)水溶液
移動相B:25mMリン酸バッファー(pH7.0)を75%とイソプロピルアルコールを25%含む混合溶液
グラジエントプログラム:20%-60%(0分-20分)、20%-80%(20-20.1分)、80%-80%(20.1―23分)、80%-20%(23分―23.1分)、20%-20%(23.1分―40分)
サンプル注入量:2μL
本データは、カラムの特性から、薬物結合数の低い抗体-薬物コンジュゲートから順に塩濃度の差により溶出されるため、その各々の面積値を測定する事により、薬物結合数の分布を推定した。そのピークは、溶出順にD0(薬物リンカーが結合していないもの)、D2、D4-1、D4-2、D6、D8となり、その分布状況は、D0:4.8%、D2:16.8%、D4-1:24.6%、D4-2:13.1%、D6:24.8%、D8:12.6%であった(図6)。
(i)抗体の還元
ヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)(22.9mL:500mg相当、濃度21.8mg/mL;25mMヒスチジンバッファー)を、ガラス反応容器に入れ、更に、25mM ヒスチジンバッファー(22mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(0.0344mL;抗体に対し5当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20水溶液(0.050ml;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.12に調整し、冷却した。攪拌下、内温0~1℃にて、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩水溶液(2.54mL;抗体一分子に対して2.58当量)を加え、内温0~1℃にて6時間攪拌加し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液に、内温0~2℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.03mg/mL 50%アセトン水溶液(2.99mL;抗体一分子に対して5.1当量)を10分かけて加え、同温度にて、40分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン水溶液(0.206 mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて10分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量700mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC組成物を含有する溶液を23.6mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として27640を、重鎖のモル吸光係数として83810を推定値として用いた。
従来の方法により作製されたヒト化抗TROP2抗体ADC組成物(実施例3-1)の平均薬物結合数は4.4であり、D4-1の含有率は24.6%であった。一方、本発明の方法により作製されたヒト化抗TROP2抗体ADC組成物(実施例3-2)の平均薬物結合数は4.1であり、D4-1の含有率は53.3%であった。
(i)ヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)発現ベクターの構築
配列番号11に示すヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号58~405に示されるヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片(ヌクレオチド番号36~422)を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD-Plus-(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでhM23-H1の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体IgG1タイプ重鎖発現ベクターpCMA-G1を制限酵素BlpIで切断した箇所にIn-Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA-G1/hM23-H1」と命名した。
プライマーセット
5’-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3’(配列番号21:プライマー EG-Inf-F)
5’-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3’(配列番号22:プライマー EG1-Inf-R)
配列番号13に示すヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号61~405に示されるヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片(ヌクレオチド番号38~420)を合成した(GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片をテンプレートとして、KOD-Plus-(TOYOBO社)と下記のプライマーセットでヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)の可変領域をコードするDNA配列を含むDNA断片を増幅し、キメラおよびヒト化抗体軽鎖発現ベクターpCMA-LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所にIn-Fusion HD PCRクローニングキット(CLONTECH社)を用いて挿入することによりヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「pCMA-LK/hM23-L1」と命名した。
プライマーセット
5’-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3’(配列番号23:プライマー CM-LKF)
5’-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3’(配列番号24:プライマー KCL-Inf-R)
ヒト化抗CD98抗体を実施例1の(iii)と同様の方法で生産した。pCMA-G1/hM23-H1とpCMA-LK/hM23-L1との組合せによって取得されたヒト化抗CD98抗体を「hM23-H1L1」と命名した。
(iii)で得られた培養上清から抗体を実施例1の(iv)と同様の方法で精製した。
(iv)にて精製したヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)を実施例1の(v)と同様の方法でバッファー交換および濃度調整した。その際に、280nm吸光係数(1.65mLmg-1cm-1)を用いて抗体濃度の測定を行ったのちに、PBS6.0/EDTAを用いて40mg/mLに抗体濃度を調整した。
(実施例5-1)従来の方法によるヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC組成物の作製
(i)抗体の還元
ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)(12mL:480mg相当、濃度40mg/mL;25mMヒスチジンバッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、25mMヒスチジンバッファー(36mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.0394mL;抗体に対し6当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20(日油株式会社)水溶液(0.048mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.10に調整した。21℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(Nacalai Tesque, Inc.)水溶液(2.17mL;抗体一分子に対して2.31当量)を加え、内温を35~36℃になるように3時間加温し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を冷却し、内温17~18℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.20mg/mL 50%アセトン水溶液(2.74mL;抗体一分子に対して5.0当量)を7分かけて加え、同温度にて、40分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン(キシダ化学)水溶液(0.197mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて30分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量600mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC組成物を含有する溶液を21.6mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として41370を、重鎖のモル吸光係数として77810を推定値として用いた。
(i)抗体の還元
ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)(12.5mL:500mg相当、濃度40mg/mL;25mMヒスチジンバッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、25mMヒスチジンバッファー(27.5mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.041mL;抗体に対し6当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20(日油株式会社)水溶液(0.050mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.10に調整した。反応液を冷却し、内温0~1℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(Nacalai Tesque, Inc.)水溶液(2.75mL;抗体一分子に対して2.80当量)を加え、内温を0~1℃になるように6時間攪拌し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を内温0.7-1.2℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.08mg/mL 50%アセトン水溶液(3.14mL;抗体一分子に対して5.4当量)を10分かけて加え、同温度にて、50分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン(キシダ化学)水溶液(0.205mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて30分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量600mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC組成物を含有する溶液を23.6mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗CD98抗体(hM23-H1L1)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として41370を、重鎖のモル吸光係数として77810を推定値として用いた。
従来の方法により作製されたヒト化抗CD98抗体ADC組成物(実施例5-1)の平均薬物結合数は4.0であり、D4-1の含有率は27.8%であった。一方、本発明の方法により作製されたヒト化抗CD98抗体ADC組成物(実施例5-2)の平均薬物結合数は4.1であり、D4-1の含有率は51.0%であった。
(実施例6)ヒト化抗B7-H3抗体ADC組成物の作製
(実施例6-1)従来の方法によるヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC組成物の作製
(i)抗体の還元
ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)(WO2014/057687の参考例1の方法に従って作製、12.4mL:250mg相当、濃度20.1mg/mL;25mMクエン酸バッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、25mMヒスチジンバッファー(18mL、pH7.5)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.018mL;抗体に対し5当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート80(日油株式会社)水溶液(0.013mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.02に調整した。35℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(Nacalai Tesque, Inc.)水溶液(1.05mL;抗体一分子に対して2.15当量)を加え、内温を35~36℃になるように2時間加温し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を冷却し、内温15~16℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.22mg/mL 50%アセトン水溶液(1.36mL;抗体一分子に対して4.8当量)を4分かけて加え、同温度にて、20分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン(キシダ化学)水溶液(0.102mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量300mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC組成物を含有する溶液を13.1mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として30160を、重鎖のモル吸光係数として87250を推定値として用いた。
(i)抗体の還元
ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)(WO2014/057687の参考例1の方法に従って作製、27.1mL:500mg相当、濃度18.5mg/mL;10mMヒスチジンバッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、10mMヒスチジン水溶液(25mL)を加えた。本反応液に、精製白糖(MERCK;1.25g)と0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.041mL;抗体に対し6当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート80(日油株式会社)水溶液(0.050mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.08に調整した。反応液を冷却し、内温0~1℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(Nacalai Tesque, Inc.)水溶液(2.08mL;抗体一分子に対して2.13当量)を加え、内温を0~1℃になるように5.5時間攪拌し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を内温0~1℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.04mg/mL 50%アセトン水溶液(2.82mL;抗体一分子に対して4.8当量)を20分かけて加え、同温度にて、20分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン(キシダ化学)水溶液(0.205mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量800mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC組成物を含有する溶液を23.6mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として30160を、重鎖のモル吸光係数として87250を推定値として用いた。
従来の方法により作製されたヒト化抗B7-H3抗体ADC組成物(実施例6-1)の平均薬物結合数は3.8であり、D4-1の含有率は27.9%であった。一方、本発明の方法により作製されたヒト化抗B7-H3抗体ADC組成物(実施例6-2)の平均薬物結合数は4.1であり、D4-1の含有率は58.4%であった。
(i)抗体の還元
ヒト化抗HER2抗体(トラスツズマブ;米国特許第5821337号)(22.3mL:500mg相当、濃度22.4mg/mL;25mM ヒスチジンバッファー)をガラス反応容器に入れ、更に、25mMヒスチジンバッファー(27mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(0.034mL;抗体に対し5当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20水溶液(0.050mL;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.12に調整した。22℃攪拌下に、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩水溶液(2.12mL;抗体一分子に対して2.15当量)を加え、内温を22~25℃になるように3時間攪拌し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液を冷却し、内温11~13℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.15mg/mL 50%アセトン水溶液(2.77mL;抗体一分子に対して4.8当量)を20分かけて加え、同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン水溶液(0.206mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて20分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量600mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗HER2抗体ADC組成物を含有する溶液を22.7mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗HER2抗体(トラスツズマブ)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として26150を、重鎖のモル吸光係数として81290を推定値として用いた。
(実施例7-2)本発明の方法によるヒト化抗HER2抗体ADC組成物の作製
ヒト化抗HER2抗体(トラスツズマブ;米国特許第5821337号)(22.3mL:500mg相当、濃度22.4mg/mL;25mMヒスチジンバッファー)を、ガラス反応容器に入れ、更に、25mM ヒスチジンバッファー(25mL、pH5.0)を加えた。本反応液に、0.5M EDTA水溶液(0.034mL;抗体に対し5当量)を加えたのち、0.1g/mLポリソルベート20水溶液(0.050ml;抗体に対し0.01%)を添加した後、0.3Mリン酸水素二ナトリウム水溶液を加え、pH7.13に調整し、冷却した。攪拌下、内温0~1℃にて、1.00mg/mL トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩水溶液(2.37mL;抗体一分子に対して2.40当量)を加え、内温0~1℃にて6時間攪拌加し、抗体の鎖間ジスルフィドを還元した。
上記(i)で得られた溶液に、内温0~2℃にて、攪拌下、実施例2で得た化合物の6.14mg/mL 50%アセトン水溶液(2.84mL;抗体一分子に対して4.9当量)を10分かけて加え、同温度にて、40分間撹拌し、薬物リンカー中間体を抗体へ結合させた。次に、50mM N-アセチルシステイン水溶液(0.206 mL;抗体一分子に対して3当量)を加え、さらに同温度にて50分間撹拌し、薬物リンカー中間体の反応を停止させたのち、10%酢酸水溶液を用いて、pH5.0に調整した。
上記(ii)で得られた溶液を、Pellicon XL(日本ミリポア株式会社、50cm2)を用い、ローラーポンプにて、10mMヒスチジンバッファー(pH5.0)を加えながら循環させ、排水量600mLになるまで洗浄作業を行い、低分子を除去した。その後、濃縮を行い、ヒト化抗HER2抗体ADC組成物を含有する溶液を21.7mL得た。
実施例3-1の(iv)に記載の共通操作Aと同様に平均薬物結合数を測定した。ヒト化抗HER2抗体(トラスツズマブ)の場合、そのアミノ酸配列に従って、軽鎖のモル吸光係数として26150を、重鎖のモル吸光係数として81290を推定値として用いた。
従来の方法により作製されたヒト化抗HER2抗体ADC組成物(実施例7-1)の平均薬物結合数は3.9であり、D4-1の含有率は34.1%であった。一方、本発明の方法により作製されたヒト化抗HER2抗体ADC組成物(実施例7-2)の平均薬物結合数は4.0であり、D4-1の含有率は55.2%であった。
実施例3、4、6、および7の結果から、平均薬物結合数は、従来の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物および本発明の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物ともに、3.5~4.5であった。一方、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率は、従来の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物では35%以下であるのに対し、本発明の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物では50%以上であった。このように、本発明の製造方法を用いることにより、平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上である抗体-薬物コンジュゲート組成物を選択的に製造できることが示された。
試験例2の結果から、本発明の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物は、従来の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物よりも優れた安全性を有することが示された。
以上により、本発明の抗体-薬物コンジュゲート組成物(平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上である抗体-薬物コンジュゲート組成物)は、従来の製造方法により製造された抗体-薬物コンジュゲート組成物(平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が35%以下である抗体-薬物コンジュゲート組成物)よりも優れた安全性を有することが示された。
配列番号2:ヒト化抗TROP2抗体重鎖(hTINA1-H1)のアミノ酸配列
配列番号3:ヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)のヌクレオチド配列
配列番号4:ヒト化抗TROP2抗体軽鎖(hTINA1-L1)のアミノ酸配列
配列番号5:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号6:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号7:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号8:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号9:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRL2のアミノ酸配列
配列番号10:抗TROP2抗体(TINA1)のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号11:ヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)のヌクレオチド配列
配列番号12:ヒト化抗CD98抗体重鎖(hM23-H1)のアミノ酸配列
配列番号13:ヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)のヌクレオチド配列
配列番号14:ヒト化抗CD98抗体軽鎖(hM23-L1)のアミノ酸配列
配列番号15:抗CD98抗体(M23)のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号16:抗CD98抗体(M23)のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号17:抗CD98抗体(M23)のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号18:抗CD98抗体(M23)のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号19:抗CD98抗体(M23)のCDRL2のアミノ酸配列
配列番号20:抗CD98抗体(M23)のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号21:プライマーEG-Inf-Fのヌクレオチド配列
配列番号22:プライマーEG1-Inf-Rのヌクレオチド配列
配列番号23:プライマーCM-LKFのヌクレオチド配列
配列番号24:プライマーKCL-Inf-Rのヌクレオチド配列
配列番号25:ヒト化抗B7-H3抗体重鎖(M30-H1)のアミノ酸配列
配列番号26:ヒト化抗B7-H3抗体軽鎖(M30-L4)のアミノ酸配列
配列番号27:抗B7-H3抗体(M30)のCDRH1のアミノ酸配列
配列番号28:抗B7-H3抗体(M30)のCDRH2のアミノ酸配列
配列番号29:抗B7-H3抗体(M30)のCDRH3のアミノ酸配列
配列番号30:抗B7-H3抗体(M30)のCDRL1のアミノ酸配列
配列番号31:抗B7-H3抗体(M30)のCDRL2のアミノ酸配列
配列番号32:抗B7-H3抗体(M30)のCDRL3のアミノ酸配列
配列番号33:ヒト化抗HER2抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号34:ヒト化抗HER2抗体軽鎖のアミノ酸配列
Claims (24)
- (i)緩衝液中、抗体を還元剤と反応させ、鎖間ジスルフィドを還元する工程、および、
(ii)(i)で得られたチオール基を有する抗体に対して、薬物リンカー中間体を反応させる工程を含む、抗体-薬物コンジュゲート組成物の製造方法であって、
(i)の工程の反応温度が、-10~10℃であり、
製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、平均薬物結合数が3.5~4.5であり、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50%以上であり、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲート組成物の含有率が5%以下である、
ことを特徴とする、製造方法。 - 製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、平均薬物結合数が4.0~4.1である、請求項1に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~90%の範囲である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~80%の範囲である、請求項3に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~70%の範囲である、請求項4に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲート組成物の、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が50~60%の範囲である、請求項5に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲートの、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが4個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、請求項6に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲートの、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が5%以下である、請求項1-7のいずれか1項に記載の製造方法。
- 製造される抗体-薬物コンジュゲートの、重鎖-重鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合し、重鎖-軽鎖間チオールに薬物リンカーが2個結合した抗体-薬物コンジュゲートの含有率が1%以下である、請求項8に記載の製造方法。
- 反応温度が、-5~5℃である、請求項1-9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 反応温度が、-3~3℃である、請求項10に記載の製造方法。
- 反応温度が、0~2℃である、請求項11に記載の製造方法。
- 反応温度が、0~1℃である、請求項12に記載の製造方法。
- 還元剤が抗体一分子あたり2~3モル当量で用いられる、請求項1-13のいずれか1項に記載の製造方法。
- 還元剤がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンまたはその塩である、請求項1-14のいずれか1項に記載の製造方法。
- トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンの塩がトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩である、請求項15に記載の製造方法。
- 緩衝液が、ヒスチジンバッファーである、請求項1-16のいずれか1項に記載の製造方法。
- 緩衝液が、キレート剤を含む、請求項1-17のいずれか1項に記載の製造方法。
- キレート剤がエチレンジアミン四酢酸である、請求項18に記載の製造方法。
- 抗体が、抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体、または抗HER2抗体である、請求項1-19のいずれか1項に記載の製造方法。
- 抗体が、抗TROP2抗体である、請求項20に記載の製造方法。
- 抗体が、抗CD98抗体である、請求項20に記載の製造方法。
- 抗体が、抗B7-H3抗体である、請求項20に記載の製造方法。
- 抗体が、抗HER2抗体である、請求項20に記載の製造方法。
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