JP7030661B2 - Cryopreservation solution - Google Patents

Description

本発明は、細胞又は組織の凍結保存に用いられる凍結保存液に関する。 The present invention relates to a cryopreservation solution used for cryopreservation of cells or tissues.

生物の細胞又は組織の優れた保存技術は、様々な産業分野で求められている。一般に、生体内から採取された細胞又は組織は、たとえ培養液の中であっても、次第に活性が失われていくことから、生体外での細胞又は組織の長期間の培養は好ましくない。そのため、生体活性を失わせずに長期間保存するための技術が重要である。優れた保存技術によって、より高い生体活性を保ったまま細胞又は組織を移植することで、移植後の生着率の向上が望める。さらに、優れた保存技術は、生体外で培養した培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シートのような移植のための人工の組織を、順次生産して保存しておき、必要なときに使用することも可能となり、研究・医療の面だけではなく、産業面においても大きなメリットが期待できる。また、優れた保存技術によって、採取された細胞又は組織をより正確に分析することが可能となる。 Excellent preservation techniques for living cells or tissues are sought after in various industrial fields. In general, cells or tissues collected from a living body gradually lose their activity even in a culture medium, and therefore long-term culture of cells or tissues in vitro is not preferable. Therefore, a technique for long-term storage without losing biological activity is important. By transplanting cells or tissues while maintaining higher biological activity by using excellent preservation technology, it is expected that the engraftment rate after transplantation will be improved. Furthermore, an excellent preservation technology is to sequentially produce and preserve artificial tissues for transplantation such as cultured skin cultured in vitro and so-called cell sheets constructed in vitro, and use them when necessary. It is possible to do so, and great merits can be expected not only in terms of research and medical care, but also in terms of industry. In addition, excellent preservation techniques make it possible to analyze the collected cells or tissues more accurately.

細胞又は組織の保存方法として、例えば緩慢凍結法が知られている。この方法では、まず、例えばリン酸緩衝生理食塩水等の生理的溶液に耐凍剤を含有させることで得られた凍結保存液に、細胞又は組織を浸漬する。該耐凍剤としては、グリセロール、エチレングリコール等の化合物が用いられる。該保存液に、細胞又は組織を浸漬後、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／ｍｉｎの速度）で、－３０～－３５℃まで冷却することにより、細胞内外又は組織内外の溶液が十分に冷却され、該保存液の粘性が高くなる。このような状態で、該保存液中の細胞又は組織をさらに液体窒素の温度（－１９６℃）まで冷却すると、細胞内又は組織内とその周囲の微少溶液がいずれも非結晶のまま固化するガラス化が起こる。ガラス化により、細胞内外又は組織内外が固化すると、実質的に分子の動きがなくなるので、ガラス化された細胞又は組織を液体窒素中に保存することで、半永久的に保存できると考えられる。 As a method for preserving cells or tissues, for example, a slow freezing method is known. In this method, first, cells or tissues are immersed in a cryopreservation solution obtained by containing a freezing agent in a physiological solution such as phosphate buffered saline. As the antifreeze agent, compounds such as glycerol and ethylene glycol are used. After immersing the cells or tissues in the preservation solution, the cells or tissues are cooled to −30 to −35 ° C. at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min) to the inside and outside of the cells or the tissues. The inner and outer solutions are sufficiently cooled, and the viscosity of the storage solution becomes high. In such a state, when the cells or tissues in the preservation solution are further cooled to the temperature of liquid nitrogen (-196 ° C.), the microsolutions in and around the cells or tissues are solidified in an amorphous state. Amorphous occurs. When the inside and outside of the cell or the inside and outside of the tissue are solidified by vitrification, the movement of the molecule is substantially stopped. Therefore, it is considered that the vitrified cell or tissue can be stored semi-permanently by storing it in liquid nitrogen.

しかしながら、緩慢凍結法では、比較的遅い冷却速度で冷却する必要があるために、凍結保存のための操作に時間を要するという問題がある。また、冷却速度を制御するための装置又は治具を必要とする問題がある。加えて、緩慢凍結法では、細胞外又は組織外の保存液中に氷晶が形成されるので、細胞又は組織が該氷晶により物理的に損害を受けるおそれがある。 However, the slow freezing method has a problem that it takes time for the operation for cryopreservation because it is necessary to cool at a relatively slow cooling rate. Further, there is a problem that an apparatus or a jig for controlling the cooling rate is required. In addition, in the slow freezing method, ice crystals are formed in the extracellular or extracellular storage solution, and the cells or tissues may be physically damaged by the ice crystals.

上記した緩慢凍結法での問題点を解決するための方法として、ガラス化凍結保存法が提案されている。ガラス化凍結保存法とは、グリセロール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの耐凍剤を多量に含む凍結保存液の凝固点降下により、氷点下でも氷晶ができにくくなる原理を用いたものである。この凍結保存液を急速に液体窒素中で冷却させると氷晶を生じさせないまま固化させることができる。このように固化させることをガラス化凍結という。 As a method for solving the above-mentioned problems in the slow freezing method, a vitrification cryopreservation method has been proposed. The vitrification cryopreservation method uses the principle that ice crystals are less likely to form even below freezing point due to a freezing point depression of a cryopreservation solution containing a large amount of antifreezing agent such as glycerol, ethylene glycol, and DMSO (dimethyl sulfoxide). When this cryopreservation solution is rapidly cooled in liquid nitrogen, it can be solidified without forming ice crystals. This solidification is called vitrification freezing.

前記ガラス化凍結保存法の具体的な操作としては、凍結保存液に細胞を浸漬させ、その後、液体窒素の温度（－１９６℃）で冷却する。ガラス化凍結保存法は、このような簡便かつ迅速な工程であるために、凍結保存のための操作に長い時間を必要としない他、温度制御をするための装置又は治具を必要としないという利点がある。 As a specific operation of the vitrification cryopreservation method, cells are immersed in a cryopreservation solution and then cooled at the temperature of liquid nitrogen (-196 ° C.). Since the vitrification cryopreservation method is such a simple and rapid process, the operation for cryopreservation does not require a long time, and no device or jig for temperature control is required. There are advantages.

ガラス化凍結法を用いると、原理的には、細胞内外のいずれにも氷晶が生じないために凍結時及び融解時の細胞への物理的障害（凍害）を回避することができるが、適切なガラス化凍結を成し得るためには、ガラス化に用いる保存液に含有される耐凍剤の濃度を高いものとしなければならない。一方で、凍結保存液に含まれる高濃度の耐凍剤は細胞にとっての化学的毒性が高いため、細胞毒性を低減する観点では、可能な限り濃度を低くすることが好ましい。低濃度の耐凍剤を含有する凍結保存液でガラス化凍結を行うためには、凍結速度を速める必要があることが知られている。 In principle, the vitrification freezing method can avoid physical damage to cells (freezing damage) during freezing and thawing because ice crystals do not form inside or outside the cells, but it is appropriate. In order to achieve stable vitrification freezing, the concentration of the antifreezing agent contained in the preservative solution used for vitrification must be high. On the other hand, since the high-concentration antifreeze agent contained in the cryopreservation solution is highly chemically toxic to cells, it is preferable to reduce the concentration as much as possible from the viewpoint of reducing cytotoxicity. It is known that it is necessary to increase the freezing rate in order to perform vitrification freezing with a cryopreservation solution containing a low concentration of antifreezing agent.

細胞又は組織の凍結速度を速める観点から、凍結保存時には細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液量は少ない方が好ましい。細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液が少ないほど凍結対象の熱容量が少なくなり、細胞又は組織の凍結速度が速くなり、ガラス化凍結にとっては好ましいといえる。さらに、細胞又は組織の周囲に存在する凍結保存液が少ないことは、凍結後の融解時においても、凍結保存液が速やかに融解液中に希釈され、細胞又は組織中への再氷晶形成を抑制する観点で好ましい。さらには、融解時に融解液中に混入する耐凍剤の濃度を低くすることができ、耐凍剤に由来する化学的毒性を低減する観点からも好ましい。 From the viewpoint of accelerating the freezing rate of cells or tissues, it is preferable that the amount of cryopreservation solution existing around the cells or tissues during cryopreservation is small. The smaller the amount of cryopreservation solution present around the cells or tissues, the smaller the heat capacity of the object to be frozen, and the faster the freezing rate of the cells or tissues, which is preferable for vitrification freezing. Furthermore, the small amount of cryopreservation solution present around the cells or tissues means that the cryopreservation solution is rapidly diluted in the thaw solution even during thawing after freezing, resulting in the formation of re-ice crystals in the cells or tissues. It is preferable from the viewpoint of suppressing. Further, it is possible to reduce the concentration of the antifreeze agent mixed in the thawed liquid at the time of thawing, which is preferable from the viewpoint of reducing the chemical toxicity derived from the antifreeze agent.

ガラス化凍結保存法を用いた細胞又は組織の凍結保存については、様々な方法で、様々な種類の細胞又は組織を用いた例が示されている。例えば、特許文献１では、動物又はヒトの生殖細胞又は体細胞へのガラス化凍結保存法の適用が、凍結保存及び融解後の生存率の点で、極めて有用であることが示されており、５．５Ｍエチレングリコール及び１Ｍスクロースを含有する凍結保存液、４０質量％エチレングリコール及び０．３Ｍトレハロースを含有する凍結保存液等が記載されている。 For cryopreservation of cells or tissues using the vitrification cryopreservation method, examples using various types of cells or tissues are shown by various methods. For example, Patent Document 1 shows that the application of the vitrified cryopreservation method to animal or human germ cells or somatic cells is extremely useful in terms of survival rate after cryopreservation and thawing. A cryopreservation solution containing 5.5 M ethylene glycol and 1 M sucrose, a cryopreservation solution containing 40 mass% ethylene glycol and 0.3 M trehalose, and the like are described.

ガラス化凍結保存法は、主にヒトの生殖細胞を用いて発展してきた技術であるが、最近では、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞への応用も広く検討されている。また、非特許文献１では、ショウジョウバエの胚の保存にガラス化凍結保存法が有効であったことが示されている。さらに、特許文献２では、植物培養細胞や組織の保存において、ガラス化凍結保存法が有効であることが示されている。前者においては、エチレングルコール、グリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ＤＭＳＯを耐凍剤として含有する凍結保存液が記載され、後者においては、凍結保存液が含有する耐凍剤（凍結保護剤）として、ＤＭＳＯ、プロピレングリコール、グリセロール、ポリエチレングリコール、ブタンジオール、ホルムアミド、プロパンジオール、ソルビトール、マンニトール等が例示されている。このように、ガラス化凍結保存法は広く様々な種の細胞及び組織の保存に有用であることが知られている。 The vitrification cryopreservation method is a technique that has been developed mainly using human germ cells, but recently, its application to iPS cells and ES cells has been widely studied. Further, Non-Patent Document 1 shows that the vitrification cryopreservation method was effective for the preservation of Drosophila embryos. Further, Patent Document 2 shows that the vitrification cryopreservation method is effective in preserving cultured plant cells and tissues. In the former, a cryopreservation solution containing ethylene glycol, glycol, propylene glycol, glycerol, and DMSO as a freezing agent is described, and in the latter, DMSO, as a freezing agent (freezing protection agent) contained in the cryopreservation solution, is described. Examples thereof include propylene glycol, glycerol, polyethylene glycol, butanediol, formamide, propanediol, sorbitol, and mannitol. Thus, vitrification cryopreservation methods are known to be useful for the preservation of cells and tissues of a wide variety of species.

特許文献３では、卵子又は胚を、凍結保存液と共に保存液除去材の上に載置し、下部から吸引することで卵子又は胚の周囲に付着した余分な凍結保存液を除き、優れた生存率で凍結保存させる方法が提案され、該凍結保存液はエチレングリコール、グリセロール及びスクロースを含有する。 In Patent Document 3, an egg or an embryo is placed on a preservation solution removing material together with a cryopreservation solution, and by sucking from the lower part, an excess cryopreservation solution adhering to the periphery of the egg or the embryo is removed, and excellent survival is achieved. A method of cryopreservation at a rate has been proposed, and the cryopreservation solution contains ethylene glycol, glycerol and sucrose.

また、特許文献４には、緩慢凍結法における細胞又は組織の凍結保存液として、主に細胞の保護、つまりは優れた生存率の達成を目的として、１．５％のポリビニルアルコールを含有する凍結保存液が提案され、特許文献５及び特許文献６には、ガラス化凍結保存法における凍結保存液が含有する細胞保護物質又は凍結保護物質として、ポリビニルアルコールがそれぞれ記載されている。一方、特許文献７には、細胞又は組織を載置する載置部にエチレンオキサイド基を有する変性ＰＶＡを含有する乾燥膜である最表層を有する凍結保存用治具が記載され、該最表層が融解液中に溶解することで、細胞又は組織の回収性（細胞又は組織の剥離性）を高めている。 Further, Patent Document 4 describes freezing containing 1.5% polyvinyl alcohol as a cryopreservation solution for cells or tissues in a slow freezing method, mainly for the purpose of protecting cells, that is, achieving excellent survival rate. A preservation solution has been proposed, and Patent Documents 5 and 6 describe polyvinyl alcohol as a cytoprotective substance or a cryoprotectant substance contained in the cryopreservation solution in the vitrification cryopreservation method, respectively. On the other hand, Patent Document 7 describes a cryopreservation jig having an outermost layer, which is a dry film containing a modified PVA having an ethylene oxide group in an embedding portion on which cells or tissues are placed, and the outermost layer is described. By dissolving in the lysate, the recoverability of cells or tissues (cell or tissue exfoliation) is enhanced.

特許第３０４４３２３号公報Japanese Patent No. 3044323 特開２００８－５８４６号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2008-5846 国際公開第２０１１／０７０９７３号パンフレットInternational Publication No. 2011/070973 Pamphlet 特開２００５－２６１４１３号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-261413 特開２０１０－２１３６９２号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2010-213692 特開２０１３－１１１０１７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2013-11017 特開２０１７－６０４５７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2017-60457

Ｓｔｅｐｏｎｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４５：１７０－１７２（１９９０）Steponkus et al. , Nature 345: 170-172 (1990)

上述の通り、ガラス化凍結保存においては、細胞又は組織を、少量の凍結保存液とともに載置することにより、細胞又は組織の優れた生存性が達成されるが、少量の凍結保存液とともに細胞又は組織を載置し凍結した場合、凍結後に融解する際、細胞又は組織の種類や状態等によって、しばしばシート上の卵子又は胚が載置部表面に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題があった。さらには、作業者が凍結に好ましい状態である、より少量の凍結保存液で細胞又は組織を凍結保存するほど、凍結後に融解する際に、細胞又は組織が載置部表面に固着する問題が顕著であった。 As mentioned above, in vitrification cryopreservation, placing cells or tissues with a small amount of cryopreservation solution achieves excellent viability of the cells or tissues, but with a small amount of cryopreservation solution the cells or tissues. When the tissue is placed and frozen, when it is thawed after freezing, the egg or embryo on the sheet often sticks to the surface of the placement part depending on the type and condition of the cell or tissue, and it is expensive to collect them. There was a problem that skill was required. Furthermore, the more the cells or tissues are cryopreserved with a smaller amount of cryopreservation solution, which is a preferable state for freezing by the operator, the more remarkable the problem that the cells or tissues adhere to the surface of the placement portion when thawed after freezing. Met.

特に、前述した特許文献３では、胚または卵子を載置する部分にガラス化保存液除去材を用いることにより、細胞又は組織の周囲に付着した余分な凍結保存液を作業者が除く必要はなく、余分な凍結保存液を除き、少量の凍結保存液とともに凍結するという点では良好な作業性が得られるものの、保存液吸収体が保存液を吸収する際に、細胞又は組織が保存液吸収体にとりわけ強固に固着する場合があり、細胞又は組織を回収する際に特に高い技量が要求される場合があった。また、凍結作業において細胞又は組織は凍結保存液中で数回ピペッティングされた後、凍結されるが、この操作性も重要である。 In particular, in Patent Document 3 described above, it is not necessary for the operator to remove the excess cryopreservation solution adhering to the periphery of the cell or tissue by using the vitrified preservation solution removing material in the portion where the embryo or egg is placed. Although good workability can be obtained in that it freezes with a small amount of cryopreservation solution except for excess cryopreservation solution, when the preservation solution absorber absorbs the preservation solution, the cells or tissues are the preservation solution absorber. In some cases, it adheres particularly firmly to the cells, and in some cases, particularly high skill is required when recovering cells or tissues. Further, in the freezing operation, cells or tissues are pipetted several times in a cryopreservation solution and then frozen, and this operability is also important.

本発明は、細胞又は組織の凍結保存作業を容易かつ確実に行うことが可能な、細胞又は組織の凍結保存液を提供することを主な課題とする。より具体的には、凍結作業時のピペット操作において良好な作業性を示し、かつ、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存液を提供することを課題とする。 The main object of the present invention is to provide a cryopreservation solution for cells or tissues, which can easily and reliably perform a cryopreservation operation for cells or tissues. More specifically, it is possible to show good workability in pipette operation during freezing work, and to easily collect cells or tissue during thawing work without the cells or tissue sticking to the surface of the mounting portion. An object of the present invention is to provide a cryopreservation solution that can be used.

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下の手段によって、上記課題を解決できることを見出した。 As a result of diligent studies to solve the above-mentioned problems, the present inventor has found that the above-mentioned problems can be solved by the following means.

（１）エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールを０．１～３質量％含有することを特徴とする凍結保存液。 (1) A cryopreservation solution containing 0.1 to 3% by mass of modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.

上記（１）の発明によれば、細胞又は組織をガラス化凍結保存する際に、凍結作業時のピペット操作において良好な作業性を示し、かつ、融解作業時に、細胞又は組織が載置部表面に固着することなく、細胞又は組織を容易に回収することができる凍結保存液を提供することができる。 According to the invention of (1) above, when cells or tissues are vitrified and cryopreserved, good workability is shown in pipette operation during freezing work, and cells or tissues are placed on the surface of the mounting portion during thawing work. It is possible to provide a cryopreservation solution capable of easily recovering cells or tissues without sticking to.

本発明の凍結保存液は、細胞又は組織を凍結保存する際に用いられるものである。本発明において細胞とは、１個の細胞または複数の細胞からなる生物の細胞集団を含むものである。複数の細胞からなる細胞集団とは単一の種類の細胞から構成されるコロニー状あるいはクラスター状の細胞集団でも良いし、複数の種類の細胞から構成されるコロニー状あるいはクラスター状の細胞集団でも良い。また、組織とは、単一の種類の細胞から構成される組織でも良いし、複数の種類の細胞から構成される組織でも良く、細胞以外に細胞外マトリックスのような非細胞性の物質を含むものでも良い。 The cryopreservation solution of the present invention is used for cryopreserving cells or tissues. In the present invention, a cell includes a cell population of an organism consisting of one cell or a plurality of cells. The cell population consisting of a plurality of cells may be a colony-like or cluster-like cell population composed of a single type of cell, or may be a colony-like or cluster-like cell population composed of a plurality of types of cells. .. Further, the tissue may be a tissue composed of a single type of cells or a tissue composed of a plurality of types of cells, and may contain a non-cellular substance such as an extracellular matrix in addition to the cells. It may be a thing.

本発明の凍結保存液は、凍結保存作業に用いるものであり、好ましくはガラス化凍結保存作業に用いるものである。より詳細には、本発明の凍結保存液は、クライオトップ（登録商標）法をはじめとする胚又は卵子の凍結保存に好ましく用いることができる。 The cryopreservation solution of the present invention is used for cryopreservation work, and is preferably used for vitrification cryopreservation work. More specifically, the cryopreservation solution of the present invention can be preferably used for cryopreservation of embryos or eggs including the cryotop (registered trademark) method.

クライオトップ法における凍結作業は、一般に以下のような手順で行われる。胚や卵子等の細胞又は組織を平衡化液に浸漬した後に、ピペット等の細管状の治具を用いて、細胞又は組織を少量の平衡化液と共に取り出し、凍結保存液中に移動させる。細胞又は組織を所定時間、凍結保存液中に浸漬させた後に、少量の凍結保存液と共に取り出し、細胞又は組織を凍結保存用治具が有するシート（例えば、特開２００２－３１５５７３号公報や特開２００６－２７１３９５号公報に記載される無色透明な卵付着保持用ストリップや、特許文献３に記載されるガラス化保存液除去材）上に少量の凍結保存液と共に滴下付着させる。この際に、滴下した凍結保存液が多い場合はピペット等の細管状の治具を用いて余分な凍結保存液を除く操作を行う。その後、細胞又は組織を載置したシートを液体窒素等の冷却媒体に浸漬させて凍結する。なお、凍結作業においては、細胞又は組織中の水分を脱水させ、耐凍剤を含む溶液に置換させることを目的とし、平衡化液中又は凍結保存液中において、細胞又は組織を細管状の治具を用いてピペッティングする作業がなされることがあるが、本発明によれば該ピペット操作を良好な作業性にて行うことができる。次に融解作業について説明する。細胞又は組織を融解する際には、シート上に載置された細胞又は組織を冷却媒体から取り出し、融解液中に浸漬させて融解する。本発明の凍結保存液を用いると、融解時には容易に細胞又は組織を載置部上から回収できることから、細胞又は組織の凍結保存にかかる作業を容易にかつ確実に行うことができる。 The freezing work in the cryotop method is generally performed by the following procedure. After immersing cells or tissues such as embryos and eggs in the equilibrium solution, the cells or tissues are taken out together with a small amount of the equilibrium solution using a thin tubular jig such as a pipette and transferred to a cryopreservation solution. After the cells or tissues are immersed in the cryopreservation solution for a predetermined time, they are taken out together with a small amount of the cryopreservation solution, and the cells or tissues are taken out with a sheet (for example, JP-A-2002-315573 and JP-A-2002-315573). It is dropped and adhered to a colorless and transparent egg adhesion holding strip described in Japanese Patent Publication No. 2006-271395 and a vitrification preservation solution removing material described in Patent Document 3 together with a small amount of cryopreservation solution. At this time, if there is a large amount of the cryopreservation solution dropped, use a thin tubular jig such as a pipette to remove the excess cryopreservation solution. Then, the sheet on which the cells or tissues are placed is immersed in a cooling medium such as liquid nitrogen and frozen. In the freezing operation, the purpose is to dehydrate the water in the cells or tissues and replace them with a solution containing a freezing agent, and the cells or tissues are formed into a thin tubular jig in an equilibrium solution or a cryopreservation solution. However, according to the present invention, the pipette operation can be performed with good workability. Next, the melting operation will be described. When thawing cells or tissues, the cells or tissues placed on the sheet are taken out from the cooling medium and immersed in a melting solution to melt. When the cryopreservation solution of the present invention is used, the cells or tissues can be easily recovered from the placement portion at the time of thawing, so that the work related to the cryopreservation of the cells or tissues can be easily and surely performed.

本明細書におけるガラス化凍結とは、比較的遅い冷却速度（例えば０．３～０．５℃／ｍｉｎの速度）で凍結するいわゆる緩慢凍結法とは異なり、極低温の冷却媒体（例えば液体窒素）を用いて速い冷却速度で、氷晶形成を抑制しながら細胞又は組織を凍結させる方法をさす。ガラス化凍結における冷却速度は、例えば、（株）チノー製シース型熱電対（先端外径０．３ｍｍ）を用いて測定される０℃から－１５０℃までの冷却速度が２００℃／ｍｉｎ以上である。 Vitrification freezing in the present specification is different from the so-called slow freezing method in which freezing is performed at a relatively slow cooling rate (for example, a rate of 0.3 to 0.5 ° C./min), and a cooling medium having an extremely low temperature (for example, liquid nitrogen) is used. ) Is used to freeze cells or tissues at a high cooling rate while suppressing ice crystal formation. The cooling rate in vitrification freezing is, for example, when the cooling rate from 0 ° C to -150 ° C measured using a sheathed thermocouple manufactured by Chino Co., Ltd. (tip outer diameter 0.3 mm) is 200 ° C / min or more. be.

本発明の凍結保存液は、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールを含有する。 The cryopreservation solution of the present invention contains a modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.

ポリビニルアルコールは、凍結保存液においては、細胞保護物質又は凍結保護物質としての役割が知られ、主に凍結融解後の生存性を向上させる目的で含有させることが知られている。前述した特許文献４によれば、同様に凍結保護物質として添加するタンパク質の代替物質として胚細胞の骨格を維持する作用があることが記載されている。 Polyvinyl alcohol is known to play a role as a cytoprotective substance or a cryoprotectant substance in a cryopreservation solution, and is known to be contained mainly for the purpose of improving viability after freeze-thaw. According to the above-mentioned Patent Document 4, it is described that it has an action of maintaining the skeleton of embryo cells as a substitute substance for a protein to be added as a freeze-protecting substance.

本発明の凍結保存液が含有するポリビニルアルコールは、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールである。エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールは、優れた親水性、適度な溶解性を有し、該ポリビニルアルコールを含有する凍結保存液は、細胞又は組織と共に前記したシート上に滴下した際に、載置部表面に溶液状態で残存・付着し、載置部表面を被覆する。また、載置部表面に載置された細胞又は組織の周囲は該ポリビニルアルコールによって被覆される。これらのプロセスにより形成された被覆部は、細胞又は組織の載置部上への固着防止に対して有効に作用し、結果、細胞又は組織を容易に回収することが可能となる。エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールは、例えば、日本合成化学工業（株）製のゴーセネックス（登録商標）ＷＯ－３２０Ｎ、ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを使用することができる。 The polyvinyl alcohol contained in the cryopreservation solution of the present invention is a modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group. The modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group has excellent hydrophilicity and moderate solubility, and the cryopreservation solution containing the polyvinyl alcohol is placed when dropped onto the above-mentioned sheet together with cells or tissues. It remains and adheres to the surface of the part in a solution state, and covers the surface of the placed part. Further, the periphery of the cell or tissue placed on the surface of the placement portion is covered with the polyvinyl alcohol. The covering portion formed by these processes effectively acts to prevent the cells or tissues from sticking to the placement portion, and as a result, the cells or tissues can be easily recovered. As the modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group, for example, Gosenex (registered trademark) WO-320N and Gosenex WO-320R manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd. can be used.

本発明の凍結保存液が含有するエチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールの含有量は、０．１～３質量％である。含有量が０．１質量％を下回る場合には、融解作業時の良好な剥離性が得られない場合がある。一方、含有量が３質量％を上回る場合には、凍結保存液の粘性が高すぎるために、ピペット等の細管状の治具操作などのハンドリングに支障が生じる場合があり、凍結保存液中でのピペッティング作業や凍結保存液から細胞又は組織を取り出す際の作業性が低下する場合がある。エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールのより好ましい含有量は０．７～２．２質量％である。
The content of the modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group contained in the cryopreservation solution of the present invention is 0.1 to 3% by mass . If the content is less than 0.1% by mass, good peelability during melting work may not be obtained. On the other hand, if the content exceeds 3% by mass, the viscosity of the cryopreservation solution is too high, which may interfere with handling such as operation of a thin tubular jig such as a pipette. The workability of pipetting and taking out cells or tissues from the cryopreservation solution may be reduced. A more preferable content of the modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group is 0.7 to 2.2% by mass.

本発明の凍結保存液は、有機溶媒系耐凍剤を含有することが好ましい。有機溶媒系耐凍剤としては、エチレングリコール、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリセロール、プロピレングリコール、プロパンジオール等の有機溶媒系耐凍剤を好適に用いることができる。有機溶媒系耐凍剤は単独で用いても良いし、二種類以上を併用して用いても良い。本発明の凍結保存液中の該有機溶媒系耐凍剤の濃度は、２０～５０容量％であることが好ましい。より好ましくは２５～４５容量％である。 The cryopreservation solution of the present invention preferably contains an organic solvent-based antifreeze agent. As the organic solvent-based freezing agent, an organic solvent-based antifreezing agent such as ethylene glycol, DMSO (dimethyl sulfoxide), glycerol, propylene glycol, and propanediol can be preferably used. The organic solvent-based antifreeze may be used alone or in combination of two or more. The concentration of the organic solvent-based freezing agent in the cryopreservation solution of the present invention is preferably 20 to 50% by volume. More preferably, it is 25 to 45% by volume.

本発明の凍結保存液は、浸透圧調整及びガラス化性能（耐凍性能）付与の観点から、糖類を含有することができる。糖類としては、スクロース、トレハロース、グルコース、ラフィノース、ラクトース、マルトース、マンノース、ガラクトース、フルクトースを好適に用いることができる。糖類は単独で用いても良いし、二種類以上を併用して用いても良い。本発明のガラス化凍結保存液中の該糖類の濃度は、０．２～１Ｍであることが好ましく、より好ましくは、０．３～０．７Ｍである。 The cryopreservation solution of the present invention can contain saccharides from the viewpoint of adjusting the osmotic pressure and imparting vitrification performance (freezing resistance). As the saccharide, sucrose, trehalose, glucose, raffinose, lactose, maltose, mannose, galactose, and fructose can be preferably used. The saccharides may be used alone or in combination of two or more. The concentration of the saccharide in the vitrified cryopreservation solution of the present invention is preferably 0.2 to 1 M, more preferably 0.3 to 0.7 M.

本発明の凍結保存液は、粘度調整や細胞保護効果の観点で、エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコール以外の高分子化合物を含有することができる。高分子化合物としては、例えば、ポリエチレングリコール、フィコール（スクロースとエピクロロヒドリンの共重合体）、デキストラン、ポリビニルピロリドン、アルブミン等の高分子化合物、または、ヒアルロン酸、ジェランガム、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム等のアルギン酸誘導体およびその塩、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体およびその塩等の増粘性多糖類等が例示される。これら高分子化合物の含有量は、エチレンオキサイド基を有するポリビニルアルコールに対して１００質量％以下であることが好ましい。 The cryopreservation solution of the present invention can contain a polymer compound other than polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group from the viewpoint of viscosity adjustment and cell protection effect. Examples of the polymer compound include polymer compounds such as polyethylene glycol, ficol (a copolymer of sucrose and epichlorohydrin), dextran, polyvinylpyrrolidone, and albumin, or hyaluronic acid, gellan gum, xanthan gum, carrageenan, and sodium alginate. Examples thereof include alginate derivatives such as and salts thereof, cellulose derivatives such as methyl cellulose, ethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose and carboxymethyl cellulose, and thickening polysaccharides such as salts thereof. The content of these polymer compounds is preferably 100% by mass or less with respect to polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.

本発明の凍結保存液は、その他、血清のような生物由来材料を含有することができる。血清は、その構成成分が未だ完全に解明されていないものの、凍結時の細胞保護効果を目的として、広く用いられている。 The cryopreservation solution of the present invention can also contain other biological materials such as serum. Although the constituents of serum have not been completely elucidated, it is widely used for the purpose of protecting cells during freezing.

本発明の凍結保存液を用いた凍結作業において、細胞又は組織を凍結保存液に浸漬させる時間（細胞を凍結保存液と接触させてから、冷却溶媒で冷却を開始するまでの時間）は、用いる凍結保存液の組成によるものの、多くの場合、凍結保存液の化学的毒性を避けるという観点で、３分以内が好ましい。より好ましくは１分３０秒以内である。 In the freezing operation using the cryopreservation solution of the present invention, the time for immersing the cells or tissues in the cryopreservation solution (the time from the contact of the cells with the cryopreservation solution to the start of cooling with the cooling solvent) is used. Although it depends on the composition of the cryopreservation solution, in many cases, within 3 minutes is preferable from the viewpoint of avoiding the chemical toxicity of the cryopreservation solution. More preferably, it is within 1 minute and 30 seconds.

本発明の凍結保存液を用いた凍結保存作業は、細胞又は組織の平衡化処理の後に、凍結保存液に細胞又は組織を浸漬させた後、極低温の冷却媒体を用いて細胞をガラス化凍結させることが好ましい。速やかな冷却速度で凍結させることで、氷晶の形成が少ない状態で細胞が凍結保存されることが期待される。冷却媒体としては、液体窒素を用いることが好ましい。 In the cryopreservation work using the cryopreservation solution of the present invention, after the equilibrium treatment of cells or tissues, the cells or tissues are immersed in the cryopreservation solution, and then the cells are vitrified and frozen using an ultra-low temperature cooling medium. It is preferable to let it. By freezing at a rapid cooling rate, it is expected that the cells will be cryopreserved with little formation of ice crystals. It is preferable to use liquid nitrogen as the cooling medium.

速やかな冷却速度で凍結させるために、細胞又は組織を、少量の凍結保存液とともに凍結することが一般になされ、これにより、細胞又は組織の優れた生存性が達成される。一方で、少量の保存液とともに細胞又は組織を載置し凍結した場合、凍結後に融解する際、細胞又は組織の種類や状態等によって、しばしばシート上の細胞又は組織が載置部表面に固着してしまい、これらを回収する際に高い技量が要求されるという問題がある。特に、特許文献３に提案されているようなガラス化保存液除去材（例えば、メンブレンフィルターや金網、あるいは濾紙等の吸収体）を用いて余分なガラス化液を除く方法では、優れた冷却速度が達成される一方で、細胞又は組織の固着がより顕著になる問題があるが、本発明の凍結保存液を用いると、融解時に細胞又は組織が容易に剥離できることから、好適に使用できる。 In order to freeze at a rapid cooling rate, it is common practice to freeze cells or tissues with a small amount of cryopreservation solution, thereby achieving excellent viability of the cells or tissues. On the other hand, when cells or tissues are placed and frozen with a small amount of storage solution, the cells or tissues on the sheet often adhere to the surface of the placement portion when thawed after freezing, depending on the type and condition of the cells or tissues. There is a problem that high skill is required when collecting these. In particular, a method of removing excess vitrified liquid by using a vitrification preservative liquid removing material (for example, a membrane filter, a wire mesh, or an absorber such as filter paper) as proposed in Patent Document 3 has an excellent cooling rate. However, the cryopreservation solution of the present invention can be suitably used because the cells or tissues can be easily exfoliated at the time of thawing.

凍結保存された細胞は、細胞のガラス化状態が維持される極低温環境下で保存することで半永久的に保存することができる。ガラス化状態が維持される温度は、凍結保存液の組成によって異なるが、多くの場合－１５０℃以下が好ましい。このような温度が維持される環境としては、液体窒素保存容器中、気相窒素保存容器中が好ましい。 The cryopreserved cells can be semi-permanently preserved by storing them in an extremely low temperature environment in which the vitrified state of the cells is maintained. The temperature at which the vitrified state is maintained varies depending on the composition of the cryopreservation solution, but is preferably −150 ° C. or lower in most cases. As an environment in which such a temperature is maintained, it is preferable to use a liquid nitrogen storage container or a gas phase nitrogen storage container.

以上、本発明の凍結保存方法における凍結作業について説明してきた。次に、融解作業について説明する。 The freezing operation in the cryopreservation method of the present invention has been described above. Next, the melting operation will be described.

本発明の凍結保存液を用いた細胞又は組織の融解作業は、クライオトップ法のように一般に知られている方法によって行うことができる。シート上に載置された細胞又は組織を冷却溶媒中から取り出し、３７℃に温調された融解液中に直接接触させることで、凍結保存液と細胞又は組織を融解させるとともに凍結保存液を希釈する。この際、融解液中で、細胞又は組織をシート上から剥離する。シート上から細胞又は組織を穏やかに剥離することが、凍結・融解後の生存性の観点で好ましい。剥離した細胞又は組織は、所定時間後に、融解液中から、希釈液中に移し、所定時間浸漬させ、さらには洗浄液中に移す。このような作業により、徐々に浸透圧を変化させ、細胞内又は組織内の耐凍剤を希釈・除去し、穏やかな培養条件に戻していく作業がなされる。 The work of thawing cells or tissues using the cryopreservation solution of the present invention can be performed by a generally known method such as the cryotop method. The cells or tissues placed on the sheet are taken out of the cooling solvent and brought into direct contact with the thaw solution heated to 37 ° C. to thaw the cells or tissues with the cryopreservation solution and dilute the cryopreservation solution. do. At this time, the cells or tissues are exfoliated from the sheet in the lysate. Gently exfoliating cells or tissues from the sheet is preferable from the viewpoint of viability after freezing and thawing. After a predetermined time, the detached cells or tissues are transferred from the thawing solution to a diluted solution, immersed for a predetermined time, and further transferred to a washing solution. By such work, the osmotic pressure is gradually changed, the antifreeze agent in the cells or tissues is diluted and removed, and the culture conditions are returned to mild.

本発明の凍結保存液を用いて凍結保存することができる細胞として、例えば、哺乳類（例えば、人（ヒト）、牛、豚、馬、ウサギ、ラット、マウス等）の卵子、胚、***等の生殖細胞；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞が挙げられる。また、初代培養細胞、継代培養細胞、及び細胞株細胞等の培養細胞が挙げられる。また、細胞は、一又は複数の実施形態において、線維芽細胞、膵ガン・肝ガン細胞等のガン由来細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、軟骨細胞、組織幹細胞、及び免疫細胞等の接着性細胞が挙げられる。さらに、凍結保存することができる組織として、同種又は異種の細胞からなる組織、例えば、卵巣、皮膚、角膜上皮、歯根膜、心筋等の組織が挙げられる。本発明は、特にシート状構造を有する組織（例えば、細胞シート、皮膚組織など）の凍結保存に好適である。本発明の凍結保存用治具は、直接生体から採取した組織だけでなく、例えば、生体外で培養し増殖させた培養皮膚、生体外で構築したいわゆる細胞シート、特開２０１２－２０５５１６号公報で提案されている三次元構造を有する組織モデルのような人工の組織の凍結保存についても、好適に用いることができる。本発明の凍結保存液は、上記のような細胞又は組織の凍結保存液として好適に用いることができる。 As cells that can be cryopreserved using the cryopreservation solution of the present invention, for example, eggs, embryos, sperms, etc. of mammals (for example, humans, cows, pigs, horses, rabbits, rats, mice, etc.) Germ cells; examples include pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem cells (iPS cells) and embryonic stem cells (ES cells). In addition, cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells can be mentioned. Further, in one or more embodiments, the cells include cancer-derived cells such as fibroblasts, pancreatic cancer / hepatic cancer cells, epithelial cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, nerve cells, cartilage cells, and tissue stem cells. And adhesive cells such as immune cells. Further, examples of tissues that can be cryopreserved include tissues composed of cells of the same type or different species, such as tissues such as ovary, skin, corneal epithelium, periodontal ligament, and myocardium. The present invention is particularly suitable for cryopreservation of tissues having a sheet-like structure (for example, cell sheets, skin tissues, etc.). The jig for cryopreservation of the present invention is not limited to tissues directly collected from a living body, for example, cultured skin cultured and grown in vitro, a so-called cell sheet constructed in vitro, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-205516. It can also be suitably used for cryopreservation of artificial tissues such as the proposed tissue model having a three-dimensional structure. The cryopreservation solution of the present invention can be suitably used as a cryopreservation solution for cells or tissues as described above.

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, and the present invention will be specifically described, but the present invention is not limited to the following Examples.

（実施例１）
Ｌ－グルタミン、フェノールレッド、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を含む市販のＭｅｄｉｕｍ１９９培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を基礎液として、有機溶媒系耐凍剤としてエチレングリコールを１５容量％とＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を１５容量％、糖類としてスクロースを０．５Ｍ、抗生物質としてゲンタマイシンを５０ｍｇ／Ｌ、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）のゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒ（ケン化度８８ｍｏｌ％）を０．５質量％含有する実施例１の凍結保存液を作製した。 (Example 1)
Ethylene glycol 15 as an organic solvent-based freezing agent using a commercially available Medium 199 medium (manufactured by Life Technologies) containing L-glutamine, phenol red, and 25 mM HEEPS (4- (2-hydroxythyyl) -1-piperazine antibiotic acid) as a basal solution. 50% by volume and 15% by volume of DMSO (dimethyl sulfoxide), 0.5M of sucrose as a saccharide, 50mg / L of gentamicin as an antibiotic, and Gosenex WO of Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is a modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group. A cryopreservation solution of Example 1 containing 0.5% by mass of −320R (consolidation degree 88 mol%) was prepared.

（実施例２）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒの含有量を０．５質量％にかえて、０．９質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例２の凍結保存液を作製した。 (Example 2)
The cryopreservation solution of Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of Gosenex WO-320R was changed to 0.5% by mass to 0.9% by mass.

（実施例３）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒの含有量を０．５質量％にかえて、１．８質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例３の凍結保存液を作製した。 (Example 3)
The cryopreservation solution of Example 3 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of Gosenex WO-320R was changed to 0.5% by mass to 1.8% by mass.

（実施例４）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒの含有量を０．５質量％にかえて、２．５質量％とした以外は実施例１と同様にして、実施例４の凍結保存液を作製した。 (Example 4)
The cryopreservation solution of Example 4 was prepared in the same manner as in Example 1 except that the content of Gosenex WO-320R was changed to 0.5% by mass to 2.5% by mass.

（実施例５）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを添加せず、エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）のゴーセネックスＷＯ－３２０Ｎ（ケン化度９９ｍｏｌ％）を０．５質量％含有させた以外は実施例１と同様にして、実施例５の凍結保存液を作製した。 (Example 5)
Conducted except that Gosenex WO-320R (saponification degree 99 mol%) of Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is a modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group, was contained in an amount of 0.5% by mass without adding Gosenex WO-320R. The cryopreservation solution of Example 5 was prepared in the same manner as in Example 1.

（実施例６）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｎの含有量を０．５質量％にかえて、０．９質量％とした以外は実施例５と同様にして、実施例６の凍結保存液を作製した。 (Example 6)
The cryopreservation solution of Example 6 was prepared in the same manner as in Example 5 except that the content of Gosenex WO-320N was changed to 0.5% by mass to 0.9% by mass.

（実施例７）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｎの含有量を０．５質量％にかえて、１．８質量％とした以外は実施例５と同様にして、実施例７の凍結保存液を作製した。 (Example 7)
The cryopreservation solution of Example 7 was prepared in the same manner as in Example 5 except that the content of Gosenex WO-320N was changed to 0.5% by mass to 1.8% by mass.

（実施例８）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｎの含有量を０．５質量％にかえて、２．５質量％とした以外は実施例５と同様にして、実施例８の凍結保存液を作製した。 (Example 8)
The cryopreservation solution of Example 8 was prepared in the same manner as in Example 5 except that the content of Gosenex WO-320N was changed to 0.5% by mass to 2.5% by mass.

（比較例１）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを添加しなかった以外は、実施例１と同様にして、比較例１の凍結保存液を作製した。 (Comparative Example 1)
A cryopreservation solution of Comparative Example 1 was prepared in the same manner as in Example 1 except that Gosenex WO-320R was not added.

（比較例２）
ゴーセネックスＷＯ－３２０Ｒを添加せず、エチレンオキサイド基を有さないポリビニルアルコールである日本合成化学工業（株）製のゴーセノール（登録商標）ＥＧ０５Ｐ（ケン化度８８ｍｏｌ％）を０．９質量％含有させた以外は実施例１と同様にして、比較例２の凍結保存液を作製した。 (Comparative Example 2)
Gosenol® EG05P (saponification degree 88 mol%) manufactured by Nippon Synthetic Chemical Industry Co., Ltd., which is a polyvinyl alcohol having no ethylene oxide group added without adding Gosenex WO-320R, is contained in an amount of 0.9% by mass. A cryopreservation solution of Comparative Example 2 was prepared in the same manner as in Example 1 except for the above.

＜スフェアの調整＞
細胞又は組織の剥離性の評価に用いるスフェアは以下のように調整した。マウス胚性線維芽細胞であるＭＥＦ細胞を培養シャーレ上で培養後、トリプシン処理により剥離、回収した。その後、住友ベークライト（株）製ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）９６Ｕプレートに５０細胞／ウェルの細胞数で播種し、浮遊培養することでスフェア形成を誘導した。培養３日後に直径約１００μｍのスフェアを得た。 <Adjustment of sphere>
The spheres used to evaluate the exfoliation of cells or tissues were adjusted as follows. MEF cells, which are mouse embryonic fibroblasts, were cultured on a culture dish, then detached and recovered by trypsin treatment. Then, sphere formation was induced by inoculating a PrimeSurface (registered trademark) 96U plate manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd. at a cell number of 50 cells / well and carrying out suspension culture. After 3 days of culturing, a sphere having a diameter of about 100 μm was obtained.

＜凍結保存用治具の準備＞
細胞又は組織の凍結保存作業に用いる凍結保存用治具は以下のようにして準備した。透明ＰＥＴフィルム上に接着層として、ヘンケルジャパン（株）製のホットメルトウレタン樹脂Ｐｕｒｍｅｌｔ（登録商標）ＱＲ １７０－７１４１Ｐを乾燥時の固形分量３０ｇ／ｍ^２となるように塗布した。なお、接着層の塗布は載置部領域には行わず、周辺のみとした。接着層が完全硬化する前に、保存液吸収体として、アドバンテック東洋（株）製の親水化処理されたポリテトラフルオロエチレン多孔体（細孔径０．２μｍ、空隙率７１％、厚み３５μｍ）を貼り合わせ、これを細胞又は組織を載置する載置部とした。この載置部を１．５ｍｍ×２０ｍｍの大きさに裁断し、載置部の短辺側をスティック状のＡＢＳ樹脂製把持部と接合させ、凍結保存用治具を作製した。 <Preparation of cryopreservation jig>
The cryopreservation jig used for the cryopreservation work of cells or tissues was prepared as follows. As an adhesive layer, a hot melt urethane resin Purmelt (registered trademark) QR 170-7141P manufactured by Henkel Japan Ltd. was applied onto the transparent PET film so as to have a solid content of 30 g / m ² at the time of drying. The adhesive layer was not applied to the mounting area, but only to the periphery. Before the adhesive layer is completely cured, a hydrophilized polytetrafluoroethylene porous body (pore diameter 0.2 μm, porosity 71%, thickness 35 μm) manufactured by Advantech Toyo Co., Ltd. is attached as a preservative solution absorber. Together, this was used as the placement part on which the cells or tissues were placed. This mounting portion was cut into a size of 1.5 mm × 20 mm, and the short side of the mounting portion was joined to a stick-shaped ABS resin grip portion to prepare a jig for cryopreservation.

＜凍結作業＞
上記のように得たスフェアを培養液中から回収し、細管状の治具であるストリッパーピペッター（以下、ピペット）を用いて、少量の培養液とともに平衡化液中に移動させた。なお、平衡化液の組成は、前記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地を基礎液として、７．５容量％エチレングリコール、７．５容量％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有させたものである。スフェアを平衡化液中で３分間浸漬させた後に、ピペットを用いて、少量の平衡化液とともに、実施例１～８または比較例１、２の凍結保存液中に移した。スフェアを凍結保存液中で数回ピペッティングした後に、凍結保存液に浸漬後４０秒経過後のタイミングで、前記凍結保存用治具の載置部上にピペットを用いて、スフェアを極少量の凍結保存液とともに、滴下付着させた。スフェアを滴下付着後、凍結保存液が自動的に保存液吸収体に吸収される様子を顕微鏡下で確認しながら、余分な凍結保存液が概ね吸収されたことを確認した後に、凍結保存用治具の載置部上のスフェアを液体窒素に浸漬させ、凍結させた。なお、スフェアを凍結保存液中で数回ピペッティングした後、液体窒素中に浸漬させるまでの時間はおよそ１分であった。凍結された凍結保存用治具は、融解作業を行うまでの間、液体窒素中で保存した。 <Freezing work>
The sphere obtained as described above was recovered from the culture broth and moved into the equilibration broth together with a small amount of the culture broth using a stripper pipette (hereinafter referred to as a pipette) which is a thin tubular jig. The composition of the equilibration solution is that the Medium 199 medium is used as a basal solution and contains 7.5% by volume ethylene glycol, 7.5% by volume DMSO (dimethyl sulfoxide), and 50 mg / L gentamicin. After immersing the sphere in the equilibration solution for 3 minutes, it was transferred to the cryopreservation solution of Examples 1 to 8 or Comparative Examples 1 and 2 together with a small amount of the equilibration solution using a pipette. After pipetting the sphere in the cryopreservation solution several times, at the timing 40 seconds after the immersion in the cryopreservation solution, use a pipette on the mounting portion of the cryopreservation jig to sprinkle a very small amount of the sphere. It was dropped and adhered together with the cryopreservation solution. After dripping and adhering the sphere, while checking under a microscope how the cryopreservation solution is automatically absorbed by the preservation solution absorber, after confirming that the excess cryopreservation solution has been mostly absorbed, the cryopreservation treatment The sphere on the placement of the tool was immersed in liquid nitrogen and frozen. The time from pipetting the sphere in the cryopreservation solution several times to immersing it in liquid nitrogen was about 1 minute. The frozen cryopreservation jig was stored in liquid nitrogen until the thawing operation was performed.

＜凍結作業における作業性の評価＞
凍結作業における凍結保存液中でのピペット操作の際の作業性を以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「凍結作業における作業性の評価」の項目に示す。 <Evaluation of workability in freezing work>
The workability of pipette operation in a cryopreservation solution during freezing work was evaluated according to the following criteria. These results are shown in the item "Evaluation of workability in freezing work" in Table 1.

凍結作業における作業性は以下の基準で評価した。
○：ピペット操作が容易であり、凍結保存液中でのピペッティング等の作業性は良好であった。
△：ピペット操作にやや支障があったが、凍結保存液中でのピペッティング等の一連の作業は可能であった。
×：ピペット操作に支障があり、ピペット操作が困難であった。 Workability in freezing work was evaluated according to the following criteria.
◯: The pipette operation was easy, and the workability such as pipetting in the cryopreservation solution was good.
Δ: Although there was some trouble in pipette operation, a series of operations such as pipetting in the cryopreservation solution was possible.
X: The pipette operation was hindered and the pipette operation was difficult.

＜融解作業＞
実施例１～８または比較例１、２の凍結保存液によって凍結作業を行ったスフェアを以下の操作によりそれぞれ融解操作を行った。液体窒素中から凍結したスフェアを含む凍結保存用治具を取り出し、３７℃に温調した融解液中に、スフェアが載置された凍結保存用治具の載置部を浸漬した。融解液の組成は、前記Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地を基礎液として、１Ｍのスクロース、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシンを含有するものである。融解液中に浸漬した載置部を顕微鏡下で観察しながら、スフェアを載置部上から剥離することを試みた。なお、スフェアの剥離作業は以下のように行った。融解液に載置部を浸漬後、６０秒間は静置しながらスフェアが載置部上から剥離する様子を観察した。融解液浸漬から６０秒経過後にスフェアが剥離しなかった場合には、載置部をゆすってスフェアの剥離を試みた。 <Melting work>
The spheres that had been frozen with the cryopreservation solutions of Examples 1 to 8 or Comparative Examples 1 and 2 were thawed by the following operations. The cryopreservation jig containing the frozen sphere was taken out from the liquid nitrogen, and the mounting portion of the cryopreservation jig on which the sphere was placed was immersed in the thaw liquid whose temperature was adjusted to 37 ° C. The composition of the melt is such that the Medium 199 medium is used as a basal solution and contains 1 M sucrose and 50 mg / L gentamicin. While observing the mounting portion immersed in the melt under a microscope, an attempt was made to peel off the sphere from the mounting portion. The sphere peeling work was performed as follows. After immersing the mounting portion in the melt, the sphere was observed to peel off from the mounting portion while standing still for 60 seconds. If the sphere did not peel off after 60 seconds from the immersion of the melt, the mounting portion was shaken to try to peel off the sphere.

＜融解作業における剥離性の評価＞
融解作業における載置部上からのスフェアの剥離性を以下の基準で評価した。これらの結果を表１の「融解作業における剥離性の評価」の項目に示す。 <Evaluation of peelability in melting work>
The peelability of the sphere from the mounting part in the melting operation was evaluated according to the following criteria. These results are shown in the item "Evaluation of peelability in melting work" in Table 1.

融解作業における剥離性は以下の基準で評価した。
◎：融解液浸漬後６０秒以内にスフェアが載置部上から剥離した。
○：融解液浸漬後６０秒経過後、載置部をゆすってスフェアを載置部上から剥離できた。
×：スフェアを回収することが容易にできないほどに固着しており、剥離できなかったか、回収の際にスフェアを構成する細胞がバラバラになってしまった。 The peelability in the melting operation was evaluated according to the following criteria.
⊚: The sphere was peeled off from the mounting portion within 60 seconds after the immersion in the melting liquid.
◯: 60 seconds after the immersion of the melting liquid, the sphere could be peeled off from the mounting portion by shaking the mounting portion.
X: The sphere was so adhered that it could not be easily collected, and it could not be peeled off, or the cells constituting the sphere were separated at the time of collection.

表１の結果から、本発明の凍結保存液は、凍結作業時の作業性と融解作業時の剥離性に優れていることが分かる。 From the results in Table 1, it can be seen that the cryopreservation solution of the present invention is excellent in workability during freezing work and peelability during thawing work.

本発明は、牛などの家畜や動物の胚移植や人工授精、人への人工授精などの他、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、一般に用いられている培養細胞、生体から採取した検査用又は移植用の細胞又は組織、生体外で培養した細胞又は組織などの凍結保存に用いることができる。 The present invention relates to embryo transfer and artificial insemination of domestic animals such as cattle and animals, artificial insemination to humans, iPS cells, ES cells, commonly used cultured cells, and for inspection or transplantation collected from a living body. It can be used for cryopreservation of cells or tissues, cells or tissues cultured in vitro.

Claims (1)

エチレンオキサイド基を有する変性ポリビニルアルコールを０．１～３質量％含有することを特徴とする凍結保存液。 A cryopreservation solution containing 0.1 to 3% by mass of modified polyvinyl alcohol having an ethylene oxide group.