TW202342979A - 檢測方法及檢測試劑 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種藉由不會對特異性反應造成影響且泛用性優異之方法來抑制非特異反應之方法。
本發明藉由如下檢測方法而提供泛用性優異之抑制非特異反應之方法,上述檢測方法係藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法,且特徵在於:
使用上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體,包含:
a)使試樣與修飾抗體接觸之步驟;及
b)與a)之步驟同時或於a)之步驟後,使上述試樣與特異抗體接觸之步驟。
Description
本發明係關於一種使用針對試樣中之抗原之特異抗體之檢測方法及檢測試劑。更詳細而言,本發明係關於一種上述檢測方法及檢測試劑,且特徵在於:為了抑制非特異反應而使用特異抗體之修飾抗體,且包含:
a)使試樣與修飾抗體接觸之步驟;及
b)與a)之步驟同時或於a)之步驟後,使上述試樣與特異抗體接觸之步驟。
作為診斷劑領域中之測定方法,可例舉如下免疫學測定法,其使用特異抗體來檢測存在於生物試樣中之測定對象抗原。
此處,生物試樣中除測定對象抗原以外還存在各種物質,大多情況下包含被稱為所謂的非特異因子之導致非特異反應之物質。若非特異因子存在於試樣中,則促進非基於特異反應之結合,或干擾特異性免疫反應,從而導致測定誤差。作為非特異因子,可知存在嗜異性抗體或類風濕因子(RF),但認為還存在其他各種物質,尚有許多不明之處。
且說,作為於免疫學測定法中抑制非特異反應之技術,已知有例如專利文獻1~4。然而,該等方法在原理上並不能適用於所有測定項目,存在實際上無法抑制非特異反應之測定項目。
專利文獻1中揭示有一種測定方法,其中免疫學測定方法中所使用之單株抗體原本之特異性抗體活性完全或實質上喪失,但藉由於共存有「實質上保持其非特異性活性之來自單株抗體之物質」之狀態下進行免疫反應,而抑制非特異反應。作為該來自單株抗體之物質,具體而言,以如下方式製備:藉由超音波處理、有機溶劑處理、酸鹼處理等而使抗體之結構變性,藉此使抗體原本具有之抗體活性實質上消失,且實質上保持非特異性活性。
專利文獻2中揭示有一種使用載持有片段抗體之不溶性載體來檢測試樣中之檢測對象抗原之方法,其中藉由預先或同時使上述片段抗體之變性體與試樣接觸而抑制非特異反應。關於變性體,還是利用加熱、酸、鹼、還原劑、離液(chaotropic)鹽等一般用於蛋白質之變性之方法來進行。
又,專利文獻3中揭示有一種關於分析物之檢測、尤其是腫瘤標記物(marker)之免疫學檢測方法,其藉由於樣本中添加包含「來自檢測抗體等之可變區之構架區(framework region)之肽序列」的物質來減少免疫分析之干涉。作為上述肽序列,示出了抗體之重鏈之構架區1及構架區3中所存在之特定序列。
又,於專利文獻4中揭示有一種消除干擾物質之影響之方法,其藉由於免疫分析中添加非常過量之抑制物質來消除干擾物質之影響,上述抑制物質係變化至「雖還維持了對於干擾物質之特異性,但與應分析之抗原不再發生反應或反應明顯降低」之程度。作為抑制物質之製備方法,可例舉:藉由使用酵素對抗體進行分解之方法等而自試劑抗體中選擇性地去除抗原結合結構之方法;藉由融合瘤培養中之突變而使試劑抗體之抗原結合結構變化之方法等。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1:日本特許第2561134號公報
專利文獻2:日本特許第6431766號公報
專利文獻3:日本特許第4334065號公報
專利文獻4:日本特開平1-28560號公報
[發明所欲解決之課題]
然而,據報告,於專利文獻1之方法中,作為非特異反應抑制劑發揮功能之來自單株抗體之物質係藉由加熱處理等來製備,且實質上Fab被去除。根據本方法,需要高溫或長時間之加熱以使抗體之反應性失活,又,極為難以找出最適條件。本發明人等嘗試了藉由專利文獻1之方法對單株抗體進行加熱處理而製備非特異反應抑制劑,結果確認到存在如下情況:在抗體之反應性失活之同時產生沈澱物,且未觀察到非特異反應抑制效果。因此,本方法有泛用性不足之問題。
又,專利文獻2之方法於利用片段抗體作為檢測用抗體之情形時受到限制。專利文獻2所記載之片段抗體之變性體需要使用識別表位與檢測用片段抗體不同之抗體,由於需要製作複數個單株抗體並明確各抗體之識別表位,故較為繁雜。進而,與專利文獻1同樣地,關於抗體之變性方法,需要設定最適條件,因此有泛用性不足之問題。
又,關於專利文獻3之方法,除利用所揭示之包含來自抗體構架區1與構架區3之特定序列之肽以外,缺乏資訊,認為僅在非特異反應之原因取決於該等序列之情形時有效。因此,與專利文獻1、2同樣地,有泛用性不足之問題。
又,專利文獻4之方法中,作為使用酵素對抗體進行分解之方法之具體例,可例舉自Fc部分將Fab部分分離之方法,但認為分離去除之區域較大,且僅在非特異反應取決於Fc區域之情形時有效,而在非特異反應取決於可變區時無效。又,由於該方法所利用之變異抗體係藉由培養融合瘤之過程中有可能產生之突變而獲得,故而「獲得產生了所期待之變異的變異抗體」之情形極為罕見,有泛用性、再現性不足之問題。
本發明係用以解決上述課題者,其課題在於提供一種藉由泛用性優異之方法而有效地抑制非特異反應之方法。
[解決課題之技術手段]
本案發明人等為了解決上述課題,對「是否存在可藉由泛用性優異之方法來抑制非特異反應之方法」進行了研究,結果認為,若可以在抗原抗體反應系統中共存一種物質,作為針對對象抗原之特異抗體之「誘餌(decoy)」,則或許可進一步確實地抑制非特異反應。然後,於特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體的存在下,進行上述特異抗體與對象抗原之抗原抗體反應,藉此成功實現能夠抑制非特異反應,從而完成本案發明。即,本案發明具有以下之構成。
<1>
一種檢測方法,其係藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法,且特徵在於包含:
a)使試樣與修飾抗體接觸之步驟;及
b)與a)之步驟同時或於a)之步驟後,使上述試樣與上述特異抗體接觸之步驟,且
上述修飾抗體係上述特異抗體之抗體輕鏈(以下,縮寫為L鏈)及/或抗體重鏈(以下,縮寫為H鏈)中之可變區之一部分或全部經修飾而成。
<2>
如<1>記載之檢測方法,其中,上述修飾抗體係上述特異抗體之L鏈及H鏈之6個互補決定區(以下,縮寫為CDR)中之至少1個CDR及/或CDR之立體結構所涉及之區域之一部分或全部經修飾,且與上述CDR不同之至少1個CDR未被修飾者。
<3>
如<1>或<2>記載之檢測方法,其中,上述修飾抗體對於上述對象抗原之反應性為上述特異抗體對於上述對象抗原之反應性的30%以下。
<4>
如<1>至<3>中任一項記載之檢測方法,其中,抗原抗體反應系統內之上述修飾抗體相對於上述特異抗體之濃度比率為1~29倍。
<5>
如<1>至<4>中任一項記載之檢測方法,其中,上述修飾抗體為完整抗體或片段抗體。
<6>
如<1>至<5>中任一項記載之檢測方法,其包含1種或2種以上之上述特異抗體,且包含上述特異抗體中之至少1種抗體之修飾抗體。
<7>
如<1>至<6>中任一項記載之檢測方法,其中,上述特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體,上述修飾抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體之至少任一者之修飾抗體。
<8>
如<1>至<7>中任一項記載之檢測方法,其中,上述特異抗體為完整抗體、或包含與上述對象抗原之結合部位之片段抗體。
<9>
如<1>至<8>中任一項記載之檢測方法,其中,上述檢測方法為基於均相法或非均相法之方法。
<10>
如<1>至<9>中任一項記載之檢測方法,其中,上述特異抗體之至少1種係與不溶性載體結合之抗體、或者經標記物標記之抗體。
<11>
如<10>記載之檢測方法,其中,不溶性載體為乳膠粒子、金膠體、磁性粒子、孔狀板或多孔性膜片。
<12>
如<1>至<11>中任一項記載之檢測方法,其中,使試樣中之對象抗原與特異抗體接觸之步驟為於溶液中進行之步驟。
<13>
如<12>記載之檢測方法,其進而包含如下步驟:對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測。
<14>
如<13>記載之檢測方法,其中,光學檢測之步驟包含如下步驟:對取決於溶液中之抗原抗體複合體之量而發生反應之顯色劑之顯色、或者標記物之量進行光學檢測。
<15>
一種檢測試劑,其係用以藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原者,並包含以下抗體。
(1)與上述抗原特異性結合之特異抗體
(2)上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體
<16>
如<15>記載之檢測試劑,其中,上述修飾抗體為上述特異抗體之L鏈及H鏈之6個CDR中之至少1個CDR及/或CDR之立體結構所涉及之區域之一部分或全部經修飾,且與上述CDR不同之至少1個CDR未被修飾者。
<17>
如<15>或<16>記載之檢測試劑,其中,上述修飾抗體對於上述對象抗原之反應性,相對於上述特異抗體對於上述對象抗原之反應性,為30%以下。
<18>
如<15>至<17>中任一項記載之檢測試劑,其被製備成抗原抗體反應系統內之上述修飾抗體相對於上述特異抗體之濃度比率達到1~29倍。
<19>
如<15>至<18>中任一項記載之檢測試劑,其中,上述修飾抗體為完整抗體或片段抗體。
<20>
如<15>至<19>中任一項記載之檢測試劑,其包含1種或2種以上之上述特異抗體,且包含上述特異抗體中之至少1種抗體之修飾抗體。
<21>
如<15>至<20>中任一項記載之檢測試劑,其中,上述特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體,上述修飾抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體之至少任一者之修飾抗體。
<22>
如<15>至<21>中任一項記載之檢測試劑,其中,上述特異抗體為完整抗體、或包含與上述對象抗原之結合部位之片段抗體。
<23>
如<15>至<22>中任一項記載之檢測試劑,其中,上述檢測試劑為基於均相法或非均相法之試劑。
<24>
如<15>至<23>中任一項記載之檢測試劑,其中,上述特異抗體之至少1種為與不溶性載體結合之抗體、或者經標記物標記之抗體。
<25>
如<24>記載之檢測試劑,其中,不溶性載體為乳膠粒子、金膠體、磁性粒子、孔狀板或多孔性膜片。
<26>
一種試劑套組,其係包含(1)及(2)之試劑,且用以藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之檢測試劑套組,其特徵在於:(1)或(2)之試劑之至少任一者中包含該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體,
(1)包含緩衝液之試劑
(2)包含特異抗體之試劑。
<27>
一種對象抗原之檢測方法中之非特異反應抑制方法,其特徵在於:將與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體、與該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體組合而使用。
<28>
一種非特異反應抑制劑,其包含如下抗體,該抗體和與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體一同被使用,且係上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成者。
<29>
一種抗體,其係和與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體一同被使用,且係該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成者。
[發明之效果]
根據本發明,於藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法中,於上述特異抗體之修飾抗體之存在下進行抗原抗體反應,可藉此廣泛地抑制由試樣中所包含之非特異因子導致之非特異反應,準確地測定對象抗原。
(修飾抗體)
於本發明之藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法中,為了抑制非特異反應而共存之抗體係指上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體(以下,有時稱為本發明之修飾抗體、或簡稱為修飾抗體)。上述所謂對特異抗體之L鏈及/或H鏈之可變區之一部分或全部進行修飾,只要上述可變區中之至少1個胺基酸被修飾即可,亦包含對複數個胺基酸或全部進行修飾。「修飾」係以包含置換、缺失、附加之任一種變異之含義被使用。上述複數個胺基酸係2個以上之胺基酸,可例舉2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個等。作為較佳之範圍,可例舉2個~20個、2個~15個、2個~10個、2個~5個等。
因此,本發明之修飾抗體包含如下任一種抗體:上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部被置換為其他胺基酸而成之抗體、上述可變區之一部分或全部被刪除而成之抗體、或於該可變區附加有1個殘基以上之胺基酸而成之抗體。又,上述修飾抗體係特異抗體之L鏈及/或H鏈之可變區中,尤其是與抗原抗體反應密切相關之區域(一般為CDR)之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體;或CDR之立體結構所涉及之區域之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體,理想的是其修飾區域儘可能小。作為CDR之立體結構所涉及之區域,可例舉:與各CDR之胺基酸序列之N末端及/或C末端側相接之附近區域、與各CDR立體結構發生相互作用之區域等。
例如上述修飾抗體較佳為如下修飾抗體:特異抗體之L鏈及H鏈之可變區中所存在之6個CDR中之至少1個CDR之一部分或全部經修飾,且與上述CDR不同之至少1個CDR完全未被修飾。其原因在於:認為藉由使至少1個CDR完全不被修飾,可抑制取決於該CDR之序列之非特異反應,且有可能廣範地抑制非特異反應。因此,理想的是未修飾之CDR較多,雖只要至少1個即可,但較佳為2個以上,進而較佳為3個以上,進而更佳為4個以上,最佳為5個。又,上述修飾抗體之其他區域可與上述特異抗體相同,亦可不同。
又,作為修飾抗體之另一態樣,例如可例舉:對與「作為CDR之立體結構所涉及之CDR附近之區域的各CDR之胺基酸序列之N末端側及/或C末端側」接近的胺基酸進行修飾、或者對與CDR之三維立體結構相關之構架區之胺基酸進行修飾,藉此使得特異抗體與對象抗原之結合得到降低之修飾抗體等。作為與各CDR接近之胺基酸,可例舉:自各CDR之胺基酸序列之N末端側及/或C末端側起之1~5個胺基酸等。
本發明之修飾抗體亦為被修飾至如下程度之抗體:在與對象抗原之反應中,使不包含胺基酸修飾之特異抗體(野生型抗體)與修飾抗體共存於反應系統中時,不與野生型特異抗體競爭而結合。
是否為不與野生型抗體競爭之程度之修飾,具體而言,可藉由對於對象抗原之特異性來進行評價。上述修飾抗體對於對象抗原之特異性,相對於WT(野生型)抗體較佳為50%以下,更佳為40%以下,進而較佳為30%以下,進而更佳為20%以下,最佳為10%以下。特異性例如可如下述實施例所示藉由固相ELISA等進行分析。
作為本發明之修飾抗體,例示下述與對象抗原結合之抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部被置換為其他胺基酸而成之抗體,更具體而言,可例舉:由抗sIL-2R抗體產生融合瘤(寄存編號:NITE BP-02123)生產之抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部被置換為其他胺基酸而成之抗體、由抗BNP抗體產生融合瘤(收置編號:NITE ABP-03799)生產之抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部被置換為其他胺基酸而成之抗體等。
又,上述修飾抗體包含完整抗體(全長抗體)、片段抗體等特異抗體之可變區之至少一部分,且只要可抑制與對象抗原特異性結合之特異抗體之非特異反應,則可為任意者。
具體而言,於特異抗體為全長抗體之情形時,作為修飾抗體,可例舉:包含特異抗體之CDR,且該CDR及/或CDR附近之區域之胺基酸經修飾而成之全長抗體或改片段抗體等。又,於特異抗體為片段抗體之情形時,作為修飾抗體,可例舉:該片段抗體之CDR及/或CDR附近之區域之胺基酸經修飾而成之片段抗體或包含該經修飾之片段抗體之全長抗體等。
不論特異抗體為全長抗體還是片段抗體,均可使用蛋白酶處理或以基因重組蛋白質形式製作之來自各個特異抗體之片段等,對非特異反應之原因部位進行確認、鑑定,而藉此選擇、設計及製作所需之修飾抗體。
本發明之修飾抗體可藉由與試樣中所存在之非特異因子結合以代替與上述特異抗體結合,從而廣泛地抑制由非特異因子與特異抗體結合導致之非特異性反應。因此,本發明之修飾抗體作為非特異反應抑制劑之有效成分而發揮功能。又,換言之,對於非特異因子,係成為特異抗體之「誘餌」之抗體,又,亦可謂「替身」抗體。本發明之修飾抗體中包含具有此種作用之抗體。
在此之前,為了感度良好且穩定地測定對象抗原,一般進行如下操作:藉由對抗體進行修飾而創出與對象抗原之反應性更高之抗體,於本發明中,反而利用一部分被修飾而使得與抗原之反應性較低之特異抗體,藉此泛用性優異,能夠有效地抑制非特異反應。即,成功提供了特異抗體之修飾抗體、使用該修飾抗體之非特異反應抑制方法及利用修飾抗體之作用之檢測用試劑。
本發明之修飾抗體之創造之概略如下所示。
首先,為了取得對象抗原之特異性抗體之基因資訊而選殖H/L鏈之基因,確定其鹼基序列,鑑定預想之胺基酸序列後,進行功能域之分析。
繼而,進行本發明之修飾抗體之探索。藉由基因重組技術,向上述特異抗體之H鏈或L鏈中之可變區轉殖各種變異,而進行修飾。H鏈或L鏈之可變區中,理想的是CDR區域、與各CDR之胺基酸序列之N末端及/或C末端側相接之附近區域、或與各CDR立體結構發生相互作用之區域。
詳細而言,本發明之修飾抗體之探索能夠以下述順序進行。製作將CDR1、CDR2、CDR3內之全部胺基酸進行丙胺酸置換而成之CDR修飾抗體,將其等對於抗原之反應性與野生型進行比較並進行評價,藉此確定有助於與抗原之結合之CDR。該CDR修飾抗體亦有可能抑制非特異反應之情形。修飾部位較理想為儘可能小,因此製作使藉由上述方法明確之CDR內之胺基酸逐個變異為丙胺酸而成之點變異抗體,如上所述,藉由將反應性與野生型進行比較並進行評價而確定哪個胺基酸重要。該點變異抗體亦有可能抑制非特異反應之情形。由於亦有時需要使對於抗原之反應性得到進一步降低之修飾抗體,故製作:將上述中所確定之胺基酸置換為丙胺酸以外之胺基酸而成之修飾抗體、或者將該胺基酸周邊置換為丙胺酸而成之多重修飾抗體、或者使該胺基酸缺損而成之修飾抗體、或者使包含該胺基酸在內之周邊多重欠損而成之修飾抗體、或者在該胺基酸前後附加新的胺基酸而成之修飾抗體,並以相同方式將反應性與野生型進行比較並進行評價,藉此篩選修飾抗體。
所獲得之修飾抗體候選對於對象抗原之反應性降低之確認係利用以下之方法進行。首先,藉由於動物細胞等中之暫時性表現系統而製作修飾抗體。繼而,藉由抗原固相ELISA等,篩選對於抗原之反應性較野生型顯著降低之修飾抗體。該暫時性表現抗體之製作中亦可使用無細胞系統或大腸桿菌等表現系統。
進而,藉由使用所篩選之修飾抗體之抗體固相ELISA等,可篩選與試樣中之非特異物質之反應性與野生型同等之修飾抗體。
藉由此步驟可獲得不會對「本發明之特異抗體與對象抗原之反應性」造成影響且可抑制非特異反應之修飾抗體。
於包含「在本發明之上述修飾抗體之存在下,使試樣中之抗原與特異抗體接觸」之步驟的上述檢測方法中,特異抗體可為1種,亦可為2種以上,修飾抗體只要包含對於特異抗體中之至少1種特異抗體之修飾抗體即可。
又,作為另一態樣,亦有如下態樣:特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體這2種,且上述修飾抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體之至少任一者之修飾抗體。
又,亦有「特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體這2種,且上述修飾抗體為第1或第2特異抗體之任一者之2種以上之修飾抗體」的情形,又,還有「包含第1特異抗體之1種修飾抗體及第2特異抗體之1種修飾抗體這2種」之情形。修飾抗體有使用1種之情形、使用2種以上之混合物之情形、或與不溶性載體結合來使用之情形等。
本發明中,修飾抗體之濃度只要為不會對抗原抗體反應造成較大影響,且可發揮所需之非特異反應抑制效果之濃度即可,可根據測定對象抗原或檢體之種類,由業者適當設定。作為抗原抗體反應系統內之修飾抗體之濃度,根據試劑構成會有所不同,為0.75~750 μg/mL,較佳為3.0~450 μg/mL,進而較佳為9.0~375 μg/mL,但該濃度並無限制。進而,抗原抗體反應系統內之修飾抗體相對於特異抗體之濃度比率為0.1~140倍,較佳為0.4~85倍,進而較佳為1.2~70倍,但該比率並無限制。例如亦有較佳為未達30倍之情形。更具體而言,為1~29倍、5~20倍、10~15倍、或作為未達10倍之1~9倍、2~7倍、3~6倍等。本發明之修飾抗體即便相對於特異抗體之濃度比率較低,亦可發揮非特異反應抑制效果,可更為減輕對於特異抗體之抗原抗體反應之影響。如上所述,修飾抗體之濃度較低,因此可抑制試劑成本,又,對於測定系統內之其他構成成分之影響亦較少,可期待不論測定原理之種類如何均可以利用。
修飾抗體有使用1種之情形、使用2種以上之修飾抗體之混合物之情形、及與不溶性載體結合之修飾抗體之情形等。又,於併用2種以上之修飾抗體之情形時,只要兩者合併濃度為上述濃度範圍即可。
於本發明之檢測試劑中事先含有修飾抗體之情形時,只要以達到上述反應系統內之濃度之方式事先含於檢測試劑中即可。
又,作為本發明之修飾抗體之用途中之另一態樣,亦可使如下試樣與特異抗體進行反應,該試樣係藉由預先利用修飾抗體對包含對象抗原之試樣進行預處理而事先吸附去除了與特異抗體潛在性結合而有可能導致非特異反應之非特異因子。
(特異抗體)
本發明中之特異抗體只要為對於作為測定對象之抗原具有特異性之抗體即可,選擇多株抗體或單株抗體(包含重組型抗體及各抗體之功能性片段)等抗體。其中,較佳為使用單株抗體。又,本發明之特異抗體亦可為完整抗體(全長抗體)或包含與對象抗原之結合之部位之片段抗體(功能性片段)。關於本發明之特異抗體,除經對於一般動物(小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊等)之免疫步驟而獲得者以外,還可為藉由基因重組技術等,使「與對免疫原(測定對象物質)免疫之動物不同之動物種」的胺基酸序列產生變化而成的抗體(嵌合抗體、人類化抗體、或完全人類化抗體等)。作為片段抗體,可例舉作為具有抗原結合活性之片段之F(ab')
2、Fab'或單鏈抗體(scFv)等。該等片段抗體可藉由將以上述方式獲得之抗體利用蛋白質分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜酶等)進行處理而製造。
作為本發明中之特異抗體之使用態樣,可為游離之態樣,亦可為結合之態樣,根據測定原理來選擇其態樣。例如若為酵素結合免疫吸附分析法(以下縮寫為ELISA),則特異抗體結合於孔狀板、或經標記物質標記,又,若為乳膠免疫比濁法(以下,亦有縮寫為LTIA之情形),則特異抗體結合於乳膠粒子,若為免疫膠體層析法,則特異抗體結合於金膠體粒子或結合於多孔性膜片。進而,若為化學發光法,則特異抗體亦有結合於磁性粒子之情形。
於特異抗體為2種以上之情形時,亦有1種特異抗體結合於不溶性載體而另1種特異抗體為游離狀態之情形(ELISA、化學發光)、2種特異抗體均結合於不溶性載體之情形(LTIA、免疫膠體層析)等。
又,作為2種特異抗體結合於不溶性載體之情形,有2種均為完整抗體之情形、其中1種為片段抗體之情形、及2種均為片段抗體之情形。
(試樣)
作為本發明之包含測定對象抗原之試樣,例如可例舉:人或動物之血液、血清、血漿、培養上清液、尿、髄液、唾液、汗、腹水、或細胞或組織之提取液等。本發明中之試樣除自生體獲得之上述檢體其本身以外,還包含進行了稀釋、純化等預處理之檢體。
(對象抗原)
本發明中,可將上述試樣所含有之各種抗原作為供測定之對象抗原。作為對象抗原,可例舉:蛋白質、肽、胺基酸、醣蛋白質、脂質、醣類、醣脂質、核酸、半抗原等,只要為理論上能夠測定之物質,則無特別限制。例如可例舉:CRP(C反應性蛋白質)、Lp(a)、MMP3(基質金屬蛋白酶3)、抗磷脂質抗體、IV型膠原蛋白、PSA(Prostate specific antigen,***特異抗原)、BNP(brain natriuretic peptide,腦利鈉)、sIL-2R(可溶性介白素-2受體)、胰島素、白蛋白、胱蛋白C、RF(風濕因子)、KL-6、降鈣素原(procalcitonin)、FDP(Fibrinogen Degradation Products,纖維蛋白降解產物)、D二聚物、SF(可溶性血纖維蛋白)、TAT(凝血酶-抗凝血酶III複合體)、PAI-1、或苯妥英、***、卡巴馬平、丙戊酸、茶鹼等。
作為使本發明之修飾抗體存在於抗原抗體反應系統內,以使試樣中之抗原與特異抗體接觸之方法,可例舉:使用本發明之修飾抗體作為檢測試劑之1個試劑構成之方法、於試樣之稀釋液或預處理液等添加本發明之修飾抗體之方法。
所謂抗原抗體反應系統內,例如於檢測試劑為液狀試劑之情形時,係指將試樣與液狀檢測試劑混合而進行免疫反應之液相。
例如於LTIA法之情形時,可將試樣混合於包含修飾抗體之LTIA檢測試劑中,亦可事先將試樣與包含修飾抗體之預處理液混合後再與檢測試劑混合。
又,於ELISA法之情形時,可事先將試樣與包含修飾抗體之預處理液混合後再滴加至孔狀板,亦可將試樣與包含修飾抗體及特異抗體之溶液混合後再滴加至孔狀板。
又,於化學發光法試劑之情形時,可事先將試樣與包含修飾抗體之預處理液混合後再與檢測試劑進行混合,亦可於檢測試劑(例如包含特異抗體、磁性粒子等之溶液)中包含修飾抗體。
進而,於免疫層析法等利用固相進行免疫反應之情形時,抗原抗體反應系統內係指進行液狀試樣與特異抗體之免疫反應之固相。於該情形時,可事先將試樣與包含修飾抗體之預處理液混合後再滴加至免疫膠體層析法試驗片,亦可預先將修飾抗體乾燥保持在試樣供給部位,在滴加了試樣時使修飾抗體溶解並展開固相,藉此達到存在於反應系統之狀態。
(檢測方法)
本發明係於藉由特異抗體對試樣中之檢測之對象抗原進行檢測之方法中,在修飾抗體存在下進行免疫反應的免疫學檢測方法。
免疫學檢測方法進而大致分為均相法與非均相法。
均相法係於試樣與試劑液之混合溶液(反應液)中不進行B/F(結合/非結合)分離之情況下,特異性地檢測藉由對象物質進行之反應的測定法,非均相法係藉由B/F分離操作將與測定反應不相關之多餘成分洗淨、去除後,進行主反應並進行檢測之測定法。
非均相法由於會經洗淨步驟,故有步驟較多而測定較為耗時之課題,另一方面,有相對不易受到非特異反應物質之影響之優點。與此相對,均相法由於不經洗淨步驟,故有更容易受到非特異反應之影響之傾向,另一方面,步驟較少而簡便,測定所需之時間亦較短,因此成為臨床診斷之領域中廣泛使用之方法。
作為均相法,可例舉:利用免疫凝集法之測定方法(TIA)、免疫層析法(側流(lateral flow)式、流通(flow through)式)。TIA係基於藉由「抗體等特異抗體所致分析物(測定對象物質)之交聯作用所形成」之免疫複合體之凝集程度,對試樣中之分析物進行定性或定量檢測的方法,其中,使用乳膠粒子作為不溶性載體以放大凝集訊號之LTIA適合光學檢測,且自動化亦容易,因此係適用於各種檢查項目之泛用性較高之測定方法。
作為非均相法,可例舉:使用孔狀板之ELISA法、化學發光法等。
本發明可利用上述任一種免疫學檢測方法,但可期待相對容易受到非特異反應之影響之均相法更好地享受本發明之效果。
再者,本說明書中「檢測」之用語係以最廣義之含義被使用,包含對象物之存在證明及/或定量等在內,還包含意指定量之「測定」之概念。
(檢測試劑)
本發明之檢測反應係使用檢測試劑來進行,該試劑中,除作為反應主成分之針對對象抗原之特異抗體以外,還包含特異抗體之修飾體。進而亦有包含不溶性載體之試劑。
又,於檢測試劑中,亦可包含例如乙酸、檸檬酸、磷酸、三羥甲基胺基甲烷(Tris)、甘胺酸、硼酸、碳酸、及古德緩衝劑、或其等之鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等作為緩衝、調整試樣之pH值、離子強度、滲透壓等之成分。又,亦可包含聚乙烯吡咯啶酮、磷脂質聚合物等高分子作為增強凝集形成之成分。又,還可包含蛋白質、胺基酸、醣類、金屬鹽類、界面活性劑類、還原性物質或離液物質等通用成分之1種、或組合包含複數種成分作為控制凝集形成之成分。
(不溶性載體)
本發明所使用之不溶性載體只要可載持針對所需之目標成分之特異抗體即可,可使用公知之粒子,尤其是將粒子之情形稱為不溶性載體粒子。可較合適地使用乳膠粒子,其使用有聚苯乙烯等高分子材料,但根據載持對於對象抗原具有特異性之結合同伴之方法,亦可使用金屬膠體、二氧化矽、碳等無機物粒子作為本發明之不溶性載體粒子。
不溶性載體粒子之尺寸可考慮要使用之光學測定法(例如,測定穿透光之比濁法、測定散射光之比濁法等),自0.04~1 μm之範圍適當選擇,以獲得所需之測定感度、測定範圍等。再者,於自動分析裝置之光學測定中,平均粒徑通用0.1~0.4 μm,但並不限定於此。
免疫測定用粒子之平均粒徑可藉由粒度分佈計或穿透式電子顯微鏡圖像等進行確認。免疫測定用粒子於試液中之濃度可根據要使用之免疫測定用粒子之粒徑或測定系統的整體設計,自例如0.0001 mg/mL~10 mg/mL之範圍適當選擇。
於採用乳膠粒子作為本發明之不溶性載體粒子之情形時,作為構成乳膠粒子之合成高分子,並無特別限定,例如可例舉:聚苯乙烯、乙烯基萘、苯乙烯-苯乙烯磺酸鹽共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、伊康酸聚合物、苯乙烯-親水性羧基單體共聚物:例如苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-伊康酸共聚物等。
尤其是將採用乳膠粒子作為不溶性載體粒子之免疫凝集法稱為乳膠免疫比濁法(LTIA,下述)。
針對對象抗原之特異抗體可藉由物理吸附法、化學結合法或其等之併用等公知之方法結合並載持於乳膠粒子。
乳膠粒子所載持之特異抗體為了形成三明治(sandwich),較佳為複數種類。但是,於對象抗原為多價抗原之情形時,特異抗體可為一種。例如於特異抗體為單株抗體之情形時,大多情況下係將識別部位不同之複數個單株抗體組合使用。
再者,若為了抑制乳膠粒子之自然凝集或非特異性反應等需要進行處理,則亦可對於乳膠粒子之表面藉由如下公知方法進行處理而進行載體之封閉(blocking)處理(遮蔽處理):使牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、明膠、卵白蛋白或其鹽等蛋白質、界面活性劑或脫脂粉乳等接觸於乳膠粒子之表面以將之被覆等。可期待包含本發明之修飾抗體之非特異反應抑制劑對於即便進行此種一般非特異反應抑制處理亦無法抑制之非特異反應亦具有效果。
(乳膠免疫比濁法)
對作為本發明之免疫學測定方法之一的乳膠免疫比濁法(LTIA法)進行說明。藉由LTIA法對測定對象物質進行測定之方法可大致分為兩種。
第一種係如下方法:使結合有針對測定對象物質之特異抗體之乳膠粒子與測定對象物質進行反應,形成三明治型免疫複合體,根據伴隨著免疫複合體形成之該乳膠粒子之凝集之程度,對測定對象物質進行測定。
第二種係如下方法:預先在試劑中添加結合有複數個測定對象物質或其相關物(包含其等之片段)之蛋白質等,使其等與試樣中之測定對象物質競爭,而會阻礙試劑中所包含之測定對象物質與結合有針對測定對象物質之特異抗體之乳膠粒子形成免疫複合體,根據「伴隨著免疫複合體之形成阻礙」之該乳膠粒子之凝集阻礙的程度,對測定對象物質(抗原)進行測定。
具體而言,例示以下之步驟。
(1)液相中使試樣與修飾抗體接觸之步驟
(2)與(1)步驟同時或於(1)之步驟後,將結合有特異抗體之乳膠粒子添加至液相中,與特異抗體進行接觸之步驟
(3)於(2)之步驟後,對該測定對象物質與該乳膠粒子之凝集反應進行測定之步驟
此處,(3)之步驟意指「於(2)之步驟之中途、或(2)之步驟後,不經洗淨、分離步驟而測定該測定對象抗原與結合有特異抗體之乳膠粒子之凝集反應的步驟」。
LTIA可藉由光學或電化學地觀察所產生之凝集程度來測定受檢物質。作為光學觀察之方法,可例舉:利用光學機器對散射光強度、吸光度、或穿透光強度進行測定之方法(終點法、速率法等)。將測定試樣所獲得之吸光度等之測定值與測定標準物質(測定對象物質之濃度已知之試樣)所獲得之吸光度等之測定值進行比較,計算試樣中所包含之測定對象物質之濃度(定量值)。再者,測定穿透光或散射光等之吸光度等時,可為單波長測定,或者亦可為雙波長測定(2個波長之差或比)。測定波長一般自500 nm至900 nm中進行選擇。
本發明之試樣中之測定對象抗原之檢測可藉由手工作業來進行,或者亦可使用測定裝置等裝置來進行。測定裝置可為通用自動分析裝置,亦可為專用之測定裝置(專用機)。又,該測定較佳為藉由兩步法(兩試劑法)等利用複數個操作步驟來進行之方法實施。
(試劑構成)
本發明之檢測試劑由一種試液或兩種試液以上之複數種試液構成。作為複數種試液之例,可例舉:由以「將對象抗原調整至適宜測定之濃度,或調整抗原抗體反應之環境等」作為目的之緩衝液所構成之試液、含有特異抗體結合粒子之試液等。本發明之特異抗體之修飾抗體亦可於檢測時之混液狀態下發揮抑制源自試樣之非特異反應的效果,並對構成試劑之穩定性無影響之範圍內,被包含於構成試劑之任一種或全部中。
於使用乳膠粒子作為不溶性載體之檢測試劑之情形時,可例示如下檢測試劑,其含有包含緩衝液之第一試劑及包含乳膠之第二試劑,且任一試劑或兩試劑中含有修飾抗體。又,亦可於檢體預處理液中含有修飾抗體。關於各構成試劑中之修飾抗體之濃度,只要以如下方式包含修飾抗體即可,即在測定時,試劑與試樣之混合狀態下,可調整至上述抗原抗體反應系統內之濃度,且該濃度根據各檢測試劑之構成而有所不同。
以上,尤其是以LTIA為中心對檢測、測定方法、試劑構成進行了說明,但對利用本發明之修飾抗體來抑制抗原抗體反應系統之非特異反應的其他檢測、測定方法亦進行說明。
<ELISA法>
ELISA法係利用各種抗原抗體反應之組合,最終將經酵素標記之抗原或抗體組入至反應系統,而檢測酵素活性之方法。酵素活性之檢測中,可使用吸光光譜會隨著反應而變化之受質,根據抗原抗體反應之組合,可例舉直接法、間接法、三明治法、競爭法等。
例示本發明之檢測方法為三明治ELISA法之情形之試劑。
(a)結合有與測定對象物質反應之特異抗體之不溶性載體
(b)經標記物質標記並與對象抗原反應之特異抗體
作為(a)之不溶性載體,較佳為孔狀板,標記物質可適當選擇來使用。與不溶性載體結合之特異抗體捕捉包含試樣之溶液中之對象抗原,於不溶性載體上形成複合體。
(b)之經標記物質標記之特異抗體結合於上述捕捉到之對象物質而與上述複合體形成三明治。藉由與標記物質對應之方法測定標記物質之量,藉此可測定試樣中之對象物質之量。特異抗體結合於不溶性載體之方法、特異抗體與標記物質之結合方法等具體之方法可無特別限制地使用業者所周知之方法。
本ELISA法中,本發明之修飾抗體例如可藉由添加於試樣稀釋液或預處理液等中,或添加於進行抗原抗體反應之溶液中而存在於反應系統中。
<免疫層析法>
對本發明之檢測方法之原理為免疫層析法之情形時的試劑構成(試驗片構成)進行說明。
免疫層析法試驗片;
於使用特異抗體之情形時,係如下試驗片:於多孔性膜片等片狀之不溶性載體上沿包含試樣之溶液之展開方向依序具備「1.試樣供給部位」、「2.保持標記特異抗體之部位(標記抗體保持部位)」、「3.結合“用以捕捉由標記抗體與特異抗體形成之複合體”之特異抗體的部位(捕捉抗體部位)」。
於免疫層析法中,至少包含如上述之試驗片,若將特定量之包含對象抗原之試樣添加至試樣供給部位,則試樣因毛細現象滲入至標記保持部位,對象抗原與經標記之特異抗體結合而形成複合體。該複合體於膜片上展開,若滲入至捕捉抗體部位,則被與膜片結合之特異抗體(捕捉抗體)捕捉,從而形成捕捉特異抗體-對象抗體-標記特異抗體之複合體。然後,藉由任意方法(例如於金膠體等能夠可視化之標記之情形時利用凝集圖像,於酵素之情形時利用添加受質所引起之顯色反應)對標記進行檢測,而可檢測測定對象物質。
於本免疫層析法中,本發明之修飾抗體例如可藉由預先添加於試樣稀釋液或預處理液等中,或預先含於試驗片之試樣供給部位或標記保持部位並進行乾燥保持,而存在於反應系統內。
<化學發光法>
對本發明之檢測方法之原理為化學發光法之情形時之試劑構成進行說明。
利用化學發光法之測定方法係如下方法:使結合有抗原或抗體之磁性粒子、對象抗原、及標記抗體接觸而形成複合體,將該複合體自未反應標記抗體分離後,添加發光試劑,測定發光量。將酵素用於標記之情形稱為化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法:Chemiluminescent enzyme immunoassay)。又,將釕吡啶錯合物等金屬錯合物用於標記並藉由電化學反應測定發光強度之情形稱為電化學發光免疫測定法(ECLIA法:Electro chemiluminescence immunoassay)。又,將化學發光性物質用於標記之情形稱為化學發光免疫測定法(CLIA法:Chemiluminescence immunoassay)。
例示本發明之檢測方法為CLEIA法之情形時之試劑。
(a)結合有與對象抗原反應之特異抗體之磁性粒子
(b)經酵素標記並與對象抗原反應之特異抗體
(c)發光試劑
與磁性粒子結合之特異抗體捕捉包含試樣之溶液中之對象抗原而形成複合體。經酵素標記物質標記之特異抗體結合於上述被捕捉到之對象抗原而與上述複合體形成三明治。使酵素標記物質與發光試劑進行反應,測定發光量,藉此可測定試樣中之對象抗原。
於本CLEIA法中,本發明之修飾抗體例如可藉由添加於試樣稀釋液或預處理液等中,或添加於進行抗原抗體反應之溶液中而存在於反應系統中。
(非特異反應之抑制方法/非特異反應抑制劑)
因生物試樣中所包含之某種成分,常常發生如下情況:產生「結合有針對對象抗原之特異抗體之免疫測定用粒子」所不應產生之凝集(正之測定誤差)、或不產生應產生之凝集(負之測定誤差)。其等被稱為非特異性反應,已知會導致各種測定誤差。
於本發明中,抑制非特異反應係指(被動地)作用於試樣中產生上述非特異反應之因子(非特異因子),作為特異抗體之誘餌,抑制目標特異反應以外之反應所致對檢測之影響。本發明可藉由於針對對象抗原之特異抗體之修飾抗體存在下進行免疫反應而抑制非特異反應。因此,本發明之上述修飾抗體亦為非特異反應抑制劑之有效成分。
(試劑套組)
本發明之試劑套組之特徵在於:套組構成中至少包含對象抗原之特異抗體及該特異抗體之修飾體。作為套組構成,除免疫學檢測相關之試劑以外,還可例舉試樣稀釋液、試樣提取液等,本發明之修飾抗體可包含於其中任一種或兩種以上中。
典型而言,包含(1)及(2)之試劑,且於(1)或(2)之試劑之至少任一者中包含特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體。
(1)包含緩衝液之試劑
(2)包含特異抗體之試劑
作為包含特異抗體之試劑,可例舉:特異抗體結合於乳膠等不溶性載體之試劑。
套組之構成除上述以外,還可例舉使用說明書、試樣採取用具(採取移液管、注射器、棉花棒、過濾濾片等)。
(其他試劑成分)
本發明之檢測試劑亦可包含聚乙二醇、聚乙烯吡咯啶酮、磷脂質聚合物等高分子作為增強不溶性載體粒子之凝集形成之成分。又,亦可將蛋白質、胺基酸、醣類、金屬鹽類、界面活性劑類、還原性物質或離液物質等通用之成分之1種或組合包含之複數種成分作為控制凝集形成之成分。
[實施例]
以下,例舉包含本發明之修飾抗體之非特異反應抑制劑、利用其之檢測方法、檢測試劑、非特異性反應之抑制方法之例,詳細地說明本發明之一部分,但本發明並不限定於此。
[試驗例1]CDR修飾抗體之製備
1.抗體可變區基因序列之分析
使用一般之分子細胞生物學手法實施抗體可變區基因序列之分析(圖1)。即,自100萬個左右之所培養之抗sIL-2R抗體產生融合瘤(寄存編號:NITE BP-02123)提取RNA,藉由反轉錄反應及模板轉換(template switching)法取得全長cDNA。以該cDNA作為模板,藉由RT-PCR(Real-time-Polymerase Chain Reaction,即時聚合酶鏈鎖反應)對H鏈及L鏈之可變區部分之基因進行擴增(圖2)。將經擴增之序列***載體,對大腸桿菌進行轉形。培養經轉形之大腸桿菌,拾取12個左右之群落,藉由群落PCR對選殖化之序列進行擴增(圖3、4)。將該PCR擴增產物純化後,藉由直接定序取得序列資訊,並對轉譯框未分斷者進行分析。最終,基於公共資料庫推定出5'末端之訊號序列,並確定了亦與已知之恆定區序列結合而自抗sIL-2R抗體產生融合瘤生產之抗sIL-2R單株抗體(92204R抗體)之H鏈及L鏈的基因序列。
2.基因重組抗體之同等性分析
使所取得之H鏈及L鏈基因於哺乳細胞中暫時性表現,對其反應性進行分析,藉此確認其是否與來自融合瘤之92204R抗體同等。具體而言,藉由人工基因合成,將H鏈及L鏈之基因選殖至哺乳細胞表現載體,基因轉殖至CHO細胞,藉此於培養上清液中暫時性表現IgG(圖5)。回收該培養上清液,藉由固相ELISA分析其對於抗原之反應性,結果確認其具有與純化抗體同等之反應性(圖6)。
因此,確認所取得之H鏈及L鏈基因係構成來自融合瘤之抗體之基因。固相ELISA中,固相使用50 ng之hIL-2Ra(R&D Systems, Cat.#2232A025/CF)作為抗原。
3.修飾抗體之篩選
藉由合成針對由公共資料庫推定出之抗體H鏈之互補決定區(complementarity determining region:CDR),置換為丙胺酸之基因序列,取得H鏈CDR變異抗體基因。將其等組入至哺乳細胞表現載體中,藉此製備變異抗體表現載體(圖7A、B、C)。
繼而,與上述同樣地於CHO細胞中暫時性表現,檢測其培養上清液中之IgG(圖8),進而藉由固相ELISA分析其對於抗原之反應性。其結果在H鏈CDR3之點變異抗體中觀察到反應性大幅降低之變異體(圖9)。因此推測,92204R抗體之抗原識別、結合主要與CDR3內之第106位周邊之胺基酸相關。
4.修飾抗體之製作
根據上述結果提示了存在於CDR3內之第106位周邊之胺基酸與92204R抗體之抗原識別、結合密切相關,因此製備包含第106位前後之胺基酸之多重變異抗體(105-107-A)及缺損抗體(Δ105-107)作為本發明之修飾抗體之候選。又,亦製備將L鏈CDR3之全部胺基酸置換為丙胺酸之抗體(圖10),實施暫時性表現及反應性分析(針對將H鏈CDR3之全部胺基酸置換為丙胺酸之抗體,亦在製備表現載體後嘗試暫時性表現,但未能確認到IgG化,因此不在以後之實驗中使用)。
以與至今為止相同之方式,藉由固相ELISA分析了對於抗原之反應性,結果(圖11)可知,於Δ105-107及L_CDR3-A時反應性顯著降低,因此作為修飾抗體用於隨後之實驗。首先,使用基於ExpiCHO細胞表現系統(Theromo Fisher)之表現系統,使該等修飾抗體表現,藉由免疫墨點法確認到培養上清液中之IgG。由於確認到包含野生型在內之充分量之IgG,故藉由Protein G管柱對該等抗體進行純化。藉由CBB(Coomassie Brilliant Blue)染色對純化抗體之純度進行分析,結果確認到與已知之純化抗體同等(圖12),因此進而對等電點進行分析。
等電點電泳之結果,H_Δ105-107之等電點與野生型同等,L_CDR3-A之等電點較野生型略高(均為pH6.0-6.9之範圍)。因此,可知等電點不會因修飾而產生顯著變化(圖13)。最終,藉由固相ELISA對純化抗體之反應性進行確認。將各種純化抗體自1 μg/mL進行10倍、100倍、1,000倍、・・・・、10,000,000倍稀釋而製備抗體液,藉由固相ELISA來分析反應性。
其結果,作為源自腹水之純化抗體之陽性對象(PC)92204R(#IL-107)與藉由該抗體之基因重組技術所製作而成之抗體92204R呈同等之抗原反應性,另一方面,於100 ng/mL之濃度時,顯示出H_D105-107與陽性對照(PC)相比為約23%之反應性,L_CDR3-A顯示為PC之約5%(與空白組同等)之反應性(圖14)。再者,於本試驗中,由於將作為未修飾抗體之陽性對象設為源自腹水之純化抗體,故表示,修飾抗體之反應性較陽性對象降低之原因在於胺基酸之修飾本身,而並非因暫時性表現導致抗體之反應性降低。
認為根據以上製作之修飾抗體具有在檢體測定中可期待非特異反應抑制效果之功能。
[試驗例2]由添加CDR修飾抗體獲得之抗體結合乳膠之非特異凝集抑制效果之驗證(LTIA法)
示出如下試驗:使用添加有本案發明之CDR修飾抗體及未修飾抗體之緩衝液,對試樣中之成分與1種抗體結合乳膠之凝集程度進行評價。
作為抗原之sIL-2R由於並非在分子內具有複數個相同表位之多價抗原,故若僅1種抗體結合乳膠,則即便通常試樣中之sIL-2R與抗體結合乳膠發生反應亦無法形成凝集塊,因此吸光度不會產生變化。因此,可以認為於本試驗例中所示之評價方法中產生之吸光度變化係由試樣中之非特異因子與抗體結合乳膠之非特異凝集所導致。
1.測定試劑
(1)第1試劑之製備
[比較例1]依照日本特開2017-181377號公報所記載之方法,製備第1試劑。
[比較例2]於比較例1之第1試劑中,以92204R-(WT)抗體(未修飾抗體)達到100 μg/mL之方式添加。
[實施例1]於比較例1之第1試劑中,以92204R-(Δ105-107)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加。
[實施例2]於比較例1之第1試劑中,以92204R-(CDR3-A)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加。
(2)包含1種抗體結合乳膠之第2試劑之製備
依據日本特開2017-181377記載之試驗例1之第2試劑(ii)之方法,製備92204R抗體結合乳膠。利用5 mM MOPS緩衝液(pH7.0)以波長600 nm時之吸光度達到2.5 Abs./mL之方式製備而作為第2試劑。
2.試樣
使用僅1種抗體結合乳膠(92204R抗體結合乳膠)之吸光度未產生變化之試樣(對照檢體:檢體1~5)、及呈非特異反應且僅92204R抗體結合乳膠之吸光度產生變化之試樣(非特異凝集檢體:檢體6~9)。
3.測定步驟
組合第1試劑與第2試劑,並使用日立7180型自動分析裝置,評價各試樣與92204R抗體結合乳膠單獨時之非特異凝集之程度。具體而言,於試樣5.6 μL中添加第1試劑120 μL,於37℃保溫5分鐘後,加入第2試劑40 μL並進行攪拌。其後歷時5分鐘,於主波長570 nm、副波長800 nm時測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化。
4.測定結果
將測定結果示於表1。
[表1]
凝集之程度(吸光度變化量)(mAbs.) | |||||
種類 | 檢體No. | 比較例1 未添加抗體 | 比較例2 添加92204R-(WT)抗體 | 實施例1 添加92204R-(Δ105-107)修飾抗體 | 實施例2 添加92204R-(CDR3-A)修飾抗體 |
對照檢體 | 1 | -1.1 | -1.4 | -1.0 | -0.9 |
2 | -1.3 | -0.8 | -0.9 | -0.9 | |
3 | -2.1 | -2.0 | -1.8 | -1.6 | |
4 | -0.7 | -1.1 | -1.4 | -0.8 | |
5 | -1.8 | -1.5 | -0.6 | -1.3 | |
非特異凝集檢體 | 6 | 5.6 | -0.7 | -0.5 | -0.4 |
7 | 2.4 | -0.5 | -0.3 | 0.1 | |
8 | 9.3 | -0.3 | 0.0 | 0.2 | |
9 | 18.3 | 1.1 | 1.1 | 2.0 |
5.探討
根據比較例1~2、及實施例1~2之結果,對本案發明之效果進行探討。
(1)根據比較例1之結果,檢體1~5之92204R抗體結合乳膠單獨時之吸光度變化量成為2.0 mAbs.以下,且未觀察到凝集。另一方面,檢體6~9之92204R抗體結合乳膠單獨時之吸光度變化量成為2.0 mAbs.以上,觀察到非特異凝集。
(2)於使用添加有92204R-(WT)之第1試劑之情形時,檢體6~9之92204R抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。對照檢體1~5中,在凝集程度上未觀察到差異。其表示,檢體6~9所包含之非特異因子與添加至第1試劑中之92204R-(WT)抗體發生反應,藉此作為誘餌發揮作用,從而抑制了添加第2試劑後之非特異因子與92204R抗體結合乳膠的非特異凝集(比較例2)。
(3)於使用添加有92204R-(Δ105-107)修飾抗體之第1試劑之情形時,檢體6~9與比較例2同樣地,92204R抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。對照檢體1~5中,在凝集程度上未觀察到差異(實施例1)。
(4)於使用添加有92204R-(CDR3-A)修飾抗體之第1試劑之情形時,檢體6~9與比較例2或實施例1同樣地,92204R抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。對照檢體1~5中,在凝集程度未觀察到差異(實施例2)。
(5)綜上所述,藉由於免疫測定方法中,使本案發明之CDR修飾抗體存在於抗原抗體反應系統內,而作為誘餌發揮作用,從而能夠抑制由試樣中之非特異因子導致之抗體敏感乳膠之非特異凝集。
[試驗例3]添加CDR修飾抗體所致對特異反應之影響之驗證(LTIA法)
藉由添加有本案發明之修飾抗體之LTIA試劑,進行試樣中之sIL-2R之濃度測定。
1.測定試劑
(1)第1試劑
[比較例3]使用比較例1中所示之第1試劑。
[比較例4]使用比較例2中所示之第1試劑。
[實施例3]使用實施例1中所示之第1試劑。
[實施例4]使用實施例2中所示之第1試劑。
(2)第2試劑
使用依據日本特開2017-181377號公報記載之試驗例1之方法所製備之第2試劑。再者,本試劑中之特異抗體濃度為20~30 μg/mL。
2.試樣
將作為濃度已知試樣之以下試樣供於測定。
(1)生理鹽水(大塚生食注)
(2)以達到表2所示之濃度之方式製備之IL-2R校正液N(Sekisui Medical股份有限公司)
3.測定步驟
組合第1試劑與第2試劑,並使用日立7180型自動分析裝置,測定上述濃度已知試樣(生理鹽水、IL-2R校正液N)。具體而言,於試樣5.6 μL中加入第1試劑120 μL,於37℃保溫5分鐘後,加入第2試劑40 μL並進行攪拌。其後歷時5分鐘,於主波長570 nm、副波長800 nm時測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化。
4.測定結果
將測定結果示於表2、圖15。
[表2]
R1添加抗體(100 μg/mL) | |||||
IL-2R顯示濃度 | 比較例3 未添加抗體 | 比較例4 添加92204R-(WT)抗體 | 實施例3 添加92204R-(Δ105-107)修飾抗體 | 實施例4 添加92204R-(CDR3-A)修飾抗體 | |
生理鹽水 | 0 U/mL | -3.0 | -2.3 | -2.6 | -2.6 |
Cal① | 509 U/mL | 12.1 | -2.4 | 10.3 | 11.1 |
Cal② | 2014 U/mL | 84.9 | -2.5 | 82.0 | 82.0 |
Cal③ | 5150 U/mL | 145.0 | -2.0 | 143.4 | 143.3 |
Cal④ | 10089 U/mL | 179.8 | -2.6 | 176.6 | 177.6 |
對於特異反應之影響 | - | 阻礙較強 | 無影響 | 無影響 | |
單位(mAbs.) |
5.探討
(1)於未添加抗體之比較例3中,觀察到sIL-2R濃度依賴性之吸光度上升,與此相對,於使用添加有92204R-(WT)抗體之第1試劑之比較例4中,未觀察到sIL-2R濃度依賴性之吸光度上升。表示藉由添加92204R-(WT)抗體,而阻礙試樣中之sIL-2R與抗體結合乳膠之特異反應。
(2)於使用添加有92204R-(Δ105-107)修飾抗體之第1試劑之實施例3中,與比較例3同樣地,觀察到sIL-2R濃度依賴性之吸光度上升,其程度亦同等。因此,表示92204R-(Δ105-107)修飾抗體未對sIL-2R與抗體結合乳膠之特異反應造成影響。
(3)又,於使用添加有92204R-(CDR3-A)修飾抗體之第1試劑之實施例4中,與比較例3或實施例3同樣地,觀察到sIL-2R濃度依賴性之吸光度上升,其程度亦同等。因此,表示92204R-(CDR3-A)修飾抗體未對sIL-2R與抗體結合乳膠之特異反應造成影響。
(4)綜上所述,藉由對特異抗體之CDR胺基酸序列進行修飾,而獲得了於免疫測定方法中未對特異反應造成影響,且作為誘餌發揮作用之非特異反應抑制劑。
[試驗例4]sIL-2R之測定(LTIA法)
藉由添加有本案發明之修飾抗體之LTIA試劑,進行了試樣中之sIL-2R之濃度測定。
1.測定試劑
[比較例5](利用CLEIA法之sIL-2R濃度測定)
使用Lumipulse(註冊商標)IL-2R(Fujirebio股份有限公司)。CLEIA法實施B/F分離操作,具有洗淨步驟。因此,由於測定方法不易受到源自試樣之非特異反應之影響,故用作比較例。
[比較例6](利用LTIA法之sIL-2R濃度測定)
依照日本特開2017-181377記載之方法,製備第1試劑及第2試劑。
[實施例5](利用添加有92204R-(Δ105-107)修飾抗體之LTIA法進行之sIL-2R濃度測定)
於比較例6之第1試劑中,以92204R-(Δ105-107)修飾抗體達到100 μg/mL、或500 μg/mL之方法添加,除此以外,以相同方式製備試劑。
[實施例6](利用添加有92204R-(CDR3-A)修飾抗體之LTIA法進行之sIL-2R濃度測定)
於比較例6之第1試劑中,以92204R-(CDR3-A)修飾抗體達到100 μg/mL、或500 μg/mL之方法添加,除此以外,以相同方式製備試劑。
2.試樣
使用顯示與利用化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法)所得之測定值(比較例5)接近之值之試樣(對照檢體:檢體編號1~5)、及呈非特異反應且大幅背離比較例5之測定值之試樣(背離檢體:檢體編號13~16)。
3.測定步驟
(1)比較例5係利用Lumipulse(註冊商標)-L2400(Fujirebio股份有限公司),依照上述試劑之附件資料進行測定。
(2)比較例6、實施例5及實施例6係組合各個第1試劑與第2試劑,並使用日立7180型自動分析裝置,測定試樣中之sIL-2R濃度。具體而言,於試樣5.6 μL中加入第1試劑120 μL,於37℃保溫5分鐘後,加入第2試劑40 μL並進行攪拌。其後歷時5分鐘,於主波長570 nm、副波長800 nm時測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化,將該吸光度變化量應用於「測定濃度已知之標準物質所獲得之校準曲線」而算出測定值。
4.測定結果
將測定結果示於表3。
[表3]
(U/mL) | |||||||
種類 | 檢體No. | 比較例5 | 比較例6 | 實施例5 | 實施例6 | ||
CLEIA法 | 未添加抗體 | 92204R-(Δ105-107)修飾抗體 | 92204R-(CDR3-A)修飾抗體 | ||||
添加100 μg/mL | 添加500 μg/mL | 添加100 μg/mL | 添加500 μg/mL | ||||
對照檢體 | 1 | 278 | 270 | 294 | - | 331 | - |
2 | 513 | 542 | 541 | 559 | 533 | 515 | |
3 | 718 | 790 | 786 | - | 798 | - | |
4 | 1242 | 1338 | 1335 | - | 1327 | - | |
5 | 1977 | 2084 | 2101 | - | 2108 | - | |
背離檢體 | 13 | 331 | 835 | 652 | 451 | 696 | 487 |
14 | 176 | 407 | 252 | 211 | 215 | 225 | |
15 | 730 | 1350 | 942 | 791 | 947 | 810 | |
16 | 274 | 479 | 396 | 363 | 401 | 366 | |
-:未測試 |
5.結果與探討
(1)於CLEIA法之測定值(比較例5)、與未添加抗體之LTIA法之測定值(比較例6)同等之對照檢體(檢體編號1~5)中,添加有本案發明之修飾抗體之LTIA法之測定值(實施例5、6)亦與比較例5、6同等。因此,可知本發明之修飾抗體之添加不會對未呈非特異反應之檢體之測定值造成影響。
(2)檢體編號13中CLEIA法之測定值(比較例5)為331 U/mL,與此相對,未添加抗體之LTIA法之測定值(比較例6)達到835 U/mL,測定值相距甚大。另一方面,添加有本案發明之修飾抗體100 μg/mL之LTIA法之測定值(實施例5、6)達到652或696 U/mL,呈接近比較例5之傾向。進而,添加有修飾抗體500 μg/mL之LTIA法之測定值(實施例5、6)達到451或487 U/mL,呈更接近CLEIA之測定值(比較例5)之傾向。檢體14~16亦獲得了相同結果。
(3)綜上所述,藉由於作為均相免疫學測定法之LTIA法中,使本案發明之修飾抗體存在於反應系統內,而抑制了源自試樣之非特異反應。
[試驗例5]利用ELISA法測定sIL-2R
藉由添加有本案發明之修飾抗體之ELISA試劑,進行試樣中之sIL-2R濃度測定。
1.測定方法
[比較例7](利用CLEIA法進行之sIL-2R濃度測定)
藉由與比較例5相同之方法進行。
[比較例8](利用ELISA法進行之sIL-2R濃度測定)
利用包含150 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH7.2;以下稱為PBS)稀釋抗sIL-2R單株抗體(殖株編號92204R)以達到10 μg/mL,將該溶液100 μL分注至96孔微量培養板之各孔,於室溫靜置1小時。
利用包含0.05%Tween(註冊商標)20之PBS(以下稱為PBST)400 μL將上述各孔洗淨3次後,加入包含1%牛血清白蛋白之PBST(以下,稱為BSA-PBST)200 μL,於室溫進行1小時封閉。將其作為ELISA用培養板。將上述ELISA用培養板之各孔利用PBST 400 μL洗淨3次後,將利用檢體稀釋液(於BSA-PBST中以HBR-1(SCANTIBODIES LABORATORY, INC.)達到100 μg/mL之方式添加而成者)稀釋20倍後所得之試樣100 μL添加至上述各孔中,於室溫靜置1小時。將上述各孔利用PBST 400 μL洗淨3次後,將利用BSA-PBST稀釋至1.0 μg/mL後所得之生物素標記抗sIL-2R單株抗體(殖株編號92212)100 μL分注至上述各孔中,於室溫靜置1小時。將上述各孔利用PBST 400 μL洗淨3次後,將利用BSA-PBST稀釋至0.2 μg/mL後所得之HRP標記鏈球親生物素蛋白(Thermo Fishier Scientific公司)100 μL分注至上述各孔中,於室溫靜置30分鐘。將上述各孔利用PBST 400 μL洗淨3次後,加入包含0.2%鄰苯二胺及0.02%過氧化氫之檸檬酸緩衝液(pH5.0)50 μL,於室溫放置10分鐘後,加入4.5 N硫酸100 μL,使酵素反應終止,測定波長492 nm時之吸光度。
使用濃度已知試樣作為校正液,算出受檢試樣中之sIL-2R值。
[實施例7](利用添加有92204R-(Δ105-107)修飾抗體之ELISA法進行之sIL-2R濃度測定)
於比較例8中所示之檢體稀釋液中,以92204R-(Δ105-107)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加,除此以外,利用與比較例8相同之方法進行測定。
[實施例8](利用添加有92204R-(CDR3-A)修飾抗體之ELISA法進行之sIL-2R濃度測定)
於比較例8中所示之檢體稀釋液中,以92204R-(CDR3-A)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加,除此以外,利用與比較例8相同之方法進行測定。
2.試樣
使用顯示與利用化學發光酵素免疫測定法(CLEIA法)所得之測定值(比較例7)接近之值之試樣(對照檢體:檢體編號17~19)、及呈非特異反應且大幅背離比較例7之測定值之試樣(背離檢體:檢體編號20)。
3.測定結果
將測定結果示於表4。
[表4]
(U/mL) | |||||
種類 | 檢體No. | 比較例7 | 比較例3 | 實施例7 | 實施例8 |
CLEIA法 | 未添加抗體 | 92204R-(Δ105-107)修飾抗體 | 92204R-(CDR3-A)修飾抗體 | ||
對照檢體 | 17 | 513 | 458 | 354 | 449 |
18 | 1242 | 1047 | 911 | 907 | |
19 | 1977 | 1848 | 1689 | 1744 | |
背離檢體 | 20 | 353 | 756 | 484 | 279 |
4.結果與探討
(1)於CLEIA法之測定值(比較例7)、與未添加抗體之ELISA法之測定值(比較例8)同等之對照檢體(檢體編號17~19)中,添加有本案發明之修飾抗體之ELISA法之測定值(實施例7、8)亦與比較例7、8同等。因此,可知本發明之修飾抗體之添加不會對未呈非特異反應之檢體之測定值造成較大之影響。
(2)檢體編號20中CLEIA法之測定值(比較例7)為353 U/mL,與此相對,未添加抗體之ELISA法之測定值(比較例8)達到756 U/mL,測定值相距甚大。與此相對,添加有本案發明之修飾抗體100 μg/mL之ELISA法之測定值(實施例7、8)達到484或279 U/mL,均呈接近比較例7之傾向。
(3)綜上所述,藉由於作為非均相免疫學測定法之ELISA法中,使本案發明之修飾抗體存在於反應系統內,而抑制了源自試樣之非特異反應。並且可知,利用該修飾抗體之非特異反應抑制方法並不限於實施例1~6之均相測定系統,於實施例7及8之非均相測定系統中亦有效果。
[試驗例6]添加CDR修飾抗體所獲得之抗體結合乳膠之非特異凝集抑制效果之驗證(LTIA法2)
示出如下試驗:使用分別添加有本案發明之CDR修飾抗體及未修飾抗體之緩衝液,對試樣中之成分與1種抗體結合乳膠之凝集程度進行評價。
作為抗原之腦利鈉(BNP)由於並非在分子內具有複數個相同表位之多價抗原,故若僅1種抗體結合乳膠,則即便通常試樣中之BNP與抗體結合乳膠發生反應亦無法形成凝集塊,因此吸光度不會產生變化。因此,可以認為於本試驗例中所示之評價方法中產生之吸光度變化係由試樣中之非特異因子與抗體結合乳膠之非特異凝集所導致。
1.抗BNP單株抗體之CDR修飾抗體之製作
依照與上述試驗例1相同之方法,基於融合瘤(NITE ABP-03799)所產生之抗BNP IgG單株抗體33236,而製作3種L鏈CDR修飾抗體、33236-(W51A)修飾抗體、33236-(K95A)修飾抗體及33236-(CDR3-A)修飾抗體(圖16)。該等抗體均為對於作為抗原之BNP之反應性大幅降低之抗體。
2.測定試劑
(1)第1試劑之製備
[比較例9]製備以下所示之第1試劑。
100 mM N,N-二羥乙甘胺酸(Bicine)緩衝液(pH8.0)
200 mM KCl
0.5% BSA
[比較例10]於比較例9之第1試劑中,以33236-(WT)抗體(未修飾抗體)達到100 μg/mL之方式添加。
[實施例9]於比較例9之第1試劑中,以33236-(W51A)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加。
[實施例10]於比較例9之第1試劑中,以33236-(K95A)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加。
[實施例11]於比較例9之第1試劑中,以33236-(CDR3-A)修飾抗體達到100 μg/mL之方式添加。
(2)片段抗體之製備
依照通常方法,自融合瘤(NITE ABP-03799)所產生之抗BNP IgG單株抗體33236製備片段抗體33236F(ab')
2。
(3)包含1種抗體結合乳膠之第2試劑之製備
33236F(ab')
2抗體結合乳膠係以如下方式製備。於平均粒徑270 nm之1%聚苯乙烯乳膠溶液(Sekisui Medical公司製造)中添加等量之0.6 mg/mL之33236F(ab')
2抗體溶液,於4℃攪拌1小時。其後,添加等量之2%BSA液,於4℃攪拌1小時,製作33236F(ab')
2抗體結合乳膠溶液。利用5 mM之MOPS緩衝液(pH7.0)以波長600 nm時之吸光度達到5.25 Abs./mL之方式進行調整並作為第2試劑。
3.試樣
使用呈非特異反應且僅1種抗體結合乳膠(33236F(ab')
2抗體結合乳膠)產生吸光度變化之試樣(非特異凝集檢體:檢體21)。
4.測定步驟
組合第1試劑與第2試劑,並使用日立7180型自動分析裝置,評價各試樣與33236F(ab')
2抗體結合乳膠單獨時之非特異凝集之程度。具體而言,於試樣12 μL中加入第1試劑150 μL,於37℃保溫5分鐘後,加入第2試劑50 μL並進行攪拌。其後,歷時5分鐘,於主波長570 nm、副波長800 nm時測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化。
5.測定結果
將測定結果示於表5。
[表5]
凝集之程度(吸光度變化量)(mAbs.) | ||||||
種類 | 檢體No. | 比較例9 未添加抗體 | 比較例10 添加33236-(WT)抗體 | 實施例9 添加33236-(W51A)抗體 | 實施例10 添加33236-(K95A)抗體 | 實施例11 添加33236-(CDR3-A)抗體 |
非特異凝集檢體 | 21 | 190.4 | -7.1 | -7.0 | -7.1 | -6.9 |
6.探討
根據比較例9~10、及實施例9~11之結果,對本案發明之效果進行了探討。
(1)於未添加抗體之比較例9中,33236F(ab')
2抗體結合乳膠單獨時之吸光度變化量成為2.0 mAbs.以上,觀察到非特異凝集。
(2)於使用添加有33236-(WT)之第1試劑之比較例10中,33236F(ab')
2抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。其表示,檢體中所包含之非特異因子藉由與添加至第1試劑之33236-(WT)抗體發生反應而作為誘餌揮發作用,而抑制了添加第2試劑後之非特異因子與33236F(ab')
2抗體結合乳膠之非特異凝集。
(3)於使用添加有33236-(W51A)修飾抗體之第1試劑之實施例9中,與比較例10同樣地,33236F(ab')
2抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。
(4)於使用添加有33236-(K95A)修飾抗體之第1試劑之實施例10中,與比較例10同樣地,33236F(ab')
2抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。
(5)於使用添加有33236-(CDR3-A)修飾抗體之第1試劑之實施例11中,與比較例10同樣地,33236F(ab')
2抗體結合乳膠之吸光度變化量大幅降低(成為2.0 mAbs.以下),非特異凝集得到抑制。
(6)綜上所述,可知即便為與試驗例2不同之測定對象,藉由使本案發明之CDR修飾抗體存在於抗原抗體反應系統內,而作為誘餌發揮作用,能夠抑制由試樣中之非特異因子導致之抗體敏感乳膠之非特異凝集。
[試驗例7]添加CDR修飾抗體對特異反應之影響驗證(LTIA法2)
藉由添加有本案發明之修飾抗體之LTIA試劑,進行試樣中之BNP之濃度測定。
1.測定試劑
(1)第1試劑
[比較例11]使用比較例9中所示之第1試劑。
[比較例12]使用比較例10中所示之第1試劑。
[實施例12]使用實施例9中所示之第1試劑。
[實施例13]使用實施例10中所示之第1試劑。
[實施例14]使用實施例11中所示之第1試劑。
(2)第2試劑
使用Nanopia(註冊商標)BNP-A(Sekisui Medical股份有限公司)之第2試劑。
2.試樣
將作為濃度已知試樣之以下試樣供於測定。
(1)Nanopia BNP BNP用校正液(Sekisui Medical股份有限公司)
3.測定步驟
組合第1試劑與第2試劑,並使用日立7180型自動分析裝置,測定上述濃度已知試樣(Nanopia BNP BNP用校正液)。具體而言,於試樣12 μL中加入第1試劑150 μL,於37℃保溫5分鐘後,加入第2試劑50 μL並進行攪拌。其後,歷時5分鐘,於主波長570 nm、副波長800 nm時測定隨著凝集形成而產生之吸光度變化。
4.測定結果
將測定結果示於表6。
[表6]
R1添加抗體(100 μg/mL) | ||||||
BNP顯示濃度 | 比較例11 未添加抗體 | 比較例12 添加33236-(WT)抗體 | 實施例12 添加33236-(W51A)抗體 | 實施例13 添加33236-(K95A)抗體 | 實施例14 添加33236(CDR3-A)抗體 | |
Cal① | 0.0 pg/mL | 6 | -1 | 1 | -4 | 0 |
Cal② | 102.8 pg/mL | 60 | 10 | 50 | 46 | 41 |
Cal③ | 214.4 pg/mL | 131 | 25 | 120 | 117 | 104 |
Cal④ | 402.2 pg/mL | 256 | 52 | 234 | 229 | 223 |
Cal⑤ | 921.7 pg/mL | 443 | 141 | 430 | 428 | 425 |
Cal⑥ | 2058.0 pg/mL | 590 | 297 | 577 | 580 | 582 |
對於特異反應之影響 | - | 有阻礙 | 無影響 | 無影響 | 無影響 | |
單位(mAbs.) |
5.探討
(1)相對於在未添加抗體之比較例11中所觀察到之BNP濃度依賴性之吸光度測定值,於使用添加有33236-(WT)抗體之第1試劑之比較例12中,吸光度明顯降低。表示藉由添加33236-(WT)抗體,而阻礙試樣中之BNP與抗體結合乳膠之特異反應。
(2)於使用添加有33236-(W51A)修飾抗體之第1試劑之實施例12中,與比較例11同樣地,觀察到BNP濃度依賴性之吸光度上升,其程度亦同等。因此,表示33236-(W51A)修飾抗體不對BNP與抗體結合乳膠之特異反應造成影響。
(3)於使用添加有33236-(K95A)修飾抗體之第1試劑之實施例13中,與比較例11或實施例12同樣地,觀察到BNP濃度依賴性之吸光度上升,其程度亦同等。因此,表示33236-(K95A)修飾抗體不對BNP與抗體結合乳膠之特異反應造成影響。
(4)於使用添加有33236-(CDR3-A)修飾抗體之第1試劑之實施例14中,與比較例11或實施例12、13同樣地,觀察到BNP濃度依賴性之吸光度上升,其程度亦同等。因此,表示33236-(CDR3-A)修飾抗體不對BNP與抗體結合乳膠之特異反應造成影響。
(5)綜上所述,即便為與試驗例3不同之測定對象,藉由對特異抗體之CDR胺基酸序列進行修飾,獲得了於免疫測定方法中不對特異反應造成影響並作為誘餌發揮作用之非特異反應抑制劑。
[產業上之可利用性]
根據本發明,藉由一種檢測方法,可抑制試樣中所包含之非特異反應,而進行準確測定,上述檢測方法,其係藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法,且特徵在於:使用上述特異抗體之修飾抗體,並包含以下之步驟:
a)使試樣與修飾抗體接觸之步驟
b)與a)之步驟同時或於a)之步驟後,使上述試樣與特異抗體接觸之步驟。進而,即便本發明之修飾抗體相對於特異抗體之濃度比率較低,亦可發揮效果,更加減輕對於抗原抗體反應之影響。因此,亦可提供包含上述修飾抗體且可抑制非特異反應之檢測試劑、以上述修飾抗體作為有效成分之非特異反應抑制劑。
無
[圖1]係表示自抗體產生細胞取得可變區基因及序列分析之概要。自抗體產生細胞製備全RNA後,藉由反轉錄反應與模板轉換(template switching)法而合成全長cDNA,藉由使用對於5'末端及恆定區具有特異性之引子之PCR而取得H鏈、L鏈之可變區基因片段。將其等選殖後,對群落PCR(colony PCR)擴增產物進行定序,藉此確定可變區基因序列。
[圖2]係表示代表性之H鏈及L鏈可變區基因擴增片段之分析結果之例。藉由瓊脂糖電泳檢測到約0.5 kb之PCR擴增產物。大小標記使用Quick-Load Purple 1kb Plus DNA Ladder。
[圖3]係表示次選殖後之鹼基序列確定方法之概率。將抗體可變區基因片段選殖至載體後,基因轉殖至大腸桿菌以進行轉形,藉此單選殖化。藉由使用載體序列特異性引子之群落PCR來篩選推測為抗體基因之殖株,進行鹼基序列之確定。
[圖4]係表示代表性之群落PCR產物之瓊脂糖電泳之結果。H鏈、L鏈均檢測出約0.9 kb之擴增產物(圖中以「←」表示),純化後確定鹼基序列。大小標記使用Quick-Load Purple 1kb Plus DNA Ladder。
[圖5]係表示利用免疫墨點法獲得之暫時性表現92204R抗體之分析結果。於CHO-K1(F)細胞中共表現H鏈及L鏈,將其培養上清液中之抗體於非還原條件下供於免疫墨點法,使用抗大鼠IgG HRP(anti-Rat IgG HRP)進行檢測。空白對照(Mock):使用將基因轉殖陰性之CHO-K1(F)細胞進行相同時間培養後所得之培養上清液。
[圖6]係表示暫時性表現92204R抗體之反應性分析之結果。藉由固相ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,酵素結合免疫吸附分析法)對於暫時性表現抗體(培養上清液)對於抗原之反應性進行分析。空白對照(Mock):使用將基因轉殖陰性之CHO-K1(F)細胞進行相同時間培養後所得之培養上清液。
[圖7]係表示加入有「用以篩選和與抗原之反應相關之可變區之各種點變異」的變異抗體之CDR序列。為了探索與對於抗原之反應性密切相關之區域,製備將所推定之H鏈可變區之CDR1(A)、CDR2(B)、CDR3(C)之胺基酸置換為丙胺酸(圖中,畫有底線)而成之變異抗體。
[圖8]係表示代表性變異抗體之利用免疫墨點法所得之暫時性表現結果。使H鏈及L鏈於CHO-K1(F)細胞中共表現,將其培養上清液中之抗體於非還原條件下供於免疫墨點法,使用抗大鼠IgG HRP進行檢測。空白對照(Mock):使用將基因轉殖陰性之CHO-K1(F)細胞進行相同時間培養後所得之培養上清液。
[圖9]係表示針對代表性變異抗體對於抗原之反應性,藉由固相ELISA對暫時性表現變異抗體(培養上清液)對於抗原之反應性進行分析所得之結果。WT:暫時性表現之野生型抗體、空白對照(Mock):將基因轉殖陰性之CHO-K1(F)細胞進行相同時間培養。PC:陽性對照組、使用來自腹水之純化抗體。
[圖10]係表示H鏈變異抗體(H_105-107-A、H_Δ105-107)、L鏈變異抗體(L_CDR3-A)之H鏈、L鏈之型及修飾內容的圖。藉由人工基因合成取得兩抗體之基因片段,並選殖至哺乳細胞表現載體。
[圖11]係表示利用免疫墨點法所得之修飾抗體IgG之分析結果。藉由抗大鼠IgG HRP檢測到由ExpiCHO細胞暫時性表現之培養上清液中之修飾抗體IgG。
[圖12]係表示純化抗體之純度分析結果之圖。將純化後之抗體於還原及非還原條件下進行SDS-PAGE後,進行CBB染色。Cont.(#IL-701):經純化之來自腹水之92204R抗體。
[圖13]係表示對92204R_H_Δ105-107抗體及92204R_L_CDR3-A抗體之等電點進行分析所得之結果。
[圖14]係表示本發明之變異抗體之反應性分析結果之圖。分別製備100 μg/mL之變異抗體,藉由固相ELISA來評價對於抗原之反應性。空白組(Blank):使用無固相抗原之孔作為陰性對照組。
[圖15]係表示對「在LTIA法中由添加CDR修飾抗體導致之對特異反應之影響」進行驗證所得之結果的圖。橫軸表示sIL-2R濃度(U/mL),縱軸表示感度(mAbs.)。
[圖16]係表示作為抗BNP IgG單株抗體33236之L鏈CDR修飾抗體之33236-(W51A)修飾抗體、33236-(K95A)修飾抗體及33236-(CDR3-A)修飾抗體之修飾內容的圖。
寄存編號
[關於寄存生物材料之]
(1)產生抗體編號92204R抗體之融合瘤
1 寄存該生物材料之寄存機關之名稱及地址
獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄存中心
日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室(郵政號碼292-0818)
2 將生物材料寄存於1之寄存機關之日期
2015年9月25日
3 1之寄存機關分配給寄存之寄存編號
NITE BP-02123
(2)產生抗體編號33236抗體之融合瘤
1 寄存該生物材料之寄存機關之名稱及地址
獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許微生物寄存中心
日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室(郵政編號292-0818)
2 將生物材料寄存於1之寄存機關之日期
2022年12月16日
3 1之寄存機關分配給寄存之寄存編號
NITE BP-03799
(收置編號為NITE ABP-03799)
TW202342979A_111150228_SEQL.xml
Claims (29)
- 一種檢測方法,其係藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之方法,且特徵在於包含: a)使試樣與修飾抗體接觸之步驟;及 b)與a)之步驟同時或於a)之步驟後,使上述試樣與上述特異抗體接觸之步驟,且 上述修飾抗體係上述特異抗體之抗體輕鏈(以下,縮寫為L鏈)及/或抗體重鏈(以下,縮寫為H鏈)中之可變區之一部分或全部經修飾而成。
- 如請求項1之檢測方法,其中,上述修飾抗體係上述特異抗體之L鏈及H鏈之6個互補決定區(以下,縮寫為CDR)中之至少1個CDR及/或CDR之立體結構所涉及之區域之一部分或全部經修飾,且與上述CDR不同之至少1個CDR未經修飾者。
- 如請求項1或2之檢測方法,其中,上述修飾抗體對於上述對象抗原之反應性為上述特異抗體對於上述對象抗原之反應性的30%以下。
- 如請求項1至3中任一項之檢測方法,其中,抗原抗體反應系統內之上述修飾抗體相對於上述特異抗體之濃度比率為1~29倍。
- 如請求項1至4中任一項之檢測方法,其中,上述修飾抗體為完整抗體或片段抗體。
- 如請求項1至5中任一項之檢測方法,其包含1種或2種以上之上述特異抗體,且包含上述特異抗體中之至少1種抗體之修飾抗體。
- 如請求項1至6中任一項之檢測方法,其中,上述特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體,上述修飾抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體之至少任一者之修飾抗體。
- 如請求項1至7中任一項之檢測方法,其中,上述特異抗體為完整抗體、或包含與上述對象抗原之結合部位之片段抗體。
- 如請求項1至8中任一項之檢測方法,其中,上述檢測方法為基於均相法或非均相法之方法。
- 如請求項1至9中任一項之檢測方法,其中,上述特異抗體之至少1種係與不溶性載體結合之抗體、或者經標記物標記之抗體。
- 如請求項10之檢測方法,其中,不溶性載體為乳膠粒子、金膠體、磁性粒子、孔狀板或多孔性膜片。
- 如請求項1至11中任一項之檢測方法,其中,使試樣中之對象抗原與特異抗體接觸之步驟為於溶液中進行之步驟。
- 如請求項12之檢測方法,其進而包含如下步驟:對溶液中之乳膠粒子之凝集程度進行光學檢測。
- 如請求項13之檢測方法,其中,光學檢測之步驟包含如下步驟:對取決於溶液中之抗原抗體複合體之量而發生反應之顯色劑之顯色、或者標記物之量進行光學檢測。
- 一種檢測試劑,其係用以藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原者,並包含以下抗體: (1)與上述抗原特異性結合之特異抗體、 (2)上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體。
- 如請求項15之檢測試劑,其中,上述修飾抗體為上述特異抗體之L鏈及H鏈之6個CDR中之至少1個CDR及/或CDR之立體結構所涉及之區域之一部分或全部經修飾,且與上述CDR不同之至少1個CDR未被修飾者。
- 如請求項15或16之檢測試劑,其中,上述修飾抗體對於上述對象抗原之反應性,相對於上述特異抗體對於上述對象抗原之反應性,為30%以下。
- 如請求項15至17中任一項之檢測試劑,其被製備成抗原抗體反應系統內之上述修飾抗體相對於上述特異抗體之濃度比率達到1~29倍。
- 如請求項15至18中任一項之檢測試劑,其中,上述修飾抗體為完整抗體或片段抗體。
- 如請求項15至19中任一項之檢測試劑,其包含1種或2種以上之上述特異抗體,且包含上述特異抗體中之至少1種抗體之修飾抗體。
- 如請求項15至20中任一項之檢測試劑,其中,上述特異抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體,上述修飾抗體包含第1特異抗體及第2特異抗體之至少任一者之修飾抗體。
- 如請求項15至21中任一項之檢測試劑,其中,上述特異抗體為完整抗體、或包含與上述對象抗原之結合部位之片段抗體。
- 如請求項15至22中任一項之檢測試劑,其中,上述檢測試劑為基於均相法或非均相法之試劑。
- 如請求項15至23中任一項之檢測試劑,其中,上述特異抗體之至少1種為與不溶性載體結合之抗體、或者經標記物標記之抗體。
- 如請求項24之檢測試劑,其中,不溶性載體為乳膠粒子、金膠體、磁性粒子、孔狀板或多孔性膜片。
- 一種試劑套組,其係包含(1)及(2)之試劑,且用以藉由與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體來檢測該抗原之檢測試劑套組,其特徵在於:於(1)或(2)之試劑之至少任一者中包含該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體, (1)包含緩衝液之試劑、 (2)包含特異抗體之試劑。
- 一種對象抗原之檢測方法中之非特異反應抑制方法,其特徵在於:將與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體、與該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成之修飾抗體組合而使用。
- 一種非特異反應抑制劑,其包含如下抗體,該抗體和與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體一同被使用,且係上述特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成者。
- 一種抗體,其係和與試樣中之對象抗原特異性結合之特異抗體一同被使用,且係該特異抗體之L鏈及/或H鏈中之可變區之一部分或全部經修飾而成者。
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