JPH04158782A - 細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は細胞培養装置、特に無限沈降を可能とする細胞
培養装置に関する。

〔従来の技術］ 従来、かかる細胞培養装置としては、例えば特開平２−
９２２７８号公報に記載されたものが知られている。

このものは、液体培地と細胞との混合系が実質的に充満
するように充填された培養容器を、実質上水平な軸線の
周りに回転せしめ無限沈降状態を得るようにしている。

そして、培養容器に養分等を供給するに際しては、固定
部に固着されたチューブの先端を培養容器内に位置せし
め、このチューブを含む固定側と培養容器の回転側との
間にメカニカルシールを配置して密封状態を得るように
している。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、かかる従来の回転式培養容器を用いる細
胞培養装置にあっては、細胞培養の効率は優れているが
、上述のように固定側と回転側との密封状態を得るのに
メカニカルシールを用いざるを得ないことから、以下の
ような問題があった。

（１）メカニカルシールにおけるゴム製リップ部等の摩
耗が避けられず、これが液体培地に混入する。あるいは
リップ部の材質によっては液体培地中に溶は込み、細胞
培養に悪影響を与える。

（２）メカニカルシール部の滅菌作業が困難である。

（３）洗浄、殺菌等をその都度行うことが不要な使い捨
ての細胞培養容器を適用することが困難である。

本発明の目的は、かかる従来の問題を解消し。

メカニカルシール等を用いることなく、密封状態を保っ
たまま、養分の補給を行い、細胞培養を確実に行うこと
ができ、接液部がすべて使い捨て可能な部品とすること
ができる細胞培養装置を提供することにある。

１課題を解決するための手段１ 上記目的を達成するために、本発明は固定部材に軸線を
略々垂直方向に向けて設けられ、チューブ通路が形成さ
れた固定支柱と、該固定支柱にその軸線周りに回動自在
に支承された第１回転部材と、該第１回転部材にほぼ水
平方向の軸線周りに回動自在に支承され、チューブ通路
が形成されると共に培養容器が取付は可能に形成された
第２回転部材と、前記固定支柱のチューブ通路と前記第
２回転部材のチューブ通路に挿通され前記固定支柱と前
記第２回転部材との間でほぼ９０”をなす屈曲状態に維
持されつつ前記培養容器に接続される可撓性チューブ部
材と、前記第１回転部材を回転駆動する駆動手段とを備
え、さらに、前記培養容器が、半透膜で仕切られた２室
からなり、その−方は細胞と培養液を満たすための第１
室と、他方は培養液を流しなから瀾たすだめの供給およ
び排出用のチューブを接続してなる第２室であり、培養
容器およびこれに接続したチューブは一体として交換可
能であることを特徴とする。

［作　用１ 本発明によれば、駆動手段により第１回転部材がほぼ垂
直方向の軸線周りに公転されると、これに伴い可撓性チ
ューブ部材の伝達力により第２回転部材がほぼ水平方向
の軸線周りで自転される。

このとき、可撓性のチューブ部材は、垂直方向の軸線周
りに公転しつつ、水平方向の軸線周りに自転し、捩れな
い。この結果、可視性チューブ部材の一端側を固定部材
に、他端側を培養容器に接続することが可能であり、メ
カニカルシール等を用いることなく密封状態を保つこと
が可能である。

［実施例］ 以下、本発明の実施例を添附図面を参照しつつ説明する
。

Ｋ血里± 図において、１００は略々矩形状の機台であり、機台１
００には固定部材としての略々矩形状の支持架台１０１
が支柱１０２でもって固設支持されている。

支持架台１０１にはその開口部に垂直方向に軸線ＬＶを
有する固定支柱１０３が圧入固設されている。

固定支柱１０３は本実施例においては中空に形成され、
この中空部は後述するチューブ部材を挿通するチューブ
通路を構成する。

固定支柱１０３の外周にはベアリング１０４を介して断
面コ字状の公転架台２００が回動自在に支承されている
。

公転架台２００はベアリング１０４支持用のハブ２０１
が設けられた矩形状の底面部２０２と、該底面部２０２
の両端から垂直方向に延びる側面部２０３．２０３とか
ら構成され、底面部２０２の下側には歯車２０４が固設
されている。該歯車２０４は前述の支持架台１０１に固
設されたモータと減速機とからなる駆動装置１０５の駆
動歯！　＋０６と噛合する。

さらに、両側面部２０３．２０３の上部には略々四角形
の公転枠体２１０が水平方向の軸線Ｌｓ＋　まわりに角
度調整自在に軸２１１，２１１でもって支持されている
ゆすなわち、公転枠体２１０はそれぞれ対向する長側枠
２１２．２１２および短剣枠２１３．２１３を有してお
り、長側枠２１２．２１２が上述の公転架台２００の側
面部２０３．２０３に軸２１１，２１１でもって支持さ
れている。そして、長側枠２１２．２１２にはそれぞれ
軸線ＬＨＩを円弧の中心とする円弧状長孔２１２Ａ、　
２１．２Ａが設けられ、側面部２０３．２０３に設けら
れたボルト２１４、２１４が貫通すべく配置されている
。公転枠体２１０の水平方向に対する角度θを調節した
後、該ボルト２１４．２１４を締付けることにより、公
転枠体２１０はその角度に保持される。

しかして、上述の公転架台２００および公転枠体２１Ｏ
でもって第１回転部材が構成される。

さらに、公転枠体２１０の短剣枠２１３の一方には、バ
ランスウェイト２１５が取付けられている。

また、他方には貫通孔２１３Ａが形成され、この貫通孔
２１３Ａのまわりの外方にハブ２１３Ｂが設けられてい
る。

そして、このハブ２１３Ｂには、ベアリング２１６を介
して第２の回転部材としての回転部材２２０が前述の水
平方向の軸線Ｌ□と直交する水平方向の軸ＩＩＬ、、の
周りに回動自在に支承されている。この回転部材２２０
には、円盤状の容器取付部２２１が設けられると共に、
回転部材２２０は全体的に中空に形成されている。しか
して、この中空部は本実施例においては後述のようにチ
ューブ部材を挿通するチューブ通路を構成している。

また、容器取付部２２１には、本実施例にあっては上述
の水平方向の軸線り、ｏｘを中心とする扁平筒状の樹脂
製培養容器２３０等が収容可能とされている。

すなわち、容器取付部２２１の外周部にはフランジ２２
１Ａが形成され、培養容器２３０の外周に設けた突条部
を枠部材２２２とでもって挟持した状態で、ボルト２２
３をフランジ２２１Ａに締付けるようにしている。

本実施例にかかる培養容器２３０は、第３図に示すよう
に、半透ＩＩＩ！２３１で仕切られた２室からなり、そ
の一方の室は細胞を分散させた培養液を満たす第１室２
３２であり、他方の室は培養液を流しながら満たすため
の供給用および排出用のチューブ２５０１．２５０□を
接続してなる第２室２３３からなる。

２室の一方または双方、通常は第１室２３２に酸素含有
ガス（空気、空気と炭酸ガスとの混合ガス等）を供給す
る。＃１．素含有ガスは室内に設けた通気性材料、たと
えばシリコンゴム製のチューブ２３４に流し、シリコン
ゴムの壁を通過して培養液に溶は込んでい（。この目的
のために培養容器２３０には、酸素含有ガスを供給する
ためのチューブ２５０３および２５０４を接続する。

本発明に使用される半透膜２３１ば、再生セルロース、
セルロースアセテート等のセルロース系の半透膜のほか
、ポリエステル、ポリアクリロニトリル等よりなる半透
膜が挙げられる。半透膜の孔径は、細胞が透過しないも
ので、通常１０μｍ以下である。なお、第１室２３２お
よび第２室２３３の境界をなす面は、３０％以上、好ま
しくは５０％以上を半透膜とする。

チューブ２５０は一端部が不図示の供給源に接続され、
他端部が前述のように培養容器２３０に接続されており
、可撓性部材、例えば、シリコンゴム等にて形成されて
いる。可撓性のチューブ２５０は複数本が束ねられた状
態とされ、固定支柱１０３の中空部および回転部材２２
０の中空部に挿通され支持されている。

可撓性のチューブ２５０が固定支柱１０３および回転部
材２２０の中空部に固定的に支持され、かつ強度が充分
である場合には不要であるが、公転架台２００および公
転枠体２１０の回転トルクを確実に回転部材２２０に伝
達するために、本実施例にあっては９０°屈曲された状
態の可撓性筒体３０００両端が固定支柱１０３および回
転部材２２０の端部に嵌着されている。可撓性筒体３０
０は屈曲に対し柔軟であり、かつ、捩りに対し強いこと
が好ましい。このような性質を備えるものであれば肉厚
のゴム管やコイルバネ等を用いることも可能であり、ま
たその形状的にもベローズ状であってもよい。

上記構成になる本実施例にあっては、所定の液体培地と
被培養細胞との混合系が実質的に充満するように充填さ
れた培養容器２３０とチューブ部材２５０とが一体的に
接続された状態で、チューブ部材２５０は前述した如（
まず、チューブ部材２５０の補給源側末端が、回転部材
２２０の右側がら左側に、さらに固定支柱１ｆ１３の上
側から下側の順で挿通配備されてから、培養容器２３０
は容器取付部２２１に収容固定される。そして、チュー
ブ部材２５０の末端部は、シールドが解除され不図示の
補給源に接続される。しがして、ががる補給源からチュ
ーブ部材２５０を通じて被培養細胞に適合する養分を送
りつつ、駆動装置１０５でもって培養容器２３０を水平
方向の軸線り、、の周りに回転させるのである。

すなわち、駆動装置１０５が作動すると駆動歯車１０６
とこれに噛合う従動歯車２０４を介して公転架台２００
、ひいては公転枠部材２１０が回転される。

今、第２図示の状態で公転枠部材２１０が時計回りに１
回転するとすれば、可撓性筒体３０（ｌの一端は固定支
柱１０３に固定されており不動であり、その他端は回転
部材２２０に固定されているから、回転部材２２０ひい
ては培養容器２３０は垂直軸Ｌｖまゎりに１回転公転し
、かつ垂直軸り、側からみて水平軸ＬＨ１まわりを時計
回りに１回転、自転する。

この結果、可撓性筒体３００ひいてはこの内部に挿通さ
れているチューブ部材２５０にはねじれを生じさせるこ
となく培養容器２３０を回転させることができる。なお
、可撓性筒体３００を用いない場合には、チューブ部材
２５０をトルク伝達部材として機能させることができる
。

この培養容器２３０の回転数が細胞培養に適した１０〜
２０ｒｐｍ程度となるように回転させるためには、公転
枠部材２１０を同じ＜１０〜２０ｒｐｍ程度で回転させ
ればよい。

本実施例によれば、チューブ部材２５０が接続された培
養容器２３０を完全密封状態で水平方向の軸線１８２周
りに自転させ無限沈降伏態を得ることができる。

なお、この無限沈降伏態をさらに確実に得るために、本
実施例では培養容器２３０を水平方向の軸線り。に対し
て所定の角度θ傾斜させて、遠心力による影響をキャン
セルできるようにしている。

ここで、培養容器２３０のＬｖがらの回転半径ｒ、角速
度ω、重力の加速度ｇとすると遠心力に釣り合う傾斜角
度θは次式で表される。

θ＝ｊａｎ−’（１０２７ｇ） そして、傾斜角度θの最適値が求まるとこれに合わせ長
孔２１２Ａを利用して公転枠部材２１０の角度を設定す
ればよい。

なお、接液部である培養容器２３０とこれに一体的に接
続されたチューブ部材２５０類は、殺菌状態で保存され
、かつ使用される。また、細胞ロフト間の汚染防止と洗
浄の手間を省略するため、使い捨てのセットで使用する
のが好ましい。

なお、上述した実施例では固定支柱１０３および回転部
材２２０を中空に形成しチューブ通路を構成させ、チュ
ーブ部材の挿通作業の容易化をはかるようにしたが、こ
れもチューブ部材を一本毎に挿通できる通路を上記部材
に形成するようにしてもよい。

釆１１江上 本発明の培養装置を用い、下記の細胞を培養した。

培養細胞：チャイニーズハムスター肺繊維芽細胞由来の
ｒＶ−７９Ｊ 液体培地：酸素および炭酸ガスを溶存するＩＯ容容量 牛胎児血清を含むｒＥａｇｌｅ−ＭＥＭＪ（粘度：　Ｏ
，０１ｐｏｉｓｅ、比重：　１．０１）担体粒子：　ｒ
ｃｙｔｏｄｅｘ　　ｍ　Ｊ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）
（粒径：１８０μｍ、比重：　１．０３）第１室２３２
の内容積が４００ｍｊ２である扁平円筒状培養容器中に
、乾燥重量で１．ＯＯＯｍｇ（約４　Ｘ　１０’個）の
担体粒子を入れて液体培地を満し、これに２．７　ＸＩ
Ｏ’個の培養細胞を播種した後、温度３７℃の環境下、
７２時間に亘り、回転数１５ｒ、　ｐ、　ｍ、で培養容
器を回転させた。

この間において牛胎児血清を含まない２ｉのｒＥａｇｌ
ｅ−ＭＥＭＪ培地を第２室２３３に循環させ、２４時間
毎に新しい培地ととり換えた。

酸素はシリコンチューブ（１ｘ　１．５ｍｍ、４ｍ）に
５容量％炭酸ガスと９５容量％空気の混合気を通して供
給した。

この結果、全担体粒子上の細胞は６Ｘ１０’個に増殖し
ていた。

夫狭■ユ 培養細胞：抗組織ブラスミノーゲンアクチベーター（抗
ＴＰＡ）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ 液体培地：酸素および炭酸ガスを溶存し、１０容量％牛
脂児血清を含むＲＰＭＩ１６４０粒子（撹拌子）：「バ
イオシロン」　（ポリスチレン、粒径１６０〜３００　
μｍ　。

日本インターメッド社製） 実験例１と同じ扁平円筒状培養容器に、乾燥重量で０．
６ｇの粒子を入れて液体培地を満し、これに２×１０°
個／■βになるよう培養細胞を播種し、空気が入らない
ように密閉した後、温度３７℃の環境下、　１５日間に
亘り、回転数１５ｒ、ｐ、ｍで培養容器を回転させて培
養を行った。

この間において牛胎児血清を含まない２℃のＲＰＭ１１
６４０培地を循環させ、２日毎に新しい培地ととり換え
た。

酸素はシリコンチューブ＜　Ｉ　Ｘ　１．５＋＋＋ｍ、
４ｍ）　ニ５容量％炭酸ガスと９５容量％空気の混合気
を通して供給した。

この結果、バイブリドーマは順調に増殖し、７日目には
ｌＸｌ０’個／ｌｌεに達し、１５日目までこの密度を
維持した。またハイブリドーマは培養７日以後、ＥＬＩ
ＳＡ法で抗体量を測定したところ３０〜４０μｇ／　ｍ
℃のモノクローナル抗体を産生じていた。

東１引旦 培養細胞：ヒト末梢血リンパ球（参考１）液体培地二酸
素および炭酸ガスを溶存し、ｌｏ容量％ヒトＡＢ型血清
を含むＲＰＭ１１６４０で、組換えインターロイキン−
２ （ｒｌＬ−２）を添加した。（参考２）粒子（撹拌子）
＝「バイオグラスＪ　（ガラス。

粒径１５０〜２１０μ囮、ソロヒ ルエンジニアリグ社） 貫験例１と同じ扁平円筒状培養容器中に１．０００ｍｇ
の粒子を入れて液体培地を満し、これに４Ｘ１０’個の
培養細胞を播種した後、温度３７℃の環境下、静置培養
した。３日後に培養器を２４日間に亘り回転数１５ｒ、
ｐ、ｍ、で回転させた。

この間においてヒトＡＢ型血清とｒｌＬ−２を含まない
２ｉのＲＰＭｒ１６４０培地を循環させ、２日毎に新し
い培地と交換した。

酸素はシリコンチューブ（Ｉ　Ｘ　１．５ａ＋ｍ、４ｍ
）に５容量％炭酸ガスと９５容量％空気の混合気を通し
て供給した。

この結果、リンパ球は順調に増殖し１２日目で３　Ｘ　
１０’個／ｌＩβに達し、２４日目までこの密度を維持
した。培養終了後、細胞を回収して１．２　Ｘ　１０Ｉ
Ｏ個のリンパ球（ＬＡＮ細胞）を得た。また、この細胞
の細胞傷害活性をｌｌＣｒ遊離法（参考３）により測定
した結果、（ｌＧ５６　（ヒト肺扁平上皮癌細胞）対し
て８０，０％（Ｅ／ＴＩＯ：１）、に５６２　（ヒト白
血病細胞）に対して６０．０％（Ｅ／Ｔ２０：１）の高
活性であった。

参考１　ヒト末梢血リンパ球の調製 健康な末梢血（３００＋１ｊ２）に同量のＰＢＳ−を加
えて希釈したもの５０ｍ０をリンパ球分離媒体（Ｌｙｍ
ｐｈｏｃｙｔｅ　５ｅｐａｒａｔｆｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ
、オルガノテクノ社製１（以下、ｒＬｓＭＪ　という）
３０ｍβに重層し遠心しく１，３５０ｒｐ１１．２０℃
、３０分）、リンパ球層を集めてラクトアルブミン含有
ハンクス緩衝液（以下、「ハンクス液」という）で洗浄
した後、これに２０ｍｎの０．７５重量％塩化アンモニ
ウム／トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）を加えて３７℃
で５分間加温した。次に遠心分離して、溶血した赤血球
を除いた後、ハンクス液で洗浄し４　Ｘ　１０’個のリ
ンパ球を得た。

参考２　液体培地の調製 ９００ｍｊ２の水に下記のものを溶解させ、ＩＮ水酸化
ナトリウムでｐＨ７，０に調整した後、０．２２μｌの
フィルターで濾過することにより調製した。

粉末ＲＰＭＩ１６４０　　　　　　　１０．４ｇ炭酸水
素ナトリウム　　　　２．０ｇ ペニシリンＧ　　　　　　　　１．２５ｘ　ｌｏ’Ｕス
トレプトマイシン　　　　１２５ｍｇＨＥＰＥ５　　　
　　　　　　　　５．　ＯｇＡＢ型血清　　　　　　　
　　１００ｍρｒＩＬ−２（組換え体）　　　　　　　
５　Ｘ　１０＠Ｕ抗ＣＤ３モノクロ一ナル抗体　１０μ
ｇ参考３　　”Ｃｒ遊離法による傷害率の測定標的細胞
としてＱＧ５６　（ヒト肺扁平上皮癌細胞）およびに５
６２　（ヒト白血病細胞）を用い、これらの標的細胞を
＠ｌにｒでラベルした。次に、得られたＬＡＮ細胞と、
１′Ｃｒでラベルした標的細胞各５Ｘ１０″個を、ＱＧ
５６は細胞数比（ＬＡＮ細胞：ＱＧ５６）　５：１，１
０：１，２０：１で、Ｋ５６２は細胞数比（ＬＡＮ細胞
：　Ｋ５６２）　２．５二１，５：１，１０＋１の割合
で混合し、９６ウエルマイクロプレートに入れ、炭酸ガ
ス培養器で３７℃にて培養した。４時間後、ウェル毎に
放出された放射能をガンマ−カウンターで測定し、傷害
率を次式に従って求めた。

ここで最大放出量はＯ，ＩＮ塩酸を加えて標識細胞を溶
解した際の１Ｃｒ放出量であり、自然放出量はＬＡＮ細
胞のかわりに培地のみを加えたときの８　ｌ　Ｃｒ放８
量であり、試験放出量はＬＡＮ細胞を加えたときのｌ　
ｌ　Ｃｒ放出量である。

［発明の効果１ 以上の説明から明らかなように、本発明の装置によれば
、細胞を液体培地中に均一に分散し、半透膜を介して常
に新鮮な培地と接触することができ、また、培地はメカ
ニカルシールを用いずに連続したチューブから捩れをお
こすことなく密封状態を保ったまま供給および排出がで
き、細胞の培養を長時間にわたり効率よ（行うことがで
きる。

また、培養容器とこれに接続した複数本のチューブは殺
菌処理した、使い捨てのセットとすることが可能であり
、培養のロット間の汚染の危険をなくシ、医療技術の向
上に貢献するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例を示す側断面図、第２図は同
じく平面図、 第３図は本発明の培養容器の一実施例を示す断面図であ
る。 １００・・・機台、 １０１・・・支持架台（固定部材）、 １０３・・・固定支柱、 ２００・・・公転架台（第１回転部材）、２１０・・・
公転枠部材（第１回転部材）、２２０・・・回転部材（
第２回転部材）、２２１・・・容器取付部、 ２３０・・・培養容器、 ２５０・・・チューブ部材、 ３００・・・可撓性筒体。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）固定部材に軸線を略々垂直方向に向けて設けられ、
   チューブ通路が形成された固定支柱と、該固定支柱にそ
   の軸線周りに回動自在に支承された第１回転部材と、 該第１回転部材にほぼ水平方向の軸線周りに回動自在に
   支承され、チューブ通路が形成されると共に培養容器が
   取付け可能に形成された第２回転部材と、 前記固定支柱のチューブ通路と前記第２回転部材のチュ
   ーブ通路に挿通され前記固定支柱と前記第２回転部材と
   の間でほぼ９０℃をなす屈曲状態に維持されつつ前記培
   養容器に接続される可撓性チューブ部材と、 前記第１回転部材を回転駆動する駆動手段 とを備え、 さらに、前記培養容器が、半透膜で仕切られた２室から
   なり、その一方は細胞と培養液を満たすための第１室と
   、他方は培養液を流しながら満たすための供給および排
   出用のチューブを接続してなる第２室であり、培養容器
   およびこれに接続したチューブは一体として交換可能で
   あることを特徴とする細胞培養装置。