JP6351113B2 - 振とう型培養装置及びこれを用いた培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、振とう型培養装置及びこれを用いた培養方法に関する。

微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などの大量培養は、医薬品、食品、化粧品や、これらの原材料などとして有用な各種物質の生産に広く用いられている。
特許文献１には、撹拌翼を有した撹拌装置を気密に収納した培養袋が記載されている。この培養装置は、撹拌時に撹拌翼により、高いシェア（せん断応力）が系内において生じるものであった。また、撹拌翼の軸受け部分の摺動を原因としたパーティクルの発生があった。さらに、価格面の課題、撹拌翼と培養袋の接合方法の課題があった。
特許文献２には、平袋からなる培養袋をトレイ状の支持装置に固定した培養装置が記載されている。この培養装置の場合、平袋が横置きに配置されるため、大スケール化には占有面積の増大の課題があった。

特許第４９８６６５９号公報 特許第５２１４７１４号公報

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、撹拌翼を使わずに大スケールの培養が可能な振とう型培養装置及びこれを用いた培養方法を提供することを課題とする。

前記課題を解決するため、軟包装材からなる培養袋と、前記培養袋全体を収容してその温度調整を行うことができるように配置され、上部に蓋部を有する外殻容器と、前記培養袋を収容した前記外殻容器を振とうさせる動力源とを含み、撹拌翼を有しない振とう型培養装置であって、前記培養袋の上部及び下部にそれぞれチューブが連結され、前記外殻容器の底部及び前記蓋部に設けられた穴には、それぞれ前記チューブが通されており、前記培養袋は前記外殻容器の外では角筒型であり、前記外殻容器の内部空間が円柱形状であり、前記外殻容器の底面に円柱の円が位置し、円の直径と、円柱の高さとの比が、１：２〜２：１の範囲内であり、前記培養袋に内容物が収容され、前記内容物の重量により前記培養袋が変形して前記外殻容器の内面に密着することにより、前記培養袋の底面及び側面が前記外殻容器に支持されており、前記培養袋を収容した前記外殻容器を、前記外殻容器の中心が円形の軌道上で水平方向に公転しながら、振とうさせることにより、前記培養袋内の内容物を撹拌混合することができることを特徴とする振とう型培養装置を提供する。

さらに前記外殻容器を前記中心の周りに自転させることが好ましい。
回転と停止をパターンで繰り返すプログラムを備えてなることが好ましい。
正方向及び逆方向の回転が可能な機構を含むことが好ましい。
カウンターバランスを搭載していることが好ましい。
前記外殻容器の側壁部に窓を有することが好ましい。
前記外殻容器の内面がバフ研磨され平滑であることが好ましい。
前記培養袋を収容した前記外殻容器の振とうの回転数が０．１〜２０００ｒｐｍ、振幅が０．１〜１００ｍｍであることが好ましい。
前記培養袋内の前記内容物の波の高さを検出する装置を含み、前記内容物の波の高さが一定となるように前記培養袋を収容した前記外殻容器の振とうの回転数を調整する調整機構を備えることが好ましい。
前記外殻容器が循環水を通すことができるジャケット構造又はラバーヒーターを含むことが好ましい。
前記培養袋がガゼット袋であり、注出口を備えていることが好ましい。

前記培養袋内の内容物のｐＨ又は溶存酸素濃度（ＤＯ）を測定するセンサーと、前記センサーで得られたデータによるフィードバッグ制御機構を備えていることが好ましい。
前記培養袋は、前記内容物のｐＨを一定にするために酸又はアルカリの投入口を備えていることが好ましい。
前記培養袋は、前記内容物に空気又は酸素を供給するための機構を備えていることが好ましい。

また、本発明は、前記振とう型培養装置を用いた培養方法を提供する。
菌類、酵母、微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、バイオ医薬製造用のＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、再生医療用途のｉＰＳ細胞、幹細胞、分化させた動物細胞のいずれかを培養することが好ましい。

本発明によれば、外殻容器を用い、撹拌翼を使わないことで、少量から大容量までのスケールアップが容易である。また、容器を振とうさせることにより、低いシェア（せん断応力）で１つの容器内で少量から大容量まで撹拌を行うことができ、効率のよい細胞培養ができる。また撹拌翼を有さないため、撹拌翼の軸受け部によるパーティクルの発生を抑制できる。培養により装置が汚染しても、培養袋を交換すればよく、撹拌翼や撹拌磁石を廃棄する必要がないため、従来よりも安価な培養装置を提供することができる。

培養袋の一例を示す斜視図である。 外殻容器の一例を示す斜視図である。 培養袋を収容した外殻容器の一例を示す断面図である。 振とう型培養装置の一例を示す斜視図である。 （ａ）は外殻容器の一例を示す平面図であり、（ｂ）は外殻容器の振とう動作の一例を示す平面図である。

以下、好適な実施形態に基づき、図面を参照して本発明を説明する。

図１に、培養袋１０の一例を示す。この培養袋１０は、フィルム１２，１３などの軟包装材から構成されている。図１では、一対のフィルム１２の間に、一対のガゼット付きフィルム１３を配置し、フィルム１２，１３の周縁部にシール部１１を設けることにより、密封されたガゼット袋を示す。袋の形状としては、円筒型、角筒型等が挙げられる。培養袋１０が、二重袋や三重袋など多重の包装袋であると、液体が漏れにくいのでより好ましい。

培養袋１０を構成するフィルムの材質は特に限定されないが、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリオレフィン等の熱可塑性樹脂や、これらの積層体が挙げられる。培養袋１０に用いるフィルムは、精製工程で用いるフィルムと同じ素材であることが好ましい。培養工程と精製工程で同じフィルムを用いることにより、作られる医薬品の製品品質の担保を容易にすることができる。
培養袋１０の容量（大きさ）は特に限定されないが、例えば０．１Ｌ〜５０００Ｌの大きさとすることができ、好ましくは１〜２０００Ｌである。培養袋１０は、シングルユース（使い捨て）であってもよい。

培養袋１０には、培地や雰囲気ガス等の内容物の追加、取り出し等の目的で、複数のチューブ１４，１５を連結することができる。また、培養袋１０は、注出口１６を備えることができる。注出口１６には、コック、キャップ、先細り状の注ぎ口等を設けることもできる。注出口１６にチューブ１４，１５を連結してもよい。本実施形態の場合、注出口１６の基部１７がフィルム１２の裏側にシールされることにより、注出口１６が培養袋１０に固定されている。
チューブの材質は特に限定されないが、シリコーン、熱可塑性エラストマー等、耐薬品性、耐候性等に優れる材質が好ましい。チューブには、フィルター、フローモニター、流量計、バルブ、ポンプ等を設けてもよい。培養袋１０及びチューブ１４，１５は、培養前に滅菌されていることが好ましい。滅菌手段は培養目的等に応じて適宜選択でき、具体例として、γ線等の放射線、エチレンオキサイド等のガス、水蒸気等による加熱などが挙げられる。

図２に、外殻容器２０の一例を示す。また、図３は、図１の培養袋１０を図２の外殻容器２０に収容した状態の断面図を示す。外殻容器２０は、軟包装材からなる培養袋１０を保護するため、図３に示すように、培養袋１０全体を収容することができる。
外殻容器の構成は特に限定されないが、図２の外殻容器２０は、側壁部２１ａ及び底壁部２１ｂを有する容器本体２１と、側壁部２１ａの上方開口部を閉鎖する蓋部２２とを備える。側壁部２１ａにより培養袋１０の上下方向で全体又は大部分を収容できる場合、蓋部２２を省略してもよい。培養袋１０の側面の下部を容器本体２１で覆い、培養袋１０の側面の上部を蓋部２２で覆うこともできる。

内部の温度変動を抑制するためには、外殻容器２０に対して培養袋１０を出し入れするための開口部を蓋部２２で閉鎖することが好ましい。蓋部２２は、容器本体２１から分離可能な取り外し式でもよく、ヒンジ等により容器本体２１に対して開閉可能に連結されてもよい。
外装容器２０（例えば、容器本体２１及び蓋部２２）の材質は、培養袋１０を保護可能な硬さ（剛性）を有することが好ましく、例えば、ステンレス等の金属、樹脂、木材、集成材、繊維強化プラスチック等の複合材料が挙げられる。
外殻容器の内部空間は円柱形状であり、外殻容器の底面に円柱の円部分が位置することが、撹拌効率の観点から好ましい。内部空間の円柱の底面に位置する円の直径（内径）と円柱の高さとの比は、例えば１：２〜２：１である。内径と高さが同等（比が１：１）でもよい。

外殻容器２０に収容される培養袋１０の内容物は、液体（培地）２６と気体２７を含むことが好ましい。気体と液体の容量比（気液容量比）は特に限定されず、液体が気体より多くても、気体が液体より多くてもよく、半々程度でもよい。気液容量比は、例えば１：９〜９：１の範囲が好ましい。培養袋１０が少なくとも液体（培地）２６を収容する範囲の全体ないし大部分で、培養袋１０が外殻容器２０に密着し、外殻容器２０が培養袋１０の側面を支持することが好ましい。培養袋１０に気体２７が収容される部分では、培養袋１０の上部（一部）が外殻容器２０の上（外）に露出されてもよい。

培地２６は、振とうにより撹拌可能であれば特に限定されず、溶液、乳液、懸濁液、分散液、ゲル等でもよい。培地２６は均一な単相の組成物でもよく、固形物を含む液体など、二相以上から構成されてもよい。培地２６は、培養前に滅菌されていることが好ましい。さらに培地２６は、微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、組織、細胞シート、細胞塊などの生体（培養対象物）を含むことができる。足場を要する培養では、粒状物、塊状物、発泡体、繊維質等の固形物を培養基材として培地に混合してもよい。

気体２７は、空気（あるいはＯ_２含有ガス）を含む好気的雰囲気でもよく、Ｏ_２の濃度が低い嫌気的雰囲気でもよい。気体２７の組成は特に限定されないが、２種以上の混合ガスが一般的である。気体２７の成分としては、酸素（Ｏ_２）等の酸化性ガス、窒素（Ｎ_２）やアルゴン（Ａｒ）等の不活性ガス、二酸化炭素（ＣＯ_２）等の酸性ガス、アンモニア（ＮＨ_３）等の塩基性ガス、硫化水素（Ｈ_２Ｓ）等の還元性ガスなどが挙げられる。培養袋１０に供給される気体は、フィルターを通したものが好ましい。空気、酸素、二酸化炭素などの気体は、下方（液体側）又は上方（気体側）のどちらか一方あるいは両方から導入することが好ましい。

側壁部２１ａには、外殻容器２０に収容された培養袋１０の内容物の量（液面）を目視で確認するための窓２３を有する。窓２３は、側壁部２１ａの上下方向にスリット状の切れ目として設けられている。窓２３は、開口してもよく、透明な材料で閉鎖されてもよい。また、底壁部２１ｂ及び蓋部２２には、チューブ１４，１５を通すための穴２４，２５を有する。

本実施形態では、培養袋１０の上面にチューブ１４を２本、培養袋１０の下面にチューブ１５を２本としたが、チューブ１４，１５の配置及び本数は特に限定されず、適宜の位置に所望の本数を設けることができる。チューブの配置は、例えば培養袋の上部、下部、側部のいずれか１又は２以上とすることができる。これらのチューブを介して、内容物のサンプリング、流動物（気体、液体、粉体等）の導入及び排出、栄養分の供給、老廃物の除去等を行うことができる。チューブを介して培養袋と外部装置を含む循環経路を設け、培養液の一部を外部装置で処理してから培養袋に戻す構成も可能である。

図３に示すように、培養袋１０を外殻容器２０に収容すると、培養袋１０が内容物の重量に従って変形し、外殻容器２０の内面に密着する。培養袋１０と外殻容器２０の間が広い面積にわたって接触することにより、機械的な嵌合、係合や、化学的な接着、吸着が無くても密着し、振とうに耐える固着力が生じる。外殻容器２０の内面は、平滑であり、例えばバフ等により研磨されていることが好ましい。内面に緩やかな凹凸があってもよいが、培養袋１０を構成するフィルム１２，１３（図１参照）の厚さに対して、フィルム１２，１３の破損や劣化を招くような微小の凹凸及び形状変化（鋭角部等）を有しないことが好ましい。

外殻容器２０は、培養袋１０及びその内容物の温度調整を行うことができるように、温度調整機構（手段）を有することが好ましい。温度調整機構としては、循環水等の熱媒体を通すことができるジャケット構造、ラバーヒーター等の加熱装置等が挙げられるが、これらに限定されない。

図４に、外殻容器２０を振とうさせる振とう装置３０の一例を示す。振とう装置３０は、外殻容器２０を囲む台部３１及び枠部３２と、外殻容器２０を振とうさせる動力源３３を含む。振とう装置３０は、図３に示すように培養袋１０を収容したまま外殻容器２０を振とうすることができる。本実施形態の振とう型培養装置は、培養袋１０を収容した外殻容器２０と、振とう装置３０を備え、培養袋１０を収容した外殻容器２０を振とうさせることにより、培養袋１０内の内容物を撹拌混合しながら、培養することができる。

図５（ｂ）に、外殻容器の振とう動作の一例を示す。本実施形態では、外殻容器２０の平面形状は円形、立体形状は中心軸を略上下に向けた円柱である。図５（ａ）は、外殻容器２０の中心２０ｃと半径２０ｒを示す。図５（ｂ）の振とう動作では、外殻容器２０の中心２０ｃが半径Ｒの軌道Ｃ上で回転（公転）する。この場合、振とうの振幅は、半径Ｒの２倍である。さらに外殻容器２０を中心２０ｃ周りに回転（自転）させてもよい。図示例の半径Ｒは半径２０ｒより小さいが、図示の比率は、特に実際の比率を正確に表したものではない。

振とうの際、培養袋１０を収容した外殻容器２０は、水平方向に回転することが好ましい。回転方向が、水平成分と垂直成分の両方を含んでもよい。垂直成分の大きさが、水平成分の大きさより小さい（垂直成分が０である場合を含む）ことが好ましい。一方向への振とうではなく、回転を取り入れることで、効率の良い撹拌ができる。撹拌時のシェア（せん断応力）が培養袋にかかりにくく、効率のよい培養を達成できる。回転速度、回転の方向は、適宜制御することができる。回転速度や回転方向を変化させることで、水平方向の液の撹拌のみではなく、垂直方向の撹拌も実現することができる。

培養の系に応じて回転数、振幅等を設定し、プログラムによって制御することが好ましい。例えば大腸菌の培養であれば、溶液中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を高くして培養することが好ましく、ＤＯを高くするためには、激しく振とうさせ、気液の混合を激しくすることが好ましい。一方、動物細胞の培養であれば、培養液の泡立ちを抑え、温和に撹拌することが好ましい。本実施形態の振とう培養装置は、例えば下記の制御因子の１つ又は２以上を制御して培養を行うことができる。

・装置の振とうの回転数及び振とう方向
・培地のｐＨ
・培地の空気通気量
・培地の温度
・液面の高さ（波の高さ）

振とう方向は、右回転と左回転、もしくは正回転と逆回転を任意のパターンで繰り返すことが好ましい。振とう装置の回転速度及び回転数は制御盤等により制御できるようにシステムを組むことが好ましい。振とう装置は、回転方向を任意に切り替え可能であることが好ましい。そのため、動力源や回転装置は、正逆双方向の回転が可能な機構を含むことが好ましい。また、例えばプログラムにより、回転パターンを制御することが好ましい。回転パターンは特に限定されないが、次に数例を挙げる。

（１）正回転→停止→逆回転→停止→正回転→停止→逆回転→（繰り返し）
（２）正回転→停止→正回転→停止→逆回転→停止→逆回転→（繰り返し）
（３）正回転→停止→正回転→停止→正回転→停止→正回転→（繰り返し）

外殻容器の振とうの回転数、振幅は任意に設定することができるが、回転した時に、培養袋内で内容物の波の高さ（例えば液面の平均高さ、最大高さ、高低差など）の上昇幅をある一定の範囲内とするために、波の高さを検出し、波の高さから回転数をフィードバック制御等で調整することが好ましい。回転数は、０．１〜２０００ｒｐｍ（回毎分）が好ましく、０．１〜２００ｒｐｍ、０．１〜１００ｒｐｍがより好ましく、１０〜８０ｒｐｍがさらに好ましい。振幅は０．１〜１００ｍｍが好ましく、２〜１００ｍｍがより好ましく、１０〜３０ｍｍがさらに好ましい。なお、回転方向が変化する場合、回転数は、右回転数と左回転数との和、もしくは正回転数と逆回転数との和のように、回転方向によらず回転数（非負値）の合計とする。

培養袋は、内容物のｐＨ又はＤＯを測定するセンサーと、センサーで得られたデータによるフィードバッグ制御機構を備えることが好ましい。
水素イオン指数（ｐＨ）については、ｐＨ電極を培養袋に挿入する、もしくはｐＨで色の変わるチップを系内に貼ることで系内のｐＨを知ることができる。系内を酸性にしたい場合は、ＣＯ_２ガスを導入する、もしくは、酸溶液を滴下することで酸性側にｐＨを変えることができる。ＣＯ_２ガスを導入する場合は、ＣＯ_２ガスが溶液中に必要以上に溶解することを防ぐため、培養袋の上面からＣＯ_２ガスを導入するか、培養袋の底部から間歇で導入することが好ましい。系内を塩基性としたい場合は、アルカリ溶液を添加することにより、ｐＨを塩基性とすることができる。ｐＨを一定にするための酸又はアルカリの投入口は、チューブ１４，１５や注出口１６であってもよく、あるいは他に設けてもよい。
ＤＯ（溶存酸素濃度）については、空気通気量を測定し、フィードバック制御をかけ、酸素を導入することが好ましい。酸素（Ｏ_２）の供給方法としては、溶液内に酸素がいきわたるように、溶液内（液面下）に出口を有するチューブから導入することが好ましい。

内容物（培地）の温度については、外殻容器２０の温度調整機能（上述）を用いて温度調整を行うことができる。培養温度は、培養される生物の種類にもよるが、例えば微生物の場合、４〜４０℃が好ましく、２５〜３７℃が特に好ましい。培養しないで培地等の撹拌装置として用いる場合は、冷却してもよい（例えば４〜２０℃）。温度管理は、培養袋１０に温度計を組み込み、その測定値を利用することで、フィードバック制御を行うことができる。温度計は、接触式温度計でもよいが、据え置き型非接触温度計が好ましい。

本実施形態の振とう型培養装置は、流加培養（フェドバッチ方式）、灌流培養（パーフュージョン方式）のいずれにも応用することができる。培養する生物体、細胞等は、特に限定されず、大腸菌をはじめとする菌類、酵母、微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞や、バイオ医薬製造用のＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞や、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、再生医療用途のｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞を始めとした幹細胞、分化させた組織細胞などの動物細胞、などの培養に用いることができる。なかでもＣＨＯ細胞の培養に好適である。

本実施形態の振とう型培養装置及びそれを用いた培養方法は、特に大スケールでの培養に適している。振とう装置は、特に大スケールの場合は、カウンターバランスを搭載することが好ましい。カウンターバランスを搭載すると、大容量の培地を含んだ培養袋を用いても、安定して装置を稼働させることができる。１つの振とう装置に２つ以上の培養袋を搭載することにより、相互にカウンターバランスとして機能させてもよい。

以上、本発明を好適な実施形態に基づいて説明してきたが、本発明は上述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で種々の改変が可能である。
上記の振とう装置は、培養のほか、組成物（培地等）の撹拌、調製、化学反応、発酵等にも利用することができる。

１０…培養袋、１１…シール部、１２，１３…フィルム、１４，１５…チューブ、１６…注出口、１７…基部、２０…外殻容器、２１…容器本体、２１ａ…側壁部、２１ｂ…底壁部、２２…蓋部、２３…窓、２４，２５…穴、３０…振とう装置、３１…台部、３２…枠部、３３…動力源。

Claims (16)

1. 軟包装材からなる培養袋と、前記培養袋全体を収容してその温度調整を行うことができるように配置され、上部に蓋部を有する外殻容器と、前記培養袋を収容した前記外殻容器を振とうさせる動力源とを含み、撹拌翼を有しない振とう型培養装置であって、
   前記培養袋の上部及び下部にそれぞれチューブが連結され、前記外殻容器の底部及び前記蓋部に設けられた穴には、それぞれ前記チューブが通されており、
   前記培養袋は前記外殻容器の外では角筒型であり、前記外殻容器の内部空間が円柱形状であり、前記外殻容器の底面に円柱の円が位置し、円の直径と、円柱の高さとの比が、１：２〜２：１の範囲内であり、前記培養袋に内容物が収容され、前記内容物の重量により前記培養袋が変形して前記外殻容器の内面に密着することにより、前記培養袋の底面及び側面が前記外殻容器に支持されており、
   前記培養袋を収容した前記外殻容器を、前記外殻容器の中心が円形の軌道上で水平方向に公転しながら、振とうさせることにより、前記培養袋内の内容物を撹拌混合することができることを特徴とする振とう型培養装置。
2. さらに前記外殻容器を前記中心の周りに自転させることを特徴とする請求項１に記載の振とう型培養装置。
3. 回転と停止をパターンで繰り返すプログラムを備えてなることを特徴とする請求項１又は２に記載の振とう型培養装置。
4. 正方向及び逆方向の回転が可能な機構を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
5. カウンターバランスを搭載していることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
6. 前記外殻容器の側壁部に窓を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
7. 前記外殻容器の内面がバフ研磨され平滑であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
8. 前記培養袋を収容した前記外殻容器の振とうの回転数が０．１〜２０００ｒｐｍ、振幅が０．１〜１００ｍｍであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
9. 前記培養袋内の前記内容物の波の高さを検出する装置を含み、前記内容物の波の高さが一定となるように前記培養袋を収容した前記外殻容器の振とうの回転数を調整する調整機構を備えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
10. 前記外殻容器が循環水を通すことができるジャケット構造又はラバーヒーターを含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
11. 前記培養袋がガゼット袋であり、注出口を備えていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
12. 前記培養袋内の内容物のｐＨ又は溶存酸素濃度（ＤＯ）を測定するセンサーと、前記センサーで得られたデータによるフィードバッグ制御機構を備えていることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
13. 前記培養袋は、前記内容物のｐＨを一定にするために酸又はアルカリの投入口を備えていることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
14. 前記培養袋は、前記内容物に空気又は酸素を供給するための機構を備えていることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の振とう型培養装置。
15. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の振とう型培養装置を用いた培養方法。
16. 菌類、酵母、微生物、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、バイオ医薬製造用のＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、再生医療用途のｉＰＳ細胞、幹細胞、分化させた動物細胞のいずれかを培養することを特徴とする請求項１５に記載の培養方法。

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