JP6327713B2 - 急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制剤 - Google Patents
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Description
internal tandem duplication)に対する酵素阻害効果を持つことにより、FLT3/ITD変異を有する白血病幹細胞に対して、前記化合物の一部が顕著な殺傷能力を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
Ar2は、置換又は非置換のアリール基又はヘテロアリール基であり;
Lは、酸素原子、イオウ原子、−NH−、−NHCO−又は−CONH−であり;
X1は、CH又は窒素原子であり;
X2及びX3は、CH又は窒素原子であり(ただし、X2及びX3は同一ではない。);
Yは、C1−3−アルキレン基であり;
Y及びX2を含む環上の基であるW1は、独立して、C1−6−アルキル基であり;
mは、0〜3の整数であり;
Z1及びZ2は、独立して、水素原子、C1−6−アルキル基、アミノ−C1−6−アルキル基、C1−6−アルキルアミノ−C1−6−アルキル基、ジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル基、ヒドロキシ−C1−6−アルキル基、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル基、C2−7−脂肪族アシル基、カルボキシ−C1−6−アルキル基、カルバモイル−C1−6−アルキル基、置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のアリール−C1−6−アルキル基、置換又は非置換のヘテロアリール−C1−6−アルキル基、置換又は非置換のアリールカルボニル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基(ただし、Z1及びZ2が共に水素原子の場合を除く。)であり;
X2がCHでありX3が窒素原子のとき、Z1及びZ2はX3を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される2個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基を形成してもよく、
X2が窒素原子でありX3がCHのとき、Z1及びZ2はX3を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基を形成してもよい。)
で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ、
個体の急性骨髄性白血病の腫瘍細胞サンプルから核酸を得る工程;及び
該核酸中のFlt3遺伝子のITD変異を検出する工程であって、当該ITD変異の存在は、個体における前記(3)から(17)のいずれかに記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性が増大することを示す工程
で示されるピペラジニル基、次式(b):
で示される縮合ピペラジニル基が好ましい。
で示される化合物を50〜250℃で、必要であれば、例えば4−ジメチルアミノピリジンのような触媒の存在下、ホルムアミドと縮合することにより製造できる。
で示される化合物を次式(IVa)、(IVb)又は(IVc):
Ar2−L−Ar1−B(OH)2 (IVa)、
Ar2−L−Ar1−Sn(CH3)3 (IVb)、
で示される化合物と、例えばパラジウム(O)、Pd(PPh3)4のような触媒の存在下で反応させることにより製造することができる。
で示される化合物によってアルキル化するか、又は次式(VII):
で示される化合物と光延(Mitsunobu)反応させることにより製造することができる。
で示される化合物を前記式(IVa)、(IVb)又は(IVc)で示される化合物と、例えばパラジウム(O)、Pd(PPh3)4のような触媒の存在下で反応させ、生成した次式(XI):
で示される化合物とし、次いで次式(XIII):
Z1−NH−Z2
(式中、Z1及びZ2は前記と同義である。)
で示される化合物と反応させることにより製造することができる。
前記式(I)で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ(以下「化合物(I)」という。)は、白血病幹細胞増殖抑制効果、又は白血病幹細胞の殺傷能を示す。従って、当該化合物、その塩又はそれらのプロドラッグは、急性骨髄性白血病の治療又は再発抑制のための医薬組成物に利用することができる。
1 生体内での白血病発症能を選択的かつ独占的に有する。
2 自身では白血病を発症することができない白血病非幹細胞分画を作り出すことができる。
3 生体に生着することができる。
4 自己複製能を有する。
HCK及びFLT3のヌクレオチド配列やアミノ酸配列は公知である。ヒトのHCKの代表的なヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、例えばNCBIに以下の通りに登録されている。
HCKアミノ酸配列:アクセッション番号 NP_002101.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_002101.2>>
FLT3ヌクレオチド配列(cDNA配列):アクセッション番号 NM_004119.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_004119.2>>
FLT3アミノ酸配列:アクセッション番号 NP_004110.2<<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_004110.2>>
HCKの発現又は機能を抑制する核酸としては、例えば、HCKの発現を特異的に抑制し得るsiRNA、アンチセンス核酸、これらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター、低分子化合物が挙げられる。好ましくは、HCKの発現を特異的に抑制し得るsiRNA、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターが用いられる。
(A)HCKをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む2本鎖のRNA、及び
(B)HCKをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりHCKの転写を抑制する2本鎖のRNAを挙げることができる。
(A)HCKをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸、及び
(B)HCKをコードするmRNA(成熟mRNA又は初期転写産物)と治療対象動物(好ましくはヒト)の細胞内で特異的にハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でHCKポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
等を挙げることができる。
以下、本発明の化合物(I)及び医薬組成物の投与量及び製剤化について説明する。
また本発明は、HCK遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させ、かつFLT3遺伝子の発現量もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択することを特徴とする、急性骨髄性白血病の治療もしくは予防のための薬剤(候補化合物)のスクリーニング方法を提供する。
(a)白血病幹細胞に、被検化合物を接触させる工程
(b)該白血病幹細胞におけるHCK遺伝子およびFLT3遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
(a)HCK遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAと、FLT3遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNA、を含む細胞と、被検化合物を接触させる工程
(b)該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する工程
トリフェニルホスフィン(63.28g)のTHF(700mL)溶液に、氷冷下にジイソプロピルアゾジカルボキシラート(48.73g)を滴下ロートを用いて滴下した。滴下ロートはTHF(30mL)で洗いこみをした。その後、混合物を室温にし、4−クロロ−5−ヨード−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン(36.84g)及び1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−オール(29.46g)のTHF(320mL)溶液を50分間かけて滴下した。滴下終了後、室温にて3時間攪拌し、それからエバポレーターにて溶媒の大部分を蒸発させた。残留物に酢酸エチル(400mL)を加え、得られた固体を濾取、酢酸エチルにて洗浄(250mL+180mL)、減圧下で乾燥し、4−クロロ−7−(1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−イル)−5−ヨード−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン(35.46g)を薄茶色の固体として得た。
4−フェノキシフェニルボロン酸ピナコールエステル(8.44g)をエチレングリコールジメチルエーテル(300mL)に溶解し、ここへ4−クロロ−7−(1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−イル)−5−ヨード−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン(7.97g)、炭酸ナトリウム(6.02g)、水(200mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(1.32g)を順次加え、混合物を80℃にて3時間半攪拌した。放冷後、酢酸エチル(400mL)を加え分液した。有機層を水(250mL)及び飽和食塩水(250mL)で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(13.8g)にヘキサン/酢酸エチル(5:1、40mL)及びジクロロメタン(15mL)を加え、析出した白色固体を濾取、乾燥し、4−クロロ−5−(4−フェノキシフェニル)−7−(1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−イル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン(5.22g)を得た。
4−クロロ−5−(4−フェノキシフェニル)−7−(1,4−ジオキサスピロ[4.5]デカン−8−イル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン(7.58g)、1,4−ジオキサン(120ml)及び濃アンモニア水溶液(120ml)の混合物を、圧力容器において120℃で17時間加熱した。混合物を周囲温度まで冷却し、そして減圧下で溶媒を留去し、薄茶色の固体(8.3g)を得た。このものは精製することなく、次の反応に使用した。
前の工程の生成物、THF(30mL)、アセトン(150ml)及び6M塩酸(109mL)の混合物を40℃で4時間撹拌した。混合物を氷冷し、1M水酸化ナトリウム水溶液(820mL)を加えpH8とし、生成した薄茶色固体を濾取した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール=50/1→20/1)にて精製し、4−[4−アミノ−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−7−イル]シクロヘキサノン(4.82g)を得た。
4−[4−アミノ−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−7−イル]シクロヘキサノン(8.23g)を1,2−ジクロロエタン(330mL)に溶かし、酢酸(3.73g)、N−メチルピペラジン(6.22g)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(6.58g)を加え、室温にて5時間半攪拌した。反応混合物に水(100mL)及びクロロホルム(100mL)を加えて、更に飽和重曹水(100mL)を加えて分液した。有機層を飽和食塩水(140mL)にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後に溶媒を留去した。カラムクロマトグラフィー(クロロホルム→クロロホルム/メタノール=20/1)により精製して、7−[cis−4−(4−メチル−1−ピペラジニル)シクロヘキシル]−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン(12.1g)、及び7−[trans−4−(4−メチル−1−ピペラジニル)シクロヘキシル]−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン(3.8g)を得た。
MS (m/z) = 483.50 [M+H]
HCK IC50 (nM); 1.1, FLT3-ITD IC50 (nM); 26.7
実施例2:RK−0020690
7−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 509.30 [M+H]
HCK IC50 (nM); 5.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 18.0
実施例1の合成方法に従い、第5工程においてグリシンtert-ブチル塩酸塩をN-メチルピペラジンの代わりに使うことにより表記化合物を合成した。
tert-ブチル 2-(((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)アミノ)アセタート(93mg 0.18mmol)を4M塩酸(2mL)に溶解し、室温で3時間撹拌した。溶媒を減圧留去後、IPEを加えて洗浄し表記化合物(白色固体、83mg)を得た。
MS (m/z) = 458.36[M+H].
HCK IC50 (nM); 4.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 24.0
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
tert-ブチル (2-メトキシ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)カルバマート(0.6g, 1.74mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(74mL)、エタノール(20mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.5g, 1.45mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(8.6mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(117mg, 0.10mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.9g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製しtert-ブチル(4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)カルバマート(0.7g)を得た。
tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)カルバマート(0.7g, 1.51mmol)をアセトン/メタノール(1/1, 10mL)に溶解し、5M塩酸(5mL)を加え2時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH9に調整し減圧濃縮後、酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.8g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1)にて精製し、4-(4-アミノ-5-(4-アミノ-3-メトキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.4g)を得た。
ピリジン(1mL)をジクロロメタン(2mL)に溶解した4-(4-アミノ-5-(4-アミノ-3-メトキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.4g, 2.00mmol)に加え氷冷下5分間撹拌した。ジクロロメタン(5mL)に溶解した1-メチル-1H-インドール-2-カルボニルクロリド(0.2g, 1.10mmol)を滴下し、氷冷下30分撹拌した。水(10mL)加え反応停止後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(0.6g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製し、表記化合物(0.3g)を得た。
N-(4-(4-アミノ-7-(4-オキソシクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.5g, 0.98mmol)を1,2-ジクロロエタン(20mL)に溶かし、酢酸(0.2g, 2.95mmol)、3-メチル-5,6,7,8-テトラヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン(0.2g, 1.48mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.3g, 1.48mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルにて抽出し水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28% アンモニア水=100/10/2)により精製を行った。N-(4-(4-アミノ-7-((cis)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(38mg)及びN-(4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(3-メチル-5,6-ジヒドロ-[1,2,4]トリアゾロ[4,3-a]ピラジン-7(8H)-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(紫色固体、98mg)を得た。
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.8, FLT3-ITD IC50 (nM); >2500, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 49%
MS (m/z) = 491.58[M+H].
HCK IC50 (nM); 0.75, FLT3-ITD IC50 (nM); 6.6
トリフェニルホスフィン(1.4g, 5.37mmol)のTHF(60mL)溶液に、氷冷撹拌下でアゾジカルボン酸ジイソプロピル40%トルエン溶液1.9mol/L(2.8mL, 5.37mmol)を滴下した。混合物を室温に戻し、4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン(1.0g, 3.58mmol)、及びtert-ブチル 4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート(1.1g, 5.37mmol)のTHF(15mL)溶液を滴下した。滴下終了後、室温で3時間撹拌し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3/1)で精製し、表記化合物(白色固体、0.7g)を得た。
tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-ヨード-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(0.7g, 1.49mmol)、及び4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン(0.5mg, 1.79mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(25mL)に溶解し、飽和炭酸ナトリウム水溶液(5mL)、及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.1g, 0.10mmol)を順次加え、混合物を80℃で終夜撹拌した。放冷後、水を加え酢酸エチルで抽出し無水硫酸ナトリウムで乾燥減圧下で溶媒を留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3/1)で精製し、表題化合物(黄色固体、0.6g)を得た。
tert-ブチル 4-(4-クロロ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(0.2g, 0.44mmol)、1,4-ジオキサン(10mL)、及び28%アンモニア水(10mL)の混合物を、圧力容器において120℃で17時間加熱した。反応液を室温に戻し減圧下で溶媒を留去し、表記化合物(白色固体、0.2g)を得た。
5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.37mmol)、アセトン(5mL)、5M塩酸(1mL)、及びトリフルオロ酢酸(0.5mL)の混合物を80℃で2時間撹拌した。溶媒濃縮後、2M水酸化ナトリウムを加えpH8とし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去し表記化合物(白色固体、0.1g)を得た。
5-(4-フェノキシフェニル)-7-(ピペリジン-4-イル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.47mmol)、tert-ブチル 4-オキソピペリジン-1-カルボキシラート(0.3g, 1.41mmol)、酢酸(0.1mL)、及び1,2-ジクロロエタン(5mL)の混合物を室温で10分撹拌し、ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.1g 0.70mmol)を加え一晩撹拌した。水を加え反応を停止し、ジクロロメタンで抽出後有機層を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1)で精製し表記化合物(白色固体、0.1g)を得た。
tert-ブチル4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)-[1,4'-ビピペリジン]-1'-カルボキシラート(0.1g, 0.20mmol)、THF(5mL)及び5M塩酸(1mL)の混合物を50℃で1時間撹拌した。反応後室温にもどし、水酸化ナトリウムでpH11に調整後減圧下で溶媒を留去した。残渣にエタノールを加え濾過後、濾液を減圧濃縮し表記化合物(白色固体、73mg)を得た。
MS (m/z) = 469.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 43.0
7−(1−((trans)−8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)ピペリジン−4−イル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 509.30 [M+H].
HCK IC50 (nM); .59, FLT3-ITD IC50 (nM); 23.0
1−((1s,4s)−4−((8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)アミノ)シクロヘキシル)−3−(4−フェノキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−アミン
3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(5.1g, 19.5mmol)、及び1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-イル4-メチルベンゼンスルホナート(6.9g, 21.4mmol)を溶かしたDMF(36.8mL)溶液に炭酸カリウム(5.4g, 39.0mmol)、18-クラウンエーテル(0.5g, 2.0mmol)、ヨウ化カリウム(0.3g, 1.95mmol)を加え、この混合液を80℃で終夜撹拌した。沈殿物を濾取し、濾液を減圧濃縮した。酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた褐色固体はそのまま精製されず次の反応に使用された。
3-ヨード-1-(1,4-ジオキサスピロ[4.5]デカン-8-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジンをアセトン(50mL)に溶解し、5M塩酸を加え1時間還流した。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(3.2g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製し、表記化合物(1.5g)を得た。
4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン(2.0g, 6.72mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(74mL)、エタノール(20mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.96g, 2.69mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(23mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.2g, 0.19mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた淡褐色油状物(2.0g)をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製し、表記化合物(0.6g)を得た。
4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(1g, 2.5mmol)、酢酸アンモニウム(2.9g, 37.6mmol)、2-ピコリンボランコンプレックス(0.3g, 3.0mmol)をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、エタノール(15mL)を加えた。この混合液を130℃で、マイクロ波リアクター中にて2分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1)にて精製し、表記化合物(0.34g)を得た。
1-(4-アミノシクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.39mmol)を1,2-ジクロロエタン(6mL)に溶かし、酢酸(70mg, 1.16mmol)、トロピノン(81mg, 0.58mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.1g, 0.58mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を濾過し減圧縮後、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)により単離、精製し1-((1s,4s)-4-((8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)アミノ)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(3.8mg)及び1-((1r,4r)-4-((8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)アミノ)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(12mg)を得た。
MS (m/z) = 524.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 26, FLT3-ITD IC50 (nM); 16
MS (m/z) = 458.38 [M+H].
HCK IC50 (nM); 16, FLT3-ITD IC50 (nM); 23
MS (m/z) = 457.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 23
MS (m/z) = 457.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 23
実施例1の合成方法に従い、第4工程生成物4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキサノン(0.60g, 1.51mmol)、酢酸アンモニウム(1.7g, 22.6mmol), 2-ピコリンボラン錯体(0.2g, 1.81mmol)をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、エタノール(11mL)を加えた。この混合液を130℃で、マイクロ波リアクター中にて2分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1→ジクロロメタン/メタノール/28% アンモニア水=100/10/2)にて精製し、表記化合物(0.3g)を得た。
7-(4-アミノシクロヘキシル)-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(100mg, 0.27mmol)、イソニコチン酸(42mg, 0.34mmol)、TBTU(88mg, 0.27mmol)をDMF(3mL)に溶解し、DIPEA (50mg, 0.39mmol)を滴下した。この溶液を室温にて1時間撹拌し減圧濃縮後、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)により精製しN-((cis)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド(白色固体、16mg)及びN-((trans)-4-(4-アミノ-5-(4-フェノキシフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-7-イル)シクロヘキシル)イソニコチンアミド(白色固体、51mg)を得た。
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 44.0
7−((trans)−4−(4−(tert−ブチル)ピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 525.74 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8.0, FLT3-ITD IC50 (nM); 17
N−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
N-(2-メトキシ-4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-アミン(0.7g, 1.83mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(16mL)、エタノール(8.5mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.54g, 1.52mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(3.4mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(123mg, 0.11mmol)を順次加え、混合物を80゜Cでアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をn-ヘキサンで洗浄しN-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.9g)を得た。
N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.3g, 0.51mmol)を1,2-ジクロロエタン(14.6mL)に溶かし、酢酸(92mg, 1.53mmol)、N-メチルピペラジン(153mg, 1.53mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.2g, 0.76mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルで抽出し、水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28% アンモニア水=100/10/2)により精製した。N-(4-(4-アミノ-1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(白色固体、36mg)及びN-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)-2-メトキシフェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(黄色固体、48mg)を得た。
MS (m/z) = 594.30 [M+H]HCK IC50 (nM); 0.77, FLT3-ITD IC50 (nM); 2747
1−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−3−(4−フェノキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 510.50 [M+H]
HCK IC50 (nM); 0.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 87
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミドアミド
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 3999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
tert-ブチル (4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)カルバマート(4.6g, 10.45mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(50mL)、エタノール(30mL)に溶解し、そこへ5-ヨード-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(4.6g, 10.5mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(20mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.8g, 73mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)にて精製し、表記化合物(4.4g)を得た。
tert-ブチル (4-(4-アミノ-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-5-イル)フェニル)カルバマート(4.4g, 8.7mmol)をアセトン(20mL)に溶解し、5M塩酸(5mL)、TFA(1mL)を加え2時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH9に調整し減圧濃縮後、酢酸エチルを加え飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し表記化合物(3.1g)を得た。このものは精製することなく、次の反応に使用した。
5-(4-アミノフェニル)-7-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-アミン(0.1g, 0.25mmol)、1-メチル-1H-インドール-2-カルボン酸(45mg, 0.259mmol)、TBTU(83mg, 0.259mmol)をDMF(6mL)に溶解し、DIPEA (48mg, 0.37mmol)を滴下した。この溶液を室温にて一晩撹拌し減圧濃縮後、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)にて精製し、さらに分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1)にて精製し、表記化合物(淡褐色固体、45mg)を得た。
MS (m/z) = 563.60 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.55, FLT3-ITD IC50 (nM); 255
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.55, FLT3-ITD IC50 (nM); 428
MS (m/z) = 505.23 [M+H].
HCK IC50 (nM); 11.85, FLT3-ITD IC50 (nM); 108
MS (m/z) = 506.22 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 414
N−(4−(4−アミノ−1−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)ピコリンアミド
4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)アニリン(3.00g, 13.7mmol)、2-ピコリン酸(1.70g, 13.7mmol)、TBTU(4.40g, 13.7mmol)をDMF(20mL)に溶解し、DIPEA (1.77g, 13.7mmol)を滴下した。この溶液を室温で3時間撹拌し、水を加え酢酸エチルで抽出した。さらに水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた固体をIPEで洗浄し表記化合物(白色固体、3.7g)を得た。
MS (m/z) = 325.30 [M+H].
4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(17.0g, 47.6mmol)、及び8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン2塩酸塩(9.5g, 47.6mmol)にメタノール(115mL)、酢酸(11.5mL)を加え90℃で撹拌し、そこへ2-ピコリンボラン錯体(5.1g, 47.6mmol)を40分かけて加えた。メタノール(30mL)を加え室温で2時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液に注ぎクロロホルム/メタノール(10/1)で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。アミノプロピルシリカゲルクロマトグラフィー(トルエン/酢酸エチル=4/1)で精製し、表記化合物(白色固体、5.6g)を得た。
MS (m/z) = 510.50 [M+H].
3-ヨード-1-((1r,4r)-4-(8-メチル-3,8-ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(0.5g, 1.1mmol)、N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)ピコリンアミド(0.4g, 1.2mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(10mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.1g, 0.11mmol)を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜攪拌した。放冷後ジクロロメタンを加え飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28% アンモニア水=100/10/2)で精製し、表記化合物(白色固体、278mg)を得た。
MS (m/z) = 538.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 1176, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 48%
MS (m/z) = 506.22 [M+H]
HCK IC50 (nM); 20, FLT3-ITD IC50 (nM); 190, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 50%
MS (m/z) = 506.22 [M+H].
HCK IC50 (nM); 12, FLT3-ITD IC50 (nM); 548
N−(4−(4−アミノ−1−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 590.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9.73, FLT3-ITD IC50 (nM); 3330, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 64%
N−(4−(4−アミノ−1−(1−(8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)ピペリジン−4−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
トリフェニルホスフィン(7.5g, 28.7mmol)のTHF(70mL)溶液に、氷冷下でジイソプロピルアゾジカルボキシラート(5.8g, 28.7mmol)を滴下した。混合物を室温にし、3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(5.0g, 19.2mmol)及びtert-ブチル- 4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシラート(5.8g, 28.7mmol)加えた。室温にて終夜攪拌後、減圧濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1)にて精製し表記化物(白色固体 3.8g)を得た。
tert-ブチル 4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)ピペリジン-1-カルボキシラート(3.8g, 8.5mmol)をアセトン/メタノール(1/1, 30mL)に溶解し、5M塩酸(14mL)を加え5時間還流した。2M水酸化ナトリウムでpH12に調整し減圧濃縮後、水で洗浄し、3-ヨード-1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(3.0g)を得た。
トロピノン(1.1g, 7.67mmol)、3-ヨード-1-(ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(0.9g, 2.56mmol)、及び2-ピコリンボラン錯体(0.5g, 3.84mmol)をマイクロウェーブ用耐圧容器に秤取り、10%酢酸/1,2-ジクロロエタン(10mL)を加えた。この混合液を110℃で、マイクロ波リアクター中にて7分間攪拌した。この反応液を減圧濃縮後シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28% アンモニア水=100/10/2)にて精製し、表記化合物(0.4g)を得た。
3-ヨード-1-(1-(8-メチル-8-アザビシクロ[3.2.1]オクタン-3-イル)ピペリジン-4-イル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(0.2g, 0.39mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(4.2mL)、エタノール(2.3mL)へ溶解し、ここへ1-メチル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.2g, 0.46mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(0.9mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(31mg, 0.03mmol)を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、酢酸エチルを加え抽出、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物を分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)により単離、精製し表記化合物(白色固体、35mg)を得た。
MS (m/z) = 590.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.05, FLT3-ITD IC50 (nM); 2780, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 42%
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 593.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 1329
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 593.33 [M+1].
HCK IC50 (nM); 1.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 609, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 39.3%
N−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.2g, 0.42mmol)、1-メチル-N-(4-(4,4,5,5-テトラメチル-1,3,2-ジオキサボロラン-2-イル)フェニル)-1H-インドール-2-アミン(0.2g, 0.51mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(4.9mL)、エタノール(2.7mL)に溶解し、ここへ飽和炭酸ナトリウム溶液(1.0mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(34mg, 0.03mmol)を順次加え、混合物を80℃にてアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後酢酸エチルを加え抽出し、飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製しN-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(0.1g)が得られた。
N-(4-(4-アミノ-1-(4-オキソシクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(100mg)を1,2-ジクロロエタン(3mL)に溶かし、酢酸(35mg, 0.59mmol)、N-メチルピペラジン(59mg, 0.59mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(63mg, 0.3mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルに抽出し水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)により単離、精製を行った。N-(4-(4-アミノ-1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(白色固体、39mg)及び表記化合物N-(4-(4-アミノ-1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-3-イル)フェニル)-1-メチル-1H-インドール-2-カルボキサミド(白色固体、12mg)が得られた。
MS (m/z) = 564.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 1.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 1079
N−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
HCK IC50 (nM); 1.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 1343, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 17.1%
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 685.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−エチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 645.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 11, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−エチル−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 645.33 [M+H].
HCK IC50 (nM); 14, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−イソプロピル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 659.35 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−イソプロピル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 659.35 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 10999.9
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾロ[1,5−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾロ[1,5−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 409
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(2−メチル−6,7−ジヒドロピラゾロ[1,5−a]ピラジン−5(4H)−イル)シクロヘキシシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 7.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 3328
N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(6,7−ジヒドロピラゾロ[1,5−a]ピラジン−5(4H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 616.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 6581
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾ[1,2−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド
MS (m/z) = 630.32 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 4623
7−((trans)−4−(4−(2−メトキシエチル)ピラジン−1−イル)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 527.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4, FLT3-ITD IC50 (nM); 16, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 96%
2−(4−((trans)−4−(4−アミノ−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−7−イル)シクロヘキシル)ピペラジン−1−イル)エタン−1−オール
MS (m/z) = 513.29 [M+H].
HCK IC50 (nM); 3.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 21, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 93%
MS (m/z) = 510.31 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.26, FLT3-ITD IC50 (nM); 22, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 88%
MS (m/z) = 469.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 2.8, FLT3-ITD IC50 (nM); 21.0
5−(4−フェノキシフェニル)−7−((trans)−4−((ピリジン−4−イルメチル)アミノ)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミンの合成
MS (m/z) = 491.61 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9, FLT3-ITD IC50 (nM); 15, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 93%
MS (m/z) = 491.60 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.9, FLT3-ITD IC50 (nM); 8.8, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%
MS (m/z) = 491.7 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.7, FLT3-ITD IC50 (nM); 11, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 92%
MS (m/z) = 491.41 [M+H].
HCK IC50 (nM); 6.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 12, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%
5−(4−フェノキシフェニル)−7−((cis)−4−((テトラヒドロ−2H−ピラン−4−イル)アミノ)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 484.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 6.8, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%
7−((cis)−4−(((1−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)メチル)アミノ)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 0.53, FLT3-ITD IC50 (nM); 23, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%
7−((trans)−4−(((1−メチル−1H−ピラゾール−5−イル)メチル)アミノ)クロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 9.6, FLT3-ITD IC50 (nM); 39, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 97%
7−((cis)−4−(((1−メチル−1H−ピラゾール−3−イル)メチル)アミノ)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 494.26 [M+H].
HCK IC50 (nM); 8, FLT3-ITD IC50 (nM); 34, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 100%
1−((1s,4s)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−3−(4−フェノキシフェニル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 510.48 [M+H].
HCK IC50 (nM); 14.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 27, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 99%
(S)−3−(((cis)−4−(4−アミノ−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−7−イル)シクロヘキシル)アミノ)ピロロリジン−2−オン
MS (m/z) = 483.45 [M+H].
HCK IC50 (nM); 5.3, FLT3-ITD IC50 (nM); 30, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 97%
(S)−3−(((trans)−4−(4−アミノ−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−7−イル)シクロヘキシル)アミノ)ピロロリジン−2−オン
MS (m/z) = 483.44 [M+H].
HCK IC50 (nM); 13.5, FLT3-ITD IC50 (nM); 25
7−((1s,4s)−4−((8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)アミノ)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 523.50 [M+H].
HCK IC50 (nM); 4.2, FLT3-ITD IC50 (nM); 35.2, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 92%
7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 521.27 [M+H].
HCK IC50 (nM); 90, FLT3-ITD IC50 (nM); 23
N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−3−フェニルプロパンアミド
MS (m/z) = 538.70 [M+H].
HCK IC50 (nM); 32, FLT3-ITD IC50 (nM); 14, hERG inhibition(automated patch-clamp), 10μM; 53%
5−(4−フェノキシフェニル)−7−((trans)−4−(3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミン
MS (m/z) = 575.50 [M+H].
HCK IC50 (nM); 23, FLT3-ITD IC50 (nM); 43
4,4,5,5-テトラメチル-2-(4-フェノキシフェニル)-1,3,2-ジオキサボロラン(1.0g, 3.38mmol)をエチレングリコールジメチルエーテル(38mL)、エタノール(11mL)に溶解し、ここへ4-(4-アミノ-3-ヨード-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.5g, 1.35mmol)、飽和炭酸ナトリウム溶液(12mL)及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0.1g, 0.10mmol)を順次加え、混合物を80℃でアルゴン雰囲気下終夜半攪拌した。放冷後、ジクロロメタンを加え抽出し飽和食塩水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去した。得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール=10/1→ジクロロメタン/メタノール=95/5)にて精製し、4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.7g)を得た。
4-(4-アミノ-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-1-イル)シクロヘキサノン(0.7g, 1.65mmol)を1,2−ジクロロエタン(20mL)に溶かし、酢酸(0.3g, 4.96mmol)、N-メチルピペラジン(0.5g, 4.96mmol)及びナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(0.5g, 2.48mmol)を加え、室温にて終夜攪拌した。反応混合物を減圧縮後、酢酸エチルで抽出し、水で分液洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下で溶媒を留去し、分取薄層クロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール/28%アンモニア水=100/10/2)により単離、精製を行った。1-((cis)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(黄色油状、194mg)及び1-((trans)-4-(4-メチルピペラジン-1-イル)シクロヘキシル)-3-(4-フェノキシフェニル)-1H-ピラゾロ[3,4-d]ピリミジン-4-アミン(白色固体、73mg)を得た。
MS (m/z) = 483.27 [M+1H]
HCK IC50 (nM); 3, FLT3-ITD IC50 (nM); 55
(材料及び方法)
(1)ヒト試料
すべての実験は、理化学研究所 免疫・アレルギー科学総合研究センター(RCAI)のInstitutional Review Board for Human Researchからの承認により実施した。すべてのヒト試料は、書面によるインフォームドコンセントを得て収集した。転写プロファイリングは、French-American-British(FAB)分類システムのサブタイプM0(N=1)、M1(N=5)、M2(N=9)、M4(N=4)、M5(N=1)及びMDS/AML(N=25)を有する患者46名に由来する骨髄(BM)又は末梢血(PB)について実施した。HCK阻害の評価は患者32名に由来するBM又はPB試料について実施した。臍帯血(CB)試料は、東京臍帯血バンクが書面によるインフォームドコンセントを得て採取した。健常ドナー由来のBM単核細胞(MNC)はCambrex社(米国メリーランド州Walkerville)から入手した。AML患者由来のBM MNC及びCB MNCは、密度勾配遠心分離を使用して単離した。
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/Sz (NOD/SCID/IL2rgnull, NSG)マウスは、Il2rg遺伝子座の完全ヌル変異をNOD. Cg-Prkdcscid (NOD/SCID)系統と戻し交雑することによって、The Jackson Laboratory(米国メーン州Bar Harbor)で開発された(Shultz,L. D. et al., Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immuno1. 154, 180-191 (1995))。マウスを、理研及びThe Jackson Laboratoryの動物施設で、各施設でInstitutional Animal Committeesによって確立されたガイドラインに従って、照射した食物及び酸性化した水を用いて飼育し、規定された細菌叢のもとで維持した。
ヒト細胞の生着及びマーカーの発現を評価するため、細胞を蛍光色素結合ラット抗マウスCD45、抗マウスCD117、抗マウスSca−1、抗マウスGr1、抗マウスCD11b、抗マウスTER119、マウス抗ヒトCD45、抗ヒトCD33、抗ヒトCD34、抗ヒトCD38、抗ヒトCD3、抗ヒトCD8、抗ヒトCD19モノクローナル抗体(BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose)で標識した。解析はFACSAria及びFASCCanto II(BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose)を用いて行った。マイクロアレイ解析及び異種移植用の細胞を得るため、ヒトMNCを蛍光色素結合マウス抗ヒトCD3、抗ヒトCD4、抗ヒトCD8、抗ヒトCD34及び抗ヒトCD38モノクローナル抗体(BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose)で標識し、レシピエントのBM MNC細胞を前述した蛍光色素結合マウス抗ヒトCD45、抗ヒトCD34及び抗ヒトCD38モノクローナル抗体で標識してFACSAria(BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose)を用いて細胞をソートした。ソートされた細胞の純度は98%よりも高かった。正確な細胞数を求めるため、AccuCount Beads(BD Biosciences、米国カリフォルニア州San Jose)を用いたフローサイトメトリーを実施した。
新生仔のNOD/SCID/IL2rgnullレシピエントに、150cGyの全身照射を与え、その後ソートされた細胞の静脈内注射を行った。F. Ishikawa et al., Nat. Biotechno1. 25, 1315 (2007)に記載したように、AML生着レシピエントを作製するために、レシピエントあたり103〜105個のソートした7AAD−系(hCD3/hCD4/hCD8)−hCD34+hCD38−AML患者のBM細胞を用いた。末梢血(PB)ヒト細胞の生着は後眼窩放血(retro-orbital phlebotomy)によって評価した。
LSC試料74個及び健常人BM由来HSC試料8個をヒト遺伝子発現解析用マイクロアレイGeneChipTM Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Affymetrix、米国)を用いて評価した。ソートされた細胞104個以上からTRIzol試薬(Invitrogen、米国)を用いて抽出された全RNAから、Two−Cycle Target Labelingキット(Affymetrix、米国)を用いてビオチン化cRNAを合成した。Bioconductorパッケージ(http://www.bioconductor.org/)を用いて、マイクロアレイデータを解析した。マイクロアレイプラットフォーム上のプローブセットのシグナル強度を、GC−RMAプログラム(http://www.bioconductor.org/)を用いて正規化した。各プラットフォームに対して、正規化したデータをRankProdプログラム(Hong et al., Bioinformatics, 22, 2825-2827, 2006)により解析し、カットオフp値0.01かつ擬陽性推定0.05%として、LSCとHSCとの間で示差的に発現した遺伝子を選択した。遺伝子アノテーションは、Ingenuity Pathway Analysis及びGene Ontology Annotationのデータベース(http://www.ingenuity.com; http://www.ebi.ac.up/GOA/)から得た。
全RNAを、WT−Ovation RNA増幅システム(Nugen、米国)を用いるcDNA増幅に供した。PCR反応は、LightCycler 480(Roche Applied Science、スイス国)を使用して、Platinum Quantitative PCR SuperMix(Invitrogen、米国)で行った。二重標識した蛍光プローブ及び遺伝子特異的プライマー(Sigma-Aldrich、米国)の配列は特許文献2(WO2010/110346)の表3に記載されている。各転写物の存在量は、標準曲線法(Giulietti, A. et al., Methods, 25, 386-401 2001)により計算した。Kaleida Graphソフトウェアパッケージ(Synergy、米国)中のKruskal−Wallis、Wilcoxon−Mann−Whitney又はStudent’s t−検定のいずれかがP<0.05を示した場合、発現レベルが有意に異なるとみなした。
大腿骨から、パラホルムアルデヒド固定し脱灰したパラフィン包埋切片を調製し、マウス抗ヒトCD45モノクローナル抗体(DAKO、デンマーク国)及びマウス抗ヒトHCKモノクローナル抗体(Novus Biologicals、米国)を用いて標識した。Zeiss LSM710(Carl Zeiss Microimaging, ドイツ国)を用いて、レーザースキャニング共焦点イメージングを得た。
レンチウイルス形質導入及びHCK knock-down細胞株TF1a、HL−60及びK562をATCCから入手し、製造者の指示に従って維持した。ヒトAML CD34+CD38−細胞はFACSで精製するか、AML患者のBM、PB又はヒトAML生着レシピエントのBMから直接得た。レンチウイルスでパッケージングされたHCK shRNA及び対照GFP shRNAはSigma社から入手した。細胞を100のMOIに3〜4日間感染させ、採取し、マウス抗ヒトCD45、抗ヒトCD34及び抗ヒトCD38モノクローナル抗体で標識し、ソートして、HCK shRNA又は対照GFP shRNAが導入された(GFP陽性)hCD34+hCD38−細胞を得た。次いで、ソートされた細胞を、細胞株については、対応する培地で、又は、ヒトAML細胞については、組換えヒト幹細胞因子(SCF,50ng/ml)、組換えヒトトロンボポエチン(TPO,50ng/ml)及び組換えヒトFLT3リガンド(FL,50ng/ml)を添加したHPGM培地(Lonza、スイス国)で培養した。Zeiss Axiovert 200(Carl Zeiss Microimaging,ドイツ国)を用いて顕微鏡写真を撮った後、細胞を採取し、フローサイトメトリーによって生存能力を評価した。
実施例の化合物、比較化合物A(WO00/17203(特許文献3)の式(I)に包含される化合物)、比較化合物B(WO00/17203(特許文献3)の請求項72の3番目の化合物)、比較化合物C(チロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブ(Dasatinib))、比較化合物D(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 271, No. 2, pp. 695-701 (1996)に記載のPP2)、比較化合物E(Nature Chemical Biology, 4, 691-699 (2008)に記載のPP121)、比較化合物F(Nature Chemical Biology, 4, 691-699 (2008)に記載のPP20)、比較化合物G(PI3K inhibitor;PI103)及び比較化合物H(mTOR inhibitor;rapamycin)を用いた。
ヒトAML CD34+CD38−細胞はFACSで精製するか、患者BM/PB又はヒトAML生着レシピエントBMから直接得た。ソートされた細胞を、96ウェル組織培養プレートのウェル中、DMSO単独又は被験化合物の共存下で、組換えヒト幹細胞因子(SCF,50ng/ml)、組換えヒトトロンボポエチン(TPO,50ng/ml)及び組換えヒトFLT3リガンド(FL,50ng/ml)を添加したHPGM培地で培養した。3日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。
実施例60記載の材料及び方法に基づき、以下のキナーゼ阻害分析を行った。
in vitroでのキナーゼ阻害分析3
実施例60記載の材料及び方法に基づき、以下のキナーゼ阻害分析を行った。
FLT3阻害効果を有する薬剤を加えたキナーゼ阻害分析
Flt3/ITDを有するヒトAML CD34+CD38−細胞をFACSで精製するか、患者BM/PB又はヒトAML生着レシピエントBMから直接得た。ソートされた細胞を、96ウェル組織培養プレートのウェル中、実施例4記載の化合物とCrenolanibそれぞれの濃度条件を変えて共存させ、組換えヒト幹細胞因子(SCF,50ng/ml)、組換えヒトトロンボポエチン(TPO,50ng/ml)及び組換えヒトFLT3リガンド(FL,50ng/ml)を添加したHPGM培地で培養した。3日後、ウェルから細胞を採取し、細胞数、表面表現型及び生存能力を前述したようにフローサイトメトリーによって評価した。
処置されたAML CD34+CD38−細胞の白血病発症能力の評価
処置されたAML CD34+CD38−細胞の白血病発症能力を試験するため、各ウェルから採取された細胞から7AAD−CD45+細胞をソートし、前述したように新生仔NSGマウスに移植した。移植レシピエントは、後眼窩放血(retro-orbital phlebotomy)を移植後6週目に開始し、3週間ごとに受け、AML生着を評価した。生存率はKaplan-Meier法を用いて計算した。
(1)in vivoでのキナーゼ阻害分析
短期のin vivoでの処置研究のため、患者7名(U58#1,SH3,KH,U62,U142,AK,U115)由来のAMLを生着させたNOD/SCID/IL2rgnull littermateにビヒクル単独又は被験化合物30mg/kgを1日2回(bid)、18日間又はいずれかが瀕死状態になるまで腹腔内(ip)投与した。化学療法抵抗性疾患(AK, U115)の患者から得られたAML細胞が生着したレシピエントのin vivoでの処置研究については、littermateに、ビヒクル単独、被験化合物単独(30mg/kg ip bid)、AraC単独(480mg/kg ip×1)、又はAraC(480mg/kg ip×1)、次いで被験化合物(30mg/kg ip bid)の組み合わせを投与した。マウスが瀕死状態になったとき、又は処置6週間後にマウスを殺処分した。次いで、BM、脾臓及びPBにおけるヒトAMLのキメラ率を解析した。ヒトAMLのキメラ率は、フローサイトメトリーを用いhCD45で全体のヒト白血病細胞を、hCD45+hCD34+hCD38-でヒト白血病幹細胞を同定し、マウス白血球をmouseCD45, マウス赤血球をmouse Ter119で同定することで算出した。この結果、実施例1の化合物(阻害剤)単独投与、及びAraCと実施例1の化合物(阻害剤)との併用投与において顕著な効果が認められた(図4、図5)。
数値データは、平均値±標準誤差で表した。差異は、両側t-検定を用いて解析した(GraphPad Prism, GraphPad, USA)。P<0.05を示した場合、有意差があるとみなした。生存数はKaplan-Meier法により推定し、曲線はLog-rank (Mantel-Cox)検定により比較した。
LSCにおけるHCKの機能的役割を確認するために、ショートヘアピンRNA(shRNA)によるHCKの発現低下の効果を調べた。
Claims (23)
- 次式(I):
X1は、CH又は窒素原子であり;
X2及びX3は、CH又は窒素原子であり(ただし、X2及びX3は同一ではない。);Yは、C1−3−アルキレン基であり;
Y及びX2を含む環上の基であるW1は、独立して、C1−6−アルキル基であり;
mは、0〜3の整数であり;
Z1及びZ2は、独立して、水素原子、C1−6−アルキル基、アミノ−C1−6−アルキル基、C1−6−アルキルアミノ−C1−6−アルキル基、ジ(C1−6−アルキル)アミノ−C1−6−アルキル基、ヒドロキシ−C1−6−アルキル基、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル基、C2−7−脂肪族アシル基、カルボキシ−C1−6−アルキル基、カルバモイル−C1−6−アルキル基、置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のアリール−C1−6−アルキル基、置換又は非置換のヘテロアリール−C1−6−アルキル基、置換又は非置換のアリールカルボニル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基(ただし、Z1及びZ2が共に水素原子の場合を除く。)であり;
X2がCHでありX3が窒素原子のとき、Z1及びZ2はX3を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される2個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基を形成してもよく、
X2が窒素原子でありX3がCHのとき、Z1及びZ2はX3を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基を形成してもよい。)
で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ(ここで、プロドラッグは、C2−7−アシル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アルコキシカルボニル)基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換された水酸基又はアミノ基を有する化合物、又はC1−6−アルキル基、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換されたカルボキシル基を有する化合物である。)を含有する、白血病幹細胞を殺傷するための医薬組成物。 - 請求項1記載の式(I)で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ(ここで、プロドラッグは、C2−7−アシル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アルコキシカルボニル)基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換された水酸基又はアミノ基を有する化合物、又はC1−6−アルキル基、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換されたカルボキシル基を有する化合物である。)を含有する、急性骨髄性白血病の治療用の医薬組成物。
- 請求項1記載の式(I)で示される化合物、その塩又はそれらのプロドラッグ(ここで、プロドラッグは、C2−7−アシル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル(C2−7−アシル)基、C1−6−アルコキシカルボニル基、C1−6−アルコキシ(C2−7−アルコキシカルボニル)基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換された水酸基又はアミノ基を有する化合物、又はC1−6−アルキル基、C1−6−アルコキシ−C1−6−アルキル基、(C2−7−アシルオキシ)メチル基、1−(C2−7−アシルオキシ)エチル基、(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシメチル基又は1−〔(C2−7−アルコキシカルボニル)オキシ〕エチル基で置換されたカルボキシル基を有する化合物である。)を含有する、急性骨髄性白血病の再発抑制用の医薬組成物。
- 再発した急性骨髄性白血病治療用である、請求項1又は2記載の医薬組成物。
- Flt3/ITD変異を有する白血病幹細胞に対して作用させる、請求項1から3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- Flt3/ITD変異を有する白血病幹細胞を体内に持つ急性骨髄性白血病患者に投与するための請求項5記載の医薬組成物。
- Ar1が置換又は非置換のアリーレン基、Ar2が置換又は非置換のアリール基、Lが酸素原子である、請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- Ar1が置換又は非置換のアリーレン基、Ar2が置換又は非置換のアリール基又はヘテロアリール基、Lが−NHCO−である、請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020729)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020730)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020732)、N−(4−(4−アミノ−1−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)ピコリンアミド(RK−0020770)、N−(4−(4−アミノ−1−((1r,4r)−4−(8−メチル−3,8−ジアザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020791)、N−(4−(4−アミノ−1−(1−(8−メチル−8−アザビシクロ[3.2.1]オクタン−3−イル)ピペリジン−4−イル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020798)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020819)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020820)、N−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)フェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020824)、N−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020826)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−(トリフルオロメチル)−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020901)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−エチル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020908)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−エチル−5,6−ジヒドロ[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020909)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−イソプロピル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020918)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−イソプロピル−5,6−ジヒドロ−[1,2,4]トリアゾロ[4,3−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020919)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾロ[1,5−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020920)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾロ[1,5−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020921)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(2−メチル−6,7−ジヒドロピラゾロ[1,5−a]ピラジン−5(4H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020930)、N−(4−(4−アミノ−7−((cis)−4−(6,7−ジヒドロピラゾロ[1,5−a]ピラジン−5(4H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020932)、N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(3−メチル−5,6−ジヒドロイミダゾ[1,2−a]ピラジン−7(8H)−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020942)及びN−(4−(4−アミノ−1−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−1H−ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン−3−イル)−2−メトキシフェニル)−1−メチル−1H−インドール−2−カルボキサミド(RK−0020618)からなる群より選択される化合物である、請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- X2がCH、X3が窒素原子であり、Z1及びZ2がX3を含み、酸素原子、イオウ原子又は窒素原子よりなる群から選択される2個以上のヘテロ原子を環員に含む置換又は非置換の単環もしくは多環の複素環基である請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記化合物が7−[trans−4−(4−メチル−1−ピペラジニル)シクロヘキシル]−5−(4−フェノキシフェニル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−4−アミンであり、再発した急性骨髄性白血病治療用である請求項10記載の医薬組成物。
- Z1が水素原子であり、Z2が置換又は非置換の飽和複素環基、置換又は非置換のヘテロアリール−C1−6−アルキル基又は置換又は非置換のヘテロアリールカルボニル基である、請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- X2が窒素原子、X3がCHであり、Z1及びZ2がX3を含み、置換又は非置換の酸素原子、イオウ原子又は窒素原子から選択されるヘテロ原子を有する単環もしくは多環の複素環基である請求項1から6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- FLT3の阻害効果を有する薬剤をさらに含む、請求項2又は3記載の医薬組成物。
- 前記薬剤がCrenolanib、Lestautirinib、PKC412、Tandutinib、Sunitinib、Sorafenib、Linifanib、Dovitinib、KW-2449、Quizartinib、Dovitinib Dilactic acid、Tandutinib、Cabozanitib、TG101209、Amuvatinib及びENMD-2076から選択される少なくとも一つの剤である、請求項14記載の医薬組成物。
- N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−3−フェニルプロパンアミド(RK−0020693)又はその塩を含有する、白血病幹細胞を殺傷するための医薬組成物。
- N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−3−フェニルプロパンアミド(RK−0020693)又はその塩を含有する、急性骨髄性白血病の治療用又は再発抑制用の医薬組成物。
- N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−3−フェニルプロパンアミド(RK−0020693)又はその塩を含有する、再発した急性骨髄性白血病治療用の医薬組成物。
- N−(4−(4−アミノ−7−((trans)−4−(4−メチルピペラジン−1−イル)シクロヘキシル)−7H−ピロロ[2,3−d]ピリミジン−5−イル)フェニル)−3−フェニルプロパンアミド(RK−0020693)又はその塩を含有する、Flt3/ITD変異を有する白血病幹細胞に対して作用させる医薬組成物。
- Flt3/ITD変異を有する白血病幹細胞を体内に持つ急性骨髄性白血病患者に投与するための請求項19記載の医薬組成物。
- FLT3の阻害効果を有する薬剤をさらに含む、請求項17記載の医薬組成物。
- 前記薬剤がCrenolanib、Lestautirinib、PKC412、Tandutinib、Sunitinib、Sorafenib、Linifanib、Dovitinib、KW-2449、Quizartinib、Dovitinib Dilactic acid、Tandutinib、Cabozanitib、TG101209、Amuvatinib及びENMD-2076から選択される少なくとも一つの剤である、請求項21記載の医薬組成物。
- 以下の工程を含む、急性骨髄性白血病と診断された個体であってFlt3/ITD変異を有する白血病幹細胞を有する個体における請求項1から22のいずれか1項に記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性の増大を決定するための方法。
個体から採取した急性骨髄性白血病の腫瘍細胞サンプルから核酸を得る工程;及び
該核酸中のFlt3遺伝子のITD変異を検出する工程であって、当該ITD変異の存在は、個体における請求項1から22のいずれか1項に記載の医薬組成物による治療の薬理有効性の可能性が増大することを示す工程。
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