JP6591395B2 - 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国特許仮出願第61/799602号の優先権を主張する。該仮出願の内容は出典明示によりその全体が本明細書に援用される。
用語「培地」および「細胞培養培地」は、細胞を培養または維持するために使用される栄養供給源をいう。当業者には理解されるように、栄養供給源は、細胞が増殖および/または生存のために必要とする成分を含むものであり得るか、または細胞の増殖および/または生存を補助する成分を含むものであり得る。ビタミン、必須または非必須アミノ酸および微量元素が培地成分の一例である。
本明細書において提供する細胞培養培地は、本明細書に詳述している方法(例えば、細胞の培養方法およびポリペプチドの作製方法)ならびに組成物(例えば、薬学的製剤)において有用性がみられ得る。培地成分は、許容され得る品質属性、例えば許容され得る着色強度のポリペプチド生成物(例えば、治療用タンパク質)をもたらし得るものであると確認されているものである。このような確認された培地成分の1種類以上が、許容され得る着色強度のポリペプチド産物を得るために使用され得る。本明細書で用いる場合、ポリペプチド生成物(例えば、ポリペプチドを含む組成物)の「許容され得る着色強度」は、ポリペプチド産物の規制機関の承認に必要とされる着色強度またはポリペプチド生成物のバッチのロット間の一貫性の評価における使用に所望される着色強度を示し得る。一部の実施態様では、1種類以上の培地成分が抗酸化剤である。一部の実施態様では、1種類以上の培地成分が、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸、ケルシトリン水和物およびアミノグアニジンからなる群より選択される。一部の実施態様では、1種類以上の培地成分はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体である。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。一部の実施態様では、1種類以上の培地成分がタウリン、リポ酸還元型またはカルベジロールである。
本明細書において、目的のポリペプチドの作製のために本明細書において提供する細胞培養培地中で細胞を培養する方法を提供する。一部の態様において、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該方法が該細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、該細胞培養培地が、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、カルノシン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、リポ酸およびケルシトリン水和物からなる群より選択される成分のうちの1種類以上を含むものである方法を提供する。一部の実施態様では、目的のポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞を培養するための方法であって、該方法が該細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、該細胞培養培地が、(a)ヒポタウリン、(b)s−カルボキシメチルシステイン、(c)カルノシン、(d)アンセリン、(e)ブチル化ヒドロキシアニソール、(f)リポ酸;(g)ケルシトリン水和物;および(h)アミノグアニジンからなる群より選択される成分のうちの1種類以上を含むものであり、成分(a)−(h)のうちの1種類以上を含む該細胞培養培地により、該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が、成分(a)−(h)のうちの1種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された該細胞によって産生された該ポリペプチドを含む組成物と比べて低減される方法を提供する。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約0.1%低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が少なくとも約5%低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約10%から約30%低減される。一部の実施態様では、該ポリペプチドを含む組成物の着色強度が約5%から約75%低減される。本明細書における一部の実施態様では、細胞培養培地が(a)約2.0mMから約50.0mMの濃度のヒポタウリン、(b)約8.0mMから約12.0mMの濃度のs−カルボキシメチルシステイン、(c)約8.0mMから約12.0mMの濃度のカルノシン、(d)約3.0mMから約5.0mMの濃度のアンセリン、(e)約0.025mMから約0.040mMの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール、(f)約0.040mMから約0.060mMの濃度のリポ酸、(g)約0.010mMから約0.020mMの濃度のケルシトリン水和物、および(h)約0.0003mMから約20mMの濃度のアミノグアニジンから選択される量の1種類以上の成分を含むものである。本明細書における一部の実施態様では、(a)ヒポタウリン、(b)s−カルボキシメチルシステイン、(c)カルノシン、(d)アンセリン、(e)ブチル化ヒドロキシアニソール、(f)リポ酸;(g)ケルシトリン水和物;および(h)アミノグアニジンからなる群より選択される1種類以上の成分を細胞培養培地に14日間の細胞培養サイクルの0日目に添加する。
本明細書において詳述している細胞培養培地は、ポリペプチド、例えば特定の抗体を作製するための細胞培養方法に使用され得る。該培地は、バッチ培養、フェドバッチ培養または灌流培養のいずれによるものであれ細胞培養方法に使用され得、任意のポリペプチド、例えば本明細書に記載のポリペプチドの任意の態様または実施態様の作製方法に使用され得る。本明細書に詳述している組成物(例えば、本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞)および方法によって作製され、本明細書において提供する組成物(例えば、作製するポリペプチドを含む細胞培養培地)中に存在するポリペプチドは宿主細胞に相同であってもよく、または好ましくは外来性(使用される宿主細胞に対して非相同である、すなわち異物であることを意味する、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生させたヒトタンパク質、または哺乳動物細胞によって産生させた酵母ポリペプチド)であり得る。多様な形態の一例では、ポリペプチドは、宿主細胞によって培地中に直接分泌された哺乳動物ポリペプチド(例えば、抗体)である。多様な形態の別の一例では、ポリペプチドは培地中に、該ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞の溶解によって放出される。
本明細書において提供する細胞培養培地を用いて細胞培養物中で作製される抗体は目的の抗原に対するものである。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、該抗体を含む組成物を、障害に苦しんでいる哺乳動物に投与することにより該哺乳動物に治療有益性がもたらされ得る。
可溶性抗原またはその断片(他の分子にコンジュゲートさせてもよい)が、抗体を生成させるための免疫原として使用され得る。膜貫通型分子、例えば受容体に対しては、その断片(例えば、受容体の細胞外ドメイン)が免疫原として使用され得る。あるいはまた、膜貫通型分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。かかる細胞は天然供給源(例えば、癌細胞株)に由来するものであってよく、膜貫通型分子を発現するように組換え手法によって形質転換した細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原およびその形態は当業者に自明であろう。
目的のモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature, 256:495 (1975)によって報告され、例えば、Hongoら, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版 1988); Hammerlingら:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N.Y., 1981)およびNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)にヒト−ヒトハイブリドーマに関してさらに報告されたハイブリドーマ法を用いて作製され得る。さらなる方法としては、例えば、ハイブリドーマ細胞株でのモノクローナルヒト天然IgM抗体の作製に関する米国特許第7189826号に記載のものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術(トリオーマ技術)はVollmersおよびBrandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)ならびにVollmersおよびBrandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。
抗体を、コンビナトリアルライブラリーを使用して所望の活性(一又は複数)を有する抗体をスクリーニングすることにより作製してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、かかるライブラリーを、所望の結合特性を有する抗体についてスクリーニングするためのさまざまな方法が当該技術分野で知られている。かかる方法は、HoogenboomらのMethods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brienら編, Human Press, Totowa, N.J., 2001)に一般的に記載されている。例えば、目的の抗体の作製方法の一例は、Leeら, J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93に記載のようなファージ抗体ライブラリーの使用によるものである。
非ヒト抗体をヒト化するための種々の方法が当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から該抗体に導入された1つ以上のアミノ酸残基を有するものである。このような非ヒトアミノ酸残基はしばしば「インポート」残基と称され、これは典型的には「インポート」可変ドメインから取り出される。ヒト化は本質的に、Winterおよび共同研究者(Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従い、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列で置き換えることにより行なわれ得る。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、インタクトのものより実質的に少ないヒト可変ドメインが非ヒト種の対応する配列で置き換えられたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のCDR残基および場合によっては一部のFR残基が齧歯類抗体の同様の部位に由来する残基で置き換えられているヒト抗体である。
抗体断片は、従来からの手段、例えば酵素による消化または組換え手法によって作製され得る。一部の特定の状況では、完全な抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。断片のサイズが小さいほど速やかな排出が可能になり、充実性腫瘍への到達の改善がもたらされ得る。特定の抗体断片の概説については、Hudsonら (2003) Nat. Med. 9:129-134を参照のこと。
多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有するものであり、この場合、該エピトープは通常、異なる抗原のものである。かかる分子は通常、2つの異なるエピトープのみに結合するもの(すなわち、二重特異性抗体,BsAb)であるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異性抗体も、本明細書で用いている場合のこの表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製され得る。
一部の実施態様では、目的の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部分または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部分を含む単一のポリペプチド鎖である。一部の特定の実施態様では、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(Domantis,Inc.,Waltham,Mass.;例えば、米国特許第6248516B1号を参照のこと)。一実施態様では、単一ドメイン抗体は抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部分からなるものである。
一部の実施態様では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾(一又は複数)が想定される。例えば、該抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合があり得る。該抗体のアミノ酸配列バリアントは、該抗体をコードしているヌクレオチド配列に適切な変更を導入することにより、またはペプチド合成によって調製され得る。かかる修飾としては、例えば、該抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または挿入および/または置換が挙げられる。最終の構築物を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行なわれ得るが、最終の構築物は所望の特性を有するものであるものとする。対象の抗体アミノ酸配列を作製する時点で該配列にアミノ酸の改変が導入され得る。
本明細書において提供する細胞培養培地中で培養された細胞によって産生される抗体は、組換え法を使用しても作製され得る。抗抗原抗体の組換え作製では、抗体をコードしている核酸を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)または発現のための複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードしているDNAは慣用的な手順容易に単離され、配列決定され得る(例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては一般的に、限定されないが、以下のもの:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列のうちの1種類以上が挙げられる。
抗体は、直接的にだけでなく、非相同ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても組換え作製され得、非相同ポリペプチドは好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択される非相同シグナル配列は好ましくは、宿主細胞によって認識されてプロセッシングされる(例えば、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然抗体シグナル配列を認識してプロセッシングしない原核生物宿主細胞では、このシグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lpp、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列で置き換える。酵母による分泌のためには、天然シグナル配列が、例えば酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー(例えば、サッカロミセス属およびクリベロミセス属のα−因子リーダー)、もしくは酸性ホスファターゼリーダー、C.albicansグルコアミラーゼリーダー、または国際公開第90/13646号に記載のシグナルで置き換えられ得る。哺乳動物細胞での発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。
発現ベクターおよびクローニングベクターはともに、該ベクターが1つ以上の選択された宿主細胞内で複製することを可能にする核酸配列が含まれている。一般的に、クローニングベクターでは、この配列は、該ベクターが宿主の染色体DNAと独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自律複製配列が挙げられる。かかる配列は、さまざまな細菌、酵母およびウイルスでよく知られている。プラスミドpBR322の複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、プラスミドの起点である2μは酵母に適しており、種々のウイルスの起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要でない(SV40起点は、典型的には初期プロモーターが含まれているという理由だけで使用されることがあり得る。
発現ベクターおよびクローニングベクターには、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子が含められ得る。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、(b)栄養要求性欠陥を補う、または(c)複雑な培地から利用可能でない不可欠な栄養を供給するタンパク質をコードしているもの、例えば、バチルス属のD−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子である。
発現ベクターおよびクローニングベクターには、一般的に、宿主生物体によって認識され、抗体コード核酸に作動可能に連結されたプロモーターが含められる。原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、phoAプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系、およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、抗体コードDNAに作動可能に連結されたシャイン−ダルガノ(S.D.)配列も含む。
本発明の抗体をコードしているDNAの高等真核生物による転写はしばしば、エンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大される。現在、哺乳動物遺伝子多くのエンハンサー配列が知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン)。しかしながら、典型的には、真核生物細胞ウイルスのエンハンサーが使用される。例としては、複製起点の後期側(bp100−270)のSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関するYaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、ベクター内に抗体コード配列の5’側の位置にスプライシングしても3’側の位置にスプライシングしてもよいが、好ましくはプロモーターの5’側の部位に存在させる。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物体の有核細胞)において使用される発現ベクターにはまた、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列が含められる。かかる配列は一般的に、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5’およびたまに3’非翻訳領域から入手可能である。このような領域は、抗体コードmRNAの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結成分の一例はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号および本明細書に開示した発現ベクターを参照のこと。
本明細書におけるベクターでのDNAのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に好適な原核生物としては、ユーバクテリウム属、例えば、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば腸内細菌科、例えばエシェリキア属、例えば大腸菌、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えば、Salmonella typhimurium、セラシア属、例えば、Serratia marcescans、および赤痢菌、ならびにバチルス属、例えば、B.subtilisおよびB.licheniformis(例えば、DD266,710(1989年4月12日公開)に開示されたB.licheniformis 41P)、シュードモナス属、例えば、P.aeruginosaおよびストレプトマイセス属が挙げられる。好ましいクローニング用大腸菌宿主は大腸菌294(ATCC31,446)であるが、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC31,537)および大腸菌W3110(ATCC27,325)などの他の菌株も好適である。これらの例は限定的ではなく例示的である。
一般的に細胞は、本明細書に記載の任意の細胞培養培地と、細胞の増殖、維持および/またはポリペプチド産生のいずれかを促進させる1つ以上の条件下で合わせる(接触させる)。細胞培養方法およびポリペプチド作製方法では、細胞および細胞培養培地が収容された培養槽(バイオリアクター)が使用される。培養槽は、細胞の培養に適した任意の材質、例えばガラス、プラスチックまたは金属で構成されたものであり得る。典型的には、培養槽は少なくとも1リットル容であり、10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000リットル容またはそれ以上であり得る。培養条件、例えば温度、pHなどは、発現のために選択した宿主細胞で先に使用したものであり、当業者に自明であろう。培養プロセス中に調整され得る培養条件としては、限定されないがpHおよび温度が挙げられる。
目的のポリペプチドは、好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナルなしで直接発現させた場合は宿主細胞溶解物から回収してもよい。一態様において、産生されたポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体である。
本明細書に詳述している方法によって作製され、提供する組成物中に存在するポリペプチドは、タンパク質精製プロセスのいずれかの工程で着色について評価され得る。着色の評価方法は、細胞培養液を本明細書に詳述している培地中で培養された細胞から収集すること、ポリペプチドを細胞培養液から精製し、ポリペプチド含有組成物(例えば、溶液)を得ること、およびポリペプチド含有溶液を着色について評価することを伴うものであり得る。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーでの精製後の着色について評価される。多様な形態のさらなる一例では、ポリペプチド含有組成物は、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態の別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、高速液体クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態のまた別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態のさらに別の一例では、ポリペプチド含有組成物は、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製後の着色について評価される。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、濾過、例えば、精密濾過または限外濾過による精製後の着色について評価される。多様な形態の一例では、ポリペプチド含有組成物は、着色について評価する前に濃縮される(例えば、該組成物は少なくとも1mg/mL、10mg/mL、50mg/mL、75mg/mL、100mg/mL、125mg/mLまたは150mg/mLのポリペプチド、例えば抗体を含むものであり得る)。ポリペプチド含有組成物は、遠心分離、フィルターデバイス、半透膜、透析、沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または疎水性相互作用クロマトグラフィーによって濃縮され得る。多様な形態の一例では、該ポリペプチドは凍結乾燥によって濃縮され、着色の評価の前に再縣濁され得る。ポリペプチド含有組成物は、本明細書に詳述している手法の1つ以上での精製後の着色について評価され得る。ポリペプチド含有組成物が1回以上の凍結解凍サイクルを受けた後の該組成物の着色の評価が本明細書において想定される。ポリペプチドの精製または濃縮前の該ポリペプチドを含む細胞培養液の着色の評価方法が本明細書においてさらに想定される。
また、細胞培養培地および1種類以上の他の成分、例えば細胞または所望のポリペプチド(例えば、抗体)を含む組成物も提供する。目的のポリペプチド(例えば、抗体)をコードしている核酸を含む細胞は、該ポリペプチドを本発明の細胞培養培地中に細胞培養中に分泌し得る。したがって、本発明の組成物は、該ポリペプチドを産生する細胞および該ポリペプチドが分泌される本明細書において提供する細胞培養培地を含むものであり得る。また、産生されたポリペプチドおよび本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物も想定される。本発明の一部の態様において、組成物は(a)ポリペプチドをコードしている核酸を含む細胞;および(b)本明細書において提供する細胞培養培地を含むものである。一部の態様では、組成物は(a)ポリペプチド;および(b)本明細書において提供される細胞培養培地を含むものであり、該ポリペプチドが該培地中に、該ポリペプチドをコードしている単離核酸を含む細胞によって分泌される。他の態様では、組成物は:(a)ポリペプチド;および(b)本明細書において提供される細胞培養培地を含むものであり、該ポリペプチドは培地中に、該ポリペプチドをコードしている単離核酸を含む細胞の溶解によって放出される。組成物中の細胞は、本明細書に詳述している任意の細胞(例えば、CHO細胞)であり得、組成物中の培地は、本明細書に詳述している任意の培地、例えば、表1もしくは表2に詳述している1種類以上の化合物を含む培地であり得る。同様に、組成物中のポリペプチドは、本明細書に詳述している任意のポリペプチド、例えば抗体であり得る。一部の態様において、組成物は色を有するものであってもよい。一部の実施態様では、色は、1つ以上の視感色標準の使用によって測定(「determine」、「measure」)または評価される。視感色標準は国際または国内色標準、例えば限定されないが、米薬局方の色標準およびヨーロッパ薬局方の色標準であり得る。USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927およびCouncil of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 第7版P.22を参照のこと。したがって、一部の実施態様では、(a)ポリペプチド;および(b)本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物は着色強度について評価される。さらなる一実施態様では、ポリペプチドは、着色強度の評価の前に単離および/または精製される。一部の実施態様では、(a)ポリペプチド;および(b)本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物着色強度は、最終のタンパク質組成物の着色強度を予測するために使用される。例えば、ポリペプチドおよび本明細書において提供する細胞培養培地を含む組成物は着色強度について、本明細書に記載のCOCアッセイを用いて測定される。着色強度値がB3、B4、B5、B6、B7、B8またはB9より高い場合、最終のタンパク質組成物がB3、B4、B5、B6、B7、B8またはB9より高い着色強度値を有する尤度が高い。一部の実施態様では、ポリペプチドおよび細胞培養培地を含む組成物は、着色強度の測定前に少なくとも1回の精製工程に供される。一部の実施態様では、最終のタンパク質組成物は薬学的製剤である。一部の態様において、本明細書において提供する組成物はポリペプチドを少なくとも約1mg/mL、10mg/mLもしくは25mg/mLもしくは50mg/mLもしくは75mg/mLから約100mg/mLの濃度で、または約1mg/mL、10mg/mLもしくは25mg/mLもしくは50mg/mLもしくは75mg/mLから約100mg/mLの濃度で含むものである。一部の態様において、本明細書において提供する組成物はポリペプチドを少なくとも100mg/mLもしくは125mg/mLもしくは150mg/mLの濃度で、または約100mg/mLもしくは125mg/mLもしくは150mg/mLもしくは175mg/mLもしくは200mg/mLの濃度で含むものである。
細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットを説明する。キットは、再構成される乾燥構成成分を含むものであってもよく、また、使用のための(例えば、培地へのキット構成成分の補給における使用のための)使用説明書を含めてもよい。キットは、細胞培養培地に本明細書において提供する構成成分が補給されるのに適した量で含むものであり得る。一部の態様において、キットは、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、アンセリン、ブチル化ヒドロキシアニソール、カルノシン、リポ酸およびケルシトリン水和物からなる群より選択される1種類以上の構成成分を、細胞培養培地に表1または表2に示した構成成分濃度が補給される量で含むものである。一部の実施態様では、キットは:(a)該細胞培養培地中に約2.0mMから約50.0mMのヒポタウリンがもたらされる量のヒポタウリン;(b)該細胞培養培地中に約8.0mMから約12.0mMのs−カルボキシメチルシステインがもたらされる量のs−カルボキシメチルシステイン;(c)該細胞培養培地中に約8.0mMから約12.0mMのカルノシンがもたらされる量のカルノシン;(d)該細胞培養培地中に約3.0mMから約5.0mMのアンセリンがもたらされる量のアンセリン;(e)約0.025mMから約0.040mMのブチル化ヒドロキシアニソールがもたらされる量のブチル化ヒドロキシアニソール;(f)該細胞培養培地中に約0.040mMから約0.060mMのリポ酸がもたらされる量のリポ酸;(g)該細胞培養培地中に約0.010mMから約0.020mMのケルシトリン水和物がもたらされる量のケルシトリン水和物;および(h)該細胞培養培地中に約0.0003mMから約10mMのアミノグアニジンがもたらされる量のアミノグアニジンのうちの1種類以上を含むものである。一部の態様において、キットは1種類以上の構成成分を含むものであり、該1種類以上の構成成分はヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体である。一部の実施態様では、ヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。一部の実施態様では、細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給するためのキットが少なくとも約0.0001mMの濃度のヒポタウリンまたはその類似体もしくは前駆体を備えており、該ヒポタウリンまたは類似体もしくは前駆体が、ヒポタウリン、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択される。
酸化体と反応することが報告されている化合物を、そのタンパク質含有組成物の着色を低減させる能力についてスクリーニングした(表4)。抗酸化剤のスクリーニングでは、1部の基本培地1と0.3部の流加培地2を、細胞培養条件に使用される培地の代表的な比を正確に反映して混合することにより、総量40mlの培地を調製した(表5)。培地1と培地2の混合物は、以前に、抗体産生細胞の培養に使用した場合、抗体含有溶液の着色強度を増大させることが示されており、この混合物には30種類の抗酸化剤化合物のうちの1種類を補給し、2g/LのIgG1モノクローナル抗体を入れた。試料を37℃で、250rpmで振盪しながら5日間のインキュベーション期間でインキュベートした。2つのコントロール試料:1)2g/LのIgG1モノクローナル抗体を含む培地1と培地2の混合物の40mlの試料、これは250rpmで振盪しながら37℃にて5日間、抗酸化剤なしでインキュベートした(陽性コントロール)、および2)1部の基本培地3と0.3部の流加培地4(表5)を混合することにより調製した培地混合物の40mLの試料(これは、以前に、抗体産生細胞の培養に使用した場合、抗体含有溶液の着色強度を低減させることが示された)、2g/LのIgG1モノクローナル抗体を入れ、250rpmで振盪しながら37℃にて5日間、抗酸化剤なしでインキュベートした(陰性コントロール)をスクリーニングアッセイに含めた。
細胞培養物から直接得た抗体含有組成物の着色強度を低減させるヒポタウリンの能力を評価した。この試験のため、大規模2L細胞培養物の代表であることがわかっている振盪フラスコ細胞培養モデルを使用した。簡単には、振盪フラスコ細胞培養モデルでは、抗体産生CHO細胞をおよそ1.0×106細胞/mLで、100mLの基本培地1または基本培地3を入れた250mL容フラスコ内でインキュベートした。大規模2L細胞培養物では、抗体産生CHO細胞をおよそ1.0×106細胞/mLで、1Lの基本培地1または基本培地3を入れた2リットル容撹拌バイオリアクター(Applikon,Foster City,CA)内でインキュベートした。大規模細胞増殖モデルでは、細胞をフェドバッチ様式で培養し、基本培地1中で培養する場合は100mLの流加培地2を、基本培地3中で培養する場合は100mLの流加培地4を(細胞培養液1リットルあたり)、3、6および9日目に産生期の開始のために添加した。振盪フラスコ細胞培養モデルでは、細胞をフェドバッチ様式で培養し、基本培地1中で培養する場合は10mLの流加培地2を、基本培地3中で培養する場合は10mLの流加培地4を(細胞培養液1リットルあたり)、3、6および9日目に産生期の開始のために添加した。グルコースの濃度を毎日解析し、グルコース濃度が3g/L未満に低下したら、グルコース枯渇を防ぐために、500g/Lのグルコースストック溶液から補給した。反応器に溶存酸素検量部、pHおよび温度プローブを取り付けた。溶存酸素は、空気および/または酸素のスパージングによりオンラインで制御した。大規模2L細胞培養物では、pHをCO2またはNa2CO3の添加によって制御し、必要に応じて培養物を消泡剤を添加した。細胞培養物を、0日目から3日目まではpH7.0および温度37℃に、次いで3日目以降は35℃に維持した。細胞培養物を275rpmでアジテーションし、溶存酸素レベルを空気飽和の30%にした。振盪フラスコ細胞培養物では、培養物を振盪機のプラットフォーム上に置き、37℃の温度の5%CO2インキュベータ内で150rpmで、細胞培養サイクルの0日目から3日目までアジテーションし、4日目に14日目の細胞培養サイクル終了時まで35℃に温度シフトした。オルモル濃度を、Advanced Instruments(Norwood,MA)の浸透圧計を用いてモニタリングした。また、オフラインpHおよび代謝産物濃度も毎日、Nova Bioprofile 400(Nova Biomedical,Waltham,MA)を用いて測定した。生存可能細胞密度(VCC)および細胞生存度を毎日、ViCell(登録商標)自動細胞計数器(Beckman Coulter,Fullerton,CA)を用いて測定した。1mLの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。14日目の細胞培養期間終了時、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。濃縮抗体組成物の着色強度を精製プールで、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示すアッセイを用いて測定した。VCCにより測定した増殖(図3A)および細胞生存度(図3B)は、使用した培地に関係なく大規模(2L)と振盪フラスコ(SF)細胞培養モデル間で同等であった。抗体産生は振盪フラスコ細胞培養モデルにおいてわずかに少なく、最も高い抗体産生が培地1および培地2中でインキュベートした大規模細胞培養モデルにおいて観察された(図3C)。振盪フラスコ細胞培養モデルから得られた抗体組成物の着色強度は、培地3および培地4中で培養した場合、培地1および培地2中で培養した場合の振盪フラスコ細胞培養組成物から得られた抗体組成物(2.25の値を有した)と比べて値は1.07と低かった。この実験により、振盪フラスコモデルは2L細胞培養モデルと同等であり、後続の実験における使用に適していることが確立された。
ヒポタウリン類似体を試験し、抗体含有組成物において着色低減効果を示すかどうかを評価した。抗体産生CHO細胞をおよそ1.0×106細胞/mLで、12.95mMのヒポタウリンまたは10mMのカルボキシメチルシステイン(CAS番号638−23−3)を補給した1Lの基本培地1を入れた2リットル容撹拌バイオリアクター(Applikon,Foster City,CA)内でインキュベートした。細胞をフェドバッチ様式で培養し、100mLの流加培地2(細胞培養液1リットルあたり)を3、6および9日目に産生期の開始のために添加した。細胞を培地1および2中でヒポタウリン補給なしで培養することにより陽性コントロールを含めた。グルコースの濃度を毎日解析し、グルコース濃度が2g/L未満に低下したら、グルコース枯渇を防ぐために1.5g/Lのグルコースストック溶液から補給した。反応器に溶存酸素検量部、pHおよび温度プローブを取り付けた。溶存酸素は、空気および/または酸素のスパージングによりオンラインで制御した。pHをCO2またはNa2CO3の添加によって制御し、必要に応じて培養物を消泡剤を添加した。細胞培養物を、0日目から3日目まではpH7.0および温度37℃に、次いで3日目以降は35℃に維持した。細胞培養物を275rpmでアジテーションし、溶存酸素レベルを空気飽和の30%にした。オルモル濃度を、Advanced Instruments(Norwood,MA)の浸透圧計を用いてモニタリングした。また、オフラインpHおよび代謝産物濃度も毎日、Nova Bioprofile 400(Nova Biomedical,Waltham,MA)を用いて測定した。VCCおよび細胞生存度を毎日、ViCell(登録商標)自動細胞計数器(Beckman Coulter,Fullerton,CA)を用いて測定した。1mLの細胞培養液を遠心分離することにより細胞培養液を毎日収集し、高速液体クロマトグラフィーを用いて抗体力価を測定した。14日目の細胞培養期間終了時、培養物中のタンパク質の量がおよそ2−10g/Lだった場合、すべての試料から細胞培養液を遠心分離によって収集した。収集した細胞培養液中のモノクローナル抗体を、タンパク質Aアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。タンパク質Aプールを150g/Lまで、Amicon Centricon遠心フィルターデバイス(Millipore Corporation,Billerica,MA)を用いて濃縮した。濃縮抗体組成物の着色強度を濃縮タンパク質Aプールにおいて、数値が高いほど着色強度が高いことを示し、数値が低いほど着色強度が低いことを示す2つの異なるアッセイ測定した。VCCにより測定した増殖(図7A)および細胞生存度(図7B)は試験したすべての細胞培養物間で同等であった。ヒポタウリンまたはカルボキシメチルシステインを補給した培地中で培養された細胞培養物では同等レベルの抗体力価が得られた(図8)。比色アッセイを使用し、単離した抗体組成物の着色強度は、抗体産生細胞をヒポタウリンおよびカルボキシメチルシステインを補給した培地で培養した場合、それぞれ27%および13%低減したことがわかった(図9A)。この着色強度の低減を、第2の色アッセイを使用することにより確認し、このアッセイでは、それぞれヒポタウリンおよびカルボキシメチルシステインを補給した培地中で培養した細胞から単離した抗体組成物においておよそ17%および13%の着色強度の低減が検出された(図9B)。
抗体組成物において低減させ、細胞培養条件下で奏功する化合物を同定するため、無細胞培地においてスクリーニングアッセイを行なった。タウリン、カルノシンおよびアミノグアニジンをスクリーニングに選択した。これらの化合物を25mLの培養培地に1.2g/L(タウリン)、13.6g/L(カルノシン)および27.2g/L(アミノグアニジン塩酸塩)の濃度で溶解させた。6.8から7.2の範囲にpH調整し、Steriflipフィルターユニット(Millipore,Billerica,MA)で滅菌濾過した後、溶液を、TubeSpinキャップ(TPP Techno Plastic Products AG,Trasadingen,Switzerland)を備えた50mL容Falconチューブ(BD Biosciences,San Jose,CA)内でインキュベートした。CHO細胞を、湿度制御された37℃の細胞培養インキュベータ内で250rpmにて、光からの保護なしで7日間インキュベートし、モノクローナル抗体を産生させた。
Claims (26)
- 抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞の培養方法であって、細胞をヒポタウリンを含む細胞培養培地と接触させる工程を含み、ヒポタウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンを含まない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度と比べて低減される方法。
- 抗体またはその断片の産生方法であって、抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞を、ヒポタウリンを含む細胞培養培地中で培養する工程を含み、ヒポタウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンを含まない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度と比べて低減される方法。
- ヒポタウリンを含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンを含まない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物と比べて少なくとも0.1%、または5%から50%低減される、請求項1または2に記載の方法。
- 細胞培養培地がヒポタウリンを少なくとも0.0001mMの濃度、または0.0001mMから500.0mMの濃度、または1.0mMから40.0mMの濃度、または1.0mMから10.0mMの濃度で含む、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 細胞培養培地が、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択されるヒポタウリンの類似体もしくは前駆体をさらに含む、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞の培養方法であって、細胞を細胞培養培地と接触させる工程を含み、細胞培養培地が、ヒポタウリンおよび成分(a)−(g):
(a)s−カルボキシメチルシステイン;
(b)カルノシン;
(c)アンセリン;
(d)ブチル化ヒドロキシアニソール;
(e)リポ酸;
(f)ケルシトリン水和物;および
(g)アミノグアニジン
のうちの1種類以上を含むものであり;
ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物と比べて低減される、方法。 - 抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞を細胞培養培地中で培養する工程を含む抗体またはその断片の産生方法であって、細胞培養培地が、ヒポタウリンおよび成分(a)−(g):
(a)s−カルボキシメチルシステイン;
(b)カルノシン;
(c)アンセリン;
(d)ブチル化ヒドロキシアニソール;
(e)リポ酸;
(f)ケルシトリン水和物;および
(g)アミノグアニジン
のうちの1種類以上を含み;
ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物と比べて低減される、方法。 - ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含む細胞培養培地により、細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物の着色強度が、ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含むものでない細胞培養培地中で培養された細胞によって産生された抗体またはその断片を含む組成物と比べて少なくとも0.1%、または5%から75%低減される、請求項6または7に記載の方法。
- ヒポタウリンおよび成分(a)−(g)のうちの1種類以上を含む細胞培養培地が:
少なくとも0.0001mMからの濃度の、または2.0mMから50mMの濃度のヒポタウリン、または
以下から選択される量の1種類以上の成分(a)−(g):
(a)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または8.0mMから12mMの濃度のs−カルボキシメチルシステイン;
(b)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または8.0mMから12.0mMの濃度のカルノシン;
(c)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または3.0mMから5.0mMの濃度のアンセリン;
(d)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または0.025mMから0.040mMの濃度のブチル化ヒドロキシアニソール;
(e)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または0.040mMから0.060mMの濃度のリポ酸;
(f)少なくとも0.0001mMからの濃度の、または0.010mMから0.020mMの濃度のケルシトリン水和物;および
(g)少なくとも0.0003mMからの濃度の、または0.0003mMから10mMの濃度のアミノグアニジン
を含む、請求項6から8の何れか一項に記載の方法。 - 細胞培養培地が、既知組成の細胞培養培地、未知組成の細胞培養培地、細胞培養基本培地、または細胞培養流加培地である、請求項1から9の何れか一項に記載の方法。
- 細胞が、細胞培養培地と細胞の増殖期、または細胞の産生期に接触させられる、請求項1から10の何れか一項に記載の方法。
- ヒポタウリンが、細胞培養培地に細胞培養サイクルの間の少なくとも1日に添加されるか、または14日間の細胞培養サイクルの0日目に添加される、請求項1から11の何れか一項に記載の方法。
- 細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1から12の何れか一項に記載の方法。
- 細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1から13の何れか一項に記載の方法。
- 抗体がIgG1抗体である、請求項1から14の何れか一項に記載の方法。
- 抗体が、細胞培養培地中に分泌される、請求項1から15の何れか一項に記載の方法。
- 抗体またはその断片を、細胞培養培地から回収する工程をさらに含む、請求項1から16の何れか一項に記載の方法。
- 回収される抗体またはその断片を含む組成物が液状組成物または非液状組成物である、請求項17に記載の方法。
- 回収される抗体またはその断片を含む組成物が無色またはわずかに着色した液体に見える、請求項18に記載の方法。
- 細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給し且つ請求項1から19の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、少なくとも0.0001mMの濃度のヒポタウリンを含み、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択されるヒポタウリンの類似体もしくは前駆体をさらに含んでもよい、キット。
- 細胞培養培地に既知組成の構成成分を補給し且つ請求項1から19の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、ヒポタウリンを含み、:
(a)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのヒポタウリンがもたらされる量のヒポタウリン;
(b)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのs−カルボキシメチルシステインがもたらされる量のs−カルボキシメチルシステイン;
(c)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのカルノシンがもたらされる量のカルノシン;
(d)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのアンセリンがもたらされる量のアンセリン;
(e)少なくとも0.0001mMからのブチル化ヒドロキシアニソールがもたらされる量のブチル化ヒドロキシアニソール;
(f)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのリポ酸がもたらされる量のリポ酸;
(g)細胞培養培地中に少なくとも0.0001mMからのケルシトリン水和物がもたらされる量のケルシトリン水和物;および
(h)細胞培養培地中に少なくとも0.0003mMからのアミノグアニジンがもたらされる量のアミノグアニジン
のうちの1種類以上を含む、キット。 - 請求項1から19の何れか一項に記載の方法を実施するための細胞培養培地であって、少なくとも0.0001mMからのヒポタウリンを含み、s−カルボキシメチルシステイン、システアミン、システインスルフィン酸およびタウリンからなる群より選択されるヒポタウリンの類似体もしくは前駆体をさらに含んでもよい、細胞培養培地。
- 請求項1から19の何れか一項に記載の方法を実施するための細胞培養培地であって、少なくとも0.0001mMからのヒポタウリンを含み、
成分(a)−(g):
(a)少なくとも0.0001mMからのs−カルボキシメチルシステイン;
(b)少なくとも0.0001mMからのカルノシン;
(c)少なくとも0.0001mMからのアンセリン;
(d)少なくとも0.0001mMからのブチル化ヒドロキシアニソール;
(e)少なくとも0.0001mMからのリポ酸;
(f)少なくとも0.0001mMからのケルシトリン水和物;および
(g)少なくとも0.0003mMからのアミノグアニジン
のうちの1種類以上をさらに含んでもよい、細胞培養培地。 - (a)抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞;および(b)請求項22または23に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
- (a)抗体またはその断片;および(b)請求項22または23に記載の細胞培養培地を含む、組成物。
- 抗体またはその断片が細胞培養培地中に、抗体またはその断片をコードしている核酸を含む細胞によって分泌される、請求項24または25に記載の組成物。
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