JP7382071B2 - 糖化ヘモグロビン(%)の測定方法 - Google Patents
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Description
前記糖化ペンタペプチドの定量は、マウスモノクロナール抗HbA1c抗体を用いた凝集阻害測定法により行われる。しかし、本方法では2種類のペプチダーゼ処理工程が必要であり、操作が煩雑である。
(1)試料中の糖化ヘモグロビン(%)を測定する方法であって、
不溶性担体と試料とを接触させることにより試料中の糖化ヘモグロビンを不溶性担体に吸着させる工程と、
不溶性担体に吸着した糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体とを接触させることにより抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体、糖化ヘモグロビン、及び不溶性担体の複合体を形成する工程と、
当該複合体と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体とを接触させることにより不溶性担体を凝集させる工程と、
を含む前記糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
(2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体が、ヒトIgGとは反応しない抗体である(1)に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
(3)不溶性担体がラテックスである(1)又は(2)に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
(4)試料が全血又は血球である(1)~(3)のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
(5)凝集度合いを光学的に検出する工程を含む(1)~(4)のいずれかに記載の測定方法。
(6)少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体を含む糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体
(7)さらに、不溶性担体を含む(6)に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
(8)第1試薬と第2試薬を含む糖化ヘモグロビン(%)測定試薬であって、
第1試薬は、不溶性担体を含み、第2試薬は、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体を含む(7)に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体
(9)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体が、ヒトIgGとは反応しない抗体である(6)~(8)のいずれかに記載の測定試薬。
(10)不溶性担体がラテックスである(6)~(9)のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
(11)(6)~(10)のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬を含む糖化ヘモグロビン(%)測定キット。
(12)ヒト糖化ヘモグロビンに結合しているモノクローナル抗体と反応し、かつ、ヒトIgGに反応しないモノクローナル抗体。
(13)異常ヘモグロビンを含む試料中の糖化ヘモグロビン(%)測定値の乖離低減方法であって、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体、不溶性担体及び試料とを接触させる工程を含む前記乖離低減方法。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体
(14)異常ヘモグロビンを含む試料中の糖化ヘモグロビン(%)測定値の高値化抑制方法であって、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体、不溶性担体及び試料とを接触させる工程を含む前記高値化抑制方法。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体には、少なくとも第1のモノクローナル抗体と第2のモノクローナル抗体があり、糖化ヘモグロビン(%)の測定に際してはこれらを組み合わせて用いる。第1のモノクローナル抗体は、ヒトの糖化ヘモグロビンと特異的に反応するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよい。ヒトの糖化ヘモグロビンと特異的に反応するとは、ヒト糖化ヘモグロビンには反応するが、糖化されていないヒトヘモグロビンには実質的に反応しないことを言う。
本発明の第2のモノクローナル抗体は、少なくとも以下の1)の性質を有するモノクローナル抗体であればいずれのモノクローナル抗体でもよい。望ましくはさらに2)の性質を有するモノクローナル抗体である。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応する
2)ヒトIgGに反応しない
従来のような、第二抗体としてポリクローナル抗体を用いた免疫凝集法では、異常ヘモグロビンが存在すると糖化ヘモグロビン(%)の測定値が高値化して真値から乖離するという問題があった。しかし、本発明の測定方法のように、第二抗体を、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に対するモノクローナル抗体とすることで、理由は定かではないが、試料中に異常ヘモグロビンが存在しても正確に糖化ヘモグロビン(%)を測定することが可能となった。
本明細書中、第1のモノクローナル抗体と第2のモノクローナル抗体は、それぞれの抗原と反応させる工程が順次行われる場合は、第1のモノクローナル抗体は1次抗体、第2のモノクローナル抗体は2次抗体と呼ぶことがある。
本発明の抗体と、ある化合物が「反応しない」とは、ある化合物と実質的に反応しないことをいい、例えば、後述する実施例では、抗原固相化ELISAのプレートリーダーによる測定で0.1Abs未満をいう。
また、第2のモノクローナル抗体を取得するための抗原として認識される第1のモノクローナル抗体はモノクローナル抗体全体であってもよく、その一部であってもよい。
第1のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、産生される抗体が実際の測定に用いられる条件を考慮し、効率的に行うことができる。例えば、ELISA法、RIA法等により、HbA1cに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより得られる。具体的には、まず、培養上清中のモノクローナル抗体を、固相化した糖化ペプチド結合蛋白と反応させ、次いで固相化したHbA0と反応させる抗原固相化ELISA法などにより、HbA1cに対し高い反応性を示し、かつ、HbA0とは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することなどにより得ることができる。
具体的には、まず、培養上清中のモノクローナル抗体から、抗原固相化ELISA法などにより、抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に対し高い反応性を示すハイブリドーマを選択する工程、及びヒトIgGとの反応性がマウスIgGよりも低いものを選択する工程の2つの工程を経て得ることができる。
試料中に存在する糖化ヘモグロビン(%)を検出するための測定用試薬はそれぞれ少なくとも以下の要素:
(a)第1のモノクローナル抗体
(b)第2のモノクローナル抗体
(c)不溶性担体粒子
が必要とされる。
本発明の不溶性担体は未感作のものが好ましい。本発明のラテックス粒子を含む試薬は、適宜緩衝成分(緩衝液)を含む。
ラテックスの凝集の測定は、生じた凝集の程度を光学的あるいは電気化学的に観察することにより糖化ヘモグロビン(%)を測定できる。光学的に観察する方法としては、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を光学機器で測定する方法(エンドポイント法、レート法等)が挙げられる。
試料を測定して得た吸光度等の測定値を、標準物質(糖化ヘモグロビン(%)が既知の試料)を測定して得た吸光度等の測定値と比較して、試料中に含まれていた測定対象物質の濃度(定量値)を算出する。なお、透過光又は散乱光などの吸光度等の測定は、1波長測定であっても、又は2波長測定(2つの波長による差又は比)であってもよい。測定波長は、400nmから800nmの中から選ばれるのが一般的である。
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
1.第1のモノクローナル抗体の取得
本発明の第一のモノクローナル抗体として、抗HbA1cモノクローナル抗体を以下のように製造した。
(1)精製HbA0及び精製HbA1cの調製
HbA0及びHbA1cは、非特許文献(Melisenda J.McDonald et al、JBC、253(7)、2327-2332、1978)記載のBio-Rex70(バイオラッド社)を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、ヒト赤血球溶血液から精製し、以降の実験に用いた。
2種類のアミノ配列のペプチド(VHLTC(配列番号1)及びVHLTPEEKYYC(配列番号2):アルファベットはアミノ酸の一文字表記を示す)は、ペプチド自動合成装置を用いFmoc法により合成、及び精製した。各ペプチドの純度は、HPLCにより95%以上であることを確認した。また、各ペプチドの分子量は、質量分析(MALDI-TOF法)により理論値と同じであることを確認した。
前記2種類のペプチドを特開昭61-172064記載の方法にて糖化し、糖化ペプチド(f-VHLTC及びf-VHLTPEEKYYC:fは、フルクトシル化を意味する)を精製した。すなわち、各配列のペプチドそれぞれとグルコースを無水ピリジン中で反応させて糖化ペプチドを合成し、HPLCで精製した。各糖化ペプチドの分子量は、質量分析(MALDI-TOF法)により理論値、すなわち各ペプチドの分子量に162を加算した分子量と同じであることを確認した。
第1のモノクローナル抗体である抗HbA1cモノクローナル抗体は、以下のように製造した。まず、前記(2)で合成した糖化ペプチド(f-VHLTPEEKYYC)をスカシ貝ヘモシアニンに結合させ、これを免疫原としてマウスに免疫した。ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ELISAで糖化ペプチド結合蛋白と反応し、かつ精製HbA0と反応しない株を6株選択した。クローニングを経て、最終的に抗原固相化ELISAで精製HbA1cと反応し、かつ精製HbA0と反応しないモノクローナル抗体(抗体68207、68208、68210、68211、68213、68214)を得た。
本発明の第2のモノクローナル抗体として、抗HbA1cモノクローナル抗体に対するモノクローナル抗体を以下のように製造した。
(1)免疫
前記1.で得られた3種の異なるマウス抗HbA1cモノクローナル抗体(68210、68211、68213:積水メディカル社製)を免疫原とし、ラットを宿主として、定法にて免疫した。最終免疫は細胞融合の3~4日前に行い、脾臓細胞及びリンパ節細胞を回収し、電気融合法またはPEG法でミエローマ細胞(SP2/O)と融合した。融合細胞は96穴プレートで培養し、細胞融合から7~8日後に培養上清を回収して下記に示すスクリーニングを行った。
ハイブリドーマのスクリーニングでは、抗原固相化ELISAで、マウスIgGと反応し、且つヒトIgGと反応しない株を選択した。
(2-1)抗原固相化ELISA
(i)ELISA用96穴プレートに固相化抗原としてPBSで1μg/mLに希釈したマウス抗HbA1cモノクローナル抗体(68208、あるいは68214)またはヒトIgGを50μL/wellずつ分注し、室温で2時間静置した。
(ii)0.05%Tween20-PBS(PBST)(400μL/well)で3回洗浄後、ブロッキング液として1%BSA-PBST(100μL/well)を分注し、室温で1時間静置した。
(iii)ブロッキング液を除去後、2倍希釈した培養上清を50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。
(iv)3回洗浄後、10000倍希釈したHRP標識ヤギ抗ラットポリクローナル抗体を50μL/wellずつ分注し、室温で1時間静置した。
(v)3回洗浄後、OPD発色液を50μL/wellずつ分注し、室温で10分間静置した。
(vi)停止液を50μL/wellずつ分注し、反応停止後プレートリーダーで吸光度を測定した(Abs.492nm)。
計13株(S07201R~S072013R)のハイブリドーマを取得した(表1)。
スクリーニングで選択したハイブリドーマを限界希釈法で単クローン化し、定法によりマウス腹腔に投与して、腹水を得た。得られた腹水から抗体を精製し、抗原固相化ELISAにて反応性を確認した。
(3-1)抗原固相化ELISA
固相化抗原として68210、68213を用いた以外は、(2)スクリーニングと同様の方法で行った。
得られた13種の抗体は、いずれの固相化抗原に対してもヒトIgGよりマウスIgG(抗マウスIgGモノクローナル抗体)に対して強い反応性を示した。
(1)実施例処方
(i)第一試薬の組成を以下に示す。
10mM EPPS(pH8.0)
ラテックス粒子(平均粒径約120nm)
(ii)第二試薬の組成を以下に示す。
10mM Bis-Tris(pH6.0)
1次抗体(0.1mg/mL マウス抗HbA1cモノクローナル抗体)(表3)
2次抗体(0.1mg/mL ラット抗マウスIgGモノクローナル抗体)(表3)
500mM NaCl
0.05% Tween-20
0.09%アジ化ナトリウム
測定には、日立7170形自動分析装置を使用した。検体6.3μLと第一試薬150μLを反応セルに添加し、37℃で5分間反応させた後、さらに第二試薬50μLを反応セルに添加し、37℃で5分間反応させ、2ポイントエンド法(測光ポイント19-34)、主波長660nm、副波長800nmで吸光度変化量を測定した。検量線は、標準品として協和メデックス社製 デタミナーキャリブレーターHbA1c液状試薬用を、メーカー指定の方法で調整して作製した。
(i)比較例1:HPLC法(アークレイ社製アダムスHA-8180T)
メーカーにより指定された方法で使用して、各種検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定をおこなった。
(ii)比較例2:2次抗体としてポリクローナル抗体を用いたLTIA法(1)(協和メデックス社製デタミナーL HbA1c)
協和メデックス社製のデタミナーL HbA1cをメーカーにより指定された方法で使用して、各種検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定をおこなった。測定の際、装置は日立7170形自動分析装置を使用した。
実施例2に示した第一試薬、および、1次抗体として68210を0.06mg/mL、2次抗体としてヤギ抗マウスIgGポリクローナル抗体(Fc特異的抗体:蛋白精製工業社製)0.05mg/mLを添加した以外は実施例2と同一組成である第二試薬を用いて、各種検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定をおこなった。測定の際、装置は日立7170形自動分析装置を使用した。
(1)正常検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定
既製品である比較例2(協和メデックス社製デタミナーL HbA1c)に対して、参考例および実施例1~17において正常検体の糖化ヘモグロビン(%)を高精度に測定できていることを確認した。
EDTA採血管で採血された任意の正常血液検体(同意を得たボランティアより入手)を、800Gで5分間遠心分離し、得られた下層の血球層を精製水で100倍希釈したものの糖化ヘモグロビン(%)を測定した。50検体測定した際の、各試薬のデタミナーL HbA1cに対する相関式および相関係数を表4に示す。
いずれも相関係数は良好であり、参考例、実施例1~17において、正常検体について高精度に糖化ヘモグロビン(%)を測定できることが示された。
市販の異常Hb検体(ビジコムジャパンより購入)について糖化ヘモグロビン(%)を測定した。これらは血球検体であり、採血後、遠心分離により血球層を分離した後、-70℃以下で凍結保存されたものである。
(2-1)HbS含有検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定
比較例1に示したHPLC法であるアークレイ社製アダムスHA-8180Tは、バリアントモード(Variant mode)にて、血球および全血検体について、異常HbであるHbSとHbCを検出できる。使用したHbSを含有する血球検体のHbS(%)は、33.2%であった。
上記のHbSを含有する検体の糖化ヘモグロビン(%)をHPLC法で測定したところ、6.2%であった。また、上記のHbSを含有する検体を実施例1~10、比較例2、参考例の試薬で測定した糖化ヘモグロビン(%)と、HPLC法で測定した際の糖化ヘモグロビン(%)との差(糖化ヘモグロビン(%))を表5に示す。
2次抗体としてポリクローナル抗体を使用している比較例2では、測定値は6.9%となり、HPLC法に対して0.7%も高値化した。また、2次抗体としてポリクローナル抗体を組み合わせた参考例においても、測定値は6.7%となり、HPLC法に対して0.5%の高値化が認められた。
一方、2次抗体として本発明のモノクローナル抗体を組み合わせた実施例1~10においては、測定値は5.9%~6.4%となり、HPLC法との差異は-0.2%~0.2%であった。変異HbであるHbSを含む血球検体において、2次抗体としてモノクローナル抗体を使用した場合に、測定精度が向上したと言える。
使用したHbCを含有する血球検体のHbC(%)をHPLC法にて測定したところ、31.8%~40.9%であった。
上記のHbCを含有する検体の糖化ヘモグロビン(%)をHPLC法にて測定したところ、4.8~5.9%であった。また、上記のHbCを含有する検体を比較例2、参考例、実施例1の試薬で測定した糖化ヘモグロビン(%)と、HPLC法で測定した際の糖化ヘモグロビン(%)との差 (糖化ヘモグロビン(%))を表6に示す。
上記の検体を、2次抗体としてポリクローナル抗体を使用している比較例2で測定したところ、HPLC法に対する差は0.9~3.1%と高く、比較例2の試薬ではHbCを含有する血球検体の糖化ヘモグロビン(%)を正確に測定することはできなかった。参考例においては、HPLC法に対する差は0.5~1.7%であり、比較例2より正確に糖化ヘモグロビン(%)を測定することができた。
さらに、2次抗体として本願発明のモノクローナル抗体を組み合わせた実施例1においては、HPLC法に対する差は-0.4~-0.2%であり、HbCを含有する血球検体においても糖化ヘモグロビン(%)を高い精度で測定することができた。
(1)正常検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定
既製品である比較例2(協和メデックス社製デタミナーL HbA1c)の血球検体の糖化ヘモグロビンの測定値に対して、比較例3および実施例3、4、8、9、11-13,15おいて全血の正常検体について高精度に糖化ヘモグロビン(%)を測定できていることを確認した。
試験例1(1)正常検体の測定で使用した、EDTA採血管で採血された任意の正常血液検体の糖化ヘモグロビン(%)を測定した。各検体は、遠心分離することなく全血状態のまま使用し、精製水で50倍希釈して調製した。50検体測定した際の各試薬の全血検体の測定結果について、デタミナーL HbA1cで血球検体を測定した際の測定値に対する相関係数を表8に示す。比較例2の試薬では、他の試薬を用いた場合と比較して相関係数が最も低く、全血検体について精度よく糖化ヘモグロビン(%)を測定できなかった。一方、参考例、実施例3、4、8、9、11-13,15においては、いずれも相関係数は良好であり、全血の正常検体について高精度に糖化ヘモグロビン(%)を測定できていることが示された。
市販の異常Hb検体(ビジコムジャパンより購入)を測定に使用した。これらは全血検体であり、採血後、-70℃以下で凍結保存されたものである。
(2-1)HbS含有検体の糖化ヘモグロビン(%)の測定
使用したHbSを含有する全血検体のHbS(%)および糖化ヘモグロビン(%)をHPLC法にて測定したところ、それぞれ28.8~37.1%および4.6~6.5%であった。
比較例2、参考例、実施例3、4、11、13、15の試薬で測定した際の測定値およびHPLC法に対する測定値の差 糖化ヘモグロビン(%)を表9に示す。
比較例2の試薬で測定した場合の含量は、HPLC法対して0.5~1.4%高値化し、測定精度は不良であった。
次に、参考例の試薬で測定した場合の含量は、HPLC法に対して0.3~0.6%高値化したものの比較例2より良好であった。
これに対し、実施例3、4、11、13、15の試薬で測定した場合の測定値は、HPLC法との差が-0.1~0.3%と小さく、測定精度は良好であった。また、2次抗体として本発明のモノクローナル抗体を使用した場合、2次抗体としてポリクローナル抗体使用した場合(参考例)に比べて測定精度がさらに向上した。
使用したHbCを含有する全血検体のHbC(%)および糖化ヘモグロビン(%)をHPLC法にて測定したところ、それぞれ34.9%~39.4%および5.0~5.5%であった。
比較例2、参考例、実施例3、8、9、12、13の試薬で測定した場合の測定値のHPLC法に対する差(糖化ヘモグロビン(%))を表10に示す。
まず、比較例2で測定した場合の測定値は、HPLC法に対して3.4~4.7%と大幅に高値化した。
次に、参考例では、HPLC法に対して0.9~1.1%高値化したものの比較例2より良好であった。
これに対し、実施例3、8、9、12、13の試薬は、HPLC法に対する差は0.1~0.4%と小さく、測定精度は良好であった。2次抗体として本発明のモノクローナル抗体を使用した場合に、測定精度が向上したと言える。
Claims (11)
- HbS及びHbCのいずれかあるいは両方を含む可能性のある試料中の糖化ヘモグロビン(%)を液中で測定する方法であって、
緩衝液に含まれる不溶性担体と試料とを接触させることにより試料中の糖化ヘモグロビンを不溶性担体に吸着させる工程と、
不溶性担体に吸着した糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体とを接触させることにより抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体、糖化ヘモグロビン、及び不溶性担体の複合体を形成する工程と、
当該複合体と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体とを接触させることにより不溶性担体を液中で凝集させる工程と、
を含む前記糖化ヘモグロビン(%)測定方法。 - 不溶性担体がラテックスである請求項1に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
- 試料が全血又は血球である請求項1又は2に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定方法。
- 凝集度合いを光学的に検出する工程を含む請求項1~3のいずれかに記載の測定方法。
- 少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体及び不溶性担体を含む緩衝液を含む、HbS及びHbCのいずれかあるいは両方を含む可能性のある試料を測定するための、糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体 - 第1試薬と第2試薬を含む糖化ヘモグロビン(%)測定試薬であって、 第1試薬は、不溶性担体を含む緩衝液を含み、第2試薬は、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体を含む請求項5に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体 - 不溶性担体がラテックスである請求項5又は6に記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬 。
- 請求項5~7のいずれかに記載の糖化ヘモグロビン(%)測定試薬を含む糖化ヘモグロビン(%)測定キット。
- HbS及びHbCのいずれかあるいは両方を含む試料中の糖化ヘモグロビン(%)測定値の乖離低減方法であって 、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体、不溶性担体を含む緩衝液及び試料とを接触させる工程を含む前記乖離低減方法。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体 - HbS及びHbCのいずれかあるいは両方を含む試料中の糖化ヘモグロビン(%)測定値の高値化抑制方法であって、少なくとも以下の2種のモノクローナル抗体、不溶性担体を含む緩衝液及び試料とを接触させる工程を含む前記高値化抑制方法。
1)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体
2)抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体 - HbS及びHbCのいずれかあるいは両方を含む可能性のある試料中の糖化ヘモグロビン(%)測定値の乖離低減あるいは高値化抑制のための測定方法であって、
緩衝液に含まれる不溶性担体と試料とを接触させることにより試料中の糖化ヘモグロビンを不溶性担体に吸着させる工程と、
不溶性担体に吸着した糖化ヘモグロビンと抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体とを接触させることにより抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体、糖化ヘモグロビン、及び不溶性担体の複合体を形成する工程と、
当該複合体と抗糖化ヘモグロビンモノクローナル抗体に反応するモノクローナル抗体であってヒトIgGとは反応しないモノクローナル抗体とを接触させることにより不溶性担体を液中で凝集させる工程と、
を含む前記測定方法。
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