JP6091158B2 - 尿を変性剤で前処理することによる免疫測定系の感度を上げる方法 - Google Patents
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Description
[1] 尿検体中のタンパク質を測定する免疫測定方法であって、変性剤を尿検体に混合することにより尿検体を前処理して免疫測定を行い、前記タンパク質の測定感度を向上させる、免疫測定方法。
[2] タンパク質が尿中濃度が低いタンパク質である、[1]の免疫測定方法。
[3] 変性剤が還元剤である、[1]又は[2]の免疫測定方法。
[4] 尿検体中に還元剤を0.0127〜64mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[3]の免疫測定方法。
[5] 還元剤がグルタチオンである、[3]又は[4]の免疫測定方法。
[6] 尿検体中にグルタチオンを0.0127〜13mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[5]の免疫測定方法。
[7] 還元剤がシステインである、[3]又は[4]の免疫測定方法。
[8] 尿検体中にシステインを0.0625〜16mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[7]の免疫測定方法。
[9] 還元剤がペニシラミンである、[3]又は[4]の免疫測定方法。
[10] 尿検体中にペニシラミンを0.0625〜64mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[9]の免疫測定方法。
[11] 2種類の変性剤を組み合わせて前処理を行なう、[1]又は[2]の免疫測定方法。
[12] 変性剤の組合せが還元剤とカオトロピック試薬である、[11]の免疫測定方法。
[13] 還元剤がグルタチオンであり、カオトロピック試薬が尿素である、[12]の免疫測定方法。
[14] 還元剤がシステインであり、カオトロピック試薬が尿素である、[12]の免疫測定方法。
[15] 還元剤がペニシラミンであり、カオトロピック試薬が尿素である、[12]の免疫測定方法。
[16] 変性剤の組合せが還元剤と界面活性剤である、[11]の免疫測定方法。
[17] 還元剤がグルタチオンであり、界面活性剤がn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)である、[16]の免疫測定方法。
[18] 還元剤がシステインであり、界面活性剤がn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)である、[16]の免疫測定方法。
[19] 還元剤がペニシラミンであり、界面活性剤がn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)である、[16]の免疫測定方法。
[20] 尿検体中に尿素を5〜320mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[13]〜[15]のいずれかの免疫測定方法。
[21] 尿検体中にn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)を1.43〜5.74mMの濃度で添加して尿検体の前処理を行う、[17]〜[19]のいずれかの免疫測定方法。
(1) 非還元処理尿を用いた尿中メガリンの測定法
ヒトメガリン細胞外領域に対するモノクローナル抗体(抗細胞外領域メガリンモノクローナル抗体)を用いてヒトメガリン細胞外領域を含有するフラグメント(細胞外領域メガリン)を測定した。抗細胞外領域メガリンモノクローナル抗体とは、配列番号2に示すアミノ酸配列の配列番号26番目のアミノ酸から314番目のアミノ酸の間の領域(LBD1)に存在するエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体である。LBD1中の異なる二つのエピトープを認識する抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Aと抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Bを用いて測定評価した。抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体A固相化マイクロタイタープレートと、ALP標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Bを用いて、尿中のヒトメガリン細胞外領域含有フラグメントを測定した。先ず、尿50μLと処理液A(400mM Tris-HCl,40mM Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid(以下、Ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acidをEDTAと略す),2%(vol./vol.) Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether(以下、Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl EtherをTriton X-100と称する)、pH8.0溶液)50μLを混合し、該混合液100μLを抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体A固相化マイクロタイタープレート(FluoroNunc(商標) Module F16 Black-Maxisorp(商標) Surface plate , Nalge Nunc International社製)のウェルへ加えた。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいた尿サンプル溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、TBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるTBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計3回行った。その後、ALP標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体B(0.5ng/mL)溶液を100μL/ウェルで加えた。ALP標識化抗ヒトメガリンLBD1モノクローナル抗体Bは標識抗体希釈液にて調製した。37℃で1時間放置し、その後、ウェルに加えておいたALP標識化抗体溶液をデカンテーションにより除去し、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、TBS-Tを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるTBS-Tの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計4回行った。その後、そのマイクロタイタープレートのウェルへ、Assay Bufferを200μL/ウェルで添加し、デカンテーションによるAssay Bufferの除去を行い、洗浄を行った。この洗浄工程を計2回行った。次に、ウェルへCDP-Star(登録商標) Chemiluminescent Substrate for Alkaline Phosphatase Ready-to-Use (0.4mM) with Emerald-II(商標) Enhancer(ELISA-Light(商標) System:Applied Biosystems社製)をALP酵素反応基質溶液として、100μL/ウェルで加え、37℃、30分遮光放置した。その後直ちに、本ウェルの1秒間の積算発光強度を測定し、測定値を尿中メガリンの測定評価の指標とした。化学発光強度の測定には、Microplate Luminometer Centro LB960とMicroWin2000 software(Berthold社製)を用いた。
上記の処理液Aに1.625mMグルタチオンを含む処理液を処理液B、上記の処理液Aに2mMシステインを含む処理液を処理液C、上記の処理液Aに2mMペニシラミンを含む処理液を処理液Dとした。処理液B、C又はD 50μLと尿検体50μLを混合した混合液を尿試料溶液として尿中メガリンを測定した。測定方法は実施例1に従って行った。
尿検体として、健常人2例由来の尿検体を用いて上記(1)及び(2)の方法で尿中メガリンを測定し、還元剤の有無での尿中メガリン測定値の比較を行った。その結果を図1に示す。図1中、縦軸はRLU(Relative Light Unit)を示す。図1より還元剤を使用することで尿中メガリンの測定感度が上がることが分かった。つまり、還元剤を使用することで測定感度を上げることが可能となり、低濃度の尿中メガリンの測定が可能となる。
健常人2例(検体A及び検体B)を用いて実施例1で使用した還元剤の有効濃度を検討した。還元剤はグルタチオン:0〜13mM、システイン:0〜16mM、ペニシラミン:0〜64mMの範囲で検討した。グルタチオン、システイン及びペニシラミンについての結果を、それぞれ表1、2及び3に示す。
(1) 還元剤と尿素を組み合わせた処理液で処理した尿を用いた尿中メガリン測定
実施例1(2)の還元剤として1.625mMグルタチオンを含む処理液Bに、さらに640mM尿素を含む処理液を処理液E、実施例1(2)の還元剤として2mMシステインを含む処理液Cに、さらに640mM尿素を含む処理液を処理液F、実施例1(2)の還元剤として2mMペニシラミンを含む処理液Dに、さらに640mM尿素を含む処理液を処理液Gとした。処理液E,F又はG 50μLと尿50μLを混合した混合液を尿試料溶液として尿中メガリンを測定した。測定方法は実施例1に従って行った。
実施例1(2)の還元剤として1.625mMグルタチオンを含む処理液Bに、さらに2.87mM SDBSを含む処理液を処理液H、実施例1(2)の還元剤として2mMシステインを含む処理液Cに、さらに2.87mM SDBSを含む処理液を処理液I、実施例1(2)の還元剤として2mMペニシラミンを含む処理液D、さらに2.87mM SDBSを含む処理液を処理液Jとした。処理液H,I又はJ 50μLと尿50μLを混合した混合液を尿試料溶液として尿中メガリンを測定した。測定方法は実施例1に従って行った。
実施例1(1)の処理液Aにカオトロピック試薬である640mM尿素を含む処理液を処理液K、実施例1(1)の処理液Aに界面活性剤である2.87mM SDBSを含む処理液を処理液Lとした。処理液K又はL 50μLと尿検体50μLを混合した混合液を尿試料溶液として尿中メガリンを測定した。測定方法は実施例1に従って行った。
尿検体として、健常人1例由来の尿検体を用いて実施例1(1)及び実施例3(1)〜(3)の方法で尿中メガリンを測定し、還元剤とカオトロピック試薬である尿素又は界面活性剤であるSDBSを組み合わせた処理液の効果を検討した。表4、5、6、7、8及び9に、それぞれ、グルタチオンと尿素を組み合わせた処理液を用いた場合、システインと尿素を組み合わせた処理液を用いた場合、ペニシラミンと尿素を組み合わせた処理液を用いた場合、グルタチオンとSDBSを組み合わせた処理液を用いた場合、システインとSDBSを組み合わせた処理液を用いた場合、及びペニシラミンとSDBSを組み合わせた処理液を用いた場合の効果を示す。表4〜9より、還元剤、カオトロピック試薬又は界面活性剤のいずれか1種類を含む処理液よりも、還元剤とカオトロピック試薬又は界面活性剤の両方を含む処理液を用いる事により測定感度が上がるこが分かった。つまり、還元剤とカオトロピック試薬又は界面活性剤の両方を含む処理液を使用することで測定感度を上げることが可能となり、低濃度の尿中メガリンの測定が可能となる。
尿検体として、健常人1例由来の尿検体を用いて実施例3(1)、(2)で使用したカオトロピック試薬又は界面活性剤の有効濃度の検討を行った。尿検体中の還元剤濃度は、グルタチオンが0.8125mM、システインが1mM、ペニシラミンが1mMであった。尿検体中のカオトロピック試薬である尿素又は界面活性剤であるSDBS濃度は尿素:0〜320mM、SDBS:0〜5.74mMの範囲で検討した。その結果を表10及び11に示す。表10より還元剤存在下で、尿素濃度が5〜320mM、表11よりSDBS濃度が1.43〜5.74mMの範囲で、還元剤とカオトロピック試薬又は界面活性剤を組合せて尿を処理して、尿中メガリンを測定することにより、還元剤のみで尿を処理して尿中メガリン測定を行うよりも測定感度が上がることが分かった。
Claims (2)
- 尿検体中の尿中濃度が低いタンパク質であるメガリンを測定する免疫測定方法であって、システイン若しくはペニシラミンと尿素若しくはn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)を尿検体に混合することにより尿検体を前処理して免疫測定を行い、前記タンパク質の測定感度を向上させる、免疫測定方法。
- 0.0625〜16mMの濃度のシステイン若しくは0.0625〜64mMの濃度のペニシラミンと5〜320mMの濃度の尿素若しくは1.43〜5.74mMの濃度のn-ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(SDBS)を尿検体に混合することにより尿検体を前処理して免疫測定を行う、請求項1記載の免疫測定方法。
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