JP6224739B2 - 抗ｌａｇ−３結合タンパク質 - Google Patents

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Description

本発明は、抗原結合タンパク質に関し、特に、リンパ球活性化遺伝子（Lymphocyte Activation Gene）（LAG-3）に結合し、LAG-3を発現する活性化T細胞を枯渇させる抗体、そのような抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記抗原結合タンパク質を含有する医薬組成物、並びに病原性T細胞の関与に関連した疾患の治療及び/又は予防における前記抗原結合タンパク質の使用に関する。
リンパ球活性化遺伝子-3（LAG-3）は、T細胞のホメオスタシス、増殖及び活性化を調節する負の補助刺激受容体である（Sierro Sら、Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101）。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるLAG-3は、CD4様タンパク質であり、CD4のようにMHCクラスII分子に結合するが、アフィニティは2倍高く、CD4とは異なる部位に結合する（Huard Bら、(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9）。非常に特有な機能を発揮することに加えて（CD4は正の補助刺激分子である）、2種の受容体は差次的に制御される。CD4はすべての成熟CD4+T細胞の表面に構成的に発現し、細胞内に存在するのはごく一部であるのに対し、LAG-3分子の大部分は細胞内の微小管形成中心付近に置かれ、抗原特異的T細胞の活性化に伴ってのみ誘発される（Woo SRら、(2010) Eur J Immunol 40: 1768-77）。T細胞反応の負のレギュレーターとしてのLAG-3の役割は、LAG-3ノックアウトマウス、並びにin vitro系及びin vivo系モデルにおける遮断抗LAG-3抗体の使用に関する研究に基づいている（Sierro Sら、Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Hannier Sら(1998)、J Immunol 161: 4058-65; Macon-Lemaitre Lら(2005)、Immunology 115: 170-8; Workman CJら(2003)、Eur J Immunol 33:970-9）。
細胞表面では、LAG-3は二量体として発現し、それは、安定なMHCクラスII結合部位の形成に必要である（Huard Bら(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 5744-9）。LAG-3は、可溶性形態では、健康なドナー並びに結核や癌の患者の血清にもみられ（Lienhardt Cら(2002)、Eur J Immunol 32: 1605-13; Triebel Fら(2006). Cancer Lett 235: 147-53）、この形態はLAG-3+T細胞の数と相互関係がある可能性がある（Siawaya Jら(2008). J of Infection 56: 340-7）。増強されたリンパ球枯渇剤の標的抗原としてのLAG-3の重要な特性は、現在臨床にある他の薬剤、すなわちCampath(商標)（T/B細胞）、Amevive（ほとんどのCD45RO+T細胞）又はRituxan（B細胞）を使用した場合と比べて、相対的に選択的な発現プロファイルを有することである。数種類の分子は、ヒトにおけるin vivoのT細胞活性化の持続的なマーカーとして特定されている。これには、LAG-3、OX40、MHCクラスII、CD69、CD38、ICOS及びCD40Lが含まれる。しかし、LAG-3及びOX40を除けば、これら分子の大部分は、ヒトの天然のT reg又は他の細胞型においても構成的に発現する。LAG-3は健康なヒトのT細胞のごく一部に発現し（約1〜4％）、NK細胞においても同程度に発現する（Baixeras Eら(1992)、J Exp Med 176: 327-37; Huard Bら(1994)、Immunogenetics 39: 213-7）。抗CD3によって活性化されると、CD4+T細胞及びCD8+T細胞のどちらも、約30％から80％が24時間から48時間以内にLAG-3を発現し、この割合はIL2、IL7及びIL12の存在により増加する（Sierro Sら、Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101; Bruniquel Dら(1998)、Immunogenetics 48: 116-24）。リコール抗原（CMV又は破傷風トキソイドなど）により抗原特異的刺激を与えると、活性化T細胞の大部分はLAG-3+T細胞となる。加えて、ヒトにおいては、LAG-3は、健康なヒト血液のCD4+ CD25+ FoxP3+ T regの部分集団（1〜10％）においても発現する。この集団は、in vitroにおいては細胞接触及びIL10依存メカニズムにより機能が抑制されるとみられ、ゆえに、最近活性化された天然の又は誘発されたT regの集団であることを示している可能性がある（Camisaschi C, Casati C, Rini Fら(2010). LAG-3 expression defines a subset of CD4+CD25highFox3P + regulatory T cells that are expanded at tumour sites. J. Immunol 184: 6545-51）。LAG-3は、形質細胞様樹状細胞、B細胞及びNKT細胞などの、造血系の他の細胞型においても検出されているが、それはマウスにおいてのみであり、ほとんどの場合、活性化に伴ってである（Sierro S, Romero P & Speiser D; Expert Opin. Ther. Targets (2010) 15: 91-101）。
LAG-3+T細胞の枯渇を利用して、T細胞により誘発される免疫炎症障害を治療又は予防することができる。大部分の自己反応性細胞が疾患部位において自己抗原によって慢性的に活性化され、且つ/又は、末梢（periphery）において再循環する自己免疫疾患においては、枯渇性抗原結合タンパク質による短期治療によりこの自己免疫T細胞レパートリーを選択的に枯渇させ、長期の寛解をもたらすことができる。このアプローチに関する前例は、汎リンパ球（pan-lymphocyte）枯渇性抗体であるCampath(商標)を用いて実証されており、多発性硬化症の試験において、12mgを1回注射することで、標準治療と比べて再発率が74％減少した（The CAMMS223 Trial Investigators (2008), N Engl J Med. 359:1786-801）。Campath(商標)が標的としているCD52に比べてLAG-3はより選択的に発現するため、ナイーブ及び静止メモリーT細胞や天然のT regレパートリーへの影響は抑えられるはずである。これにより、Campath(商標)に関連した自己免疫の発症に加えて、感染症や悪性腫瘍の危険性も低下させることにより、効力を維持しつつも、治療指数を改善することにつながるものと期待される。さらに、ヒヒにおけるツベルクリン皮膚チャレンジモデルにおいては、LAG-3を標的とするキメラ抗体IMP731は、末梢及び皮膚チャレンジ部位双方においてLAG-3+T細胞の枯渇を媒介し、その結果ツベルクリン皮膚チャレンジ反応が減少した（Poirier Nら(2011)、Clin Exp Immunol 164: 265-74）。さらなる研究においては、LAG-3ポリクローナル抗体はラットの移植心から採取されたLAG-3+浸潤T細胞を枯渇させ、これら移植組織の生存を延長した（Haudebourg Tら(2007)、Transplantation 84: 1500-1506）。
当技術分野では、LAG-3に結合し、LAG-3+活性化T細胞を枯渇させ、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎及び自己免疫性肝炎などの自己免疫疾患;感染性疾患、アレルギー性疾患並びに癌の治療に使用することができる、抗原結合タンパク質、特にヒト化抗体が必要とされている。
本発明は、リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）に結合し、LAG-3+活性化T細胞を枯渇させることができる、ヒト化抗体などの抗原結合タンパク質を広く対象とする。より具体的には、本発明の抗原結合タンパク質は、配列番号5のCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含みうる。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、病原性T細胞の関与に関連した疾患、例えば自己免疫疾患、例えば乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎及び自己免疫性肝炎など；感染性疾患、アレルギー性疾患並びに癌の治療又は予防に使用することができる。それゆえに、本発明はさらに、本発明に係る抗原結合タンパク質と任意選択で1種以上の薬学的に許容される賦形剤及び/又は担体とを含む医薬組成物に関する。
LAG-3を発現するEL4（A）及び活性化ヒトCD3+T細胞（B）に結合した抗体。陰性対照としては、関連のない標的に対するモノクローナル抗体であるSynagisを使用した。 注射から24時間後に腹腔から採取された、腹腔内に同時投与される活性化ヒトPBMCに対するアフコシル化抗体H5L7BWの影響。A）1×107個の活性化ヒトPBMC及び5mg/kgの対照抗体、H5L7BW又はCampath(商標)の同時投与から24時間後のヒトCD4+LAG-3+及びCD8+LAG-3+ T細胞の定量（ドナーA:対照n=2、H5L7BW n=2、MabCampath n=1、ドナーB:対照n=2、H5L7BW n=3、Campath(商標)n=2）。B）CD4+及びCD8+T細胞の合計の定量。（*p<0.001）。 注射から5時間後に腹腔から採取された、腹腔内に同時投与される活性化ヒトPBMCに対する、アフコシル化抗体H5L7BW及びその非ADCC増強バリアントH5L7の影響。A）1×107個の活性化ヒトPBMC及び5mg/kgの対照抗体、H5L7BW又はH5L7（各群n=3）の同時投与から5時間後のヒトCD4+LAG-3+及びCD8+LAG-3+ T細胞の定量。B）CD4+及びCD8+T細胞の合計の定量。（*p<0.001）。 SCIDマウスの腹膜にヒト活性化PBMCを投与する18時間前に静脈内投与されたアフコシル化抗体H5L7BWの影響。A）5×106個（各群n=1）又は1×107個O/N（各群n=4）の活性化ヒトPBMCの腹腔内（i.p.）注射から5時間後のヒトCD4+LAG-3+及びCD8+LAG-3+ T細胞の定量。B）CD4+及びCD8+T細胞の合計の定量。H5L7BW又は対照抗体5mg/kgは、活性化ヒトPBMCを注射する18時間前に静脈内注射した。（*p<0.001、# p=0.0052）。 SCIDマウスの腹膜に活性化ヒトPBMCを投与する18時間前に静脈内投与されたH5L7BW、H5L7又はIMP731（5mg/kg）の影響。A）1×107個（各群n=4）の活性化ヒトPBMCの腹腔内（i.p.）注入から5時間後のヒトCD4+LAG-3+及びCD8+LAG-3+ T細胞の定量。5mg/kgのH5L7BW、H5L7、IMP731又は対照抗体は、ヒトPBMCを注射する18時間前に静脈内注射した。B）CD4+及びCD8+T細胞の合計の定量。5mg/kgのLAG-3枯渇性抗体又は対照抗体は、活性化ヒトPBMCを注射する18時間前に静脈内注射された。（*p<0.001）。
本発明は、リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）に結合する抗原結合タンパク質、より具体的にはLAG-3+活性化T細胞を枯渇させることができる抗原結合タンパク質を広く対象とする。
本明細書において使用する「抗原結合タンパク質」という用語は、LAG-3に結合することができる抗体及びそのフラグメントを指す。特に指定がない限り、本明細書において使用する「LAG-3」という用語は、リンパ球活性化遺伝子3のことである。「LAG-3」という用語は、その範囲内に、例えば活性化T細胞、NK細胞及びB細胞の表面に二量体として発現するLAG-3（当技術分野では、例えばCD223などとしても知られる）、並びに本明細書においては「sLAG-3」と称する、例えばヒト血清中に見られる可溶性形態のLAG-3を含むが、それに限定されない。特に指定がない限り、本明細書における「sLAG-3」及び「LAG-3」は、ヒトポリペプチドを指す。ある特定の実施形態においては、本発明は、例えば活性化T細胞、NK細胞及びB細胞の表面に二量体として発現する形態のLAG-3（当技術分野では、例えばCD223などとしても知られる）に結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。より具体的には、本発明は、活性化T細胞に発現するLAG-3に結合することができ、前記活性化T細胞を枯渇させることができる抗原結合タンパク質に関する。
一態様では、本発明は、LAG-3に結合することができ、27E位がプロリンである配列番号5からのCDRL1を含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号1のCDRL1を含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、LAG-3に結合することができ、配列番号5からのCDRL1を含み、配列番号5のCDRL2及び/若しくはCDRL3又はそのCDRバリアントをさらに含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号2のCDRL2及び/若しくは配列番号3のCDRL3又はそのCDRバリアントをさらに含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、LAG-3に結合することができ、配列番号5からのCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号10からのCDRH1、CDRH2及びCDRH3のうち1つ以上、又はそのCDRバリアントを含む抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号5からのCDRL1、CDRL2及びCDRL3と、配列番号10からのCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号6のCDRH1、配列番号7のCDRH2及び配列番号8のCDRH3からなる群より選択される1つ以上のCDR又はそのCDRバリアントを含む抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様において、本発明は、以下のCDR：
CDRL1: 配列番号1
CDRL2: 配列番号2
CDRL3: 配列番号3
CDRH1: 配列番号6
CDRH2: 配列番号7
CDRH3: 配列番号8
を含む抗原結合タンパク質を提供する。
別の態様において、本発明は、配列番号5からのCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む可変軽鎖と、配列番号10からのCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む可変重鎖とを含む抗原結合タンパク質を提供する。
特定の態様において、抗原結合タンパク質はヒト化抗体であり、場合によりIgGであってもよい。
本明細書において使用する「CDR」という用語は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域のアミノ酸配列を指す。これらは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分において3つの重鎖CDR及び3つの軽鎖CDR（又はCDR領域）が存在する。
当業者であれば、CDR配列のための種々の番号付け慣用法があることを理解しているだろう：Chothia（Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883）、Kabat（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)）、AbM（University of Bath）、及びContact（University College London）。Kabat、Chothia、AbM及びContact法のうちの少なくとも2つを使用した最小の重複領域を「最小結合単位」を提供するために決定できる。最小結合単位はCDRの一部分であってもよい。抗体の構造及びタンパク質折りたたみは、他の残基がCDR配列の一部と考えられることを意味し、当業者であればそのように理解するだろう。
他に言及しない場合及び／又は具体的に配列を特定しない場合、本明細書における「CDR」、「CDRL1」、「CDRL2」、「CDRL3」、「CDRH1」、「CDRH2」、「CDRH3」への言及は、表1に示される公知の規則のいずれかにしたがって番号付けされたアミノ酸配列を指す。特定の実施形態において、使用する番号付け規則はKabat規則である。本明細書における「27E位」の言及は、Kabat番号付け規則を用いて定義された軽鎖可変ドメインにおける27E位に存在するアミノ酸に対するものである。当業者であれば、この位置が他の公知の規則において等価であること、例えばChothiaでは27E位が30B位と等価であることを理解するだろう。
以下の表1は、各CDR又は結合単位についての各番号付け規則を使用した一つの定義を表す。CDR定義の一部は、使用される個々の刊行物に応じて異なる場合があることに留意すべきである。
Figure 0006224739
本明細書において使用する「CDRバリアント（変異体）」という用語は、少なくとも1つ、例えば1つ、2つ又は3つ、のアミノ酸の置換、欠失又は付加により改変されたCDRを指し、ここでこのCDRバリアントを含む改変型抗原結合タンパク質は改変前の抗原結合タンパク質の生物学的特徴を実質的に保持する。改変することができる各CDRを、単独で又は別のCDRと組み合わせて改変してもよいことが理解されるだろう。一態様において、改変は、置換、特に保存的置換（例えば表2に示すもの）である。
Figure 0006224739
例えば、バリアントCDRにおいて、最小結合単位のアミノ酸残基は同じまま保持することができるが、Kabat又はChothia定義の一部としてCDRを含む隣接残基は、保存的アミノ酸残基で置換してもよい。
上述したような改変CDR又は最小結合単位を含む抗原結合タンパク質は、本明細書において「機能的CDRバリアント」又は「機能的結合単位バリアント」と称されうる。
本発明の抗原結合タンパク質は、sLAG-3に結合することができる。一態様において、抗原結合タンパク質−sLAG-3相互作用の平衡解離定数（KD）は10nM又はそれ未満であり、1nM又はそれ未満など、例えば1pMと300、400、500pMの間、又は500pMと1nMの間である。当業者であれば、KDの数値が小さくなるほど、結合が強くなることを理解するだろう。KDの逆数（すなわち1/KD）は、平衡結合定数（KA）であり単位M-1を有する。当業者であれば、このKAの数値が大きくなるほど、結合が強くなることを理解するだろう。
一態様において、本発明は、それぞれ配列番号51及び52の組換えヒト又はカニクイザル（cynomolgus macaque）LAG-3細胞外ドメイン（ECD）を用いてBiacore(商標)表面プラズモン共鳴分析により決定した場合に、組換えLAG-3と1nM未満のKD、例えば1pM〜300pMのKDで結合することができる抗原結合タンパク質を提供する。
さらに、本発明の抗原結合タンパク質はまた、例えばEL4細胞又は活性化ヒトCD3+ T細胞上に発現されるLAG-3と結合することができる。
本発明の抗原結合タンパク質はまた、LAG-3+活性化T細胞、特にCD4+LAG-3+及びCD8+LAG-3+ T細胞を枯渇することができる。LAG-3+ T細胞の枯渇は、例えば、抗体依存性細胞媒介細胞傷害活性（ADCC）及び／又は補体依存性細胞傷害活性（CDC）によって生じうる。
一態様において、本発明は、初代ヒトT細胞を用いたin vitroアッセイにおいてADCCにより抗原特異的CD4及び／又はCD8 LAG-3+ヒトT細胞の40％を超える枯渇を生じることができる抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ユーロピウム標識LAG-3発現EL4細胞を標的細胞として、ヒトPBMCをエフェクター細胞として用いるin vitro ADCCアッセイ（ここで、エフェクター：標的の比が、50：1以下であり、アッセイを2時間の時間で実行する）において、0.1μg/mLの濃度で、50％を超える枯渇を生じることができる抗原結合タンパク質を提供する。細胞溶解率（％）は、LAG-3発現EL4細胞からのユーロピウム放出に基づいて計算する。
抗原結合タンパク質の定常領域と様々なFcレセプター（FcR）（FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）など）との間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能、例えばADCC及びCDCを媒介すると考えられる。有意な生物学的影響は、エフェクター機能性の結果であり得る。通常、エフェクター機能を媒介する能力は、抗原に対する抗原結合タンパク質の結合を必要とするものであり、全ての抗原結合タンパク質が全てのエフェクター機能を媒介するとは限らない。
ADCCエフェクター機能を測定するために、本発明の抗原結合タンパク質（例えば抗体）の、FcγRIIIを介したナチュラルキラー細胞への結合、又はFcγRIを介した単球/マクロファージへの結合によるものを含む多数の方法でエフェクター機能を測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ADCCエフェクター機能について、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいて評価することができる。このようなアッセイの例は、Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, p6591-6604、Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol268, p25124-25131、Lazar et al, 2006 PNAS, 103;4005-4010に見出すことができる。
CDCの機能を測定するためのアッセイの例としては、1995 J Imm Meth 184:29-38に記載されているものが挙げられる。
本発明の一態様において、抗原結合タンパク質は抗体である。
本明細書において使用する「抗体」という用語は、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指し、モノクローナル（例えばIgG、IgM、IgA、IgD若しくはIgE）、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン（例えば、VL）、ドメイン抗体（dAb(登録商標)）、抗原結合フラグメント、免疫学的に有効なフラグメント、Fab、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、一本鎖Fv、閉鎖型コンフォメーション多重特異性抗体、ジスルフィド結合scFv、ダイアボディ、TANDABS(商標)など、並びに上記のいずれかの改変型形態が含まれる（別の「抗体」形式の概要については、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 2005, Vol 23, No. 9, 1126-1136を参照）。別の抗体形式としては、本開示にしたがって任意の分子の1以上のCDRを好適な非免疫グロブリンタンパク質スカフォールド又は骨格上に配置することができる別のスカフォールド、例えばアフィボディ、SpAスカフォールド、LDL受容体クラスAドメイン、アビマー（avimer）（例えば、米国特許出願公開第2005/0053973号、同第2005/0089932号、同第2005/0164301号）又はEGFドメインが含まれる。
さらなる態様において、抗原結合タンパク質はヒト化抗体である。
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのCDRを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分は1種（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリン（複数可）由来である操作された抗体の種類を指す。加えて、フレームワーク支持残基は結合アフィニティを保存するように改変できる（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032(1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421(1991)を参照のこと）。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との相同性により、慣用的データベース、例えばKABAT(登録商標)データベース、ロスアラモスデータベース、及びスイスプロテインデータベースから選択されるものであってもよい。（アミノ酸に基づいて）ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性により特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域及び/又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適切であり得る。軽鎖定常領域又は可変フレームワーク領域を供与し得る適切なアクセプター抗体を同様に選択することができる。アクセプター抗体重鎖及び軽鎖は、同じアクセプター抗体が起源である必要はないということに留意すべきである。従来技術はこのようなヒト化抗体を作製するいくつかの方法を記載している（例えば、EP-A-0239400及びEP-A-054951を参照のこと）。
また別の態様において、ヒト化抗体は、IgG1であるヒト抗体定常領域、例えば、配列番号46の重鎖定常領域を有する。
本発明がさらに、（a）配列番号5の軽鎖配列、又は配列番号5のいずれかに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号10の重鎖配列、又は配列番号10のいずれかに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する重鎖配列を含むヒト化抗体を提供することが理解されよう。
さらなる態様において、本発明は、（a）配列番号5に対して少なくとも90％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号10に対して少なくとも90％の同一性を有する重鎖配列を含むヒト化抗体を提供する。
さらなる態様において、本発明は、（a）配列番号5に対して少なくとも95％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号10に対して少なくとも95％の同一性を有する重鎖配列を含むヒト化抗体を提供する。
また別の態様において、本発明は、（a）配列番号5に対して少なくとも97％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号10に対して少なくとも97％の同一性を有する重鎖配列を含むヒト化抗体を提供する。
また別の態様において、本発明は、（a）配列番号5の軽鎖配列、及び（b）配列番号10の重鎖配列を含むヒト化抗体を提供する。
本発明がさらに、（a）配列番号35の軽鎖配列、又は配列番号35のいずれかに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号36の重鎖配列、又は配列番号36のいずれかに対して少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％若しくは99％の同一性を有する重鎖配列を含むヒト化抗体を提供することが理解されよう。
さらなる態様において、本発明は、それぞれ配列番号35及び36のCDRL1-L3及びCDRH1-H3を含む抗原結合タンパク質を提供する。
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列に関して、「同一」又は「同一性」という用語は、適当な挿入及び欠失を行って最適にアライメントし比較した場合の、2つの核酸配列又は2つのアミノ酸配列の間の同一性の程度を示す。
2つの配列間の同一性％は、2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、それらの配列で共有される同じ位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同じ位置の数／位置の総数×100）である。配列の比較及び2つの配列間の同一性％の決定は、以下に記載するような数学アルゴリズムを用いて行うことができる。
クエリー核酸配列と対象の核酸配列との間の同一性％は、ペアワイズBLASTNアライメントを行った後に対象の核酸配列がクエリー核酸配列と100％のクエリーをカバーする場合にBLASTNアルゴリズムにより計算される、パーセンテージで表される「同一性（Identities）」の値である。そのようなクエリー核酸配列と対象の核酸配列との間のペアワイズBLASTNアライメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトにおいて利用可能なBLASTNアルゴリズムのデフォルト設定を用いて、低複雑度領域（low complexity region）のフィルターはオフにして行う。重要な点は、クエリー核酸配列は、本出願の1以上の請求項において特定された核酸配列によって表されることである。
クエリーアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列との間の同一性％は、ペアワイズBLASTPアライメントを行った後に対象のアミノ酸配列がクエリーアミノ酸配列と100％のクエリーをカバーする場合にBLASTPアルゴリズムにより計算される、パーセンテージで表される「同一性（Identities）」の値である。そのようなクエリーアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列との間のペアワイズBLASTPアライメントは、National Center for Biotechnology Instituteのウェブサイトにおいて利用可能なBLASTPアルゴリズムのデフォルト設定を用いて、低複雑度領域（low complexity region）のフィルターはオフにして行う。重要な点は、クエリーアミノ酸配列は、本出願の1以上の請求項において特定されたアミノ酸配列によって表されることである。
製造（作製）
本発明の抗原結合タンパク質、例えば抗体（ヒト化抗体など）は、本発明の抗原結合タンパク質についてのコード配列を含む発現ベクターでの宿主細胞のトランスフェクションにより製造し得る。発現ベクター又は組換えプラスミドは、宿主細胞中での複製及び発現並びに／又は宿主細胞からの分泌を制御することができる慣用の調節制御配列と機能的に結合した抗原結合タンパク質のこれらのコード配列を配置することにより作製される。調節配列としては、プロモーター配列、例えばCMVプロモーター、及び他の公知の抗体由来であり得るシグナル配列が挙げられる。同様に、相補的抗原結合タンパク質軽鎖又は重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを作製することができる。特定の実施形態において、この第2の発現ベクターは、可能な限り、各ポリペプチド鎖が機能的に発現されることを確保するようにコード配列及び選択可能なマーカーが関連する場合を除いて第1のベクターと同一である。あるいは、抗原結合タンパク質についての重鎖及び軽鎖コード配列は単一ベクターに存在していてもよい。
選択される宿主細胞は、第1及び第2のベクター両方を用いて従来技術により共トランスフェクトし（又は単に単一ベクターによりトランスフェクトし）て、組換え又は合成軽鎖及び重鎖の両方を含む本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作出する。次いでトランスフェクトされた細胞を従来技術により培養して、本発明の操作された抗原結合タンパク質を作製する。組換え重鎖及び/又は軽鎖の両方の結合を含む抗原結合タンパク質は、ELISA又はRIAなどの適切なアッセイにより培養物からスクリーニングされる。同様の従来技術を他の抗原結合タンパク質を構築するために利用できる。
当業者であれば、本発明の方法及び組成物の構築に利用されるクローニング及びサブクローニングステップに適切なベクターを選択することができる。例えば、クローニングベクターの従来のpUC系を使用してもよい。1つのベクターであるpUC19は、Amersham（Buckinghamshire、英国）又はPharmacia（Uppsala、スウェーデン）などの供給会社から市販されている。更に、容易に複製でき、多数のクローニング部位及び選択可能な遺伝子（例えば抗生物質耐性）を有し、容易に操作される任意のベクターをクローニングに使用することができる。このように、クローニングベクターの選択は本発明における限定要因ではない。
発現ベクターは、異種DNA配列、例えば哺乳動物ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（DHFR）の発現を増幅するのに適した遺伝子を特徴とすることができる。他の好ましいベクター配列としては、ウシ成長ホルモン（BGH）及びベータグロビンプロモーター配列（ベータグロプロ（betaglopro））由来などのポリAシグナル配列が挙げられる。本明細書に有用な発現ベクターは当業者に周知の技術により合成できる。
このようなベクターの要素、例えばレプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列などは、商業的供給源若しくは天然源から得られてもよいし、又は選択された宿主内の組換えDNA産物の発現及び/若しくは分泌を駆動するのに使用するために公知の手順により合成してもよい。哺乳動物、細菌、昆虫、酵母及び真菌発現についての多くの種類が当技術分野において知られている他の適切な発現ベクターもまた、この目的のために選択できる。
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質のコード配列を含有する組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞株を包含する。これらのクローニングベクターのクローニング及び他の操作に有用な宿主細胞も従来からある。しかしながら、大腸菌（E.coli）の種々の株由来の細胞を、クローニングベクターの複製、及び本発明の抗原結合タンパク質の構築における他のステップに使用してもよい。
本発明の抗原結合タンパク質の発現のために適切な宿主細胞又は細胞株としては、NS0、Sp2/0、CHO（例えばDG44）、COS、HEK、線維芽細胞（例えば3T3）及び骨髄腫細胞などの哺乳動物細胞が挙げられ、例えばそれはCHO又は骨髄腫細胞において発現できる。ヒト細胞を使用してもよく、それにより分子がヒトグリコシル化パターンで修飾されることが可能になる。あるいは、他の真核細胞株を利用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞の選択並びに形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び産物の産生並びに精製のための方法は当技術分野において公知である。例えば上記で引用したSambrook et al.を参照のこと。
細菌細胞は組換えFab又は本発明の他の実施形態の発現に適切な宿主細胞として有用となり得る（例えば、Pluckthun, A., Imuunol.Rev., 130:151-188(1992)を参照のこと）。しかしながら、折り畳まれていない若しくは不適切に折り畳まれた形態又は非グリコシル化形態である細菌細胞中で発現されるタンパク質の性質に起因して、細菌細胞中で産生される任意の組換えFabは抗原結合能力の保持についてスクリーニングする必要がある。細菌細胞により発現される分子が適切に折り畳まれた形態で産生された場合、その細菌細胞は望ましい宿主であるか、又は別の実施形態において、分子は細菌宿主中で発現でき、次いでその後再び折り畳まれる。例えば、発現に使用される大腸菌の種々の株はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。枯草菌（B.subtilis）、ストレプトミセス（Streptomyces）、他の桿菌など様々な株もまた、本方法に利用できる。
所望の場合、当業者に公知の酵母細胞の株もまた、宿主細胞及び昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）及び鱗翅類（Lepidoptera）、並びにウイルス発現系として利用可能である。例えば、Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press(1986)及びその中で引用されている参考文献を参照のこと。
ベクターが構築され得る一般的な方法、本発明の宿主細胞を作製するのに必要とされるトランスフェクション方法及びこのような宿主細胞から本発明の抗原結合タンパク質を産生するのに必要な培養方法は全て従来技術でよい。典型的に、本発明の培養方法は、通常、血清を含まない懸濁液中で細胞を培養することによる無血清培養方法である。同様に、一旦産生されると、本発明の抗原結合タンパク質は、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って細胞培養含有物から精製することができる。このような技術は当業者の範囲内であり、本発明を限定するものではない。例えば、改変される抗体の調製はWO99/58679及びWO96/16990に記載されている。
抗原結合タンパク質を発現する更に別の方法は米国特許第4,873,316号に記載されているようなトランスジェニック動物中での発現を利用してもよい。これは、哺乳動物中に遺伝子導入により組み込む場合、メスがその乳汁中に所望の組換えタンパク質を産生できる動物カゼインプロモーターを使用した発現系に関する。
本発明の更なる態様において、本発明の抗原結合タンパク質（例えばヒト化抗体）を産生する方法であって、本発明の抗体の軽鎖及び/又は重鎖をコードするベクターで形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養するステップと、これにより産生された抗原結合タンパク質を回収するステップを含む方法が提供される。
本発明において、ヒトLAG-3に結合する本発明の抗LAG-3抗原結合タンパク質（例えばヒト化抗体）を製造する方法であって、
（a）抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供するステップと、
（b）抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供するステップと、
（c）哺乳動物宿主細胞（例えばCHO）を前記第1及び第2のベクターで形質転換するステップと、
（d）前記宿主細胞から前記培地中に抗体の分泌を誘導する条件下でステップ（c）の宿主細胞を培養するステップと、
（e）ステップ（d）の分泌された抗体を回収するステップと
を含む方法が提供される。
抗原結合タンパク質は、所望の方法により発現された後は、次いで、LAG-3への抗原結合タンパク質の結合を評価するための適切なアッセイ（例えばBiacoreTM表面プラズモン共鳴分析など）の使用によりインビトロ活性について試験することができる。更に、他のインビトロアッセイ及びインビボアッセイを使用して、LAG-3を発現する細胞（例えば活性化ヒトT細胞集団など）の枯渇を生じる抗原結合タンパク質の能力を決定することもできる。
当業者であれば、抗原結合タンパク質、例えば抗体などの製造時に、特に使用する細胞株及び抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸配列に応じて、翻訳後修飾が起こり得ることを理解するだろう。例えばこれには、ある種のリーダー配列の切断、種々のグリコシル化及びリン酸化パターンでの種々の糖部分の付加、脱アミド、酸化、ジスルフィド結合置き換え（scrambling）、異性化、C末端リジン切り取り（clipping）、並びにN末端グルタミン環化が挙げられる。本発明は、1種以上の翻訳後修飾に供された又はそれを受けた抗原結合タンパク質の使用を包含する。したがって、本発明の「抗原結合タンパク質」又は「抗体」には、それぞれ本明細書に記載するものなどの翻訳後修飾を受けたと以前に定義された「抗原結合タンパク質」又は「抗体」が含まれる。
抗体の定常領域内の保存位置における抗体のグリコシル化は、抗体の機能、特にエフェクター機能に対して重大な影響があることが知られている（例えば、Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32: 1311-1318参照）。1以上の糖鎖部分が付加、置換、欠失又は修飾されている本発明の抗原結合タンパク質のグリコシル化バリアントが想定される。アスパラギン-X-セリン又はアスパラギン-X-トレオニンモチーフの導入によって、糖鎖部分の酵素的付加のための潜在的な部位が作り出され、そのためこれを用いて抗体のグリコシル化を操作することができる。Raju et al. (2001) Biochemistry 40: 8868-8876では、TNFR-IgGイムノアドヘシンの末端シアル化を、β-1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はα2,3シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化及び／又は再シアル化のプロセスによって増加させている。末端シアル化の増加は、免疫グロブリンの半減期を増大させると考えられる。抗体は、大部分の糖タンパク質と同様に、典型的には複数のグライコフォームの混合物として製造される。この混合物は、抗体を真核細胞、特に哺乳動物細胞において製造する場合に特に明らかである。規定のグライコフォームを製造するために種々の方法が開発されている。Zhang et al. (2004) Science 303: 371: Sears et al. (2001) Science 291: 2344; Wacker et al. (2002) Science 298: 1790; Davis et al. (2002) Chem. Rev. 102: 579; Hang et al. (2001) Acc. Chem. Res 34: 727参照。本明細書において記載する抗体（例えばIgGアイソタイプのもの、例としてIgG1）は、規定数（例えば、7若しくはそれ未満、例として5若しくはそれ未満、例えば2又は1）のグライコフォームを含みうる。
脱アミドは、主にアスパラギン（N）をおよそ3：1の比でイソアスパラギン酸及びアスパラギン酸（D）に変換する酵素反応である。はるかに低い程度で、グルタミン残基で同様に脱アミドが生じ得る。CDRにおける脱アミドによって、分子の電荷が変化するが、典型的には抗原結合に変化を生じさせるものではなく、PK/PDに対する影響もない。
酸化は、製造及び保管過程（すなわち酸化条件の存在下）で生じることがあり、反応性酸素種によって直接的に誘導されるか又は酸化ストレスの二次的副産物との反応によって間接的に誘導されるタンパク質の共有結合修飾を生じる。酸化は、主にメチオニン残基で起こるが、場合によってはトリプトファン及び遊離システイン残基でも起こることがある。
ジスルフィド結合置き換え（scrambling）は、製造及び基本的な保管条件中に起こり得る。特定の状況下において、ジスルフィド結合が破壊し又は不正確に形成し、対にならないシステイン残基（-SH）を生じ得る。これらの遊離（対にならない）スルフヒドリル（-SH）はシャフリングを促進し得る。
異性化は、典型的には製造、精製及び保管（酸性pHにて）の過程で生じ、通常、化学プロセスによってアスパラギン酸がイソアスパラギン酸に変換するときに生じる。
重鎖及び／又は軽鎖におけるN末端グルタミンは、ピログルタミン酸（pGlu）を形成する可能性がある。大部分のpGlu形成は、製造バイオリアクター中で起こるが、加工及び保存のpH及び温度条件に応じて非酵素的に形成されることもある。pGlu形成は、組換えmAbの主な分解経路の1つとみなされる。
C末端リジン切り取り（clipping）は、カルボキシペプチダーゼにより触媒される酵素反応であり、一般的に組換えmAbにおいて観察される。このプロセスのバリアントとしては、一方又は両方の重鎖からのリジンの除去が含まれる。リジン切り取りは、生物活性に影響を及ぼすようではなく、mAbエフェクター機能に対して影響がない。
エフェクター機能の増強
抗原結合タンパク質の定常領域と様々なFcレセプター（FcR）（FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）を含む）との間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能、例えばADCC及びCDCを媒介すると考えられる。
本明細書において使用する「エフェクター機能」という用語は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性（ADCC）、補体依存性細胞傷害活性（CDC）媒介性反応、Fc媒介性食作用又は抗体依存性細胞食作用（ADCP）、及びFcRnレセプターを介した抗体の再利用のうちの1以上を指すことを意味する。
本発明の抗原結合タンパク質のADCC又はCDC特性は、いくつかの方法で増強することができる。
残基Asn297に特定の突然変異又は改変されたグリコシル化を含有するヒトIgG1定常領域は、Fcレセプターへの結合を増強することが示されている。いくつかの事例において、これらの突然変異はまた、ADCC及びCDCを増強することが示されている（Lazar et al. PNAS 2006, 103;4005-4010、Shields et al. J Biol Chem 2001, 276;6591-6604、Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44;1815-1817）。
本発明の一実施形態において、このような変異は、239、332及び330（IgG1）から選択される位置のうちの1以上、又は他のIgGアイソタイプにおける等価位置にある。適切な変異の例はS239D及びI332E及びA330Lである。一実施形態において、本明細書に記載される本発明の抗原結合タンパク質は、239位及び332位、例えばS239D及びI332Eにて変異されるか、又は更なる実施形態において、それは239及び332及び330、例えばS239D及びI332E及びA330L（EUインデックスの番号付け）から選択される3以上の位置において変異される。
本発明の一実施形態において、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する、例えば、それが増強されたADCC若しくは増強されたCDC、又は増強されたADCC及びCDCの機能を有するように、キメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質、例えばIgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメインを有するキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。1つのこのような実施形態において、抗原結合タンパク質は、IgG3由来の1つのCH2ドメインを含むものでも、両方のCH2ドメインがIgG3由来のものでもよい。
本発明に係る抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（a）本明細書に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養するステップであって、発現ベクターは、ヒト生殖系列IgG1及びIgG3配列に由来するドメインを含有するFc領域をコードする核酸配列を含む、ステップと、
（b）抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む方法もまた提供される。
抗原結合タンパク質を製造するためのこのような方法は、例えば、BioWa,Inc.（Princeton、NJ）及び協和発酵工業（現在、協和発酵キリン株式会社）株式会社から利用可能なCOMPLEGENT(商標)技術システムを使用して実施することができる。そのシステムにおいて、ヒト生殖系列IgG1及びIgG3配列に由来するドメインを含有するFc領域をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞が発現されて、このようなキメラFcドメインを欠く他の点は同一の抗原結合タンパク質と比べて増大している増強された補体依存性細胞傷害（CDC）活性を有する抗原結合タンパク質を製造する。COMPLEGENT(商標)技術システムの態様は、WO2007011041及び米国特許出願公開第20070148165号（それらの各々は参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。別の実施形態において、CDC活性は、配列特異的突然変異をIgG鎖のFc領域内に導入することによって増大させることができる。当業者はまた、他の適したシステムを認識するであろう。
本発明の別の実施形態において、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように改変されたグリコシル化プロファイルを有する重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質が提供される。例えば、抗原結合タンパク質は、増強されたADCC若しくは増強されたCDCを有し、又はそれは、増強されたADCC及びCDCエフェクター機能の両方を有する。改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質を製造する適切な方法の例は、WO2003011878、WO2006014679及びEP1229125に記載されており、それらの全てが本発明の抗原結合タンパク質に適用可能である。
本発明はまた、本発明に係る抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（a）本明細書に記載される単離された核酸を含む発現ベクターを含む組換え宿主細胞を、抗原結合タンパク質を発現するのに適した条件下で培養するステップであって、組換え宿主細胞ではα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、ステップと、
（b）上記組換え宿主細胞により産生された抗原結合タンパク質を単離するステップと
を含む方法を提供する。
本発明はまた、本発明に係る抗原結合タンパク質の製造方法であって、以下のステップ：
（a）本発明に係る抗原結合タンパク質を組換え宿主細胞において発現させるステップであって、該組換え宿主細胞ではα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されているステップ；及び
（b）上記組換え宿主細胞により産生された抗原結合タンパク質を単離するステップ
を含む方法を提供する。
抗原結合タンパク質を製造するためのこのような方法は、例えば、BioWa,Inc.（ La Jolla, CA, USA）から利用可能なPOTELLIGENT(商標)技術システムを使用して実施することができ、そのシステムにおいて、FUT8遺伝子の機能的コピーを欠くCHOK1SV細胞は、機能的FUT8遺伝子を有する細胞内で産生された同一のモノクローナル抗体に対して増加している増強された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）活性を有するモノクローナル抗体を産生する。POTELLIGENT(商標)技術システムの態様は、米国特許第7,214,775号、米国特許第6,946,292号、WO0061739及びWO0231240（これらの全ては参照により本明細書に組み込まれている）に記載されている。当業者はまた、他の適したシステムを認識するだろう。
さらなる態様において、本発明は、非フコシル化抗体を提供する。本明細書における「非フコシル化」又は「アフコシル化（afucosylated）」抗体の言及は、フコース残基を有しないFcの複合型N-グリカンのトリマンノシルコア構造を有する抗体を指す。本発明の非フコシル化又はアフコシル化抗体は、Asn297に結合したコア糖鎖構造上にフコースを含まない。Fc N-グリカンからコアフコース残基を欠損するこれらの糖鎖操作抗体は、FcγRIIIa結合能力の増強のため、同等のフコシル化抗体よりも強力なADCCを示しうる。
当業者は、このような修飾が単独で使用できるだけでなく、更にエフェクター機能を増強させるために互いに組み合わせて使用できることを理解するであろう。
本発明の一つのこのような実施形態において、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含む重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質を提供する。例えば、抗原結合タンパク質はヒトIgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメイン及びヒトIgG1由来の1つのCH2ドメインを含み、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有するように、IgG1 CH2ドメインは、239及び332及び330から選択される位置において1以上の変異（例えばその変異はS239D及びI332E及びA330Lから選択できる）を有する、抗原結合タンパク質が提供される。これに関して、増強されたエフェクター機能は、例えば増強されたADCC又は増強されたCDCに等しい、例えばそれが増強されたADCC及び増強されたCDCを有する。一実施形態において、IgG1 CH2ドメインは変異S239D及びI332Eを有する。
本発明の別の実施形態において、キメラ重鎖定常領域を含み、改変されたグリコシル化プロファイルを有する抗原結合タンパク質が提供される。1つのこのような実施形態において、重鎖定常領域は、IgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメイン及びIgG1由来の1つのCH2ドメインを含み、フコース対マンノースの比が0.8:3以下であるように改変されたグリコシル化プロファイルを有する、例えば抗原結合タンパク質が脱フコシル化され、それにより前記抗原結合タンパク質が、前記変異及び改変されたグリコシル化プロファイルを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域を有する等価の抗原結合タンパク質と比較して増強されたエフェクター機能を有する、例えばそれが以下の機能、増強されたADCC又は増強されたCDCのうちの1以上を有する、例えばそれが増強されたADCC及び増強されたCDCを有する。
別の実施形態において、抗原結合タンパク質は少なくとも1つのヒトIgG3 CH2ドメイン及びヒトIgG1由来の少なくとも1つの重鎖定常ドメインを有し、両方のIgG CH2ドメインは本明細書に記載される制限に従って変異される。
本発明の一態様において、本明細書に記載される本発明に係る抗原結合タンパク質を製造する方法であって、
（a）本明細書に記載される単離された核酸を含有する発現ベクターを含有する組換え宿主細胞を培養するステップであって、前記発現ベクターは、ヒト生殖系列IgG1及びIgG3配列に由来するドメインを含有するFc領域をコードするFc核酸配列を更に含み、組換え宿主細胞ではアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子は不活性化されている、ステップと、
（b）抗原結合タンパク質を回収するステップと
を含む方法が提供される。
抗原結合タンパク質を製造するためのこのような方法は、例えば、POTELLIGENT(商標)及びCOMPLEGENT(商標)技術システムを組み合わせたBioWa,Inc.（Princeton、NJ）から利用可能なAccretaMab(商標)技術システムを使用して、キメラFcドメインを欠き、オリゴ糖上にフコースを有する他の同一のモノクローナル抗体と比べて増大している、増強されたADCC及びCDC活性の両方を有する抗原結合タンパク質を製造することができる。
本発明の更に別の実施形態において、変異型及びキメラ重鎖定常領域を含む抗原結合タンパク質であって、抗原結合タンパク質が増強されたエフェクター機能を有する、例えばそれが以下の機能、すなわち増強ADCC機能又は増強CDC機能のうちの1以上を有するように、前記抗原結合タンパク質が改変されたグリコシル化プロファイルを有する、抗原結合タンパク質が提供される。一実施形態において、突然変異は239位及び332位及び330位から選択される、例えば突然変異はS239D及びI332E及びA330Lから選択される。更なる実施形態において、重鎖定常領域はヒトIgG3由来の少なくとも1つのCH2ドメイン及びヒトIgG1由来の1つのCh2ドメインを含む。一実施形態において、フコース対マンノースの比は0.8:3以下であるように重鎖定常領域は改変されたグリコシル化プロファイルを有する、例えば抗原結合タンパク質が脱フコシル化され、それにより前記抗原結合タンパク質が、等価非キメラ抗原結合タンパク質又は前記変異及び改変されたグリコシル化プロファイルを欠く免疫グロブリン重鎖定常領域と比較して増強されたエフェクター機能を有する。
半減期の延長
半減期の増大又は半減期の延長は、抗原結合タンパク質、特に抗体、最も特には小さいサイズの抗体フラグメントのin vivo適用において有用であり得る。そのようなフラグメント（Fv、ジスルフィド結合Fv、Fab、scFv、dAb）は一般的に体内から迅速にクリアランスされる。本開示に係る抗原結合タンパク質は、in vivoにおける血清半減期の増大、そして結果的に抗原結合タンパク質の体内での長い持続性又は機能活性の滞留時間をもたらすために適合又は改変（修飾）することができる。好適には、そのような改変型分子は、非適合分子と比べてクリアランスの低下及び平均滞留時間の増大を有する。半減期の増大は、治療用分子の薬物動態及び薬力学特性を改善することができ、また患者のコンプライアンスの改善にとっても重要でありうる。
「半減期」（「t1/2」）及び「血清半減期」という句は、本開示に係る抗原結合タンパク質の血清（又は血漿）濃度が、例えば抗原結合タンパク質の分解及び／又は天然メカニズムによる抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは分離に起因して、in vivoにおいて50％まで低減するのに要する時間を指す。
本開示の抗原結合タンパク質はin vivoにおいて安定化することができ、それらの半減期は分解及び／又はクリアランス若しくは分離に抵抗する分子（「半減期延長部分」又は「半減期延長分子」）との結合によって増大する。半減期の延長手法は、例えば「Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives」, Roland Kontermann編, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9において概説されている。好適な半減期の延長手法としては、PEG付加、ポリシアル化、HES処理（HESylation）、組換えPEGミメティック（模倣物）、N-グリコシル化、O-グリコシル化、Fc融合、操作Fc、IgG結合、アルブミン融合、アルブミン結合、アルブミンカップリング及びナノ粒子が挙げられる。
一実施形態において、半減期延長部分又は分子はポリエチレングリコール分子又はPEGミメティック（模倣物）である。一実施形態において、抗原結合タンパク質は、本開示の単一可変ドメインとそれに結合したポリエチレングリコール部分（場合により、この部分は約20〜約50kDaのサイズを有する、場合により約40kDaの直鎖状又は分枝状PEG）とを含む（場合によりこれからなる）。ドメイン抗体又は結合部分のPEG付加に関するより詳細についてはWO04081026を参照のこと。一実施形態において、アンタゴニストは、PEGと結合したドメイン抗体モノマーからなり、ここでドメイン抗体モノマーは本開示に係る単一可変ドメインである。好適なPEGミメティックについて、例えば「Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives」 Roland Kontermann編, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9のチャプター4、63-80頁で概説されている。
抗体のFc領域と種々のFcレセプター（FcγR）との相互作用は、抗体又は抗体フラグメントの半減期/クリアランス及び食作用を媒介すると考えられている。新生児FcRnレセプターは、抗体のクリアランス及び組織間のトランスサイトーシスに関与すると考えられている（Junghans (1997) Immunol. Res 16: 29-57；及びGhetie et al. (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 739-766参照）。一実施形態において、半減期延長部分は、抗体からのFc領域とすることができる。そのようなFc領域は、所望の特性に応じて種々の改変を導入することができる。例えば、サルベージ受容体結合エピトープを抗体に導入して、血清半減期を増大させることができる。米国特許第5,739,277号参照。
ヒトFcRnと直接相互作用することが決定されているヒトIgG1残基には、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及びHis435が含まれる。したがって、この節に記載された位置のいずれかにおける置換によって、抗体の血清半減期の増大及び／又はエフェクター特性の改変が可能となる。
Fc領域への融合による半減期の延長は、例えば「Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives」 Roland Kontermann編, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9のチャプター9、157-188頁に概説されている。
典型的には、in vivoにおいて血清半減期を増大させるポリペプチド、すなわち半減期延長分子は、in vivoで天然に生じ、生物（例えばヒト）から望ましくない物質を除去する内因性機構による分解又は除去に抵抗するポリペプチドである。典型的には、そのような分子は、それ自体がin vivoで長い半減期を有する天然のタンパク質である。
例えば、in vivoにおいて血清半減期を増大させるポリペプチドは、細胞外マトリックス由来のタンパク質、血液中に見られるタンパク質、血液脳関門若しくは神経組織に見られるタンパク質、腎臓、肝臓、筋肉、肺、心臓、皮膚若しくは骨に局在するタンパク質、ストレスタンパク質、疾患特異的タンパク質、又はFc輸送に関与するタンパク質から選択することができる。好適なポリペプチドは、例えばWO2008/096158に記載されている。
このような手法もまた、本開示に従って、対象の組織への抗原結合タンパク質（例えば単一可変ドメイン）の標的化送達のために用いることができる。一実施形態において、本開示に係る高アフィニティ単一可変ドメインの標的化送達が提供される。
一実施形態において、本開示に係る抗原結合タンパク質、例えば単一可変ドメインは、血清アルブミン、その断片及び類似体に結合、すなわちコンジュゲート又は会合させてもよい。アルブミンへの融合による半減期の延長については、例えば「Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives」 Roland Kontermann編, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9のチャプター12、223-247頁に概説されている。
好適なアルブミン、アルブミン断片又はアルブミンバリアントの例は、例えばWO2005077042及びWO2003076567に記載されている。
別の実施形態において、本開示に係る単一可変ドメイン、ポリペプチド又はリガンドは、トランスフェリン、その断片及び類似体に結合、すなわちコンジュゲート又は会合させてもよい。
一実施形態において、半減期の延長は、in vivoにおいて半減期を増大させる抗原又はエピトープに標的化することにより実施することができる。抗原結合タンパク質の流体力学的サイズ及びその血清半減期は、本開示の抗原結合タンパク質を、天然分子に結合しかつin vivoにおいて半減期を増大させる結合ドメインとコンジュゲート又は会合することにより増大させることができる。
例えば、本発明に係る抗原結合タンパク質は、抗血清アルブミン又は抗新生児Fcレセプター抗体又は抗体フラグメント、例えば抗SA又は抗新生児FcレセプターdAb、Fab、Fab’又はscFvと、あるいは抗SAアフィボディ若しくは抗新生児Fcレセプターアフィボディ又は抗SAアビマー、又は限定されるものではないがCTLA-4、リポカリン、SpA、アフィボディ、アビマー、GroEl及びフィブロネクチンからなる群より選択されるスカフォールドを含む抗SA結合ドメインとコンジュゲート又は結合させることができる。コンジュゲートとは、結合ドメイン、例えば血清アルブミンに結合する結合ドメインなどと結合（共有結合又は非共有結合）した、本開示のポリペプチド、dAb又はアンタゴニストを含む組成物を指す。
別の実施形態において、結合ドメインは、アルブミン結合ドメイン（ABD）又はアルブミンに結合する小分子などのポリペプチドドメインであってもよい（例えば「Therapeutic Proteins: Strategies to Modulate Their Plasma Half-Lives」 Roland Kontermann編, Wiley-Blackwell, 2012, ISBN: 978-3-527-32849-9のチャプター14、269-283頁及びチャプター15、285-296頁に概説されている）。
一実施形態において、本発明に係る抗原結合タンパク質と、抗血清アルブミン又は抗新生児Fcレセプター抗体又は抗体フラグメントとを含む融合タンパク質を提供する。
IgG抗体の長い半減期は、そのFcRnへの結合に依存することが報告されている。したがって、定常領域を操作することによって相互作用のpH依存性を維持しつつpH6.0におけるIgGのFcRnへの結合アフィニティを増加させる置換が広く研究されている（Ghetie et al., Nature Biotech. 15: 637-640, 1997; Hinton et al., JBC 279: 6213-6216, 2004; Dall'Acqua et al., 10 J Immunol 117: 1129-1138, 2006）。本発明の抗原結合タンパク質を改変する他の手法は、免疫グロブリン定常ドメイン又はFcRn（Fcレセプター新生児）結合ドメインの改変により、かかるタンパク質のin vivo半減期を増大することを含む。
成体哺乳動物において、FcRn（新生児Fcレセプターとしても知られる）は、IgGアイソタイプと結合しかつ分解から救出する保護レセプターとして作用することにより血清抗体レベルの維持に重要な役割を果たす。IgG分子は内皮細胞によりエンドサイトーシスを受け、もしFcRnと結合すれば、循環中にリサイクルされる。対照的に、FcRnと結合しないIgG分子は細胞内に進入し、リソソーム経路に標的化されて分解される。
新生児FcRnレセプターは組織全体の抗体クリアランス及びトランスサイトーシス（経細胞輸送）に関わると思われる（Junghans R.P （1997）Immunol. Res 16. 29-57及びGhetie et al （2000） Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766を参照されたい）。ヒトFcRnと直接相互作用することが確認されているヒトIgG1残基にはIle253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及びHis435が含まれる。本節に記載したこれらの位置のいずれかのスイッチは、本発明の抗原結合タンパク質の血清半減期の増加及び／又はエフェクター特性の改変を可能にする。
本発明の抗原結合タンパク質は、FcRnに対する定常ドメイン又はそのフラグメントのアフィニティを増加するアミノ酸改変を有してもよい。治療及び診断用のIgG及び他の生体活性分子の半減期の増加は多くの利益を有し、それにはこれらの分子の投与の量及び頻度を減ずることが含まれる。一実施形態においては、それ故に、1以上のこれらのアミノ酸改変を有するIgG定常ドメインの全て又は一部分（FcRn結合部分）と、かかる改変IgG定常ドメインとコンジュゲートした非IgGタンパク質又は非タンパク質分子（ここでは改変IgG定常ドメインの存在が抗原結合タンパク質のin vivo半減期を増加する）とを含む本明細書に記載の本発明に係る抗原結合又は融合タンパク質が提供される。
PCT公開WO 00/42072は、改変FcRn結合アフィニティをもつバリアントFc領域を含むポリペプチドを開示し、前記ポリペプチドは1以上のアミノ酸位置：Fc領域の238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439、及び447におけるアミノ酸改変を含む（Fc領域中の残基の番号付けはEUインデックス（Kabat et al.）のものである）。
PCT公開WO 02/060919 A2は、野生型IgG定常ドメインと比較して1以上のアミノ酸改変を含むIgG定常ドメインを含む改変IgGを開示し、前記改変IgGは野生型IgG定常ドメインを有するIgGの半減期と比較して増加した半減期を有し、ここで、1以上のアミノ酸改変は、251、253、255、285〜290、308〜314、385〜389、及び428〜435位の1以上におけるものである。
Shieldsら（2001, J Biol Chem ; 276:6591-604）はアラニン走査突然変異誘発を用いてヒトIgG1抗体のFc域中の残基を改変し、次いでヒトFcRnとの結合を評価した。アラニンへ変更した場合に、FcRnとの結合を効果的に無効化した位置にはI253、S254、H435、及びY436が含まれる。結合の低下がそれよりも顕著でない他の位置は次の通りであった：E233〜G236、R255、K288、L309、S415、及びH433。いくつかのアミノ酸位置は、アラニンに変えるとFcRn結合の改善を示した：これらのうち顕著なものはP238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424、及びN434である。多くの他のアミノ酸位置はFcRn結合において、わずかな改善を示す（D265、N286、V303、K360、Q362、及びA378）か又は変化を示さなかった（S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444、及びK447）。
最も顕著な効果は、FcRnとの結合の改善をもたらす組み合わせバリアントについて見出された。pH 6.0において、E380A/N434Aバリアントは生来のIgG1と比較して8倍を超えるFcRnとの優れた結合を示し、E380Aの2倍及びN434Aの3.5倍と比較した。これにT307Aを加えると、生来のIgG1と比較して結合の12倍の改善をもたらした。一実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質はE380A/N434A突然変異を含み、FcRnとの結合を増加した。
Dall'Acquaら（2002, J Immunol.；169：5171-80）は、マウスFcRnに対するヒトIgG1ヒンジ-Fcフラグメントファージディスプレイライブラリーの無作為突然変異誘発及びスクリーニングを記載している。彼らは251、252、254〜256、308、309、311、312、314、385〜387、389、428、433、434、及び436位の無作為突然変異誘発を開示した。IgG1-ヒトFcRn複合体安定性の大きな改善がFc-FcRn界面を横切るバンドに位置する残基（M252、S254、T256、H433、N434、及びY436）を置換することで起こり、そしてより小さい改善がV308、L309、Q311、G385、Q386、P387、及びN389のような末梢の残基の置換で起こる。ヒトFcRnに対する最大アフィニティを示すバリアントは、M252Y/S254T/T256E及びH433K/N434F/Y436H突然変異を組み合わせることにより得られ、野生型IgG1と比較して57倍のアフィニティ増加を示した。かかる突然変異したヒトIgG1のin vivo挙動は、野生型IgG1と比較してカニクイザルサルの血清半減期のほぼ4倍増加を示した。
本発明はそれ故に、FcRnとの最適化結合を示す抗原結合タンパク質のバリアントを提供する。好ましい実施形態において、前記抗原結合タンパク質のバリアントは、親ポリペプチドと比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を前記抗原結合タンパク質のFc領域中に含み、ここで前記改変は、Fc領域の226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446及び447からなる群より選択される（ここで、Fc領域のアミノ酸の番号付けはKabatのEUインデックスによるものである）。
本発明のさらなる態様において、改変はM252Y/S254T/T256Eである。
さらに様々な刊行物が半減期の改変された生理活性分子を得る方法を記載しており、それらはFcRn結合ポリペプチドを分子中に導入することによる（WO97/43316；米国特許5,869,046号；米国特許5,747,035号；WO96/32478；WO91/14438）、又は分子をFcRn結合アフィニティは保存されるが他のFcレセプターに対するアフィニティが非常に低い抗体と融合することによる（WO99/43713）、又は抗体のFcRn結合ドメインと融合することによる（WO 00/09560；米国特許4,703,039号）ものである。
定常領域における置換は治療用IgG抗体の機能を顕著に改善することができるが、厳密に保存されている定常領域における置換は、ヒトにおける免疫原性のリスクがあり（Presta,前掲, 2008; De Groot and Martin, Clin Immunol 131: 189-201, 2009）、高度に多様な可変領域配列における置換はより免疫原性が低い可能性がある。可変領域に関する報告には、抗原への結合アフィニティを改善するためのCDR残基の操作（Rothe et al., Expert Opin Biol Ther 6: 177-187,2006; Bostrom et al., Methods Mol Bioi 525: 353-376,2009; Thie et al., Methods Mol Biol 525: 309-322, 2009）、並びに安定性を改善するため（Worn and Pluckthun, J Mol Biol 305: 989-1010, 2001; Ewert et al., Methods 34: 184-199, 2004）及び免疫原性のリスクを低減するため（De Groot and Martin,前掲, 2009; Jones et al., Methods Mol Biol 525: 405-423, xiv, 2009）のCDR及びフレームワーク残基の操作がある。報告されているように、抗原へのアフィニティの改善は、ランダム化ライブラリのファージ又はリボソームディスプレイを用いたアフィニティ成熟によって行うことができる。
改善された安定性は、配列及び構造に基づく合理的設計から合理的に得ることができる。免疫原性リスクの低減（脱免疫原性（deimmunization））は、種々のヒト化方法論及びT細胞エピトープの除去（in silico技術を用いて予測又はin vitroアッセイによって決定することができる）によって達成することができる。さらに、可変領域は、低pIとなるよう操作されている。これらの抗体では、同等のFcRn結合であるにもかかわらず、野生型抗体と比較して長い半減期が観察された。抗体及び／又は抗原半減期（例えばIgG2抗体半減期）を改変するためにpH依存的抗原結合を示す抗体を操作すること又は選択することは、抗原媒介クリアランス機構が、抗原と結合したときに通常は抗体を分解する場合には短縮（shortened）されうる。同様に、抗原：抗体複合体は、典型的な分解プロセスから抗原を保護することによる半減期の延長、又は抗原媒介性分解による半減期の短縮のいずれかで、抗原の半減期に影響を及ぼす可能性がある。一実施形態は、エンドソーム（endosomal ）pH（すなわち、pH 5.5〜6.0）と比較してpH7.4において抗原に対して高いアフィニティを有し、その結果、pH5.5/pH7.4又はpH6.0/pH7.4におけるKD比が2以上である抗体に関する。例えば、抗体の薬物動態（PK）及び薬力学（PD）特性を増強するために、ヒスチジンをCDR残基に導入することによって抗体へのpH感受性結合を操作することが可能である。
医薬組成物
本発明の抗原結合タンパク質は、必ずしもそうではないが、通常、患者に投与する前に医薬組成物として製剤化される。ゆえに、本発明の別の態様においては、本発明に係る抗原結合タンパク質と、1種以上の薬学的に許容される賦形剤及び/又は担体を含む医薬組成物を提供する。
そのような医薬組成物の調製方法は当業者にはよく知られている（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co、及びPharmaceutical Biotechnology; Plenum publishing corporation; Volumes 2, 5 and 9）。
本発明の抗原結合タンパク質は、投与のために何らかの好都合な方法で製剤化することができる。医薬組成物は、例えば、注射又は持続注入により投与しうる（例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与及び門脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない）。一実施形態においては、組成物は皮下注射に適している。
医薬組成物は、局所投与（経皮投与、吸入投与、鼻腔内投与若しくは眼内投与が挙げられるが、これらに限定されない）又は腸内投与（経口投与若しくは直腸内投与が挙げられるが、これらに限定されない）に適するものであってもよい。
医薬組成物は、0.0001mg/kgから10mg/kgの間の抗原結合タンパク質を含むことができる。例えば、0.1mg/kgから5mg/kgの間の抗原結合タンパク質を含むことができる。あるいは、組成物は1.0mg/kgから3.0mg/kgを含むこともできる。
医薬組成物は、本発明の抗原結合タンパク質に加えて、1種以上の他の治療薬を含むことができる。本発明の抗原結合タンパク質と組み合わせることができる追加の治療薬には、抗CTLA-4（例えば、イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗TIM-3、抗OX40、抗OX40L、抗PD1（例えば、ニボルマブ及びランブロリズマブ）、抗PD1L、抗GITR、抗IL-5（例えば、メポリズマブ）、抗Bリンパ球活性化（BLyS）因子（例えば、ベリムマブ）、抗GITRL、抗IL-7、抗IL-7R、抗CD20、抗CCL20、抗TNFα、抗OSM及び抗IL-6の各種抗体、並びにJAK、CCR9、RIPキナーゼ、BETタンパク質、RORγ1及びチオプリンの抑制剤が挙げられるが、それらに限定されない。
併用療法用の本発明の抗原結合タンパク質及び1種以上の他の治療薬は、同一の組成物に一緒に配合することもでき、別々の組成物として提供することもできる。別々に提供する組成物は、同時投与又は逐次投与することができる。
使用方法
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、治療に使用することができる。リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）に結合し、LAG-3+活性化T細胞を枯渇させる本発明の抗原結合タンパク質は、自己免疫疾患、感染性疾患、アレルギー性疾患及び癌などの病原性T細胞の関与に関連した疾患の治療又は予防に使用することができる。
抗原結合タンパク質が潜在的に有益な効果をもたらす病態の例としては、自己免疫疾患、限定されるものではないが、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び/又は潰瘍性大腸炎）、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、自己免疫性肝炎、ブドウ膜炎、I型糖尿病、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、グレーヴス病、移植片対宿主病、臓器移植拒絶反応の治療及び/又は予防、例えば、腎臓又は肝臓移植の拒絶反応、原発性硬化性胆管炎、サルコイドーシス、血管炎、腎炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、全身性硬化症、セリアック病、抗リン脂質抗体症候群、円形脱毛症及び重症筋無力症など；感染性疾患、限定されるものではないが、C型肝炎、B型肝炎、HIV、結核及びマラリアなど；並びに、アレルギー性疾患、限定されるものではないが、喘息、アトピー性皮膚炎及びCOPDなどが挙げられる。
本発明の抗原結合タンパク質は、癌、限定されるものではないが、卵巣癌、黒色腫（例えば転移性悪性黒色腫）、前立腺癌、腸癌（例えば、結腸癌及び小腸癌）、胃癌、食道癌、乳癌、肺癌、腎臓癌（例えば腎明細胞癌）、膵臓癌、子宮癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、口腔癌、脳癌、精巣癌、皮膚癌、甲状腺癌、並びに骨髄腫や慢性及び急性白血病を含む血液学的悪性腫瘍などの治療にも使用することができる。
当業者は、本明細書における「治療」又は「治療（法）」とは、確立した状態の治療に加えて、条件によっては、予防法にも及ぶことを認識するであろう。
ゆえに、本発明のさらなる態様として、治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質を提供する。
ゆえに、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、SLE、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎又は自己免疫性肝炎の治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質も提供する。
さらなる実施形態では、乾癬の治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる実施形態では、クローン病の治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質を提供する。
さらなる実施形態では、潰瘍性大腸炎の治療に使用するための本発明の抗原結合タンパク質を提供する。
さらに、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎又は自己免疫性肝炎の治療のための医薬の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用を提供する。
さらなる実施形態では、乾癬の治療のための医薬の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用を提供する。
さらなる実施形態では、クローン病の治療のための医薬の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用を提供する。
さらなる実施形態では、潰瘍性大腸炎の治療のための医薬の製造における、本発明の抗原結合タンパク質の使用を提供する。
さらに、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を投与することを含む、ヒト又は動物対象の治療方法を提供する。
さらに、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を投与することを含む、ヒト又は動物対象における病原性T細胞の関与に関連した疾患の治療方法を提供する。
さらに、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎又は自己免疫性肝炎の治療方法を提供する。
さらなる実施形態では、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、乾癬の治療方法を提供する。
さらなる実施形態では、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、クローン病の治療方法を提供する。
さらなる実施形態では、治療上有効な量の本発明の抗原結合タンパク質を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む、潰瘍性大腸炎の治療方法を提供する。
本明細書において使用する「治療上有効な量」という句は、疾患の1つ以上の症状を改善若しくは軽減する、又は疾患を予防若しくは治癒するのに必要な本発明の抗原結合タンパク質の量のことである。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）リンパ球活性化遺伝子3（LAG-3）と結合することができ、配列番号5からのCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む抗原結合タンパク質。
（２）配列番号1のCDRL1を含む、（１）に記載の抗原結合タンパク質。
（３）配列番号2のCDRL2及び／若しくは配列番号3のCDRL3、又はそれらのCDRバリアントを含む、（１）又は（２）に記載の抗原結合タンパク質。
（４）配列番号10からのCDRH1、CDRH2及びCDRH3の1以上を含む、（１）〜（３）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（５）配列番号6のCDRH1、配列番号7のCDRH2、及び配列番号8のCDRH3からなる群より選択される1以上のCDRを含む、（１）〜（４）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（６）以下のCDR：
CDRL1: 配列番号1
CDRL2: 配列番号2
CDRL3: 配列番号3
CDRH1: 配列番号6
CDRH2: 配列番号7
CDRH3: 配列番号8
を含む、（１）〜（５）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（７）（a）配列番号4の可変軽鎖（VL）、及び（b）配列番号9の可変重鎖（VH）を含む、（１）〜（６）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（８）Biacore(商標)表面プラズモン共鳴分析により決定した場合に、配列番号51の組換えヒトLAG-3 Hisと1nM未満のKDで結合することができる、（１）〜（７）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（９）Biacore(商標)表面プラズモン共鳴分析により決定した場合に、配列番号51の組換えヒトLAG-3 Hisと1nM未満のKDで結合することができる抗原結合タンパク質。
（１０）活性化T細胞上に発現されるLAG-3と結合することができる、（１）〜（９）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（１１）LAG-3+活性化ヒトT細胞を枯渇することができる、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（１２）初代ヒトT細胞を用いたin vitroアッセイにおいてADCCにより抗原特異的CD4及び／又はCD8 LAG-3 + ヒトT細胞の40％を超える枯渇を生じることができる、（１１）に記載の抗原結合タンパク質。
（１３）ヒト化抗体である、（１）〜（１２）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質。
（１４）ヒト化抗体がヒトIgG1定常領域を含む、（１３）に記載のヒト化抗体。
（１５）（a）配列番号5に対して少なくとも97％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号10に対して少なくとも97％の同一性を有する重鎖配列を含む、（１４）に記載のヒト化抗体。
（１６）（a）配列番号5の軽鎖配列、及び（b）配列番号10の重鎖配列を含む、（１５）に記載のヒト化抗体。
（１７）非フコシル化されている、（１４）〜（１６）のいずれか１に記載のヒト化抗体。
（１８）配列番号4の可変軽鎖（VL）及び配列番号9の可変重鎖（VH）を含むヒト化抗体であって、Asn297に結合したコア糖鎖構造上にフコースを含まないヒト化抗体。
（１９）（１）〜（１３）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に記載のヒト化抗体をコードする単離された核酸分子。
（２０）（１９）に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
（２１）（２０）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（２２）（２０）に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞においてα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、宿主細胞。
（２３）（２１）又は（２２）に記載の宿主細胞により産生される抗原結合タンパク質。
（２４）（１）〜（１３）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１６）のいずれか１に記載のヒト化抗体を製造する方法であって、（a）（２１）に記載の宿主細胞を、該抗原結合タンパク質又は抗体を発現するのに適した条件下で培養するステップと、（b）該抗原結合タンパク質又は抗体を単離するステップを含む方法。
（２５）（１７）又は（１８）に記載のヒト化抗体を製造する方法であって、（a）（２２）に記載の宿主細胞を、該抗原結合タンパク質又は抗体を発現するのに適した条件下で培養するステップであって、該組換え宿主細胞ではα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、ステップと、（b）該抗体を単離するステップを含む方法。
（２６）（a）（１）〜（１３）のいずれか１に記載の抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に記載の抗体、及び（b）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
（２７）治療における、（１）〜（１３）のいずれか１に定義される抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に定義されるヒト化抗体の使用。
（２８）病原性T細胞の関与に関連した疾患の治療における、（１）〜（１３）のいずれか１に定義される抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に定義されるヒト化抗体の使用。
（２９）前記疾患が、自己免疫疾患、感染性疾患、アレルギー性疾患又は癌である、（２８）に記載の抗原結合タンパク質の使用。
（３０）自己免疫疾患が、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎及び自己免疫性肝炎からなる群より選択される、（２９）に記載の使用。
（３１）治療上有効な量の（１）〜（１３）のいずれか１に定義される抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に定義されるヒト化抗体を投与することを含む、ヒト又は動物対象の治療方法。
（３２）治療上有効な量の（１）〜（１３）のいずれか１に定義される抗原結合タンパク質又は（１４）〜（１８）のいずれか１に定義されるヒト化抗体を投与することを含む、ヒト又は動物対象における病原性T細胞の関与に関連した疾患の治療方法。
（３３）前記疾患が、自己免疫疾患、感染性疾患、アレルギー性疾患又は癌である、（３２）に記載の治療方法。
（３４）自己免疫疾患が、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス（SLE）、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎及び自己免疫性肝炎からなる群より選択される、（３３）に記載の治療方法。
[実施例]
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、限定するものではない。
[実施例1]
精製された抗LAG-3ヒト化抗体のBiacore(商標)によるSPR分析
国際公開第2008/132601号で開示されているA9H12（IMP731）は、マウスのCDRを2つの重鎖及び2つの軽鎖のヒトアクセプターフレームワークに移植することによりヒト化されたものである。ヒトからマウスへの逆突然変異及びCDR改変を含む、いくつかの重鎖及び軽鎖のヒト化抗LAG-3バリアントを調製した。重鎖バリアントにはH0〜H8及びJ0、J7〜J13の番号を付け、軽鎖バリアントにはL0〜L10及びM0〜M1の番号を付けた。重鎖及び軽鎖のヒト化抗LAG-3バリアントのすべての組合せを含有する組織培養上清を、Fcタグ付加組換え可溶性LAG-3（IMP321）に対する結合に関して分析した。そのデータはBiacore(商標)4000ソフトウェアに固有の1:1モデルを用いて分析した。抗体は、算出されたアフィニティに基づいて及びキメラ抗体IMP731との結合のセンサーグラムの目視比較によって選択した。IMP321に対して同等の又は改善された結合を示した合計54種類の構築物を、Biacore(商標)3000による再分析のために同定した。データはBiaCore 3000分析ソフトウェアに固有の1:1及び2価のモデルの両方にフィットし、結合データは、結合曲線を最大会合において正規化し、IMP731に対する解離速度を目視比較することにより比較した。これにより、IMP731と比較して改善された解離速度を示した抗体を識別することが可能となった。合計18種類のヒト化抗LAG-3抗体を、組換えsLAG-3に対して、IMP731と比較して同等の又は改善された結合キネティクスに基づいて、さらなる分析のために選抜した。これら18種類のヒト化抗体は、以下のように再発現し分析した。
抗LAG-3ヒト化抗体は、HEK 293 6E細胞において発現させ、アフィニティークロマトグラフィーにより以下のように精製した。
100mlスケールでのHEK 293 6Eにおける発現
表3に表すヒト化抗体の重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドは、HEK 293 6E細胞に一過性に共トランスフェクトし、100mlスケールで発現させることにより抗体を作製した。
ヒト化抗体の精製
発現した抗体分子はアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。細胞培養上清には、プロテインAセファロースビーズ（GE Healthcare Cat No 17-5280-04）を加え、室温で30〜60分間混合した。次いで、プロテインAセファロースビーズを遠心分離し、PBSで洗浄した。次いで、その混合物を10mlの使い捨てカラム（Pierce Cat No: 29924）に添加し、PBSを排出した。IgG溶出バッファー（Pierce Cat No:21009）によって抗体を溶出する前に、カラムを10mlのPBSで3度洗浄した。溶出した抗体は、1M Trizma(登録商標)塩酸バッファー（T2819）で即座に中和し、次いでVivaspin 6 mwco 5000カラム（Cat. No.: FDP-875-105D）を使用してPBSにバッファー交換した。収量は280nmにおける吸光度を測定することによって決定した。精製したサンプルにおける凝集タンパク質のレベルはサイズ排除クロマトグラフィーによって決定した。
結合キネティクス
精製した抗体のsLAG-3分子に対する結合キネティクスはBiacore(商標)3000を用いたSPRによって評価した。ヤギ抗ヒトκ抗体（Southern Biotech, Catalogue No. 2060-01）を、第一級アミン結合によってCM5チップに固定化した。ヒト化抗LAG-3抗体をこの表面に捕捉し、LAG3-Ig分子IMP321（Chrystelle Brignone, Caroline Grygar, Manon Marcu, Knut Schakel, Frederic Triebel, The Journal of Immunology, 2007, 179: 4202-4211）を64nMにおいて、結合曲線のダブルリファレンスのために使用するバッファー注入（つまり0nM）と共にアナライトとして併用した。再生はpH1.5の10mMのグリシンによって行った。その工程（run）は、Biacore(商標)3000上で、ランニングバッファーとしてHBS-EPを用い、25℃で実施した。センサーグラムは、最大会合での結合について正規化し、センサーグラムプロファイルを目視検査することにより解離速度をIMP731と比較した。
結果は、精製したヒト化抗LAG-3抗体が3つの群に分類できることを示している。すなわち、第1群としてキメラIMP731よりもIMP321に良好に結合すると思われるヒト化バリアント、第2群として、IMP731と非常に類似した様式で結合すると思われるバリアント、及び、第3群としてIMP731よりも悪い結合性を示すバリアントである。
10種類のヒト化バリアントは第1群に属し、Biacore(商標)のセンサーグラムを目視検査した結果、IMP731に比べて改善された（つまり低減した）解離速度を示す。これらの分子はすべてL7軽鎖を含んでおり、それは軽鎖CDR1の27e位のグリシンのプロリン置換を含む。このデータは、27e位におけるプロリンが、多数のヒト化重鎖と組み合わせた場合に、ヒト化抗LAG-3抗体のIMP321に対する解離速度を改善することを示している。
検査した残りの抗体では、4種類の分子が第2群に属し、キメラIMP731抗体と類似した解離速度を有しており、一方、他の4種類の分子は第3群に属し、IMP731よりも悪い解離速度を示している。表3は、IMP731と比較したそれらの分子のおおよその順位を提供している。この実験では、Biacore(商標)のセンサーグラムの目視検査により、H5L7が最善の（つまり最も低い）解離速度を示している。
Figure 0006224739
[実施例2]
Biacore(商標)T100を用いた、野生型のフコシル化及びアフコシル化ヒト化抗LAG-3抗体の組換えヒトLAG-3-Hisに対する結合分析
アフコシル化抗体H5L7BWは、BioWa POTELLIGENT(登録商標)（FUT8ノックアウトCHO）細胞株中のH5L7をコードするプラスミドを発現させることによって作製した。POTELLIGENT(登録商標)技術を使用して作製したアフコシル化抗体は、FcγRIIIa（CD16）に対するアフィニティの増大により、同等の従来の高フコシル化抗体と比べてより増大した抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を示すことが示されている。
野生型のフコシル化及びアフコシル化抗体は、Biacore(商標)T100（GE Healthcare(商標)）を用いてC末端His6（配列番号51）を有する組換えヒトLAG-3 ECDに結合する能力に関して比較した。プロテインAは一級アミン結合によりCM5チップに固定化した。次いで、この表面を、ヒト化抗体を捕捉するために使用した。次いで、組換えヒトLAG-3 ECD-His6を、捕捉されたヒト化抗体に32、8、2、0.5及び0.125nMで流し（passed over）、再生は50mM NaOHを使用して実施した。結合曲線はバッファー注入（つまり0nM）によりダブルリファレンスし、データは1:1モデルを使用してT100分析ソフトウェアにフィットした。その実験は25℃で実施し、ランニングバッファーとしてはHBS-EPを使用した。
この動的データの統計的有意性を調査するため、本実験は、4種類の抗体及びキメラ対照の同一バッチを使用して3度繰り返した。KD、ka及びkdパラメータは、別個の統計学的分析に先立ってそれぞれ対数変換（底は10）した。各パラメータには、変換されたデータに対して、Run（ランダムブロック効果）及びAntibodyの項を含む混合モデルによる分散分析（「Anova」）を実施した。
Anovaから、各抗体に関して幾何平均を推定し、それと共に、各平均に関して統計学的尤度の範囲（statistically plausible range）（95％信頼区間）も推定した。抗体の計画的比較はAnovaの範囲内で実施した。比較結果は、95％信頼区間及びp値と共に比較された2種類の抗体の比として示した。比は倍率変化として解釈することもでき、例えば、比0.1は90％減少に対応する。
幾何平均は、表4に示す結合アフィニティ（KD）を得るために、各ヒト化抗体及びキメラ対照IMP731に関して求めた。H5L7の平均KDは0.2075nMで、IMP731と比較して92％の有意な減少（p<0.0001）（つまり10倍の減少）を示した。IMP731の平均KDは2.76nMであった。アフコシル化H5L7BWはフコシル化H5L7と同等の結合を示し、幾何学的KDは0.2179nMで、有意差はなかった（p=0.1790）。
表5で示すように、IMP731と比較してH5L7ではアフィニティの改善が観察されたことは、主として抗体のLAG-3-ECD-His6に対する解離速度の違いによるものである。H5L7は、IMP731と比較してkdが約85％減少（つまりほぼ10倍減少）しており、これは統計学的に非常に有意である。アフコシル化H5L7BWとH5L7の間には有意差はなかった（p=0.4408）。
Figure 0006224739
Figure 0006224739
[実施例3]
ProteOn(商標)を使用した、キメラ抗体IMP731と比較した抗LAG-3ヒト化バリアントのLAG-3-His結合エピトープの評価
ヒト化に際してIMP731が結合するLAG-3のエピトープが保存されるか否かを評価するため、H5L7に対してエピトープビニング実験を実施した。加えて、フコシル化及びアフコシル化ヒト化バリアントの結合エピトープも比較した。
エピトープ結合の評価は、ProteOn(商標)XPR36（BioRad(商標)）バイオセンサー機器を使用して、抗LAG-3抗体がProteOn(商標)チップの表面に捕捉された抗体と複合体として同時にLAG-3-Hisに結合することができるかを判定することにより行った。本アッセイにおいてはIMP731及び非競合的なマウスの抗体17B4を対照として使用した。
試験する抗体はEz-Link-sulfo-NHSビオチン化キットを使用してビオチン化した。ビオチン化した各抗体は、縦型射出によりニュートラアビジンNLCチップのそれぞれ別のフローセルに捕捉した。抗体を捕捉したのち、表面を2.5mg/mlのビオシチンでブロッキングした。ProteOnが実行するソフトウェア固有の同時注入設備を使用して、100nMのLAG-3 ECD-His6をカップリングされた抗体上に注入し、次いで、100nMのビオチン化していない抗体を注入したが、LAG-3-His及び上記抗体が、ニュートラアビジンで捕捉した6種類の抗体すべてに交差反応する（cross）ようにどちらも横型射出した。本アッセイは25℃で、ProteOn XPR36 Protein Interaction Array SystemのHBS-EP中で実施した。
データ分析はLAG-3-His注入後に取ったレポートポイント及びビオチン化していない抗体アナライトの注入後に取ったレポートポイントを使用して実施した。全体の応答は、LAG-3 ECD-His6結合に見られた応答から抗体結合に見られた応答を差し引くことにより算出した。正の共鳴単位（RU）値は、注入した抗体アナライトがLAG-3 ECD-His6に、ニュートラアビジン捕捉表面のビオチン化した抗体と複合体として結合したことを意味し、それは、競合しないエピトープに結合したことを示した。応答がない、若しくは負の応答は、注入した抗体アナライトがLAG-3 ECD-His6に、ニュートラアビジン捕捉表面のビオチン化した抗体と複合体として結合しなかったことを意味し、それは、抗体が競合するエピトープに結合することを示した。
抗LAG-3ヒト化バリアント（フコシル化及びアフコシル化）はIMP731と複合体としてヒトLAG-3 ECD-His6に結合することができず、そのことは、LAG-3 ECD-His6のエピトープが共有されており、ゆえに保存されていることを示す。マウス抗体17B4はIMP731と複合体としてヒトLAG-3 ECD-His6に結合することができ、それによりこの抗体がLAG-3 ECD-His6との結合においてIMP731と競合しないことを実証している。逆に、ヒト化抗体は、17B4と複合体としてヒトLAG-3 ECD-His6と結合することができる。
分析結果は、本実験で試験されたキメラIMP731とIMP731のヒト化バリアントとの間にはエピトープに変化がないことを確証している。さらに、本実験はフコシル化抗体とアフコシル化抗体との間には結合に違いがないことも示している。
[実施例4]
Biacore(商標)T100を使用した、カニクイザル及びヒヒの組換えLAG-3 ECD-His6に対する抗LAG-3ヒト化抗体の結合分析
カニクイザル（cyno）及びヒヒの組換えLAG-3 ECD-His6（それぞれ配列番号52及び53）に対する抗LAG-3ヒト化抗体の結合交差反応性は、Biacore(商標)T100（GE Healthcare(商標)）を使用して評価した。
プロテインAは一級アミン結合によってCM5チップに固定化した。次いで、この表面を使用してヒト化抗体を捕捉した。次いで、実験室内で作製したカニクイザル及びヒヒの組換えLAG-3 ECD-His6を、捕捉した抗体上に流し、再生を50mM NaOHを使用して実施した。LAG-3 ECD-His6は16、4、1、0.25及び0.0625nMで流した。結合曲線は、バッファー注入（つまり0nM）によりダブルリファレンスし、データは1:1モデルを使用してT100分析ソフトウェアにフィットした。その実験を37℃で、HBS-EPをランニングバッファーとして使用して実施した。
H5L7、H5L7BW及びIMP731は、カニクイザル及びヒヒの組換えLAG-3 ECD-His6の両方に同等のアフィニティで結合する。データは別個の実験から生成したが、キメラ抗体IMP731が両方の実験において対照として使用された。
このデータは、非ヒト霊長類の組換えLAG-3オルソログが両方とも、ヒトの組換えLAG-3 ECD-His6（配列番号51）に比べて10倍改善されたアフィニティでH5L7由来の抗体に結合することを示している（H5L7:ヒトLAG-3が0.208nM、カニクイザルLAG-3が0.017nM及びヒヒLAG-3が0.022nM、H5L7BW:ヒトLAG-3が0.218nM、カニクイザルLAG-3が0.021nM及びヒヒLAG-3が0.024nM）。一方で、両方の非ヒト霊長類の組換えLAG-3オルソログとも、ヒトの組換えLAG-3 ECD-His6（配列番号51）に比べて約100倍改善されたアフィニティでIMP731由来の抗体に結合する（IMP731:ヒトLAG-3が2.76nM、カニクイザルLAG-3が0.021nM及びヒヒLAG-3が0.019nM）。
[実施例5]
ヒトLAG-3を発現するEL4細胞及びヒト初代活性化CD3+T細胞に対するH5L7BW、H5L7及びIMP731の結合プロファイル
ヒトLAG-3を発現するEL4細胞は、50μg/ml以下の様々な濃度においてIMP731、H5L7又はH5L7BW Alexa 647コンジュゲート抗体のいずれかと共に室温で30分間インキュベートした。結合していない抗体を除くため、細胞をFACSバッファー（PBS＋0.5％ BSA）で洗浄した。
CD3+T細胞は、Untouched Human T cell Dynalビーズを用いて、ネガティブ選択により、PBMCから調製した。CD3+T細胞は、固定化した抗CD3及び抗CD28及び可溶性組換えヒトIL-12と共に、37℃で3日間インキュベートすることによって活性化させた。活性化細胞は3μg/ml以下の様々な濃度のAlexa 647コンジュゲート抗体と共に、室温で30分間培養した。細胞はFACSバッファー（PBS＋0.5％ BSA）で洗浄した。
EL4細胞及びCD3+T細胞は、Beckman Coulter FC500フローサイトメーターを使用してFACSによって分析した。FACSの生データはCXP Analysisソフトウェア（Beckman Coulter）を使用して分析した。データはまず前方散乱対側方散乱プロットでプロットし、対象の細胞集団をゲートした。次いで、このゲートした細胞集団を、蛍光強度を表示するヒストグラムとしてプロットし、平均蛍光強度（MFI）を計算した。次いで、用量反応曲線を生成するために、MFI値をGraphPad Prism 5ソフトウェアにプロットした。
ヒトLAG-3を発現するEL4細胞及びヒト初代活性化CD3+T細胞に対するH5L7BW、H5L7及びIMP731の結合プロファイルは図1に示す。3種類の抗体は、ヒトLAG-3を発現するEL4細胞（図1A）及び活性化ヒトCD3+T細胞（図1B）に対して類似した結合特性を示した。
[実施例6]
初代ヒトT細胞における抗体依存性細胞傷害性（ADCC）によるH5L7BW及びH5L7の枯渇活性の評価
これらの実験に使用されたドナーは、Revaxis（ジフテリア、破傷風及び灰白髄炎）に存在するCD4抗原、並びに、CMV、EBV及びインフルエンザに対するペプチドエピトープを含むものであるCMVpp65ペプチドプール又はCD8ペプチドプールのいずれかに対するリコール応答（recall response）に関してスクリーニングした。最初の研究を実施する際に使用された抗原はCMVpp65ペプチドプールであった。しかし、この抗原に対してリコール応答を示したドナーの数が限られていたため、抗LAG-3抗体の有効性データの大半を生成するために使用された抗原はRevaxis及びCD8ペプチドプールであった。
末梢血は健康なヒトのボランティアから実験の第0日（25ml）及び第5日（75ml）に採取し、フィコールプラーク（ficollplaque）密度勾配遠心分離により単核細胞を調製するために使用した。第0日に調製したPBMCは、製造者の指示書に従ってCellTrace(商標)Violet Cell Proliferation Kitを使用して標識し、その後、洗浄し、培地中に2×106/mLの密度で24ウェル平底組織培養プレートに播種し、抗原（Revaxis及びCD8ペプチドプールは1000分の1に希釈して使用し、CMVpp65ペプチドは100分の1に希釈して使用した）によって刺激した。PBMCは37℃で5％CO2加湿インキュベーターで5日間インキュベートした。
自己ドナーNK細胞は、Invitrogen又はMiltenyi Biotecのキットをそれぞれの製造者の特定指示書に従って使用して、ネガティブ選択によって、実験の第5日に調製したPBMCから精製した。精製したNK細胞をカウントし、培地中に1.3×106/mLの密度に希釈した。
5日間抗原によって刺激した細胞を洗浄し、カウントし、そして、培地中に2×106/生細胞/mLの密度に希釈した。
自己ドナーNK細胞（80μL）及び抗原により活性化された細胞（100μL）は、丸底5mLポリスチレンFACSチューブに試験抗体又は培地（20μL）と共にピペッティングした。試験した抗LAG-3抗体の最終的な濃度は1000ng/mLから0.015ng/mLまでの範囲である。サンプルは37℃で、5％CO2加湿インキュベーターで18時間インキュベートした。18時間後、ADCCアッセイサンプルは、フローサイトメトリーによって、抗原特異的LAG-3陽性T細胞の存在を確認するために分析した。簡単に説明すると、サンプルをFACSバッファーで洗浄し、ヒトIgG（3μg/チューブ）でブロッキングし、マウス抗ヒトCD4、CD8、CD337、CD25及びLAG-3蛍光色素コンジュゲート抗体と共に暗所で室温で30分間インキュベートした。細胞は、PBSでさらに洗浄した後、固定可能緑色死滅細胞（fixable green dead cell）の存在下、暗所で室温で30分間インキュベートした。サンプルは最後にPBSで洗浄し、固定し、フローサイトメトリーによって取得時間60秒で1μL毎秒の流速で分析した。
すべてのサンプルデータはFACS Divaソフトウェアバージョン6.1.3を搭載したBD FACSCanto IIフローサイトメーター（BD BioSciences）を使用して取得した。死細胞除外マーカーとしては生存/死滅固定可能緑色死滅細胞染料（Live/Dead fixable green dead cell stain）を使用し、ネガティブ細胞集団を識別するためには、適切なアイソタイプ及びFMO-1対照を使用した。簡単に説明すると、死滅細胞は、前方散乱（FSC-A）対FL1における蛍光（緑色死滅細胞染料）をプロットすることで分析から除外した。次いで二重項は、FSC-W対FSC-Hのプロットを使用することで分析から除外した。その後、生存している個々のリンパ球は、前方散乱（FSC-A）対側方散乱（SSC-A）のプロットを使用することで特定し、ゲートした。CD4抗原特異的T細胞は、CD4蛍光対SSC-A、及びCD4蛍光対Violet色素蛍光のプロットを使用して、このゲートした細胞集団からそれぞれ特定した。抗原特異的CD4 T細胞はViolet色素蛍光の減少によって特定した。さらに、CD25蛍光対LAG-3蛍光をプロットすることで、この細胞集団の活性化状態及びそれらがLAG-3を発現していることを確認した。抗原特異的CD8 T細胞を特定するためにも同様のプロットを実施した。
各サンプルにおいて、存在している抗原特異的CD4及びCD8 T細胞の割合（％）（生存しているリンパ球の集団の割合（％））を記録した。これらのデータの非線形可変傾斜曲線フィットをプロットし、GraphPad Prismソフトウェア（v5.03）を使用してEC50の値を生成した。
あるアッセイにおいて観察される枯渇の最大レベルを計算するには、試験した抗体の最高濃度において、次の式を使用した：（1-（抗体処理後に残存する抗原特異的T細胞の％）/（抗体が存在しない場合に残存する抗原特異的T細胞の％））×100。
H5L7BW及びH5L7によるLAG-3陽性抗原特異的CD8及びCD4 T細胞の枯渇に関する有効性データは、上記に詳述したin vitroアッセイシステムを使用して生成した。それぞれの細胞型の消失に関して研究された7つのドナー中6つにおいて、H5L7BWは、ADCCによるLAG-3陽性抗原特異的CD4及びCD8 T細胞の枯渇を誘発した。EC50値によって数量化された抗原特異的CD4 T細胞に対するH5L7BWの有効性は、14pg/mLから3.4ng/mLまでの範囲であり、枯渇の最大レベルは44％から78％までの範囲である。抗原特異的LAG-3陽性CD8 T細胞におけるこの抗体の有効性は、122pg/mLから17.5ng/mLまでの範囲であり、枯渇の最大レベルは39％から87％までの範囲であった。研究されたドナーにおいて、H5L7は低レベルの枯渇を媒介したか、又は不活性であった。
[実施例7]
in vivoヒトPBMC/マウスSCID異種移植片モデルにおけるH5L7BW及びH5L7の枯渇活性の評価
本アッセイは、活性化ヒトT細胞に対する、モノクローナル完全ヒト化アフコシル化LAG-3枯渇抗体H5L7BWのin vivo枯渇効力を評価するために、ヒトPBMC/マウスSCID異種移植片モデルを使用することに関して説明している。健康なボランティアの末梢血単核細胞（PBMC）を単離し、免疫無防備状態のSCIDマウスの腹膜に注射する前に、LAG-3の発現を誘発するために一晩刺激を与えた（抗CD3、IL-12）。LAG-3枯渇性抗体又は対照の抗体は、腹膜に同時投与又は静脈注射した。
LAG-3陽性細胞の枯渇は、細胞注射の5時間又は24時間後に腹腔洗浄サンプルにおけるフローサイトメトリーによって評価した。
マウスには、活性化huPBMC（PBS 0.4ml中4×106個から2×107個の細胞）を腹腔内経路によって注射した。特定の検査ルートに応じて、LAG-3抗体若しくはhuIgG1 BioWa対照は、huPBMCと共に腹腔内に同時投与するか、若しくは、マウスをhuPBMC注射から18時間前に静脈内に前処理した。細胞注射の5時間又は24時間後に、マウスを安楽死させ、腹腔洗浄を実施し、洗浄バッファーの細胞含量をフローサイトメトリーによって分析した。簡単に説明すると、腹腔洗浄は、無処置の腹腔において、3mM EDTAを含んだ5mLの冷却PBSを使用した3回の洗浄を伴った。
すべてのサンプルデータは、FACS Divaソフトウェアのバージョン6.1.3を搭載したBD FACSCanto IIフローサイトメーター（BD BioSciences）により取得した。各FACSチューブには（可能な場合）約1×106個の細胞を加え、細胞懸濁液を1500rpmで10分間遠心分離し、次いで、そのペレットを3mlのPBSに再懸濁した。次いで、上清を慎重にデカントし、細胞ペレットを100μlの冷FACS洗浄バッファーに再懸濁した。次いで、各チューブには15μlのFcRブロッキング試薬を加え、細胞を10分間室温でインキュベートした。次いで、各染色抗体（staining antibody）（10μlの1:100に前希釈した抗LAG-3ブロッキング/検出抗体17B4-PE）又はアイソタイプ対照をそれぞれに5μl加え、遮光状態で20分間室温でインキュベートした。その後、各チューブにFACSバッファーを4ml加え、1500rpmで5分間遠心分離することで細胞を洗浄し、その後上清を慎重にデカントした。この洗浄ステップは繰り返された。最後に細胞をFACSバッファー300μlに再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。蛍光標識したLAG-3ブロッキング抗体17B4-PEによるLAG-3検出に加え、T細胞及び活性化マーカーCD45、CD4、CD8及びCD25をT細胞の表現型決定に使用した。CD4及びCD8 T細胞の割合（％）はCD45陽性細胞に対する割合（％）として表された。LAG-3陽性T細胞の集団はCD4及びCD8の母集団に対する割合（％）として表された。
個々の細胞カウント/イベントのバッチ分析及び細胞集団の百分率を生成するために、FACS Divaソフトウェアのバージョン6.1.3を用いた。データは、SASバージョン9.2.2ソフトウェアにより、二項のデータ（binomial data）用の一般化線形モデルを用いて分析した。この分析は、細胞カウントを母集団に対する割合として直接的にモデル化している。このようにして、分析において母集団の大きさが考慮に入れられている。各処理における標的細胞型の割合の平均値と共に95％信頼区間が計算された。これらはパーセンテージとして表された。
処理対対照の計画的比較はオッズ比を使用して行われた。これにより、一方の処理においてある標的細胞型が存在するオッズを、対照処理においてその標的細胞型が存在するオッズに対する比として表す。1未満のオッズ比は、対象となる処理において標的細胞型が存在するオッズが対照と比較して低いことを示す。
すべての実験は、個々の健康な血液ドナーから得られたPBMCを使用して実施され、各実験には多量の血液を要したため、同じドナーが2回以上用いられることはなかった。一晩の刺激後のLAG-3発現レベルはドナーごとに大きく異なっていたが（2％から73％までの範囲での細胞表面における発現）、これらの発現レベルの差は、試験された抗体の極めて有意な枯渇効力には影響しなかった。
ヒトPBMC/マウスSCIDのin vivoモデルを用いて、免疫無防備状態のSCIDマウスの腹膜内におけるヒトLAG-3発現活性化T細胞の枯渇を実証するのに成功した。ドナー、投与経路及び分析の時点に応じて、84.22％から99.71％のLAG-3陽性ヒトCD4 T細胞及び84.64％から99.62％のLAG-3陽性ヒトCD8 T細胞が枯渇した。図2に示すように、SCIDマウスの腹膜内の活性化ヒトPBMCへの5mg/kgのH5L7BWの同時投与は、注射から24時間後において、IgGを注射した対照動物と比較してLAG-3陽性CD4及びCD8陽性T細胞の極めて有意な枯渇を引き起こした。
図3は、上記に説明した、活性化ヒトPBMCへの腹腔内（i.p.）同時投与から5時間後における、5mg/kgのH5L7BWとH5L7との間の比較を際立たせている。どちらの抗体もLAG-3陽性CD4及びCD8 T細胞の極めて有意な枯渇を誘発した（図3A）。
図4に示すように、LAG-3枯渇性抗体の腹腔内（i.p.）同時投与の実験において観察されたのと同様に、静脈内経路で投与した5mg/kgのH5L7BWは、5時間後には、LAG-3陽性T細胞を統計的に極めて有意に枯渇させる結果となった（図4A）。活性化ヒトPBMCを腹腔内（i.p.）投与してから5時間後に静脈内（iv）投与したH5L7BW、H5L7及びIMP731（すべて各5mg/kg）の比較により、3種類の分子は、対照処理動物と比べて非常に類似した枯渇効力を示した（図5）。試験された3種類のLAG-3枯渇性抗体はどれも、LAG-3陽性CD4及びCD8 T細胞の数の極めて有意な減少を引き起こし（図5A）、その中でもH5L7BWが、H5L7やIMP731と比較してより大きな枯渇能力を示した。
[実施例8]
ProteOn(商標)を使用した、組換え可溶性ヒトFcγレセプターに対する抗LAG-3ヒト化抗体の結合分析
H5L7及びH5L7BWの抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を誘発する能力を評価するために、ヒトFcγRIIIaに対する結合を調査した。H5L7及びH5L7BW抗LAG-3抗体は、ProteOn(商標)XPR36（BioRad(商標)）バイオセンサー機器を使用して、FcγRI及びFcγRIIレセプターに加えて、組換え可溶性ヒトFcγRIIIaへの結合に関しても評価し、キメラ抗体IMP731と比較した。
ヤギ抗ポリヒスチジンIgGを、一級アミン結合によりGLMバイオセンサーチップ上に固定化した。この表面をポリヒスチジン標識したヒトFcγレセプターのための捕捉表面として使用した。試験する抗体はアナライトとして使用し、2048nM、512nM、128nM、32nM及び8nMの濃度で流され、結合曲線をダブルリファレンスするために0nMの注入（つまりバッファーのみ）を使用した。ヤギ抗ポリヒスチジンIgGを固定化した表面は、相互作用と相互作用との間で100mMのリン酸を使用して再生した。その実験はProteOn XPR36 Protein Array Interaction System上で、25℃で、ランニングバッファーとしてHBS-EPを使用して実施した。データ分析は、global R-maxを設定し、ProteOnの分析ソフトウェア固有の平衡モデルを使用して、それぞれのレセプターに関して別個に行った。対照分子を使用した実験は、実験結果の相互比較性を保証するため、サンプルセットの最初と最後に実施した。データは2回の実験をもとに比較し、実験と実験との間でハイブリッドの対照抗体を対照として使用した。
実験結果は、H5L7BWがFcγRIIIaの両方の多型（バリンV158及びフェニルアラニンF158）に、H5L7と比較して約10倍改善されたアフィニティをもって結合したことを示している（表6を参照）。フコシル化抗体H5L7は、FcγRIIIaにキメラ抗体IMP731と同様のアフィニティで結合した。
FcγRI又はFcγRIIaレセプターに対する結合に関しては、ヒト化フコシル化及びアフコシル化抗LAG-3抗体の間では有意な変化は観察されなかった。
Figure 0006224739
配列
Figure 0006224739
Figure 0006224739
配列番号1
KSSQSLLNPSNQKNYLA

配列番号2
FASTRDS

配列番号3
LQHFGTPPT

配列番号4
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKR

配列番号5
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号6
AYGVN

配列番号7
MIWDDGSTDYDSALKS

配列番号8
EGDVAFDY

配列番号9
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSS

配列番号10
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配列番号11
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配列番号12
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配列番号13
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配列番号14
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配列番号15
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配列番号16
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配列番号17
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配列番号18
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配列番号19
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配列番号20
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配列番号21
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配列番号22
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配列番号23
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号24
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配列番号25
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号26
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号27
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNPSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号28
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配列番号29
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号30
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号31
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号32
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号33
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号34
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号35
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号36
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFSLTAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号37
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号38
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYDSALKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号39
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号40
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYDSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号41
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号42
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGVNWVRQAPGQGLEWMGMIWDDGSTDYNSALKSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号43
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLVYFASTRDSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHFGTPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号44
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISAYGVNWIRQPPGKGLEWIGMIWDDGSTDYNSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREGDVAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号45
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号46
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号47
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWDDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCAREGDVAFDYWGQGTTLTVSS

配列番号48
DIVMTQSPSSLAVSVGQKVTMSCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCLQHFGTPPTFGGGTKLEIKR

配列番号49（キメラ抗体に使用したリーダー配列とは異なることに留意）
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTAYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWDDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCAREGDVAFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号50
DIVMTQSPSSLAVSVGQKVTMSCKSSQSLLNGSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRDSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCLQHFGTPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号51
LQPGAEVPVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRAAVHLRDRALSCRLRLRLGQASMTASPPGSLRASDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRNRGQGRVPVRESPHHHLAESFLFLPQVSPMDSGPWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPPTPLTVYAGAGSRVGLPCRLPAGVGTRSFLTAKWTPPGGGPDLLVTGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYTCHIHLQEQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPVSGQERFVWSSLDTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLYQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

配列番号52
PQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAPAPGHPPAPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGRVPVQGSPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPATPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVAGDNGDFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQEHFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

配列番号53
PQPGAEISVVWAQEGAPAQLPCSPTIPLQDLSLLRRAGVTWQHQPDSGPPAPAPGHPPAPGHRPAAPYSWGPRPRRYTVLSVGPGGLRSGRLPLQPRVQLDERGRQRGDFSLWLRPARRADAGEYRATVHLRDRALSCRLRLRVGQASMTASPPGSLRTSDWVILNCSFSRPDRPASVHWFRSRGQGQVPVQESPHHHLAESFLFLPHVGPMDSGLWGCILTYRDGFNVSIMYNLTVLGLEPTTPLTVYAGAGSRVELPCRLPPAVGTQSFLTAKWAPPGGGPDLLVVGDNGNFTLRLEDVSQAQAGTYICHIRLQGQQLNATVTLAIITVTPKSFGSPGSLGKLLCEVTPASGQERFVWSPLNTPSQRSFSGPWLEAQEAQLLSQPWQCQLHQGERLLGAAVYFTELSSPHHHHHH

配列番号54
MGWSCIILFLVATATGVHS

配列番号55
MESQTQVLMFLLLWVSGACA

配列番号56
MPLLLLLPLL WAGALA

配列番号57
AAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCC

配列番号58
TTCGCCTCTACCAGGGATTCC

配列番号59
CTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACT

配列番号60
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGT
配列番号61
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号62
GCCTACGGCGTCAAC

配列番号63
ATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGC

配列番号64
GAGGGCGACGTGGCCTTCGATTAC

配列番号65
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGC

配列番号66
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号67
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号68
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号69
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号70
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号71
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号72
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGCTGGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGCTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号73
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号74
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号75
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号76
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCAAGGACAACAGCAAGAACCAGGTGAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号77
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号78
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号79
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号80
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号81
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号82
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号83
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACCCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号84
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号85
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号86
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号87
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号88
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCTTCTCCCTGACCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号89
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号90
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号91
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号92
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTTCTCTCTCACTGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号93
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号94
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号95
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号96
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACGACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号97
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号98
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGGGCCGAAGTCAAGAAACCCGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGCCTACGGCGTGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCACCGCCGACAAGAGCACCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号99
GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCTCTAGCCTCAGCGCCAGCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACGGCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGGTCTACTTCGCCTCTACCAGGGATTCCGGCGTCCCCAGCAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACTTCGGCACCCCTCCCACTTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号100
CAGGTGCAGCTCCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCTCCATCAGCGCCTACGGCGTCAACTGGATCAGGCAGCCCCCCGGCAAAGGCCTGGAGTGGATTGGGATGATCTGGGACGACGGCAGCACCGACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGGGTGACCATCAGCGTGGACACCAGCAAGAACCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACTGCCGCCGACACCGCCGTCTATTACTGCGCCAGGGAGGGCGACGTGGCCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
配列番号101
ACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC

配列番号102
GCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG

配列番号103
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGTCCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGCCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGATGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGTAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAAGGGGACGTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA

配列番号104
GACATTGTGATGACACAGTCTCCCTCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATGGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCTGCAACATTTTGGCACTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGG

配列番号105
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGTCCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACCGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGCCTATGGTGTAAACTGGGTTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAATGATATGGGATGATGGAAGCACAGACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGTAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCAGGTACTACTGTGCCAGAGAAGGGGACGTAGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

配列番号106
GACATTGTGATGACACAGTCTCCCTCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATGGTAGCAATCAAAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGATTCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCTGCAACATTTTGGCACTCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAACTGGAAATCAAACGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

配列番号107
CTCCAGCCAGGGGCTGAGGTCCCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAGCCAGACAGTGGCCCGCCCGCTGCCGCCCCCGGCCATCCCCTGGCCCCCGGCCCTCACCCGGCGGCGCCCTCCTCCTGGGGGCCCAGGCCCCGCCGCTACACGGTGCTGAGCGTGGGTCCCGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTATGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCGCGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTCCGTCTGCGCCTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGATCTCTCAGAGCCTCCGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAACCGGGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCGGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCAAGTCAGCCCCATGGACTCTGGGCCCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAACGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGAGCCCCCAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGGGCTGCCCTGCCGCCTGCCTGCTGGTGTGGGGACCCGGTCTTTCCTCACTGCCAAGTGGACTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGACTGGAGACAATGGCGACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTGAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACACCTGCCATATCCATCTGCAGGAACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCTGGATCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGTATCTGGACAAGAACGCTTTGTGTGGAGCTCTCTGGACACCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCTTGGCTGGAGGCACAGGAGGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGGCAATGCCAGCTGTACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTGTACTTCACAGAGCTGTCTAGCCCACACCACCATCATCACCAT

配列番号108
CCCCAGCCAGGGGCTGAGATCTCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAACCAGACAGTGGCCCGCCCGCTCCCGCCCCCGGCCACCCCCCGGCCCCCGGCCATCGCCCGGCGGCGCCCTACTCTTGGGGGCCCAGGCCCCGCCGCTACACAGTGCTGAGCGTGGGTCCTGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTGTGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCACGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTTCGTCTGCGCGTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGGTCTCTCAGGACCTCTGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAGCCGTGGCCAGGGCCGAGTCCCTGTCCAGGGGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCATGTCGGCCCCATGGACTCTGGGCTCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGAGCCCGCAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGAGCTGCCCTGCCGCCTGCCTCCTGCTGTGGGGACCCAGTCTTTCCTTACTGCCAAGTGGGCTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGGCTGGAGACAATGGCGACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTAAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACATCTGCCATATCCGTCTACAGGGACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCTGGCTCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGCATCTGGACAAGAACACTTTGTGTGGAGCCCCCTGAACACCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCATGGCTGGAGGCCCAGGAAGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGGCAATGCCAGCTGCACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTATACTTCACAGAACTGTCTAGCCCACACCACCATCATCACCAT

配列番号109
CCCCAGCCAGGGGCTGAGATCTCGGTGGTGTGGGCCCAGGAGGGGGCTCCTGCCCAGCTCCCCTGCAGCCCCACAATCCCCCTCCAGGATCTCAGCCTTCTGCGAAGAGCAGGGGTCACTTGGCAGCATCAACCAGACAGTGGCCCGCCCGCTCCCGCCCCCGGCCACCCCCCGGCCCCCGGCCATCGCCCGGCGGCGCCCTACTCTTGGGGGCCCAGGCCCCGCCGCTACACAGTGCTGAGCGTGGGTCCTGGAGGCCTGCGCAGCGGGAGGCTGCCCCTGCAGCCCCGCGTCCAGCTGGATGAGCGCGGCCGGCAGCGCGGGGACTTCTCGCTGTGGCTGCGCCCAGCCCGGCGCGCGGACGCCGGCGAGTACCGCGCCACGGTGCACCTCAGGGACCGCGCCCTCTCCTGCCGCCTTCGTCTGCGCGTGGGCCAGGCCTCGATGACTGCCAGCCCCCCAGGGTCTCTCAGGACCTCTGACTGGGTCATTTTGAACTGCTCCTTCAGCCGCCCTGACCGCCCAGCCTCTGTGCATTGGTTCCGGAGCCGTGGCCAGGGCCAAGTCCCTGTCCAGGAGTCCCCCCATCACCACTTAGCGGAAAGCTTCCTCTTCCTGCCCCATGTCGGCCCCATGGACTCTGGGCTCTGGGGCTGCATCCTCACCTACAGAGATGGCTTCAATGTCTCCATCATGTATAACCTCACTGTTCTGGGTCTGGAGCCCACAACTCCCTTGACAGTGTACGCTGGAGCAGGTTCCAGGGTGGAGCTGCCCTGCCGCCTGCCTCCTGCTGTGGGGACCCAGTCTTTCCTTACTGCCAAGTGGGCTCCTCCTGGGGGAGGCCCTGACCTCCTGGTGGTTGGAGACAATGGCAACTTTACCCTTCGACTAGAGGATGTAAGCCAGGCCCAGGCTGGGACCTACATCTGCCATATCCGTCTACAGGGACAGCAGCTCAATGCCACTGTCACATTGGCAATCATCACAGTGACTCCCAAATCCTTTGGGTCACCTGGCTCCCTGGGGAAGCTGCTTTGTGAGGTGACTCCAGCATCTGGACAAGAACGCTTTGTGTGGAGCCCCCTGAACACCCCATCCCAGAGGAGTTTCTCAGGACCGTGGCTGGAGGCCCAGGAAGCCCAGCTCCTTTCCCAGCCTTGGCAATGCCAGCTGCACCAGGGGGAGAGGCTTCTTGGAGCAGCAGTATACTTCACAGAACTGTCTAGCCCACACCACCATCATCACCAT

配列番号110
ATGGGCTGGAGCTGCATCATCCTGTTCCTGGTGGCCACCGCTACCGGAGTGCACAGC
配列番号111
ATGGAATCACAGACCCAGGTCCTCATGTTTCTTCTGCTCTGGGTATCTGGTGCCTGTGCA

配列番号112
ATGCCGCTGC TGCTACTGCT GCCCCTGCTG TGGGCAGGGG CGCTAGCT

Claims (21)

  1. リンパ球活性化遺伝子3(LAG-3)と結合することができ、配列番号５からのCDRL1、CDRL2及びCDRL3、並びに配列番号１０からのCDRH1、CDRH2及びCDRH3を含む抗体又はそのフラグメントであって、Biacore(商標)表面プラズモン共鳴分析により決定した場合に、配列番号５１の組換えヒトLAG-3 Hisと1nM未満のKDで結合することができる、前記抗体又はそのフラグメント。
  2. 以下のCDR：
    CDRL1: 配列番号１
    CDRL2: 配列番号２
    CDRL3: 配列番号３
    CDRH1: 配列番号６
    CDRH2: 配列番号７
    CDRH3: 配列番号８
    を含む、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
  3. （a）配列番号４の可変軽鎖(VL)、及び（b）配列番号９の可変重鎖(VH)を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント。
  4. 活性化T細胞上に発現されるLAG-3と結合することができる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
  5. LAG-3+活性化ヒトT細胞を枯渇することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
  6. ヒト化抗体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
  7. ヒト化抗体がヒトIgG1定常領域を含む、請求項６に記載のヒト化抗体。
  8. （a）配列番号５に対して少なくとも97％の同一性を有する軽鎖配列、及び（b）配列番号１０に対して少なくとも97％の同一性を有する重鎖配列を含む、請求項７に記載のヒト化抗体。
  9. （a）配列番号５の軽鎖配列、及び（b）配列番号１０の重鎖配列を含む、請求項８に記載のヒト化抗体。
  10. 非フコシル化されている、請求項７〜９のいずれか１項に記載のヒト化抗体。
  11. 配列番号４の可変軽鎖(VL)及び配列番号９の可変重鎖(VH)を含むヒト化抗体であって、Asn297に結合したコア糖鎖構造上にフコースを含まない、前記ヒト化抗体。
  12. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体若しくはそのフラグメント又は請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヒト化抗体をコードする単離された核酸分子。
  13. 請求項１２に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  14. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  15. 請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、該宿主細胞においてα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、前記宿主細胞。
  16. 請求項１４又は１５に記載の宿主細胞により産生される抗体又はそのフラグメント。
  17. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体若しくはそのフラグメント又は請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヒト化抗体を製造する方法であって、（a）請求項１４に記載の宿主細胞を、該抗体若しくはそのフラグメント又はヒト化抗体を発現するのに適した条件下で培養するステップと、（b）該抗体若しくはそのフラグメント又はヒト化抗体を単離するステップを含む、前記方法。
  18. 請求項１０又は１１に記載のヒト化抗体を製造する方法であって、（a）請求項１５に記載の宿主細胞を、該ヒト化抗体を発現するのに適した条件下で培養するステップであって、該組換え宿主細胞ではα-1,6-フコシルトランスフェラーゼをコードするFUT8遺伝子が不活性化されている、前記ステップと、（b）該ヒト化抗体を単離するステップを含む、前記方法。
  19. （a）請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体若しくはそのフラグメント又は請求項７〜１１のいずれか１項に記載のヒト化抗体、及び（b）薬学的に許容される担体、を含む医薬組成物。
  20. 請求項１〜６のいずれか１項に定義される抗体若しくはそのフラグメント又は請求項７〜１１のいずれか１項に定義されるヒト化抗体を含む、治療用医薬組成物。
  21. 請求項１〜６のいずれか１項に定義される抗体若しくはそのフラグメント又は請求項７〜１１のいずれか１項に定義されるヒト化抗体を含む、乾癬、クローン病、関節リウマチ、原発性胆汁性肝硬変、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎及び自己免疫性肝炎から成る群より選択される自己免疫疾患、又はアレルギー性疾患の治療用医薬組成物。
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