JP6660932B2 - L−fabpの免疫学的測定方法及び該方法に用いられる測定試薬 - Google Patents
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Description
本発明の課題は、既存の体外診断用医薬品と同等以上の検出感度を持ち、かつ良好な相関性を有する、抗L−FABP抗体を用いた試料中のL−FABPの免疫学的測定方法を提供することである。また、別の本発明の課題は、抗L−FABP抗体を用いた試料中のL−FABPの免疫学的測定方法に用いる試薬、キットを提供することである。
試料中のL−FABP(肝臓型脂肪酸結合蛋白質)を抗L−FABP抗体により検出する方法であって、抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程を含む前記方法。
[2]
分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物が、下記式(1)で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式(2)で表される化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である[1]に記載の方法。
式(1)
式(2)
R15は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が1、2、又は3のアルキル基であり、
X11は、窒素原子又は硫黄原子であり、
X12及びX13は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1であり、
X11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記l1、l2、m1、m2及びnの値並びにX11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線の結合は、X11〜X13の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す]の化合物又はその塩。
[3]
式(2)で表される化合物又はその塩が、以下の化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である[2]に記載の方法。
式(2)
R15は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が1、2、又は3のアルキル基を示す]において、
X11〜X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1を表す)及び二重破線の組み合わせは、
(a)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは0であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(b)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(c)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは1であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(d)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(e)X11及びX12は窒素原子、X13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は二重結合、X12とX13との間の二重破線は単結合であるか、又は、
(f)X11及びX12及びX13は窒素原子であり、l1+l2は0、m1+m2は0、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩。
[4]
抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程が、前記化合物とL−FABPの存在が疑われる試料とを接触させる工程の後、抗L−FABP抗体と接触させる工程の順で行われる[1]に記載の方法。
[5]
抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程における、前記化合物の濃度が、300mmol/L〜500mmol/Lである[1] 〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
抗L−FABP抗体が、不溶性担体に固定化されている、[1] 〜[5]のいずれかに記載の方法。
[7]
不溶性担体が、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、多孔性メンブレン又は合成高分子化合物よりなるイムノプレートである[6]に記載の方法。
[8]
粒子免疫凝集測定法を利用する、[7]に記載の方法。
[9]
ラテラルフロー式又はフロースルー式のイムノクロマトグラフィーを利用する、[7]に記載の方法。
[10]
抗L−FABP抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法によりL−FABPを検出する、[10]に記載の方法。
[12]
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体の、一方のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、他方のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、イムノクロマトグラフィー、ELISA又は化学発光検出法によりL−FABPを検出する、[10]に記載の方法。
[13]
試料が、尿、全血、血清又は血漿である、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]
試料中のL−FABPを、抗L−FABP抗体により検出するための試薬であって、抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む前記試薬。
[15]
試料中のL−FABPを抗L−FABP抗体により検出するための前処理方法であって、分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程を含む前記前処理方法。
[16]
試料中のL−FABPを、抗L−FABP抗体により検出するための前処理試薬であって、分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む前記前処理試薬。
[17]
試料中のL−FABP(肝臓型脂肪酸結合蛋白質)を抗L−FABP抗体により検出する方法における、測定感度を向上させる方法であって、抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程を含む前記方法。
[18]
分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物が、下記式(1)で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式(2)で表される化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である[17]に記載の方法。
式(1)
式(2)
R15は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が1、2、又は3のアルキル基であり、
X11は、窒素原子又は硫黄原子であり、
X12及びX13は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1であり、
X11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記l1、l2、m1、m2及びnの値並びにX11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線の結合は、X11〜X13の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す]の化合物又はその塩。
[19]
式(2)で表される化合物又はその塩が、以下の化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である[18]に記載の方法。
式(2)
X11〜X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1を表す)及び二重破線の組み合わせは、
(a)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは0であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(b)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(c)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは1であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(d)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(e)X11及びX12は窒素原子、X13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は二重結合、X12とX13との間の二重破線は単結合であるか、又は、
(f)X11及びX12及びX13は窒素原子であり、l1+l2は0、m1+m2は0、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩。
[20]
抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程が、前記化合物とL−FABPの存在が疑われる試料を接触させる工程の後、抗L−FABP抗体と接触させる工程の順で行われる[17]に記載の方法。
[21]
抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程における、前記化合物の濃度が、300mmol/L〜500mmol/Lである[17] 〜[20]のいずれかに記載の方法。
[22]
抗L−FABP抗体が、不溶性担体に固定化されている、[17] 〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23]
不溶性担体が、ラテックス粒子、金属コロイド粒子、多孔性メンブレン又は合成高分子化合物よりなるイムノプレートである[22]に記載の方法。
[24]
粒子免疫凝集測定法を利用する、[23]に記載の方法。
[25]
ラテラルフロー式又はフロースルー式のイムノクロマトグラフィーを利用する、[23]に記載の方法。
[26]
抗L−FABP抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、[17]〜[25]のいずれかに記載の方法。
[27]
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法によりL−FABPを検出する、[26]に記載の方法。
[28]
互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体の、一方のモノクローナル抗体は標識物質で標識されており、他方のモノクローナル抗体は固相に固定化されており、イムノクロマトグラフィー、ELISA又は化学発光検出法によりL−FABPを検出する、[26]に記載の方法。
[29]
試料が、尿、全血、血清又は血漿である、[17]〜[28]のいずれかに記載の方法。
[30]
試料中のL−FABPを、抗L−FABP抗体により検出するための試薬における、測定感度を向上させるための試薬であって、抗L−FABP抗体、及び分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む前記試薬。
[31]
試料中のL−FABPを抗L−FABP抗体により検出するための方法における、測定感度を向上させるための前処理方法であって、分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程を含む前記前処理方法。
[32]
試料中のL−FABPを、抗L−FABP抗体により検出するための試薬における、測定感度を向上させるための前処理試薬であって、分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む前記前処理試薬。
本発明に用いる試料としては、尿、血液(全血、血漿又は血清)、腎組織、腎組織からの抽出液等が挙げられる。これらのうち、特に尿が好適な試料である。L−FABPの存在が疑われる試料であれば、健常者由来の試料、患者由来の試料、罹病を疑われる者由来の試料等、いずれの試料も用いることができる。
本発明に用いる抗L−FABP抗体は、臓器、細胞、体液等から精製した天然のL−FABPを免疫原(抗原)として調製することができる。L−FABPは、主に肝臓又は腎臓に分布しているので、それらの臓器等から精製、単離することができる。また、L−FABPは、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ラット間でホモロジーが高く、アミノ酸レベルで90%以上のホモロジーがあることが知られているので、ヒトのL−FABPと結合する抗体を得るために、例えばマウスL−FABPを抗原として用いることもできる。
本発明の抗L−FABP抗体を用いたL−FABPを検出する方法は、免疫学的測定法である。より具体的には、ラテックス免疫比濁法(LTIA)等の粒子免疫凝集測定法、ELISA、化学発光検出法、イムノクロマトグラフィー(ラテラルフロー式、フロースルー式)が挙げられるが、これらの例に限定されない。なかでも、B/F分離のための工程を含まない免疫学的測定法(ホモジニアス免疫測定法)がより好ましい。
なお、本明細書において測定方法としてLTIAを記述する場合、その検出方法は、透過光(吸光度)の変化の測定、散乱光の変化の測定、粒子径の変化の測定等、公知の検出方法のいずれを用いても差し支えないものとして記述している。
また、本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物と接触した試料を用いて抗L−FABP抗体を用いた免疫学的測定を行う限り、免疫組織染色法、電気泳動法(ウエスタンブロット等)、ドット・ブロッティング法等においても本発明が適用可能であることは、当業者には容易に理解されうる。
さらに、「検出」又は「測定」という用語は、L−FABPの存在の証明及び/又は定量等を含めて最も広義に解釈する必要があり、限定的に解釈してはならない。
本発明で使用する不溶性担体としては、ポリスチレン樹脂等の高分子基材、ガラス等の無機基材、セルロースやアガロース等の多糖類基材等からなる不溶性担体を用いることができ、その形状は特に限定されず、ビーズあるいは粒子状(例えば、ラテックス粒子、金属コロイド粒子)、板あるいはシート状(例えば、多孔性メンブレン、イムノプレート)、筒状(例えば、試験管)等、採用する測定法に応じた任意の形状を選択できる。
担体粒子の粒子径としては、0.15〜0.45μm程度が好ましく、より好ましくは、0.2〜0.4μmである。また、平均粒子径の異なる二種類以上の担体粒子を組み合わせて用いることもできる。
抗L−FABP抗体を不溶性担体上に固定化する方法としては特に制限はなく、公知の方法を使用することができる。
抗L−FABP抗体を粒子上に固定化する場合、例えば、粒子と抗体を混合することによりおこる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジイミド等のカップリング剤により、粒子表面のカルボキシ基やアミノ基と抗体分子を化学的に結合させる化学結合法が用いられる。また、抗体分子はスペーサー分子を介して粒子に固定化させてもよい。さらに、アルブミン等の他のタンパク質に化学結合法を用いて抗体を結合させた後に、そのタンパク質を粒子に物理的あるいは化学的に固定化してもよい。
また、抗L−FABP抗体を多孔性メンブレン上に固定化する場合、例えば、抗体を含む溶液を一定量、ライン状、点あるいは、+等の特定のシンボル状に、多孔性メンブレンに塗布することで固定化できる。
抗体を標識するための標識物質としては、例えば酵素、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン、アビジン、放射性同位体、金コロイド粒子、又は着色ラテックス粒子等が挙げられる。また標識物質と抗体との結合方法としては、当業者に利用可能なグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、又は過ヨウ素酸法等の方法を用いることができる。標識物質、結合方法のいずれも、上記に限定されることなく公知の方法を用いることができる。
標識の検出は、例えば、パーオキシダーゼやアルカリホスファターゼ等の酵素を標識物質として用いる場合には、その酵素の特異的基質(酵素が西洋ワサビパーオキシダーゼの場合には、例えば1,2-フェニレンジアミンあるいは3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン、アルカリホスファターゼの場合には、p-ニトロフェニルホスフェート等)を用いて酵素活性を測定することができ、ビオチンを標識物質として用いる場合には少なくともビオチン以外の標識物質で標識されたアビジンを反応させるのが一般的である。
本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物は、式(1)及び式(2)で表される化合物である(本明細書において、「式(1)の化合物」、「式(2)の化合物」ということがある)。
X11は、窒素原子又は硫黄原子であり、
X12及びX13は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1であり、
X11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記l1、l2、m1、m2及びnの値並びにX11とX13との間の二重破線及びX12とX13との間の二重破線の結合は、X11〜X13の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す]の化合物又はその塩である。
X11〜X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1を表す)及び二重破線の組み合わせは、
(a)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは0であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(b)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(c)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは1であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(d)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(e)X11及びX12は窒素原子、X13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は二重結合、X12とX13との間の二重破線は単結合であるか、又は、
(f)X11及びX12及びX13は窒素原子であり、l1+l2は0、m1+m2は0、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合、である化合物又はその塩である。
さらに詳しい式(1)の化合物としては、ベンズアミジン塩酸塩(CAS番号:1670-14-0)、ベンズアミジン塩酸塩水和物(CAS番号:206752-36-5)、4-フルオロベンズアミドオキシム(CAS番号:69113-32-2)、4-クロロベンズアミジン塩酸塩(CAS番号:14401-51-5)が挙げられる。さらに詳しい式(2)の化合物としては、アミノチアゾリン(CAS番号:1779-81-3)、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩(CAS番号:3882-98-2)、プソイドチオヒダントイン(CAS番号:556-90-1)、2-アミノ-5-ブロモチアゾール臭化水素酸塩(CAS番号:61296-22-8)、2-アミノ-4,5-ジメチルチアゾール臭化水素酸塩(CAS番号:7170-76-5)、2,4-ジアミノ-5-フェニルチアゾール一臭化水素酸塩(CAS番号:6020-54-8)、クレアチニン(CAS番号:60-27-5)が挙げられる。これらの中でも、ベンズアミジン塩酸塩、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩、クレアチニンが特に好ましい。また、これらの分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物は、単独で用いてもよいし、二種以上を組み合わせて用いることもできる。
本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、試料中のL−FABPと接触させる方法としては、例えば本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含有する液状の試薬と試料とを混合する方法を挙げることができる。また、別の方法としては、本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を浸潤させた多孔性メンブレン等の不溶性担体に、試料を供給することによって接触させる方法を挙げることができる。
さらに試料中のL−FABPは、本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物と接触した後、又は接触と同時に、不溶性担体に固定化された抗L−FABP抗体と公知の適宜な方法により接触させる。
また、本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を試料と接触させる方法としては、試料の希釈液、試料の抽出液、あるいは試料の保存液、展開液などとして接触させる方法も含まれる。さらに、採尿、採血など試料の収集時に、採尿カップ、採血管などの試料収集の容器中で、必要により酵素活性阻害剤や高凝固剤などと一緒に試料と接触させる方法も含まれる。
本発明により提供される、本発明の分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物以外の、測定キットの構成物は、L−FABPを免疫学的に測定できることを限度として、特に限定されるものではない。以下、サンドイッチELISA、イムノクロマトグラフィー及びLTIAを例にそれぞれを説明する。
サンドイッチELISAの場合、測定用キットは少なくとも、(a)本発明の抗L−FABP抗体を固定化した不溶性担体及び(b)標識物質で標識され、L−FABPと反応する性質を有する抗体、を含む。この場合、不溶性担体はプレート(イムノプレート)が好ましく、標識物質は、適宜選択して使用できる。
一般的なイムノクロマトグラフィーでは、多孔性メンブレン等のシート状の不溶性担体上に、試料を含む溶液の展開方向に順に「1.試料供給部位」、「2.標識抗体を保持する部位(標識抗体保持部位)」、「3.標識抗体とL−FABP抗体により形成された複合体を捕捉するための抗体を固定化する部位(捕捉抗体部位)」を具備した試験片が使用され、試料溶液が毛細管現象により連続的に移動するように構成されている。イムノクロマトグラフィーでは、測定用キットは、上記のような試験片を少なくとも含む。
ラテックス免疫凝集測定法では、測定用キットは少なくとも抗体が固定化されたラテックス粒子を含む。ラテックス免疫凝集測定法に使用される抗体としては、「抗原に対する認識部位が異なる二種類のモノクローナル抗体」、「ポリクローナル抗体」、又は「モノクローナル抗体とポリクローナル抗体」のいずれの組合せも用いることが出来る。この場合、ラテックス粒子は、抗体を固定化する不溶性担体であると同時に、標識物質である。
(1)CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗L−FABP抗体 CloneL(シミックホールディングス社製)を0.36mg/mL含む20mmol/LTris緩衝液(pH8.5)13mLに、平均粒径0.27μmの1%ラテックス粒子(積水化学工業社製)懸濁液13mLを加え、4℃にて2時間撹拌した。これに、0.5%BSAを含む20mmol/LTris緩衝液(pH8.5)13mLを加え、4℃で1時間撹拌した。その後、5mmol/LMOPS緩衝液(pH7.0)に透析して、CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
(2)Clone2抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗L−FABP抗体 Clone2(シミックホールディングス社製)を0.54mg/mL含む20mmol/Lグリシン緩衝液(pH9.5)8mLに、平均粒径0.25μmの1%ラテックス粒子(積水化学工業社製)懸濁液8mLを加え、4℃にて2時間撹拌した。これに、0.5%BSAを含む20mmol/Lグリシン緩衝液(pH9.5)8mLを加え、4℃で1時間撹拌した。その後、5mmol/LMOPS緩衝液(pH7.0)に透析してClone2抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
L−FABP標準物質は、特許文献1の記載に従い、遺伝子組換えにより得た。
ELISAによる体外診断用医薬品(レナプロ(登録商標)L−FABPテスト TMB)を基準方法とした。
100mmol/L リン酸緩衝液(pH7.0)
300mmol/L NaCl
0.2% BSA
0.4% Lipidure−BL103
(第二試薬)
5mmol/L MOPS緩衝液(pH7.0)
2.5Abs/mL CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液(注)
2.5Abs/mL Clone2抗体固定化ラテックス粒子懸濁液(注)
(注)Absは280nmにおける吸光度を示す。
(標準液)
L−FABP標準物質を、標準物質希釈液を用いて所望濃度に調整し、標準液とした。
(凍結融解尿)
採取後、−30℃で凍結保存されていた部分尿を、一度だけ融解して測定に使用した。
(健常血清)
体内でのL−FABPの変動を懸念される既往歴がなく、現に尿中L−FABP濃度が基準範囲内であるボランティア50人より採血して得た血清をプールし健常血清とした。当該健常血清は、採血及びプール当日に使用した。参考までに基準方法を用いて測定した健常血清中L−FABPの濃度は3ng/mL未満であった。
(1)分析装置:日立7170型自動分析装置(日立ハイテクノロジーズ社製)
(2)試料量及び試薬量:試料3μL、第一試薬150μL、第二試薬50μL
(3)反応時間(反応温度):第一試薬5分(37℃)、第二試薬5分(37℃)
(4)測光ポイント及び測光対象:第二試薬添加直後と添加5分後の間の吸光度変化量
従来技術によるLTIA(対照例A)、基準方法の前処理液を用いたLTIA(比較例1)及び式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)を用いたLTIA(実施例1)を比較した。
1.操作
(1)実施例1
標準液を試料として、500mmol/L 式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(2)対照例A
標準液を試料として、対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(3)比較例1
基準方法の前処理液と2倍濃厚標準物質希釈液を、1容量対1容量の割合で混合して得た溶液を使用して、標準物質を所望濃度に希釈調整し、比較例1用試料とした。比較例1用試料を試料として、対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
実施例1、対照例A、及び比較例1、それぞれの試験において測定された各試料の吸光度から、各試験において測定されたL−FABP0ng/mL試料の吸光度(ブランク吸光度)を差し引いて正味吸光度を算出した。L−FABP濃度をx軸、正味吸光度をy軸とする検量線を図1に示した。
一方、式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)を含有する対照第一試薬を用いた実施例1の条件で測定した場合(−△−)、いずれのL−FABP濃度においても、対照例A(−◆−)の正味吸光度を上回り、かつ濃度依存的な正味吸光度の増加が観察された。これより、式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)のLTIAにおける増感効果が確認された。
式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)及び式(2)の化合物(2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩)と共通の部分構造(NH2−C=N−)を有するが環状構造を有さない化合物を参考例の化合物として用い、LTIAに及ぼす効果を確認した。
1.操作
(1)実施例2a、実施例2b
凍結融解尿21例(L−FABP濃度:6ng/mL〜365ng/mL)を試料として、500mmol/L ベンズアミジン塩酸塩を含有する対照第一試薬(実施例2a)又は500mmol/L 2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩を含有する対照第一試薬(実施例2b)、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(2)対照例B
上記凍結融解尿を試料として、対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(3)参考例2a
上記凍結融解尿を試料として、500mmol/L グアニジン塩酸塩を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(4)参考例2b
上記凍結融解尿を試料として、500mmol/L グアニジンスルファミン酸塩を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
(5)参考例2c
上記凍結融解尿を試料として、500mmol/L アミノグアニジン塩酸塩を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
実施例2a、2b、対照例B、参考例2a〜2c、それぞれの試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてL−FABP濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のL−FABP濃度(基準測定値)をx軸、それぞれの試験より求められたL−FABP濃度(試験測定値)をy軸として、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表1に示した。
また、参考例2a〜2cにおける測定値と基準測定値との相関関係は、対照例Bを上回ったものの実施例2a、実施例2bを下回った。これより、式(1)の化合物及び式(2)の化合物の効果は、参考例の化合物と共通の部分構造(NH2−C=N−)に加え、式(1)及び式(2)の化合物が有する環状構造が関与している可能性が示唆された。
式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩:BA)の好適な濃度を検討した。
1.操作
(1)実施例3
凍結融解尿12例(L−FABP濃度:6ng/mL〜130ng/mL)を試料として、表2記載の濃度で式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩:BAH)を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
実施例3において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてL−FABP濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のL−FABP濃度(基準測定値)をx軸、それぞれの試験より求められたL−FABP濃度(試験測定値)をy軸として、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表2に示した。
1.操作
添加L−FABP濃度が表3に示す濃度となるよう、2倍濃厚標準物質希釈液と健常血清を用いてL−FABP標準物質を希釈して、添加回収試験試料を調製した。なお、前記試料中の健常血清の最終濃度は当初濃度の1/2である。
500mmol/L ベンズアミジン塩酸塩を含有する対照第一試薬、第二試薬を用いて、上記試料のL−FABPの測定を行った。得られた測定値より回収率を求めた。
各L−FABP濃度における回収率を表3に示した。
(1)CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗L−FABP抗体 CloneL(シミックホールディングス社製)を0.36mg/mL含む20mmol/LTris緩衝液(pH8.5)13mLに、平均粒径0.27μmの1%ラテックス粒子(積水化学工業社製)懸濁液13mLを加え、4℃にて2時間撹拌した。これに、0.5%BSAを含む20mmol/LTris緩衝液(pH8.5)13mLを加え、4℃で1時間撹拌した。その後、5mmol/LMOPS緩衝液(pH7.0)に透析して、CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
(2)Clone1抗体固定化ラテックス粒子懸濁液の調製
抗L−FABP抗体 Clone1(シミックホールディングス社製)を0.54mg/mL含む5mmol/Lトリス緩衝液(pH7.5)8mLに、平均粒径0.25μmの1%ラテックス粒子(積水化学工業社製)懸濁液8mLを加え、4℃にて2時間撹拌した。これに、0.5%BSAを含む5mmol/Lトリス緩衝液(pH7.5)8mLを加え、4℃で1時間撹拌した。その後、5mmol/LMOPS緩衝液(pH7.0)に透析してClone1抗体固定化ラテックス粒子懸濁液を得た。
L−FABP標準物質は、特許文献1の記載に従い、遺伝子組換えにより得た。
ELISAによる体外診断用医薬品(レナプロ(登録商標)L−FABPテスト TMB)を基準方法とした。
300mmol/L KCl
0.2% BPF(東洋紡社製、カタログ番号BPF−301)
0.32〜0.68% Lipidure−BL403SE
(第二試薬)
5mmol/L MOPS緩衝液(pH7.0)
3.75Abs/mL CloneL抗体固定化ラテックス粒子懸濁液(注)
1.25Abs/mL Clone1抗体固定化ラテックス粒子懸濁液(注)
(注)Absは280nmにおける吸光度を示す。
(標準物質希釈液)
リン酸緩衝液(pH7.0)
0.1% BPF(東洋紡社製、カタログ番号BPF−301)
(標準液)
L−FABP標準物質を、標準物質希釈液を用いて所望濃度に調整し、標準液とした。
(凍結融解尿)
採取後、−30℃で凍結保存されていた部分尿を、一度だけ融解して測定に使用した。
(1)分析装置:日立7170型自動分析装置(日立ハイテクノロジーズ社製)
(2)試料量及び試薬量:試料3μL、第一試薬150μL、第二試薬50μL
(3)反応時間(反応温度):第一試薬5分(37℃)、第二試薬5分(37℃)
(4)測光ポイント及び測光対象:第二試薬添加直後と添加5分後の間の吸光度変化量
(5)測定波長570nm/800nm
式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩)及び式(2)の化合物(2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩及びクレアチニン)を用い、LTIAに及ぼす効果を確認した。
1.操作
(1)実施例5a、5b、5c
凍結融解尿34例(L−FABP濃度:0.6ng/mL〜123.0ng/mL)を試料として、表4記載の濃度のベンズアミジン塩酸塩(構造式:表5中の5a、実施例5a)、2-アミノ-2-チアゾリン塩酸塩(構造式:表5中の5b、実施例5b)又はクレアチニン(構造式:表5中の5c、実施例5c)を含有する対照第一試薬、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。
実施例5a、5b、5cそれぞれの試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてL−FABP濃度に換算した。基準方法を用いて求めた各試料のL−FABP濃度(基準測定値)をx軸、それぞれの試験より求められたL−FABP濃度(試験測定値)をy軸として、基準測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表4に示した。
基準方法であるレナプロ(登録商標)L−FABPテスト TMBの添付文書には、試料である尿を採取後、試料を保存する場合には、冷蔵又は凍結(−20〜−80℃)とする旨が記載されている。
臨床の場においては、試料を採取後、直ちに測定をできないことがある。適切ではない試料の保存は、予期せぬ測定値の変動を招くことがある。本発明の試薬を用いて、室温にて24時間保存された試料(尿)の測定を行った。
1.操作
(1)実施例6、比較例2
凍結融解尿23例(L−FABP濃度:0.3ng/mL〜111.9ng/mL)を試料として、表6記載の濃度の式(1)の化合物(ベンズアミジン塩酸塩:BAH)を含有する対照第一試薬(実施例6、比較例2)、及び第二試薬を用いて試料中のL−FABPの測定を行った。参考例として基準方法の添付文書に記載された条件(冷蔵保存24時間)で保存した試料についても同様の試薬を用いてL−FABPの測定を行った。
2、結果
実施例6、比較例2、参考例それぞれの試験において測定された各試料の正味吸光度を、標準液を試料として作成した検量線を用いてL−FABP濃度に換算した。保存0時間の試料を用いて求めた各試料のL−FABP濃度(0時間測定値)をx軸、それぞれの試験より求められたL−FABP濃度(試験測定値)をy軸として、0時間測定値に対する各試験測定値の相関関係を最少二乗法により検討し、表6に示した。
また、本発明の化合物は試料の保存液として使用することが可能であることも示された。
Claims (8)
- 以下の工程を含む、粒子凝集測定法を利用して、試料中のL−FABP(肝臓型脂肪酸結合蛋白質)を抗L−FABP抗体により検出する方法:
L−FABPの存在が疑われる試料に、分子内にNH 2 −C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む第一試薬を接触させ、その後、当該試料に、不溶性担体粒子に固定化されている抗L−FABP抗体を含む第二試薬を接触させる工程;
ここで、分子内にNH 2 −C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物は、下記式(1)で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式(2)で表される化合物又はその塩から選ばれる;
式(1)
式(2)
X 11 は、窒素原子又は硫黄原子であり、
X 12 及びX 13 は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1であり、
X 11 とX 13 との間の二重破線及びX 12 とX 13 との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記l1、l2、m1、m2及びnの値並びにX 11 とX 13 との間の二重破線及びX 12 とX 13 との間の二重破線の結合は、X 11 〜X 13 の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す]。 - 式(2)で表される化合物又はその塩が、以下の化合物又はその塩から選ばれる、一種又は二種以上である請求項1に記載の方法;
式(2)
R15は、水素原子、ハロゲン原子又は分岐していてもよい炭素数が1、2、又は3のアルキル基を示す]において、
X11〜X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1を表す)及び二重破線の組み合わせは、
(a)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは0であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(b)X11は硫黄原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(c)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は2、m1+m2は2、nは1であり、X11とX13との間及びX12とX13との間の二重破線は単結合であるか、
(d)X11は窒素原子、X12及びX13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合であるか、
(e)X11及びX12は窒素原子、X13は炭素原子であり、l1+l2は1、m1+m2は1、nは0であり、X11とX13との間の二重破線は二重結合、X12とX13との間の二重破線は単結合であるか、又は、
(f)X11及びX12及びX13は窒素原子であり、l1+l2は0、m1+m2は0、nは1であり、X11とX13との間の二重破線は単結合、X12とX13との間の二重破線は二重結合、である。 - 抗L−FABP抗体、及び分子内にNH 2 −C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を、L−FABPの存在が疑われる試料と接触させる工程における、前記化合物の濃度が、300mmol/L〜500mmol/Lである請求項1又は2に記載の方法。
- 不溶性担体粒子が、ラテックス粒子又は金属コロイド粒子である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 抗L−FABP抗体が、互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 互いに認識部位が異なる二種以上のモノクローナル抗体が、ラテックス粒子にそれぞれ固定化されており、ラテックス免疫比濁法によりL−FABPを検出する、請求項5に記載の方法。
- 試料が、尿、全血、血清又は血漿である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 粒子凝集測定法を利用して、試料中のL−FABPを抗L−FABP抗体により検出するための試薬であって、分子内にNH2−C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物を含む第一試薬と、不溶性担体粒子に固定化されている抗L−FABP抗体を含む第二試薬とを含む、前記試薬;
ここで、分子内にNH 2 −C=N−の部分構造と環状構造とを有する化合物は、下記式(1)で表される化合物もしくはその塩又はエステル、下記式(2)で表される化合物又はその塩から選ばれる;
式(1)
式(2)
X 11 は、窒素原子又は硫黄原子であり、
X 12 及びX 13 は、それぞれ独立して、炭素原子又は窒素原子であり、
l1、l2、m1、m2及びnは、それぞれ独立して、0又は1であり、
X 11 とX 13 との間の二重破線及びX 12 とX 13 との間の二重破線は、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、ここで、
上記l1、l2、m1、m2及びnの値並びにX 11 とX 13 との間の二重破線及びX 12 とX 13 との間の二重破線の結合は、X 11 〜X 13 の原子価に応じて適宜定まる値及び結合を示す]。
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