JP2002506342A

JP2002506342A - 化学修飾された酵素

Info

Publication number: JP2002506342A
Application number: JP52478698A
Authority: JP
Inventors: ジェイブライアンジョーンズ; リチャードアールボット; トーマスピーグレイカー; コリンミッチンソン; グレイスデサンティス
Original assignee: ジェネンコーインターナショナルインコーポレイテッド; ジェイブライアンジョーンズ
Priority date: 1996-11-26
Filing date: 1997-11-24
Publication date: 2002-02-26
Also published as: CA2273079C; EP0942962B1; EP0942962A2; AU7417398A; DK0942962T3; CN1246146A; DE69737148T2; WO1998023732A2; US6277617B1; CA2763810A1; DE69737148D1; WO1998023732A3; CA2763810C; ES2277364T3; NZ336434A; ATE349514T1; AU733082B2; CA2273079A1

Abstract

(57)【要約】修飾酵素は、酵素のアスパラギン、ロイシン、メチオニン又はセリンといった少なくとも１つのアミノ酸をシステインで置換し、そのチオール水素原子がａ）−ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｂ）−ＳＲ³であって、Ｒ³は、置換された又は未置換のフェニル基、ｃ）−ＳＲ⁴であって、Ｒ⁴は、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｄ）−ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基、ｅ）−ＳＲ⁶であって、Ｒ⁶は、Ｃ_1-6のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を与えるような置換基で置換されている。また、修飾酵素を製造するための方法が、洗剤、食品添加物、繊維の処理剤組成物と共に開示されている。有機合成における修飾酵素の使用方法がこれらに加えて提供されている。さらには、修飾酵素は、改善された活性、変更されたｐＨプロファイル及び／又は洗浄特性を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】化学修飾された酵素発明の背景サイト指向性突然変異誘発により酵素特性を修飾することは、天然アミノ酸置換体に制限されているが、この制限に対する分子生物学的な解決手段が近年提供されている(コーニッシュ(Cornish),V.W.等(1995)、Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.3 4:621)。しかしながら、後者の方法は、一般にはほとんどの実験室において容易に適用することができない。これとは対照的に、酵素の制御された化学修飾は、酵素構造の容易且つ柔軟な修飾を行う可能性を秘めており、酵素特性を制御しつつ目的に合わせて調整するさらなる可能性を提供する。化学修飾により酵素特性を変更することは、従来より検討されており、最初の報告は、１９６６年にベンダー(Bender)(Polgar.L.et.al(1966)),J.Am.Chem.Soc . 88:3153)及びコシランド(Koshland)(ニート(Neet)K.E.等、(1966),Proc.Natl.A cad.Sci.USA. 56:1606)である。彼らは、チオールサブチリシンをサブチリシンＰＢＮ’の活性サイトであるセリンの化学的な変換（ＣＨ₂ＯＨ→ＣＨ₂ＳＨ）により、システインとして形成した。化学的に生成した人工的な酵素に関する関心は、合成の可能性も含めてウ(Wu),Z.-P等、(1989)J.Am.Chem.Soc.111,4514;ベル(B ell)I.M.等(1993)、Biochemistry,32,3754、及びピーターソン(Peterson),E.B. 等(1995)Biochemistry,34:6616、より最近には、サックリング(Suckling),C.J. 等(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.3:531に開示されている。酵素は、現在では広く有機合成に有用であることが認められている。しかしながら、天然の野生タイプの酵素は、関心のある合成化学のすべての構造に適用できるということは期待できず、合成に必要とされるエナンチオマー的に純粋な材料として望まれる立体特異性に常に変換することも期待できない。酵素に対するこのような合成用途における制限が認識されているので、タンパク工学のサイト指向性ランダム突然変異誘発技術を用いて制御しつつ酵素特性を変更するため、いくつかの進展が見られている。しかしながら、タンパク工学による酵素特性の修飾は、天然のアミノ酸置換体の形成に制限され、分子生物学的な方法をこの制限を克服するために用いるのは、ルーチン作業又は大スケール合成には容易に適用できるものではない。新規な特性又は活性を酵素の化学修飾によって発生させることは、多年にわたって化学者により検討されてきており、依然として続けられている。本発明者等は、いかなるアミノ酸位置においても新規な構造的環境を形成することができるという可能性に対して実質的に制限がないことから、サイト指向性突然変異誘発−化学修飾法を採用した。米国特許第５，２０８，１５８号においては、化学的に修飾された消化酵素が開示されており、１つ以上のメチオニンがシステインへと突然変異されている。これらのシステインは、その後修飾されて、酵素の酸化剤に対する安定性が改善されている。クレームに記載された化学修飾は、チオール水素原子をＣ_1-5のアルキル基で置換することによるものである。米国特許第５，２０８，１５８号は、酵素の酸化安定性を変更することについて開示しているものの、活性、親核特性、基質特性、立体選択性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、例えば洗剤又は有機合成に使用するための表面結合特性といった特性を１つ以上変更するように改善することが望まれている。発明の要約特性が変更されたプロテアーゼといった酵素が要求されている。したがって、本発明は、システイン残基によって１つ以上のアミノ酸残基を置換して修飾酵素を提供するものである。このシステイン残基は、チオール水素原子を、ａ）−ＳＲ¹Ｒ²であってＲ¹が、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｂ）−ＳＲ³であってＲ³が、置換された又は未置換のフェニル基、ｃ）−ＳＲ⁴であってＲ⁴が、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｄ）−ＳＲ⁵であってＲ⁵が、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を提供する置換基で置換することにより修飾するものである。好ましい態様においては、チオール側鎖基は、上述した−ＳＲ³基及び−ＳＲ⁴ 基であり、さらに、アルキル基Ｒを含有していることが好ましく、Ｒは、Ｒ³又はＲ⁴の前におかれて、−ＳＲＲ³基又は−ＳＲＲ⁴基とされていても良く、Ｒは、好ましくはＣ_1-10のアルキル基である。チオール側鎖基−ＳＲ¹Ｒ²に関しては、Ｒ²は、正に帯電又は負に帯電していても良い。Ｒ²は、ＳＯ₃ ^-、ＣＯＯ^-又はＮＨ₃ ⁺とされていることが好ましい。さらには、Ｒ¹は、Ｃ_1-10のアルキル基であることが好ましい。この酵素は、プロテアーゼであるのが好ましい。さらには、この酵素は、Baci llusサブチリシンであることがより好ましい。また、この酵素に含まれるシステインに置換されるアミノ酸は、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、セリンからなる群から選択されることが好ましい。置換されるアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトに位置されていることが好ましく、好ましくはこれらのサブサイトは、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましく、これらの番号位置は、Bacillus amyloliquefaciensからの天然のサブチリシン又はBacillus lentusサブチリシンといった別のサブチリシンの等価なアミノ酸残基に対応する。特に、好ましい態様においては、酵素は、Bacillus lentusサブチリシンとされる。最も好ましい態様においては、システインに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２であり、チオール側鎖基が、 −ＳＲ¹Ｒ²であってＲ¹は、ＣＨ₂であり、Ｒ²は、ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-である基、 −ＳＲＲ³であってＲは、ＣＨ₂であり、Ｒ³は、Ｃ₆Ｈ₅である基、 −ＳＲＲ⁴であってＲは、ＣＨ₂であり、Ｒ⁴は、Ｃ−Ｃ₆Ｈ₁₁である基、 −ＳＲ⁵であってＲ⁵は、ｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である基又はシステインに置換されるアミノ酸がＬ２１７であり、チオール側鎖が、 −ＳＲ⁵であり、Ｒ⁵がｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である基からなる群から選択されていることが好ましい。本発明は、さらにシステイン残基により１つ以上のアミノ酸が置換された修飾された酵素を提供するものである。これらのシステイン残基は、チオール水素原子を置換基で置換することによって修飾されており、これらの置換基は、チオ− ル側鎖−ＳＲ⁶を与え、このＲ⁶は、Ｃ_1-6のアルキル基であり、システインにより置換されるアミノ酸残基は、アスパラギン、ロイシン、セリンとされている。この酵素は、プロテアーゼとされていることが好ましい。さらにこの酵素は、Ba cillusサブチリシンとされていることがより好ましい。さらに、このアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトにおいて、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましい。この酵素は、B.lent usサブチリシンであることが好ましい。システインにより置換されるアミノ酸は、Ｎ６２又はＬ２１７とされ、チオール側鎖基は、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶は、ＣＨ₂ Ｃ（ＣＨ₃）₃又はＣ₅Ｈ₁₁とされていることが好ましい。本発明は、１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基で置換された酵素を用い、システイン残基のチオール水素原子を、ａ）−ＳＲ¹Ｒ²であってＲ¹は、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｂ）−ＳＲ³であって、Ｒ³は、置換された又は未置換のフェニル基、ｃ）−ＳＲ⁴であって、Ｒ⁴は、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｄ）−ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を与えるような置換基で置換された修飾された酵素を製造する方法を提供するものである。好ましい態様においては、チオール側鎖基は、上述した−ＳＲ³基及び−ＳＲ⁴ 基であり、さらに、アルキル基を含有していることが好ましく、Ｒは、Ｒ³又はＲ⁴の前に置かれて、−ＳＲＲ³基又は−ＳＲＲ⁴基とされていても良く、Ｒは、Ｃ₁ _〜10のアルキル基が好ましい。チオール側鎖基−ＳＲ¹Ｒ²に関しては、Ｒ²は、正に帯電又は負に帯電していても良い。Ｒ²は、ＳＯ₃ ^-、ＣＯＯ^-又はＮＨ₃ ⁺とされていることが好ましい。さらには、Ｒ¹は、Ｃ_1-10のアルキル基であることが好ましい。この酵素は、プロテアーゼとされていることが好ましい。さらには、この酵素は、Bacillusサブチリシンであることがより好ましい。また、この酵素に含まれるシステインに置換されるアミノ酸は、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、セリンからなる群から選択されることが好ましい。置換されるアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトに位置されていることが好ましく、好ましくはこれらのサブサイトは、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましく、これらの番号位置は、Bacillus amyloliquefac iensからの天然のサブチリシン又はBacillus lentusサブチリシンといった別のサブチリシンの等価なアミノ酸残基に対応する。特に、好ましい態様においては、酵素は、Bacillus lentusサブチリシンとされる。最も好ましい態様においては、システインに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２であり、チオール側鎖基が、 −ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、ＣＨ₂であり、Ｒ²は、ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-である基、 −ＳＲＲ³であって、Ｒ³は、ＣＨ₂であり、Ｒ³は、Ｃ₆Ｈ₅である基、 −ＳＲＲ⁴であって、Ｒは、ＣＨ₂であり、Ｒ⁴は、ｃ−Ｃ₆Ｈ₁₁である基、 −ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、ｎ−Ｃ_1OＨ₂₁である基又はシステインに置換されるアミノ酸がＬ２１７であり、チオール側鎖が、 −ＳＲ⁵であり、Ｒ⁵がｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である基からなる群から選択されていることが好ましい。本発明は、さらにシステイン残基により１つ以上のアミノ酸が置換された修飾された酵素を提供するものである。これらのシステイン残基は、チオールの水素原子を置換基で置換することによって修飾されており、これらの置換基は、チオール側鎖−ＳＲ⁶を与え、このＲ⁶は、Ｃ_1-6のアルキル基であり、システインにより置換されるアミノ酸残基は、アスパラギン、ロイシン、セリンとされている。この酵素は、プロテアーゼとされていることが好ましい。さらにこの酵素は、 Bacillusサブチリシンとされていることがより好ましい。さらに、このアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトにおいて、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましい。この酵素は、B.le ntusサブチリシンであることが好ましい。システインにより置換されるアミノ酸は、Ｎ６２又はＬ２１７とされ、チオール側鎖基は、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶ は、ＣＨ₂Ｃ（ＣＨ₃）₃又はＣ₅Ｈ₁₁とされていることが好ましい。さらに、修飾された酵素を含有する洗剤用添加剤を提供するものである。修飾された酵素を含有する食品添加剤を提供するものである。修飾された酵素を洗剤配合物中に用いる方法を提供するものである。繊維処理に修飾された酵素を用いる方法を提供するものである。食品添加剤製造に酵素を用いる方法を提供するものである。活性が高められた修飾された酵素を提供するものである。異なったｐＨプロファイルを有する修飾された酵素を提供するものである。改善された洗浄特性を有する修飾された酵素を提供するものである。有機合成において修飾された酵素を用いる方法を提供するものである。図面の簡単な説明図１は、ｐＨ８．６でボロンインヒビターでプローブした後の修飾Ｓ１５６Ｃミュータントについて得られた結果を棒グラフで示した図である。図２は、ｐＨ８．６でボロンインヒビターでプローブした後の修飾Ｓ１６６Ｃミュータントについて得られた結果を棒グラフで示した図である。図３は、野生種のBacilluslentusサブチリシン（ＳＢＬ−ＷＴ、□）及び修飾Ｎ６２Ｃミュータント（Ｎ６２Ｃ−Ｓｃｙ；○）のｐＨ特性を示した図である。ポイントは再現性が確認されている。発明の詳細な説明本発明の第１の態様においては、修飾された酵素及びこのようなサブチリシンの１つ以上のアミノ酸残基をシステイン残基で置換した酵素を製造する方法を提供するものである。このシステイン残基は、その後チオール水素を、ａ）−ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｂ）−ＳＲ³であって、Ｒ³は、置換された又は未置換のフェニル基、ｃ）−ＳＲ⁴であって、Ｒ⁴は、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｄ）−ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を与える置換基で置換されて修飾が行われる。好ましい態様においては、チオール側鎖基は、上述した−ＳＲ³基及び−ＳＲ⁴基であり、さらに、アルキル基を含有していることが好ましく、このＲは、Ｒ³又はＲ⁴の前におかれて、−ＳＲＲ³基又は−ＳＲＲ⁴基とされていても良く、Ｒは、Ｃ_1-10のアルキル基とされていることが好ましい。チオール側鎖基−ＳＲ¹Ｒ²に関しては、Ｒ²は、正に帯電又は負に帯電していても良い。Ｒ²は、ＳＯ₃ ^-、ＣＯＯ^-又はＮＨ₃ ⁺とされていることが好ましい。さらには、Ｒ¹は、Ｃ_1-10のアルキル基であることが好ましい。この酵素は、プロテアーゼとされていることが好ましい。さらには、この酵素は、Bacillusサブチリシンであることがより好ましい。また、この酵素に含まれるシステインに置換されるアミノ酸は、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、又はセリンからなる群から選択されることが好ましい。置換されるアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトに位置されていることが好ましく、好ましくはこれらのサブサイトは、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましく、これらの番号位置は、Bacillus amyloliqu efaciensからの天然のサブチリシン又はBacillus lentusサブチリシンといった別のサブチリシンの等価なアミノ酸酸基に対応する。特に、好ましい態様においては、酵素は、Bacillus lentusサブチリシンとされる。最も好ましい態様においては、システインに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２であり、チオール側鎖基が、 −ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、ＣＨ₂であり、Ｒ²は、ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-である基、 −ＳＲＲ³であって、Ｒは、ＣＨ₂であり、Ｒ³は、Ｃ₆Ｈ₅である基、 −ＳＲＲ⁴であって、Ｒは、ＣＨ₂であり、ｃ−Ｃ₆Ｈ₁₁である基、 −ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、ｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である基又はシステインに置換されるアミノ酸がＬ２１７であり、チオール側鎖が、 −ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵がｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である基からなる群から選択されている。本発明は、さらにシステイン残基により１つ以上のアミノ酸が置換された修飾された酵素を提供するものである。これらのシステイン残基は、チオールの水素原子を置換基で置換することによって修飾されており、これらの置換基は、チオール側鎖−ＳＲ⁶を与え、このＲ⁶は、Ｃ_1-6のアルキル基であり、システインにより置換されるアミノ酸残基は、アスパラギン、ロイシン、セリンとされている。この酵素は、プロテアーゼとされていることが好ましい。さらにこの酵素は、 Bacillusサブチリシンとされていることがより好ましい。さらに、このアミノ酸は、プロテアーゼのサブサイトにおいて、Ｓ₁、Ｓ₁’又はＳ₂サブサイトとされていることが好ましい。さらに置換されるアミノ酸は、Ｎ６２，Ｌ２１７，Ｍ２２２，Ｓ１５６，Ｓ１６６とされていることがより好ましい。この酵素は、B.le ntusサブチリシンであることが好ましい。システインにより置換されるアミノ酸は、Ｎ６２又はＬ２１７とされ、チオール側鎖基は、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶は、ＣＨ₂Ｃ（ＣＨ₃）₃又はＣ₅Ｈ₁₁とされていることが好ましい。 “修飾された酵素”とは、アスパラギン、セリン、メチオニン又はロイシンといったアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、その後システインのチオール水素原子をチオール側鎖、すなわちＣ_1-6アルキル基又はＣ_10-15のアルキル基又はフェニル基、シクロヘキシル基又は帯電した又は極性の部分を有する置換基を含む基で置換したものをいう。この修飾後、酵素特性、すなわち活性又は基質特性が変更される。酵素活性は、向上されることが好ましい。用語“酵素”とは、それ自体は変化せずに他の物質を触媒的に化学変化させる能力を有するタンパクをいう。酵素は、野生種の酵素又は突然変異体の酵素とすることができる。本発明の範囲に含まれる酵素としては、プルラナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、イソメラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、リダクターゼを挙げることができる。これらの酵素は、野生種であってもミュータントの酵素であっても良い。野生種のプロテアーゼとしては、Bacillus lentus 又はBacillus amyloliquefaciens（又はＢＰＮとして参照される）を挙げることができる。ミュータントのプロテアーゼは、例えばＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１０６１５及びＷＯ９１／０６６３７に開示の方法にしたがって製造することができる。いくつかのタイプの部分は、システイン残基のチオール水素を置換するために用いることができる。これらの部分としては、−ＳＲ¹Ｒ²、−ＳＲ³、−ＳＲ⁴、 −ＳＲ⁵又は−ＳＲ⁶を挙げることができる。Ｒ及びＲ¹としては、独立して置換又は未置換のＣ_1-10のアルキル基を挙げることができる。Ｒ²は、帯電した基又は極性基である。Ｒ³は、置換又は未置換のフェニル基である。Ｒ⁴は、置換又は未置換のシクロヘキシル基である。Ｒ⁵は、Ｃ_10-15のアルキル基である。Ｒ⁶は、Ｃ_1-6のアルキル基である。Ｒ¹、Ｒ⁵又はＲ⁶は、置換又は未置換及び／又は直鎖又は分岐鎖とされていても良い。帯電した基は、帯電した分子を形成する１つ以上の原子を有する基、すなわちＳＯ₃ ^-、ＣＯＯ^-又はＮＨ₃ ⁺をいう。用語“チオール側鎖基”、“チオール側鎖を与える置換基”、“チオール含有基”、及び“チオール側鎖”は、それぞれ置き換えて用いることができ、サブチリシンのアミノ酸の１つを置換するために用いるシステインのチオール水素原子を置換するために用いられる基をいう。共に、このチオール側鎖基は、上述したＲ^X基がシステインのチオールのＳ原子に結合するイオウ（Ｓ）を含む。用語、“置換された”とは、基の水素原子が別の原子又は分子で置換された基をいう。例えば、水素原子は、例えばメチル基、フッ素原子又は水酸基で置換することができる。本発明においては、アルキル基、シクロヘキシル基、フェニル基は置換することができ、つまり、１つ以上の水素原子を別の原子又は分子で置換することもできる。酵素の結合サイトは、酵素の表面にわたる連なったサブサイトから構成される。サブサイトに対応する基質残基は、Ｐによりラベルでき、サブサイトはＳでラベルできる。習慣上、サブサイトは、Ｓ₁，Ｓ₂，Ｓ₃，Ｓ₄，Ｓ₁’及びＳ₂’でラベルされる。サブサイトの説明については、サイゼン(Seizen)等、(1991)Protei n Engineering ,４：719-737及びフェルシュト(Fersht)A.E.(1985)、Enzyme Stru cure and Mechanism ,第２版、フリーマン(Freeman)(ニューヨーク)、第２９頁〜３０頁に記載されている。好ましいサブサイトとしては、Ｓ₁，Ｓ₁’及びＳ₂を挙げることができる。本発明のアミノ酸残基は、サイト指向性突然変異法又はこれとは別の当業界で良く知られた方法を用いてシステイン残基に置換される。(例えばＰＣＴ公開番号を９５／１０６１５号を参照されたい)。システイン残基のチオール水素原子を修飾する方法としては、後述する実施例４に記載されている方法を挙げることができる。本発明の１つの特徴においては、修飾されたプロテアーゼは、前駆体であるプロテアーゼと比較して変更されたタンパク活性を有するが、この理由は、このような活性（数値的に大きな）は、上述した酵素をターゲット基質に対してより効果的に作用させるために用いることを可能とするためである。また、修飾された酵素が前駆体に比較して変更された活性、親核性、基質特性、立体選択性、熱安定性、ｐＨ活性プロファイル、表面結合特性を有することにも関心が持たれる。驚くべきことに、本発明の修飾されたプロテアーゼは、変更されたｐＫａを有しており、このためプロテアーゼ分子の表面特性を変化させることなく、前駆体プロテアーゼ（実施例７参照）のｐＨプロファイルからシフトされたｐＨ特性を付与することができる。本発明の修飾された酵素は、ｐＨが６．５〜１２．０の既知の粉体及び液体洗剤中に、重量において約０．０１〜約５％（好ましくは０．１％〜０．５％）配合することができる。これらの洗剤組成物又は添加物はまた、既知のプロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、又はエンドグリコシダーゼ(endoglyco sidase)といった別の酵素をビルダー及び安定剤と共に添加することもできる本発明の修飾された酵素、特にサブチリシンは、種々の洗剤組成物に配合することができる。多くの知られた化合物は、本発明の修飾された酵素を含有する組成物中で有効な界面活性剤となる。これらのものとしては、バリーＪ．アンダーソン(Barry J.Anderson)による米国特許第４，４０４，１２８号及びジールフローラ(Jirl Flora)等の米国特許第４，２６１，８６８号に開示のノニオン性、アニオン性、カチオン性、アニオン性すなわち両性洗剤を挙げることができる。好適な洗剤配合物は、例えば米国特許第５，２０４，０１５号の実施例７に開示のものを挙げることができる。この技術は、クリーニング組成物として用いられる異なった配合についてよく見られるものである。典型的なクリーニング組成物に加え、本発明の修飾された酵素が天然又は野生の酵素を用いていかなる目的にも用いることができることが容易に理解されよう。したがって、上述した修飾された酵素は、例えばバー又は液体石鹸に、食器洗浄剤配合物に、コンタクトレンズクリーニング溶液又は製品に、ペプチド合成に、食品添加物又は食品添加物を製造する等の食品用途に、廃棄物処理に、繊維処理といった繊維用途に、タンパク製造における融合−切断酵素に用いることができる。この修飾された本発明の酵素は、洗剤組成物において改善された洗浄特性を有する(前駆体と比較した場合)。本発明で用いるように、洗剤における改善された洗浄特性は、野菜又は血液といった酵素感受性を有するある種の汚れの洗浄性を向上させることとして定義することができ、標準的な洗浄サイクルの後に光を反射させることにより評価できる。本発明の修飾された酵素を通常の洗浄組成物に添加してもいかなる使用に対する制限は生じない。言い換えれば、洗剤に好適ないかなる温度及びｐＨでも本発明の組成物のｐＨが上述の範囲であり、温度が修飾された酵素の脱活性温度以下である限り好適である。これに加えて、洗浄剤組成物に用いられる本発明の修飾された酵素は、洗剤なしでも用いることができ、また単独で又はビルダ又は安定化剤とともに用いることもできる。本発明の別の特徴によれば、修飾された酵素は、動物飼料、例えばシリアルベースの飼料を製造するために用いることができる。シリアル類とは、少なくとも小麦、大麦、トウモロコシ、モロコシ、ライ麦、オート麦、ライ小麦、及びコメをいう。シリアルベース飼料のシリアル成分は、タンパク源を含有しているが、これは通常では、飼料中の補助的なタンパクを添加することが必要とされるためであり、これらのものとしては、魚肉ミール、肉ミール、又は植物タンパクから得られるものを挙げることができる。植物タンパク源としては、完熟大豆、菜種、キャノーラ(canola)、大豆ミール、菜種ミール及びキャノーラミールの少なくとも１つを挙げることができる。動物飼料に含有される本発明の修飾した酵素は、粗タンパク値及び／又は消化性及び／又はアミノ酸含有量及び／又は飼料の消化系数を増加させることができ、これにより従来では動物飼料の成分として必要とされているこれ以外のタンパク源の量及び／又はアミノ酸といった補助成分の量が低減できる。本発明により与えられる食品にはまた、β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、マンナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、リパーゼ、α−アラビノフラノシダーゼ、キシラナーゼ(xylanase)、α−アミラーゼ、エステラーゼ、オキシダーゼ、オキシドリダクターゼ、ペクチナーゼのうちの１種以上といった他の酵素助剤を含有することができる。特にキシラナーゼをBacillus遺伝子から得たサブチリシンの別の酵素助剤として用いることが特に好適である。このようなキシラナーゼは、例えばＰＣＴ特許公開ＷＯ９７／２０９２０号に詳細に開示されている。本発明の一つの特徴としては、ＭＰを含有する繊維処理のための組成物を提供することである。この組成物は、ＲＤ２１６，０３４号、ＥＰ１３４，２６７号、ＵＳ４，５３３，３５９号、ＥＰ３４４，２５９号に開示のように、絹又はウールの処理に用いることができる。本発明の変性酵素は、例えば、所望する反応のための触媒や、及び／又は所定の立体選択性といった有機合成に対しても用いることができる。これについては、例えば、ノートムル(Norltml)等、Biotech.Bloeng.51:95-99(1996)；ダブリス (Dabulis)等、Biotech.Bioeng.41:566-571(1993)；フィッツパトリック(Fitzpat rick)等、J.Am.Chem.Soc.113:3166-3171(1991)を参照することができる。例示の目的のために後述する内容を記載するが、これらの記載により本発明の請求の範囲が制限されるわけではない。実施例実施例１Ｃｙｓ−ミュータントの製造 B.lentus（ＳＢＬ）からのサブチリシン遺伝子をバクテリオファージＭ１３ｍｐ１９ベクターに突然変異誘発体としてクローンした(米国特許第５，１８５，２５８号)。オリゴヌクレオチド−指向性突然変異誘発性は、ゾラー(Zoller)等( 1983),Methods Enzymol．100:468-500に開示されているようにして行った。突然変異させたシーケンスをクローンして、抽出し、B.subtilisホストのプラスミドＧＧ２７４発現中に再導入した。ＰＥＧ（５０％）を安定剤として添加した。得られた粗タンパク濃縮物をまずセファデックス(Sephadex)（登録商標）Ｇ −２５を脱塩マトリックスとしてｐＨ５．２バッファ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭＣａＣｌ₂）を用いて通過させて、低分子量不純物を除去した。脱塩カラムに蓄えられたフラクションをその後強いカチオン交換カラム（ＳＰセファローズ（登録商標）ＦＦ）を用いて酢酸ナトリウムバッファ（上述の）を用いて通過させ、ＳＢＬをワンステップで濃度の徐々に上がるｐＨ５．２の０−２００ｍＭのＮａＣｌ酢酸バッファで溶出させた。塩を含まない酵素パウダーを得、その後溶出物をミリポアで精製した水を用いて透析し、その後凍結乾燥を行って得た。ミュータント及び０℃で３０分間０．１ＭＨＣｌ中で培養した野生種の酵素の純度をファルマシア（ウプサラ、スエーデン）からのファスト(Phast)(登録商標 )システムを用いホモジニアスケル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。ＳＢＬの濃度は、バイオ−ラッド(Bio-Rad)（ハーキュレス(Hercules),CA）ダイ試薬キットを用いて決定した。この方法は、ブラッドフォード（Bradford）(1976) ,Analytical Biochemistry 72:248-254に基づいたものである。酵素の特性活性は、ｐＨ８．６のバッファを用いて後述する方法により決定した。実施例２特定部分の製造３−メチルブチルメタンチオスルホネート１−ブロモ−３−メチルブタン(１．７５２０ｇ、０．０１１６ｍｏｌ)、メタンチオスルホン酸ナトリウム（１．５５４ｇ、０．０１１６ｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中で５０℃２時間加熱した。室温で、水（１５ｍＬ）を添加して、この混合物をエーテルで抽出した(３ｘ３０ｍＬ)。抽出物を混合して、鹹水で洗浄し、脱水後濃縮した。残査をシリカゲル上でＥｔＯＡＣ−ヘキサン（１：４）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた。製造物を、無色の液体として得た(１．４７７７ｇ，７０％)。ネオペンチルメタンチオスルホネートネオペンチルヨウ素(３．０５４ｇ，０．０１５４ｍｏｌ)、メタンチオスルホン酸ナトリウム(２．２７２ｇ，０．０１７０ｍｏｌ)、乾燥ＤＭＦ（４ｍＬ）の反応混合物を９０℃で９０時間加熱した。ヨウ素が日光に感受性を持つので、反応フラスコをアルミニウムフオイルでくるんで反応混合物に直接日光が当たるのを避けた。加熱終了時に反応混合物は赤茶色をしていた。室温で水（１５ｍＬ）を添加してこの混合物をエーテル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。混合したエーテル抽出物を鍼水で２度洗浄し脱水後濃縮し、残査をシリカゲルを用いたＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：２）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、無色のオイルをゆっくりと固化させた。この製造物を９５％ＥｔＯＨで再結晶した。ヘキシルメタンスルホネート１−ブロモヘキサン(１．０４６ｇ，０．００６３５ｍｏｌ)、メタンチオスルホン酸ナトリウム(０．８５０ｇ，０．００６３５ｍｏｌ)、乾燥DＭＦ（６ｍＬ）の反応混合物を６０℃で２時間加熱した。室温で水（１５ｍＬ）を加え、得られた混合物をエーテル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。抽出物を鹹水で洗浄し脱水後濃縮し、残査をシリカゲルを用いたＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：４）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、無色の液体を得た(２．０５７ｇ、８２％)。シクロヘキシルメチルメタンチオスルホネートブロモメチルシクロヘキサン(１．５６０ｇ，０．００８８１ｍｏｌ)、メタンチオスルホン酸ナトリウム(１．１８０ｇ，０．００８８１ｍｏｌ)、乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）の反応混合物を５０℃で２４時間加熱した。室温で水（１５ｍＬ）を加え、得られた混合物をエーテル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。抽出物を鹹水で洗浄し脱水後濃縮し、残査をシリカゲルを用いたＥｔＯＡＣ−ヘキサン（１：４）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、無色のオイルを得た( １．５０３３ｇ、８２％)。デシルメタンチオスルホネート１−ブロモデカン(２．０９５ｇ，０．００９４７ｍｏｌ)、メタンチオスルホン酸ナトリウム及び乾燥ＤＭＦ（６ｍＬ）の反応混合物を６０℃で２時間加熱した。室温で水（１５ｍＬ）を加え、得られた混合物をエーテル（３ｘ３０ｍＬ）で抽出した。エーテル抽出物を鹹水で洗浄し脱水後濃縮し、残査をシリカゲルを用いたＥｔＯＡｃ−ヘキサン（１：４）を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけ、白色の固体を得た(２．０６３ｇ、９４％)。得られた製造物を９５％ＥｔＯＨ中で再結晶させた。メタンチオスルホン酸ナトリウム塩化メシル（４６．６ｍＬ、０．６０２ｍｏｌ）をＮａ₂Ｓ・９Ｈ₂Ｏ（１４２．２ｇ、０．５９２ｍｏｌ）の水（１５０ｍＬ）溶液に８０℃で滴下して加えた。この添加の後、反応混合物を還流下で加熱し、１５時間で淡黄色から黄色へと変化した。また、この期間中、また幾分かの黄色の析出物が形成された。反応混合物を室温まで冷却し水を蒸発させた。固体残査を乳鉢及び乳棒で粉砕した後、粉末をさらに５０℃、１ｔｏｒｒでさらに乾燥させた。無水エタノール（７００ｍＬ）を用いてこの粉末４部に分けて粉砕するために用い、エタノールろ過物を濃縮してアイスバス中で冷却して析出物を得、この析出物を真空ろ過して回収した。このろ過物をさらに濃縮して第２の析出物を得た。濃縮及びろ過を繰り返し（４ｘ）た後、ろ過物の最終体積を約１０ｍＬとした。混合された析出物を室温で無水エタノールに溶解してろ過し、トレース量の塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムを除去した。このろ過物を濃縮して冷却し、固体を真空ろ過して回収した。再度濃縮、冷却、ろ過のプロセスを３度繰り返して白色のフレーク状の結晶を得、この結晶をさらに１ｔｏｒｒで１晩乾燥させた（２４．５１ｇ、３１％）ベンジルメタンチオスルホネートベンジルブロミド（９．０７ｇ、０．０５３ｍｏｌ）をゆっくりメタンチオスルホン酸ナトリウム（７．１０ｇ，０．０５３０ｍｏｌ）の無水ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）の懸濁物中に添加し、この反応混合物を１晩還流下で加熱した。この反応混合物をアイスバスで冷却し、固体（臭化ナトリウム及びメタンスルホン酸ナトリウム）をろ別した。このろ過物を濃縮して主として所望する製造物からなる粗生成物を得た。純粋な製造物は、ＥｔＯＡＣ−ヘキサン（１：６）を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーによって得た(７．９２ｇ、７４％) 。製造物をさらに無水エタノールから再結晶させることによって精製した。試薬ＣＨ₃ＳＯ₂−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＳＯ₃−Ｎａ⁺及びＣＨ₃ＳＯ₂−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₃ ⁺Ｂｒ^-は、トロントリサーチケミカルズ（トロント、オハイオ州）から購入した。実施例３Ｃｙｓ−ミュータントの修飾下記の実施例は、Ｃｙｓ−ミュータント、すなわちＮ６２Ｃを修飾するために用いた代表例である。Ｍ２２２Ｃの修飾Ｃｙｓ−ミュータント、Ｍ２２２Ｃ、B.lentus（２５．１ｍｇ、０．９４μ ｍｏｌ）のポリエチレングリコール１０，０００の０．１％ｗ／ｖの水溶液でプレコートしたポリプロピレンチューブ中の緩衝液（２５０ｍ１：７０ｍＭＣＨＥＳ，５ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ₂，ｐＨ９．５）に加え、これを実施例２に記載したメチルメタンチオスルホネートの９５％ＥｔＯＨ（１００μｌ、９２．４μｍｏｌ）溶液に加えた。この溶液を撹拌し、エンド−オーバー−エンド (end-over-end)ローテータ上で室温下（２２℃）ゆっくりと回転させた。試薬溶液の代わりにエタノールを含有する１つのブランクを並列的に製造した。修飾は、１０μｌの抽出したサンプルについて活性を測定し、上述の方法に従って決定した。反応は、試薬の分取物をさらに加えてもプロテアーゼの活性が変化しなくなってから２．５ｈｒ後に停止させた。この溶液（２．５ｍｌ）を使い捨て脱塩カラム(ファルマシアバイオテックＰＤ−１０(登録商標)、セファデックス(登録商標)Ｇ−２５Ｍ)上で精製した。このカラムをバッファ(２５ｍｌ；５ｍＭＭＥＳ、２ｍＭＣａＣｌ₂、ｐＨ６．５)で平衡とし、サンプルを頂部から採取した。回収された最初の２．５ｍｌを廃棄した。タンパクをＭＥＳバッファ（３．５ｍｌ）で溶出させ、３つのフラクションとして回収した。すべてのフラクションは、ゲル上(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ファルマシアファーストシステム(登録商標)) でチェックしたところ単一のバンドを与え、リファレンスとしたＣｙｓ−ミュータント又は野生種からは区別されなかった。これらの３つのフラクションを混合し、脱イオン水で０℃で透析し(３ｘ１１)、次いで１晩真空乾燥して修飾ミュータントを得た(１４．３ｍｇ)。特性活性は、Ｃｙｓ−ミュータント（４７．１Ｕ／ｍｇ）と比較して６４．３Ｕ／ｍｇであった。修飾されたプロテアーゼの活性測定キネティックパラメータｋ_cat，Ｋ_M，ｋ_cat／Ｋ_Mを含む活性を合成ペプチド基質サクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドの加水分解についてボノー(Bonneau)P.等（1991）J.Am.Che.Soc.,113(3):10 30に記載された方法を用いて測定した。概略的には、サブチリシン突然変異体のストックの少量分取物を０．１Ｍ燐酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．５、０.５ＭＮａＣｌ及び１％ＤＭＳＯ含有、を含む１ｃｍのキューベットに添加し、２５ ℃で恒温とするか、又はｐＨ８．６、０．１Ｍトリスバッファ(tris buffer)、０．０５％ツイーン(Tween)（登録商標）８０及び１％ＤＭＳＯ含有、に同様にして添加した。反応の進行は、反応生成物であるｐ−ニトロアニリンの４１０ｎｍの吸収を、パーキンエルマーλ２分光光度計によってモニタすることによって分光光度法により測定した(Δε₄₁₀８８００Ｍ^-1ｃｍ^-1)。キネティックパラメータは、０．２５ｍＭから４．０ｍＭ（８濃度）の基質濃度における初期速度を測定することによって得、このデータをMichaelis-Menten式にフィッティングさせることにより得た。表１は、チオスルホネートの特定のものについて略号で示している。表２は、修飾したB.lentusサブチリシン（ＳＢＬ）及びｐＨ７．５でのサブチリシン前駆体（ＳＢＬ−ＷＴ）のキネティックパラメータを示す。修飾された酵素は、上述したようにサイト指向性突然変異誘発後に、システインで関心のあるアミノ酸を置換して製造した。この前駆体プロテアーゼは、Bacillus lentusサブチリシン（ＳＢＬ−ＷＴ）とした。実施例４ B.lentusサブチリシンの修飾された特性競合インヒビタとして種々のホウ酸を用い基質特性の変化、特にＳ１サブサイト特性を示す。上述した４つの修飾されたＳ１５６Ｃミュータント及び３つの修飾されたＳ１６６Ｃミュータントについて、ホウ酸インヒビタを用いて評価した。修飾されたミュータントは、Ｓ１５６Ｃ−ＳＭｅ、Ｓ１５６Ｃ−ＳＢｎ、Ｓ１５６Ｃ−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-、Ｓ１５６Ｃ−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₃ ⁺、Ｓ１６６Ｃ− ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＳＯ₃ ^-、Ｓ１６６Ｃ−ＳＣＨ₂ＣＨ₂ＮＨ₃ ⁺、Ｓ１６６Ｃ−ＳＢｎである。ホウ酸を製造し、ｐＨ８．６⁽ワーレイ(Waley)(1982),Biochem.J.205:631-33) でそのインヒビションコンスタントを、上述したソーファー−ワッサータール(S eufer-Wasserthal)等、(1994)Bioorganic and Medicinal Chemistry 2:35-48)にしたがって測定した。これらの結果を図１及び図２に示す。実施例５洗浄特性試験上述した実施例のいくつかの修飾された酵素の洗浄特性をＥＭＰＡ１１６（綿上の血液／ミルク／カーボンブラック）のクロススオッシュ（テストファブリックス社(Testfabrics,Inc.,)、ミドルエセックス、NJ07030）からの汚れ除去を測定して評価を行った。このクロススオッシュは、下記の方法によりプリブリーチ処理した。：４リットルのガラスビーカ中に、１．９ｇのパーボレートテトラハイドレート、１．４ｇのパーボレートモノハイドレート、１ｇのＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンジアミン）を３リットルの脱イオン水に６０℃で加え、１分間撹拌て溶解した。３６枚のＥＭＰＡ１１６スオッシュを入れ、３分間撹拌した。このスオッシュを冷脱イオン温水で１０分間リンスした。このスオッシュを吸収用紙タオル上に引き延べて１晩乾燥させた。５つのプリブリーチしたＥＭＰＡ１１６スオッシュを１０００ｍｌの水、３ｇｐｇ硬度(Ｃａ⁺⁺：Ｍｇ⁺⁺：３：１：ｗ：ｗ)、０．６７ｇのブリーチ剤と適切な酵素とを含む洗剤を含有するモデル７２４３Ｓテルゴトメータ(Tergotometer) （ユナイテッドステーツテスティング社、(United States Testing Co.Inc.,)、ホーボッケン(Hoboken)、ＮＪの各ポット中に配置した。この洗剤ベースは、ｗｆｋ−テストゲベーベ（Testgewebe）ＧｍｂＨ、アドラーストラッセ４２、ポストファーハ１３０７６２、Ｄ−４７７５９、クレッフェルド、ドイツ(wfk-T estgewebe GmbH,Adlerstrasse 42,Postfach 13 07 62,D-47759 Krefeld,Germany )社製のＷＦＫ１とした。このベース洗剤に対して、下記添加剤を加えた。ソジウムパーボレートモノハイドレート及びソジウムパーボレートテトラハイドレートは、デグッサコーポレーション(Degussa Corporation)、リッジフィールドパーク(Ridgefield Park)、NJ07446から得た。ＴＡＥＤ（テトラアセチルエチレンジアミン）は、ワールウイックインターナショナル社、モースチン、ホリウエル、(Warwick International,Limited,Mostyn,Holywell)、Ciwyd CH89HE,イングランドから得た。プリブリーチしたＥＭＰＡ１１６スオッシュを０．１ｐｐｍの酵素を含有する洗剤中で２０℃で２０ｍｉｎ洗浄し、続いて１０００ｍｌの水で５ｍｉｎ２回リンスした。スオッシュを乾燥し、圧迫してスオッシュからの反射をミノルタ色彩色差計モデルＣＲ−２００、ミノルタ社、ラムゼイ、(Minolta Corporation, Ramsey)、NJ07446のｌａｂスケールにおけるＬ値を用いて測定した。その特性を汚れ除去％及びネーティブB.lentusプロテアーゼの汚れ除去レベルの相対％で記載する。汚れ除去％は、下記式を用いて算出した。実施例７サブチリシン前駆体のｐＨプロファイルの変更ＳＢＬのｐＨプロファイルの化学修飾の効果を検討するため、７つの修飾Ｎ６２Ｃミュータントを上述のようににして製造した。イオン強度０．０５Ｍ（ＫＣｌで調節した）の０．０２Ｍのエチレンジアミンバッファを１．２５ｘ１０^-4ＭのサクシニルＡＡＰＦ−ｐＮＡ基質と共に用い、Ｋ_cat／Ｋ_M測定を上述のように行った。Ｋ_cat／Ｋ_Mは、Ｈｉｓ６４のｐＫａをリファレンスとした。３組の触媒の部分は、フリーの酵素においてノンプロダクティブバインディングモード(non productive binding modes)により影響を受けないようにした((フェルシト(Fers ht),A.E.,(1985)Enzyme Structure and Mechanism、第２版、フリーマン(ニューヨーク))。ｐＫａは、グラフィット(Graphit)（マックゲーリイ＆アソシエーツ( McGeary & Aysociates)、ミドルタウン(Middletown)、ＣＴ）を用いて計算した。ｐＫａにおけるシフトは、ＳＢＬのｐＨプロファイルのシフトを反映する。ＳＢＬＮ６２Ｃ−Ｓシクロヘキシル（Ｎ６２Ｃ−Ｓｃｙ）及びＳＢＬ−ＷＴの代表的なｐＨプロファイルを図３に示す。（２５℃で[E]＝１ｘ１０^-7〜５ｘ１０^-8Ｍ）である。ポイントはそれぞれ再現性があった。表４には、Ｈｉｓ６４のB.lentus野生種（ＷＴ）からのｐＫａの変化及びｋ_ca _t ／Ｋ_Mを７種の修飾Ｎ６２ＣＳＢＬミュータントについて示した。表４に示されるように、野生種に比較してＨｉｓ６４のｐＫａにおける極めて大きな０．５ユニットの減少がＮ６２Ｃ−Ｓシクロヘキシル修飾ＳＢＬにおいて観測されている。本発明はこれまでその特定の態様に基づいて説明を行ってきたが、本発明に対するさらなる変更及びその用途については、概ね本発明の原理を用いることによって行うことが可能であり、このような本発明との相違についても、当業者における周知又は常法であり本発明の特徴を適用することができ、添付する本発明の請求の範囲の記載の範囲内となるものである。上述した特許又は出願については本発明の一部を構成するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジョーンズジェイブライアンカナダオンタリオケイ０エル２エイチ０レイクフィールドシーフォースクレッセント 1275 (72)発明者ボットリチャードアールアメリカ合衆国カリフォルニア州 94010 バーリンゲイムヒルサイドドライヴ 3032 (72)発明者グレイカートーマスピーアメリカ合衆国カリフォルニア州 94044 パシフィカマンザニータドライヴ 1166 (72)発明者ミッチンソンコリンアメリカ合衆国カリフォルニア州 94019 ハーフムーンベイマートルストリート 381 (72)発明者デサンティスグレイスカナダオンタリオエム５ジー１エイチ４トロントエルムストリート７ ―＃406

Claims

【特許請求の範囲】１．１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換され、該システイン残基が、そのチオール水素原子を、ａ）−ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｂ）−ＳＲ³であって、Ｒ³は、置換された又は未置換のフェニル基、ｃ）−ＳＲ⁴であって、Ｒ⁴は、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｄ）−ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を与える置換基で置換することにより修飾された修飾酵素。２．Ｒ¹がＣ_1-10のアルキル基である請求項１に記載の修飾酵素。３．Ｒ²が正に帯電している請求項１に記載の修飾酵素。４．Ｒ²がＮＨ₃ ⁺である請求項３に記載の修飾酵素。５．Ｒ²が負に帯電している請求項１に記載の修飾酵素。６．Ｒ²がＳＯ₃ ^-である請求項５に記載の修飾酵素。７．前記酵素はプロテアーゼである請求項１に記載の修飾酵素。８．前記プロテアーゼは、Bacillus lentusサブチリシンである請求項７に記載の修飾酵素。９．システインで置換される前記アミノ酸が、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、及びセリンからなる群から選択される請求項７に記載の修飾プロテアーゼ。 10．前記アスパラギンが、前記プロテアーゼのサブサイトである請求項９に記載の修飾プロテアーゼ。 11．前記サブサイトが、Ｓ₂である請求項１０に記載の修飾プロテアーゼ。 12．前記アスパラギンが、６２位にある請求項１１に記載の修飾プロテアーゼ。 13．前記修飾酵素が、さらに、アルキル基Ｒを有しており、Ｒ³又はＲ⁴の前におかれて−ＳＲＲ³基又は−ＳＲＲ⁴基を形成する請求項１に記載の修飾酵素。 14．前記Ｒが、Ｃ_1-10のアルキル基である請求項１３に記載の修飾酵素。 15．１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換され、該システイン残基が該システイン残基のチオール水素原子を−ＳＲ⁶のチオール側鎖を与えるような置換基で置換することにより修飾されており、ここで、Ｒ⁶は、Ｃ₁〜Ｃ ₆のアルキル基であり、前記アミノ酸残基は、アスパラギン、ロイシン、及びセリンからなる群から選択されることを特徴とする修飾酵素。 16．ａ）システイン残基で１つ以上のアミノ酸が置換された酵素を用意し、ｂ）チオール水素原子を、ｉ）−ＳＲ¹Ｒ²であって、Ｒ¹は、アルキル基であり、Ｒ²は帯電した基又は極性基、ｉｉ）−ＳＲ³であって、Ｒ³は、置換された又は未置換のフェニル基、ｉｉｉ）−ＳＲ⁴であって、Ｒ⁴は、置換された又は未置換のシクロヘキシル基、ｉｖ）−ＳＲ⁵であって、Ｒ⁵は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₅のアルキル基からなる群から選択されるチオール側鎖を与える置換基で置換することを特徴とする修飾酵素を製造するための方法。 17．Ｒ¹がＣ₁ _〜10のアルキル基である請求項１６に記載の方法。 18．Ｒ²が正に帯電している請求項１６に記載の方法。 19．Ｒ²がＮＨ₃ ⁺である請求項１８に記載の方法。 20．Ｒ²が負に帯電している請求項１６に記載の方法。 21．Ｒ²がＳＯ₃ ^-である請求項２０に記載の方法。 22．前記酵素はプロテアーゼである請求項１６に記載の方法。 23．前記プロテアーゼが、Bacillus lentusサブチリシンである請求項２２に記載の方法。 24．システインで置換される前記アミノ酸が、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、及びセリンからなる群から選択される請求項１６に記載の方法。 25．前記アスパラギンが、前記プロテアーゼのサブサイトである請求項２３に記載の方法。 26．前記サブサイトが、Ｓ₂である請求項２５に記載の方法。 27．前記アスパラギンが、６２位にある請求項２６に記載の方法。 28．前記修飾酵素が、さらに、アルキル基Ｒを有しており、Ｒ³又はＲ⁴の前におかれて−ＳＲＲ³基又は−ＳＲＲ⁴基を形成する請求項１６に記載の方法。 29．前記Ｒが、Ｃ_1-10のアルキル基である請求項２８に記載の方法。 30．ａ）１つ以上のアミノ酸残基がシステイン残基により置換され、前記アミノ酸残基は、アスパラギン、ロイシン及びセリンからなる群から選択された修飾酵素を用意し、ｂ）前記システイン残基の前記チオール水素原子をＲ⁶がＣ₁ _〜6のアルキル基である−ＳＲ⁶のチオール側鎖を形成する置換基で置換することを特徴とする修飾酵素の製造方法。 31．請求項１又は１５に記載の修飾酵素を含有する洗剤添加物。 32．請求項１又は１５に記載の修飾酵素を含有する食品添加物。 33．請求項１又は１５に記載の修飾酵素を含有する繊維処理組成物。 34．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ¹Ｒ²であり、Ｒ¹は、ＣＨ₂ＣＨ₂であり、Ｒ²は、ＳＯ₃ ^-である請求項１の修飾酵素。 35．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲＲ³であり、Ｒが、ＣＨ₂であり、Ｒ³ が、Ｃ₆Ｈ₅である請求項１の修飾酵素。 36．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ¹Ｒ⁴であり、Ｒ¹が、ＣＨ₂であり、Ｒ ⁴が、ｃ−Ｃ₆Ｈ₁₁である請求項１の修飾酵素。 37．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁵であり、Ｒ⁵が、ｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である請求項１の修飾酵素。 38．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｌ２１７であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁵であり、Ｒ⁵が、ｎ−Ｃ₁₀Ｈ₂₁である請求項１の修飾酵素。 39．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶が、ＣＨ₂Ｃ（ＣＨ₃）₃ である請求項１５の修飾酵素。 40．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ６２であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶が、Ｃ₅Ｈ₁₁である請求項１５の修飾酵素。 41．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｌ２１７であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶が、ＣＨ₂Ｃ（ＣＨ₃） ₃である請求項１５の修飾酵素。 42．前記酵素が、Bacillus lentusサブチリシンであり、前記アミノ酸が、Ｎ２１７であり、前記チオール側鎖が、−ＳＲ⁶であり、Ｒ⁶が、Ｃ₅Ｈ₁₁である請求項１５の修飾酵素。