JP6843911B2 - 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法 - Google Patents

抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6843911B2
JP6843911B2 JP2019060156A JP2019060156A JP6843911B2 JP 6843911 B2 JP6843911 B2 JP 6843911B2 JP 2019060156 A JP2019060156 A JP 2019060156A JP 2019060156 A JP2019060156 A JP 2019060156A JP 6843911 B2 JP6843911 B2 JP 6843911B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell culture
culture medium
polypeptide
cells
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2019060156A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019141053A (ja
Inventor
ナタラジャン ビジャヤサンカラン，
ナタラジャン ビジャヤサンカラン，
スティーヴン ジェー． マイアー，
スティーヴン ジェー． マイアー，
シャラット ヴァルマ，
シャラット ヴァルマ，
イー ヤン，
イー ヤン，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
ジェネンテック， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50639996&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP6843911(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by ジェネンテック， インコーポレイテッド, ジェネンテック， インコーポレイテッド filed Critical ジェネンテック， インコーポレイテッド
Publication of JP2019141053A publication Critical patent/JP2019141053A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6843911B2 publication Critical patent/JP6843911B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／７９９６０２号の優先権を主張する。該仮出願の内容は出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
本発明は、抗酸化剤を含む細胞培養培地、細胞培養のための該培地の使用方法およびポリペプチド産生ならびに本明細書において提供する方法によって産生されたポリペプチドを含む組成物およびキットに関する。
細胞培養物製造技術は、タンパク質系生成物、例えば治療用タンパク質の薬学的製剤の作製に広く使用されている。タンパク質系生成物、例えば抗体生成物の商業的生産には、製造需要を満たすのに充分なタンパク質生成物を細胞に産生させるために細胞培養パラメータの最適化が必要とされる。しかしながら、細胞培養パラメータをタンパク質生成物の生産性改善のために最適化する場合、生成物の所望の品質属性、例えば、グリコシル化プロフィール、凝集体レベル、荷電多様性およびアミノ酸配列の完全性を維持することも必要である（Li et al., mAbs, 2010, 2(5):466-477）。懸念される別の品質属性はタンパク質生成物の着色である。ヒト使用のための治療用製剤品の液状製剤の許容され得る着色レベルに関する法的規制要件が満たされなければならない（United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927およびCouncil of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 第7版 p. 22）。したがって、着色量が許容され得るタンパク質生成物の作製は治療用タンパク質の作製の重要な態様である。
治療用タンパク質、例えばモノクローナル抗体を皮下送達する最近の傾向には、製剤化タンパク質物質の濃度の増大（例えば、約１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度）が伴うようになってきている（Daughertyら, Adv Drug Deliver Rev, 2006, 58（5-6）:686-706）。着色強度の増大と組成物中に含まれる治療用タンパク質の量の増大との間の相関性が観測されており、この関係は、製剤化される生成物の着色強度をモニタリングするための標準的な方法ではこれまでは観測不可能であった低レベルのタンパク質生成物バリアントによるものであり得る。
酸化は、タンパク質医薬品の主な化学的分解経路である。例えば、メチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファンおよびチロシンは、その反応性酸素種（ＲＯＳ）との反応性による酸化を受けやすいアミノ酸残基であり、この酸化は薬学的タンパク質製剤の保存時にしばしば観察される。細胞培養条件がタンパク質生成物の品質属性に、例えば大規模製造に充分な量の生産に影響を及ぼし得ることは知られているが、このような条件の最終のタンパク質生成物の着色強度に対する影響は不明なままである。
許容され得る着色強度などの生成物品質属性を有するタンパク質（例えば、抗体）の改善されたコスト効率のよい作製方法が得られる必要性が継続的に存在している。一貫してタンパク質生成物を低着色強度で送達する成分を有するとともに所望のタンパク質濃度（例えば、≧１００ｍｇ／ｍＬ）が維持された細胞培養培地は、未知組成であれ既知組成であれ、抗体などのタンパク質生成物の開発に有用性が見出されよう。
一部の態様では、本発明は、本明細書において、ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞の培養方法であって、該方法が該細胞をヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地と接触させる工程を含み、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約５０％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を少なくとも約０．０００１ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約０．０００１ｍＭから約５００．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約１．０ｍＭから約４０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地が既知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地が未知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地が細胞培養基本培地である。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地が細胞培養流加培地である。本明細書における一部の実施態様では、該細胞をヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地と該細胞の増殖期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、該細胞をヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地と該細胞の産生期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも１日に添加する。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。本明細書における任意の実施態様において、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体は細胞培養培地に、細胞培養サイクルの任意の日に添加され得る。本明細書における一部の実施態様では、該細胞が哺乳動物細胞である。本明細書における一部の実施態様では、哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書における一部の実施態様では、該ポリペプチドが抗体またはその断片である。
他の態様では、本発明は、本明細書において、ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞の培養方法であって、該方法が該細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、該細胞培養培地が、成分（ａ）−（ｈ）：（ａ）ヒポタウリン；（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）カルノシン；（ｄ）アンセリン；（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンのうちの１種類以上を含むものであり；成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約７５％低減される。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約５０％低減される。本明細書における一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地が：（ａ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のヒポタウリン；（ｂ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のカルノシン；（ｄ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のアンセリン；（ｅ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のリポ酸；（ｇ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のケルシトリン水和物；および（ｈ）少なくとも約０．０００３ｍＭからの濃度のアミノグアニジンから選択される量の該１種類以上の成分（ａ）−（ｈ）を含むものである。さらなる一実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンを約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がｓ−カルボキシメチルシステインを約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がカルノシンを約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がアンセリンを約３．０ｍＭから約５．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がブチル化ヒドロキシアニソールを約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がリポ酸を約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がケルシトリン水和物を約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭの濃度で含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地がアミノグアニジンを約０．０００３ｍＭから約２４５ｍＭの濃度で含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地がアミノグアニジンを約０．０００３ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が既知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が未知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養基本培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養流加培地である。本明細書における一部の実施態様では、該細胞を該細胞培養培地と該細胞の増殖期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、該細胞を該細胞培養培地と該細胞の産生期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも１日に添加する。本明細書における一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。本明細書における任意の実施態様において、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上は細胞培養培地に、細胞培養サイクルの任意の日に添加され得る。本明細書における一部の実施態様では、該細胞が哺乳動物細胞である。本明細書における一部の実施態様では、該哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書における一部の実施態様では、該ポリペプチドが抗体またはその断片である。
一部の態様において、本明細書における発明はまた、ポリペプチドの作製方法であって、該方法が該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地中で培養する工程を含み、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約５０％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約０．０００１ｍＭから約５００．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約１．０ｍＭから約４０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が既知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が未知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養基本培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養流加培地である。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも１日に添加する。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。本明細書における任意の実施態様において、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体は細胞培養培地に、細胞培養サイクルの任意の日に添加され得る。本明細書における一部の実施態様では、該細胞が哺乳動物細胞である。一部の実施態様では、哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書における一部の実施態様では、該ポリペプチドが抗体である。一部の実施態様では、該抗体がＩｇＧ１抗体である。一部の実施態様では、該抗体が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地中に分泌される。一部の実施態様では、該方法はさらに、該ポリペプチドをヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地から回収する工程を含む。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物は液状組成物または非液状組成物である。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物が無色またはわずかに着色した液体に見える。
一部の態様において、本発明は、ポリペプチドの作製方法であって、該方法が該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含み、該細胞培養培地が、成分（ａ）−（ｈ）：（ａ）ヒポタウリン；（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）カルノシン；（ｄ）アンセリン；（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンのうちの１種類以上を含むものであり；成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約５０％低減される。一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、該成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約７５％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が：（ａ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のヒポタウリン；（ｂ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のカルノシン；（ｄ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のアンセリン；（ｅ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のリポ酸；（ｇ）少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のケルシトリン水和物；および（ｈ）少なくとも約０．０００３ｍＭからの濃度のアミノグアニジンから選択される量の該１種類以上の成分（ａ）−（ｈ）を含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地がヒポタウリンを約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がｓ−カルボキシメチルシステインを約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がカルノシンを約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がアンセリンを約３．０ｍＭから約５．０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がブチル化ヒドロキシアニソールを約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がリポ酸を約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地がケルシトリン水和物を約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭの濃度で含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地がアミノグアニジンを約０．０００３ｍＭから約２４５ｍＭの濃度で含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地がアミノグアニジンを約０．０００３ｍＭから約１０ｍＭの濃度で含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が既知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が未知組成の細胞培養培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養基本培地である。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が細胞培養流加培地である。本明細書における一部の実施態様では、該細胞を該細胞培養培地と該細胞の増殖期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、該細胞を該細胞培養培地と該細胞の産生期に接触させる。本明細書における一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも１日に添加する。本明細書における一部の実施態様では、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。本明細書における任意の実施態様において、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上は細胞培養培地に、細胞培養サイクルの任意の日に添加され得る。本明細書における一部の実施態様では、該細胞が哺乳動物細胞である。一部の実施態様では、哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。本明細書における一部の実施態様では、該ポリペプチドが抗体またはその断片である。一部の実施態様では、該抗体がＩｇＧ１抗体である。一部の実施態様では、該抗体が該細胞培養培地中に分泌される。本明細書における一部の実施態様では、該方法はさらに、該ポリペプチドを、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地から回収する工程を含む。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物は液状組成物または非液状組成物である。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物が無色またはわずかに着色した液体に見える。本明細書における一部の実施態様では、ポリペプチドは、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製され得るものである。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製されたポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含む薬学的組成物を提供する。
一部の態様において、本発明は、細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットであって、該キットが少なくとも約０．０００１ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を備えており、該ヒポタウリンまたは類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択されるキットを提供する。
また、他の態様において、本発明は、細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットであって、（ａ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのヒポタウリンがもたらされる量のヒポタウリン；（ｂ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのｓ−カルボキシメチルシステインがもたらされる量のｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのカルノシンがもたらされる量のカルノシン；（ｄ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのアンセリンがもたらされる量のアンセリン；（ｅ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのブチル化ヒドロキシアニソールがもたらされる量のブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのリポ酸がもたらされる量のリポ酸；（ｇ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００１ｍＭからのケルシトリン水和物がもたらされる量のケルシトリン水和物；および（ｈ）該細胞培養培地中に少なくとも約０．０００３ｍＭからのアミノグアニジンがもたらされる量のアミノグアニジンのうちの１種類以上を備えているキットを提供する。
一部の態様では、本発明は、本明細書において、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される少なくとも約０．０００１ｍＭからのヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地を提供する。
本発明の他の態様では、本明細書において、成分（ａ）−（ｈ）：（ａ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのヒポタウリン；（ｂ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのカルノシン；（ｄ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのアンセリン；（ｅ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのリポ酸；（ｇ）少なくとも約０．０００１ｍＭからのケルシトリン水和物；および（ｈ）少なくとも約０．０００３ｍＭからのアミノグアニジンのうちの１種類以上を含む細胞培養培地を提供する。
一部の態様では、本発明は、本明細書において、（ａ）ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞；および（ｂ）本明細書に記載の任意の細胞培養培地を含む組成物を提供する。
本発明の一部の態様では、本明細書において：（ａ）ポリペプチド；および（ｂ）本明細書に記載の任意の細胞培養培地を含む組成物を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドが該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞によって細胞培養培地中に分泌される。
本明細書は、当業者が本発明を実施することができるのに充分であると考える。本明細書に図示および説明したものに加えて、本発明の種々の変形例が前述の説明から当業者に自明となり、添付の特許請求の範囲の範囲に含まれる。本明細書において挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、出典明示によりその全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。
抗体を含む代表的な細胞培養培地の着色強度に対する影響についてスクリーニングした代表的な化合物のグラフである。数値結果を陽性コントロールに対して正規化した（ここで、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した）。０％より高い値は着色強度の増大を示す。０％より低い値は着色強度の低減を示す。 抗体を含む代表的な細胞培養培地の着色強度を低減させた化合物を示す図１のサブプロットである。数値結果を陽性コントロールに対して正規化した（ここで、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した）。０％より低い値は着色強度の低減を示す。 振盪フラスコ細胞培養モデルが、対応する大規模２Ｌ細胞培養モデルと同等であることを示す一連のグラフである。Ａ）生存可能細胞密度（ＶＣＣ）によって測定したときの細胞培養容量あたりの細胞数として表示したインキュベーション期間における培養状態の増殖細胞。Ｂ）生存可能細胞の数によって測定したときの細胞総数に対するパーセンテージとしてのインキュベーション期間における細胞培養物の細胞生存度。Ｃ）高速液体クロマトグラフィーによって測定したときの抗体力価として表示したインキュベーション期間における細胞培養物の抗体産生。ＳＦは振盪フラスコ細胞培養モデルを示す。２Ｌは大規模細胞培養モデルを示す。 細胞培養培地に対するヒポタウリンの添加は細胞増殖、細胞生存度または抗体産生に支障がなかったことを示す一連のグラフである。Ａ）ＶＣＣによって測定したときの細胞培養容量あたりの細胞数として表示したインキュベーション期間における培養状態の増殖細胞。Ｂ）生存可能細胞の数によって測定したときの細胞総数に対するパーセンテージとしてのインキュベーション期間における細胞培養物の細胞生存度。Ｃ）高速液体クロマトグラフィーによって測定したときの抗体力価として表示したインキュベーション期間における細胞培養物の抗体産生。 ヒポタウリンを補給した培地中で培養した細胞培養物から単離した抗体組成物の着色強度を示すグラフである。１００％、５０％または２５％は、それぞれ９．１６ｍＭ、４．５８ｍＭまたは２．２９ｍＭのヒポタウリンを補給した基本培地１を示す。黒丸は細胞培養実験の着色強度値を示す。白丸はインキュベーションスクリーニング実験の着色強度値を示す。数値結果を陽性コントロールに対して正規化した（ここで、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した）。０％より低い値は着色強度の低減を示す。 ヒポタウリンを補給した培地中で培養した細胞培養物から単離した抗体組成物の着色強度を示すグラフである。３×、２×または１×は、それぞれ３８．８５ｍＭ、２５．９ｍＭまたは１２．９５ｍＭのヒポタウリンを補給した基本培地３を示す。黒丸は細胞培養実験の着色強度値を示す。数値結果を陽性コントロールに対して正規化した（ここで、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した）。０％より低い値は着色強度の低減を示す。 培地に対するヒポタウリンまたはカルボキシメチルシステインの添加は細胞増殖または細胞生存度に支障がなかったことを示すグラフを含む。Ａ）ＶＣＣによって測定したときの細胞培養容量あたりの細胞数として表示したインキュベーション期間における培養状態の増殖細胞。Ｂ）総培養容量に対するパーセントとして表示したインキュベーション期間における培養物の細胞生存度。 培地に対するヒポタウリンまたはカルボキシメチルシステインの添加によって抗体産生が有意に低下しなかったことを示すグラフである。インキュベーション期間における細胞培養物の抗体産生を高速液体クロマトグラフィーによって測定し、抗体力価として表示した。 ヒポタウリンまたはカルボキシメチルシステインを補給した培地中で培養した細胞培養物から単離した抗体組成物の着色強度を示すグラフである。ＡおよびＢ）は着色強度を測定するために使用した２つの異なる色アッセイを示す。数値結果を陽性コントロールに対して正規化した（ここで、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した）。０％より低い値は着色強度の低減を示す。 タウリン、カルノシン、アミノグアニジン、陰性コントロールまたは陽性コントロールを補給した培地中の細胞培養物から単離した抗体組成物の相対着色強度を示すグラフである。
Ｉ．定義
用語「培地」および「細胞培養培地」は、細胞を培養または維持するために使用される栄養供給源をいう。当業者には理解されるように、栄養供給源は、細胞が増殖および／または生存のために必要とする成分を含むものであり得るか、または細胞の増殖および／または生存を補助する成分を含むものであり得る。ビタミン、必須または非必須アミノ酸および微量元素が培地成分の一例である。
「既知組成の細胞培養培地」または「ＣＤＭ」は、動物または植物由来の生成物、例えば動物血清および植物ペプトンなどを含んでいない特定の組成を有する培地である。当業者には理解され得るように、ＣＤＭはポリペプチド産生プロセスにおいて使用され得、その場合、細胞はＣＤＭと接触しており、ポリペプチドをＣＤＭ中に分泌する。したがって、組成物はＣＤＭとポリペプチド産物を含むものであってもよいこと、およびポリペプチド産物の存在によってＣＤＭが未知組成にはならないことを理解されたい。
「未知組成の細胞培養培地」は、その化学組成を特定することができず、動物または植物由来の１種類以上の生成物、例えば動物血清および植物ペプトンなどを含んでいてもよい培地をいう。当業者には理解され得るように、未知組成の細胞培養培地は、動物または植物由来の生成物を栄養供給源として含有していてもよい。
細胞を「培養する」とは、細胞を細胞培養培地と、細胞の生存および／または成長および／または増殖に適した条件下で接触させることをいう。
「バッチ培養」は、細胞培養のためのすべての成分（例えば、細胞およびすべての培養栄養物）が培養槽に培養プロセスの開始時に供給される培養をいう。
語句「フェドバッチ細胞培養」は、本明細書で用いる場合、最初に細胞および培養培地を培養槽に供給し、培養プロセス中、培養終了前に定期的な細胞および／または生成物の収集を伴って、または伴わずにさらなる培養栄養物を培養物に連続的または離散的増分で供給するバッチ培養をいう。
「灌流培養」は、細胞を培養物中に例えば濾過、封入、マイクロ担体への係留などによって拘束する培養であり、培養培地は連続的または断続的に培養槽内に導入され、培養槽から除去される。
「培養槽」は、細胞の培養に使用される容器をいう。培養槽は、細胞の培養に有用である限り任意のサイズのものであり得る。
本明細書で用いる場合、「ヒポタウリン類似体」は、ヒポタウリンと構造的に類似しているが、ヒポタウリンと化学組成において異なる（例えば、ヒポタウリンコア上の官能基または置換基の数、位置または化学的性質が異なる）化学物質化合物をいう。ヒポタウリン類似体は、ヒポタウリンと異なる化学的または物理的特性を有するものであっても有しないものであってもよく、ヒポタウリンと比べて細胞培養培地の活性改善されたもの（例えば、ヒポタウリンと比べて細胞培養培地中で作製されたポリペプチド（例えば、抗体）の着色強度がさらに低減されたもの）であってもそうでなくてもよい。例えば、ヒポタウリン類似体はヒポタウリンと比べて、より親水性のものであってもよく、改変された反応性を有するものであってもよい。ヒポタウリン類似体はヒポタウリンの化学的および／または生物学的に活性を模倣するものであってもよく（すなわち、同様または同一の活性を有するものであり得る）、一部の場合では、ヒポタウリンと比べて増大した、または低下した活性を有するものであってもよい。
用語「力価」は、本明細書で用いる場合、細胞培養物によって産生された組換え発現されたポリペプチドの総量を所与の培地容量で除算したものをいう。力価は典型的には、培地１ミリリットルあたりのポリペプチドのミリグラムの単位で表示される。
「核酸」は、本明細書で互換的に用いる場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾型ヌクレオチドもしくは塩基および／またはその類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、もしくは合成反応によってポリマー内に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾型ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含むものであってもよい。存在させる場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの合成前の行っても合成後に行ってもよい。
「単離核酸」は、天然に存在しない組換え配列、または通常の状況外もしくは通常の状況から分離された天然に存在する配列を意味し、包含している。単離核酸分子は、自然界においてみられる形態または状況以外のものである。したがって、単離核酸分子は、天然細胞内に存在する場合の核酸分子と区別される。しかしながら、単離核酸分子は、そのタンパク質が通常発現される細胞に含まれた核酸分子であって、例えば、天然細胞のものとは異なる染色体内位置に存在する核酸分子を包含する。
「単離された」タンパク質（例えば、単離型抗体）は同定され、その天然環境の成分から分離および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、該タンパク質の研究用途、診断用途または治療用途に支障をきたし得る物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が挙げられ得る。単離型タンパク質には組換え細胞内のインサイチュタンパク質が包含される。これは、該タンパク質の天然環境少なくとも１種類の成分は存在していないであろうからである。しかしながら、通常、単離型タンパク質は少なくとも１回の精製工程によって調製される。
「精製（された）」ポリペプチドは、該ポリペプチドの純度が増大しており、その結果、その天然環境で存在しているよりもおよび／または実験室内条件下で最初に作製および／または合成および／または増幅されたときよりも純粋な形態で存在していることを意味する。純度は相対語であり、必ずしも絶対純度を意味しているのではない。
「夾雑物」は、所望のポリペプチド生成物とは異なる物質をいう。夾雑物としては、限定されないが：宿主細胞物質、例えばＣＨＯＰ；浸出タンパク質Ａ；核酸；バリアント、断片、所望のポリペプチドの凝集体または誘導体；別のポリペプチド；内毒素；ウイルス夾雑物；細胞培養培地成分などが挙げられる。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書において互換的に用いている。該ポリマーは線状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含むものであってもよく、非アミノ酸が介在していてもよい。該用語はまた、天然状態で、または介入；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば標識成分とのコンジュゲーションによって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含している。また、この定義には、例えば、１種類以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸など）ならびに当該技術分野で知られた他の修飾を含むポリペプチドも包含される。本明細書における定義に包含されるポリペプチドの例としては、哺乳動物タンパク質、例えば、レニン；成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびヴォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質Ｃ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管退縮因子；レラキシンＡ−鎖；レラキシンＢ−鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、β−ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−ｂ；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９およびＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞受容体；膜表面タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）またはＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；イムノアドヘシン；ならびに上記のいずれかのタンパク質の断片および／またはバリアントならびにタンパク質（例えば、上記のいずれかのタンパク質など）に結合する抗体（抗体断片を含む）などが挙げられる。
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（例えば、完全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を包含している（所望の生物学的活性を示すものである限り）。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体および／または親和性成熟抗体である。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で用いる場合、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体、すなわち、微量に存在し得る起こり得る天然の変異以外は同一である集団を構成している個々の抗体をいう。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原性部位に指向される。さらに、種々の決定基（エピトープ）に指向される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の抗体の夾雑なしで合成され得るという点で好都合である。修飾語「モノクローナル」は、任意の具体的な方法によって抗体を作製することを要すると解釈されるべきでない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体はさまざまな手法によって、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、KohlerおよびMilstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongoら, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988); Hammerlingら, :Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas563-681 (Elsevier,N.Y., 1981)）、細菌、真核生物 動物または植物の細胞内での組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）；ファージディスプレイ技術（例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628 (1991); Marksら, J. Mol. Biol. 222 : 581-597 (1992); Sidhuら, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Leeら, J. Mol, Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004);およびLeeら, J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)を参照のこと、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードしているヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒト抗体またはヒト様抗体を作製するための技術（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；国際公開第１９９６／３４０９６号；国際公開第１９９６／３３７３５号；国際公開第１９９１／１０７４１号；Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovitsら, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemannら, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；および同第５６６１０１６号；Marksら, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonbergら, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwildら, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996);ならびにLonbergおよびHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995)を参照のこと）などによって作製され得る。
用語「薬学的製剤」は、活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、製剤が投与される被検体に対して許容され得ないような毒性であるさらなる成分を含有していない調製物をいう。かかる製剤は滅菌である。
「薬学的に許容され得る」担体、賦形剤または安定剤は、これらに曝露される細胞または哺乳動物に対して使用される投薬量および濃度で無毒性であるものである（Remington's Pharmaceutical Sciences (第20版), A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA）。多くの場合、生理学的に許容され得る担体は水性ｐＨ緩衝液である。生理学的に許容され得る担体の例としては、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；単糖類、二糖類および他の糖質、例えばグルコース、マンノースもしくはデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）が挙げられる。
「滅菌された」製剤は、無菌状態またはあらゆる生きている微生物およびその胞子がないもしくは本質的にないものである。
「無色またはわずかに着色した」液体は、定量的および／または定性的解析によって測定されるポリペプチドを含む液状組成物をいう。定性的解析としては目視検査、例えば、ポリペプチドを含む組成物と参照標準との比較が挙げられる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は本文中にそうでないことを明示していない限り、その対応する複数の指示対象物を包含している。したがって、例えば、「ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」に対する言及は、２種類以上のかかる化合物の組合せなどが包含されていてもよい。
本明細書に記載の本発明の態様および実施態様には、該態様および実施態様「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ものが包含されていることを理解されたい。
本明細書において「約」値またはパラメータに対する言及は、該値またはパラメータ自体に関する実施態様を包含（および記載）している。例えば、「約Ｘ」に言及している記載は「Ｘ」の記載を包含している。数値範囲は、該範囲を規定している両端を含む。
本発明の態様または実施態様が択一物のマーカッシュ群または他のグルーピングによって記載されている場合、本発明は、記載の群全体を一体として包含しているだけでなく、該群の個々の各構成員および主たる該群の考えられ得るすべての下位群も包含しており、主たる該群において構成員の１つ以上が存在していない群も包含している。また、本発明では、請求項に記載の発明において該群の構成員のいずれか１つ以上の明白な除外も想定される。
ＩＩ．細胞培養培地
本明細書において提供する細胞培養培地は、本明細書に詳述している方法（例えば、細胞の培養方法およびポリペプチドの作製方法）ならびに組成物（例えば、薬学的製剤）において有用性がみられ得る。培地成分は、許容され得る品質属性、例えば許容され得る着色強度のポリペプチド生成物（例えば、治療用タンパク質）をもたらし得るものであると確認されているものである。このような確認された培地成分の１種類以上が、許容され得る着色強度のポリペプチド産物を得るために使用され得る。本明細書で用いる場合、ポリペプチド生成物（例えば、ポリペプチドを含む組成物）の「許容され得る着色強度」は、ポリペプチド産物の規制機関の承認に必要とされる着色強度またはポリペプチド生成物のバッチのロット間の一貫性の評価における使用に所望される着色強度を示し得る。一部の実施態様では、１種類以上の培地成分が抗酸化剤である。一部の実施態様では、１種類以上の培地成分が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸、ケルシトリン水和物およびアミノグアニジンからなる群より選択される。一部の実施態様では、１種類以上の培地成分はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体である。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。一部の実施態様では、１種類以上の培地成分がタウリン、リポ酸還元型またはカルベジロールである。
培地成分は細胞培養培地に、当該技術分野で知られた形態で添加され得る。例えば、ヒポタウリンはＣＡＳ番号３００−８４−５によって識別される化合物として供給され得、ｓ−カルボキシメチルシステインはＣＡＳ番号６３８−２３−３によって識別される化合物として供給され得、アンセリンはＣＡＳ番号１００３０−５２−１によって識別される化合物として供給され得、ブチル化ヒドロキシアニソールはＣＡＳ番号２５０１３−１６−５によって識別される化合物として供給され得、カルノシンはＣＡＳ番号３０５−８４−０によって識別される化合物として供給され得、リポ酸はＣＡＳ番号１２００−２２−２によって識別される化合物として供給され得、ケルシトリン水和物はＣＡＳ番号５２２−１２−３によって識別される化合物として供給され得る。別の例として、ヒポタウリンの類似体または前駆体はｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸および／またはタウリンなどで供給され得る。一部の実施態様では、ｓ−カルボキシメチルシステインはＣＡＳ番号６３８−２３−３によって識別される化合物として供給され、システアミンはＣＡＳ番号６０−２３−１によって識別される化合物として供給され、システインスルフィン酸はＣＡＳ番号１１１５−６５−７によって識別される化合物として供給され、タウリンはＣＡＳ番号１０７−３５−７によって識別される化合物として供給される。一部の実施態様では、表４に示す化合物は、ＣＡＳ番号４６２−２０−４によって識別されるリポ酸還元型またはＣＡＳ番号７２９５６−０９−３によって識別されるカルベジロールなどで供給される。一部の実施態様では、アミノグアニジンはＣＡＳ番号１９３７−１９−５によって識別されるアミノグアニジン塩酸塩として供給される。本明細書において提供する培地成分は細胞培養培地に塩、水和物もしくは塩の水和物または当業者に知られた任意の他の形態として供給してもよい。また、培地成分を細胞培養培地に溶液、抽出物として、または固形形態で供給してもよい。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地は既知組成の培地である。本明細書における他の実施態様では、細胞培養培地は未知組成の培地である。
一部の態様では、本発明は、本明細書において、以下の成分：（ａ）ヒポタウリン；（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）カルノシン；（ｄ）アンセリン；（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンのうちの１種類以上を含む細胞培養培地を提供する。一部の実施態様では、細胞培養培地が、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）のうちの２または３または４または５または６種類または各成分を含むものである。本明細書において提供する細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）の任意の組合せを、あたかも１つ１つの組合せが具体的に個々に示されているかのごとく同じように含むものであり得ることを理解されたい。例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）のうちの４種類を含む細胞培養培地は、該成分のうちの少なくとも４種類が存在している限り該成分のどのような組合せを含むものであってもよいことを理解されたい。
一部の態様では、本明細書において提供される細胞培養培地は、（ａ）ヒポタウリン；（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）カルノシン；（ｄ）アンセリン；（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される１種類以上の培地成分を表１に示す量で含むものである。培地は、表１の培地成分の任意の１種類以上（例えば、成分（ａ）−（ｈ）のうちの任意の１種類以上、例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を含む培地または成分（ａ）、（ｂ）および（ｇ）を含む培地または成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類だけを含む培地）を表１に示した任意の量で、あたかも成分および量の１つ１つの組合せが具体的に個々に示されているかのごとく同じように含むものであり得ることを理解されたい。一態様において、細胞培養培地は既知組成の培地である。別の態様において、細胞培養培地は未知組成の培地である。一部の実施態様では、細胞培養培地が成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものであり、ここで（ａ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのヒポタウリンであり、（ｂ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのｓ−カルボキシメチルシステインであり、（ｃ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのカルノシンであり、（ｄ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのアンセリンであり、（ｅ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのブチル化ヒドロキシアニソールであり、（ｆ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのリポ酸であり、（ｇ）が少なくとも約０．０００１ｍＭからのケルシトリン水和物であり、（ｈ）が少なくとも約０．０００３ｍＭからのアミノグアニジンである。一部の実施態様では、細胞培養培地が成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものであり、ここで（ａ）が約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭのヒポタウリンであり、（ｂ）が約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭのｓ−カルボキシメチルシステインであり、（ｃ）が約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭのカルノシンであり、（ｄ）が約３．０ｍＭから約５．０ｍＭのアンセリンであり、（ｅ）が約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭのブチル化ヒドロキシアニソールであり、（ｆ）が約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭのリポ酸であり、（ｇ）が約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭのケルシトリン水和物であり、（ｈ）が約０．０００３ｍＭから約１０ｍＭのアミノグアニジンである。
Figure 0006843911
Figure 0006843911
Figure 0006843911
一部の態様では、本発明は、本明細書において、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択されるヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地を提供する。一部の態様において、細胞培養培地は、以下の成分：（ａ）ヒポタウリン；（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）システアミン；（ｄ）システインスルフィン酸；および（ｅ）タウリンのうちの１種類以上を含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地が成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの２または３または４種類または各成分を含むものである。本明細書において提供する細胞培養培地は、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の任意の組合せを、あたかも１つ１つの組合せが具体的に個々に示されているかのごとく同じように含むものであり得ることを理解されたい。例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のうちの３種類を含む細胞培養培地は、該成分のうちの少なくとも３種類が存在している限り該成分のどのような組合せを含むものであってもよいことを理解されたい。ヒポタウリン類似体としては、例えば、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンが挙げられる。ヒポタウリン前駆体の例は当業者によく知られており、一部の態様では、ヒポタウリン前駆体はヒポタウリン類似体であり得る。
一部の態様では、本明細書において提供される細胞培養培地はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を表２に示す量で含むものである。培地は、表２の培地成分の任意の１種類以上（例えば、成分（ａ）−（ｅ）の任意の１種類以上、例えば、成分（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を含む培地または成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む培地または成分（ａ）−（ｅ）のうち１種類だけを含む培地）を表２に示した任意の量で、あたかも成分と量の１つ１つの組合せが具体的に個々に示されているかのごとく同じように含むものであり得ることを理解されたい。一部の実施態様では、細胞培養培地が、少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体、例えば、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸および／またはタウリンを含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地が、約０．５ｍＭから約５００．０ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体、例えば、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸および／またはタウリンを含むものである。
Figure 0006843911
Figure 0006843911
一部の態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は約０．０００１ｍＭから約０．５ｍＭの濃度のリポ酸還元型を含むものである。一部の態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は約０．０００１ｍＭから約１．５ｍＭの濃度のカルベジロールを含むものである。
本明細書において提供する個々の培地成分は、細胞培養および／または細胞培養物からのポリペプチド産生のための１つ以上の好都合な特性がもたらされる量で存在させるのがよい。好都合な特性としては、限定されないが、細胞培養物中のポリペプチドの酸化の低減および／または本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の着色強度の低減が挙げられる。また、本明細書において提供する細胞培養培地の好都合な特性としては、１つ以上の製品属性、例えば、細胞によって産生されるポリペプチドの量（例えば、抗体力価）、ポリペプチドのグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）プロフィール、組成物中のポリペプチドの荷電多様性、またはポリペプチドのアミノ酸配列の完全性に影響のない、該細胞培養培地中で培養された細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の着色強度の低減も挙げられる。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地中で細胞を培養するための１つ以上の好都合な特性は、細胞生存度、細胞によって産生されるポリペプチドの量、ポリペプチドのグリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）プロフィール、組成物中のポリペプチドの荷電多様性および／またはポリペプチドのアミノ酸配列の完全性に影響のない、細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の着色強度の低減である。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地中で細胞を培養するための１つ以上の好都合な特性は、細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の着色強度の低減および細胞培養物中のポリペプチドの酸化の低減である。このような好都合な特性は、本明細書に記載の目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞の培養方法および細胞培養物中での目的のポリペプチドの作製方法に適用可能である。
一部の態様において、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸、ケルシトリン水和物およびアミノグアニジンからなる群より選択される１種類以上の培地成分は本明細書において、細胞培養および／または細胞培養物からのポリペプチド産生のための１つ以上の好都合な特性がもたらされる量で提供される。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のヒポタウリンの量は約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、約１．６ｍＭから約９０ｍＭ、約１．７ｍＭから約８０ｍＭ、約１．８ｍＭから約７０ｍＭ、約１．９ｍＭから約６０ｍＭ、約２．０ｍＭから約５０ｍＭまたは約１．７５ｍＭから約５０ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のｓ−カルボキシメチルシステインの量は約０．５ｍＭから約１２０ｍＭ、約５．０ｍＭから約１５ｍＭ、約６．０ｍＭから約１４ｍＭ、約７．０ｍＭから約１３ｍＭまたは８．０ｍＭから約１２ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のアンセリンの量は約０．５ｍＭから約２０ｍＭ、約２．０ｍＭから約１０ｍＭまたは約３．０ｍＭから約５．０ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のブチル化ヒドロキシアニソールの量は約０．００５ｍＭから約０．２ｍＭ、約０．０２ｍＭから約０．０５ｍＭまたは約０．０２５ｍＭから約０．０４ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のカルノシンの量は約０．５ｍＭから約２０ｍＭ、約６．０ｍＭから約１４ｍＭまたは約８．０ｍＭから約１２ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のリポ酸の量は約０．０１ｍＭから約１．５ｍＭのリポ酸、約０．０３６ｍＭから約０．０８ｍＭ、約０．０３８ｍＭから約０．０７ｍＭまたは約０．０４ｍＭから約０．０６ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のケルシトリン水和物の量は約０．００５ｍＭから約０．０４ｍＭ、約０．０１ｍＭから約０．０３ｍＭ、約０．０１５ｍＭから約０．０２５ｍＭまたは約０．０１ｍＭから約０．０２ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のアミノグアニジンの量は約０．０００３ｍＭから約２４５ｍＭ、約０．００３ｍＭから約１５０ｍＭ、約０．０３ｍＭから約１００ｍＭ、約０．０３ｍＭから約５０ｍＭ、約０．０３ｍＭから約２５ｍＭ、約０．０３から約１０ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸、ケルシトリン水和物およびアミノグアニジンからなる群より選択されるもう１種類の培地成分の量は表１に示したものである。
一部の態様では、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される１種類以上の培地成分が本明細書において、細胞培養および／または細胞培養物からのポリペプチド産生のための１つ以上の好都合な特性がもたらされる量で提供される。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のヒポタウリンの量は約０．５ｍＭから約１００ｍＭ、約１．６ｍＭから約９０ｍＭ、約１．７ｍＭから約８０ｍＭ、約１．８ｍＭから約７０ｍＭ、約１．９ｍＭから約６０ｍＭ、約２．０ｍＭから約５０ｍＭまたは約１．７５ｍＭから約５０ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のｓ−カルボキシメチルシステインの量は約０．５ｍＭから約１２０ｍＭ、約５．０ｍＭから約１５ｍＭ、約６．０ｍＭから約１４ｍＭ、約７．０ｍＭから約１３ｍＭまたは約８．０ｍＭから約１２ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のシステアミンの量は約０．０１ｍＭから約３００ｍＭ、約０．０２ｍＭから約１ｍＭ、約０．０４ｍＭから約０．８ｍＭ、約０．０６ｍＭから約０．６ｍＭ、約０．０８ｍＭから約０．４ｍＭまたは約０．１ｍＭから約０．２ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のシステインスルフィン酸の量は約０．１ｍＭから１００ｍＭ、約０．２ｍＭから約１０ｍＭ、約０．３ｍＭから約１ｍＭ、約０．１ｍＭから約１ｍＭ、約０．２ｍＭから約０．８ｍＭまたは約０．３ｍＭから約０．６ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のタウリンの量は約０．５ｍＭから５００ｍＭ、約４．０ｍＭから約１００ｍＭまたは約１．０ｍＭから約１０ｍＭである。一部の実施態様では、１つ以上の好都合な特性がもたらされる細胞培養培地中のヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される１種類以上の培地成分の量は表２に示したものである。
本明細書において細胞培養培地は一態様において、細胞培養物中でポリペプチドを産生させる方法に使用した場合、異なる培地中で産生させた場合の該ポリペプチドの品質属性と比べて１つ以上の有利な製品品質属性または好都合な特性をもたらすものである。一部の特定の培地成分の使用によって形成される反応性酸素種（ＲＯＳ）によりポリペプチドの特定のアミノ酸が酸化され、酸化されたポリペプチド生成物が生成し得る。また、かかる酸化されたタンパク質種の存在により、任意の濃度で、例えば限定されないが約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬまたは約７５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬまでのいずれかより高い濃度で製剤化されたポリペプチド生成物で特に有意であり得る着色強度などのタンパク質生成物の製品品質属性が改変され得る。一部の実施態様では、酸化されたタンパク質種の存在により、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬまたは約２５０ｍｇ／ｍＬのいずれかより高い濃度で製剤化されたポリペプチド生成物で特に有意であり得る着色強度などのタンパク質生成物の製品品質属性が改変され得る。本明細書に詳述している培地を用いて産生されたポリペプチドを含む組成物（例えば、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ，２００ｍｇ／ｍＬまたは約２５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド、例えば抗体を含む組成物）の着色強度は、本明細書に記載のもの、または限定されないが米薬局方の色標準およびヨーロッパ薬局方の色標準に記載のものなどの色アッセイを用いて評価することができる。USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927およびCouncil of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 第7版 P.22（これらは出典明示によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。本明細書における任意の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は、色アッセイによって測定したとき参照溶液と比べて低減された着色強度を有するポリペプチドを含む組成物の調製のために使用され得る。例えば、本明細書において提供される細胞培養培地を用いて産生されたポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）を含む組成物（例えば、薬学的製剤）の着色強度は、表１または表２の成分のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地を用いて産生させたポリペプチドを含む組成物と比べて例えば限定されないが、少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％またはそれ以上の任意の量で低減され得る。
市販の培地、例えば限定されないが、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］，Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（［ＤＭＥＭ］，Ｓｉｇｍａ）、ルリアブロス（ＬＢ）およびテリフィック（ＴＢ）（細胞の培養に適したもの）に、本明細書に詳述したいずれかの培地成分を補給してもよい（例えば、提供するキットの使用により）。また、HamおよびWallace, Meth. Enz., 58:44 (1979)、BarnesおよびSato, Anal. Biochem., 102:255 (1980)、Vijayasankaranら, Biomacromolecules., 6：605：611 (2005)、Patkarら, J Biotechnology, 93:217-229 (2002)、米国特許第４７６７７０４号；同第４６５７８６６号；同第４９２７７６２号；または同第４５６０６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；米国再発行特許第３０９８５号；または米国特許第５１２２４６９号（これらのすべての開示内容は出典明示によりその全体が本明細書に援用される）に記載の任意の培地に、本明細書に詳述したいずれかの培地成分が補給され得る（例えば、提供するキットの使用により）。
一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地はシスチンを含んでおり、システインを含んでいないものである。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地はクエン酸第二鉄を含んでおり、硫酸第一鉄を含んでいないものである。本明細書における一部の実施態様では、提供する細胞培養培地はシステインおよび硫酸第一鉄を含んでいないものである。一部の実施態様では、培地はシステインおよび硫酸第一鉄を含んでおらず、シスチンおよび／またはクエン酸第二鉄を含んでいるものである。本明細書における任意の実施態様において、細胞培養培地は基本培地または流加培地であり得る。アミノ酸、ビタミン類、微量元素および他の培地成分が、欧州特許第３０７２４７号または米国特許第６１８０４０１号に明示された範囲の１倍または２倍で使用され得、これらの文献は出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
また、本明細書において提供する任意の培地に、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、イオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、微量元素（通常、マイクロモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義する）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を補給してもよい。一部の態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は、植物または動物に由来するタンパク質を含むものである。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養物は植物または動物に由来するタンパク質を含んでいない。また、任意の他の必要な補給物が、当業者にわかるであろう適切な濃度で含められ得る。
ＩＩＩ．本発明の方法および使用
本明細書において、目的のポリペプチドの作製のために本明細書において提供する細胞培養培地中で細胞を培養する方法を提供する。一部の態様において、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該方法が該細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、該細胞培養培地が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、カルノシン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、リポ酸およびケルシトリン水和物からなる群より選択される成分のうちの１種類以上を含むものである方法を提供する。一部の実施態様では、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該方法が該細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、該細胞培養培地が、（ａ）ヒポタウリン、（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）カルノシン、（ｄ）アンセリン、（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される成分のうちの１種類以上を含むものであり、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約５％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約１０％から約３０％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約５％から約７５％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が（ａ）約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭの濃度のヒポタウリン、（ｂ）約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度のｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度のカルノシン、（ｄ）約３．０ｍＭから約５．０ｍＭの濃度のアンセリン、（ｅ）約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭの濃度のリポ酸、（ｇ）約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭの濃度のケルシトリン水和物、および（ｈ）約０．０００３ｍＭから約２０ｍＭの濃度のアミノグアニジンから選択される量の１種類以上の成分を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、（ａ）ヒポタウリン、（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）カルノシン、（ｄ）アンセリン、（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される１種類以上の成分を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。
他の一部の態様では、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該細胞を、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地と接触させる工程を含む方法を提供する。一部の実施態様では、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該方法が該細胞を、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む細胞培養培地と接触させる工程を含み、該ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約５％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約１０％から約３０％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が約０．５ｍＭから約５００ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地が約１．０ｍＭから約４０ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体は細胞培養培地に細胞培養サイクル過程全体にわたって漸増的に添加されない。
また、本明細書において、ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む目的のポリペプチドの作製方法であって、該細胞培養培地が、（ａ）ヒポタウリン、（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）カルノシン、（ｄ）アンセリン、（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）リポ酸、（ｇ）ケルシトリン水和物および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される成分のうちの１種類以上を含むものである方法を提供する。一部の実施態様では、ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む目的のポリペプチドの作製方法であって、該細胞培養培地が、（ａ）ヒポタウリン、（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）カルノシン、（ｄ）アンセリン、（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）リポ酸、（ｇ）ケルシトリン水和物および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される成分のうちの１種類以上を含むものであり、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、成分（ａ）−（ｈ）のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約５％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約１０％から約３０％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約５％から約７５％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が、（ａ）約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭの濃度のヒポタウリン、（ｂ）約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度のｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭの濃度のカルノシン、（ｄ）約３．０ｍＭから約５．０ｍＭの濃度のアンセリン、（ｅ）約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭの濃度のリポ酸、（ｇ）約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭの濃度のケルシトリン水和物および（ｈ）約０．０００３ｍＭから約２０ｍＭの濃度のアミノグアニジンから選択される量の１種類以上の成分を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、（ａ）ヒポタウリン、（ｂ）ｓ−カルボキシメチルシステイン、（ｃ）カルノシン、（ｄ）アンセリン、（ｅ）ブチル化ヒドロキシアニソール、（ｆ）リポ酸；（ｇ）ケルシトリン水和物；および（ｈ）アミノグアニジンからなる群より選択される１種類以上の成分を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。
別の態様では、本明細書において、目的のポリペプチドの作製方法であって、該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む方法を提供する。一部の実施態様では、目的のポリペプチドの作製方法であって、該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含み、該細胞培養培地がヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものであり、該ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含まない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約０．１％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約５％低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約１０％から約３０％低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が約０．５ｍＭから約５００ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。一部の実施態様では、細胞培養培地が約１．０ｍＭから約４０ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。本明細書における一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体は細胞培養培地に細胞培養サイクル過程全体にわたって漸増的に添加されない。
本明細書における任意の実施態様において、本明細書に記載の方法に使用される細胞培養培地は既知組成の細胞培養培地であっても未知組成の細胞培養培地であってもよい。本明細書において提供する細胞培養培地は細胞培養基本培地または細胞流加培地として使用され得る。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は本細胞培養方法の細胞の増殖期に使用される。一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地は本細胞培養方法の細胞の産生期に使用される。本明細書における任意の方法において、細胞はＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞であり得る。一部の実施態様では、目的のポリペプチドは抗体またはその断片である。
本明細書におけるさらなる実施態様では、目的のポリペプチドが回収される。回収されるポリペプチドを含む組成物を、本明細書に記載のような定量的または定性的色アッセイを用いた着色強度の評価の前に少なくとも１回の精製工程に供してもよい。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物は液状組成物または非液状組成物である。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む液状組成物または非液状組成物は着色強度について、本明細書に記載のような、または当該技術分野で知られた色アッセイを用いて評価され得る。例えば、回収されるポリペプチドを含む非液状組成物は、後で着色強度の測定前に再構成される凍結乾燥組成物であり得る。本明細書における一部の実施態様では、本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の着色強度は、本明細書に記載の培地成分（例えば、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体）を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度と比べて少なくとも０．１％低減される。一部の実施態様では、着色強度は少なくとも約０．１％、少なくとも約０．２％、少なくとも約０．３％、少なくとも約０．４％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．６％、少なくとも約０．７％、少なくとも約０．８％、少なくとも約０．８％または少なくとも約０．９％から約１．０％低減される。一部の実施態様では、着色強度は少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％から約１００％低減される。一部の実施態様では、着色強度は約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％から約１．０％低減される。一部の実施態様では、着色強度は約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％から約１００％低減される。一部の実施態様では、着色強度は約１％から約１０％、約５％から約１５％、約５％から約２０％、約５％から約２５％、約５％から約３０％、約５％から約３５％、約５％から約４０％、約５％から約４５％、約５％から約５０％、約１０％から約２０％または約１５％から約２５％低減される。一部の実施態様では、回収されるポリペプチドを含む組成物は無色またはわずかに着色した液体または組成物に見える。液体または組成物は、本明細書に記載のような色アッセイまたは当業者に知られた色アッセイを用いて無色またはわずかに着色していると判定され得る。さらなる一実施態様では、組成物は、本明細書に記載のような薬学的に許容され得る担体をさらに含んでいてもよい薬学的組成物である。
また、本明細書に詳述しているポリペプチドの投与方法も提供する。例えば、個体にポリペプチドを含む製剤を投与するための方法であって、該製剤が該ポリペプチドを少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬより高い濃度で有し、ＣＯＣアッセイによって測定したときＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い着色強度値を有するものである方法を提供する。一部の態様では、ＣＯＣアッセイによって測定される着色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹまたはＲのうちのいずれか１つであり得、ここで、値が大きいほど着色強度が小さいことを示す。目的のポリペプチドを含む製剤は注射に、例えば個体への皮下注射（例えば、ヒトへの皮下注射）に適したものであり得る。一部の態様において、目的のポリペプチドを含む注射に適した（例えば、皮下注射に適した）製剤は少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２５ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬより高い濃度であり、ＣＯＣアッセイによって測定したときＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い着色強度値を有するものである。一部の態様では、ＣＯＣアッセイによって測定される着色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹまたはＲのうちのいずれか１つであり得、ここで、値が大きいほど着色強度が小さいことを示す。
全体において、例えば本発明の簡単な概要およびその他の箇所に他の方法を提供する。
ポリペプチドの作製
本明細書において詳述している細胞培養培地は、ポリペプチド、例えば特定の抗体を作製するための細胞培養方法に使用され得る。該培地は、バッチ培養、フェドバッチ培養または灌流培養のいずれによるものであれ細胞培養方法に使用され得、任意のポリペプチド、例えば本明細書に記載のポリペプチドの任意の態様または実施態様の作製方法に使用され得る。本明細書に詳述している組成物（例えば、本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞）および方法によって作製され、本明細書において提供する組成物（例えば、作製するポリペプチドを含む細胞培養培地）中に存在するポリペプチドは宿主細胞に相同であってもよく、または好ましくは外来性（使用される宿主細胞に対して非相同である、すなわち異物であることを意味する、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生させたヒトタンパク質、または哺乳動物細胞によって産生させた酵母ポリペプチド）であり得る。多様な形態の一例では、ポリペプチドは、宿主細胞によって培地中に直接分泌された哺乳動物ポリペプチド（例えば、抗体）である。多様な形態の別の一例では、ポリペプチドは培地中に、該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞の溶解によって放出される。
宿主細胞において発現可能な任意のポリペプチドが本開示に従って作製され得、提供する組成物中に存在し得る。ポリペプチドは、宿主細胞に内在性の遺伝子から発現させたものであってもよく、宿主細胞内に遺伝子操作よって導入した遺伝子から発現させたものであってもよい。ポリペプチドは天然に存在するものであってもよく、あるいはまた、人間の手で操作または選択した配列を有するものであってもよい。操作されたポリペプチドは、個々に天然に存在する他のポリペプチドセグメントから合成したものであってもよく、天然に存在しない１つ以上のセグメントを含むものであってもよい。
本発明に従って望ましく発現され得るポリペプチドは、しばしば、興味深い生物学的または化学的活性に基づいて選択される。例えば、本発明は、任意の薬学的または商業的に重要な酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現させるために使用され得る。
細胞培養物中での抗体などのポリペプチドの作製方法は当該技術分野でよく知られている。本明細書において、細胞培養物中で抗体（例えば、完全長抗体、抗体断片および多重特異性抗体）を作製するための非限定的で例示的な方法を提供する。本明細書における方法は当業者によって、他のタンパク質、例えばタンパク質系阻害剤の作製に適合され得る。タンパク質（例えば、治療用タンパク質）の作製のための一般的に充分理解されており、一般的に使用されている手法および手順については、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrookら, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら編, 2003); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編, J. Wiley and Sons, 2002); Current Protocols in Protein Science, (Horswillら, 2006; Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane編, 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 第6版, J. Wiley and Sons, 2010)（これらはすべて、出典明示によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。
（Ａ）抗体の調製
本明細書において提供する細胞培養培地を用いて細胞培養物中で作製される抗体は目的の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、該抗体を含む組成物を、障害に苦しんでいる哺乳動物に投与することにより該哺乳動物に治療有益性がもたらされ得る。
（ｉ）抗原の調製
可溶性抗原またはその断片（他の分子にコンジュゲートさせてもよい）が、抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。膜貫通型分子、例えば受容体に対しては、その断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が免疫原として使用され得る。あるいはまた、膜貫通型分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。かかる細胞は天然供給源（例えば、癌細胞株）に由来するものであってよく、膜貫通型分子を発現するように組換え手法によって形質転換した細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原およびその形態は当業者に自明であろう。
（ｉｉ）一部の特定の抗体系の方法
目的のモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature, 256:495 (1975)によって報告され、例えば、Hongoら, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988); Hammerlingら:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)およびNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)にヒト−ヒトハイブリドーマに関してさらに報告されたハイブリドーマ法を用いて作製され得る。さらなる方法としては、例えば、ハイブリドーマ細胞株でのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の作製に関する米国特許第７１８９８２６号に記載のものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はVollmersおよびBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)ならびにVollmersおよびBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
種々の他のハイブリドーマ手法については、例えば、米国特許出願公開第２００６／２５８８４１号；米国特許出願公開第２００６／１８３８８７号（完全ヒト抗体）、米国特許出願公開第２００６／０５９５７５号；米国特許出願公開第２００５／２８７１４９号；米国特許出願公開第２００５／１００５４６号；米国特許出願公開第２００５／０２６２２９号；ならびに米国特許第７０７８４９２号および同第７１５３５０７号を参照のこと。ハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を作製するための例示的なプロトコルは以下のとおりに記載される。一実施態様では、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを免疫処置し、免疫処置に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生し得るリンパ球を誘発する。抗体は動物において、目的のポリペプチドまたはその断片およびアジュバント、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／トレハロースジコリノミコレート（torehalose dicrynomycolate）（ＴＤＭ）の反復皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射によって生成させる（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）。免疫処置した動物の血清を抗抗原抗体についてアッセイし、ブースター免疫処置を施してもよい。抗抗原抗体が生じた動物のリンパ球を単離する。あるいはまた、リンパ球をインビトロで免疫処置してもよい。
次いで、リンパ球をミエローマ細胞と、適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。例えば、Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)を参照のこと。効率的に融合され、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を補助し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるミエローマ細胞が使用され得る。例示的なミエローマ細胞としては、限定されないが、マウスミエローマ系統、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が挙げられる。また、ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もヒトモノクローナル抗体の作製について報告されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
かくして調製されたハイブリドーマ細胞を適当な培養培地中に、例えば、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１種類以上の物質を含む培地中に播種し、培養する。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサン、アミノプテリンおよびチミジンを含むものであり（ＨＡＴ培地）、これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を抑制する。好ましくは、ウシ胎仔血清などの動物由来の血清の使用を低減するため、例えばEvenら, Trends in Biotechnology, 24(3), 105-108 (2006)に記載のような無血清ハイブリドーマ細胞培養方法が使用される。
ハイブリドーマ細胞培養物の生産性を改善するためのツールとしてのオリゴペプチドは、Franek, Trends in Monoclonal Antibody Research, 111-122 (2005)に記載されている。具体的には、標準的な培養培地を、特定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）またはタンパク質加水分解物画分を富化し、３つから６つのアミノ酸残基で構成された合成オリゴペプチドによってアポトーシスが有意に抑制され得る。ペプチドはミリモル濃度またはそれ以上の濃度で存在する。
ハイブリドーマ細胞を培養している培養培地は、モノクローナル抗体の産生についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によって、またはインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード解析によって測定され得る。例えば、Munsonら, Anal. Biochem., 107:220 (1980)を参照のこと。
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンが限界希釈手順によってサブクローニングされ、標準的な方法によって培養され得る。例えば、Goding, 上掲を参照のこと。この目的のための好適な培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。一部の実施態様では、ハイブリドーマ細胞は本明細書において提供する細胞培養培地中で培養される。一部の実施態様では、ハイブリドーマ細胞は、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸およびケルシトリン水和物からなる群より選択される１種類以上の培地成分を含む細胞培養培地中で培養される。一部の実施態様では、該１種類以上の培地成分はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体である。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。
抗体を組換え法を用いて作製してもよい。抗抗原抗体の組換え作製のため、該抗体をコードしている核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または発現のために複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードしているＤＮＡは慣用的な手順を用いて（例えば、該抗体の重鎖と軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、配列決定され得る。多くのベクターが利用可能である。一般的にベクター成分としては、限定されないが、以下のもの：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１種類以上が挙げられる。
（ｉｉｉ）一部の特定のライブラリースクリーニング法
抗体を、コンビナトリアルライブラリーを使用して所望の活性（一又は複数）を有する抗体をスクリーニングすることにより作製してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、かかるライブラリーを、所望の結合特性を有する抗体についてスクリーニングするためのさまざまな方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は、HoogenboomらのMethods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brienら編, Human Press, Totowa, N.J., 2001)に一般的に記載されている。例えば、目的の抗体の作製方法の一例は、Leeら, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載のようなファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
原則的に、合成の抗体クローンが、ファージコートタンパク質と融合させた抗体可変領域（Ｆｖ）の種々の断片をディスプレイしているファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることにより選択される。かかるファージライブラリーは、アフィニティークロマトグラフィーにより所望の抗原に対してパニングされる。所望の抗原に結合し得るＦｖ断片を発現しているクローンは抗原に吸着され、したがってライブラリー内の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンを抗原から溶出し、抗原吸着／溶出のさらなるサイクルによってさらに富化してもよい。目的のファージクローンを選択するための適当な抗原スクリーニング手順を設計した後、Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), 第1-3巻に記載されている、この目的のファージクローンのＦｖ配列と適当な定常領域（Ｆｃ）配列を用いて完全長抗体クローンを構築することにより、任意の目的の抗体が得られ得る。
一部の特定の実施態様では、抗体の抗原結合ドメインが約１１０個のアミノ酸の２つの可変（Ｖ）領域から形成され、この２つの可変（Ｖ）領域はそれぞれ軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）に由来し、どちらも３つの超可変ループ（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）を提示する。可変ドメインは、機能的にファージ上に単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片（この場合、ＶＨとＶＬは柔軟性の短鎖ペプチドを介して共有結合されている）、またはＦａｂ断片（この場合、各々は定常ドメインと融合され、非共有結合的に相互作用している）のいずれかとしてディスプレイされ得る（Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載）。本明細書で用いる場合、ｓｃＦｖコードファージクローンおよびＦａｂコードファージクローンを集合的に「Ｆｖファージクローン」または「Ｆｖクローン」と称する。
ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、ファージライブラリー内でランダムに再結合させてもよく、次いで、これを抗原結合クローンについてWinterら, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載のようにして調べてもよい。免疫処置源のライブラリーにより、ハイブリドーマを構築する必要なく免疫原に対して高親和性の抗体が得られる。あるいはまた、Griffithsら, EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載のように、ナイーブレパートリーをクローニングし、なんら免疫処置を伴わずに広範な非自己抗原とともに自己抗原に対する単一のヒト抗体源を得てもよい。最後に、ナイーブライブラリーはまた、HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載のようにして、幹細胞由来の非再編成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、高度可変ＣＤＲ３領域をコードさせるため、およびインビトロ再編成を行なうためのランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより、合成によって作製することもできる。
一部の特定の実施態様では、繊維状ファージが使用され、抗体断片をマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩとの融合によってディスプレイさせる。抗体断片は、単鎖Ｆｖ断片（この場合、ＶＨおよびＶＬドメインは、同じポリペプチド鎖上で柔軟性ポリペプチドスペーサーによって連結されている、例えば、Marksら, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載）、またはＦａｂ断片（この場合、一方の鎖がｐＩＩＩと融合され、他方が細菌宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、ここで、一部の野生型コートタンパク質と置き換えられることにより、ファージ表面上にディスプレイされるＦａｂ−コートタンパク質構造が合成される、例えば、Hoogenboomら, Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)に記載）としてディスプレイされ得る。
一般に、抗体遺伝子断片をコードしている核酸は、ヒトまたは動物から収集した免疫細胞から得られる。抗抗原クローンに有利に偏ったライブラリーが所望される場合、被検体を抗原で免疫処置して抗体応答を生じさせ、脾臓細胞および／または循環Ｂ細胞 他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を回収してライブラリーを構築する。一実施態様では、抗抗原クローンに有利に偏ったヒト抗体遺伝子断片ライブラリーが、機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する（内在性の機能性抗体産生系はない）トランスジェニックマウスにおいて、抗原免疫処置によってＢ細胞が抗原に対するヒト抗体を産生するような抗抗原抗体応答を生じさせることにより得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は後述する。
抗原特異性膜結合型抗体を発現しているＢ細胞を単離するための適当なスクリーニング手順を使用することにより、例えば、抗原アフィニティークロマトグラフィーを用いた細胞分離または蛍光色素標識抗原への細胞の吸着の後、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によって、抗抗原反応性の細胞集団のさらなる富化が得られ得る。
あるいはまた、免疫処置していないドナー由来の脾臓細胞および／またはＢ細胞もしくは他のＰＢＬの使用により、より良好な考えられ得る抗体レパートリーの提示がもたらされ、また、抗原が抗原性でない任意の動物（ヒトまたは非ヒト）種を用いた抗体ライブラリーの構築が可能になる。インビトロ抗体遺伝子構築が組み込まれたライブラリーでは、被検体から幹細胞を収集し、非再編成抗体遺伝子セグメントをコードしている核酸を得る。目的の免疫細胞は、さまざまな動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ルプリン（ｌｕｐｒｉｎｅ）、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマおよびトリ種などから得られ得る。
抗体可変遺伝子セグメント（例えば、ＶＨおよびＶＬセグメント）をコードしている核酸を目的の細胞から回収し、増幅する。再編成ＶＨおよびＶＬ遺伝子ライブラリーの場合、所望のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをリンパ球から単離した後、再編成ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子の５’末端と３’末端がマッチングしているプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られ得（Orlandiら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載）、それにより、発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーが作製され得る。Ｖ遺伝子はｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡから、エキソンの５’末端に成熟Ｖ−ドメインがコードされたバック（ｂａｃｋ）プライマーとＪ−セグメント内ベースのフォワードプライマーを用いて増幅され得る（Orlandiら (1989)およびWardら, Nature, 341: 544-546(1989)に記載）。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅では、リーダーエキソン内ベースのバックプライマー（Jonesら, Biotechnol., 9: 88-89 (1991)に記載）および定常領域内のフォワードプライマー（Sastryら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 5728-5732 (1989)に記載）を使用してもよい。相補性を最大限にするため、縮重がプライマー内に組み込まれ得る（Orlandiら(1989)またはSastryら(1989)に記載）。一部の特定の実施態様では、ライブラリーの多様性は、免疫細胞核酸試料中に存在する利用可能なすべてのＶＨおよびＶＬ編成を増幅させるために各Ｖ遺伝子ファミリーに標的化されたＰＣＲプライマーを使用することにより最大限になる（例えば、Marksら, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)の方法に記載、またはOrumら, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993)の方法に記載）。増幅ＤＮＡの発現ベクター内へのクローニングのため、レア制限部位がＰＣＲプライマー内に、一端にタグとして（Orlandiら(1989)に記載）またはタグ化プライマーを用いたさらなるＰＣＲ増幅によって（Clacksonら, Nature, 352: 624-628 (1991)に記載）導入され得る。
合成的に再編成されるＶ遺伝子のレパートリーは、インビトロでＶ遺伝子セグメントから誘導され得る。ほとんどのヒトＶＨ遺伝子セグメントがクローニングされ、配列決定されており（Tomlinsonら, J. Mol. Biol., 227: 776-798 (1992)に報告）、マッピングされている（Matsudaら, Nature Genet., 3: 88-94 (1993)に報告）；このようなクローニングセグメント（例えば、Ｈ１およびＨ２ループのすべての主要コンホメーション）が、多様な配列および長さのＨ３ループをコードしているＰＣＲプライマーを用いて多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するために使用され得る（HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載）。また、ＶＨレパートリーは、単一の長さの長鎖Ｈ３ループに重点を置いたすべての配列多様性を用いて作製することもできる（Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461 (1992)に記載）。ヒトＶκおよびＶλセグメントがクローニングされ、配列決定されており（WilliamsおよびWinter, Eur. J. Immunol., 23:1456-1461 (1993)に報告）、合成軽鎖レパートリーの作製に使用され得る。ＶＨおよびＶＬフォールディング部ならびにＬ３およびＨ３長さ部の範囲に基づいた合成Ｖ遺伝子レパートリーは、相当な構造的多様性の抗体をコードする。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅後、生殖細胞系列Ｖ遺伝子セグメントがインビトロで、HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)の方法に従って再編成され得る。
抗体断片のレパートリーは、ＶＨおよびＶＬの遺伝子レパートリーをいくつかの様式で一体に結合することにより構築され得る。各レパートリーを異なるベクター内で作出し、ベクターをインビトロで（例えば、Hogrefeら, Gene, 128: 119-126 (1993)に記載）、またはインビボでコンビナトリアル感染（例えば、Waterhouseら, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993)に記載のｌｏｘＰ系）によって再結合してもよい。インビボ再結合アプローチでは、大腸菌の形質転換効率によって課されるライブラリーサイズの制限が解消されるというＦａｂ断片の２鎖性が利用される。ナイーブＶＨおよびＶＬレパートリーは別々に、一方はファージミド内に、他方はファージベクター内にクローニングされる。次いで、この２つのライブラリーをファージミド含有細菌のファージ感染により、各細胞が異なる組合せを含み、ライブラリーサイズが存在する細胞の数（約１０１２クローン）によってのみ制限されるように結合する。どちらのベクターも、ＶＨ遺伝子とＶＬ遺伝子が単一のレプリコンに再結合され、ファージビリオン内に共パッケージングされるようなインビボ再結合シグナルを含む。このような巨大なライブラリーにより、良好な親和性（約１０−８ＭのＫｄ −１）の大量数の多様な抗体が得られる。
あるいはまた、レパートリーを同じベクター内に逐次クローニングしてもよく（例えば、Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載）、ＰＣＲによって一体合成し、次いでクローニングしてもよい（例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628 (1991)に記載）。また、ＰＣＲ合成を用い、ＶＨおよびＶＬのＤＮＡを、柔軟性ペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡと連接し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成してもよい。また別の手法では「細胞内ＰＣＲ合成」を使用し、ＶＨおよびＶＬの遺伝子をリンパ球内でＰＣＲによって結合し、次いで連結した遺伝子のレパートリーをクローニングする（Embletonら, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992)に記載）。
ナイーブライブラリー（天然または合成のいずれか）によって作製した抗体は中くらいの親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫｄ −１）のものであり得るが、二次ライブラリーを構築してこのライブラリーから再選択することにより、親和性成熟をインビトロで模倣することもできる（Winterら(1994), 上掲に記載）。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼ（Leungら, Technique 1: 11-15 (1989)に報告）をHawkinsら, J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)の方法またはGramら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992)の方法において使用することにより、インビトロでランダムに導入され得る。さらに、親和性成熟は、１つ以上のＣＤＲを、例えば、対象のＣＤＲにまたがるランダム配列を有するプライマーを用いたＰＣＲを使用して、選択した個々のＦｖクローンにおいてランダムに変異させ、より高親和性クローンをスクリーニングすることにより行なわれ得る。国際公開第９６０７７５４号（１９９６年３月１４日公開）では、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に変異誘発を誘導し、軽鎖遺伝子のライブラリーを作出するための方法が報告された。別の有効なアプローチは、ファージディスプレイによって選択したＶＨまたはＶＬドメインを、免疫処置していないドナーから得た天然に存在するＶドメインバリアントのレパートリーと再結合し、数回の再鎖シャッフリングにおいて高親和性についてスクリーニングすることである（Marksら, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載）。この手法では、約１０−９Ｍ以下の親和性を有する抗体および抗体断片の作製が可能である。
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野で知られた種々の手法によって行なわれ得る。例えば、抗原は、吸着プレートのウェルをコートするために使用されて、吸着プレートに固定した宿主細胞上で発現させ得るか、もしくは細胞分取において使用され得るか、またはストレプトアビジンコートビーズでの捕捉のためにビオチンとコンジュゲートされ得るか、またはファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法において使用され得る。
ファージライブラリー試料は固定化した抗原と、ファージ粒子の少なくとも一部分を吸着剤に結合させるのに適した条件下で接触させる。通常、条件、例えばｐＨ、イオン強度、温度などが生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合しているファージを洗浄し、次いで、酸によって（例えば、Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 88: 7978-7982 (1991)に記載）またはアルカリによって（例えば、Marksら, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載）、または抗原競合によって（例えば、Clacksonら, Nature, 352: 624-628 (1991)の抗原競合方法と同様の手順で）溶出する。ファージは１回の選択で２０−１，０００倍に富化され得る。さらに、富化されたファージは細菌培養液中で培養され、さらなる回数の選択に供され得る。
選択効率は多くの要素に、例えば洗浄中の解離の速度論、および単一のファージ上の多数の抗体断片が同時に抗原と結合し得るかかどうかに依存する。高速解離速度論（および弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間の洗浄、多価ファージディスプレイおよび固相内における高密度の抗原コーティングの使用によって保持され得る。この高密度は、多価相互作用によってファージを安定させるだけでなく、解離したファージの再結合に有利である。遅い解離速度論（および良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、長時間の洗浄ならびに一価ファージディスプレイ（Bassら, Proteins, 8: 309-314 (1990)および国際公開第９２／０９６９０号に記載）および低密度の抗原コーティング（Marksら, Biotechnol., 10: 779-783 (1992)に記載）の使用によって促進され得る。
抗原に対して異なる親和性のファージ抗体間での選択が可能である（親和性の違いがわずかであっても）。しかしながら、選択された抗体（例えば、いくつかの親和性成熟手法で行なわれる）のランダム変異では多くの変異型が生じやすく、ほとんどが抗原に結合し、高親和性のものは少ない。抗原が限定的な場合では、稀に高親和性ファージが出る場合があり得る。すべて高親和性の変異型を保持するためには、ファージを過剰のビオチン化抗原とインキュベートするのがよいが、ビオチン化抗原は、抗原に対する目標モル親和性定数より低いモル濃度の濃度である。次いで、高親和性結合ファージがストレプトアビジンコート常磁性ビーズによって捕捉され得る。かかる「平衡捕捉」により抗体をその結合の親和性に従って、親和性が低い大過剰のファージから２倍という少しだけ高い親和性の変異型クローンの単離を可能にする感度で選択することが可能である。また、固相に結合しているファージの洗浄に使用される条件も、解離速度論に基づいて識別されるように操作され得る。
抗抗原クローンは活性に基づいて選択され得る。一部の特定の実施態様では、本発明は、抗原を天然に発現する生細胞に結合する抗抗原抗体、または遊離の浮遊抗原もしくは他の細胞構造体に結合している抗原に結合する抗抗原抗体を提供する。かかる抗抗原抗体に対応するＦｖクローンは、（１）上記のようにして抗抗原クローンをファージライブラリーから単離すること、および単離したファージクローン集団を、該集団を適当な細菌宿主内で増殖させることにより増幅してもよい；（２）抗原ならびにそれぞれブロック活性および非ブロック活性が所望される対象の第２のタンパク質を選択すること；（３）抗抗原ファージクローンを固定化した抗原に吸着させること；（４）過剰の該第２のタンパク質を使用し、該第２のタンパク質の結合決定基と重複しているか、または共有されている抗原結合決定基を認識する所望されないクローン（あれば）を溶出させること；ならびに（５）工程（４）の後、吸着されたままのクローンを溶出させることにより選択され得る。任意選択で、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選択手順を１回以上繰り返すことによりさらに富化してもよい。
目的のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体またはファージディスプレイＦｖクローンをコードしているＤＮＡは、慣用的な手順を用いて（例えば、目的の重鎖および軽鎖コード領域がハイブリドーマまたはファージＤＮＡ鋳型から特異的に増幅されるように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより）容易に単離され、配列決定される。単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配置され得、発現ベクターは次いで、通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞内での所望のモノクローナル抗体の合成を得る。細菌内での抗体コードＤＮＡの組換え発現に関する概説論文としては、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993)およびPluckthun, Immunol. Revs,130: 151 (1992)が挙げられる。
ＦｖクローンをコードしているＤＮＡを、重鎖および／または軽鎖の定常領域をコードしている既知のＤＮＡ配列（例えば、適切なＤＮＡ配列はKabatら, 上掲から得られ得る）と結合させ、完全長または一部の長さの重鎖および／または軽鎖をコードしているクローンを形成してもよい。任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使用され得ること（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域）、ならびにかかる定常領域は任意のヒトまたは動物種から得られ得ることは認識されよう。ある動物（例えば、ヒト）種の可変ドメインＤＮＡから誘導し、次いで、別の動物種の定常領域ＤＮＡと融合させて「ハイブリッド」完全長の重鎖および／または軽鎖コード配列（一又は複数）を形成したＦｖクローンは、本明細書で用いる「キメラ」および「ハイブリッド」抗体の定義に包含される。一部の特定の実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから誘導したＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡと融合させて、完全長または一部の長さのヒト重鎖および／または軽鎖のためのコード配列（一又は複数）を形成する。
また、ハイブリドーマから誘導した抗抗原抗体をコードしているＤＮＡを、例えば、ハイブリドーマクローンから誘導した相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列で置き換えることにより修飾してもよい（例えば、Morrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)の方法の場合のように）。ハイブリドーマ由来またはＦｖクローン由来の抗体または断片をコードしているＤＮＡを、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を共有結合させることによりさらに修飾してもよい。このようにして、目的のＦｖクローンまたはハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
（ｉｖ）ヒト化およびヒト抗体
非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から該抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有するものである。このような非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従い、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列で置き換えることにより行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトのものより実質的に少ないヒト可変ドメインが非ヒト種の対応する配列で置き換えられたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基および場合によっては一部のＦＲ残基が齧歯類抗体の同様の部位に由来する残基で置き換えられているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作製に使用するためのヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖ともに）の選択は、抗原性を低減させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列が既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、齧歯類のものに最も近いヒト配列がヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れられる（Simsら, J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901 (1987)）。別の方法では、特定のサブグループの軽鎖または重鎖のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークが使用される。同じフレームワークがいくつかの異なるヒト化抗体に使用され得る（Carterら, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 89: 4285 (1992); Prestaら, J. Immunol., 151:2623 (1993)）。
抗体を、抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性を保持したままヒト化することはさらに重要である。この目的を果たすため、該方法の一実施態様によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用する親配列および種々の概念的ヒト化産物の解析方法によって調製される。免疫グロブリンの３次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者は熟知している。選択した候補免疫グロブリン配列の予想される３次元コンホメーション構造を図示および表示するコンピュータプログラムも入手可能である。このような表示物を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能発揮における諸残基のありそうな役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能である。このようにして、ＦＲ残基がレシピエント配列およびインポート配列から、所望の抗体特性、例えば標的抗原（一又は複数）に対する増大した親和性が得られるように選択され、結合され得る。一般に、超可変領域の残基が抗原結合への影響に直接および最も実質的に関与する。
目的のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列（一又は複数）を既知のヒト定常ドメイン配列（一又は複数）と上記のようにして結合することにより構築され得る。あるいはまた、目的のヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の作製のためのヒトミエローマ細胞株およびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);およびBoernerら, J. Immunol., 147: 86 (1991)に報告されている。
免疫処置すると内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを生成し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することが可能である。例えば、キメラ生殖細胞系列変異型マウスの抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失により、内因性抗体産生の完全阻害がもたらされることが報告されている。ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子アレイをかかる生殖細胞系列変異型マウスに導入すると、抗原刺激によりヒト抗体の生成がもたらされる。例えば、Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovitsら, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermannら, Year in Immuno., 7:33 (1993);およびDuchosalら Nature 355:258 (1992)を参照のこと。
また、遺伝子シャッフリングを用いて非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を誘導することもでき、このとき、このヒト抗体は非ヒトの出発抗体と類似した親和性および特異性を有するものである。この方法（これは「エピトープインプリンティング」とも称される）によれば、本明細書に記載のファージディスプレイ手法によって得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれかがヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖のｓｃＦｖまたはＦａｂキメラ集団が作出される。抗原を用いた選択により非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離がもたらされ、ここで、ヒト鎖は一次ファージディスプレイクローンの対応する非ヒト鎖の除去時に破壊された抗原結合部位が回復している、すなわち、エピトープによりヒト鎖パートナーの選択が支配（インプリンティング）される。残りの非ヒト鎖の置き換えのためにこのプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる（国際公開第９３／０６２１３号（１９９３年４月１日公開）を参照のこと）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この手法では、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全なヒト抗体が得られる。
（ｖ）抗体断片
抗体断片は、従来からの手段、例えば酵素による消化または組換え手法によって作製され得る。一部の特定の状況では、完全な抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。断片のサイズが小さいほど速やかな排出が可能になり、充実性腫瘍への到達の改善がもたらされ得る。特定の抗体断片の概説については、Hudsonら (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照のこと。
抗体断片を作製するための種々の手法が開発されている。従来、このような断片はインタクトな抗体のタンパク質分解的消化によって得ていた（例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);およびBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照のこと）。しかしながら、このような断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接作製することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌において発現および分泌させることができ、したがって、これらの断片を大量に容易に作製することが可能である。抗体断片を、上記に論考した抗体ファージライブラリーから単離してもよい。あるいはまた、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２断片を形成してもよい（Carterら, Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含むインビボ半減期が長くなったＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体断片の作製のための他の手法は当業者に自明であろう。一部の特定の実施態様では、抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；および同第５５８７４５８号を参照のこと。ＦｖおよびｓｃＦｖはインタクトな結合部位を有する唯一の種であるが定常領域はない；したがって、これらはインビボ使用の際の非特異的結合の低減に適したものであり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合体を得るために構築され得る。Antibody Engineering, Borrebaeck編, 上掲を参照のこと。また、例えば抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載のような「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体は単一特異性であっても二重特異性であってもよい。
（ｖｉ）多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有するものであり、この場合、該エピトープは通常、異なる抗原のものである。かかる分子は通常、２つの異なるエピトープのみに結合するもの（すなわち、二重特異性抗体，ＢｓＡｂ）であるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体も、本明細書で用いている場合のこの表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。
二重特異性抗体の作製方法は当該技術分野で知られている。従来の完全長二重特異性抗体の作製は２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づいており、この場合、２つの鎖は異なる特異性を有するものである（Millsteinら, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のランダムな組合せのため、このようなハイブリドーマ（クアドローマ）では、１０種類の異なる抗体分子の考えられ得る混合物が生じ、これらのうち、１種類だけが正しい二重特異性構造を有するものである。正しい分子の精製は、通常アフィニティークロマトグラフィー工程によって行なわれるが、どちらかというと面倒であり、生成物収率は低い。同様の手順が国際公開第９３／０８８２９号およびTrauneckerら, EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリンの定常ドメイン配列と融合させる。この融合体は好ましくは、免疫グロブリン重鎖の定常ドメインを有し、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部分を含むものである。典型的には、融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含む第１重鎖の定常領域（ＣＨ１）を有する。免疫グロブリン重鎖融合体および所望される場合は免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを別々の発現ベクター内に挿入し、適当な宿主生物体にコトランスフェクトする。これにより、構築物に等しくない比の３つのポリペプチド鎖を使用して最適な収率を得る実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調整において大きな柔軟性がもたらされる。しかしながら、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現により高い収率がもたらされる場合、または比率が特に重要でない場合、３つのポリペプチド鎖のうち２つまたは全部のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの一実施態様では、二重特異性抗体は、一方のアームに第１の結合特異性、および他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性をもたらす）を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖で構成されたものである。この非対称な構造により、二重特異性分子の片方だけに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより容易な分離様式がもたらされるため、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組合せから分離することが容易になることがわかった。このアプローチは国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Sureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
国際公開第９６／２７０１１号に記載の別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面が、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージが最大限になるように操作され得る。界面の一例は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含むものである。この方法では、第１の抗体分子の界面の１つ以上の小型のアミノ酸側鎖が大型側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置き換えられる。大型のアミノ酸側鎖と小型のもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）との置き換えにより、この大型側鎖（一又は複数）と同一または類似のサイズの代償的「空洞」が第２の抗体分子の界面上に作出される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終生成物よりもヘテロ二量体の収率を増大させるための機構がもたらされる。
二重特異性抗体としては、架橋型または「ヘテロコンジュゲート」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体はアビジンに、他方はビオチンにカップリングされ得る。かかる抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化させること（米国特許第４６７６９８０号）ならびにＨＩＶ感染の治療（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号および欧州特許第０３０８９号）が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法を用いて作製され得る。好適な架橋剤は当該技術分野でよく知られており、米国特許第４６７６９８０号にいくつかの架橋手法とともに開示されている。
また、抗体断片から二重特異性抗体を作製するための手法も文献も報告されている。例えば、二重特異性抗体は化学的連結を用いて調製され得る。Brennanら, Science, 229: 81 (1985)には、インタクトな抗体をタンパク質分解的に切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成させる手順が記載されている。この断片をジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元し、ビシナールジチオールを安定化させて分子間ジスルフィドの形成を抑制する。次いで、生成したＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換させる。次いで、一方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体を、メルカプトエチルアミンでの還元によってＦａｂ’−チオールに再変換させ、等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合すると二重特異性抗体が形成される。作製された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化ための薬剤として使用され得る。
最近の進歩によってＦａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することが容易になってきており、これを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製が記載されている。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別々に分泌させ、指向型インビトロ化学的カップリングに供し、二重特異性抗体を形成した。
また、二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製して単離するための種々の手法も報告されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。Kostelnyら, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に遺伝子融合によって連結させた。この抗体ホモ二量体のヒンジ領域を還元してモノマーを形成し、次いで再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は抗体ホモ二量体の作製にも使用され得る。Hollingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に報告された「ダイアボディ」技術により二重特異性抗体断片を作製するための択一的機構がもたらされている。この断片は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に、同じ鎖上での両ドメイン間の対合形成を可能にするには短すぎるリンカーによって接続されて構成されている。したがって、一方の断片のＶＨおよびＶＬドメインを別の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対合形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成している。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別のストラテジーも報告されている。Gruberら, J. Immunol, 152:5368 (1994)を参照のこと。
２つより多くの結合価を有する抗体も想定される。例えば、三重特異性抗体を調製してもよい。Tuftら. J. Immunol. 147: 60(1991)。
（ｖｉｉ）単一ドメイン抗体
一部の実施態様では、目的の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む単一のポリペプチド鎖である。一部の特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照のこと）。一実施態様では、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部分からなるものである。
（ｖｉｉｉ）抗体バリアント
一部の実施態様では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾（一又は複数）が想定される。例えば、該抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合があり得る。該抗体のアミノ酸配列バリアントは、該抗体をコードしているヌクレオチド配列に適切な変更を導入することにより、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、該抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。最終の構築物を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行なわれ得るが、最終の構築物は所望の特性を有するものであるものとする。対象の抗体アミノ酸配列を作製する時点で該配列にアミノ酸の改変が導入され得る。
（Ｂ）ベクター、宿主細胞および組換え法
本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞によって産生される抗体は、組換え法を使用しても作製され得る。抗抗原抗体の組換え作製では、抗体をコードしている核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードしているＤＮＡは慣用的な手順容易に単離され、配列決定され得る（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては一般的に、限定されないが、以下のもの：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの１種類以上が挙げられる。
（ｉ）シグナル配列成分
抗体は、直接的にだけでなく、非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え作製され得、非相同ポリペプチドは好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される非相同シグナル配列は好ましくは、宿主細胞によって認識されてプロセッシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。天然抗体シグナル配列を認識してプロセッシングしない原核生物宿主細胞では、このシグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置き換える。酵母による分泌のためには、天然シグナル配列が、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー（例えば、サッカロミセス属およびクリベロミセス属のα−因子リーダー）、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、または国際公開第９０／１３６４６号に記載のシグナルで置き換えられ得る。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
（ｉｉ）複製起点
発現ベクターおよびクローニングベクターはともに、該ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列が含まれている。一般的に、クローニングベクターでは、この配列は、該ベクターが宿主の染色体ＤＮＡと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が挙げられる。かかる配列は、さまざまな細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、プラスミドの起点である２μは酵母に適しており、種々のウイルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない（ＳＶ４０起点は、典型的には初期プロモーターが含まれているという理由だけで使用されることがあり得る。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターには、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子が含められ得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠陥を補う、または（ｃ）複雑な培地から利用可能でない不可欠な栄養を供給するタンパク質をコードしているもの、例えば、バチルス属のＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子である。
選択スキームの一例では、宿主細胞の増殖を停止させる薬物が使用される。非相同遺伝子で成功裡に形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンにおいて残存する。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンの使用である。
哺乳動物細胞のための適当な選択可能マーカーの別の例は、抗体コード核酸の取込みにコンピテントな細胞の同定を可能にするもの、例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中で培養することにより同定される。このような条件下では、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性が欠損しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）が使用され得る。
あるいはまた、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体を、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）を含む培養培地中で培養することにより同定される。このような条件下では、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上記のＤＨＦＲ選択／増幅系と併用して使用され得る。
あるいはまた、目的の抗体をコードしているＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子、および別の選択可能マーカー、例えば、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換または共形質転換された宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能マーカーである選択薬剤、例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８を含む培地中での細胞培養によって選択され得る。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
酵母における使用のための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcombら, Nature, 282:39 (1979)）。tｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能が欠損している変異型株の酵母、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１の選択マーカーとなる。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１病変の存在により、トリプトファンの非存在下での培養による形質転換の検出のための有効な環境がもたらされる。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって想定される。
また、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されたベクターは、クリベロミセス属酵母の形質転換に使用され得る。あるいはまた、組換えウシキモシンの大規模生産のための発現系がK. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)に報告された。また、工業株のクリベロミセス属による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー数発現ベクターも開示されている。Fleerら, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターには、一般的に、宿主生物体によって認識され、抗体コード核酸に作動可能に連結されたプロモーターが含められる。原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、抗体コードＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列も含む。
真核生物のプロモーター配列も知られている。事実上すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に存在するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部から７０から８０塩基上流にみられる別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これは、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加シグナルとなり得る。このような配列はすべて真核生物発現ベクター内に好適に挿入される。
酵母宿主での使用のための適当なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。
培養条件によって転写が制御されるというさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素の代謝と関連している分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用のための好適なベクターおよびプロモーターは欧州特許第７３６５７号にさらに記載されている。また、酵母エンハンサーも酵母プロモーターとともに好都合に使用される。
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシポリオーマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるプロモーター、または非相同哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、かかるプロモーターは宿主細胞系と適合性であるものとする。
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ウシポリオーマウイルスをベクターとして使用し、哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるための系は米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の改良は米国特許第４６０１９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関するReyesら, Nature 297:598-601 (1982)も参照のこと。あるいはまた、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列がプロモーターとして使用され得る。
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
本発明の抗体をコードしているＤＮＡの高等真核生物による転写はしばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大される。現在、哺乳動物遺伝子多くのエンハンサー配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン）。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関するYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、ベクター内に抗体コード配列の５’側の位置にスプライシングしても３’側の位置にスプライシングしてもよいが、好ましくはプロモーターの５’側の部位に存在させる。
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体の有核細胞）において使用される発現ベクターにはまた、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列が含められる。かかる配列は一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’およびたまに３’非翻訳領域から入手可能である。このような領域は、抗体コードｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結成分の一例はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号および本明細書に開示した発現ベクターを参照のこと。
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクターでのＤＮＡのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物としては、ユーバクテリウム属、例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、Salmonella typhimurium、セラシア属、例えば、Serratia marcescans、および赤痢菌、ならびにバチルス属、例えば、B．subtilisおよびB．licheniformis（例えば、ＤＤ２６６，７１０（１９８９年４月１２日公開）に開示されたB．licheniformis 41P）、シュードモナス属、例えば、P．aeruginosaおよびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましいクローニング用大腸菌宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の菌株も好適である。これらの例は限定的ではなく例示的である。
完全長抗体、抗体融合タンパク質および抗体断片は、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合、例えば、単独で腫瘍細胞の破壊に有効性を示す治療用抗体を細胞傷害剤（例えば、毒素）にコンジュゲートさせる場合、細菌において作製され得る。完全長抗体の方が循環半減期が大きい。大腸菌における作製の方が速くてコスト効率が高い。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号（Ｃａｒｔｅｒら）、米国特許第５７８９１９９号（Ｊｏｌｙら）、米国特許第５８４０５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓら）を参照のこと。これらには、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列が記載されている。また、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo編, Humana Press, Totowa, N.J., 2003)，pp．245-254（大腸菌における抗体断片の発現について記載）も参照のこと。発現後、抗体は、可溶性画分の大腸菌細胞ペーストから単離され得、例えば、アイソタイプに応じてタンパク質ＡまたはＧカラムによって精製され得る。最終精製は、例えばＣＨＯ細胞において発現させた抗体の精製方法と同様にして行なわれ得る。
原核生物に加え、真核生物微生物、例えば糸状真菌または酵母は、抗体コードベクターのための適当なクローニングまたは発現用の宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中でも最も一般的に使用されている。しかしながら、いくつかの他の属、種および系統も一般的に利用可能であり、本明細書において有用である（例えば、Schizosaccharomyces pombe；クリベロミセス属宿主、例えば、K．lactis、K．fragilis（ＡＴＣＣ１２，４２４）、K．bulgaricus（ＡＴＣＣ１６，０４５）、K．wickeramii（ＡＴＣＣ２４，１７８）、K．waltii（ＡＴＣＣ５６，５００）、K．drosophilarum（ＡＴＣＣ３６，９０６）、K．thermotoleransおよびK．marxianusなど；ヤロウィア（欧州特許第４０２２２６号）；Pichia pastoris（欧州特許第１８３０７０号）；カンジダ属；Trichoderma reesia（欧州特許第２４４２３４号）；Neurospora crassa；シワニオマイミセス属、例えば、Schwanniomyces occidentalis；ならびに糸状真菌；例えば、ニューロスポラ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属、ならびにアスペルギルス属宿主、例えば、A．nidulansおよびA．nigerなど。酵母および糸状真菌の使用を論考している概説について；治療用タンパク質の作製については、例えば、Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)を参照のこと。
グリコシル化経路が「ヒト化」され、一部または完全ヒトグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす一部の特定の真菌株および酵母株が選択され得る。例えば、Liら, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)（Pichia pastorisにおけるグリコシル化経路のヒト化について記載）；およびGerngrossら, 上掲を参照のこと。
また、グリコシル化抗体の発現のために好適な宿主細胞は多細胞生物体（無脊椎動物および脊椎動物）に由来するものである。無脊椎動物細胞の例としては植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株およびバリアントならびにSpodoptera frugiperda（イモムシ）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ミバエ）およびBombyx moriなどの宿主に由来する対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのためのさまざまなウイルス株、例えば、Autographa californica ＮＰＶのＬ−１バリアントおよびBombyx mori ＮＰＶのＢｍ−５株が公衆に利用可能であり、かかるウイルスは、本明細書における本発明によるウイルスとして、特に、Spodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために使用され得る。
また、綿花、トウモロコシ、イモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、ウキクサ（Leninaceae）、アルファルファ（M．truncatula）およびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、および同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を作製するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載）を参照のこと。
脊椎動物細胞は宿主として使用され得、脊椎動物培養細胞（組織培養物）の増殖は常套手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（浮遊培養での培養のためにサブクローニングした２９３または２９３細胞，Grahamら, J. Gen Virol. 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら, Annals N.Y.Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝臓癌系統（Ｈｅｐ Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；ならびにミエローマ細胞株、例えばＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。抗体作製に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、YazakiおよびWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo編, Humana Press, Totowa, N.J., 2003）, pp. 255-268を参照のこと。
宿主細胞は、抗体作製のための上記の発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、適宜、プロモーターの導入、形質転換体の選択または所望の配列をコードしている遺伝子の増幅のために改良される本明細書において提供する細胞培養培地中で培養される。
細胞培養およびポリペプチド産生
一般的に細胞は、本明細書に記載の任意の細胞培養培地と、細胞の増殖、維持および／またはポリペプチド産生のいずれかを促進させる１つ以上の条件下で合わせる（接触させる）。細胞培養方法およびポリペプチド作製方法では、細胞および細胞培養培地が収容された培養槽（バイオリアクター）が使用される。培養槽は、細胞の培養に適した任意の材質、例えばガラス、プラスチックまたは金属で構成されたものであり得る。典型的には、培養槽は少なくとも１リットル容であり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００リットル容またはそれ以上であり得る。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択した宿主細胞で先に使用したものであり、当業者に自明であろう。培養プロセス中に調整され得る培養条件としては、限定されないがｐＨおよび温度が挙げられる。
細胞培養物は一般的に、細胞培養物の生存、増殖および生存度（維持）が助長される条件下で初期増殖期に維持される。厳密な条件は、細胞型、細胞を得た生物体ならびに発現させるポリペプチドの性質および特性に応じてさまざまである。
初期増殖期の細胞培養物の温度は主に、細胞培養物が生存可能のままである温度範囲に基づいて選択される。例えば、初期増殖期の間、ＣＨＯ細胞は３７℃で良好に増殖する。一般に、ほとんどの哺乳動物細胞は約２５℃から４２℃の範囲内で良好に増殖する。好ましくは、哺乳動物細胞は約３５℃から４０℃の範囲内で良好に増殖する。当業者は、細胞のニーズおよび産生要件に応じて、細胞を増殖させるのに適切な温度（一又は複数）を選択することができよう。
本発明の一実施態様では、初期増殖期の温度は単一の一定温度に維持される。別の実施態様では、初期増殖期の温度は、ある温度範囲内に維持される。例えば、温度は初期増殖期の間、一様に上昇または下降され得る。あるいはまた、温度は初期増殖期の間、種々の時点で相違する量で上昇または下降され得る。当業者は、単一の温度を使用すべきか多数の温度を使用すべきか、および温度は一様に調整すべきか相違する量で調整すべきかを決定することができよう。
細胞は初期増殖期の間、大量時間で培養してもよく、少量時間で培養してもよい。多様な形態の一例では、細胞は、静かに培養した場合に該細胞が最終的に達するであろう最大生存可能細胞密度の所与のパーセンテージである生存可能細胞密度が得られるのに充分な時間培養される。例えば、細胞は、最大生存可能細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの所望の生存可能細胞密度が得られるのに充分な時間培養され得る。
別の実施態様では、細胞は、規定された時間培養される。例えば、細胞培養物の開始濃度、細胞が培養される温度、および細胞の固有の増殖速度にもよるが、細胞は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれ以上の日数培養され得る。一部の場合では、細胞は１ヶ月以上培養され得る。
細胞培養物は初期培養期の間、細胞への酸素供給および栄養の分散を増大させるためにアジテーションまたは振盪され得る。本発明に従い、当業者には、初期増殖期の間、バイオリアクターの特定の内部条件、例えば限定されないがｐＨ、温度、酸素供給などを制御または調節することが有益であり得ることが理解されよう。例えば、ｐＨは、適切な量の酸または塩基を供給することにより制御され得、酸素供給は、当該技術分野でよく知られたスパージングデバイスで制御され得る。
初期培養工程は増殖期であり、このとき、バッチ細胞培養条件は組換え細胞の増殖が向上し、種菌株（ｔｒａｉｎ）が得られるように修正される。増殖期は一般的に、細胞が一般的に急速に***する、例えば増殖する対数増殖期間をいう。この期の間に、細胞を通常、限定されないが１日から４日の期間、例えば１、２、３または４日間、細胞増殖が最適となるような条件下で培養する。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、当業者に知られた方法によって具体的な宿主細胞に対して行なわれ得る。
増殖期では、本明細書において提供する培養基本培地と細胞がバッチ式の培養槽に供給され得る。培養培地は、一態様では含まれる血清および他の動物由来タンパク質が約５％未満または１％未満または０．１％未満である。しかしながら、所望される場合は血清および動物由来タンパク質が使用され得る。増殖中の特定の時点で、細胞は、産生期の培養開始時に培養培地に播種するための播種材料を構成し得る。あるいはまた、産生期が増殖期と連続的であってもよい。細胞の増殖期の後には一般的にポリペプチド産生期が続く。
ポリペプチド産生期の間、細胞培養物は、細胞培養物の生存および生存度が助長され、所望のポリペプチドの発現に適切な第２の一組の培養条件（増殖期と対比して）下に維持され得る。例えば、後続の産生期の間、ＣＨＯ細胞が組換えポリペプチドおよびタンパク質を２５℃から３８℃の範囲で良好に発現する。細胞密度もしくは生存度を増大させるため、または組換えポリペプチドもしくはタンパク質の発現を増大させるために多数の相違する温度シフトを使用してもよい。一態様において、本明細書において提供する培地により、ポリペプチド産生を増大させる方法において使用した場合、異なる培地でポリペプチドを産生させた場合に得られる夾雑物と比べて代謝による副生成物の存在が低減される。多様な形態の一例では、夾雑物が活性酸素種である。一態様では、本明細書において提供する培地により、ポリペプチドの産生を増大させる方法において使用した場合、異なる培地でポリペプチド産物を産生させた場合に得られる着色強度と比べてポリペプチド産物の着色強度が低減される。多様な形態の一例では、ポリペプチド産生を増大させる方法はポリペプチド産生期の間に温度シフト工程を含む。多様な形態のさらなる一例では、温度シフト工程は３１℃から３８℃まで、３２℃から３８℃まで、３３℃から３８℃まで、３４℃から３８℃まで、３５℃から３８℃まで、３６℃から３８℃まで、３１℃から３２℃まで、３１℃から３３℃まで、３１℃から３４℃まで、３１℃から３５℃まで、または３１℃から３６℃までの温度シフトを含む。
細胞は後続の産生期に、所望の細胞密度または産生力価に達するまで維持され得る。一実施態様では、細胞は後続の産生期に、組換えポリペプチドに対する力価が最大に達するまで維持される。他の実施態様では、この時点の前に培養物が収集され得る。例えば、細胞は、最大生存可能細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの生存可能細胞密度が得られるのに充分な時間維持され得る。一部の場合では、生存可能細胞密度を最大に到達させ、次いで、培養物を収集する前に生存可能細胞密度をあるレベルまで低下させることが望ましい場合があり得る。
一部の特定の場合では、細胞培養物に後続の産生期の間、該細胞によって枯渇または代謝された栄養または他の培地成分を補給することが有益または必要であり得る。例えば、細胞培養物に、細胞培養物のモニタリング中に枯渇したことが観察された栄養または他の培地成分を補給することが好都合であり得る。択一的または付加的に、細胞培養物に、後続の産生期の前に補給することが有益または必要であり得る。非限定的な例として、細胞培養物にホルモンおよび／または他の成長因子、特定のイオン（例えば、ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸）、バッファー、ビタミン類、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド、微量元素（通常、非常に低最終濃度で存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質またはグルコースもしくは他のエネルギー源を補給することが有益または必要であり得る。
本明細書において提供する成分（例えば、ヒポタウリン その類似体または前駆体）は細胞培養培地に、細胞培養サイクル中の任意の時点で添加され得る。例えば、ヒポタウリンは、１４日間の細胞培養サイクルの０から１４日目の任意の１日以上（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日目の任意の１日以上）において、ヒポタウリンを本明細書において提供する濃度（例えば、少なくとも０．０００１ｍＭ）で含む細胞培養培地が得られる任意の量で添加され得る。したがって、１４日間の細胞培養サイクルの間、ヒポタウリンは０から１４日目の任意の１日以上（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４日目の任意の１日以上）において任意の量で添加され得ることは認識されよう。本明細書で用いる場合、「０日目」は、本明細書において提供する成分（例えば、ヒポタウリン）を補給したが細胞培養物に適用する前の細胞培養培地を示し得る。細胞培養サイクルは、細胞が生存可能である限り、および／または充分なレベルのポリペプチドが産生される限り任意の日数であり得る（当業者は決定することができよう）ことを理解されたい。例えば、細胞培養サイクルは少なくとも３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間または２０日間の持続期間であり得る。一部の実施態様では、本明細書において提供する成分（例えば、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体）を細胞培養培地に細胞培養サイクルの少なくとも当日に添加する。
ポリペプチドの精製
目的のポリペプチドは、好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナルなしで直接発現させた場合は宿主細胞溶解物から回収してもよい。一態様において、産生されたポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体である。
培養培地または溶解物は、粒状細胞残屑を除去するために遠心分離され得る。その後、ポリペプチドが、夾雑している可溶性のタンパク質およびポリペプチドから精製され得、以下の手順が適当な精製手順の例示である：イムノアフィニティカラムまたはイオン交換カラムでの分別；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカまたはカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥなど）でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲル濾過；およびＩｇＧなどの夾雑物を除去するためのタンパク質Ａセファロースカラムによるもの。また、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤も、精製中のタンパク質分解による分解を抑止するのに有用であり得る。当業者には、目的のポリペプチドに適した精製方法に、組換え細胞培養物中で発現されたときのポリペプチドの性質の変化を考慮した修正が必要な場合があり得ることが認識されよう。ポリペプチドは一般的に、クロマトグラフィーによる手法（例えば、タンパク質Ａ、低ｐＨ溶出工程を伴うアフィニティークロマトグラフィーおよび工程不純物を除去するためのイオン交換クロマトグラフィー）を用いて精製され得る。抗体の場合、親和性リガンドとしてのタンパク質Ａの好適性は、該抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメイン（あれば）の種およびアイソタイプに依存する。タンパク質Ａは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づいた抗体を精製するために使用され得る（Lindmarkら, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)）。タンパク質Ｇはすべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Gussら, EMBO J. 5:15671575 (1986)）。精製したタンパク質を濃縮し、本明細書に記載の濃縮タンパク質薬物製剤品、例えば、少なくとも１ｍｇ／ｍＬもしくは１０ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬもしくは１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有するもの、または約１ｍｇ／ｍＬもしくは１０ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬもしくは１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬの濃度を有するものが得られ得る。濃縮ポリペプチド生成物は、濃縮条件下で許容可能なレベルまで、例えば、ポリペプチドが溶液中でもはや可溶性でない濃度まで濃縮され得ることを理解されたい。例えば、ポリペプチド精製プロセスは、細胞培養液をポリペプチド産生細胞から収集する工程、およびポリペプチドをタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製する工程（アニオン交換クロマトグラフィーおよびカチオン交換クロマトグラフィーによるさらなる精製を伴う）、ウイルス除去のための濾過工程ならびにポリペプチドの最終製剤化および濃縮のための最終の限外濾過およびダイアフィルトレーション工程を含むものであり得る。ポリペプチドの作製方法および薬物製剤のためのポリペプチドの精製方法の非限定的な例は、Kelley, B. MAbs., 2009, 1(5):443-452（これは、出典明示によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。
ポリペプチドの着色の評価
本明細書に詳述している方法によって作製され、提供する組成物中に存在するポリペプチドは、タンパク質精製プロセスのいずれかの工程で着色について評価され得る。着色の評価方法は、細胞培養液を本明細書に詳述している培地中で培養された細胞から収集すること、ポリペプチドを細胞培養液から精製し、ポリペプチド含有組成物（例えば、溶液）を得ること、およびポリペプチド含有溶液を着色について評価することを伴うものであり得る。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーでの精製後の着色について評価される。多様な形態のさらなる一例では、ポリペプチド含有組成物は、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態の別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、高速液体クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態のまた別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態のさらに別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、濾過、例えば、精密濾過または限外濾過による精製後の着色について評価される。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、着色について評価する前に濃縮される（例えば、該組成物は少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド、例えば抗体を含むものであり得る）。ポリペプチド含有組成物は、遠心分離、フィルターデバイス、半透膜、透析、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーによって濃縮され得る。多様な形態の一例では、該ポリペプチドは凍結乾燥によって濃縮され、着色の評価の前に再縣濁され得る。ポリペプチド含有組成物は、本明細書に詳述している手法の１つ以上での精製後の着色について評価され得る。ポリペプチド含有組成物が１回以上の凍結解凍サイクルを受けた後の該組成物の着色の評価が本明細書において想定される。ポリペプチドの精製または濃縮前の該ポリペプチドを含む細胞培養液の着色の評価方法が本明細書においてさらに想定される。
本明細書に詳述している方法によって本明細書に記載の培地を用いて作製される（または提供する組成物中に存在する）ポリペプチドは着色について、１つ以上の視感色標準の使用によって評価され得る。ポリペプチド含有組成物の着色の評価方法としては、国際または国内色標準、例えば限定されないが、米薬局方の色標準およびヨーロッパ薬局方の色標準の使用が挙げられる。USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927およびCouncil of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 第7版 P.22（これらは出典明示によりその全体が本明細書に援用される）を参照のこと。例えば、Ｃｏｌｏｒ，Ｏｐａｌｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ（ＣＯＣ）アッセイが、該ポリペプチドを含む溶液の着色を評価するために使用され得る。多様な形態の一例では、１２ｍｍ外径の無色透明のニュートラルガラス製の同一のチューブが、該ポリペプチドを含む２．０ｍＬの組成物を２．０ｍＬの水または溶媒またはモノグラフで規定された参照溶液と比較するために使用される。着色は、拡散昼光において比較され、測色、測定または評価のための白色背景に対して水平に観察される。多様な形態の別の一例では、平台および１５ｍｍから２５ｍｍの内径を有する無色透明のニュートラルガラス製の同一のチューブが、ポリペプチド含有組成物を水または溶媒またはモノグラフで規定された参照溶液と比較するために使用される（層の深さは４０ｍｍである）。着色は拡散昼光において比較され、測色、測定または評価のための白色背景に対して垂直に観察される。多様な形態の一例では、測色、測定または評価は人間の目視検査によって行なわれる。多様な形態の別の一例では、測色、測定または評価は自動化プロセスを使用することによって行なわれ得る。例えば、チューブは、該チューブをイメージングする機械に負荷され得、画像は、着色を測色、測定または評価するためのアルゴリズムで処理される。ＣＯＣアッセイの参照標準は、限定されないが、茶色（Ｂ）、茶色っぽい黄色（ＢＹ）、黄色（Ｙ）、緑色っぽい黄色（ＧＹ）または赤色（Ｒ）のうちのいずれか１つであり得ることを理解されたい。茶色参照標準と比較されるポリペプチド含有組成物にはＢ１（最も暗い）、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９（最も明るい）の茶色の参照標準値が付与され得る。茶色っぽい黄色参照標準と比較されるポリペプチド含有組成物にはＢＹ１（最も暗い）、ＢＹ２、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６またはＢＹ７（最も明るい）の茶色っぽい黄色の参照標準値が付与され得る。黄色参照標準と比較されるポリペプチド含有組成物にはＹ１（最も暗い）、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６またはＹ７（最も明るい）の黄色の参照標準値が付与され得る。緑色っぽい黄色参照標準と比較されるポリペプチド含有組成物にはＧＹ１（最も暗い）、ＧＹ２、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６またはＧＹ７（最も明るい）の緑色っぽい黄色の参照標準値が付与され得る。赤色参照標準と比較されるポリペプチド含有組成物にはＲ１（最も暗い）、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７（最も明るい）の赤色参照標準値が付与され得る。一態様において、許容され得る着色は、本明細書において提供するスケールで最も暗いと測定されるもの以外（例えば、赤色参照標準値の場合ではＲ１以外）任意の色である。多様な形態の一例では、本明細書に詳述している培地中で培養された細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物の色は表３に記載の参照標準値を有するものである。本明細書に記載の場合、一態様では、本明細書における方法および組成物において使用され得る培地は、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、Ｂ９、ＢＹ３、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、ＢＹ７、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、ＧＹ３、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７からなる群より選択される参照標準色値を有するポリペプチド組成物（これは、多様な形態の一例では、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬまたは１２５ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを含む組成物である）をもたらすものであることを理解されたい。一態様において、本明細書における方法および組成物において使用され得る培地は、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８、ＢＹ４、ＢＹ５、ＢＹ６、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、ＧＹ４、ＧＹ５、ＧＹ６、ＧＹ７、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のいずれか１つよりも大きい参照標準色値を有するポリペプチド組成物（これは、多様な形態の一例では、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬまたは１２５ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを含む組成物である）をもたらすものである。当業者には理解され得ようが、参照標準色値の説明は、本明細書に詳述している任意の培地、方法または組成物に適用可能であり、その説明はさらに修正されることがあり得る。
一部の実施態様では、着色強度はＴｏｔａｌ Ｃｏｌｏｒアッセイを用いて測定される。例えば、Vijayasankaranら, Biotechol. Prog. 29:1270-1277, 2013（これは、出典明示により本明細書に援用される）を参照のこと。Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｏｒアッセイでは、試料の相対な色の定量的値を色測定のＣＩＥ Ｓｙｓｔｅｍを使用することによって得る（Bernsら, Billmeyer and Saltzman’s Principles of Color Technology, 第3版 New York, NY, John Wiley & Sons, Inc., (2000)に記載）。簡単には、水でのブランク測定後、そのままの試験試料吸収スペクトルを可視領域（３８０−７８０ｎｍ）において、ＨＰ８４５３Ａ分光測光器（１ｃｍ光路長キュベット）を用いて測定する。次いで、吸収スペクトルをStandard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 06.01, (2011)に既報のＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊カラースケールに変換させる。Ｌ＊ａ＊ｂ＊は、視覚的にほぼ一様な間隔の３次元の色空間である。Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間により、視覚的判断で色の違いを定量することができる。例えば、非常に異なる色を有すると視覚的に判断される２つの溶液は、Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間内で互いに近い同様の色を有する２つの溶液と比べた場合、Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間内でさらに離れる。３次元Ｌ＊ａ＊ｂ＊空間内では、点間距離を点間ユークリッド（ΔＥ）として計算する。これにより、Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間内の点間ΔＥを測定し、この距離を色の違いの視覚的判断と相関させることが可能になり、大きなΔＥは２つの溶液が非常に異なる色であることを表し、小さなΔＥは２つの溶液が同様の色であることを表す。吸収スペクトルをＬ＊ａ＊ｂ＊色空間に変換するには、規定の光源が必要とされる。例えば、可視領域の人工平坦スペクトルが光源として使用され得る。一部の実施態様では、「Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｏｒ」が３次元ＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間における試験試料と水のユークリッド距離に対応するΔＥを表し得る。また、「Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｏｒ」は、色相の違いの識別なしの試験モノクローナル抗体試料の全体的な色を表す場合があり得る。全色測定は、参照標準について測定された値に対して正規化され得る。例えば、続いて、着色強度値が、≦Ｂ５の示度のＣＯＣを含む参照モノクローナル抗体試料に対する試験モノクローナル抗体試料の「Ｔｏｔａｌ Ｃｏｌｏｒ」測定値の比を計算することにより求められる。
また、着色強度は、ＮＩＦＴＹ（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／茶色タンパク質）アッセイを用いて測定することもできる。このアッセイでは、抗体分子の蛍光が色の代わりとして使用される。これは、タンパク質Ａプールにおいて着色強度と蛍光強度が良好に相関していることが示されているためである（Ｒ２＝０．８４）。Vijayasankaranら, Biotechnol Prog 27:1270-1277 (2013)を参照のこと。ＮＩＦＴＹの数値が大きいほど着色強度が高いことを示し、ＮＩＦＴＹの数値が小さいほど着色強度が低いことを示す。約５０から１２５μｇのモノクローナル抗体試料をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、Ｇ３０００ＳＷＸＬ カラム（ＴＯＳＯＨ）を用いて０．５ｍＬ／分の定組成流速で解析する。ＳＥＣの移動相は０．２Ｍリン酸カリウム、０．２５Ｍ塩化カリウム、ｐＨ６．２である。カラム温度は１５℃に制御する。例えば、ＳＥＣ溶離液は、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収について、ならびに３５０ｎｍの励起波長および４２５ｎｍの発光波長で蛍光についてモニタリングされ得る。これらの波長は強い相関性ならびにこれらの波長で観察される最大蛍光応答に基づいて選択される。モノクローナル抗体種のＳＥＣピークは、ＵＶ吸光度および蛍光放射クロマトグラムに関してＡｇｉｌｅｎｔ Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて積分される。各モノクローナル抗体試料について、主要ピークの蛍光ピーク面積を主要ピークのＵＶ吸光度ピーク面積で除算することにより正規化蛍光を求め、これにより、抗体質量の寄与による蛍光応答が補正される。続いて、参照モノクローナル抗体試料（例えば、≦Ｂ５の示度のＣＯＣを含む試料）に対する試験モノクローナル抗体試料の正規化蛍光の比を計算することにより着色強度値を求める。ＮＩＦＴＹの試料要件は少ないため、培養容量が限定的である場合、これは色の代用物として有用である。
ＮＩＦＴＹ値は以下に示すようにして計算され得る。Ｆ＝蛍光クロマトグラムにおけるピーク面積；Ｕ＝ＵＶ吸収クロマトグラムにおけるピーク面積；ｉ＝変数；Ｓ＝試料；Ｒ＝参照。
Figure 0006843911
Figure 0006843911
別の例では、本明細書に記載の培地を用いて本明細書に詳述している方法によって作製される（または提供する組成物中に存在する）ポリペプチドは、定量アッセイにより着色について評価され得る。一部の実施態様では、定量アッセイは自動化プロセスを用いて行なわれ得る。一部の実施態様では、定量アッセイで得られる値が高いほど（例えば、数値が大きいほど）着色強度が強いことを示し、値が低いほど（例えば、数値が小さい）着色強度が低いことを示す。
本明細書に詳述している色アッセイは、任意の溶液（例えば、ポリペプチド含有溶液）、例えば限定されないが、本明細書において提供するポリペプチド組成物の色の評価において有用性がみられ得る。
ＩＶ．組成物および薬学的製剤
また、細胞培養培地および１種類以上の他の成分、例えば細胞または所望のポリペプチド（例えば、抗体）を含む組成物も提供する。目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードしている核酸を含む細胞は、該ポリペプチドを本発明の細胞培養培地中に細胞培養中に分泌し得る。したがって、本発明の組成物は、該ポリペプチドを産生する細胞および該ポリペプチドが分泌される本明細書において提供する細胞培養培地を含むものであり得る。また、産生されたポリペプチドおよび本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物も想定される。本発明の一部の態様において、組成物は（ａ）ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞；および（ｂ）本明細書において提供する細胞培養培地を含むものである。一部の態様では、組成物は（ａ）ポリペプチド；および（ｂ）本明細書において提供される細胞培養培地を含むものであり、該ポリペプチドが該培地中に、該ポリペプチドをコードしている単離核酸を含む細胞によって分泌される。他の態様では、組成物は：（ａ）ポリペプチド；および（ｂ）本明細書において提供される細胞培養培地を含むものであり、該ポリペプチドは培地中に、該ポリペプチドをコードしている単離核酸を含む細胞の溶解によって放出される。組成物中の細胞は、本明細書に詳述している任意の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）であり得、組成物中の培地は、本明細書に詳述している任意の培地、例えば、表１もしくは表２に詳述している１種類以上の化合物を含む培地であり得る。同様に、組成物中のポリペプチドは、本明細書に詳述している任意のポリペプチド、例えば抗体であり得る。一部の態様において、組成物は色を有するものであってもよい。一部の実施態様では、色は、１つ以上の視感色標準の使用によって測定（「ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ」、「ｍｅａｓｕｒｅ」）または評価される。視感色標準は国際または国内色標準、例えば限定されないが、米薬局方の色標準およびヨーロッパ薬局方の色標準であり得る。USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927およびCouncil of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 第7版P.22を参照のこと。したがって、一部の実施態様では、（ａ）ポリペプチド；および（ｂ）本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物は着色強度について評価される。さらなる一実施態様では、ポリペプチドは、着色強度の評価の前に単離および／または精製される。一部の実施態様では、（ａ）ポリペプチド；および（ｂ）本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物着色強度は、最終のタンパク質組成物の着色強度を予測するために使用される。例えば、ポリペプチドおよび本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物は着色強度について、本明細書に記載のＣＯＣアッセイを用いて測定される。着色強度値がＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い場合、最終のタンパク質組成物がＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い着色強度値を有する尤度が高い。一部の実施態様では、ポリペプチドおよび細胞培養培地を含む組成物は、着色強度の測定前に少なくとも１回の精製工程に供される。一部の実施態様では、最終のタンパク質組成物は薬学的製剤である。一部の態様において、本明細書において提供する組成物はポリペプチドを少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬもしくは２５ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で、または約１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬもしくは２５ｍｇ／ｍＬもしくは５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で含むものである。一部の態様において、本明細書において提供する組成物はポリペプチドを少なくとも１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、または約１００ｍｇ／ｍＬもしくは１２５ｍｇ／ｍＬもしくは１５０ｍｇ／ｍＬもしくは１７５ｍｇ／ｍＬもしくは２００ｍｇ／ｍＬの濃度で含むものである。
本明細書に記載の方法のいずれかによって作製されるポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）の組成物（例えば、薬学的製剤）は、所望の度合いの純度を有するポリペプチドを、１種類以上の任意選択の薬学的に許容され得る担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編 (1980)）と、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態に混合することによりにより調製される。薬学的に許容され得る担体は一般的に、レシピエントに対して使用される投薬量および濃度で無毒性であり、限定されないが：バッファー、抗酸化剤、保存料、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質；親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類、二糖類および他の糖質、キレート剤、糖類、塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）および／または非イオン界面活性剤が挙げられる。例示的な凍結乾燥ポリペプチド製剤は米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性ポリペプチド製剤としては米国特許第６１７１５８６号および国際公開第２００６／０４４９０８号に記載のものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸バッファーを含むものである。一部の実施態様では、薬学的製剤はヒトなどの哺乳動物に投与される。ポリペプチド（例えば、抗体）薬学的製剤は任意の適当な手段によって、例えば、非経口、肺内および鼻腔内ならびに、所望される場合は局所治療のために病変内投与で投与され得る。非経口輸注としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。投与は任意の適当な経路によるもの、例えば、一部において投与が短期間か長期間かにもよるが、静脈内または皮下注射などの注射によるものであり得る。したがって、本明細書において提供するポリペプチド含有製剤は注射に、例えば個体への皮下注射（例えば、ヒトへの皮下注射）に適したものであり得る。インビボ投与に使用される薬学的製剤は一般的に滅菌されている。滅菌は、例えば、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に行なわれ得る。
一部の態様において、本明細書において提供する組成物（例えば、薬学的製剤）はポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）を少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬもしくは７５ｍｇ／ｍＬの濃度で、または約１ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬもしくは約７５ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬまでの濃度で含むものである。他の態様では、本明細書において提供する組成物（例えば、薬学的製剤）はポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）を少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬもしくは２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、または約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２５ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１７５ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬもしくは約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含むものである。一部の実施態様では、本明細書において提供する薬学的製剤はポリペプチドを少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬより高い濃度で含み、ＣＯＣアッセイによって測定したときＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い着色強度値を有するものである。一部の実施態様では、本明細書において提供する薬学的製剤はポリペプチドを少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬより高い濃度で含み、ＣＯＣアッセイによって測定したときＢ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ８またはＢ９より高い着色強度値を有するものである。一部の態様では、ＣＯＣアッセイによって測定される着色強度値は、限定されないが、Ｂ、ＢＹ、Ｙ、ＧＹまたはＲのうちのいずれか１つであり得、ここで、値が大きいほど着色強度が小さいことを示す。一部の態様において、本明細書において提供する薬学的製剤はポリペプチドを少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬより高い濃度で含み、色アッセイによって測定したとき、参照溶液の着色強度値より低い着色強度値を有するものである。一部の態様において、本明細書において提供する薬学的製剤はポリペプチドを少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬより高い濃度で含み、色アッセイによって測定したとき、参照溶液の着色強度値より低い着色強度値を有するものである。例えば、ポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）を含む組成物（例えば、薬学的製剤）の着色強度は、表１または表２の成分のうちの１種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生されたポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも０．１％または約５％から約５０％低減され得る。
V．製造物品またはキット
細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットを説明する。キットは、再構成される乾燥構成成分を含むものであってもよく、また、使用のための（例えば、培地へのキット構成成分の補給における使用のための）使用説明書を含めてもよい。キットは、細胞培養培地に本明細書において提供する構成成分が補給されるのに適した量で含むものであり得る。一部の態様において、キットは、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸およびケルシトリン水和物からなる群より選択される１種類以上の構成成分を、細胞培養培地に表１または表２に示した構成成分濃度が補給される量で含むものである。一部の実施態様では、キットは：（ａ）該細胞培養培地中に約２．０ｍＭから約５０．０ｍＭのヒポタウリンがもたらされる量のヒポタウリン；（ｂ）該細胞培養培地中に約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭのｓ−カルボキシメチルシステインがもたらされる量のｓ−カルボキシメチルシステイン；（ｃ）該細胞培養培地中に約８．０ｍＭから約１２．０ｍＭのカルノシンがもたらされる量のカルノシン；（ｄ）該細胞培養培地中に約３．０ｍＭから約５．０ｍＭのアンセリンがもたらされる量のアンセリン；（ｅ）約０．０２５ｍＭから約０．０４０ｍＭのブチル化ヒドロキシアニソールがもたらされる量のブチル化ヒドロキシアニソール；（ｆ）該細胞培養培地中に約０．０４０ｍＭから約０．０６０ｍＭのリポ酸がもたらされる量のリポ酸；（ｇ）該細胞培養培地中に約０．０１０ｍＭから約０．０２０ｍＭのケルシトリン水和物がもたらされる量のケルシトリン水和物；および（ｈ）該細胞培養培地中に約０．０００３ｍＭから約１０ｍＭのアミノグアニジンがもたらされる量のアミノグアニジンのうちの１種類以上を含むものである。一部の態様において、キットは１種類以上の構成成分を含むものであり、該１種類以上の構成成分はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体である。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。一部の実施態様では、細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットが少なくとも約０．０００１ｍＭの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を備えており、該ヒポタウリンまたは類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、ｓ−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。
本発明の別の態様では、容器を備えた製造物品を提供し、該容器には本発明の細胞培養培地が収容され、その使用のための使用説明書が備えられていてもよい。好適な容器としては、例えば、ボトルおよびバッグが挙げられる。容器はさまざまな材質で、例えばガラスまたはプラスチックで形成されたものであり得る。容器には細胞培養培地が収容され、上面または付属のラベルにより、容器に使用のための（例えば、細胞の培養における使用のための）指示が表示され得る。製造物品に、さらに、商業的見地およびユーザーの見地から望ましい他の物質、例えば他のバッファー、希釈剤および添付文書を使用のための使用説明書とともに含めてもよい。
以下の実施例は本発明の実例を例示するために示しており、本発明を限定するために示しているのではない。
培地は、特にタンパク質生成物が濃縮液（例えば、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの濃度まで）として存在する場合、許容され得る品質属性、例えば着色強度の低減を有するタンパク質生成物（例えば、タンパク質薬物製剤品）が得られるものと同定されたものである。本明細書におい提供する培地中での細胞の培養方法を説明し、該培地を用いてポリペプチドを作製する方法も説明する。培地は、一態様ではヒポタウリンを含むものであり得る。本明細書において提供する一部の態様では、培地は、１種類以上のヒポタウリン類似体またはその前駆体、例えばカルボキシメチルシステインを含むものである。各培地構成成分は、本明細書全体に示された任意の値で存在させ得る。培地は既知組成であっても未知組成であってもよい。本培地により、ポリペプチド作製方法に使用した場合、異なる培地で作製されたポリペプチドと比べて活性酸素種の存在が低減され得る。本培地は、細胞培養およびポリペプチド産生のすべての段階で有用性がみられ、基本培地および／または流加培地に使用され得る。本明細書に記載の方法のいずれかによって作製されるポリペプチドを提供し、本明細書に詳述しているようにして作製されるポリペプチドを含む薬学的組成物も提供する。一態様において、薬学的組成物はポリペプチドを少なくともまたは約１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍＬのいずれかの濃度で含むものである。抗体の作製方法および抗体を含む組成物が特に想定される。また、細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットも説明する。
実施例１：抗体組成物の着色を低減し得る抗酸化剤化合物の同定
酸化体と反応することが報告されている化合物を、そのタンパク質含有組成物の着色を低減させる能力についてスクリーニングした（表４）。抗酸化剤のスクリーニングでは、１部の基本培地１と０．３部の流加培地２を、細胞培養条件に使用される培地の代表的な比を正確に反映して混合することにより、総量４０ｍｌの培地を調製した（表５）。培地１と培地２の混合物は、以前に、抗体産生細胞の培養に使用した場合、抗体含有溶液の着色強度を増大させることが示されており、この混合物には３０種類の抗酸化剤化合物のうちの１種類を補給し、２ｇ／ＬのＩｇＧ１モノクローナル抗体を入れた。試料を３７℃で、２５０ｒｐｍで振盪しながら５日間のインキュベーション期間でインキュベートした。２つのコントロール試料：１）２ｇ／ＬのＩｇＧ１モノクローナル抗体を含む培地１と培地２の混合物の４０ｍｌの試料、これは２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて５日間、抗酸化剤なしでインキュベートした（陽性コントロール）、および２）１部の基本培地３と０．３部の流加培地４（表５）を混合することにより調製した培地混合物の４０ｍＬの試料（これは、以前に、抗体産生細胞の培養に使用した場合、抗体含有溶液の着色強度を低減させることが示された）、２ｇ／ＬのＩｇＧ１モノクローナル抗体を入れ、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて５日間、抗酸化剤なしでインキュベートした（陰性コントロール）をスクリーニングアッセイに含めた。
Figure 0006843911
Figure 0006843911
Figure 0006843911
インキュベーション後、モノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。数値結果を陽性コントロールに対して正規化し、このとき、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した。試験した３０種類の抗酸化剤化合物のうち、いくつかの化合物、例えば、ゲンチシン酸、システアミン、ヒドロコルチゾンおよびメルカプトプロピオニルグリシンは、抗体組成物の着色を増大させることがわかった（図１）。比較において、該化合物のうち６種類、例えば、ヒポタウリン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸およびケルシトリン水和物は、抗体組成物の着色低減させることがわかった（図２）。着色強度を低減させる抗酸化剤のうち、ヒポタウリンは、抗体含有組成物の着色強度をおよそ２５％低減させることにより最も大きな効果を示した。また、ヒポタウリンの類似体であるタウリンも着色強度をおよそ５％低減させた。
Figure 0006843911
実施例２：抗体産生細胞株から単離された抗体組成物の着色強度を低減させ得る抗酸化剤化合物の特性評価
細胞培養物から直接得た抗体含有組成物の着色強度を低減させるヒポタウリンの能力を評価した。この試験のため、大規模２Ｌ細胞培養物の代表であることがわかっている振盪フラスコ細胞培養モデルを使用した。簡単には、振盪フラスコ細胞培養モデルでは、抗体産生ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬで、１００ｍＬの基本培地１または基本培地３を入れた２５０ｍＬ容フラスコ内でインキュベートした。大規模２Ｌ細胞培養物では、抗体産生ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬで、１Ｌの基本培地１または基本培地３を入れた２リットル容撹拌バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内でインキュベートした。大規模細胞増殖モデルでは、細胞をフェドバッチ様式で培養し、基本培地１中で培養する場合は１００ｍＬの流加培地２を、基本培地３中で培養する場合は１００ｍＬの流加培地４を（細胞培養液１リットルあたり）、３、６および９日目に産生期の開始のために添加した。振盪フラスコ細胞培養モデルでは、細胞をフェドバッチ様式で培養し、基本培地１中で培養する場合は１０ｍＬの流加培地２を、基本培地３中で培養する場合は１０ｍＬの流加培地４を（細胞培養液１リットルあたり）、３、６および９日目に産生期の開始のために添加した。グルコースの濃度を毎日解析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌ未満に低下したら、グルコース枯渇を防ぐために、５００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液から補給した。反応器に溶存酸素検量部、ｐＨおよび温度プローブを取り付けた。溶存酸素は、空気および／または酸素のスパージングによりオンラインで制御した。大規模２Ｌ細胞培養物では、ｐＨをＣＯ２またはＮａ２ＣＯ３の添加によって制御し、必要に応じて培養物を消泡剤を添加した。細胞培養物を、０日目から３日目まではｐＨ７．０および温度３７℃に、次いで３日目以降は３５℃に維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍでアジテーションし、溶存酸素レベルを空気飽和の３０％にした。振盪フラスコ細胞培養物では、培養物を振盪機のプラットフォーム上に置き、３７℃の温度の５％ＣＯ２インキュベータ内で１５０ｒｐｍで、細胞培養サイクルの０日目から３日目までアジテーションし、４日目に１４日目の細胞培養サイクル終了時まで３５℃に温度シフトした。オルモル濃度を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）の浸透圧計を用いてモニタリングした。また、オフラインｐＨおよび代謝産物濃度も毎日、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて測定した。生存可能細胞密度（ＶＣＣ）および細胞生存度を毎日、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて測定した。１ｍＬの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。１４日目の細胞培養期間終了時、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。ＶＣＣにより測定した増殖（図３Ａ）および細胞生存度（図３Ｂ）は、使用した培地に関係なく大規模（２Ｌ）と振盪フラスコ（ＳＦ）細胞培養モデル間で同等であった。抗体産生は振盪フラスコ細胞培養モデルにおいてわずかに少なく、最も高い抗体産生が培地１および培地２中でインキュベートした大規模細胞培養モデルにおいて観察された（図３Ｃ）。振盪フラスコ細胞培養モデルから得られた抗体組成物の着色強度は、培地３および培地４中で培養した場合、培地１および培地２中で培養した場合の振盪フラスコ細胞培養組成物から得られた抗体組成物（２．２５の値を有した）と比べて値は１．０７と低かった。この実験により、振盪フラスコモデルは２Ｌ細胞培養モデルと同等であり、後続の実験における使用に適していることが確立された。
抗酸化剤ヒポタウリンを補給した細胞培養培地組成物を用いた実験手法では、抗体産生ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬで、１００ｍＬの基本培地１を入れた２５０ｍＬ容フラスコ内でインキュベートした。培地１に細胞培養における使用のための９．１６ｍＭ（１００％）、４．５８ｍＭ（５０％）または２．２９ｍＭ（２５％）ヒポタウリンを０日目に補給した。細胞をフェドバッチ様式で培養し、１０ｍＬの流加培地２（細胞培養液１リットルあたり）を３、６および９日目に産生期の開始のために添加した。さらなる実験試料には、細胞培養物期間にわたって９．１６ｍＭのヒポタウリンの漸増添加を含めた。具体的には、２．２９ｍＭ（２５％）ヒポタウリンを細胞培養の０日目に基本培地１中に、および２５％を３日目、６日目および９日目に流加培地２中に添加した。細胞を培地１および２中でヒポタウリン補給なしで培養することにより陽性コントロールを含めた。培地３および培地４中で培養した細胞をヒポタウリン補給なしで培養することにより陰性コントロールを含めた。上記のように、グルコースの濃度を毎日解析し、グルコース濃度が３ｇ／Ｌ未満に低下したら、グルコース枯渇を防ぐために、５００ｇ／Ｌのグルコースストック溶液から補給した。細胞培養物を、０日目から３日目まではｐＨ７．０および温度３７℃に、次いで３日目以降は３５℃に維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍでアジテーションし、溶存酸素レベルを空気飽和の３０％にした。ＶＣＣおよび細胞生存度を毎日、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて測定した。１ｍＬの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。１４日目の細胞培養期間終了時、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。数値結果を陽性コントロールに対して正規化し、このとき、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した。ＶＣＣにより測定した増殖（図４Ａ）および細胞生存度（図４Ｂ）は試験したすべての細胞培養物間で同等であった。さらに、ヒポタウリンの漸増添加以外は、ヒポタウリンを補給した培地中で培養した細胞培養物では、ヒポタウリンを含有していない培地中で培養した細胞培養物と同レベルの抗体力価が得られた（図４Ｃ）。着色強度はヒポタウリンの濃度が高いほど低減されることがわかり、９．１６ｍＭのヒポタウリンを含む培地で最も大きな低減が観察された（図５）。この着色強度の低減は、ヒポタウリンを、細胞培養物のインキュベーション過程で漸増的に添加するのではなく１日目にボーラスとして添加した場合に最適であった。細胞培養実験およびインキュベーション実験（実施例１を参照）で得られた着色強度値の比較により、インキュベーションスクリーニング実験の結果（図５、白丸）が細胞培養実験の結果（図５、黒丸）と良好に相関していることが示された。
同様の実験を、基本培地３および流加培地４で収集した細胞培養物から単離された抗体組成物について行ない、ヒポタウリンの着色低減効果が他の細胞培養培地に拡張されるかどうかを調べた。簡単には、上記のように、抗体産生ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬで、１００ｍＬの基本培地３を入れた２５０ｍＬ容フラスコ内でインキュベートした。培地３に細胞培養における使用のための１２．９５ｍＭ（１×）、２５．９ｍＭ（２×）または３８．８５ｍＭ（３×）ヒポタウリンを０日目に補給した。細胞をフェドバッチ様式で培養し、１０ｍＬの流加培地４（細胞培養液１リットルあたり）を３、６および９日目に産生期の開始のために添加した。細胞を培地１および２中でヒポタウリン補給なしで培養することにより陽性コントロールを含めた。培養物を振盪機のプラットフォーム上に置き、３７℃の温度の５％ＣＯ２インキュベータ内で１５０ｒｐｍで細胞培養サイクルの０日目から３日目までアジテーションし、４日目に１４日目の細胞培養サイクル終了時まで３５℃に温度シフトした。オルモル濃度、オフラインｐＨおよび代謝産物濃度を上記のようにして測定した。ＶＣＣおよび細胞生存度を毎日、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて測定した。１ｍＬの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。１４日目の細胞培養期間終了時、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。数値結果を陽性コントロールに対して正規化し、このとき、陽性コントロールの値を着色強度の変化０％に設定した。着色強度はヒポタウリンの濃度が高いほど低減されることがわかり、３８．８５ｍＭのヒポタウリンを含む培地で最も大きな低減が観察された（図６）。
実施例３：抗体産生細胞株から単離された抗体組成物の着色の低減におけるヒポタウリン類似体の特性評価
ヒポタウリン類似体を試験し、抗体含有組成物において着色低減効果を示すかどうかを評価した。抗体産生ＣＨＯ細胞をおよそ１．０×１０６細胞／ｍＬで、１２．９５ｍＭのヒポタウリンまたは１０ｍＭのカルボキシメチルシステイン（ＣＡＳ番号６３８−２３−３）を補給した１Ｌの基本培地１を入れた２リットル容撹拌バイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内でインキュベートした。細胞をフェドバッチ様式で培養し、１００ｍＬの流加培地２（細胞培養液１リットルあたり）を３、６および９日目に産生期の開始のために添加した。細胞を培地１および２中でヒポタウリン補給なしで培養することにより陽性コントロールを含めた。グルコースの濃度を毎日解析し、グルコース濃度が２ｇ／Ｌ未満に低下したら、グルコース枯渇を防ぐために１．５ｇ／Ｌのグルコースストック溶液から補給した。反応器に溶存酸素検量部、ｐＨおよび温度プローブを取り付けた。溶存酸素は、空気および／または酸素のスパージングによりオンラインで制御した。ｐＨをＣＯ２またはＮａ２ＣＯ３の添加によって制御し、必要に応じて培養物を消泡剤を添加した。細胞培養物を、０日目から３日目まではｐＨ７．０および温度３７℃に、次いで３日目以降は３５℃に維持した。細胞培養物を２７５ｒｐｍでアジテーションし、溶存酸素レベルを空気飽和の３０％にした。オルモル濃度を、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）の浸透圧計を用いてモニタリングした。また、オフラインｐＨおよび代謝産物濃度も毎日、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて測定した。ＶＣＣおよび細胞生存度を毎日、ＶｉＣｅｌｌ（登録商標）自動細胞計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて測定した。１ｍＬの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。１４日目の細胞培養期間終了時、培養物中のタンパク質の量がおよそ２−１０ｇ／Ｌだった場合、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。タンパク質Ａプールを１５０ｇ／Ｌまで、Ａｍｉｃｏｎ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ遠心フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮した。濃縮抗体組成物の着色強度を濃縮タンパク質Ａプールにおいて、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示す２つの異なるアッセイ測定した。ＶＣＣにより測定した増殖（図７Ａ）および細胞生存度（図７Ｂ）は試験したすべての細胞培養物間で同等であった。ヒポタウリンまたはカルボキシメチルシステインを補給した培地中で培養された細胞培養物では同等レベルの抗体力価が得られた（図８）。比色アッセイを使用し、単離した抗体組成物の着色強度は、抗体産生細胞をヒポタウリンおよびカルボキシメチルシステインを補給した培地で培養した場合、それぞれ２７％および１３％低減したことがわかった（図９Ａ）。この着色強度の低減を、第２の色アッセイを使用することにより確認し、このアッセイでは、それぞれヒポタウリンおよびカルボキシメチルシステインを補給した培地中で培養した細胞から単離した抗体組成物においておよそ１７％および１３％の着色強度の低減が検出された（図９Ｂ）。
実施例４：抗体産生細胞株から単離された抗体組成物の着色の低減におけるアミノグアニジンの特性評価
抗体組成物において低減させ、細胞培養条件下で奏功する化合物を同定するため、無細胞培地においてスクリーニングアッセイを行なった。タウリン、カルノシンおよびアミノグアニジンをスクリーニングに選択した。これらの化合物を２５ｍＬの培養培地に１．２ｇ／Ｌ（タウリン）、１３．６ｇ／Ｌ（カルノシン）および２７．２ｇ／Ｌ（アミノグアニジン塩酸塩）の濃度で溶解させた。６．８から７．２の範囲にｐＨ調整し、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）で滅菌濾過した後、溶液を、ＴｕｂｅＳｐｉｎキャップ（ＴＰＰ Ｔｅｃｈｎｏ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ＡＧ，Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を備えた５０ｍＬ容Ｆａｌｃｏｎチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）内でインキュベートした。ＣＨＯ細胞を、湿度制御された３７℃の細胞培養インキュベータ内で２５０ｒｐｍにて、光からの保護なしで７日間インキュベートし、モノクローナル抗体を産生させた。
収集した細胞培養液（ＨＣＣＦ）およびインキュベーションブロス中のモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーでさらに精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。
タウリン、カルノシンまたはアミノグアニジンを含む培養培地中で産生された抗体についての相対着色強度を図１０に示す。データにより、アミノグアニジンは着色を約７１％低減させることができ、相対着色強度値は、抗体をグルコースを全くなしでインキュベートした陰性コントロールの値よりもさらに低いことが示された。

Claims (25)

  1. ポリペプチドの生成方法であって：
    細胞をタウリンを含む細胞培養培地と接触させることを含む、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養すること；
    前記ポリペプチドを産生すること；及び
    前記ポリペプチドを精製すること
    とを含み、タウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物の着色強度が、タウリンを含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物と比べて低減される、方法。
  2. タウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物の着色強度が、タウリンを含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物と比べて少なくとも約０．１％低減される、請求項１に記載の方法。
  3. タウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物の着色強度が、タウリンを含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生され精製されたポリペプチドを含む組成物と比べて約５％から約７５％低減される、請求項１に記載の方法。
  4. 細胞培養培地が、少なくとも約０．０００１ｍＭからの濃度のタウリンを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 細胞培養培地がタウリンを約０．０００１ｍＭから約５００．０ｍＭの濃度で含む、請求項４に記載の方法。
  6. 細胞培養培地がタウリンを約１．０ｍＭから約４０．０ｍＭの濃度で含む、請求項４に記載の方法。
  7. 細胞培養培地がタウリンを約１．０ｍＭから約１０．０ｍＭの濃度で含む、請求項４に記載の方法。
  8. 細胞培養培地が既知組成の細胞培養培地である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  9. 細胞培養培地が未知組成の細胞培養培地である、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
  10. 細胞培養培地が細胞培養基本培地である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  11. 細胞培養培地が細胞培養流加培地である、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  12. 細胞を細胞培養培地と細胞の増殖期に接触させる、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  13. 細胞を細胞培養培地と細胞の産生期に接触させる、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
  14. タウリンを細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも１日に添加する、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. タウリンを細胞培養培地に１４日間の細胞培養サイクルの０日目に添加する、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
  16. 細胞が哺乳動物細胞である、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
  17. 哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. ポリペプチドが抗体またはその断片である、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
  19. 抗体がＩｇＧ１抗体である、請求項１８に記載の方法。
  20. ポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項１から１９の何れか一項に記載の方法。
  21. ポリペプチドが細胞培養培地中に分泌される、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
  22. ポリペプチドを、細胞培養培地から回収することを含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 精製されたポリペプチドを含む組成物が液状組成物である、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
  24. 精製されたポリペプチドを含む組成物が非液状組成物である、請求項１から２２の何れか一項に記載の方法。
  25. 精製されたポリペプチドを含む組成物が無色またはわずかに着色した液体に見える、請求項２３または２４に記載の方法。
JP2019060156A 2013-03-15 2019-03-27 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法 Active JP6843911B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361799602P 2013-03-15 2013-03-15
US61/799,602 2013-03-15

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016503220A Division JP6591395B2 (ja) 2013-03-15 2014-03-14 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2019141053A JP2019141053A (ja) 2019-08-29
JP6843911B2 true JP6843911B2 (ja) 2021-03-17

Family

ID=50639996

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016503220A Active JP6591395B2 (ja) 2013-03-15 2014-03-14 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法
JP2019060156A Active JP6843911B2 (ja) 2013-03-15 2019-03-27 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2016503220A Active JP6591395B2 (ja) 2013-03-15 2014-03-14 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法

Country Status (19)

Country Link
US (5) US10017732B2 (ja)
EP (2) EP2970875B1 (ja)
JP (2) JP6591395B2 (ja)
KR (2) KR20210037745A (ja)
CN (2) CN105121628B (ja)
AU (3) AU2014233393B2 (ja)
BR (1) BR112015021993A8 (ja)
CA (1) CA2903596C (ja)
ES (1) ES2798307T3 (ja)
HK (1) HK1218141A1 (ja)
HR (1) HRP20200893T1 (ja)
IL (2) IL240644B (ja)
MX (2) MX360779B (ja)
PL (1) PL2970875T3 (ja)
RU (2) RU2020111947A (ja)
SG (3) SG10201809452RA (ja)
SI (1) SI2970875T1 (ja)
WO (1) WO2014145098A1 (ja)
ZA (2) ZA201506155B (ja)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014145098A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production
WO2014182658A1 (en) * 2013-05-06 2014-11-13 Abbvie Inc. Compositions for cell culture and methods of using the same
MA40864A (fr) * 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
TWI797060B (zh) 2015-08-04 2023-04-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
US11254964B1 (en) * 2016-03-15 2022-02-22 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Cell culture methods for increased cell viability
US11186858B1 (en) 2016-03-15 2021-11-30 Fresenius Kabi Deutschland Gmbh Methods for increasing biosimilarity
KR20190005966A (ko) * 2016-05-10 2019-01-16 제넨테크, 인크. 폴리펩타이드의 재조합 생산 동안 트리설파이드 결합을 감소시키기 위한 방법
CN106070537A (zh) * 2016-07-08 2016-11-09 广东海洋大学 一种抑制虾黑变的抗氧化剂及其制备方法与应用
WO2020091041A1 (ja) * 2018-11-02 2020-05-07 協和キリン株式会社 液体培地の調製方法
HUP1800376A2 (hu) * 2018-11-07 2020-05-28 Richter Gedeon Nyrt Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
BR112021025769A2 (pt) 2019-12-06 2022-04-12 Regeneron Pharma Composições de proteína anti-vegf e métodos para a produção das mesmas
WO2023194946A1 (en) * 2022-04-06 2023-10-12 Kashiv Biosciences, Llc An improved cell culture process for production of protein

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE266710C (ja)
US3883511A (en) 1974-03-07 1975-05-13 Rit Rech Ind Therapeut New 6-aminopenicillanic acid derivative
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
CA1338518C (en) 1987-09-23 1996-08-13 Joyce M. Zarling Antibody heteroconjugates for the killing of hiv-infected cells
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE69029036T2 (de) 1989-06-29 1997-05-22 Medarex Inc Bispezifische reagenzien für die aids-therapie
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
JP3230091B2 (ja) 1990-06-25 2001-11-19 ウェルファイド株式会社 ヒト血清アルブミンの着色抑制方法
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
EP0571390B1 (en) * 1990-11-23 2000-03-08 Peptech Limited The delay, prevention and/or reversal of cell senescence
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
WO1993018143A1 (en) 1992-03-04 1993-09-16 Synaptic Pharmaceutical Corporation Dna encoding taurine and gaba transporters and uses thereof
JPH07102147B2 (ja) * 1992-03-16 1995-11-08 株式会社ミドリ十字 ヒト血清アルブミンの着色抑制方法
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
CA2149329C (en) 1992-11-13 2008-07-15 Darrell R. Anderson Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5856179A (en) 1994-03-10 1999-01-05 Genentech, Inc. Polypeptide production in animal cell culture
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
ES2304786T3 (es) 1995-04-27 2008-10-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpos anti-il-8 humanos, derivados a partir de xenoratones inmunizados.
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
DK1500329T3 (da) 1996-12-03 2012-07-09 Amgen Fremont Inc Humane antistoffer, der specifikt binder TNF-alfa
US20080318254A9 (en) 1997-03-10 2008-12-25 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US20020012991A1 (en) * 1997-04-07 2002-01-31 Florence Chua Nee Ho Kit Fong Cell culture media for enhanced protein production
US20020173629A1 (en) 1997-05-05 2002-11-21 Aya Jakobovits Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998059035A2 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 The Goverment Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, National Institutes Of Health Serum-free cell growth medium
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DE60039596D1 (de) 1999-03-30 2008-09-04 Japan Tobacco Inc Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikörpern
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
RU2192884C2 (ru) * 2000-11-09 2002-11-20 Государственное учреждение Научно-исследовательский институт клинической иммунологии СО РАМН Вакцина для стимуляции противоопухолевого иммунитета
US7311905B2 (en) * 2002-02-13 2007-12-25 Anthrogenesis Corporation Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells
WO2002092017A2 (en) 2001-05-16 2002-11-21 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Human antipneumococcal antibodies from non-human animals
AU2002316230A1 (en) 2001-06-13 2002-12-23 Genentech, Inc. Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
JP4359503B2 (ja) 2001-08-23 2009-11-04 ゲンマブ エー／エス インターロイキン１５（ｉｌ−１５）に特異的なヒト抗体
US7371922B2 (en) * 2002-07-31 2008-05-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nuclear transfer with porcine embryonic stem cells
DE60332957D1 (de) * 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
EP1590364B1 (en) 2002-12-16 2011-10-05 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against interleukin 8 (il-8)
CA2513308A1 (en) 2003-01-17 2004-08-05 Josef Michl Pancreatic cancer associated antigen, antibody thereto, and diagnostic and treatment methods
WO2004069172A2 (en) * 2003-01-30 2004-08-19 The Government of the United States of America as represented by the Department of Veterans Affairs Multilineage-inducible cells and uses thereof
AU2004270103B2 (en) 2003-05-21 2012-02-23 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies against Bacillusanthracis protective antigen
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
WO2006047380A2 (en) 2004-10-22 2006-05-04 Amgen, Inc. Method and media for single cell serum-fee culture of cho cells
WO2006050050A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
US8207303B2 (en) * 2005-02-18 2012-06-26 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies against CD30 lacking in fucosyl residues
JP2008536524A (ja) * 2005-04-21 2008-09-11 グレン エー． ゴールドスタイン， 不妊に関連する酸化ストレス治療のためのｎ−アセチルシステインアミド（ｎａｃアミド）
KR20070122497A (ko) * 2005-04-22 2007-12-31 제넨테크, 인크. Ｃｄ20 항체로 치매 또는 알츠하이머병을 치료하는 방법
MX2007014148A (es) 2005-05-19 2008-01-11 Amgen Inc Composiciones y metodos para incrementar la estabilidad de anticuerpos.
PE20070796A1 (es) 2005-10-24 2007-08-15 Wyeth Corp Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia
CA2654716A1 (en) 2006-06-09 2007-12-21 Anthrogenesis Corporation Placental niche and use thereof to culture stem cells
TW200902708A (en) * 2007-04-23 2009-01-16 Wyeth Corp Methods of protein production using anti-senescence compounds
ES2591284T3 (es) 2007-08-07 2016-11-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para la producción de proteínas heterogéneas
CN101815786A (zh) 2007-10-12 2010-08-25 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 来自多个核酸的蛋白质表达
CN101418330B (zh) 2008-06-20 2012-01-04 华东理工大学 适于nso细胞大规模培养及抗体生产的无蛋白培养基
CN102224239A (zh) * 2008-09-26 2011-10-19 先灵公司 高效价抗体生产
CN101603026B (zh) * 2009-06-19 2011-01-19 华东理工大学 适于动物细胞产品生产的无动物来源低蛋白培养基
CA2765220A1 (en) 2009-07-14 2011-01-20 Biogen Idec Ma Inc. Methods for inhibiting yellow color and peroxide formation in a composition
HUE048980T2 (hu) 2009-08-11 2020-08-28 Hoffmann La Roche Fehérjék elõállítása glutaminmentes sejttenyésztõ táptalajban
LT2563906T (lt) 2010-04-26 2018-02-26 Novartis Ag Cho ląstelių kultivavimo būdas
KR20130118899A (ko) * 2010-11-05 2013-10-30 애브비 인코포레이티드 세포배양에서의 화학적으로 규명된 배지의 개발을 위한 효율적이고 효과적인 보충물 스크리닝
CN102093978A (zh) 2010-12-17 2011-06-15 上海市农业科学院 猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液
US20120171161A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-05 Sascha Abramson Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof
US20130281355A1 (en) 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
US20150267237A1 (en) * 2012-04-24 2015-09-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
WO2014029772A1 (en) 2012-08-20 2014-02-27 Schreder Method of and system for isolating led luminaires from electrical surges
WO2014145098A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Genentech, Inc. Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production

Also Published As

Publication number Publication date
NZ712315A (en) 2021-07-30
ES2798307T3 (es) 2020-12-10
EP2970875B1 (en) 2020-04-15
SI2970875T1 (sl) 2020-08-31
ZA201805630B (en) 2019-11-27
SG11201507367PA (en) 2015-10-29
JP2019141053A (ja) 2019-08-29
CN105121628B (zh) 2020-03-24
CA2903596A1 (en) 2014-09-18
BR112015021993A8 (pt) 2019-12-03
BR112015021993A2 (pt) 2017-07-18
KR20210037745A (ko) 2021-04-06
EP3712252A1 (en) 2020-09-23
US20210017488A1 (en) 2021-01-21
IL240644B (en) 2020-04-30
PL2970875T3 (pl) 2020-08-10
MX360779B (es) 2018-11-16
JP2016514461A (ja) 2016-05-23
AU2020223634A1 (en) 2020-09-10
EP2970875A1 (en) 2016-01-20
KR102235452B1 (ko) 2021-04-02
KR20150131172A (ko) 2015-11-24
AU2014233393A1 (en) 2015-09-10
US10676710B2 (en) 2020-06-09
CN105121628A (zh) 2015-12-02
RU2718986C2 (ru) 2020-04-15
ZA201506155B (en) 2018-11-28
JP6591395B2 (ja) 2019-10-16
SG10201809452RA (en) 2018-11-29
US20190144817A1 (en) 2019-05-16
US10829732B2 (en) 2020-11-10
CA2903596C (en) 2023-10-03
WO2014145098A1 (en) 2014-09-18
HRP20200893T1 (hr) 2020-09-18
IL273504A (en) 2020-05-31
US10017732B2 (en) 2018-07-10
US20190002822A1 (en) 2019-01-03
IL240644A0 (en) 2015-10-29
CN110951670A (zh) 2020-04-03
SG10201912621TA (en) 2020-02-27
MX2015012875A (es) 2016-02-03
NZ751400A (en) 2021-10-29
US20140314779A1 (en) 2014-10-23
MX2018014043A (es) 2020-11-12
HK1218141A1 (zh) 2017-02-03
US20160002593A1 (en) 2016-01-07
RU2015144172A (ru) 2017-04-24
AU2022231703A1 (en) 2022-10-06
RU2015144172A3 (ja) 2018-03-12
RU2020111947A (ru) 2020-09-02
AU2014233393B2 (en) 2020-05-28
US10131873B2 (en) 2018-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6843911B2 (ja) 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法
JP2021104023A (ja) ポリペプチド生成のための細胞培養組成物及び方法
JP7046814B2 (ja) タンパク質製剤のためのトリプトファン誘導体の使用
NZ712315B2 (en) Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production
NZ751400B2 (en) Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190425

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190425

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200303

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200528

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200727

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200828

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210126

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210224

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6843911

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250