CN107922477B - 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法 - Google Patents

用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法 Download PDF

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Abstract

用于产生抗体‑药物缀合物组合物的方法,其包括:(i)使抗体与还原剂在缓冲液中反应以还原链间二硫化物的步骤,和(ii)使药物接头中间体与步骤(i)中获得的具有硫醇基的抗体反应的步骤,其中步骤(i)中的反应温度为‑10℃至10℃,且产生的抗体‑药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目是3.5至4.5,并且产生的抗体‑药物缀合物组合物中的其中4个药物接头与重‑轻链间硫醇结合的抗体‑药物缀合物的含量是50%或更多;和抗体‑药物缀合物组合物,其中,其中结合药物的平均数目是3.5至4.5的抗体‑药物缀合物的含量和其中4个药物接头与重‑轻链间硫醇结合的抗体‑药物缀合物的含量是50%或更多。

Description

用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
技术领域
本发明涉及用于产生其中结合药物的数目和结合位点受控制的抗体-药物缀合物组合物的方法以及其中结合药物的数目和结合位点受控制的抗体-药物缀合物组合物。
背景技术
可以预期,通过使具有细胞毒性的药物结合至与能够在癌细胞表面上表达的抗原结合的抗体且通过内化于细胞中而形成的抗体-药物缀合物(在下文中也称为“ADC”)能够选择性地将药物递送至癌细胞,使得其引起药物在癌细胞内累积并杀死癌细胞(参见非专利文献1至3)。作为此抗体-药物缀合物,通过使作为喜树碱衍生物的依喜替康结合至抗B7-H3抗体等而形成的抗体-药物缀合物是已知的(专利文献1)。
抗体具有四个链间二硫化物。这些链间二硫化物比其他二硫化物更容易被溶剂接近,并且容易被还原。因此,此链间二硫化物可以用作抗体-药物缀合物中与药物(或药物接头)的结合位点。抗体中的此链间二硫化物被还原,然后使药物与因此产生的硫醇基结合,由此产生其中2至8个药物与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物。此外,存在已知用于选择性产生具有与重-重链间硫醇结合的四个药物接头的抗体-药物缀合物的方法,其中所述方法包括首先完全还原抗体中的链间二硫化物,将产生的链间硫醇中的一些再氧化以使其返回至二硫化物,然后使药物与剩余的链间硫醇结合(专利文献2)。然而,用于选择性产生具有与重-轻链间硫醇结合的四个药物接头的抗体-药物缀合物的方法还是未知的。
引文列表
专利文献
专利文献1:国际公开号WO2014/057687
专利文献2:国际公开号WO2005/084390
非专利文献
非专利文献1:Ducry,L.,等人,Bioconjugate Chem.(2010)21,5-13。
非专利文献2:Alley,S.C.,等人,Current Opinion in Chemical Biology(2010)14,529-537。
非专利文献3:Damle N.K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2004)4,1445-1452。
发明概述
技术问题
其中8个药物与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物在抗肿瘤效果方面是优异的,但在某些情况下在安全性诸如副作用和毒性方面可引起问题。因此,为了减少副作用或毒性,在维持治疗效力的同时,存在使用其中结合药物的平均数小于8的抗体-药物缀合物的情况。其中结合药物的平均数小于8的此抗体-药物缀合物可以通过例如使药物与抗体反应、同时控制每个抗体分子的药物量来获得。反应产物是抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的数目是2、4、6和8。因此,可能存在这样的情况,其中,即使抗体-药物缀合物组合物具有与彼此相同的结合药物的平均数目,如果它们各自具有不同的结合药物的数目的分布,则其疗效和毒性彼此不同。也就是说,当其中结合药物的平均数目为4的抗体-药物缀合物组合物中结合药物的数目为0和8的抗体-药物缀合物的含量高时,当与其中结合药物的数目为4的抗体-药物缀合物的含量高的情况相比,其治疗效果可能降低,并且可能表现出强烈的毒性。此外,还可能存在这样的情况,其中,即使抗体-药物缀合物具有与彼此相同的结合药物的数目,其治疗效力和毒性由于药物的结合位点的差异而彼此不同。因此,期望开发用于产生抗体-药物缀合物组合物的方法,其中在抗体-药物缀合物组合物的产生中控制结合药物的数目和结合位点。
问题的解决方案
作为针对实现上述目的而进行的深入研究的结果,本发明人已发现了操作更简单的用于产生其中结合药物的数目和结合位点受控制的抗体-药物缀合物组合物的方法。也就是说,本发明人已经发现可以通过使用还原剂在缓冲液中在-10℃至10℃的温度下还原抗体且然后使药物接头中间体与获得的具有硫醇基的抗体反应来产生抗体-药物缀合物组合物,其中抗体-药物缀合物(其中结合药物的平均数目是3.5至4.5且四个药物接头与重-轻链间硫醇结合)的含量为50%或更多。此外,本发明人也已经发现,本发明的抗体-药物缀合物组合物具有比通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物(即抗体-药物缀合物组合物,其中抗体-药物缀合物(其中结合药物的平均数目是3.5至4.5且四个药物接接头与重-轻链间硫醇结合)的含量为35%或更少)更优异的安全性,由此完成本发明。
具体地,本申请的发明涉及以下(1)至(77):
(1)
用于产生抗体-药物缀合物组合物的方法,其包括:
(i)使抗体与还原剂在缓冲液中反应以还原链间二硫化物的步骤;和
(ii)使药物接头中间体与步骤(i)中获得的具有硫醇基的抗体反应的步骤,其中
步骤(i)中的反应温度为-10℃至10℃,且
产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目是3.5至4.5,并且产生的抗体-药物缀合物组合物中的其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是50%或更多。
(2)
根据上述(1)所述的生产方法,其中产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目为4.0至4.1。
(3)
根据上述(1)或(2)所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至90%的范围内。
(4)
根据上述(3)所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至80%的范围内。
(5)
根据上述(4)所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至70%的范围内。
(6)
根据上述(5)所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至60%的范围内。
(7)
根据上述(1)至(6)中任一项所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为5%或更低。
(8)
根据上述(7)所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为1%或更低。
(9)
根据上述(1)至(8)中任一项所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为5%或更低。
(10)
根据上述(1)至(8)中任一项所述的生产方法,其中在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为1%或更低。
(11)
根据上述(1)至(10)中任一项所述的生产方法,其中步骤(i)中的反应温度为-5℃至5℃。
(12)
根据上述(11)所述的生产方法,其中步骤(i)中的反应温度为-3℃至3℃。
(13)
根据上述(12)所述的生产方法,其中步骤(i)中的反应温度为0℃至2℃。
(14)
根据上述(13)所述的生产方法,其中步骤(i)中的反应温度为0℃至1℃。
(15)
根据上述(1)至(14)中任一项所述的生产方法,其中步骤(ii)中的反应温度为0℃至2℃。
(16)
根据上述(1)至(15)中任一项所述的生产方法,其中所述还原剂以每个抗体分子2至3摩尔当量的量使用。
(17)
根据上述(1)至(16)中任一项所述的生产方法,其中所述还原剂为三(2-羧乙基)膦或其盐。
(18)
根据上述(17)所述的生产方法,其中三(2-羧乙基)膦的盐为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
(19)
根据上述(1)至(18)中任一项所述的生产方法,其中所述缓冲液为组氨酸缓冲液。
(20)
根据上述(1)至(19)中任一项所述的生产方法,其中所述缓冲液包含螯合剂。
(21)
根据上述(20)所述的生产方法,其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸。
(22)
根据上述(1)至(21)中任一项所述的生产方法,其中所述抗体为抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体或抗HER2抗体。
(23)
根据上述(22)所述的生产方法,其中所述抗体为抗TROP2抗体。
(24)
根据上述(22)所述的生产方法,其中所述抗体为抗CD98抗体。
(25)
根据上述(22)所述的生产方法,其中所述抗体为抗B7-H3抗体。
(26)
根据上述(22)所述的生产方法,其中所述抗体为抗HER2抗体。
(27)
根据上述(1)至(26)中任一项所述的生产方法,其中所述药物接头中间体具有N-取代的马来酰亚胺基。
(28)
根据上述(27)所述的生产方法,其中
所述药物接头中间体为
[式1]
Figure GDA0002943772440000051
[式2]
Figure GDA0002943772440000052
,或
[式3]
Figure GDA0002943772440000053
其中-GGFG-代表由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基。
(29)
根据上述(28)所述的生产方法,其中
所述药物接头中间体为
[式4]
Figure GDA0002943772440000061
其中-GGFG-代表由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基。
(30)
通过根据上述(1)至(29)中任一项所述的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物。
(31)
抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目是3.5至4.5且其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是50%或更多。
(32)
根据上述(31)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目为4.0至4.1。
(33)
根据上述(31)或(32)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至90%的范围内。
(34)
根据上述(33)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至80%的范围内。
(35)
根据上述(34)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至70%的范围内。
(36)
根据上述(35)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至60%的范围内。
(37)
根据上述(31)至(36)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为5%或更低。
(38)
根据上述(37)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为1%或更低。
(39)
根据上述(31)至(38)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为5%或更低。
(40)
根据上述(39)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为1%或更低。
(41)
根据上述(31)至(40)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物,其中所述抗体为抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体或抗HER2抗体。
(42)
根据上述(41)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中所述抗体为抗TROP2抗体。
(43)
根据上述(41)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中所述抗体为抗CD98抗体。
(44)
根据上述(41)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中所述抗体为抗B7-H3抗体。
(45)
根据上述(41)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中所述抗体为抗HER2抗体。
(46)
根据上述(31)至(45)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物,其中
所述药物接头为
[式5]
Figure GDA0002943772440000071
[式6]
Figure GDA0002943772440000081
,或
[式7]
Figure GDA0002943772440000082
其中A代表与所述抗体的结合位点,且-GGFG-代表由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基。
(47)
根据上述(46)所述的抗体-药物缀合物组合物,其中
所述药物接头为
[式8]
Figure GDA0002943772440000083
其中A代表与所述抗体的结合位点,且-GGFG-代表由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基。
(48)
包含根据上述(30)至(47)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物的药物组合物。
(49)
根据上述(48)所述的药物组合物,其用于***和/或癌症。
(50)
根据上述(49)所述的药物组合物,其用于治疗肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结肠癌、***癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、***、子宫癌、头颈癌、食管癌、胆管癌、甲状腺癌、淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和/或多发性骨髓瘤。
(51)
用于***和/或癌症的方法,其包括施用根据上述(30)至(47)中任一项所述的抗体-药物缀合物组合物。
(52)
根据上述(51)所述的治疗方法,其为用于治疗肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结肠癌、***癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、***、子宫癌、头颈癌、食管癌、胆管癌、甲状腺癌、淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和/或多发性骨髓瘤的方法。
(53)
用于产生具有硫醇基的抗体的方法,其包括使抗体与还原剂在缓冲液中反应以还原链间二硫化物的步骤,其中
反应温度为-10℃至10℃,且
产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目为3.5至4.5,且其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为50%或更多。
(54)
根据上述(53)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目为4.0至4.1。
(55)
根据上述(53)或(54)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至90%的范围内。
(56)
根据上述(55)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至80%的范围内。
(57)
根据上述(56)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至70%的范围内。
(58)
根据上述(57)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在50%至60%的范围内。
(59)
根据上述(53)至(58)中任一项所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在5%或更少的范围内。
(60)
根据上述(59)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中4个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量在1%或更少的范围内。
(61)
根据上述(53)至(60)中任一项所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为5%或更低。
(62)
根据上述(61)所述的生产方法,其中产生的具有硫醇基的抗体用于产生抗体-药物缀合物组合物,其中,其中2个药物接头与重-重链间硫醇结合且2个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为1%或更低。
(63)
根据上述(53)至(62)中任一项所述的生产方法,其中所述反应温度为-5℃至5℃。
(64)
根据上述(63)所述的生产方法,其中所述反应温度为-3℃至3℃。
(65)
根据上述(64)所述的生产方法,其中所述反应温度为0℃至2℃。
(66)
根据上述(65)所述的生产方法,其中所述反应温度为0℃至1℃。
(67)
根据上述(53)至(66)中任一项所述的生产方法,其中所述还原剂以每个抗体分子2至3摩尔当量的量使用。
(68)
根据上述(53)至(67)中任一项所述的生产方法,其中所述还原剂为三(2-羧乙基)膦或其盐。
(69)
根据上述(68)所述的生产方法,其中三(2-羧乙基)膦的盐为三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
(70)
根据上述(53)至(69)中任一项所述的生产方法,其中所述缓冲液为组氨酸缓冲液。
(71)
根据上述(53)至(70)中任一项所述的生产方法,其中所述缓冲液包含螯合剂。
(72)
根据上述(71)所述的生产方法,其中所述螯合剂为乙二胺四乙酸。
(73)
根据上述(53)至(72)中任一项所述的生产方法,其中所述抗体为抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体或抗HER2抗体。
(74)
根据上述(73)所述的生产方法,其中所述抗体为抗TROP2抗体。
(75)
根据上述(73)所述的生产方法,其中所述抗体为抗CD98抗体。
(76)
根据上述(73)所述的生产方法,其中所述抗体为抗B7-H3抗体。
(77)
根据上述(73)所述的生产方法,其中所述抗体为抗HER2抗体。
本发明的有利效果
根据本发明,提供了用于产生其中结合药物的数目和结合位点受控制的抗体-药物缀合物组合物的方法以及其中结合药物的数目和结合位点受控制的抗体-药物缀合物组合物。本发明的抗体-药物缀合物组合物在安全性方面是优异的,并且可用作用于***和/或癌症的药物。另外,由于可以获得其中结合药物的数目和结合位点被控制为恒定的抗体-药物缀合物组合物,其在质量控制方面也是优异的,因此是优选的。
附图简述
[图1]图1是显示人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的核苷酸序列和氨基酸序列的视图。
[图2]图2是显示人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)的核苷酸序列和氨基酸序列的视图。
[图3]图3是显示人源化抗CD98抗体重链(h23M-H1)的核苷酸序列和氨基酸序列的视图。
[图4]图4是显示人源化抗CD98抗体轻链(h23M-L1)的核苷酸序列和氨基酸序列的视图。
[图5]图5是显示通过常规方法产生的人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图6]图6是显示通过常规方法产生的人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图7]图7是显示通过本发明的方法产生的人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图8]图8是显示通过本发明的方法产生的人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图9]图9是显示通过常规方法产生的人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图10]图10是显示通过常规方法产生的人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图11]图11是显示通过本发明的方法产生的人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图12]图12是显示通过本发明的方法产生的人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图13]图13是显示人源化抗B7-H3抗体重链(M30-H1)的氨基酸序列的视图。
[图14]图14是显示人源化抗B7-H3抗体轻链(M30-L4)的氨基酸序列的视图。
[图15]图15是显示通过常规方法产生的人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图16]图16是显示通过常规方法产生的人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图17]图17是显示通过本发明的方法产生的人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图18]图18是显示通过本发明的方法产生的人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图19]图19是显示人源化抗HER2抗体重链的氨基酸序列的视图。
[图20]图20是显示人源化抗HER2抗体轻链的氨基酸序列的视图。
[图21]图21是显示通过常规方法产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图22]图22是显示通过常规方法产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图23]图23是显示通过本发明的方法产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中每条链的峰面积比(%)的图。
[图24]图24是显示通过本发明的方法产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中结合药物的各自数目的分布(%)的图。
[图25]图25是显示通过常规方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的肿瘤生长抑制效果和通过本发明的方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的肿瘤生长抑制效果的图。
实施方案的描述
在本说明书中,术语“癌症”用于具有与术语“肿瘤”的含义相同的含义。
在本说明书中,术语“基因”用于不仅包括DNA,而且包括其mRNA和cDNA以及其cRNA。
在本说明书中,术语“多核苷酸”用于具有与核酸的含义相同的含义,并且包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。
在本说明书中,术语“多肽”用于具有与术语“蛋白”的含义相同的含义。
在本说明书中,术语“细胞”包括个体动物中的细胞和培养的细胞。
在本说明书中,术语“链间二硫化物”用于意指位于抗体中的两条重链之间的二硫化物(重-重链间二硫化物)或位于抗体中的重链和轻链之间的二硫化物(重-轻链间二硫化物)。
在本说明书中,术语“链间硫醇”用于意指通过还原抗体的链间二硫化物而获得的硫醇基。
在本说明书中,术语“重-重链间硫醇”用于意指通过还原抗体的重-重链间二硫化物而获得的硫醇基。
在本说明书中,术语“重-轻链间硫醇”用于意指通过还原抗体的重-轻链间二硫化物而获得的硫醇基。
在本说明书中,术语“肿瘤相关抗原(TAA)”用于意指在正常细胞和肿瘤细胞两者中都表达、但其表达相对局限于肿瘤细胞的抗原。
在本说明书中,术语“肿瘤特异性抗原(TSA)”用于意指对肿瘤细胞特异性的抗原。
在本说明书中,术语“TROP2”用于具有与TROP2蛋白的含义相同的含义。
在本说明书中,术语“CD98”用于具有与CD98蛋白的含义相同的含义。由于CD98由重链和轻链组成,术语“CD98重链”和“CD98轻链”分别用于具有与CD98重链蛋白和CD98轻链蛋白的含义相同的含义。此外,在本说明书中,除非另有说明,否则术语“CD98”以与“CD98重链”和“CD98轻链”或“CD98重链”或“CD98轻链”中任一个可互换的方式使用。
在本说明书中,术语“抗TROP2抗体”用于意指能够结合TROP2的抗体。
在本说明书中,术语“抗CD98抗体”用于意指能够结合CD98的抗体。
在本说明书中,术语“抗B7-H3抗体”用于意指能够结合B7-H3的抗体。
在本说明书中,术语“抗HER2抗体”用于意指能够结合HER2的抗体。
在本说明书中,术语“细胞毒素的”用于意指通过任何给定的方式给予细胞病理变化。其不仅意指直接的外部损伤,而且意指给予细胞的所有类型的结构或功能损伤,诸如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝***装置的损伤以及各种类型的酶的活性降低。
在本说明书中,术语“细胞毒性”用于意指引起上述细胞毒性现象的作用。
在本说明书中,“抗体依赖性细胞毒性”用于意指“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性”,且该活性意指由抗体介导的NK细胞对靶细胞诸如肿瘤细胞给予损伤的活性。
在本说明书中,术语“补体依赖性细胞毒性”用于意指“补体依赖性细胞毒性(CDC)活性”,且该活性意指由抗体介导的补体对靶细胞诸如肿瘤细胞给予损伤的活性。
在本说明书中,术语“表位”用于意指结合特定抗体的抗原的部分肽或部分三维结构。作为抗原的部分肽的此表位可以通过本领域技术人员众所周知的方法,诸如免疫测定法来确定,例如通过以下方法。首先,产生抗原的各种部分结构。为了产生此类部分结构,可以应用已知的寡肽合成技术。例如,通过本领域技术人员众所周知的基因重组技术产生一系列肽,其中从其C-末端或N-末端以适当的长度连续切割抗原,且其后,研究抗体与此类多肽的反应性,并且大致确定识别位点。其后,合成进一步更短的肽,且然后研究其与上述肽的反应性,以便确定表位。此外,可以通过经由X-射线结构分析指定与上述抗体相邻的抗原的氨基酸残基来确定作为结合特定抗体的抗原的部分三维结构的表位。
在本说明书中,短语“结合相同表位的抗体”用于意指结合共同表位的不同抗体。如果第二抗体结合第一抗体结合的部分肽或部分三维结构,则可以确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位。另外,通过证实第二抗体竞争第一抗体与抗原的结合(即,第二抗体阻止第一抗体与抗原结合),可以确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位,尽管表位的特定序列或结构尚未确定。另外,当第一抗体和第二抗体结合相同的表位且进一步第一抗体具有特殊效果诸如抗肿瘤活性时,可预期第二抗体具有与第一抗体的活性相同的活性。
在本说明书中,术语“CDR”用于意指互补决定区(CDR)。已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个CDR。此CDR也被称为高变区,并且存在于抗体的重链和轻链的可变区中,其中一级结构的突变特别高。在重链和轻链各自中的多肽链的一级结构上,CDR被分成三个位点。在本说明书中,关于抗体的CDR,重链的CDR从重链的氨基酸序列的N-末端侧起分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3,而轻链的CDR从轻链的氨基酸序列的N-末端侧起分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此接近定位,并且决定抗体对抗原(所述抗体与其结合)的特异性。
在本说明书中,术语“几个/种”用于意指2至10的数。该数优选为2至9,更优选2至8,甚至更优选2至7,进一步优选2至6,还进一步优选2至5,还进一步优选2至4,更进一步优选2至3,且更进一步优选2。
在本说明书中,术语“抗体-药物缀合物组合物”用于意指以任何给定比率包含由两个药物接头结合的抗体-药物缀合物、由四个药物接头结合的抗体-药物缀合物、由六个药物接头结合的抗体-药物缀合物、由八个药物接头结合的抗体-药物缀合物以及未由任何药物接头结合的抗体的组合物。在本说明书中,“抗体-药物缀合物组合物”也被称为“ADC组合物”。
在本说明书中,“结合药物的平均数目”也被称为药物:抗体比率(DAR),且结合药物的平均数目意指抗体-药物缀合物组合物中结合单个抗体分子的药物的平均数目。
在本说明书中,术语“含量”用于意指抗体-药物缀合物组合物中具有特定数目的结合药物和特定结合位点的抗体-药物缀合物的含量(基于抗体的摩尔%)。
在本说明书中,术语“同一性”用于具有与术语“同源性”的含义相同的含义。
1.抗体
本发明中使用的抗体可以针对目标抗原,例如针对肿瘤特异性抗原(TAA)或肿瘤相关抗原(TSA)产生。此抗体具有能够识别肿瘤细胞的特性,能够结合此类肿瘤细胞的特性以及能够被并入此类肿瘤细胞中、然后在其中内化的特性。
此目标抗原的类型没有特别限制,只要其为肿瘤细胞相关抗原。目标抗原的实例包括B7-H3、CD3、CD30、CD33、CD37、CD56、CD98、DR5、EGFR、EPHA2、FGFR2、FGFR4、FOLR1(叶酸受体1)、HER2、HER3、TROP2和VEGF。
本发明中使用的抗体可以通过例如WO2009/091048、WO2011/027808或WO2012/133572中所述的方法获得。具体地,用目标抗原免疫非人动物,且然后从免疫的动物收集淋巴液、淋巴组织、血细胞样品或骨髓衍生的细胞。其后,选择特异性结合目标抗原的非人动物的浆细胞和/或浆母细胞。从获得的浆细胞和/或浆母细胞收集针对目标抗原反应的抗体基因,且然后鉴定抗体基因的核苷酸序列。其后,可以基于鉴定的基因的核苷酸序列获得上述抗体或其抗体片段。将因此获得的抗体在其与目标抗原的结合活性方面进行检查,使得可以选择适用于人类疾病的抗体。
或者,根据已知的方法(例如,Kohler和Milstein,Nature(1975)256,pp.495-497;Kennet,R.编辑,Monoclonal Antibodies,pp.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980)),将产生针对目标抗原反应的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合以建立杂交瘤,以便获得单克隆抗体。此类方法的具体实例描述于WO2009/048072(在2009年4月16日公开)和WO2010/117011(在2010年10月14日公开)。
本发明中使用的抗体包括出于降低针对人类的异源抗原性的目的而人工修饰的基因重组抗体,例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。这些抗体可以根据已知的方法产生。
嵌合抗体是例如其可变区和恒定区彼此异源的抗体,诸如通过将小鼠或大鼠衍生的抗体的可变区与衍生自人的恒定区缀合而形成的嵌合抗体(参见Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
人源化抗体的实例包括通过仅将CDR并入人衍生的抗体而形成的抗体(参见Nature(1986)321,pp.522-525),以及通过根据CDR移植方法将一些框架中的氨基酸残基以及CDR移植入人抗体而形成的抗体(国际公开号WO90/07861)。
本发明的抗体的优选实例包括抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体和抗HER2抗体。
人源化抗TROP2抗体的实际实例可以是以下的任何给定的组合:重链和轻链,所述重链包含由以下任一项组成的重链可变区:(1)由SEQ ID NO:2的位置20至140的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(2)相对于上述(1)中的氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列,和(3)包含上述(1)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列;且所述轻链包含由以下任一项组成的轻链可变区:(4)由SEQ ID NO:4的位置21至129的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(5)相对于上述(4)中的氨基酸序列具有至少95%的同源性的氨基酸序列,和(6)包含上述(4)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
包含重链和轻链的优选组合的上述抗体的一个实例可以是抗体(hTINA1-H1L1),其由重链和轻链组成,所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:2的位置20至470的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:4的位置21至234的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
人源化抗TROP2抗体不限于特定人源化抗体,只要其保留由SEQ ID NO:5(TAGMQ)中所示的氨基酸序列组成的CDRH1,由SEQ ID NO:6(WINTHSGVPKYAEDFKG)中所示的氨基酸序列组成的CDRH2,由SEQ ID NO:7(SGFGSSYWYFDV)中所示的氨基酸序列组成的CDRH3,由SEQ ID NO:8(KASQDVSTAVA)中所示的氨基酸序列组成的CDRL1,由SEQ ID NO:9(SASYRYT)中所示的氨基酸序列组成的CDRL2,和由SEQ ID NO:10(QQHYITPLT)中所示的氨基酸序列组成的CDRL3,其显示于序列表中。
人源化抗CD98抗体的实例可以是以下的任何给定的组合:重链和轻链,所述重链包含由以下任一项组成的重链可变区:(1)由SEQ ID NO:12的位置20至135的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(2)相对于上述(1)中的氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列,和(3)包含上述(1)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列;且所述轻链包含由以下任一项组成的轻链可变区:(4)由SEQ ID NO:14的位置21至135的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(5)相对于上述(4)中的氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列,和(6)包含上述(4)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
包含重链和轻链的优选组合的上述抗体的一个实例可以是抗体(hM23-H1L1),其由重链和轻链组成,所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:12的位置20至465的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:14的位置21至240的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
人源化抗CD98抗体不限于特定人源化抗体,只要其保留由SEQ ID NO:15(NYLIE)中所示的氨基酸序列组成的CDRH1,由SEQ ID NO:16(VINPGSGVTNYNEKFKG)中所示的氨基酸序列组成的CDRH2,由SEQ ID NO:17(AEAWFAY)中所示的氨基酸序列组成的CDRH3,由SEQ IDNO:18(KSSQSLLYSSNQKNYLA)中所示的氨基酸序列组成的CDRL1,由SEQ ID NO:19(WASTRES)中所示的氨基酸序列组成的CDRL2,和由SEQ ID NO:20(QRYYGYPWT)中所示的氨基酸序列组成的CDRL3,其显示于序列表中。
人源化抗B7-H3抗体的实例可以是以下的任何给定的组合:重链和轻链,所述重链包含由以下任一项组成的重链可变区:(1)由SEQ ID NO:25的位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(2)相对于上述(1)中的氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列,和(3)包含上述(1)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列;且所述轻链包含由以下任一项组成的轻链可变区:(4)由SEQ ID NO:26的位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列,(5)相对于上述(4)中的氨基酸序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列,和(6)包含上述(4)的氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。
包含重链和轻链的优选组合的上述抗体的一个实例可以是抗体(M30-H1-L4),其由重链和轻链组成,所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:25的位置20至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:26的位置21至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
人源化抗B7-H3抗体不限于特定人源化抗体,只要其保留由SEQ ID NO:27(NYVMH)中所示的氨基酸序列组成的CDRH1,由SEQ ID NO:28(YINPYNDDVKYNEKFKG)中所示的氨基酸序列组成的CDRH2,由SEQ ID NO:29(WGYYGSPLYYFDY)中所示的氨基酸序列组成的CDRH3,由SEQ ID NO:30(RASSRLIYMH)中所示的氨基酸序列组成的CDRL1,由SEQ ID NO:31(ATSNLAS)中所示的氨基酸序列组成的CDRL2,和由SEQ ID NO:32(QQWNSNPPT)中所示的氨基酸序列组成的CDRL3,其显示于序列表中。
人源化抗HER2抗体的实例可以是这样的抗体(曲妥珠单抗;美国专利号5821337),其由重链和轻链组成,所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:33的位置1至449的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:34的位置1至214的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
而且,本发明中使用的抗体中也包括CDR修饰的人源化抗体(其中每个CDR中的1-3个氨基酸残基被其他氨基酸残基取代),只要CDR修饰的人源化抗体具有与肿瘤细胞的结合活性。
本发明中使用的抗体还包括人抗体。此人抗体可以通过使用人抗体产生小鼠的方法来获得,所述人抗体产生小鼠具有包含人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段(参见Tomizuka,K.等人,Nature Genetics(1997)16,pp.133-143;Kuroiwa,Y.等人,Nucl.AcidsRes.(1998)26,pp.3447-3448;Yoshida,H.等人,Animal Cell Technology:Basic andApplied Aspects vol.10,pp.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.和Iijima,S.编),KluwerAcademic Publishers,1999.;Tomizuka,K.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,pp.722-727;等)。
而且,存在已知的获得人抗体的方法,所述人抗体衍生自选自人抗体文库的噬菌体展示(参见Wormstone,I.M.等人,Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002)43(7),pp.2301-2308;Carmen,S.等人,Briefings in Functional Genomics andProteomics(2002),1(2),pp.189-203;Siriwardena,D.等人,Ophthalmology(2002)109(3),pp.427-431;等)。
例如,可以使用噬菌体展示方法,其包括使人抗体的可变区在噬菌体表面上表达为单链抗体(scFv),然后选择与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology(2005),23,(9),pp.1105-1116)。通过分析基于其对抗原的结合活性选择的噬菌体的基因,可以测定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果阐明与抗原结合的scFv的DNA序列,则通过产生具有该DNA序列的表达载体、且然后将表达载体引入合适的宿主来获得人抗体会变得可能(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,pp.433-455,Nature Biotechnology(2005)23(9),pp.1105-1116)。
评估上述抗体与目标抗原的结合活性,使得可以选择优选的抗体。抗体和抗原之间的解离常数可以通过使用涉及表面等离子共振(SPR)作为检测原理的Biacore T200(GEHealthcare Bioscience)来测量。例如,使经调节以具有相对于作为配体固相化的抗原的合适浓度的抗体与分析物反应,且然后测量其结合和解离,以便获得缔合速率常数ka1、解离速率常数kd1和解离常数(KD;KD=kd1/ka1)。可以不仅使用Biacore T200,而且通过使用涉及表面等离子共振(SPR)作为检测原理的装置、涉及动力学排阻测定作为检测原理的KinExA(Sapidyne Instruments)、涉及生物层干涉测量作为检测原理的BLItz System(Pall)、ELISA(酶联免疫吸附测定)方法等评估与目标抗原的结合活性。
细胞中内化的活性可通过应用如下证实:(1)使用与治疗性抗体结合的二抗(荧光标记),在荧光显微镜下显现并入细胞中的抗体的测定法(Cell Death andDifferentiation(2008)15,751-761),(2)使用与治疗性抗体结合的二抗(荧光标记),测量并入细胞中的荧光量的测定法,或(3)Mab-ZAP测定法,其中使用与治疗性抗体结合的免疫毒素,并且当将免疫毒素并入细胞中时,释放毒素并抑制细胞生长(BioTechniques 28:162-165,January 2000)。作为此免疫毒素,也可以使用由白喉毒素的催化区域和蛋白G组成的重组缀合的蛋白。
用于比较抗体特性的另一个指标的实例可以是抗体的稳定性。差示扫描量热法(DSC)是能够迅速而精确地测量热变性中点(Tm)的方法,所述量热变性中点(Tm)充当蛋白的相对结构稳定性的良好指标。通过使用DSC来测量此类Tm值且然后比较获得的值,可以比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性显示与抗体的热稳定性的某种程度的相关性(Lori Burton,等人,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,pp.265-273),并且使用热稳定性作为指标,可以选择优选的抗体。用于选择抗体的其他指标的实例包括在合适的宿主细胞中的高产率和在水溶液中的低粘结性。例如,由于产率最高的抗体并不总是表现出最高的热稳定性,因此基于上述指标进行综合判断,并且需要选择最合适施用于人的抗体。
而且,通过调节与抗体结合的糖链修饰,可以增强抗体依赖性细胞毒性。作为调节抗体的糖链修饰的技术,WO99/54342、WO2000/61739、WO2002/31140等中描述的技术是已知的,但该技术不限于此。
当已经分离抗体基因且其后将基因引入合适的宿主中以产生抗体时,可以使用宿主和表达载体的合适组合。抗体基因的具体实例可以是编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其中描述的抗体的轻链序列的基因的组合。对于宿主细胞的转化,可以将重链序列基因和轻链序列基因***单个表达载体中,或者也可以将这些基因各自***不同的表达载体中。当真核细胞用作宿主时,可以使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。动物细胞的实例包括哺乳动物细胞,诸如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman,Y.,Cell(1981)23,pp.175-182,ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷的细胞系(CHO细胞,ATCC CCL-61)(Urlaub,G.和Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,pp.4126-4220)。另一方面,当原核细胞用作宿主时,可以使用例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。将目标抗体基因引入这些细胞用于转化,且然后将转化的细胞在体外培养以获得抗体。在上述培养方法中,存在产率根据抗体的序列而不同的情况,且因此可以使用产率作为指标从具有等效结合活性的抗体选择容易作为药物产生的抗体。
在本发明中使用的抗体的同种型不受限制,并且本抗体的同种型的实例包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(IgA1和IgA2)、IgD和IgE。其中,IgG或IgM是优选的,且IgG1、IgG2或IgG3是更优选的。
抗体的一般功能的实例包括抗原-结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性(complement-dependentcytotoxicity)、补体依赖性细胞的细胞毒性(complement-dependent cellularcytotoxicity)和内化活性。
此外,本发明中使用的抗体可以是对至少两种类型的不同抗原具有特异性的多特异性抗体。通常,此分子结合两种类型的抗原(即双特异性抗体)。然而,本发明中的“多特异性抗体”包括对更多种抗原(例如3种抗原)具有特异性的抗体。
本发明中使用的抗体可以是与上述抗体的重链和/或轻链具有80%至99%的同一性(或同源性)的抗体。通过组合与上述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列具有高度同源性的序列,可以选择具有与上述抗体各自的那些相同的抗原-结合活性和内化活性的抗体。此同源性为通常80%或更多、优选90%或更多、更优选95%或更多且最优选99%或更多的同源性。此外,通过组合包含相对于重链和/或轻链的氨基酸序列的一个至几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列,可以选择具有与上述抗体各自的那些等效的各种类型的作用的抗体。待被取代、缺失和/或添加的氨基酸残基的数目为通常10个或更少的氨基酸残基,优选9个或更少的氨基酸残基,更优选8个或更少的氨基酸残基,更优选7个或更少的氨基酸残基,甚至更优选6个或更少的氨基酸残基,进一步优选5个或更少的氨基酸残基,还进一步优选4个或更少的氨基酸残基,还进一步优选3个或更少的氨基酸残基,还进一步优选2个或更少的氨基酸残基,最优选1个氨基酸残基。
已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Joumal of Chromatography A,705:129-134(1995)),并且此外,已知在重链羧基末端的两个氨基酸残基甘氨酸和赖氨酸缺失,并且位于羧基末端的脯氨酸残基被新酰胺化(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))。然而,这些重链序列的缺失和修饰不会对抗体的抗原-结合活性和效应子功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒性等)具有影响。因此,本发明还包括已经历上述修饰的抗体,并且此抗体的具体实例包括在重链羧基末端包含1或2个氨基酸缺失的缺失突变体,以及通过使上述缺失突变体酰胺化形成的缺失突变体(例如,其中羧基末端位点的脯氨酸残基被酰胺化的重链)。然而,关于根据本发明的抗体的重链的羧基末端处缺失的缺失突变体不限于上述缺失突变体,只要它们保留抗原-结合活性和效应子功能。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长抗体和上述缺失突变体的任一种类型的重链,或选自上述组的任何两种类型的组合。个别缺失突变体的量比率可以受产生根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。根据本发明的抗体的主要成分可以是其中在两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸残基的情况。
两种类型的氨基酸序列之间的同源性可以通过使用Blast算法版本2.2.2的默认参数确定(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,JinghuiZhang,Zheng Zhang,Webb Miller和David J.Lipman(1997),″Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs,″Nucleic AcidsRes.25:3389-3402)。Blast算法也通过在互联网上访问www.ncbi.nlm.nih.gov/blast可得。应当注意的是,使用上述Blast算法,可以计算两种类型的百分比值,即,同一性(Identity)(或同一性(Identities))和阳性率(Positivity)(或阳性率(Positivities))。前者是当应获得其同源性的两种类型的氨基酸序列之间的氨基酸残基相同时获得的值。后者是也考虑具有相似化学结构的氨基酸残基的数值。在本说明书中,当氨基酸残基彼此相同时的同一性的值被定义为同源性的值。
可以纯化获得的抗体,直至其变得均匀。对于抗体的分离和纯化,可以使用应用于蛋白的普通分离和纯化方法。抗体可以通过如下来分离和纯化:从例如柱色谱、过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦适当选择方法,然后组合选择的方法(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory CourseManual,Daniel R.Marshak等人,编,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring HarborLaboratory(1988)),但分离和纯化方法不限于此。
色谱的实例包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤色谱、反相色谱和吸附色谱。
这些色谱方法可以使用液相色谱诸如HPLC或FPLC进行。
亲和色谱中使用的柱的实例包括蛋白A柱和蛋白G柱。
2.药物
本发明中使用的药物没有特别限制,只要其为具有抗肿瘤作用且还具有能够与接头结构结合的取代基或部分结构的化合物。关于此药物,部分或整个接头在肿瘤细胞中被切割,并且释放抗肿瘤化合物部分,使得表现出抗肿瘤作用。如果接头在与药物结合的部分被切割,则抗肿瘤化合物在具有其原始结构的同时被释放,使得表现出原始的抗肿瘤作用。允许药物经由具有特定结构的接头部分与抗体结合。在本说明书中,包含该药物和该接头部分的药物接头也被称为“药物”。
抗肿瘤化合物的实例包括卡里奇霉素、多柔比星、柔红霉素、丝裂霉素C、博来霉素、环胞苷、长春新碱、长春花碱、甲氨蝶呤、顺铂或其衍生物、阿里他汀或其衍生物、美登素或其衍生物、紫杉醇或其衍生物和喜树碱或其衍生物。在这些化合物中,依喜替康或单甲基阿里他汀E是优选的。
作为喜树碱衍生物的依喜替康((1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-2,3-二氢-9-羟基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3′,4′:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)是由下式代表的化合物。
[式9]
Figure GDA0002943772440000231
单甲基阿里他汀E((2R,3R)-N-[(1R,2S)-1-甲基-2-羟基-2-苯基乙基]-2-甲基-3-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-3-甲氧基-4-[(N-甲基-L-Val-L-VaI-)(甲基)氨基]-5-甲基庚酰基]-2-吡咯烷基]-3-甲氧基丙酰胺)是由下式代表的化合物。
[式10]
Figure GDA0002943772440000232
3.接头
本发明中使用的药物可以经由接头结合至抗体。本发明中使用的接头优选具有N-取代的马来酰亚胺基。接头的实例包括可切割接头和不可切割接头。可切割接头的实例是被细胞内蛋白酶(诸如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)切割的肽接头。
本发明中使用的接头优选具有由下式中的任一个诱导的结构:
[式11]
Figure GDA0002943772440000233
[式12]
Figure GDA0002943772440000241
,和
[式13]
Figure GDA0002943772440000242
,且优选具有诱导自下式的结构:
[式14]
Figure GDA0002943772440000243
术语“GGFG”意指由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基。
本发明中使用的接头可以例如根据WO2014/057687的实施例58中所述的方法来制备。
4.药物接头中间体
本发明中使用的药物接头中间体可以通过如下产生:使用缩合剂等使上述接头化合物的羧基与抗肿瘤化合物的氨基反应。
本发明的方法中使用的药物接头中间体没有特别限制,只要其为能够与抗体的链间硫醇反应的化合物。本药物接头中间体优选为具有N-取代的马来酰亚胺基的化合物,且其更优选为
[式15]
Figure GDA0002943772440000251
[式16]
Figure GDA0002943772440000252
,或
[式17]
Figure GDA0002943772440000253
,且其进一步优选为
[式18]
Figure GDA0002943772440000254
本发明中使用的药物接头中间体可以例如根据WO2014/057687的实施例58、实施例43和实施例14中所述的方法来制备。
如果本药物接头中间体是具有N-取代的马来酰亚胺基的药物接头中间体,则可以使其与通过抗体的链间二硫化物的还原而产生的链间硫醇反应,从而使得抗体通过接头与药物结合。因此,该药物接头中间体优选为具有N-取代的马来酰亚胺基的化合物。然而,本文使用的药物接头中间体不限于此化合物,并且所有类型的药物接头中间体可以应用于本发明的生产方法,只要它们具有用于促进与抗体的链间硫醇反应的官能团。
5.抗体-药物缀合物
关于抗体-药物缀合物,与单个抗体分子结合的药物的数目是对效力和安全性具有影响的重要因素。由于抗体具有四个链间二硫化物,并且此二硫化物用两个硫醇基构成,所以与单个抗体分子结合的药物的数目是2、4、6或8。
其中两个药物与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物(下文也称为“D2”)的实例包括其中两个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D2-1”)和其中两个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D2-2”)。
[式19]
Figure GDA0002943772440000261
其中四个药物与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物(下文也称为“D4”)的实例包括其中四个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D4-1”)、其中四个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D4-2”)以及其中两个药物接头与重-轻链间硫醇结合且两个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D4-3”)。
[式20]
Figure GDA0002943772440000262
其中六个药物与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物(下文也称为“D6”)的实例包括其中四个药物接头与重-轻链间硫醇结合且两个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D6-1”)以及其中两个药物接头与重-轻链间硫醇结合且四个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D6-2”)。
[式21]
Figure GDA0002943772440000271
其中八个药物接头与单个抗体分子结合的抗体-药物缀合物(以下也称为“D8”)的实例是其中四个药物接头与重-轻链间硫醇结合且四个药物接头与重-重链间硫醇结合的抗体-药物缀合物。
[式22]
Figure GDA0002943772440000272
抗体的链间硫醇例如与药物接头中间体的N-取代的马来酰亚胺基的3-位形成硫醚并与之结合。即,抗体与药物接头的结合部分例如由下式代表:
[式23]
Figure GDA0002943772440000273
其中“抗体-S-”衍生自抗体。
所述药物接头优选为,
[式24]
Figure GDA0002943772440000274
[式25]
Figure GDA0002943772440000281
,或
[式26]
Figure GDA0002943772440000282
其中A代表与抗体的结合位点,且其更优选为,
[式27]
Figure GDA0002943772440000283
其中A代表与抗体的结合位点。
在确定反应条件诸如反应中使用的原料和/或试剂的量的同时,产生抗体-药物缀合物,使得可以控制结合药物的数目。与低分子量化合物的化学反应不同,抗体-药物缀合物通常以不同数目的药物结合的混合物的形式获得。指定与单个抗体分子结合的药物的数目并表示为平均值,即结合药物的平均数目。
本发明的生产方法是用于产生抗体-药物缀合物组合物的方法,其中控制结合药物的数目和结合位点,并且本生产方法由以下组成:选择性还原抗体的重-轻链间二硫化物以将它们转化为硫醇基的第一步骤,和使药物接头中间体与具有硫醇基的抗体反应、以便产生抗体-药物缀合物组合物(其中控制结合药物的数目和结合位点)的第二步骤。其后,将详细描述每个步骤。
(第一步骤)抗体的还原
具有硫醇基的抗体可以通过使抗体与还原剂在缓冲液中在-10℃至10℃的温度下反应来产生。
反应温度优选为-5℃至5℃,更优选-3℃至3℃,甚至更优选0℃至2℃,且进一步优选0℃至1℃。
基于单个抗体分子的量,还原剂的量为1至4摩尔当量,且优选2至3摩尔当量。
作为此还原剂,例如可以使用三(2-羧乙基)膦或其盐、二硫苏糖醇或2-巯基乙醇。所述还原剂优选为三(2-羧乙基)膦或其盐,且更优选三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
作为缓冲液,可以使用组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液等,且其中,组氨酸缓冲液是优选的。
所述缓冲液优选包含螯合剂。可以本文使用的螯合剂的实例包括乙二胺四乙酸(以下也称为“EDTA”)和二乙烯三胺五乙酸。其中,乙二胺四乙酸是优选的。此缓冲液可以1至20mM的浓度使用。
所述反应时间优选为1至15小时,更优选3至10小时,且甚至更优选5至7小时。
应用于该反应的pH为pH 5至9,优选pH 6至8,更优选pH 6.8至7.2。
(第二步骤)抗体与药物接头中间体的缀合
使药物接头中间体与第一步骤中获得的具有硫醇基的抗体反应以产生抗体-药物缀合物组合物。基于单个抗体分子的量,药物接头中间体以2至10摩尔当量、且优选4至6摩尔当量的量使用。
具体地,将药物接头中间体已经溶解的溶液添加至包含在第一步骤中获得的具有硫醇基的抗体的缓冲液,使得可以使它们彼此反应。
本文可以使用的其中溶解药物接头中间体的溶剂的实例包括有机溶剂,诸如50%丙酮水溶液、80%乙醇水溶液、80%甲醇水溶液、80%异丙醇水溶液、80%二甲亚砜水溶液、二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)和N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。在这些溶剂中,50%丙酮水溶液或80%二甲亚砜水溶液是优选的。
将已经溶解药物接头中间体的有机溶剂溶液以1%至20%v/v的量添加至包含具有硫醇基的抗体的缓冲液,使得可以使它们彼此反应。
所述反应温度优选为-10℃至10℃,更优选-5℃至5℃,且甚至更优选0℃至2℃。
所述反应时间优选为0.5至2小时。
可以通过用含硫醇基试剂来使未反应的药物接头中间体的反应性失活来终止缀合反应。
作为此含硫醇基试剂,例如可以使用半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸。更具体地,缀合反应可以通过如下来终止:将N-乙酰基-L-半胱氨酸以1至2摩尔当量的量添加至所用的药物接头中间体,且然后在室温下使它们反应10至30分钟。
缀合反应结束之后,可以使用市售的超滤膜等进行纯化。在将乙酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液等添加至反应产物的同时,通过使用超滤膜可以除去低分子量部分。作为此超滤膜,可以使用适当的超滤膜。可以使用具有1kDa至100kDa的分子量的超滤膜,并且具有30kDa的分子量的超滤膜是优选的。
6.抗体-药物缀合物组合物的鉴定
将产生的抗体-药物缀合物组合物根据以下操作进行浓缩、缓冲液交换、纯化、抗体浓度和结合药物的平均数目的测定,使得可以鉴定抗体-药物缀合物组合物。
(1)抗体或抗体-药物缀合物水溶液的浓缩
将抗体或抗体-药物缀合物溶液置于Amicon Ultra(50,000MWCO,MilliporeCorporation)的容器中,且然后使用离心机(Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.)进行离心操作(以2000G至3800G离心5至20分钟),使得可以浓缩抗体或抗体-药物缀合物溶液。
(2)抗体浓度的测量
使用UV测量装置(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.),可以根据制造商提供的方法测量抗体的浓度。在测量期间,使用280nm吸光系数(1.3mLmg-1cm-1至1.8mLmg-1cm-1),其根据各个抗体而不同。
(3)抗体的缓冲液交换
根据制造商提供的方法,用含有氯化钠(137mM)和乙二胺四乙酸(5mM)的磷酸盐缓冲液(10mM,pH6.0;以下也称为″PBS6.0/EDTA″)平衡其中使用Sephadex G-25载体的NAP-25柱(目录号17-0852-02,GE Healthcare Japan Corporation)。其后,将2.5mL抗体水溶液施加至单个NAP-25柱,然后分级分离用3.5mL PBS6.0/EDTA洗脱的级分(3.5mL)。通过与上述(1)中所述的方法相同的方法浓缩该级分,且然后通过与上述(2)中所述的方法相同的方法测量抗体的浓度。其后,可以使用PBS6.0/EDTA调节抗体的浓度。
(4)抗体-药物缀合物组合物的纯化
NAP-25柱用含有山梨糖醇(5%)的乙酸盐缓冲液(10mM,pH 5.5;以下也称为“ABS”)平衡。向该NAP-25柱中施加抗体-药物缀合物反应水溶液(2.5mL),且其然后用缓冲液以制造商确定的量进行洗脱,以便分级分离抗体级分。将该级分再次施加至NAP-25柱,且然后将涉及用缓冲液洗脱的凝胶过滤纯化操作总共重复两次或三次,以便获得抗体-药物缀合物组合物,其中已经除去未结合的药物接头中间体或低分子量化合物(三(2-羧乙基)膦盐酸盐、N-乙酰-L-半胱氨酸和二甲亚砜)。
(5)抗体-药物缀合物组合物的使用疏水柱色谱的分离方法(5-1)HPLC测量方法
在以下测量条件下进行HPLC分析。
HPLC***:Shimadzu Science HPLC***
检测器:紫外吸收光谱仪(测量波长:280nm)
柱:TSKgel Butyl-NPR(4.6×100mm,2.5μm;TOSOH CORPORATION)
柱温:30℃
流动相A:含有1.5M硫酸铵的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)水溶液
流动相B:包含75%25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和25%异丙醇的混合溶液梯度程序:20%-60%(0min-20min),20%-80%(20min-20.1min),80%-80%(20.1min-23min),80%-20%(23min-23.1min),20%-20%(23.1min-40min)
注入样品量:2μL。
(5-2)数据分析
关于目前的数据,由于因为柱的特征,基于盐浓度的差异,按照结合药物的数目增加的顺序洗脱抗体-药物缀合物,所以可以通过测量个别面积值来假定键的数目。峰按洗脱顺序为D0(未通过任何药物接头结合的抗体)、D2、D4-1、D4-2、D6和D8,且因此,可以掌握分布情况。
通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的数目为4的抗体-药物缀合物的含量为50%或更多。
通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的D4-1的含量为50%或更多,或50%至90%、50%至80%、50%至70%或50%至60%的范围内。
通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的D4-2的含量优选为5%或更少,且更优选1%或更少。
通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的D4-3的含量优选为5%或更少,且更优选1%或更少。
(6)抗体-药物缀合物组合物中抗体浓度和结合药物的平均数目的测量(UV方法)
抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的浓度可以通过如下计算:测量抗体-药物缀合物水溶液在两个波长(280nm和370nm)处的UV吸光度,且然后进行以下计算。
由于在特定波长处的总吸光度等于***中所有吸收化学物质的吸光度的总和[吸光度的相加性],如果假设抗体和药物的摩尔吸光系数在抗体与药物缀合之前和之后没有变化,则抗体-药物缀合物组合物中的抗体浓度和药物浓度由以下关系表达式代表。
A280=AD,280+AA,280=εD,280CDA,280CA 表达式(1)
A370=AD,370+AA,370=εD,370CDA,370CA 表达式(2)
在以上表达式中,A280代表抗体-药物缀合物水溶液在280nm处的吸光度,A370代表抗体-药物缀合物水溶液在370nm处的吸光度,AA,280代表抗体在280nm处的吸光度,AA,370代表抗体在370nm处的吸光度,AD,280代表缀合物前体在280nm处的吸光度,AD,370代表缀合物前体在370nm处的吸光度,εA,280代表抗体在280nm处的摩尔吸光系数,εA,370代表抗体在370nm处的摩尔吸光系数,εD,280代表缀合物前体在280nm处的摩尔吸光系数,εD,370代表缀合物前体在370nm处的摩尔吸光系数,CA代表抗体-药物缀合物组合物中的抗体浓度,且CD代表抗体-药物缀合物组合物中的药物浓度。
本文中,对于由εA,280、εA,370、εD,280和εD,370代表的值,使用预先准备的值(估计的计算值或通过化合物的UV测量获得的测量值)。例如,可以根据已知的计算方法(ProteinScience,1995,vol.4,2411-2423)从抗体的氨基酸序列中假定值εA,280。值εA,370通常为零。根据朗伯-比尔定律(Lambert-Beer law)(吸光度=摩尔浓度×摩尔吸光系数×室光路长度),可以通过测量溶液(其中所用的缀合物前体以特定浓度溶解)的吸光度来获得值εD,280和εD,370。测量抗体-药物缀合物水溶液的值A280和A370,且然后将获得的值代入公式(1)和(2)中以解联立方程,由此获得CA和CD。此外,将CD除以CA以获得每个抗体的结合药物的平均数目。
(7)抗体-药物缀合物组合物中每个单一抗体分子的结合药物的平均数目的测量(RPC方法)
也可以通过下述使用反相色谱(RPC)方法的高效液相色谱(HPLC)分析代替上述UV方法来获得抗体-药物缀合物组合物中每个单一抗体分子的结合药物的平均数目。
(7-1)用于HPLC分析的样品的制备(抗体-药物缀合物的还原)
将抗体-药物缀合物溶液(约1mg/mL,60μL)与二硫苏糖醇(DTT)水溶液(100mM,15μL)混合。将混合物在37℃下孵育30分钟,以便获得其中抗体-药物缀合物的链间二硫化物已经被切割的样品,且其后将获得样品用于HPLC分析中。
(7-2)HPLC分析
在以下测量条件下进行HPLC分析。
HPLC***:Agilent 1290HPLC***(Agilent Technologies)
检测器:紫外吸收光谱仪(测量波长:280nm)
柱:PLRP-S(2.1×50mm,8μm,
Figure GDA0002943772440000333
;Agilent Technologies,P/N PL1912-1802)
柱温:80℃
流动相A:0.04%三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B:含有0.04%TFA的乙腈溶液
梯度程序:29%-36%(0min-12.5min),36%-42%(12.5min-15min),42%-29%(15min-15.1min),29%-29%(15.1min-25min)
注入样品量:15μL。
(7-3)数据分析
(7-3-1)当与任何药物都不结合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)相比时,在药物结合的轻链(一个药物结合的轻链:L1)和药物结合的重链(一个药物结合的重链:H1,两个药物结合的重链:H2,和三个药物结合的重链:H3)的情况下,疏水性与结合药物的数目成比例地增加,并且保留时间延长。因此,以L0、L1、H0、H1、H2和H3的顺序发生洗脱。作为比较L0和H0之间的保留时间的结果,可以将检测峰分配给L0、L1、H0、H1、H2和H3中的任一个。
[式28]
Figure GDA0002943772440000331
(7-3-2)由于药物接头吸收UV,根据以下表达式,使用轻链、重链和药物接头的摩尔吸光系数,根据结合的药物接头的数目,校正峰面积值。
[表达式1]
Figure GDA0002943772440000332
[表达式2]
Figure GDA0002943772440000341
本文中,关于各抗体的轻链和重链的摩尔吸光系数(280nm),可以使用根据已知的计算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)从各抗体的轻链和重链的氨基酸序列假定的值。此外,关于药物接头的摩尔吸光系数(280nm),可以使用通过如下制备的化合物的实际测量的摩尔吸光系数(280nm):使每个药物接头中间体与巯基乙醇或N-乙酰半胱氨酸反应,然后将N-取代的马来酰亚胺基转化为琥珀酰亚胺硫醚。
(7-3-3)根据以下表达式计算各链的峰面积与总峰面积校正值的比率(%)。
[表达式3]
Figure GDA0002943772440000342
Figure GDA0002943772440000343
ALi、AHi各自的峰面积校正值:Li、Hi
如果已优先产生L1和H1,则可以假定重-轻链间二硫化物已被选择性还原。另一方面,如果已优先产生L0和H2,则可以假定重-重链间二硫化物已被选择性还原。
(7-3-4)根据以下表达式计算抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目。
结合药物的平均数目=(L0峰面积比×0+L1峰面积比×1+H0峰面积比×0+H1峰面积比×1+H2峰面积比×2+H3峰面积比×3)/100×2
通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目优选为3.5至4.5,且更优选4.0至4.1。
7.包含抗体-药物缀合物组合物的药剂
在已经将通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物转移至肿瘤细胞中之后,其接头部分被切割,且药物被释放于肿瘤细胞中。
在由下式代表的抗体-药物缀合物的情况下:
[式29]
Figure GDA0002943772440000351
由下式代表的化合物被释放:
[式30]
Figure GDA0002943772440000352
由于该化合物具有不稳定的缩醛胺结构,其被进一步水解,使得可以产生由下式代表的化合物:
[式31]
Figure GDA0002943772440000353
在由下式代表的抗体-药物缀合物的情况下:
[式32]
Figure GDA0002943772440000354
由下式代表的化合物被释放:
[式33]
Figure GDA0002943772440000361
在由下式代表的抗体-药物缀合物的情况下:
[式34]
Figure GDA0002943772440000362
由下式代表的化合物被释放:
[式35]
Figure GDA0002943772440000363
由于通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物表现出对癌细胞的细胞毒性,因此其可以用作用于治疗和/或预防癌症的药物组合物的活性成分。
也就是说,通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物可以被选择并用作作为癌症疗法中的主要治疗方法的化学治疗剂,并且由于其使用,癌细胞的生长可以被延缓,其增殖可以被抑制,并且进一步癌细胞可以被破坏。通过这样做,对于癌症患者可以实现从癌症引起的症状的免除或QOL的改善,并且可以保持癌症患者的生命,使得可以实现治疗效果。甚至在不能实现癌细胞的破坏的情况下,也可以通过抑制或控制癌细胞的生长来实现癌症患者的更高QOL,使得可以实现患者的更长时间段的存活。
通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物不仅可以在此类药物疗法中以单独药物的形式使用,而且可以在在辅助疗法中以与其他疗法组合的药剂的形式使用。本抗体-药物缀合物组合物可以与外科手术、放射疗法、激素疗法等组合。此外,本抗体-药物缀合物组合物也可以用作用于新辅助疗法中的药物疗法的药剂。
除了前述治疗用途以外,可以预期通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物具有抑制非常小的转移癌细胞的生长和进一步破坏此类转移癌细胞的效果。例如,可以预期本抗体-药物缀合物组合物具有在转移过程中抑制和破坏体液中的癌细胞的效果,或者抑制和破坏刚刚附着至任何组织的非常小的癌细胞的效果。因此,可以预期本抗体-药物缀合物组合物具有抑制和防止癌症转移的作用,特别是在通过手术操作除去癌症之后。
通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物不仅通过全身性疗法施用于患者,还可以预期抗体-药物缀合物组合物将局部施用于癌症组织,并且将对其表现出治疗效果。
癌症的类型的实例包括肺癌、肾癌、尿路上皮癌、结肠癌、***癌、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、***、子宫癌、头颈癌、食管癌、胆管癌、甲状腺癌、淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和多发性骨髓瘤,但不限于此。
通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物可以用作用于治疗自身免疫疾病的药物组合物或用于抑制针对移植的排斥反应的药物组合物的活性成分。
当将包含通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物的药物组合物施用于哺乳动物(例如人、马、牛、猪等,且优选人)时,可以全身或局部施用,且优选通过肠胃外施用来施用。
用于肠胃外施用的施用途径的实例包括皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下途径,但不限于此。施用方法的实例包括注射和弹丸式注射,且施用方法优选为注射。
本发明的药物组合物可以通过如下来制备:根据施用方法选择合适的形式,且然后使用常用的制备各种类型的制备物的方法。例如,将通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物与溶剂诸如无菌液体(包括水和油(衍生自石油、动物、蔬菜的油或合成油(例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等))、盐水、右旋糖水溶液或甘油水溶液以及添加剂诸如保湿剂、乳化剂或pH缓冲剂(其描述于由E.W.Martin等撰写的″Remington′s PharmaceuticalSciences″中)混合,以便制备本发明的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包含增溶剂,用于缓解注射部位的疼痛的局部麻醉剂(例如利多卡因)等。在一个方面,可以提供本发明的药物组合物,其中活性成分、溶剂等各自放置在不同的容器中。此外,当本发明的药物组合物通过注射施用时,其可以例如以含有活性成分和无菌药物级水或盐水的注射瓶的形式施用。当本发明的药物组合物通过注射施用时,所述活性成分可以在其施用之前与无菌注射用水或盐水混合。
本发明的药物组合物可以包含抗体-药物缀合物组合物和除了前述抗体-药物缀合物组合物以外的至少一种癌症治疗剂。通过本发明获得的抗体-药物缀合物组合物也可以与其他癌症治疗剂一起施用,并且本抗体-药物缀合物组合物可以由此增强抗癌效果。用于此目的的其他抗癌剂可以与本抗体-药物缀合物组合物同时、分开或连续地施用于个体受试者。否则,也可以与本发明抗体-药物缀合物组合物不同的施用间隔来施用此类其他抗癌剂。此癌症治疗剂的实例包括卡铂、顺铂、吉西他滨、依立替康(CPT-11)、紫杉醇、培美曲塞、索拉非尼、长春花碱、国际公开号WO2003/038043中描述的药剂和进一步LH-RH类似物(亮丙瑞林、戈舍瑞林等)、***氮芥-磷酸盐、***拮抗剂(他莫昔芬、雷洛昔芬等)和芳香酶抑制剂(阿那曲唑、来曲唑、依西美坦等)。然而,癌症治疗剂的类型不受限制,只要它是具有抗肿瘤活性的药剂。
本发明的药物组合物也可以以冷冻干燥的制剂或液体制剂的形式提供。当本发明药物组合物作为冷冻干燥的制剂提供时,其可以是包含在相关技术领域中使用的合适的制备添加剂的制剂。此外,当本发明药物组合物作为液体制剂提供时,其可以是包含在相关技术领域中使用的合适的制备添加剂的制剂。
本发明的药物组合物的组成和其活性成分的浓度根据施用方法而变化。在本发明的药物组合物中包含的抗体-药物缀合物组合物的情况下,因为抗体-药物缀合物对抗原的亲和力增加,即就抗体-药物缀合物对抗原的解离常数(Kd值)而言亲和力增加(即,因为Kd值降低),所以尽管以少量施用抗体-药物缀合物组合物也能够表现出药效。因此,为了确定抗体-药物缀合物组合物的应用剂量,可以基于抗体-药物缀合物对抗原的亲和力的条件来确定剂量。当将由本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物施用于人时,本发明抗体-药物缀合物组合物可以例如以约0.001至100mg/kg的剂量施用于人,一次性施用,或分几次施用,间隔为每1至180天一次。
以下实施例中将具体描述本发明。然而,这些实施例并不意在限制本发明的范围。另外,以下实施例在任何意义上都不进行限制性解释。此外,除非另有说明,否则本说明书中描述的试剂、溶剂和起始材料可以容易地从市售的供应源获得。
实施例
(实施例1)人源化抗TROP2抗体表达载体的构建和抗体的产生
(i)人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)表达载体的构建
合成包含编码人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的可变区的DNA序列的DNA片段(Artificial Gene Synthesis Service,GENEART),所述DNA片段由人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的核苷酸序列中的核苷酸编号36至437所代表,其在序列表中显示于SEQID NO:2中。使用合成的DNA片段作为模板,用KOD-Plus-(TOYOBO)和以下引物组扩增包含编码人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的可变区的DNA序列的DNA片段。此后,用限制性酶BlpI切割嵌合和人源化抗体IgG1型重链的表达载体pCMA-G1,且然后使用In-Fusion HDPCR克隆试剂盒(CLONTECH)将该DNA片段***切割位点,以构建人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)表达载体。获得的表达载体被命名为″pCMA-G1/hTINA1-H1″。
引物组:
5′-agctcccagatgggtgctgagc-3′(SEQ ID NO:21:引物EG-Inf-F)
5′-gggcccttggtggaggctgagc-3′(SEQ ID NO:22:引物EG1-Inf-R)
(ii)人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)表达载体的构建
合成包含编码人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)的可变区的DNA序列的DNA片段(Artificial Gene Synthesis Service,GENEART),所述DNA片段由人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)的核苷酸序列中的核苷酸编号38至402所代表,其在序列表中显示于SEQID NO:4中。使用合成的DNA片段作为模板,用KOD-Plus-(TOYOBO)和以下引物组扩增包含编码人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)的可变区的DNA序列的DNA片段。此后,用限制性酶BsiWI切割嵌合和人源化抗体轻链的表达载体pCMA-LK,且然后使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(CLONTECH)将该DNA片段***切割位点,以构建人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)表达载体。获得的表达载体被命名为″pCMA-LK/hTINA1-L1″。
引物组:
5′-ctgtggatctccggcgcgtacggc-3′(SEQ ID NO:23:引物CM-LKF)
5′-ggagggggcggccaccgtacg-3′(SEQ ID NO:24:引物KCL-Inf-R)
(iii)人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)的产生
将FreeStyle 293F细胞(Invitrogen)根据说明书手册进行亚培养和培养。具体地,将处于对数生长期的1.2×109个FreeStyle 293F细胞(Invitrogen)接种于3LFernbachErlenmeyer烧瓶(CORNING)中,且然后用FreeStyle293表达培养基(Invitrogen)稀释以调节至1.0×106个细胞/mL。其后,将细胞在8%CO2培养箱中在37℃下以90rpm进行振荡培养1小时。其后,将聚乙烯亚胺(Polyscience#24765;3.6mg)溶解于Opti-Pro SFM(Invitrogen;20mL)中,且其后将使用PureLink HiPure质粒试剂盒(Invitrogen)制备的轻链表达载体(0.8mg)和重链表达载体(0.4mg)添加至Opti-Pro SFM(Invitrogen;20mL)。将表达载体/Opti-Pro SFM混合溶液(20mL)添加至聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合溶液(20mL),且其后将所得混合物轻轻搅拌,且然后放置5分钟。其后,将FreeStyle 293F细胞添加至反应混合物。将因此获得的混合物在8%CO2培养箱中在37℃下以90rpm进行振荡培养7天,然后用一次性胶囊过滤器(ADVANTEC#CCS-045-E1H)过滤获得的培养上清液。
将通过pCMA-G1/hTINA1-H1与pCMA-LK/hTINA1-L1的组合获得的人源化抗TROP2抗体命名为“hTINA1-H1L1”。
(iv)人源化抗TROP2抗体(hTINAI-H1L1)的纯化
通过两步过程,即,通过rProtein A亲和色谱(4℃-6℃)和陶瓷羟基磷灰石(室温),从上述(iii)中获得的培养上清液纯化抗体。通过rProtein A亲和色谱纯化之后和用陶瓷羟基磷灰石纯化之后,在4℃至6℃下进行缓冲液置换步骤。首先,将培养上清液施加至已经用PBS平衡的MabSelect SuRe(HiTrap柱,由GE Healthcare Bioscience制造)。在已将全部培养上清液置于柱中之后,用PBS以柱体积的两倍或更多倍的量洗涤该柱。随后,使用2M精氨酸盐酸盐溶液(pH4.0)进行洗脱,以收集包含抗体的级分。根据透析(Slide-A-Lyzer透析盒,Thermo Scientific)用PBS置换该级分,且其后将已经用由5mM磷酸钠和50mM MES组成的缓冲液(pH 7.0)稀释五倍的抗体溶液施加至已经用由5mM NaPi、50mM MES和30mMNaCl组成的缓冲液(pH 7.0)平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Scale CHTType-I羟基磷灰石柱,JAPAN Bio-Rad Laboratories K.K.)。随后,使用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱,且收集包含抗体的级分。根据透析(Slide-A-Lyzer透析盒,Thermo Scientific),用HBSor(25mM组氨酸/5%山梨醇,pH 6.0)置换该级分。最后,使用离心UF过滤装置VIVASPIN20(截止分子量:UF10K,Sartorius,4℃)浓缩所得物,并将IgG浓度调节至20mg/mL或更高,从而制备纯化的样品。
(v)人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)的缓冲液交换和浓度的调整根据制造商提供的方法,用含有氯化钠(137mM)和乙二胺四乙酸(5mM)的磷酸盐缓冲液(10mM,pH6.0;以下也称为“PBS6.0/EDTA”)平衡其中使用Sephadex G-25载体的NAP-25柱(目录号17-0852-02,GE Healthcare Japan Corporation)。将2.5mL上述(iv)中产生的含有人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)的抗体水溶液施加至上述单一NAP-25柱,并收集用3.5mL PBS6.0/EDTA稀释的级分(3.5mL)。将该级分置于Amicon Ultra(50,000MWCO,Millipore Corporation)的容器中,且然后进行使用离心机(Allegra X-15R,Beckman Coulter,Inc.)的离心操作(在2000G至3800G离心5至20分钟),以便浓缩抗体溶液。使用UV测量装置(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.),根据制造商提供的方法测量抗体的浓度。为了测量,使用280nm吸光系数(1.54mLmg-1cm-1)测量抗体的浓度,且其后使用PBS6.0/EDTA,将抗体浓度调节至21.8mg/mL。
(实施例2)药物接头中间体的产生由下式代表的N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]甘氨酰基甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-N-[(2-{[(1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羟基-4-甲基-10,13-二氧代-2,3,9,l0,13,15-六氢-1H,12H-苯并[de]吡喃并[3′,4′:6,7]吲哚嗪并[1,2-b]喹啉-1-基]氨基}-2-氧代乙氧基)甲基]甘氨酰胺通过WO2014/057687的实施例58中描述的方法合成。
[式36]
Figure GDA0002943772440000411
(实施例3)人源化抗TROP2抗体ADC组合物的产生
(实施例3-1)根据常规方法产生人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)(15mL:对应于327mg,浓度:21.8mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(18mL,pH5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(0.027mL;基于抗体,6当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20水溶液(0.033mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调节至pH 7.12。在24℃下搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液(1.58mL;每个单一抗体分子,2.45当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物加热3小时以导致35℃至36℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
将上述(i)中获得的溶液冷却,且然后在16℃至17℃的内部温度下在搅拌60分钟下将6.67mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(1.71mL;每个单一抗体分子,5.2当量)添加至反应溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌20分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸水溶液(0.135mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌20分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为500mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得17.6mL含有人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
[常用操作A]抗体-药物缀合物组合物中每个单一抗体分子的结合药物的平均数目的测量
通过使用以下方法的高效液相色谱(HPLC)分析来获得抗体-药物缀合物组合物中每个单一抗体分子的结合药物的平均数目。
1.用于HPLC分析中的样品的制备(抗体-药物缀合物的还原)
将抗体-药物缀合物溶液(约1mg/mL,60μL)与二硫苏糖醇(DTT)水溶液(100mM,15μL)混合。将混合物在37℃下孵育30分钟以制备其中抗体-药物缀合物的重链和轻链之间以及重链和重链之间的二硫化物被切割的样品。获得的样品用于HPLC分析中。
2.HPLC分析
在以下测量条件下进行HPLC分析。
HPLC***:Shimadzu Science HPLC***
检测器:紫外吸收光谱仪(测量波长:280nm)
柱:PLRP-S(2.1×50mm,8μm,
Figure GDA0002943772440000421
;Agilent Technologies)
柱温:80℃
流动相A:0.05%三氟乙酸(TFA)水溶液
流动相B:含有0.04%TFA的乙腈溶液
梯度程序:29%-36%(0min-12.5min),36%-42%(12.5-15min),42%-29%(15min-15.1min),29%-29%(15.1min-25min)
注入样品量:15μL。
4.数据分析
当与药物不结合的抗体的轻链(L0)和重链(H0)相比时,在药物结合的轻链(一个药物结合的轻链:L1)和药物结合的重链(一个药物结合的重链:H1,两个药物结合的重链:H2,和三个药物结合的重链:H3)的情况下,疏水性与结合药物的数目成比例地增加,并且保留时间延长。因此,以L0、L1、H0、H1、H2和H3的顺序发生洗脱。作为比较L0和H0之间的保留时间的结果,将检测峰分配给L0、L1、H0、H1、H2和H3中的任一个。
由于药物接头吸收UV,根据以下表达式,使用轻链、重链和药物接头的摩尔吸光系数,根据结合的药物接头的数目,校正峰面积值。
[表达式4]
Figure GDA0002943772440000431
[表达式5]
Figure GDA0002943772440000432
t文中,关于各抗体的轻链和重链的摩尔吸光系数(280nm),使用根据已知的计算方法(Protein Science,1995,vol.4,2411-2423)从各抗体的轻链和重链的氨基酸序列推定的值。在人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值27640作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值83810作为重链的摩尔吸光系数的估计值。此外,关于药物接头的摩尔吸光系数(280nm),使用通过如下制备的化合物的实际测量的摩尔吸光系数(280nm):使每个药物接头中间体与巯基乙醇或N-乙酰半胱氨酸反应,然后将N-取代的马来酰亚胺基转化为琥珀酰亚胺硫醚。
根据以下表达式计算各链的峰面积与总峰面积校正值的比率(%)。
[表达式6]
Figure GDA0002943772440000433
Figure GDA0002943772440000434
ALi、AHi各自的峰面积校正值:Li、Hi
根据以下表达式计算抗体-药物缀合物组合物中每个单一抗体分子的结合药物的平均数目。
结合药物的平均数目=(L0峰面积比×0+L1峰面积比×1+H0峰面积比×0+H1峰面积比×1+H2峰面积比×2+H3峰面积比×3)/100×2
发现抗体的浓度为16.49mg/mL,发现抗体的产量为290mg(86%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.4。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图5中。
[常用操作B]涉及抗体-药物缀合物组合物的疏水柱色谱的分离方法
1.HPLC测量方法
在以下测量条件下进行HPLC分析。
HPLC***:Shimadzu Science HPLC***
检测器:紫外吸收光谱仪(测量波长:280nm)
柱:TSKgel Butyl-NPR(4.6×100mm,2.5μm;TOSOH CORPORATION)
柱温:30℃
流动相A:含有1.5M硫酸铵的25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)水溶液
流动相B:包含75%25mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)和25%异丙醇的混合溶液
梯度程序:20%-60%(0min-20min),20%-80%(20min-20.1min),80%-80%(20.1min-23min),80%-20%(23min-23.1min),20%-20%(23.1min-40min)
注入样品量:2μL。
2.数据分析
关于目前的数据,由于因为柱的特征,基于盐浓度的差异,按照结合药物的数目增加的顺序洗脱抗体-药物缀合物,所以通过测量个别面积值来假定键的数目分布。峰按洗脱顺序为D0(未通过任何药物接头结合的抗体)、D2、D4-1、D4-2、D6和D8,且分布情况如下:D0:4.8%,D2:16.8%,D4-1:24.6%,D4-2:13.1%,D6:24.8%和D8:12.6%(图6)。
(实施例3-2)根据本发明的方法产生人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)(22.9mL:对应于500mg,浓度:21.8mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(22mL,pH 5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(0.0344mL;基于抗体,5个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20水溶液(0.050mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调节至pH 7.12,且然后冷却混合物。在0℃至1℃的内部温度下,在搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液(2.54mL;每个单一抗体分子,2.58当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物在0℃至1℃的内部温度下搅拌6小时,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
在0℃至2℃的内部温度下在搅拌下,经10分钟将6.03mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(2.99mL;每个单一抗体分子,5.1当量)添加至上述(i)中获得的溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌40分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸水溶液(0.206mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌10分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为700mL,使得除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得23.6mL含有人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗TROP2抗体(hTINA1-H1L1)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值27640作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值83810作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为19.63mg/mL,发现抗体的产量为463mg(92%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.1。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图7中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:1.9%,D2:19.5%,D4-1:53.3%,D6:18.5%和D8:5.5%(图8)。
(v)结果
通过常用方法(实施例3-1)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.4,且其中D4-1的含量为24.6%。另一方面,通过本发明的方法(实施例3-2)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.1,且其中D4-1的含量为53.3%。
(实施例4)人源化抗CD98抗体表达载体的构建和抗体的产生(i)人源化抗CD98抗体重链(hM23-H1)表达载体的构建
合成包含编码人源化抗CD98抗体重链(hM23-H1)的可变区的DNA序列的DNA片段(核苷酸编号36至422)(Artificial Gene Synthesis Service,GENEART),所述DNA片段由SEQ ID NO:11中显示的人源化抗CD98抗体重链(hM23-H1)的核苷酸序列中的核苷酸编号58至405所代表。使用合成的DNA片段作为模板,用KOD-Plus-(TOYOBO)和以下引物组扩增包含编码hM23-H1的可变区的DNA序列的DNA片段。此后,用限制性酶BlpI切割嵌合和人源化抗体IgG1型重链的表达载体pCMA-G1,且然后使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(CLONTECH)将该DNA片段***切割位点,以构建人源化抗CD98抗体重链(hM23-H1)表达载体。获得的表达载体被命名为″pCMA-G1/hM23-H1″。
引物组:
5′-AGCTCCCAGATGGGTGCTGAGC-3′(SEQ ID NO:21:引物EG-Inf-F)
5′-GGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGC-3′(SEQ ID NO:22:引物EG1-Inf-R)
(ii)人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)表达载体的构建
合成包含编码人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)的可变区的DNA序列的DNA片段(核苷酸编号38至420)(Artificial Gene Synthesis Service,GENEART),所述DNA片段由SEQ ID NO:13中显示的人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)的核苷酸序列中的核苷酸编号61至405所代表。使用合成的DNA片段作为模板,用KOD-Plus-(TOYOBO)和以下引物组扩增包含编码人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)的可变区的DNA序列的DNA片段。此后,用限制性酶BsiWI切割嵌合和人源化抗体轻链的表达载体pCMA-LK,且然后使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(CLONTECH)将该DNA片段***切割位点,以构建人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)表达载体。获得的表达载体被命名为″pCMA-LK/hM23-L1″。
引物组:
5′-CTGTGGATCTCCGGCGCGTACGGC-3′(SEQ ID NO:23:引物CM-LKF)
5′-GGAGGGGGCGGCCACCGTACG-3′(SEQ ID NO:24:引物KCL-Inf-R)
(iii)人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)的产生
通过与实施例1,(iii)中应用的方法相同的方法产生人源化抗CD98抗体。将通过pCMA-G1/hM23-H1与pCMA-LK/hM23-L1的组合获得的人源化抗CD98抗体命名为″hM23-H1L1″。
(iv)人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)的纯化
通过与实施例1,(iv)中应用的方法相同的方法从上述(iii)中获得的培养上清液纯化抗体。
(v)人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)的缓冲液交换和浓度的调整
通过与实施例1,(v)中应用的方法相同的方法将上述(iv)中纯化的人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)进行缓冲液的交换和浓度的调整。在操作期间,使用280nm吸光系数(165mLmg-1cm-1)测量抗体的浓度,且其后使用PBS6.0/EDTA将抗体浓度调节至40mg/mL。
(实施例5)人源化抗CD98抗体ADC组合物的产生
(实施例5-1)根据常规方法产生人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)(12mL:对应于480mg,浓度:40mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(36mL,pH5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.0394mL;基于抗体,6个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20(NOF CORPORATION)水溶液(0.048mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调整至pH7.10。在21℃下搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Nacalai Tesque,Inc.)水溶液(2.17mL;每个单一抗体分子,2.31当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物加热3小时以导致35℃至36℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
将上述(i)中获得的溶液冷却,且然后在17℃至18℃的内部温度下在搅拌下经7分钟将6.20mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(2.74mL;每个单一抗体分子,5.2当量)添加至反应溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌40分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸(Kishida Chemical Co.,Ltd.)水溶液(0.197mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌30分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为600mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得21.6mL含有人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值41370作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值77810作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为20.8mg/mL,发现抗体的产量为449mg(91%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.0。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图9中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:4.2%,D2:24.2%,D4-1:27.8%,D4-2:13.3%,D6:20.8%和D8:7.6%(图10)。
(实施例5-2)根据本发明的方法产生人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)(12.5mL:对应于500mg,浓度:40mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(27.5mL,pH5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.041mL;基于抗体,6个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20(NOF CORPORATION)水溶液(0.050mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调整至pH7.10。将反应溶液冷却,且在0℃至1℃的内部温度下在搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Nacalai Tesque,Inc.)水溶液(2.75mL;每个单一抗体分子,2.80当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物搅拌6小时以导致0℃至1℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
在0.7℃至1.2℃的内部温度下在搅拌下,经10分钟将6.08mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(3.14mL;每个单一抗体分子,5.4当量)添加至上述(i)中获得的溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌50分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸(Kishida Chemical Co.,Ltd.)水溶液(0.205mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌30分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为600mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得23.6mL含有人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗CD98抗体(hM23-H1L1)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值41370作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值77810作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为19.91mg/mL,发现抗体的产量为470mg(94%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.1。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图11中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:2.2%,D2:18.1%,D4-1:51.0%,D6:20.6%和D8:7.6%(图12)。
(v)结果
通过常用方法(实施例5-1)产生的人源化抗CD98抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.0,且其中D4-1的含量为27.8%。另一方面,通过本发明的方法(实施例5-2)产生的人源化抗CD98抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.1,且其中D4-1的含量为51.0%。
(实施例6)人源化抗B7-H3抗体ADC组合物的产生
(实施例6-1)根据常规方法产生人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)(根据WO2014/057687的参考实施例1中描述的方法产生,12.4mL:对应于250mg,浓度:20.1mg/mL;25mM柠檬酸盐缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(18mL,pH 7.5)。向本反应溶液中添加0.5MEDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.018mL;基于抗体,5个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯80(NOF CORPORATION)水溶液(0.013mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调整至pH 7.02。在35℃下搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Nacalai Tesque,Inc.)水溶液(1.05mL;每个单一抗体分子,2.15当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物加热2小时以导致35℃至36℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
将上述(i)中获得的溶液冷却,且然后在15℃至16℃的内部温度下在搅拌下经4分钟将6.22mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(1.36mL;每个单一抗体分子,4.8当量)添加至反应溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌20分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸(Kishida Chemical Co.,Ltd.)水溶液(0.102mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌20分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为300mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得13.1mL含有人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值30160作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值87250作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为18.4mg/mL,发现抗体的产量为241mg(94%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为3.8。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图15中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:6.5%,D2:30.5%,D4-1:27.9%,D4-2:12.3%,D6:17.7%和D8:4.9%(图16)。
(实施例6-2)根据本发明的方法产生人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)(根据WO2014/057687的参考实施例1中描述的方法产生,27.1mL:对应于500mg,浓度:18.5mg/mL;10mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加10mM组氨酸缓冲液(25mL)。向本反应溶液中添加蔗糖(MERCK;1.25g)和0.5M EDTA水溶液(CALBIOCHEM;0.041mL;基于抗体,6个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯80(NOF CORPORATION)水溶液(0.050mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调节至pH 7.08。将反应溶液冷却,且在0℃至1℃的内部温度下搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐(NacalaiTesque,Inc.)水溶液(2.08mL;每个单一抗体分子,2.13当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物搅拌5.5小时以导致0℃至1℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
在0℃至1℃的内部温度下在搅拌下,经20分钟将6.04mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(2.82mL;每个单一抗体分子,4.8当量)添加至上述(i)中获得的溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌20分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸(Kishida Chemical Co.,Ltd.)水溶液(0.205mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌20分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为800mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得23.6mL含有人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗B7-H3抗体(M30-H1-L4)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值30160作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值87250作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为19.4mg/mL,发现抗体的产量为455mg(89%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.1。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图17中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:2.7%,D2:22.3%,D4-1:58.4%,D6:14.1%和D8:2.4%(图18)。
(v)结果
通过常用方法(实施例6-1)产生的人源化抗B7-H3抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为3.8,且其中D4-1的含量为27.9%。另一方面,通过本发明的方法(实施例6-2)产生的人源化抗B7-H3抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.1,且其中D4-1的含量为58.4%。
(实施例7)人源化抗HER2抗体ADC组合物的产生
(实施例7-1)根据常规方法产生人源化抗HER2抗体ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗HER2抗体(曲妥珠单抗;美国专利号5821337)(22.3mL:对应于500mg,浓度:22.4mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(27mL,pH 5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(0.034mL;基于抗体,5个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20水溶液(0.050mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调节至pH7.12。在22℃下搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液(2.12mL;每个单一抗体分子,2.15当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物搅拌3小时以导致22℃至25℃的内部温度,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
将上述(i)中获得的溶液冷却,且然后在11℃至13℃的内部温度下在搅拌下经20分钟将6.15mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(2.77mL;每个单一抗体分子,4.8当量)添加至反应溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌20分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸水溶液(0.206mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌20分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为600mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得22.7mL含有人源化抗HER2抗体ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗HER2抗体(曲妥珠单抗)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值26150作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值81290作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为20.39mg/mL,发现抗体的产量为462mg(90%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为3.9。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图21中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:3.6%,D2:26.1%,D4-1:34.1%,D4-2:13.6%,D6:17.6%和D8:5.0%(图22)。
(实施例7-2)根据本发明的方法产生人源化抗HER2抗体ADC组合物
(i)抗体的还原
将人源化抗HER2抗体(曲妥珠单抗;美国专利号5821337)(22.3mL:对应于500mg,浓度:22.4mg/mL;25mM组氨酸缓冲液)置于玻璃反应容器中,且进一步向其中添加25mM组氨酸缓冲液(25mL,pH 5.0)。向本反应溶液中添加0.5M EDTA水溶液(0.034mL;基于抗体,5个当量),且其后向其中添加0.1g/mL聚山梨醇酯20水溶液(0.050mL;基于抗体,0.01%)。其后,将0.3M磷酸氢二钠水溶液添加至反应混合物,使得混合物被调节至pH7.13,且然后冷却混合物。在0℃至1℃的内部温度下,在搅拌下,将1.00mg/mL三(2-羧乙基)膦盐酸盐水溶液(2.37mL;每个单一抗体分子,2.40当量)添加至反应混合物,且然后将获得的混合物在0℃至1℃的内部温度下搅拌6小时,使得抗体的链间二硫化物被还原。
(ii)抗体与药物接头中间体的缀合
在0℃至2℃的内部温度下在搅拌下,经10分钟将6.14mg/mL实施例2中获得的化合物的50%丙酮水溶液(2.84mL;每个单一抗体分子,4.9当量)添加至上述(i)中获得的溶液。将获得的混合物在与上述相同的温度下搅拌40分钟,使得允许药物接头中间体与抗体结合。随后,将50mM N-乙酰半胱氨酸水溶液(0.206mL;每个单一抗体分子,3当量)添加至反应混合物,并将因此获得的混合物在与上述相同的温度下进一步搅拌50分钟。终止药物接头中间体的反应,且然后使用10%乙酸水溶液将反应混合物的pH调节至pH5.0。
(iii)纯化
采用Pellicon XL(Millipore Japan,50cm2),使上述(ii)中获得的溶液循环,同时使用辊泵向其中添加10mM组氨酸缓冲液(pH 5.0),并进行洗涤操作,直至排出的水量变为600mL,以除去低分子量物质。其后,将剩余溶液浓缩以获得21.7mL含有人源化抗HER2抗体ADC组合物的溶液。
(iv)特性的评估
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作A相同的方式测量结合药物的平均数目。在人源化抗HER2抗体(曲妥珠单抗)的情况下,基于其氨基酸序列,使用数值26150作为轻链的摩尔吸光系数的估计值,且使用数值81290作为重链的摩尔吸光系数的估计值。
发现抗体的浓度为21.2mg/mL,发现抗体的产量为459mg(89%),发现通过常用操作A测量的每个单一抗体分子的结合药物的平均数目(n)为4.0。代表各链的峰面积比(%)的HPLC色谱图显示于图23中。
以与实施例3-1,(iv)中描述的常用操作B相同的方式测量结合药物的数目的面积值。结合药物的数目的分布情况如下:D0:2.8%,D2:23.8%,D4-1:55.2%,D6:15.0%和D8:3.3%(图24)。
(v)结果
通过常用方法(实施例7-1)产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为3.9,且其中D4-1的含量为34.1%。另一方面,通过本发明的方法(实施例7-2)产生的人源化抗HER2抗体ADC组合物中的结合药物的平均数目为4.0,且其中D4-1的含量为55.2%。
(测试例1)抗体-药物缀合物组合物的疗效
小鼠:在用于实验之前,将5-6周龄雌性BALB/c-nu/nu小鼠(Charles RiverLaboratories International,Inc.)在SPF条件下驯化4至7天。给小鼠喂食灭菌固体饲料(FR-2,Funabashi Farms Co.,Ltd)和灭菌自来水(通过向自来水中添加5-15ppm次氯酸钠溶液来制备)。
测量和计算表达式:使用电子数字卡尺(CD-15C,Mitutoyo Corp.)每周测量肿瘤的长轴和短轴两次或更多次,然后计算肿瘤的体积(mm3)。应用的计算表达式如下。
肿瘤体积(mm3)=1/2×长轴(mm)×[短轴(mm)]2
将已经购自ATCC的人胰腺癌细胞系CFPAC-1(4×106个细胞)悬浮于生理盐水中。其后,将获得的溶液皮下植入雌性BALB/c-nu/nu小鼠(第0天),且然后在第11天将小鼠随机分组。在完成分组后,将根据常规方法(实施例3-1)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物和根据本发明的方法(实施例3-2)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物各自经由尾静脉以0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg的剂量施用于小鼠。将抗体-药物缀合物组合物都用乙酸盐缓冲盐水(pH 5.5)(Nacalai Tesque,Inc.)稀释,且其后将获得的溶液以10mL/kg的液体量施用于每只小鼠。使用能够使肿瘤体积消退的最小剂量(消退剂量)作为指标来确定疗效。通过常规方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的消退剂量为1mg/kg,而通过本发明的方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的消退剂量也是1mg/kg(图19)。因此,证明了通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物具有与通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物的疗效等效的疗效。
(测试例2)抗体-药物缀合物组合物的安全性
将根据常规方法(实施例3-1)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物和根据本发明的方法(实施例3-2)产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物各自以每三周一次的间隔施用于跨物种的食蟹猴,总共三次。观察猴,直到最后一次施用后次日,并且分析没有提供严重毒性的最大剂量(HNSTD)。作为结果,通过常规方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的HNSTD是10mg/kg,而通过本发明的方法产生的人源化抗TROP2抗体ADC组合物的HNSTD是30mg/kg。因此,证明了通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物具有比通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物的安全性更优异的安全性。
(考量1)
从实施例3、4、6和7的结果发现通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目和通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目均为3.5至4.5。另一方面,通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中的其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量为35%或更少,而通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物中与上述相同的含量为50%或更多。因此,证明了可以通过使用本发明的生产方法来选择性产生抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目是3.5至4.5且其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是50%或更多。
(考量2)
从实施例2的结果证明了通过本发明的生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物具有比通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物的安全性更优异的安全性。
从前述结果证明了,本发明的抗体-药物缀合物组合物(抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目是3.5至4.5,且其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是50%或更多)具有比通过常规生产方法产生的抗体-药物缀合物组合物(抗体-药物缀合物组合物,其中结合药物的平均数目是3.5至4.5,且其中4个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是35%或更少)的安全性更优异的安全性。
序列表自由文本
SEQ ID NO:1:人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的核苷酸序列
SEQ ID NO:2:人源化抗TROP2抗体重链(hTINA1-H1)的氨基酸序列
SEQ ID NO:3:人源化抗TROP2抗体轻链(hTINA1-L1)的核苷酸序列
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SEQ ID NO:10:抗TROP2抗体(TINA1)CDRL3的氨基酸序列
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SEQ ID NO:13:人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)的核苷酸序列
SEQ ID NO:14:人源化抗CD98抗体轻链(hM23-L1)的氨基酸序列
SEQ ID NO:15:抗CD98抗体(M23)CDRH1的氨基酸序列
SEQ ID NO:16:抗CD98抗体(M23)CDRH2的氨基酸序列
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SEQ ID NO:25:人源化抗B7-H3抗体重链(M30-H1)的氨基酸序列
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SEQ ID NO:27:抗B7-H3抗体(M30)CDRH1的氨基酸序列
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SEQ ID NO:34:人源化抗HER2抗体轻链的氨基酸序列
序列表
<110> Daiichi Sankyo Company, Limited
<120> 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
<130> FP1618
<150> JP2015-129692
<151> 2015-06-29
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hTINA1-H1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1410)
<400> 1
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
cca ggc gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac acc ttt 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
acc acc gcc ggc atg cag tgg gtg cgc cag gct cct gga cag ggc ctg 192
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gaa tgg atg ggc tgg atc aac acc cac agc ggc gtg ccc aaa tac gcc 240
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
gag gac ttc aag ggc aga gtg acc atc agc gcc gac acc agc acc tcc 288
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
aca gcc tac ctg cag ctg agc agc ctg aag tcc gag gac acc gcc gtg 336
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
tac tac tgc gcc aga agc ggc ttc ggc agc agc tac tgg tac ttc gac 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
gtg tgg ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtc agc tca gcc tcc acc aag 432
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
ggc cca agc gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc 480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
ggc aca gcc gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc 528
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
gtg acc gtg agc tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc 576
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
ttc ccc gct gtc ctg cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg 624
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac 672
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc 720
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa 768
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
ctc ctg ggg gga ccc tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac 960
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
agc acg tac cgg gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa 1104
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac 1152
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
gcc gtg gag tgg gag agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc 1248
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
acc cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc 1344
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc 1392
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
tcc ctg tct ccc ggc aaa 1410
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 2
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
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420 425 430
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
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<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hTINA1-L1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<400> 3
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Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
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65 70 75 80
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc gtg tac tac tgc cag cag cac tac 336
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
atc acc ccc ctg acc ttt ggc cag ggc acc aag ctg gaa atc aag cgt 384
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc tcc gac gag cag 432
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc ctg agc tcc ccc 672
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 702
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 4
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Thr Ala Gly Met Gln
1 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 11
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hM23-H1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1395)
<400> 11
atg aaa cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gca gct ccc aga tgg 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
gtg ctg agc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa 96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
cca ggc gcc agc gtg aag gtg tcc tgc aag gcc agc ggc tac gcc ttc 144
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
agc aac tac ctg atc gag tgg gtg cgc cag gcc cct gga cag gga ctg 192
Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gaa tgg atg ggc gtg atc aac cct ggc agc ggc gtg acc aac tac aac 240
Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
gag aag ttc aag ggc aga gtg acc atc acc gcc gac acc agc acc tcc 288
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
acc gcc tac atg gaa ctg agc agc ctg cgg agc gag gac acc gcc gtg 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
tac tat tgt gcc aga gcc gag gct tgg ttt gcc tac tgg ggc cag gga 384
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
acc ctc gtg acc gtc agc tca gcc tcc acc aag ggc cca agc gtc ttc 432
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggc ggc aca gcc gcc ctg 480
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
145 150 155 160
ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccc gtg acc gtg agc tgg 528
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccc gct gtc ctg 576
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc 624
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc 672
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa 720
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
225 230 235 240
act cac aca tgc cca ccc tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccc 768
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc 816
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac 864
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 912
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
gcc aag aca aag ccc cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgg gtg 960
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag 1008
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa 1056
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
acc atc tcc aaa gcc aaa ggc cag ccc cgg gaa cca cag gtg tac acc 1104
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
355 360 365
ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc 1152
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
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tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag 1200
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
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agc aat ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc cct ccc gtg ctg 1248
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag 1296
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
agc agg tgg cag cag ggc aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag 1344
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
gct ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctc tcc ctg tct ccc ggc 1392
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
aaa 1395
Lys
465
<210> 12
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
210 215 220
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
260 265 270
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
275 280 285
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
290 295 300
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
325 330 335
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
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Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
370 375 380
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
385 390 395 400
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
420 425 430
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
435 440 445
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450 455 460
Lys
465
<210> 13
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hM23-L1
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(720)
<400> 13
atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
ggc gcg tac ggc gac atc gtg atg acc cag agc cct gac agc ctg gcc 96
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
gtg tct ctg gga gag aga gcc acc atc aac tgc aag agc agc cag agc 144
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
ctg ctg tac tcc agc aac cag aag aac tac ctg gcc tgg tat cag cag 192
Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
aag ccc ggc cag cct ccc aag ctg ctg atc tac tgg gcc agc acc aga 240
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
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gaa agc ggc gtg ccc gat aga ttc agc ggc agc gga agc ggc acc gac 288
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
ttc acc ctg aca atc agc tcc ctg cag gcc gag gac gtg gcc gtg tac 336
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
tac tgc cag cgg tac tac ggc tac ccc tgg acc ttt ggc cag ggc acc 384
Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
aag gtg gaa atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc 432
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
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ccc ccc tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc 480
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
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ctg ctg aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg 528
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
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Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
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gac agc aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc 624
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
aaa gcc gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac 672
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
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cag ggc ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
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Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
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Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
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Tyr Cys Gln Arg Tyr Tyr Gly Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
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180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
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Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
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Asn Tyr Leu Ile Glu
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<213> 小家鼠
<400> 16
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1 5 10 15
Gly
<210> 17
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<213> 小家鼠
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1 5
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<211> 17
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<213> 小家鼠
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1 5 10 15
Ala
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<211> 7
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<213> 小家鼠
<400> 19
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<211> 22
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<220>
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<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物KCL-Inf-R
<400> 24
ggagggggcg gccaccgtac g 21
<210> 25
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M30-H1
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Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
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65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Tyr Tyr Gly Ser Pro Leu Tyr Tyr Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
210 215 220
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
225 230 235 240
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
245 250 255
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
260 265 270
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
275 280 285
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
305 310 315 320
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
325 330 335
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
340 345 350
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
355 360 365
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
370 375 380
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
385 390 395 400
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
405 410 415
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
420 425 430
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
435 440 445
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465 470
<210> 26
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M30-L4
<400> 26
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Arg
35 40 45
Leu Ile Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Ser
100 105 110
Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
115 120 125
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
130 135 140
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
165 170 175
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Asn Tyr Val Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
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<213> 小家鼠
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Arg Ala Ser Ser Arg Leu Ile Tyr Met His
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Gln Gln Trp Asn Ser Asn Pro Pro Thr
1 5
<210> 33
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗的重链
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 34
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗的轻链
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (12)

1.用于产生抗体-药物缀合物组合物的方法,其包括:
(i)使抗体与还原剂在缓冲液中反应以还原链间二硫化物的步骤,其中所述抗体为抗TROP2抗体、抗CD98抗体、抗B7-H3抗体或抗HER2抗体,其中所述还原剂为三(2-羧乙基)膦盐酸盐,且其中所述缓冲液包含螯合剂,所述缓冲液为组氨酸缓冲液,所述螯合剂为乙二胺四乙酸;和
(ii)使药物接头中间体与步骤(i)中获得的具有硫醇基的抗体反应的步骤,其中所述药物接头中间体为
Figure FDA0003746252800000011
其中-GGFG-代表由甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸组成的四肽残基;
步骤(i)中的反应温度为0℃至1℃,步骤(i)中的反应时间为5至7小时;
步骤(ii)中的药物接头中间体用量为基于单个抗体分子的量的4至6摩尔当量,步骤(ii)中的反应温度为-10℃至10℃,和步骤(ii)中的反应时间为0.5至2小时;且
产生的抗体-药物缀合物组合物中的结合药物的平均数目是4.0至4.1,并且在产生的抗体-药物缀合物组合物中,其中四个药物接头与重-轻链间硫醇结合的抗体-药物缀合物的含量是50%至60%;
其中所述还原剂以每个抗体分子2至3摩尔当量的量使用。
2.根据权利要求1所述的生产方法,其中所述抗体为抗TROP2抗体。
3.根据权利要求2所述的生产方法,其中所述抗TROP2抗体保留氨基酸序列为SEQ IDNO:5(TAGMQ)的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO:6(WINTHSGVPKYAEDFKG)的CDRH2,氨基酸序列为SEQ ID NO:7(SGFGSSYWYFDV)的CDRH3、氨基酸序列为SEQ ID NO:8(KASQDVSTAVA)的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO:9(SASYRYT)的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO:10(QQHYITPLT)的CDRL3。
4.根据权利要求2所述的生产方法,其中所述抗TROP2抗体由重链和轻链组成,其中所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:2的位置20至470的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:4的位置21至234的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的生产方法,其中所述抗TROP2抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失。
6.根据权利要求1所述的生产方法,其中所述抗体为抗B7-H3抗体。
7.根据权利要求6所述的生产方法,其中所述抗B7-H3抗体保留氨基酸序列为SEQ IDNO:27(NYVMH)的CDRH1、氨基酸序列为SEQ ID NO:28(YINPYNDDVKYNEKFKG)的CDRH2、氨基酸序列为SEQ ID NO:29(WGYYGSPLYYFDY)的CDRH3、氨基酸序列为SEQ ID NO:30(RASSRLIYMH)的CDRL1、氨基酸序列为SEQ ID NO:31(ATSNLAS)的CDRL2和氨基酸序列为SEQ ID NO:32(QQWNSNPPT)的CDRL3。
8.根据权利要求6所述的生产方法,其中所述抗B7-H3抗体由重链和轻链组成,其中所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:25的位置20至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:26的位置21至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的生产方法,其中所述抗B7-H3抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失。
10.根据权利要求1所述的生产方法,其中所述抗体为抗HER2抗体。
11.根据权利要求10所述的生产方法,其中所述抗HER2抗体由重链和轻链组成,其中所述重链由以下组成:由SEQ ID NO:33的位置1至449的氨基酸残基组成的氨基酸序列,且所述轻链由以下组成:由SEQ ID NO:34的位置1至214的氨基酸残基组成的氨基酸序列。
12.根据权利要求10所述的生产方法,其中所述抗HER2抗体由重链和轻链组成,其中所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:33,且所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:34。
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