JP2022523475A

JP2022523475A - 真核宿主細胞において多量体タンパク質を産生する方法

Info

Publication number: JP2022523475A
Application number: JP2021541600A
Authority: JP
Inventors: ローラシー．シモンズ，; タラバン，ノエリアブランコ
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレイテッド
Priority date: 2019-01-23
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2022-04-25
Also published as: MX2021008561A; KR20210118115A; CN113330027A; IL284803A; US20210363178A1; WO2020154410A1; BR112021014481A2; AU2020211976A1; EP3914615A1; JP2023106414A; CA3124515A1; SG11202106713UA

Abstract

本開示は、真核宿主細胞における多量体ポリペプチド（例えば、２つ以上のサブユニットを含み、各サブユニットが２つ以上のポリペプチド鎖を含むもの、例えば、多重特異性又は二重特異性抗体）の産生に関する。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドの各ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに作用可能に結合した翻訳開始配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用して、真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法が明細書で提供される。有利には、本開示は、各オープンリーディングフレームに結合した翻訳開始配列の強度を調整することにより、誤対合した副産物を少なくし、多量体ポリペプチドの産生量を高くすることができることを実証する。本開示は、これらに関する細胞、スクリーニング方法、及びキットをさらに提供する。【選択図】図２０Ａ

Description

関連出願との相互参照
［０００１］本出願は、２０１９年１月２３日出願の米国仮出願第６２／７９６，０１４号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
［０００２］以下のＡＳＣＩＩテキストファイルによる提出の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１４６３９２０４５２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：：２０２０年１月２２日、サイズ：５ＫＢ）。

［０００３］本開示は、真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法、並びにそれに関連する細胞、方法、及びキット又は製造品に関する。

［０００４］治療用抗体は、最も成功した生物学的薬物の代表である。過去３０年の間に、４０以上の治療用抗体が、がん、自己免疫、感染症、及び血管疾患を含む様々な適応症において臨床使用が承認されている。このように、治療用抗体は製薬業界で最も成長している分野の一つであり、その臨床的影響は顕著である。

［０００５］ほとんどの疾患は、複数の並行したシグナル伝達経路を有するため、受容体及びリガンドを複数回阻害することで、より優れた治療効果が得られる場合がある。したがって、２つの異なるエピトープに結合する能力を有する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、とりわけ、炎症性疾患及び自己免疫疾患（ＣｈａｎＡＣ，ＣａｒｔｅｒＰＪ．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ．２０１０；１０（５）：３０１－１６）、がん（ＫｏｕＧ，ＳｈｉＪ，ＣｈｅｎＬ，ＺｈａｎｇＤ，ＨｏｕＳ，ＺｈａｏＬ，ｅｔａｌ．ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．２０１０；２９９（２）：１３０－６；ＤｏｎｇＪ，ＳｅｒｅｎｏＡ，ＡｉｖａｚｉａｎＤ，ＬａｎｇｌｅｙＥ，ＭｉｌｌｅｒＢＲ，ＳｎｙｄｅｒＷＢ，ｅｔａｌ．ＭＡｂｓ．２０１１；３（３）：２７３－８８）、及び感染症疾患（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉｓＦ，ＬｉｕＨ，Ｏ’ＭａｈｏｎｙＲ，ＬａＶａｌｌｅＲ，ＢａｒｔｏｌｌｉｎｏＳ，ＳａｎｄｉｎｉＳ，ｅｔａｌ．ＪＩｎｆｅｃｔＤｉｓ．２００７；１９５（１）：１４９－５７；ＬａｖｅｎｔｉｅＢＪ，ＲａｄｅｍａｋｅｒＨＪ，ＳａｌｅｈＭ，ｄｅＢｏｅｒＥ，ＪａｎｓｓｅｎｓＲ，ＢｏｕｒｃｉｅｒＴ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１１；１０８（３９）：１６４０４－９）などの多面的な疾患治療への応用が期待できるものとして浮上してきた（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎＲＥ．ＭＡｂｓ．２０１２；４（２）：１８２－９７；ＢｒｉｎｋｍａｎｎＵ，ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎＲＥ．ＭＡｂｓ．２０１７；９（２）：１８２－２１２；ＣａｒｔｅｒＰＪ，ＬａｚａｒＧＡ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ．２０１８；１７（３）：１９７－２２３）。過去数十年の間に、遺伝子工学によって６０種類以上の異なる二重特異性抗体のフォーマットがもたらされ、ｂｓＡｂの免疫原性、薬物動態特性、及び分布が改善された（ＳｐｉｅｓｓＣ，ＺｈａｉＱ，ＣａｒｔｅｒＰＪ．ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６７（２ＰｔＡ）：９５－１０６）。

［０００６］ｂｓＡｂの用途にかかわらず、２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖が乱雑に対になり、１６の異なる組み合わせになるが、二重特異性であるのは１つだけであるため、前臨床及び臨床開発をサポートするために十分な量、品質、及びアセンブリを産生することが困難であることから、製造プロセスは困難であった。抗体工学は、重鎖又は軽鎖をそれぞれノブ－イントゥ－ホール及びｃｒｏｓｓＭａｂ技術でヘテロ二量化することにより、鎖の誤対合の問題を軽減するために使用されてきた（ＲｉｄｇｗａｙＪＢ，ＰｒｅｓｔａＬＧ，ＣａｒｔｅｒＰ．ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．１９９６；９（７）：６１７－２１；ＡｔｗｅｌｌＳ，ＲｉｄｇｗａｙＪＢ，ＷｅｌｌｓＪＡ，ＣａｒｔｅｒＰ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９７；２７０（１）：２６－３５；ＭｅｒｃｈａｎｔＡＭ，ＺｈｕＺ，ＹｕａｎＪＱ，ＧｏｄｄａｒｄＡ，ＡｄａｍｓＣＷ，ＰｒｅｓｔａＬＧ，ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６（７）：６７７－８１）。製造プロセスの解決策としては、半抗体の別個の発現と、その後のｂｓＡｂへのｉｎｖｉｔｒｏ組立を採用している（ＳｐｉｅｓｓＣ，ＭｅｒｃｈａｎｔＭ，ＨｕａｎｇＡ，ＺｈｅｎｇＺ，ＹａｎｇＮＹ，ＰｅｎｇＪ，ｅｔａｌ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３；３１（８）：７５３－８）。しかし、これは２つの異なる安定した細胞株を生成するため、製造プロセスに時間とコストがかかることと関連している。

［０００７］したがって、２つの抗体を単一の細胞内で共発現させることは、より簡単である可能性があるが、同時に、軽鎖をその同種重鎖に誘導し、望ましくない副産物の存在及び複雑な精製プロセスの必要性を回避して、適切な量の正しく組み立てられたｂｓＡｂを達成するために、発現系のより広範な最適化が頻繁に必要となる。

［０００８］過去数十年にわたり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、バイオ医薬品産業の主要な宿主として浮上してきた（ＷｕｒｍＦＭ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４；２２（１１）：１３９３－８）。バイオプロセスの革新及び細胞工学の努力により、産生物力価が改善された（ＡｙｙａｒＢＶ，ＡｒｏｒａＳ，ＲａｖｉＳＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７；１１６：５１－６２；ＫｅｌｌｅｙＢ，ＫｉｓｓＲ，ＬａｉｒｄＭ．ＡｄｖＢｉｏｃｈｅｍＥｎｇＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８．Ｅｐｕｂ２０１８／０５／０４）。しかし、未解明の細胞プロセス及び遺伝子制御メカニズムは、依然として、細胞成長、特異的生産性、及びタンパク質の品質を妨げる要因となっている。現在、哺乳動物細胞内で組み換えタンパク質の翻訳レベルを正確に制御する体系的なアプローチはほとんど存在しない。

［０００９］二重特異性抗体のような複雑な抗体フォーマットの工学は進歩してきたが、単一の哺乳動物発現系における製造可能性は低いパフォーマンスを示すことが多い。低い力価と不十分な産生物品質は、ｂｓＡｂの安定した産生を困難にする要因の２つである。結果として、産生系における制限的な工程を同定し、例えば真核生物又は哺乳動物の宿主細胞系において、正しく組み立てられた多量体ポリペプチドの産生を改善することを可能にする方法を提供することが急務となっている。

［００１０］特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献がそれぞれ参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

［００１１］これら及び他の要求に応えるために、本明細書では真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法が提供される。これらの多量体ポリペプチドは、２つ以上サブユニットを含み、各サブユニットは２つ以上のポリペプチド鎖を含む（例えば、多重特異性又は二重特異性抗体と同様）。有利には、これらの方法は、多量体ポリペプチドにおける各ポリペプチド鎖の翻訳レベルをより正確に操作し、正しく組み立てられた多量体ポリペプチドの産生の改善を可能にする。

［００１２］本開示の特定の態様は、真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法に関する。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む。いくつかの実施態様では、方法は、真核宿主細胞を用意することと、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、発現時に、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖が多量体ポリペプチドを形成する、真核宿主細胞を培養することと、真核宿主細胞よって産生された多量体ポリペプチドを回収することとを含む。いくつかの実施態様では、真核宿主細胞は、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施態様では、第１のサブユニットは、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方は、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い。いくつかの実施態様では、第１のサブユニットは、すべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞で一緒に発現されるとき、第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方は、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、二重特異性抗体である。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは二重特異性抗体であり、第１及び第３のポリペプチド鎖は抗体重鎖であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は抗体軽鎖であり、第１のサブユニットは、第１の抗原に結合する第１の半抗体であり、第２のサブユニットは、第２の抗原に結合する第２の半抗体である。

［００１３］本開示の他の態様は、真核宿主細胞において二重特異性抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第１の抗体重鎖及び第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体と、第２の抗体重鎖及び第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体とを含み、（ａ）真核宿主細胞を用意することであって、真核宿主細胞が、第１の抗体重鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第１の抗体軽鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第２の抗体重鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第２の抗体軽鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、かつ各半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１の半抗体が第２の半抗体よりも低いレベルで発現され、かつ第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い、真核宿主細胞を用意することと、（ｂ）第１及び第２の抗体重鎖及び軽鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、第１及び第２の抗体重鎖及び軽鎖が二重特異性抗体を形成し、かつ、第１の半抗体が第１の抗原に結合し、第２の半抗体が第２の抗原に結合する、真核宿主細胞を培養することと、（ｃ）真核宿主細胞によって産生された二重特異性抗体を回収することと、を含む、方法に関する。

［００１４］いくつかの実施態様では、第１の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み、ここで、第２の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変される。いくつかの実施態様では、第１の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み、ここで、第２の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変される。いくつかの実施態様では、ノブ変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、及びＦ４０５Ｗのうちの少なくとも一つを含む。いくつかの実施態様では、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３９４Ｓのうちの少なくとも一つを含む。いくつかの実施態様では、ノブ変異はＴ３６６Ｗを含み、ここで、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つすべてを含む。いくつかの実施態様では、第１の抗体軽鎖は第１の変異を含み、第１の抗体重鎖は第２の変異を含み、第１及び第２の変異は、第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖との選択的会合を促進する。いくつかの実施態様では、第１の変異はＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、かつ／又は、第２の変異はＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、かつ／又は、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、第２の抗体軽鎖は第３の変異を含み、第２の抗体重鎖は第４の変異を含み、第３及び第４の変異は、第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖との選択的会合を促進する。いくつかの実施態様では、第３の変異はＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、かつ／又は、第４の変異はＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、かつ／又は、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は、正電荷を帯びた残基（例えば、Ｓ１８３Ｋ）をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は、負電荷を帯びた残基（例えば、Ｖ１３３Ｅ）をもたらす。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は、負電荷を帯びた残基（例えば、Ｓ１８３Ｅ）をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は、正電荷を帯びた残基（例えば、Ｖ１３３Ｋ）をもたらす。

［００１５］いくつかの実施態様では、方法は、例えば、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾の翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む産生、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む産生と比較して、真核宿主細胞においてより多くの多量体ポリペプチドを産生する。［００１５］いくつかの実施態様では、方法は、例えば、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾の翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む産生、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む産生と比較して、真核宿主細胞における誤対合した副産物の数を少なくする。例えば、一過性のトランスフェクタント又は安定したトランスフェクタントを培養し、多量体のポリペプチドの産生を測定することができる。フェドバッチ培養又は灌流培養を行い、細胞培地中又は細胞表面上の産生物の力価を測定することができる。表面発現については、細胞を抗体で染色して、産生物を検出し、例えばフローサイトメトリーにより、分析することができる。産生物の品質及び／又は純度は、例えば電気泳動及び／又は質量分析などを用いて評価することができる。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも遅い速度で翻訳される。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりもゆっくりとかつ／又は効率的でなく折り畳まれる。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットは、第２のサブユニットよりも遅い速度で組み立てられる。いくつかの実施態様では、第１及び／又は第２の翻訳開始配列は、第３及び／又は第４の翻訳開始配列よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％弱い。いくつかの実施態様では、第１及び／又は第２の翻訳開始配列は、第３及び／又は第４の翻訳開始配列よりも少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍弱い。いくつかの実施態様では、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニット又は半抗体は、第２のサブユニット又は半抗体の発現レベルよりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％低いレベルで発現される。いくつかの実施態様では、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニット又は半抗体は、第２のサブユニット又は半抗体の発現レベルよりも少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍低いレベルで発現される。いくつかの実施態様では、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニット又は半抗体は、第２のサブユニット又は半抗体の発現レベルよりも０．２倍から０．８倍、０．８倍未満、０．５倍未満、又は０．３倍未満のレベルで発現される。

［００１６］本開示の他の態様は、多量体ポリペプチド又は二重特異性抗体の複数の組成物に関し、ここで複数の組成物の各多量体ポリペプチド又は二重特異性抗体は、本明細書に記載の実施態様のいずれか一つの方法によって産生される。

［００１７］本開示の他の態様は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む非天然の多量体ポリペプチドの発現のための組み換え真核宿主細胞であって、宿主細胞が、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、かつ各サブユニットが組み換え真核宿主細胞において個別に発現されるとき又はすべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞で一緒に発現されるとき、第１のサブユニットが第２のサブユニットよりも低いレベル発現され、かつ第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方よりも弱い、組み換え真核宿主細胞に関する。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは二重特異性抗体であり、第１及び第３のポリペプチド鎖は抗体重鎖であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は抗体軽鎖であり、第１のサブユニットは、第１の抗原に結合する第１の半抗体であり、第２のサブユニットは、第２の抗原に結合する第２の半抗体である。

［００１８］本開示の他の態様は、第１の抗体重鎖及び第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体と、第２の抗体重鎖及び第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体とを含む二重特異性抗体の発現のための組み換え真核宿主細胞であって、（ａ）第１の抗体重鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）第１の抗体軽鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、（ｃ）第２の抗体重鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、（ｄ）第２の抗体軽鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、ここで、各半抗体が組み換え真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１の半抗体が第２の半抗体よりも低いレベルで発現され、かつ第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い、組み換え真核宿主細胞に関する。いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗体重鎖及び軽鎖は二重特異性抗体を形成し、第１の半抗体は第１の抗原に結合し、かつ第２の半抗体は第２の抗原に結合する。

［００１９］いくつかの実施態様では、第１の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み、ここで、第２の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変される。いくつかの実施態様では、第１の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み、ここで、第２の抗体重鎖は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変され、かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインは改変される。いくつかの実施態様では、ノブ変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、及びＦ４０５Ｗのうちの少なくとも一つを含む。いくつかの実施態様では、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３９４Ｓのうちの少なくとも一つを含む。いくつかの実施態様では、ノブ変異はＴ３６６Ｗを含み、ここで、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つすべてを含む。いくつかの実施態様では、第１の抗体軽鎖は第１の変異を含み、第１の抗体重鎖は第２の変異を含み、第１及び第２の変異は、第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖との選択的な会合を促進する。いくつかの実施態様では、第１の変異はＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、かつ／又は、第２の変異はＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、かつ／又は、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、第２の抗体軽鎖は第３の変異を含み、第２の抗体重鎖は第４の変異を含み、第３及び第４の変異は、第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖との選択的会合を促進する。いくつかの実施態様では、第３の変異はＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、かつ／又は、第４の変異はＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、かつ／又は、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は、正電荷を帯びた残基（例えば、Ｓ１８３Ｋ）をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は、負電荷を帯びた残基（例えば、Ｖ１３３Ｅ）をもたらす。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は、負電荷を帯びた残基（例えば、Ｓ１８３Ｅ）をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は、正電荷を帯びた残基（例えば、Ｖ１３３Ｋ）をもたらす。いくつかの実施態様では、第１の抗体軽鎖はＶ１３３Ｋ変異を含み、第１の抗体重鎖はＳ１８３Ｅ変異を含み、第２の抗体軽鎖はＶ１３３Ｅ変異を含み、第２の抗体重鎖はＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）。いくつかの実施態様では、第１の抗体重鎖は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第２の抗体重鎖は、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）。いくつかの実施態様では、第２の抗体軽鎖はＶ１３３Ｋ変異を含み、第２の抗体重鎖はＳ１８３Ｅ変異を含み、第１の抗体軽鎖はＶ１３３Ｅ変異を含み、第１の抗体重鎖はＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）。いくつかの実施態様では、第２の抗体重鎖は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第１の抗体重鎖は、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）。

［００２０］本開示の他の態様は、真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを発現するための翻訳開始配列の組み合わせを同定するための方法であって、多量体ポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む、方法に関する。いくつかの実施態様では、方法は、複数の真核宿主細胞を含むライブラリを用意することであって、複数のそれぞれの真核宿主細胞が、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、かつ第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列の複数の組み合わせが複数の真核宿主細胞に表されている、ライブラリを用意することと、複数の真核宿主細胞による多量体ポリペプチドの発現に適した条件下で真核宿主細胞のライブラリを培養することと、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンによって発現された多量体ポリペプチドの量を測定することと、多量体ポリペプチドを発現する、一又は複数の、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンの、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列を同定することと、を含む。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドを発現する、一又は複数の、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンの、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列は、例えば４つの翻訳開始配列の参照又は異なる組み合わせと比較して、多量体ポリペプチド産生量が多いこと及び／又は誤対合した副産物のレベルが低いことに基づいて同定される。いくつかの実施態様では、複数の宿主細胞の各宿主細胞における第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべては、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である。

［００２１］本開示の他の態様は、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む多量体ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドを含むキット又は製造品に関する。いくつかの実施態様では、キット又は製造品は、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、ここで、それぞれのオープンリーディングフレームは天然に存在する宿主細胞ゲノムに存在する場合、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のうちの一又は複数はそのそれぞれのオープンリーディングフレームに作用可能に結合していない。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは二重特異性抗体であり、第１及び第３のポリペプチド鎖は抗体重鎖であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は抗体軽鎖であり、第１のサブユニットは、第１の抗原に結合する第１の半抗体であり、第２のサブユニットは、第２の抗原に結合する第２の半抗体である。

［００２２］いくつかの実施態様では、各サブユニットが個別に産生されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで産生される。いくつかの実施態様では、すべてのサブユニットが同じ宿主細胞によって産生されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで産生される。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットは、第２のサブユニットよりもより誤対合した副産物と組み合わさる。いくつかの実施態様では、すべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞において一緒に発現されるとき、第１のサブユニットは、第２のサブユニットよりもより誤対合した副産物と組み合わさる。

［００２３］本明細書に記載される実施態様のいずれかのいくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべては、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方は、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施態様では、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方は、配列ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号３）又はＧＡＡＧＴＡＴＧＡ（配列番号１１）を含む。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含み、第２の翻訳開始配列は、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含み、第３の翻訳開始配列は配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列は配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列は配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列は配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列は配列番号１１の配列を含む。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれは、プロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、第１及び第２のポリヌクレオチドは同じプロモーターに作用可能に結合しており、第３及び第４のポリヌクレオチドは同じプロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第３の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第２の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第２の翻訳開始配列は第３の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第２の翻訳開始配列と同じである。いくつかの実施態様では、第３の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列と同じである。本明細書に記載される実施態様のいずれかのいくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、一又は複数の標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは多重特異性抗原結合タンパク質である。

［００２４］本明細書では、配列番号８－１１からなる群より選択される翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドも提供される。本明細書では、第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む第１の翻訳開始配列と、第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む第２の翻訳開始配列と、第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した配列番号２の配列を含む第３の翻訳開始配列と、第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した配列番号１１の配列を含む第４の翻訳開始配列とを含む
ポリヌクレオチドのセットもさらに提供される。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列は配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列は配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列は配列番号１１の配列を含む。本明細書では、本明細書に記載される実施態様のいずれかによるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含む宿主細胞もまたさらに提供される。

［００２５］本明細書に記載される実施態様のいずれかのいくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドは、真核宿主細胞の一又は複数の染色体に組み込まれる。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドは、真核宿主細胞の同じ染色体座に組み込まれる。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドは、真核宿主細胞中の一又は複数の染色体外ポリヌクレオチドの一部である。いくつかの実施態様では、真核宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。いくつかの実施態様では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

［００２６］本明細書に記載の様々な実施態様の特性のうちの１つ、いくつか、又はすべてを組み合わせて、本発明の他の実施態様を形成することができることを理解されたい。本発明のこれら及び他の態様は、当業者に明らかであろう。本発明のこれら及び他の実施態様は、以下の発明を実施するための形態によってさらに説明される。

［００２７］特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面（複数可）を含む本特許又は特許出願公開のコピーは、申請に応じて、必要な手数料を支払うことにより、米国特許庁から提供されることになる。

［００２８］一過性トランスフェクションによって設計及び分析されたＫｏｚａｋ（Ｋｚ）配列バリアントの名称及びヌクレオチド配列を示す。開始コドンは、グレーであり、下線が引かれている。示されている配列は、配列番号３－７（上から下）に対応する。［００２９］Ｆｃ融合タンパク質Ａ及びＢの正規化された力価を、一過性トランスフェクションとそれに続く均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）によって試験された異なるコザック配列バリアントで示す。データは平均値として示され、エラーバーは４つの独立したトランスフェクションの標準偏差（ＳＤ）を表す。コザックコンセンサス配列の変化は、Ｆｃ融合タンパク質の力価を調節した。［００３０］コザックライブラリの設計、そのライブラリでの大腸菌細胞の形質転換、バリアントのヌクレオチド配列を決定するための配列決定、一過性トランスフェクションによるバリアントのスクリーニング、範囲内での分類及びバリアントの絞り込み、そして発現の範囲全体をカバーするバリアントの選択のためのプロセスを説明する。［００３１］上の行に野生型（ＷＴ）コザック配列を示す。下の行では、設計されたコザックライブラリが示されている。Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、又はＣのいずれかである。開始コドンは、グレーであり、下線が引かれている。開始コドンから－３及び＋４の位置が示されている。示されている配列は、それぞれ、配列番号２３及び１（上から下）に対応する。［００３２］ＣＨＯ細胞中に一過性トランスフェクトされた１１１のコザック配列バリアントの正規化された抗体力価を示す。データは平均値として示され、エラーバーは２つの独立したトランスフェクションの標準偏差（ＳＤ）を表す。０．０５から１．５４単位の正規化された力価のほぼ連続的な範囲の翻訳が観察された（１．０はＷｔコザック配列を使用して産生された力価に相当する）。［００３３］コザックライブラリの１０８のコロニーのヌクレオチド分布を示す。各位置の各ヌクレオチドのパーセンテージが示されている。分析されたバリアントのヌクレオチド分布はランダムであり、位置ごとに多様であり、これはライブラリスクリーニングが歪曲されていないことを示した。［００３４］コザックバリアントの数を減少させるために行われた、ＣＨＯ細胞における一過性トランスフェクションによるスクリーニングプロセスを示す。バリアントをラウンドツーラウンドで選択するための基準は、一過性トランスフェクション間の再現性、ＤＮＡ調製物間の安定性、及びヌクレオチド多様性の保存であった。［００３５］コザック配列バリアントの最終パネルの正規化された力価及び配列を示す。図８Ａは、ＣＨＯ細胞中に一過性トランスフェクトされた、示されたコザック配列バリアントの正規化された抗体力価を示す。データは平均値として示され、エラーバーは１１の独立したトランスフェクションの標準偏差を表す。１１のコザック配列バリアントは、Ｗｔコザックの０．２から１．３倍の発現範囲を示し、これは、高精度で力価の調節を可能にする。星印は、一過性のトランスフェクションで観察された幅広い発現レベルをカバーしていたためＷｔコザックを含む５つのバリアントの代表的なパネルとして選択されたコザック配列バリアントを示す。図８Ｂは、コザック配列バリアントの最終パネルの配列を示す。Ｗｔコンセンサスコザック配列は、ボックスで囲まれている。［００３６］軽鎖の比（ＬＣ１：ＬＣ２）を操作することによって、高割合の正しく組み立てられたＢｓＡｂが得られることを示す。例えば、ＬＣ１：ＬＣ２比を１：２．５から１．５：１に修正することにより、正しく対合された軽鎖が４０％増加する。［００３７］Ｗｔコザックに対する（１×）列記されたコザックバリアントの翻訳強度を示す。挙げられたコザックバリアントの配列を右に示す。一過性のトランスフェクションで観察された幅広い発現レベルをカバーしていたため、これらのコザック配列バリアントはＷｔコザックを含む５つのバリアントの代表的なパネルとして選択された。配列は、配列番号８、９、１０、２、及び１１（上から下）に対応する。［００３８］Ａｂ１／Ａｂ２ＢｓＡｂの各群の２５の組み込み発現ベクターを発生させるのに使用されるコザックバリアントの組み合わせを示す。５０のプラスミドの混合物をＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした。このアプローチで生成された多様性は、潜在的な６２５の異なる鎖比の組み合わせに達した。Ａｂ１についての組み合わせのみが示されているが、Ａｂ２群のベクターの生成に同じ組み合わせが使用された。［００３９］示されているコザック混合プールのトランスフェクション効率及びトランスフェクション数を示す。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ｈｕＩｇＧ抗体での細胞表面染色分析を実施すること及びフローサイトメトリーによって抗体－ＡＰＣ発現を測定することにより、トランスフェクション効率をモニタリングする。空の宿主を使用して、Ａｂ発現陰性細胞及びＧＦＰ陽性細胞のゲートを設定した。Ｘ軸はＧＦＰ発現を示し、Ｙ軸はＡＰＣ－抗体発現を示す。同様のトランスフェクション効率が、コザック混合プールとＷｔコザックプールの両方について観察された。［００４０］安定なプール回収の時間経過を示す。条件ごとに２つのプールが示されている。安定なプールを確立するための選択薬物の追加を矢印で示す。Ｙ軸は生存率を示し、Ｘ軸は選択薬物の追加後の日数を示す。［００４１］各トランスフェクション及び条件から選択され、単一細胞クローニングを施された、コザック混合クローン又はＷｔコザッククローンの７０４の個別のクローンの絶対的力価を示す。ＨＴＲＦによって力価を測定した。示されているようにトランスフェクション数に基づいてペアで示す。［００４２］コザック混合クローン及びＷｔ－コザッククローンの１４日間の振盪フラスコフェッドバッチ産生の生存率を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は生存率を示す。トランスフェクション数が示されている。調査したすべてのクローンは、産生アッセイ全体で同等の生存率を示した。１４日目の最終生存率は、７４％の生存率の結果となった１つのコザック混合クローンを除き、両条件でおよそ８０－９５％であった。［００４３］コザック混合クローン及びＷｔ－コザッククローンの１４日間の振盪フラスコフェッドバッチ産生の生細胞数を示す。Ｘ軸は日数を示し、Ｙ軸は１ミリリットル／１０^６あたりの生細胞を示す。トランスフェクション数が示されている。指数関数的成長率が７日目まで観察され、続いて、すべての個別のクローンについてプラトー期が達成された。［００４４］各トランスフェクションの上位１１のコザック混合クローン及びＷｔコザッククローンの一般的な絶対的力価を示す。振盪フラスコフェッドバッチ産生の１４日目に力価を測定した。個別のＷｔコザッククローンは、両トランスフェクションにおいて個別のコザック混合クローンよりも高い一般的な絶対的抗体力価を示した。力価は、正しく組み立てられた二重特異性抗体並びに半抗体及び他の望ましくない副産物を表したことに留意されたい。［００４５］各トランスフェクションの上位１１のコザック混合及びＷｔコザックの組み立てられた抗体の品質を評価する。非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）によってサンプルを分析して、２つの抗体フォーマット：正しく組み立てられたＢｓＡｂと正しく組み立てられていないＢｓＡｂのフォーマットの完全抗体（ｆｕｌｌ－ａｂ）と同等視されたメインピークと、異なる分子量の他の種を表すプレピークの合計とを区別及び定量化した。トランスフェクション数が示されている。上位２２のクローン内では、Ｗｔコザッククローンよりも、完全ａｂ形成の割合が高いコザック混合クローンは少なかった。［００４６］中程度（Ｍで表す）のＨＣＣＦ力価のコザック混合クローン及び低い（Ｌで表す）ＨＣＣＦ力価のコザック混合クローンの品質及び組み立て効率を示す。図１９Ａは、１４日目に振盪フラスコフェッドバッチ産生アッセイによって測定された、３つの中程度のコザック混合クローン及び４つの低いコザック混合クローンの一般的な絶対的力価を示す。これらのクローンの産生力価は、一次スクリーニングにおいて以前観察されたのと同様の挙動を示した。図１９Ｂは、中程度のコザック混合クローン及び低いコザック混合クローンの組み立てられた抗体の品質を評価する。非還元ＣＥ－ＳＤＳによってサンプルを分析して、誤対合した副産物と正しく組み立てられたＢｓＡｂの形態の完全抗体（ｆｕｌｌ－ａｂ）と同等視されたメインピークと、異なる分子量の他の種を表すプレピークの合計とを区別及び定量化した。一般的な力価と完全抗体の最高含有量との間に直接的な相関関係はなかった。例えば、上位１１のクローンと比較してより穏やかな力価を有する一部のコザック混合クローンは、約５０－６０％の完全ａｂの同様の割合を示した。［００４７］示されているＷｔコザック及びコザック混合クローンの品質及び効果定なＢｓＡｂ力価を示す。図２０Ａは、８つのコザック混合クローン及び８つのＷｔコザッククローンの質量分光光度法によって検出された種を定量化する。各種の構造が凡例に示されている。正しく組み立てられたＢｓＡｂは、白色でハイライトされている。最良の個別のコザック混合クローンは、正しく組み立てられたＢｓＡｂの約４０％を示した。これは最良の個別のＷｔコザッククローン（約１８％）の２倍超である。図２０Ｂは、二重特異性抗体及びさまざまな誤対合した副産物及び半抗体種の推定力価を示す。推定力価は、一般的な力価を乗じた各フォーマットの割合として計算された。二重特異性の効果的な力価は、白色でハイライトされている。一部のコザック混合クローンはＷｔコザッククローンよりもＢｓＡｂのアセンブリが高いという事実により、一部のコザック混合クローンは、図１７で先に示されている一般的な力価の不足を打開する。［００４８］示されているコザック混合クローンのコザック配列バリアント組み合わせ及び翻訳強度を示す。図２１Ａは、コザック混合クローンのコザック配列バリアント組み合わせを示す。グレーでハイライトされているのは、得ることができなかった配列決定データである。各コザック配列バリアントの名称及び翻訳強度を右に示す。図２１Ｂは、最良の抗体産生コザック混合クローンのコザック配列バリアント組み合わせを示す。コザック混合クローンの名称及びトランスフェクション数が示されている。グレーでハイライトされているのは、得ることができなかった配列決定データである。図２１Ｃは、３つの中程度のコザック混合クローン（Ｍで表す）及び４つの低いコザック混合クローン（Ｌで表す）のコザック配列バリアント組み合わせを左に示す。各コザック配列バリアントの名称及び翻訳強度を右に示す。グレーでハイライトされているのは、得ることができなかった配列決定データである。［００４９］Ｗｔコザッククローン５０並びにコザック混合クローン６９及び１７Ｍの質量分析による、二重特異性抗体、誤対合した副産物、及び半抗体種の定量化を示す。正しく組み立てられた二重特異性抗体は、白色でハイライトされている。［００５０］一般的な力価を乗じた各種の割合として計算された、二重特異性抗体、誤対合した副産物、半抗体種の効果的な力価を右に示す。正しく組み立てられた二重特異性抗体は、白色でハイライトされている。［００５１］クローン１７Ｍの産生パフォーマンスを上に示す。このクローンのＣＥ－ＳＤＳデータは、産生物品質が、完全ａｂの約４８％及び半ａｂの約５２％であることを示す。質量分析データは、約４８％の完全ａｂのうち、そのすべてが正しく組み立てられた二重特異性抗体を表すことを示した。一方、半ａｂ種のほぼすべてはノブ 1/2 Ａｂ２であった。これは、Ａｂ２の重鎖及び軽鎖は、それぞれ、Ｗｔコザック配列及び最強のコザック配列バリアント＃２２８の下にあったという事実と一致している。各コザック配列バリアントの名称及び翻訳強度を下に示す。クローン１７Ｍは、弱いコザック配列バリアント下でＡｂ１の重鎖及び軽鎖の両方を保有した。［００５２］示されている中程度及び低いコザック混合クローンの質量分光光度法により、二重特異性抗体、誤対合した副産物、及び半抗体フォーマットを定量化する。コザック混合クローン１７を除き、ＢｓＡｂアセンブリの割合は１０％未満であった。各種の絶対的存在数は、各鎖の発現強度と相関した。

Ｉ．定義
［００５３］本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物又は生体系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施態様を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。

［００５４］本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、２つ以上のかかる分子の組み合わせを任意に含むといった具合である。

［００５５］本明細書で使用される「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値又はパラメータへの言及は、その値又はパラメータ自体を対象とする実施態様を含む（かつ説明する）。

［００５６］本明細書に記載される本開示の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、態様及び実施態様「からなる」、及び態様及び実施態様「から本質的になる」を含むことを理解されたい。

［００５７］「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように交換可能に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、又は介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分若しくは毒素とのコンジュゲーションにより修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の一又は複数の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もまたこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗体及び抗原結合タンパク質を具体的に包含する。

［００５８］本明細書で使用される「多量体」ポリペプチド又はタンパク質は、１を超えるポリペプチド又はタンパク質モノマー（例えばポリペプチド鎖）を含む任意の複合体を指す場合がある。例えば、多量体ポリペプチド又はタンパク質は、二つ以上のサブユニットを含む複合体を指すことがあり、各サブユニットは、１、２、又はそれ以上の異なるポリペプチド鎖を含む。「多量体」ポリペプチド又はタンパク質という用語は、抗体及び抗原結合タンパク質を具体的に包含する。特定の実施態様では、多量体ポリペプチドは、二重特異性抗体である。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、第１の重鎖、第１の軽鎖、第２の重鎖、及び第２の軽鎖を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４アイソタイプである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。

［００５９］多量体ポリペプチド又はタンパク質の成分を参照して使用されるとき、本明細書で使用される「サブユニット」という用語は、１を超える異なるポリペプチド鎖を含有する任意のポリペプチドを指すことが意図される。いくつかの実施態様では、サブユニットは、一又は複数のジスルフィド結合を含むが、これに限定されない、一又は複数の分子間結合を介して共に結合する２つ以上のポリペプチドの高分子複合体を含み得る。特定の実施態様では、サブユニットは免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を含む。特定の実施態様では、サブユニットは半抗体を含む。特定の実施態様では、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又は半抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４アイソタイプである。特定の実施態様では、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又は半抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４アイソタイプである。特定の実施態様では、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖又は半抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである。

［００６０］本明細書で使用される「誤対合した副産物」は、望ましくない配置での多量体ポリペプチドの一又は複数のポリペプチド鎖の構成要素のアセンブリを指す。例えば、多量体ポリペプチドがサブユニット軽鎖Ｂ／重鎖Ｂと会合したサブユニット軽鎖Ａ／重鎖Ａを含む二重特異性抗体である場合、誤対合した副産物は、重鎖Ａ二量体、重鎖Ｂ二量体の産生中の誤対合、及び／又は、軽鎖Ａ／重鎖Ａ及び軽鎖Ｂ／重鎖Ｂサブユニットのうちの一又は複数の誤対合から生じることがあり、正しく組み立てられた二重特異性抗体以外の任意の産生物を含むことがある。誤対合した副産物の具体例は、図２０Ａ、２０Ｂ、及び２２Ａ－２２Ｄを参照して記載されており、それらの図面で説明されている。また、ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌＳｃａｎｎｉｎｇＦｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ、ＭＳなどのタンパク質の折り畳みを評価するための他の方法、又はｉｎｓｉｌｉｃｏツールを用いて生産結果を予測するための方法も使用され得る。

［００６１］本明細書で使用される「翻訳開始配列」という用語は、開始コドンと、オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドの隣接塩基とを含む、ポリヌクレオチド配列を指す。翻訳走査モデルによれば、リボソーム開始前複合体は、ポリヌクレオチドの５’末端に結合し、停止コドンを探して３’方向に直線的に進む。翻訳開始配列は、翻訳開始の走査モデルを詳述するＭａｒｉｌｙｎＫｏｚａｋの研究に基づく「コザック」配列（例えば、ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８１；９（２０）：５２３３－５２；ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７；１５（２０）：８１２５－４８；ＫｏｚａｋＭ．ＥＭＢＯＪ．１９９７；１６（９）：２４８２－９２；ＫｏｚａｋＭ．ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９８７；１９６（４）：９４７－５０；ＨａｍｉｌｔｏｎＲ，ＷａｔａｎａｂｅＣＫ，ｄｅＢｏｅｒＨＡ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７；１５（８）：３５８１－９３；ＣａｖｅｎｅｒＤＲ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７；１５（４）：１３５３－６１；ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８４；１２（２）：８５７－７２；ＧｕｐｔａＰ，ＲａｎｇａｎＬ，ＲａｍｅｓｈＴＶ，ＧｕｐｔａＭ．ＪＴｈｅｏｒＢｉｏｌ．２０１６；４０４：３０３－１１；ＧｒｚｅｇｏｒｓｋｉＳＪ，ＣｈｉａｒｉＥＦ，ＲｏｂｂｉｎｓＡ，ＫｉｓｈＰＥ，ＫａｈａｎａＡ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１４；９（９）：ｅ１０８４７５；及びＫｏｚａｋＭ．Ｃｅｌｌ．１９８６；４４（２）：２８３－９２を参照）、及び本明細書に記載されるバリアントなコザック配列を含み得る。

一又は複数の遺伝要素（例えば、ポリペプチド、プロモーター、翻訳単位、又はそれらの組み合わせをコードする）に関して本明細書で使用される「天然」及び「非天然」という用語は、自然界で発生する宿主細胞染色体中の遺伝要素のゲノム状況を指すことを意図している。例えば、ポリペプチド（例えば多量体ポリペプチド）は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム中に天然に存在するとき、宿主細胞又は宿主細胞染色体に関して「天然」であり、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞のゲノム中に天然に存在しないとき、「非天然」である。翻訳開始配列又はオープンリーディングフレームは、翻訳開始配列又はオープンリーディングフレームが宿主細胞のゲノム中に天然に存在するとき、宿主細胞又は宿主細胞染色体に関して「天然」であり、翻訳開始配列又はオープンリーディングフレームが宿主細胞のゲノム中に天然に存在しないとき、「非天然」である。翻訳開始配列とオープンリーディングフレームの作用可能な組み合わせは、翻訳開始配列が宿主細胞のゲノム中にオープンリーディングフレームと同じ作用可能な結合で天然に存在しないとき、又はその逆であるとき、「非天然」である。例えば、翻訳開始配列：オープンリーディングフレームの組み合わせは、翻訳開始配列及びオープンリーディングフレームの一方又は両方が、宿主細胞ゲノム中に天然に存在しないとき、翻訳開始配列が、（たとえ、同じ翻訳開始配列が、宿主細胞ゲノム中のどこか他の場所に天然に存在する場合であっても）天然に存在する宿主細胞ゲノムにおいて作用可能に組み合わされていないオープンリーディングフレームと、作用可能に結合して宿主細胞ゲノム中に存在するとき、又はオープンリーディングフレームが、（たとえ、同じオープンリーディングフレーム配列が、宿主細胞ゲノム中のどこか他の場所に天然に存在する場合であっても）天然に存在する宿主細胞ゲノム中に作用可能に組み合わされていない翻訳開始配列と作用可能に結合して宿主細胞ゲノム中に存在するときに、宿主細胞又は宿主細胞染色体に関して「非天然」である。

［００６３］本明細書で使用される「ベクター」という用語は、結合している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すように意図される。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは環状二本鎖ＤＮＡループを指し、これに追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る。別の種類のベクターは、ファージベクターである。別の種類のベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、複製起点を有するベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作用可能に結合する遺伝子の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書において「組み換え発現ベクター」（又は単純に「組み換えベクター」）と称される。一般に、組み換えＤＮＡ技法における利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、同義に使用され得る。

「作用可能に結合した」は、２つ以上の構成要素の並立を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。一般的に、「作用可能に結合する」ＤＮＡ配列は、必ずしも隣接しているわけではないが、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、又は分泌リーダーの場合には、隣接し、かつリーディングフレーム内にある。しかしながら、作用可能に結合したプロモーターは、概して、コード配列又は翻訳単位の上流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。作用可能に結合されたエンハンサーは、プロモーターから相当な距離を置いて、コード配列／翻訳単位の上流、その中、又はその下流に位置し得る。結合は、当該技術分野で既知の組み換え方法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、アニールによって、又は都合の良い制限部位でのライゲーションによって、達成される。都合の良い制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、慣行に従って使用される。

［００６５］「プロモーター」は、遺伝子又はそれが作用可能に結合している配列の転写を制御するポリヌクレオチド配列を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写の開始のためのシグナルを含む。使用されるプロモーターは、選択された配列の発現が企図される細胞型の宿主細胞において機能的となる。構成型プロモーター、誘導型プロモーター、抑制型プロモーターを含む数多くのプロモーターが当該技術分野で知られている（また、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースで同定されている）。

［００６６］「宿主細胞」（又は「組み換え宿主細胞」）という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝的に改変されているか、又は組み換えプラスミド若しくはベクターなどの外因性若しくは非天然ポリヌクレオチドの導入よって遺伝的に改変されることができる細胞を指すように意図される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すように意図されることを理解されたい。突然変異又は環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代においてある特定の修飾が起こる場合があるため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

［００６７］本明細書の「抗原」という用語は、最も広義に使用され、限定されないが、低分子ペプチド抗原、完全長タンパク質抗原、炭水化物抗原、脂質抗原、及び核酸抗原を含む、ポリペプチド抗原と非ポリペプチド抗原の両方のさまざまな形態を包含する。

［００６８］本明細書の「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と交換可能に使用される。

［００６９］「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定及び分離され、かつ／又は回収された抗体である。その自然環境の夾雑物成分は、抗体の試験的、診断的、又は治療的使用を妨害するであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質が挙げられる。いくつかの実施態様では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって決定される、９５重量％超、いくつかの実施態様では、９９重量％超になるまで、（２）例えば、スピニング・カップ・シークエネーターを使用して、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）例えば、クマシーブルー又は銀染色を使用して、還元又は非還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質性が得られるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組み換え細胞内のｉｎｓｉｔｕ抗体を含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。

［００７０］「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含有する可変ドメインである免疫グロブリンの他の部分と比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３（集合的に、ＣＨ）ドメイン、並びに軽鎖ＣＨＬ（又はＣＬ）ドメインを含有する。

［００７１］抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「Ｖ_Ｈ」と称され得る。軽鎖の可変ドメインは、「Ｖ_Ｌ」と称され得る。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含む。

［００７２］「可変」という用語は、可変ドメインのある特定の部分の配列が抗体間で広く異なり、かつ各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方における超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、ベータ－シート構造を接続し、かついくつかの場合では、ベータ－シート構造の一部を形成するループを形成する３つのＨＶＲによって接続されたベータシート立体配置を大いに採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内のＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して互いに保持され、他方の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＦｉｆｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与等の様々なエフェクター機能を呈する。

［００７３］任意の哺乳動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明らかに異なるタイプのうちの一方に割り当てられ得る。

［００７４］本明細書で使用されるＩｇＧ「アイソタイプ」又は「サブクラス」という用語は、それらの定常領域の化学的及び抗原的特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのうちのいずれかを意味する。

［００７５］それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、γ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元構成が周知であり、例えば、Ａｂｂａｓら、ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．、２０００）に一般的に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有又は非共有会合によって形成されるより大きい融合分子の一部であり得る。

［００７６］「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、以下に記載の抗体断片ではない、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために本明細書で同義に使用される。これらの用語は、具体的には、Ｆｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。

［００７７］「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。いくつかの実施態様では、本明細書に記載の抗体断片は、抗原結合断片である。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。

［００７８］抗体のパパイン消化により、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と、容易に結晶化するその能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が産生される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、かつ依然として抗原を架橋することができるＦ（ａｂ’）_２断片がもたらされる。

［００７９］「Ｆｖ」とは、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。一実施態様では、二本鎖Ｆｖ種は、密接に非共有会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造に類似の「二量体」構造で会合し得るように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合し得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義するのは、この立体配置においてである。集合的に、６つのＨＶＲが抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、全結合部位よりも低い親和性であるが、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的なＨＶＲを３つしか含まないＦｖの半分）でさえも、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

［００８０］Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖定常ドメイン及び第１の重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されているという点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

［００８１］「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖに関するレビューについては、例えば、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎのＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙｏｆＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９４）、２６９～３１５頁を参照されたい。

［００８２］「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、これらの断片は、同じポリペプチド鎖内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ－ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、二価又は二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ１９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９～１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４～６４４８（１９９３）において、より完全に記載されている。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９～１３４（２００３）においても記載されている。

［００８３］本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な変異、例えば、天然に存在する変異を除いて同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。特定の実施態様では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、該標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られたものである。例えば、この選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組み換えＤＮＡクローンのプール等の複数のクローンからの特有のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列が、例えば、標的への親和性を改善し、標的結合配列をヒト化し、細胞培養物におけるその産生を改善し、ｉｎｖｉｖｏでのその免疫原性を低減し、多重特異性抗体を作製するなどのために、さらに改変されてもよく、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示のモノクローナル抗体でもあることを理解されたい。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンによる混入がないという点で有利である。

［００８４］「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、原核宿主細胞における発現、ハイブリドーマ法（例えば、ＫｏｈｌｅｒａｎｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏｅｔａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３－２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，２ｎｄｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇｅｔａｌ．，ｉｎ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ－ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ５６３－６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）、ファージディスプレイ技法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４－６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９－３１０（２００４）；Ｌｅｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３－１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（３４）：１２４６７－１２４７２（２００４）；及びＬｅｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２８４（１－２）：１１９－１３２（２００４）を参照）、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座又は遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技法（例えば、国際公開第１９９８／２４８９３号；同第１９９６／３４０９６号；同第１９９６／３３７３５号；同第１９９１／１０７４１号；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５－２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎｅｔａｌ．，ＹｅａｒｉｎＩｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９－７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６－８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ３６８：８１２－８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；並びにＬｏｎｂｅｒｇａｎｄＨｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５－９３（１９９５）を参照）を含む多数の技法によって作製され得る。

本明細書で使用されるとき、「超可変領域」、「ＨＶＲ」、又は「ＨＶ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。天然抗体では、Ｈ３及びＬ３が、６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示し、特にＨ３が抗体に優れた特異性を与える上で特有の役割を果たすと考えられている。例えば、Ｘｕｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１３：３７－４５（２０００）；ＪｏｈｎｓｏｎａｎｄＷｕ，ｉｎＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２４８：１－２５（Ｌｏ，ｅｄ．，ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる、天然に存在するラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的であり、安定している。例えば、Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ３６３：４４６～４４８（１９９３）、Ｓｈｅｒｉｆｆら、ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３～７３６（１９９６）を参照されたい。

［００８６］いくつかのＨＶＲ描写が本明細書で使用され、本明細書に包含されている。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））。代わりに、Ｃｈｏｔｈｉａは、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））。ＡｂＭＨＶＲは、ＫａｂａｔＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループとの間の妥協案を示し、ＯｘｆｏｒｄＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づく。これらＨＶＲの各々に由来する残基が、以下に示される。

［００８７］ＨＶＲは、以下の「伸長ＨＶＲ」を含み得る：ＶＬにおいて、２４～３６又は２４～３４（Ｌ１）、４６～５６又は５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７又は８９～９６（Ｌ３）、並びにＶＨにおいて、２６～３５（Ｈ１）、５０～６５又は４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、又は９５～１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義の各々について、Ｋａｂａｔら（上記参照）に従って番号付けされる。

［００８８］「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

［００８９］「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔら（上記参照）における抗体の編集物の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮、又はそれへの挿入に対応する、より少ないアミノ酸又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従う残基５２ａ）を含み、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従う残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、抗体の配列と「標準の」Ｋａｂａｔによって番号付けされた配列との相同領域での整列によって決定され得る。

［００９０］Ｋａｂａｔ番号付けシステムは一般に、可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１～１０７及び重鎖の残基１～１１３）内の残基に言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈＥｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域における残基について言及するときに使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上記参照）で報告されるＥＵインデックス）。

［００９１］「直鎖状抗体」という表現は、Ｚａｐａｔａら（１９９５ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ、８（１０）：１０５７～１０６２）に記載されている抗体を指す。簡潔には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は、二重特異性又は単一特異性であり得る。

ＩＩ．多量体ポリペプチドの産生及びスクリーニングの方法
［００９２］本明細書では、真核宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において多量体ポリペプチドを産生する方法が提供される。いくつかの実施態様では、方法は、多量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、多量体ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、多量体ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、多量体ポリペプチドの第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む真核宿主細胞を用意することと、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖が多量体ポリペプチドを形成する、真核宿主細胞を培養することと、真核宿主細胞によって産生された多量体ポリペプチドを回収することとを含む。

［００９３］いくつかの実施態様では、各ポリペプチド鎖が真核宿主細胞において個別に産生されるとき、第１のサブユニットは第２のサブユニットよりも低いレベルで産生され、又は両方のポリペプチド鎖が同じ真核宿主細胞によって一緒に産生されるとき、第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方は、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方よりも弱い。いくつかの実施態様では、各サブユニットは、抗体重鎖及び抗体軽鎖を含む半抗体を含み、多量体ポリペプチドは二重特異性抗体である。

［００９４］本明細書に記載される産生方法は、少なくとも部分的には、異なる翻訳開始配列を使用する翻訳強度の調整により、多量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）アセンブリを改善することができ、誤対合した副産物などの産生物関連不純物を減少させることができるという本明細書中の実証に基づく。驚くべきことに、選択されたポリペプチド鎖の翻訳の減少は、多量体ポリペプチドの他のポリペプチド鎖の翻訳レベルと比べて、多量体ポリペプチドアセンブリを効率的に増加させることができ、誤対合した副産物の蓄積を制限することによって全体的な産生物品質を改善できることがわかった。理論に縛られることを望むことなく、最強の翻訳開始配列の下でのいくつかのポリペプチド鎖の産生は、実際には、より正確に組み立てられた多量体ポリペプチドの代わりに、その鎖を含むより誤対合した副産物の生成を促したと考えられる。したがって、二重特異性抗体などの多量体ポリペプチドの組立を減速させ得る二重特異性抗体などの多量体ポリペプチドの一又は複数の鎖の翻訳の下方制御は、実際には、組み立て効率と、望ましくない誤対合した副産物の減少にプラスの影響を与え得る。そのため、本明細書に記載される方法は、高レベルの多量体ポリペプチド発現を可能にするだけでなく、それらの除去するためのコストのかかる精製方法の必要性などの負担を課す誤対合した副産物などの不純物の産生も減少させる。

［００９５］いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞で個別に産生されるとき、又はすべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞で一緒に産生されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで翻訳される。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞で個別に産生されるとき、又はすべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞で一緒に産生されるとき、第１のサブユニットは第２のサブユニットよりもより誤対合した副産物と組み合わさる。いくつかの実施態様では、第２のサブユニットのポリペプチド鎖の一又は複数（例えば、一方又は両方）と結合した翻訳開始配列と比較して、第１のサブユニット（例えば、宿主細胞においてより弱いか又はより困難なエクスプレッサーであるサブユニット）のポリペプチド鎖のうちの一又は複数（例えば、一方又は両方）と作用可能に連結した弱い翻訳開始配列を使用することにより、多量体ポリペプチドの産生量が多くなり、かつ／又は誤対合した副産物が少なくなる。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも遅い速度で翻訳される。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖は、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりもゆっくりとかつ／又は効率的でなく折り畳まれる。いくつかの実施態様では、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットは、第２のサブユニットよりも遅い速度で組み立てられる。タンパク質の翻訳速度を測定するためのアッセイは、当該技術分野で知られており、限定されないが、３５Ｓメチオニン標識及びリボソームプロファイリングが含まれる（例えば、Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．（２０１６）Ｃｅｌｌ１６５：２２－３３を参照）。

［００９６］本明細書に記載されるとおり、いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは２つのサブユニットを含む。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニットは、２本以上のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニットは、２本のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームに作用可能に結合した翻訳開始配列を含む。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは２つのサブユニットを含み、各サブユニットは２本のポリペプチド鎖を含み、多量体ポリペプチドの第１のサブユニットは、各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき又はすべてのサブユニットが同じ真核宿主細胞で一緒に発現されるとき、第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、第１の翻訳開始配列（第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合）及び第２の翻訳開始配列（第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合）のうちの一方又は両方は、第３の翻訳開始配列（第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合）及び第４の翻訳開始配列（第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合）のうちの一方又は両方よりも弱い。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、二重特異性抗体である。

［００９７］いくつかの実施態様では、本開示のサブユニット又は半抗体は、各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、別のサブユニット又は半抗体よりも低いレベルで発現される。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニット又は半抗体は、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、別のサブユニット又は半抗体よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％低いレベルで発現される。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニット又は半抗体は、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、別のサブユニット又は半抗体よりも少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍低いレベルで発現される。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニット又は半抗体は、例えば各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、別のサブユニット又は半抗体よりも０．２倍から０．８倍、０．８倍未満、０．５倍未満、又は０．３倍未満のレベルで発現される。

［００９８］いくつかの実施態様では、方法は、二重特異性抗体の第１の抗体重鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、二重特異性抗体の第１の抗体軽鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、二重特異性抗体の第２の抗体重鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、二重特異性抗体の第２の抗体軽鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む真核宿主細胞を用意することと、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、第１、第２、第３、及び第４の抗体重鎖が二重特異性抗体を形成する、真核宿主細胞を培養することと、真核宿主細胞から二重特異性抗体を回収することとを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、２つの抗原に特異的に結合する（例えば、第１の抗体重鎖及び軽鎖は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、第２の抗体重鎖及び軽鎖は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する）。

［００９９］いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は効率／発現と比較して、翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームの翻訳効率及び／又は発現が低くなるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。真核宿主細胞においてさまざまな翻訳開始配列の強度を比較するのに適した方法が、本明細書に記載及び例示される。例えば、一過性のトランスフェクタント又は安定したトランスフェクタントを培養し、多量体のポリペプチドの産生を測定することができる。フェドバッチ培養又は灌流培養を行い、細胞培地中又は細胞表面上の産生物の力価を測定することができる。表面発現については、細胞を抗体で染色して、産生物を検出し、例えばフローサイトメトリーにより、分析することができる。産生物の質及び／又は純度は、例えば電気泳動及び／又は質量分析などを用いて評価することができる。

［０１００］いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％弱い。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は効率と比較して（例えば、上に記載されるように測定したとき）、翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの翻訳効率が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％低くなるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は発現レベルと比較して（例えば、上に記載されるように測定したとき）、翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの発現が少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、５％から３０％、５％から５０％、５％から７５％、１０％から３０％、１０％から５０％、１０％から７５％、２５％から５０％、２５％から７５％、２５％から１００％、５０％から７５％、５０％から１００％、又は７５％から１００％低くなるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。

［０１０１］いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列よりも少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍弱い。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は効率と比較して（例えば上に記載されるように測定したとき）、翻訳開始配列と作用可能に結合したオープンリーディングフレームの翻訳効率が少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍低くなるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は発現レベルと比較して（例えば、上に記載されるように測定したとき）、翻訳開始配列と作用可能に結合したオープンリーディングフレームの発現が少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、１．３倍から３倍、１．５倍から３倍、２倍から１０倍、２倍から５倍、３倍から５倍、３倍から１０倍、５倍から１０倍、又は７倍から１０倍低くなるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列は、別の翻訳開始配列と作用可能に結合した同じオープンリーディングフレームの参照又は発現レベルと比較して（例えば、上に記載されるように測定したとき）、翻訳開始配列と作用可能に結合したオープンリーディングフレームの発現が０．２倍から０．８倍、０．８倍未満、０．５倍未満、０．３倍未満になるとき、別の翻訳開始配列よりも弱いと言われる。

［０１０２］いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第３の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第２の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第２の翻訳開始配列は第３の翻訳開始配列よりも弱い。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第２の翻訳開始配列と同じである。いくつかの実施態様では、第１の翻訳開始配列は第２の翻訳開始配列とは異なる。いくつかの実施態様では、第３の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列と同じである。いくつかの実施態様では、第３の翻訳開始配列は第４の翻訳開始配列とは異なる。

［０１０３］いくつかの実施態様では、本開示の方法は、例えば、既存の方法を使用する多量体ポリペプチドの産生と比較して、真核宿主細胞における多量体ポリペプチドの産生量をより高くする。いくつかの実施態様では、本開示の方法は、例えば、既存の方法を使用する多量体ポリペプチドの産生と比較して、真核宿主細胞における多量体ポリペプチドの産生量を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％高くする（例えば、より高レベルの、正しく組み立てられた、二重特異性抗体などの多量体ポリペプチド）。例えば、発現は、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾の翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む発現、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む発現と比較することができる。

［０１０４］いくつかの実施態様では、本開示の方法は、例えば、既存の方法を使用する多量体ポリペプチドの産生と比較して、真核宿主細胞における多量体ポリペプチドの誤対合した副産物の量を少なくする。いくつかの実施態様では、本開示の方法は、例えば、既存の方法を使用する多量体ポリペプチドの産生と比較して、真核宿主細胞における多量体ポリペプチドの誤対合した副産物の量を少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％少なくする。本開示の方法は、製造において下方制御精製を実施する点で有利であるが、これは、細胞培養上清中の不純物（例えば、誤って空気化された副産物）が少ないためである。いくつかの実施態様では、産生は、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾の翻訳開始配列に作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む産生、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む産生と比較することができる。いくつかの実施態様では、誤対合した副産物の量は、一又は複数の特異的な誤対合した副産物の量を指す。いくつかの実施態様では、誤対合した副産物の量は、すべての誤対合した副産物の総量を指す。

［０１０５］いくつかの実施態様では、本開示の方法は、１：１：１：１の鎖比で本開示の多量体ポリペプチドの４つのサブユニットを表すのに使用することができる。ただし、本明細書に記載される方法は、例えば、正しく対合した多量体ポリペプチドの発現及び／又は組立を改善するために、他の所望の鎖比で本開示の多量体ポリペプチドの４つのサブユニットの発現を調整するのに使用することもできる。例えば、抗体軽鎖が抗体重鎖のシャペロンとして機能し得ることは十分文書化されており（例えば、Ｌｅｅ，Ｙ．Ｋ，ｅｔａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ１０：２２０９－２２１９を参照のこと）、軽鎖の発現が高いことは、製造中に有利になる可能性がある。このため、いくつかの実施態様では、本開示の方法は、重鎖の発現に対して、二重特異性抗体の一方又は両方の軽鎖の発現を増加させるのに使用される。さらに、本明細書で提供されるデータは、いくつかの場合、軽鎖１：軽鎖２の比率を操作することにより、正しく組み立てられた二重特異性抗体の産生量を高くすることができることを実証する。このため、いくつかの実施態様では、本開示の方法は、他の軽鎖の発現に対して、二重特異性抗体の一つの軽鎖の発現を増加させるのに使用される。いくつかの実施態様では、本明細書で決定され得る、二重特異性抗体の最適な産生方法に応じて、本開示の方法は、１：１：１：１の鎖比又は別の鎖比で二重特異性抗体の４本のポリペプチド鎖を発現するのに使用され得る。

［０１０６］いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のうちの一又は複数は、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべては、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である。いくつかの実施態様では、第１のサブユニット（例えば、多量体ポリペプチドのより弱く発現するサブユニット）のポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレームに作用可能に結合した一方又は両方の翻訳開始配列は、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施態様では、第２のサブユニット（例えば、多量体ポリペプチドのより強く発現するサブユニット）のポリペプチド鎖をコードするオープンリーディングフレームに作用可能に結合した一方又は両方の翻訳開始配列は、配列番号２、３、及び１１からなる群より選択される配列を含む。

［０１０７］例示的な翻訳開始配列を表２に示す。例示的な翻訳開始配列の相対強度を図１０に示す。

［０１０８］いくつかの実施態様では、翻訳開始配列の翻訳効率（すなわち、強度）は、参照と比較される。いくつかの実施態様では、参照は、宿主細胞中野生型コザック配列を含む翻訳開始配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号２又は３のポリヌクレオチド配列を含む。翻訳開始配列の相対強度を決定するのに適した例示的なアッセイが本明細書で記載及び例示される（例えば、実施例１－３を参照）。いくつかの実施態様では、翻訳開始配列の強度は、オープンリーディングフレーム（例えば、本開示のポリペプチド、サブユニット、又は多量体ポリペプチド、例えば抗体又は半抗体をコードする）に作用可能に結合した翻訳開始配列を含むポリヌクレオチドを（例えば一過性のトランスフェクションの後に）宿主細胞において発現すること、及びポリペプチド産物の産生を測定することによって評価される。いくつかの実施態様では、ポリペプチド産物の産生レベル（例えば、産生物力価）は、オープンリーディングフレームが宿主細胞において活性な野生型コザック配列などの参照翻訳開始配列に作用可能に結合した同じ宿主細胞型の同じ産物の産生レベルなどの参照と比較される。例示的な翻訳開始配列の相対強度を図１０に示す。例えば、一過性のトランスフェクタント又は安定したトランスフェクタントを培養し、多量体のポリペプチドの産生を測定することができる。フェドバッチ培養又は灌流培養を行い、細胞培地中又は細胞表面上の産生物の力価を測定することができる。表面発現については、細胞を抗体で染色して、産生物を検出し、例えばフローサイトメトリーにより、分析することができる。産生物の質及び／又は純度は、例えば電気泳動及び／又は質量分析などを用いて評価することができる。

［０１０９］いくつかの実施態様では、多量体タンパク質の第１のサブユニット（例えば、より弱く発現するサブユニット）の第１のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、多量体タンパク質の第１のサブユニット（例えば、より弱く発現するサブユニット）の第２のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、多量体タンパク質の第２のサブユニット（例えば、より強く発現するサブユニット）の第１のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号２又は１１を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、多量体タンパク質の第２のサブユニット（例えば、より強く発現するサブユニット）の第２のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号２又は１１を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、第１のサブユニット（例えば、より弱く発現するサブユニット）の第１のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第１のサブユニット（例えば、より弱く発現するサブユニット）の第２のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第２のサブユニット（例えば、より強く発現するサブユニット）の第１のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号２又は１１を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第２のサブユニット（例えば、より強く発現するサブユニット）の第２のポリペプチド鎖のオープンリーディングフレームは、配列番号２又は１１を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、多量体タンパク質は、二重特異性抗体である。いくつかの実施態様では、第１及び第２のサブユニットは半抗体を含む。いくつかの実施態様では、各サブユニットの２本のポリペプチド鎖は、それぞれ、抗体重鎖及び抗体軽鎖を表す。いくつかの実施態様では、第１の半抗体の重鎖をコードするオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第１の半抗体の軽鎖をコードするオープンリーディングフレームは、配列番号９を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第２の半抗体の重鎖をコードするオープンリーディングフレームは、配列番号３を含む翻訳開始配列に作用可能に結合しており、第２の半抗体の軽鎖をコードするオープンリーディングフレームは、配列番号１１を含む翻訳開始配列に作用可能に結合している。

プロモーター
［０１１０］いくつかの実施態様では、本開示の翻訳開始配列及び／又はオープンリーディングフレームは、プロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれは、プロモーターに作用可能に結合している。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核プロモーターは、典型的には、誘導型及び構成型の２つのクラスに分類される。誘導プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在若しくは不在、又は温度の変化に応答してその制御下で増加したレベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。

いくつかの実施態様では、プロモーターは、構成型プロモーターである。いくつかの実施態様では、プロモーターは、誘導型プロモーターである。真核宿主細胞における使用に適したさまざまなプロモーターが当該技術分野で知られている。いくつかの実施態様では、サブユニットの第１及び第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、同じプロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、サブユニットの第１及び第２のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドは、異なるプロモーターに作用可能に結合している。

［０１１２］さまざまな潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。選択されたプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、かつ単離されたプロモーター配列を本発明のベクターに挿入することによって、例えば、軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に結合され得る。天然プロモーター配列も多くの異種プロモーターもいずれも、標的遺伝子の直接増幅及び／又は発現に使用することができる。いくつかの実施態様では、異種プロモーターが一般に天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きい転写及びより高い収率をもたらすため、異種プロモーターが利用される。

発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、所望のＦｃ含有ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体）核酸に作用可能に結合されるプロモーターを含有する。真核生物のプロモーター配列が既知である。実質的にすべての真核遺伝子が、転写が始まる部位からおよそ２５～３０塩基上流に位置するＡＴに富んだ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０～８０塩基上流に見られる別の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであり得るＣＮＣＡＡＴ領域である。大半の真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡ尾部の付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列のすべてが真核細胞発現ベクターに好適に挿入される。

［０１１４］Ｆｃ含有ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体等）の産生の場合、哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーターから、又は熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御され得るが、かかるプロモーターが宿主細胞系と適合することを条件とする。いくつかの実施態様では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。

ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、Ｈｉｎｄ１１１Ｅ制限断片として好都合に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主におけるＤＮＡを発現させるための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ－インターフェロンｃＤＮＡの発現に関して、Ｒｅｙｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２９７：５９８－６０１（１９８２）も参照されたい。代替として、ラウス肉腫ウイルス長末端反復がプロモーターとして使用され得る。

［０１１６］より高次の真核生物による、抗原結合ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体等）をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増大され得る。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ－フェトプロテイン、及びインスリン遺伝子）由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている。また、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用してもよい。例としては、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００～２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核プロモーターの活性化を強化するための要素の説明に関しては、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７－１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、強化が達成される限り、抗体ポリペプチドコード配列の５’位側でも３’位側でもベクターへとスプライシングされ得るが、一般には、プロモーターから５’部位に位置する。

多重特異性多量体ポリペプチド
［０１１７］本開示のある態様は、例えば、それぞれ２本以上のポリペプチド鎖を含む２つ以上のサブユニットを含む、多量体ポリペプチドに関する。いくつかの実施態様では、本開示の一又は複数のポリペプチド鎖、一又は複数のサブユニット、又は一又は複数の多量体ポリペプチドは、宿主細胞に対して非天然である。

［０１１８］いくつかの実施態様では、本開示のサブユニットは、ヘテロ二量体のモノマーである。本明細書で使用されるとき、ヘテロ二量体は、作用可能に連結している２つの別個のポリペプチド又はポリペプチド複合体を含有する任意のポリペプチド複合体を指し得る。ヘテロ二量体の非限定的な例は、２つの別個の抗体モノマーで構成される二重特異性又は二価抗体（すなわち、作用可能に結合している軽鎖－重鎖対）である。この例では、第１の抗原を認識する第１の重鎖－軽鎖対の折り畳み及び組み立ては、第１の抗体モノマーを産生する。第２の抗原を認識する第２の重鎖－軽鎖対の折り畳み及び組み立ては、第２の抗体モノマーを産生する。これらのモノマーは、当該技術分野で既知である任意の手段（二重特異性抗体に関して以下でより詳細に記載される）によって組み立てられて、ヘテロ二量体を形成し得る。例示的なヘテロ二量体抗体形成に関するさらなる詳細については、ＲｉｄｇｗａｙＪＢＢｅｔａｌ．１９９６ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（７）：６１７－６２１を参照のこと。

［０１１９］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチド又はサブユニットは、分泌タンパク質である。本明細書で使用される場合、分泌タンパク質は、宿主細胞によって宿主細胞ペリプラズム又は細胞外環境に分泌される任意のタンパク質を指し得る。分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌されるタンパク質であっても良く、又は分泌タンパク質は、宿主細胞によって内因的に分泌されないが、その分泌を促進するような方法で修飾されるタンパク質であっても良い。例えば、典型的にはポリペプチドのＮ末端で見られるシグナル配列の存在により、ポリペプチドが分泌のための分泌経路に導かれ得る。多数のシグナル配列が当該技術分野で知られており、分泌タンパク質の分泌を促進するため、又は宿主細胞によって自然に分泌されないタンパク質の分泌を可能にするために有用であり得る。例えば、Ｐｉｃｋｅｎｅｔａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：２６９－２７５（１９８３）；ＳｉｍｍｏｎｓａｎｄＹａｎｓｕｒａ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：６２９－６３４（１９９６）；及びＨｕｍｐｈｒｅｙｓＤＰｅｔａｌ．２０００ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２０（２）：２５２を参照のこと。シグナル配列の１つの非限定的な例は、耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列である。

［０１２０］いくつかの実施態様では、本開示のサブユニットのポリペプチド鎖は、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに結合している。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって互いに結合している。ジスルフィド結合は、２つのチオール基を結合している任意の共有結合を指し得る。ポリペプチドにおけるジスルフィド結合は、典型的には、システイン残基のチオール基の間で形成される。ポリペプチドジスルフィド結合は、本開示の２鎖タンパク質等の多くのポリペプチドの折り畳み及び組み立てに重要であることが当該技術分野で知られている。ポリペプチドジスルフィド結合は、単一のポリペプチド鎖におけるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子内又は鎖内ジスルフィド結合）を含み得る。ポリペプチドジスルフィド結合はまた、別個のポリペプチド鎖上で見出されるシステイン残基間のジスルフィド結合（すなわち、分子間又は鎖間ジスルフィド結合）を含み得る。

［０１２１］ジスルフィド結合は、抗体及び抗体断片の折り畳み及び組み立てに重要であることが当該技術分野で知られている。異なる抗体同位体、及び同位体内の異なるサブクラスは、異なるパターンのジスルフィド結合を保有することが知られている。例えば、ＩｇＧ抗体は、特定のＩｇＧサブクラスに応じて、鎖内ジスルフィド結合を１２個、各軽鎖とその対応する重鎖との間の鎖間ジスルフィド結合を１個、重鎖間の鎖間ジスルフィド結合を２～１１個含有しても良い（より詳細な説明については、ＬｉｕＨａｎｄＭａｙＫ２０１２ＭＡｂｓ．４（１）：１７を参照のこと）。ＩｇＭ（例えば、ＷｉｅｒｓｍａＥＪａｎｄＳｈｕｌｍａｎＭＪ１９９５Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１０）：５２６５を参照）、ＩｇＥ（例えば、ＨｅｌｍＢＡｅｔａｌ．１９９１Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１（６）：１５４３を参照）、ＩｇＡ（例えば、ＣｈｉｎｔａｌａｃｈａｒｕｖｕＫＲｅｔａｌ．２００２Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９（９）：５０７２を参照）、及びＩｇＤ（例えば、ＳｈｉｎＳＵｅｔａｌ．１９９２Ｈｕｍ．ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ３（２）：６５を参照）もまた、折り畳み及び組み立て中にジスルフィド結合を形成することが知られている。

［０１２２］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは、多重特異性抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、多重特異性抗原結合タンパク質は、１つ、２つ、又はそれ以上のポリペプチド又は他の抗原のうちの２つ以上のエピトープに結合する。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、これらのエピトープは、通常、異なる抗原由来である。かかる分子が通常２つの異なるエピトープ（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）のみに結合する一方で、三重特異性抗体等のさらなる特異性を有する抗体は、本明細書で使用される場合、この表現に包含される。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製され得る。

［０１２３］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは抗体である。いくつかの実施態様では、本開示のサブユニットは半抗体である。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化抗体である。ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書においてヒト抗体又はヒト抗体断片と見なされる。以下に記載されるように、抗体は、抗体を産生するための当該技術分野で利用可能な技法を使用して調製され、その例示的な方法は、以下のセクションにより詳細に記載される。当業者は、以下に記載の方法の多くが、抗体以外の多量体ポリペプチドに適用され得ることを認識するであろう。

［０１２４］いくつかの実施形態では、本開示のサブユニットは、第１の鎖及び第２の鎖が免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖に相当する一価抗体である。本明細書で使用される場合、一価抗体は、共に作用可能に結合して重鎖－軽鎖対を形成する抗体重鎖及び抗体軽鎖から作製される任意のポリペプチド複合体を指しても良く、これにおいて、重鎖－軽鎖対は第２の重鎖－軽鎖対に作用可能に結合しない。「半抗体（ｈＡｂ）」という用語が本明細書では同義に使用され得る。

［０１２５］いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、一又は複数の標的抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチド又はサブユニットは、抗原に特異的に結合することができる。本明細書で使用される場合、「結合する」、「特異的に結合する」、又は「～に特異的である」という用語は、標的と（すなわち、生体分子を含む不均一な分子集団の存在下での標的の存在を決定する抗体と）の間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、又はそれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも高い親和性で、結合力で、より容易に、かつ／又はより長期間結合する抗体である。一実施態様では、抗体が無関係の標的に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体の標的への結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施態様では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施態様では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要とするわけではない。特定の実施態様では、本明細書で提供される抗体は、１μＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、又は０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍから１０^－１３Ｍ、例えば１０^－９Ｍから１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

［０１２６］一実施態様では、Ｋｄは、以下のアッセイにより説明されるように、目的とする抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系の存在下で、最小濃度の（^１２５Ｉ）標識抗原によりＦａｂを平衡化し、次いで、結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定する（例えばＣｈｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５～８８１（１９９９）参照）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（ＣａｐｐｅｌＬａｂｓ）で一晩コーティングし、その後、ＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２～５時間にわたって室温（およそ２３℃）で遮断する。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）内で、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［^１２５Ｉ］抗原を、目的とするＦａｂの段階希釈液と混合する。次いで、目的のＦａｂを一晩インキュベートするが、インキュベーションをより長い期間（例えば、約６５時間）続けて、平衡に達することを保証してもよい。その後、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のために混合物を捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ－２０^ＴＭ、Ｐａｃｋａｒｄ）を付加し、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ^ＴＭガンマ計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）上で１０分間、計数する。最大結合の２０％以下をもたらす各Ｆａｂの濃度を競合結合アッセイでの使用に選択する。

［０１２７］別の実施態様によると、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して、２５℃で、約１０の応答ユニット（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）を、供給業者の指示に従って、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、ｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムによって、５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流速でインジェクトし、カップリングされたタンパク質のおよそ１０応答ユニット（ＲＵ）を達成する。抗原のインジェクション後、１Ｍのエタノールアミンをインジェクトして、未反応基をブロックする。動態測定のため、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）を、およそ２５μＬ／分の流量にて２５℃で０．０５％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０^ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を有するＰＢＳ中に注射する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ第３．２版）を使用して、会合センサグラム及び解離センサグラムを同時に適合することによって、算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算される。例えば、Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５－８８１（１９９９）を参照のこと。上述の表面プラズモン共鳴アッセイによりオン速度が１０６Ｍ－１ｓ－１を超える場合、オン速度を、ストップフローを装備した分光測色計（ＡｖｉｖＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ^ＴＭ分光測色計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される抗原の増加した濃度の存在下でＰＢＳ（ｐＨ７．２）中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加又は減少を測定する蛍光クエンチ技法を使用することによって決定することができる。

［０１２８］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは、二重特異性抗体を含む。いくつかの実施態様では、第１及び第３のポリペプチド鎖は抗体重鎖であり、第２及び第４のポリペプチド鎖は抗体軽鎖である。いくつかの実施態様では、第１のサブユニットは、第１の抗原に結合する第１の半抗体であり、第２のサブユニットは、第２の抗原に結合する第２の半抗体である。いくつかの実施態様では、第１の抗原と第２の抗原は異なる。いくつかの実施態様では、第１及び第２の抗原は、同じ標的の異なるエピトープに相当する。三重特異性又は四価抗体などの他の抗体も企図される。

［０１２９］二重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で既知である。完全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づき、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７～５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子を有する混合物を産生する可能性があり、これらのうちの１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常親和性クロマトグラフィーステップによって行われるこの正しい分子の精製は、幾分厄介であり、産生物収率は低い。同様の手順は、国際公開第９３／０８８２９号、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯＪ．、１０：３６５５～３６５９（１９９１）に記載されている。

［０１３０］ある特定の実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。

［０１３１］ある特定の実施態様では、本開示は、すべてではないが、いくつかのエフェクター機能を有することにより、ｉｎｖｉｖｏでの抗体の半減期は重要ではあるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途に望ましい候補となる抗体バリアントを企図する。ｉｎｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、Ｆｃ(ＲＩＩＩのみを発現するが、一方で単球は、Ｆｃ(ＲＩ、Ｆｃ(ＲＩＩ、及びＦｃ(ＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７～４９２（１９９１）の４６４頁、表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：７０５９～７０６３（１９８６）を参照）、及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１４９９～１５０２（１９８５）；５，８２１，３３７（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１～１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を使用してもよい（例えば、フローサイトメトリー（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、ＣＡ）のためのＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ、及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：６５２～６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎｖｉｖｏで評価され得る。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ１０１：１０４５～１０５２（２００３）、並びにＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．及びＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ、Ｂｌｏｏｄ１０３：２７３８～２７４３（２００４）を参照されたい）、ＦｃＲｎ結合及びｉｎｖｉｖｏクリアランス／半減期の判定はまた、当該技術分野で公知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ら、Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９～１７６９（２００６）を参照されたい）。

［０１３２］エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が挙げられ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。

ＦｃＲに対する結合が改善又は減少したある特定の抗体バリアントが記載される（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。

［０１３４］ある特定の実施態様では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。例示的な一実施態様では、抗体は、そのＦｃ領域に以下のアミノ酸置換：Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、及びＫ３３４Ａを含む。

［０１３５］いくつかの実施態様では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅｅｔａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、変化した（すなわち、改善されたか又は減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。

［０１３６］半減期が増加し、母体のＩｇＧの胎児への移行に関与する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、米国特許公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、以下のＦｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４のうちの一又は複数での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４での置換を有するバリアントが挙げられる（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ」、第３２２巻７３８～４０頁（１９８８年）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及び国際公開第９４／２９３５１号も参照されたい。

［０１３７］本開示の抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な、追加の非タンパク質性部分を含有するように、さらに修飾され得る。ある特定の実施態様では、本抗体の誘導体化に好適なこれらの部分は、水溶性ポリマーである。

ノブ－イントゥ－ホールアプローチ
［０１３８］二重特異性抗体を作製するための当該技術分野で公知の１つのアプローチは、「ノブ・イントゥー・ホール」又は「プロチュバランス・イントゥー・キャビティ」アプローチである（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）。このアプローチでは、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）がそれぞれ、界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面が他方の免疫グロブリンポリペプチドの対応する界面と相互作用し、それにより、２つの免疫グロブリンポリペプチドの会合を可能にする。これらの界面は、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」又は「プロチュバランス」（これらの用語は、本明細書で同義に使用され得る）は、他方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」又は「キャビティ」（これらの用語は、本明細書で同義に使用され得る）に対応するように操作することができる。いくつかの実施態様では、ホールは、ノブと同一又は同様の大きさのものであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブが他方の界面の対応するホール内に位置付け可能であるように好適に位置付けられる。理論に拘束されることを望むことなく、これは、ヘテロ多量体を安定させ、かつ他の種、例えば、ホモ多量体よりもヘテロ多量体の形成を好むと考えられる。いくつかの実施態様では、このアプローチを使用して、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を作製することができる。

［０１３９］いくつかの実施態様では、ノブは、小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖で置き換えることによって構築され得る。いくつかの実施態様では、ホールは、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖で置き換えることによって構築され得る。ノブ又はホールは、元の界面に存在し得るか、又は合成的に導入され得る。例えば、ノブ又はホールは、界面をコードする核酸配列を改変し、少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基で置き換えることによって組み換え導入され得る。核酸配列を改変させるための方法としては、当該技術分野で既知の標準の分子生物学技法が挙げられ得る。様々なアミノ酸残基の側鎖体積は、以下の表に示される。いくつかの実施態様では、元の残基は、小さい側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、トレオニン、又はバリン）を有し、ノブを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含み得る。いくつかの実施態様では、元の残基は、大きい側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン）を有し、ホールを形成するための移入残基は、天然に存在するアミノ酸であり、アラニン、セリン、トレオニン、及びバリンを含み得る。

［０１４０］いくつかの実施態様では、ノブ又はホールを形成するための元の残基は、ヘテロ多量体の三次元構造に基づいて同定される。当該技術分野で既知の三次元構造を得るための技法としては、Ｘ線結晶学及びＮＭＲが挙げられ得る。いくつかの実施態様では、界面は、免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施態様では、ＩｇＧ_１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４つの逆平行β鎖上に位置する各ドメイン上に１６個の残基を含む。理論に拘束されることを望むことなく、変異残基は、好ましくは、ノブがパートナーＣＨ３ドメイン内の補償ホールではなく周囲の溶媒によって収容され得る危険性を最小限に抑えるように、これらの２つの中央逆平行β鎖上に位置する。いくつかの実施態様では、２つの免疫グロブリンポリペプチド内の対応するノブ及びホールを形成する変異は、以下の表に提供される一又は複数の対に対応する。

［０１４１］ある特定の実施態様では、本開示の抗体のＣＨ３及び／又はＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ４サブタイプに由来する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体のＩｇＧ４ＣＨ３及び／又はＣＨ２ドメインは、限定されないが、Ｓ２２８Ｐ変異（ＥＵ番号付け）を含む一又は複数の追加の変異を含み得る。

^ａアミノ酸の分子量は、水の分子量を差し引いたものである。ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｙｓｉｃｓ、第４３版、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＣｈｅｍｉｃａｌＲｕｂｂｅｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、１９６１からの値。
^ｂＡ．Ａ．Ｚａｍｙａｔｎｉｎ，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：１０７－１２３，１９７２からの値。
^ｃＣ．Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：１－１４，１９７５からの値。アクセス可能な表面積は、この参考文献の図６～２０に定義されている。

［０１４２］いくつかの実施態様では、一方のサブユニットのポリペプチド鎖は、少なくとも一つのホール変異を含み、他方のサブユニットのポリペプチド鎖は、少なくとも一つのノブ変異を含む。例えば、第１のサブユニットは少なくとも一つのホール変異を含む抗体Ｆｃ領域を含み、かつ第２のサブユニットは少なくとも一つのノブ変異を含む抗体Ｆｃ領域を含むか、又は第１のサブユニットは少なくとも一つのノブ変異を含む抗体Ｆｃ領域を含み、かつ第２のサブユニットは少なくとも一つのホール変異を含む抗体Ｆｃ領域を含む。

［０１４３］いくつかの実施態様では、本開示の抗体のＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１サブタイプ、ＩｇＧ２サブタイプ、ＩｇＧ２Ａサブタイプ、ＩｇＧ２Ｂサブタイプ、ＩｇＧ３サブタイプ、又はＩｇＧ４サブタイプ）に由来する。いくつかの実施態様では、本開示の抗体のＣＨ３ドメインは、一又は複数のノブ変異又はホール変異（例えば、下記の表３に記載されている変異など）を含み得る。

［０１４４］いくつかの実施態様では、免疫グロブリンポリペプチドは、上の表２に列記される一又は複数のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、表３の左側の欄に列記される一又は複数のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表３の右側の欄に列記される一又は複数の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのあるサブユニットは、表３の列の左側の欄に列記される変異を含み、多量体ポリペプチドの別のサブユニットは、表３の同じ列の右側の欄に列記される変異を含む。ノブ及びホール対の非限定的な例として、いくつかの実施態様では、二重特異性抗体は、Ｔ３６６Ｗ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドとを含む。いくつかの実施態様では、少なくとも一つのノブ変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、及びＦ４０５Ｗからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、少なくとも一つのホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３９４Ｓからなる群より選択される。特定の実施態様では、ノブ変異はＴ３６６Ｗ置換を含み、ホール変異は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ置換を含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）。本明細書に記載される方法及び細胞において有用なノブ変異及びホール変異についての他の説明は、例えば、ＲｉｄｇｗａｙＪＢＢｅｔａｌ．１９９６ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（７）：６１７－６２１及びｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ＿ＩｇＧ．ｈｔｍｌに見つけられる。

［０１４５］上述のようにＤＮＡを変異させた後、一又は複数の対応するノブ又はホール変異を有する修飾された免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の標準の組み換え技法及び細胞系を使用して発現及び精製することができる。例えば、二重特異性抗体の４本すべてのポリペプチド鎖は、例えば以下の実施例に記載及び例示されるように、単一の宿主細胞において産生され組み立てられ得る。

［０１４６］ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体が産生された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７～１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、その後、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４～６４４８（１９９３）により記載されている「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替的機構を提供している。それらの断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む。したがって、ある断片のＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインが別の断片の相補的Ｖ_Ｌドメイン及びＶ_Ｈドメインと対合させられ、それにより、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性抗体断片を作製するための別の方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。

［０１４７］二重特異性抗体断片を作製するための別の技法は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー」又はＢｉＴＥ（登録商標）アプローチである（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号を参照されたい）。このアプローチは、単一のポリペプチド上に配列された２つの抗体可変ドメインを利用する。例えば、単一のポリペプチド鎖は、可変重鎖（Ｖ_Ｈ）及び可変軽鎖（Ｖ_Ｌ）ドメインを各々有する２つの一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含み、これらのドメインは、２つのドメイン間の分子内会合を可能にする十分な長さのポリペプチドリンカーにより分離される。この単一のポリペプチドは、２つのｓｃＦｖ断片間のポリペプチドスペーサー配列をさらに含む。各ｓｃＦｖは、異なるエピトープを認識し、２つの異なる細胞型の細胞が、各ｓｃＦｖがその同種のエピトープと係合するときに近接近するか又は係留されるように、これらのエピトープは、異なる細胞型に対して特異的であり得る。このアプローチの１つの特定の実施態様は、免疫細胞によって発現される細胞表面抗原を認識するｓｃＦｖ、例えば、Ｔ細胞上のＣＤ３ポリペプチドを含み、これは、悪性又は腫瘍細胞などの標的細胞によって発現される細胞表面抗原を認識する別のｓｃＦｖに結合される。

［０１４８］２を超える結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体が調製され得る。Ｔｕｆｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。

［０１４９］いくつかの実施態様において、本開示の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて若しくは一部又は軽鎖可変ドメインのすべて若しくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．、例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照されたい）。一実施態様では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部からなる。

選択的な軽鎖－重鎖対合を促進する変異
［０１５０］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドは、抗体軽鎖と抗体重鎖との選択的会合を促進する一又は複数の変異を含む。本明細書に記載される方法及び細胞において有用な抗体重鎖と抗体軽鎖との間の選択的会合を促進する例示的なアミノ酸置換は、国際公開第２０１６／１７２４８５号に見つけられる。いくつかの実施態様では、サブユニットの抗体重鎖は、選択的会合を促進する一又は複数の変異を含み、サブユニットの抗体軽鎖は、重鎖との組み合わせで選択的会合を促進する一又は複数の変異を含む。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体の両方の半抗体は、抗体軽鎖と抗体重鎖との選択的会合を促進する一又は複数の変異を含む（例えば、ある重鎖は正電荷を帯びた変異を有し、その対応する軽鎖は負電荷を帯びた変異を有するのに対して、他の重鎖は負電荷を帯びた変異を有し、その対応する軽鎖は正電荷を帯びた変異を有する。又は、その逆の場合も同じである）。いくつかの実施態様では、二重特異性抗体の半抗体の一方のみが、抗体軽鎖と抗体重鎖との選択的会合を促進する一又は複数の変異を含む（例えば、ある重鎖は正電荷を帯びた変異を有し、その対応する軽鎖は負電荷を帯びた変異を有する。又は、その逆の場合も同じである）。

［０１５１］いくつかの実施態様では、抗体重鎖（例えば、ＣＨ１ドメイン）はＳ１８３でのアミノ酸置換を含み、抗体軽鎖（例えば、ＣＬドメイン）はＶ１３３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３置換は、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、Ｖ１３３置換は、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は正電荷を帯びた残基をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は負電荷を帯びた残基をもたらす。いくつかの実施態様では、Ｓ１８３でのアミノ酸置換は負電荷を帯びた残基をもたらし、Ｖ１３３でのアミノ酸置換は正電荷を帯びた残基をもたらす。

［０１５２］重鎖／軽鎖対の選択的会合を促進する変異は、重鎖の選択的会合を促進する変異（例えば、ノブ変異及びホール変異）と組み合わせることができる。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）は、ノブ変異及びホール変異のセットと、抗体軽鎖と抗体重鎖との選択的会合を促進する一又は複数の変異とを含む。有利には、これは、一方又は両方の半抗体における適切な重鎖／軽鎖会合と、二重特異性抗体の適切なアセンブリを（例えば、各半抗体の二量体を形成するのとは対照的に）促進し、誤対合した副産物を少なくする。いくつかの実施態様では、本開示のポリペプチド鎖（例えば、二重特異性抗体又は半抗体の抗体重鎖）は、一又は複数のノブ変異又はホール変異と、抗体軽鎖と抗体重鎖との選択的会合を促進する一又は複数の変異とを含む。例えば、いくつかの実施態様では、二重特異性抗体の第１の抗体重鎖は、負電荷をもたらす変異（例えば、Ｓ１８３Ｅ変異）とホール変異とを含み、第１の抗体軽鎖は、正電荷をもたらす変異（例えば、Ｖ１３３Ｋ変異）を含み、二重特異性抗体の第２の抗体重鎖は、正電荷をもたらす変異（例えば、Ｓ１８３Ｋ変異）とノブ変異とを含み、第２の抗体軽鎖は、負電荷をもたらす変異（例えば、Ｖ１３３Ｅ変異）を含む。

複数の多量体ポリペプチド及び多量体ポリペプチドの組成物
［０１５３］本明細書に記載される方法によって産生される、多量体ポリペプチド、及び複数の多量体ポリペプチド又は多量体ポリペプチドの組成物がさらに提供される。有利には、本開示は、本明細書に記載される方法が、所望の多量体ポリペプチドの産生量がより高くかつ／又は誤対合した副産物などの不純物がより少ない多量体ポリペプチドの改善された産生を可能にすることを実証している。このため、いくつかの実施態様では、本開示の方法によって産生された複数の多量体ポリペプチド及び多量体ポリペプチド組成物は、既存の技法によって産生された複数の多量体ポリペプチド及び多量体ポリペプチド組成物と比較して（例えば、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの一又は複数、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾翻訳開始配列と作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む発現、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む発現と比較して）、より少ない数の誤対合した副産物を含む。いくつかの実施態様では、本開示の方法によって産生された複数の多量体ポリペプチド及び多量体ポリペプチド組成物は、既存の技法によって産生された複数の多量体ポリペプチド及び多量体ポリペプチド組成物と比較して（例えば、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドの一又は複数、２つ以上、３つ以上、又は４つが、天然又は非修飾翻訳開始配列と作用可能に結合したオープンリーディングフレームを含む発現、又は多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれが、同じ翻訳開始配列を含む発現と比較して）、誤対合した副産物に対してより高い比率の多量体ポリペプチドを含む。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のすべては、単一の真核生物（例えば、哺乳動物）細胞から産生される。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは二重特異性抗体である。

多量体タンパク質の産生
［０１５４］宿主細胞（例えば、下記のセクションＩＩＩに記載されるようなもの）は、一又は複数のポリヌクレオチド又はベクター（例えば、発現ベクター）で形質転換され、プロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された従来の栄養培地で培養される。

［０１５５］本開示の所望の多量体ポリペプチドを産生するのに使用される宿主細胞又はそのサブユニットは、さまざまな培地で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が、宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；若しくは同第５，１２２，４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；又は米国再特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ^ＴＭ薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終密度で存在する無機化合物と定義される）、並びにグルコース又は等価エネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物も当業者に既知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で既に使用したものであり、当業者に明らかであろう。

［０１５６］本開示の多量体ポリペプチドを回収するための方法が本明細書に記載される。組み換え技術を使用するとき、本開示の多量体ポリペプチド又はそのサブユニットは、細胞内で産生されるか、又は培地に直接分泌される。ポリペプチドが細胞内に産生される場合、第１のステップとして、粒子状残屑、宿主細胞、又は溶解された断片のいずれかが、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去される。ポリペプチドが培地に分泌される場合、かかる発現系由来の上清が、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅＰｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を使用して最初に濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前述のステップのいずれかに含まれてもよく、外来性混入物の増殖を防止するために、抗生物質が含まれてもよい。

［０１５７］細胞から調製されたポリペプチド組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製され得、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技法である。タンパク質Ａの親和性リガンドとしての好適性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３（１９８３））。タンパク質Ｇは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成され得るよりも速い流速及び短いプロセシング時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸ^ＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収される抗体に応じて利用可能である。

［０１５８］任意の予備精製ステップ（複数可）の後、目的とするポリペプチド及び夾雑物を含む混合物が、約２．５～４．５のｐＨの溶出緩衝液を使用して、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供され得る。抗原結合ポリペプチドの産生は、（上述の特定の方法のうちのいずれかに対して）代替的に又は追加的に、ポリペプチドの混合物を含む溶液を透析することを含む。

［０１５９］一実施態様では、本開示の多量体ポリペプチド又はここで産生されるそのサブユニットは、さらなるアッセイ及び使用のために、実質的に同種の調製物を得るようにさらに精製される。当該技術分野で既知の標準のタンパク質精製方法が用いられ得る。以下の手順は、適切な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又は陽イオン交換樹脂（ＤＥＡＥ等）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿、及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５を使用したゲル濾過。

［０１６０］多量体ポリペプチドの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む、既知のクロマトグラフィー技法を用いて行うことができる。一実施態様では、目的とする多量体ポリペプチドは、カオトロピック剤又は中性洗剤を含有する溶液中への溶出によって、カラムの固相から回収されてもよい。例示的なカオトロピック剤及び中性洗剤には、グアニジン－ＨＣＩ、尿素、過塩素酸リチウム（ｌｉｔｈｉｕｍｐｅｒｃｌｏｒａｔｅ）、アルギニン、ヒスチジン、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、及びＮＰ－４０が含まれるが、これらに限定されず、これらのすべては市販されている。

［０１６１］一実施態様では、固相に固定化されたプロテインＡが、例えば、本発明の抗原結合ポリペプチドの免疫親和性精製に使用される。プロテインＡは、高親和性で抗原結合ポリペプチドのＦｃ領域に結合する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋｅｔａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１－１３。タンパク質Ａが固定化される固相は、好ましくは、ガラス又はシリカ表面を含むカラム、より好ましくは、制御細孔ガラスカラム又はケイ酸カラムである。いくつかの用途では、このカラムは、夾雑物の非特異的付着を阻止するために、グリセロール等の試薬でコーティングされている。

［０１６２］精製の第１のステップとして、上述のように細胞培養から得られた調製物がプロテインＡ固定化固相に適用されて、目的とする抗原結合ポリペプチドのプロテインＡへの特異的結合を可能にする。その後、固相は洗浄され、固相に非特異的に結合した夾雑物が除去される。抗原結合ポリペプチド（例えば、抗体等）が、溶出により固相から回収される。

スクリーニング方法
［０１６３］本開示の真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを発現するための翻訳開始配列の組み合わせを同定するための方法もまたさらに提供される。いくつかの実施態様では、この方法は、複数の真核宿主細胞を含むライブラリを用意することと、複数の真核宿主細胞による多量体ポリペプチドの発現に適した条件下で真核宿主細胞のライブラリを培養することと、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンによって産生された多量体ポリペプチドの量を測定することと、多量体ポリペプチドを産生する、一又は複数の、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンの、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列を同定することと、を含む。このような方法の例は、下記に記載及び例示される。

［０１６４］いくつかの実施態様では、本開示のライブラリは、本開示の複数の宿主細胞を含む。いくつかの実施態様では、複数の宿主細胞の二つ以上、又はすべては、本明細書に記載されるサブユニット又は多量体ポリペプチドの各ポリペプチド鎖をコードするのに必要なポリヌクレオチドのセットを含む。例えば、いくつかの実施態様では、ライブラリ中の宿主細胞の複数又はすべては、本開示の多量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施態様では、複数の宿主細胞又はライブラリは、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列の複数の組み合わせを含む。このため、ライブラリのスクリーニングは、目的の特性（例えば、高レベルの発現又は低レベルの誤対合した副産物などの多量体ポリペプチドの発現）を生じさせる翻訳開始配列の組み合わせを同定するのに使用することができる。本開示は、多量体ポリペプチドの発現が、構成ポリペプチド鎖の一又は複数をコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合した翻訳開始配列の強度を調整することにより改善され得ることを実証している。

［０１６５］いくつかの実施態様では、複数の宿主細胞の各宿主細胞におけるオープンリーディングフレームに作用可能に結合した翻訳開始配列の一又は複数は、配列５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である。

［０１６６］本明細書に記載されるさまざまな方法は、本開示の一又は複数の宿主細胞又は宿主細胞のクローン集団によって産生された多量体ポリペプチドの量を測定するのに使用することができる。例えば、一過性のトランスフェクタント又は安定したトランスフェクタントを培養し、多量体のポリペプチドの産生を測定することができる。フェドバッチ培養又は灌流培養を行い、細胞培地中又は細胞表面上の産生物の力価を測定することができる。表面発現については、細胞を抗体で染色して、産生物を検出し、例えばフローサイトメトリーにより、分析することができる。産生物の質及び／又は純度は、例えば電気泳動及び／又は質量分析などを用いて評価することができる。

［０１６７］本開示の抗体は、コンビナトリアルライブラリを所望される活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって、単離することができる。例えば、実施例３に記載の方法等のファージディスプレイライブラリを生成し、かつ所望の結合特性を有する抗体についてかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で既知である。追加の方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１７８：１～３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら編、ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００１）でレビューされ、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２～５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１～５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ及びＢｒａｄｂｕｒｙ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、２４８：１６１～１７５（Ｌｏ編、ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３）、Ｓｉｄｈｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３３８（２）：２９９～３１０（２００４）、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３４０（５）：１０７３～１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１（３４）：１２４６７～１２４７２（２００４）、並びにＬｅｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８４（１～２）：１１９～１３２（２００４）でさらに説明されている。

［０１６８］ある種のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリはポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリ内で無作為に再結合され、次いでＷｉｎｔｅｒら、「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１２巻：第４３３～４５５頁（１９９４年）に記載されているような、抗原結合ファージに対してスクリーニングすることが可能である。ファージは、典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＦａｂ断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なく、免疫原に対する高親和性抗体を与える。あるいは、ナイーブレパートリは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯＪ、１２：７２５～７３４（１９９３）によって記載されているように、免疫化を行わずに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原にも対する抗体の単一供給源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、天然ライブラリはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第２２７巻第３８１～３８８頁（１９９２年）に記載されるように、幹細胞からの再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、ｉｎｖｉｔｒｏで再配列を遂行することによって、合成的に作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリを説明する特許刊行物には、例えば、以下が含まれる：米国特許第５，７５０，３７３号、並びに米国特許公開第２００５／００７９５７４号書、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号。

ＩＩＩ．細胞
［０１６９］例えばセクションＩＩに記載される方法に従って、多量体ポリペプチドの産生に有用な組み換え真核宿主細胞も本明細書で提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示の多量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施態様では、第１のサブユニットは、各サブユニットが組み換え真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方は、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い。いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドは、組み換え真核宿主細胞に対して非天然である。いくつかの実施態様では、組み換え真核宿主細胞は、単離された組み換え真核宿主細胞である。

［０１７０］いくつかの実施態様では、本開示の宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施態様では、本開示の宿主細胞は哺乳動物細胞である。

［０１７１］適切な宿主細胞には、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載される高等真核生物細胞が含まれる。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の繁殖が日常的な手技になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．，Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ７７：４２１６（１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）である。

［０１７２］いくつかの実施態様では、本開示の宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は細胞株である。いくつかの実施態様では、本開示の宿主細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞株である（例えば、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＣＬ－６１^ＴＭ及びＬｅｗｉｓ，Ｎ．Ｅ．ｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：７５９－７６５を参照）。いくつかの実施態様では、本開示の宿主細胞は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性が欠損したＣＨＯ細胞である（例えば、Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：４２１６－４２２０を参照）。

［０１７３］いくつかの実施態様では、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のすべては、単一の真核生物（例えば、哺乳動物）細胞から産生される。有利には、これにより、２つのサブユニット（例えば、半抗体）が産生後にｉｎｖｉｔｒｏで組み立てられる場合のように、多量体ポリペプチド（例えば、二重特異性抗体）の産生後の組み立てが不要になる。

［０１７４］本明細書に記載されるプロモーター及び／又は翻訳開始配列のいずれかは、本開示の宿主細胞において使用を見出すことができる。

［０１７５］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードする一又は複数のポリヌクレオチドは、本開示の宿主細胞の染色体上に（例えば、組み込みを介して）存在する。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれは、本開示の宿主細胞の染色体上に（例えば、組み込みを介して）存在する。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれは、本開示の宿主細胞の同じ染色体又は染色体座上に（例えば、組み込みを介して）存在する。

［０１７６］本開示のポリヌクレオチドの宿主細胞染色体上への安定な組み込み又は安定なトランスフェクションは、本開示の多量体ポリペプチドを産生するための安定な産生細胞株を提供し得る。ランダムな組み込み又は部位特異的な組み込みを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに組み込むのに適した様々なアプローチが当該技術分野で知られている（例えば「ランディングパッド」手法）。例えば、Ｚｈａｏ，Ｍ．ｅｔａｌ．（２０１８）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：６１０５－６１１７；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．ｅｔａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：８５７２；及びＧａｉｄｕｋｏｖ，Ｌ．ｅｔａｌ．（２０１８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４６：４０７２－４０８６を参照のこと。

［０１７７］いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードする一又は複数のポリヌクレオチドは、宿主細胞において染色体外ポリヌクレオチドとして維持される。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれは、宿主細胞において染色体外ポリヌクレオチドとして維持される。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードする一又は複数のポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、発現ベクター）に存在する。いくつかの実施態様では、本開示の多量体ポリペプチドのサブユニットのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドのそれぞれは、一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）に存在する。

［０１７８］ベクター成分には、一般に、シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列のうちの一又は複数が含まれるが、これらに限定されない。

［０１７９］真核宿主細胞で使用するためのベクターは、目的とする成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドも含有し得る。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識及び処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列である。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域のＤＮＡは、リーディングフレームにおいて、所望の抗原結合ポリペプチド（複数可）（例えば、抗体）をコードするＤＮＡに連結される。

［０１８０］一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要ではない。例えば、ＳＶ４０起点が典型的に使用され得るが、これは単に、ＳＶ４０起点が初期プロモーターを含有するためである。

［０１８１］本明細書に記載されるプロモーター及び／又は翻訳開始配列のいずれかは、本開示のベクターにおいて使用を見出すことができる。

［０１８２］発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子、別名、選択可能なマーカーを含有し得る。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンへの耐性を付与するタンパク質、（ｂ）関連性がある場合、栄養要求性欠損を補足するタンパク質、又は（ｃ）複合培地から入手不可能な重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

［０１８３］選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止する薬物を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬物耐性を与え、それ故に選択レジメンで生き残るタンパク質を産生する。かかる優性選択の例は、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシンを使用する。

［０１８４］哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン－Ｉ及び－ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等の、抗体核酸を取り込むための細胞成分の同定を可能にするものである。

［０１８５］例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、形質転換体のすべてを、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で培養することによって最初に同定される。野生型ＤＨＦＲが用いられる場合、適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ－９０９６）である。

［０１８６］あるいは、本開示のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択可能なマーカー、例えば、アミノグリコシド３’－ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）で形質転換又は共形質転換された宿主細胞（具体的には、内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、又はＧ４１８等の選択可能なマーカー用の選択剤を含有する培地中での細胞成長によって選択され得る。例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。

［０１８７］真核宿主細胞で使用される発現ベクターは、典型的には、転写終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有する。かかる配列は一般的に、真核又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’非翻訳領域、時折、３’非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号及びそこで開示される発現ベクターを参照されたい。

［０１８８］宿主細胞は、所望のポリペプチド（複数可）（例えば、多量体ポリペプチド等）の産生のために、上述の発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜改変された従来の栄養素培地中で培養される。

ＩＶ．キット及び製造品
［０１８９］例えば多量体ポリペプチドの発現に有用なキット又は製造品が本明細書でさらに提供される。

［０１９０］いくつかの実施態様では、キットは、多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖及び／又はサブユニットのそれぞれをコードするポリヌクレオチドのセットを含む。例えば、いくつかの実施態様では、キットは、本開示の多量体ポリペプチドの第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、本開示の多量体ポリペプチドの第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含む。いくつかの実施態様では、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のうちの一又は複数は、それぞれのオープンリーディングフレームが天然に存在する宿主細胞ゲノム中に存在する場合、そのそれぞれのオープンリーディングフレームに作用可能に結合していない。

［０１９１］いくつかの実施態様では、本開示のキット中のポリヌクレオチドのそれぞれは、本開示の一又は複数の発現ベクターの一部である。

［０１９２］いくつかの実施態様では、本開示のキット中のポリヌクレオチドのそれぞれは、本開示のプロモーターに作用可能に結合している。例えば、いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドのそれぞれは、異なるプロモーターに作用可能に結合している。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドの２つ以上は、同じプロモーターに作用可能に結合している。例えば、多量体ポリペプチドが二重特異性抗体である場合、各抗体の重鎖及び軽鎖のオープンリーディングフレームをコードするポリヌクレオチドは、同じプロモーターに作用可能に結合することができる。いくつかの実施態様では、「同じプロモーター」は、同じ物理的ポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施態様では、「同じプロモーター」は、同じプロモーター配列を共有する物理的に異なるポリヌクレオチドを指す。

［０１９３］いくつかの実施態様では、キット又は製造品は、例えば、上のセクションＩＩに記載される方法のいずれかに従って、又は上のセクションＩＩＩに記載される宿主細胞のいずれかを使用する、本開示のサブユニット又は多量体ポリペプチドの産生のためのポリヌクレオチドのセットの使用についての説明書をさらに含む。

［０１９４］本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されることになる。しかしながら、実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施態様が例証のみを目的とするものであり、それを考慮に入れた様々な修正又は変更が当業者に提案されており、本明細書の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。

実施例１：哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションにおけるコザック配列バリアントによるタンパク質産生の調整
［０１９５］現在、哺乳動物細胞内で組み換えタンパク質の翻訳レベルを正確に制御する体系的なアプローチはほとんど存在しない。翻訳がポリペプチドの合成を開始する領域は、翻訳開始部位（ＴＩＳ）と呼ばれる。翻訳開始部位（ＴＩＳ）は、開始コドンとその隣接する塩基からなる。真核生物では、翻訳開始は通常、走査機構モデルに従い（ＫｏｚａｋＭ．Ｃｅｌｌ．１９７８；１５（４）：１１０９－２３）、これは、小さな４０Ｓリボソームサブユニット、Ｍｅｔ－ｔＲＮＡ、ｅＩＦ２－ＧＴＰ、ｅＩＦ１、ｅＩＦ１Ａ、ｅＩＦ３、及びｅＩＦ５からなるリボソーム開始前複合体を前提とし、ｍＲＮＡの５’末端で結合し、開始コドンを求めて３’方向に直線的に進む。小さな４０Ｓリボソームサブユニットを開始コドン中に配置した後、開始因子は解離し、大きなサブユニットは小さな４０Ｓリボソームサブユニットに結合してリボソーム複合体を形成し、翻訳が開始する（ＮａｎｄａＪＳ，ＳａｉｎｉＡＫ，ＭｕｎｏｚＡＭ，ＨｉｎｎｅｂｕｓｃｈＡＧ，ＬｏｒｓｃｈＪＲ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２０１３；２８８（８）：５３１６－２９；ＰｅｓｔｏｖａＴＶ，ＫｏｌｕｐａｅｖａＶＧ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．２００２；１６（２２）：２９０６－２２）。開始は、必ずしも５’末端に最も近い開始コドン（ＡＵＧ）に制限されるわけではない。第１のＡＵＧコドンが最適な状況で生じる場合、リボソーム複合体は翻訳を開始するが、第１のＡＵＧトリプレットの周りの翻訳開始部位（ＴＩＳ）が準最適である場合、一部の４０Ｓサブユニットは、その部位をバイパスし、さらに下流で開始する。したがって、細胞はＴＩＳを調整することによってタンパク質翻訳レベルを制御することができるため、開始コドンの周りの配列は、開始とそれに続く翻訳効率の強化において重要な役割を果たす（ＫｏｚａｋＭ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９９１；２６６（３０）：１９８６７－７０；ＫｏｚａｋＭ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９９１；１１５（４）：８８７－９０３；ＳｏｎｅｎｂｅｒｇＮ，ＨｉｎｎｅｂｕｓｃｈＡＧ．Ｃｅｌｌ．２００９；１３６（４）：７３１－４５；ＩｖａｎｏｖＩＰ，ＬｏｕｇｈｒａｎＧ，ＳａｃｈｓＭＳ，ＡｔｋｉｎｓＪＦ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１０；１０７（４２）：１８０５６－６０）。

［０１９６］コザックは、ＣＣＲＣＣＡＵＧＧ（プリン、Ｒ＝Ａ又はＧ；開始コドンに下線）が非常に効率的な哺乳動物ＴＩＳであることを報告した（ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８１；９（２０）：５２３３－５２）。その配列内で、－３位のプリン（ＡＵＧコドンの３ヌクレオチド上流）は、脊椎動物のメッセンジャーＲＮＡにおいて最も高度に保存されている（ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７；１５（２０）：８１２５－４８）。点変異の研究は、最適な翻訳効率にとって重要であるとして、－３位のＡ又はＧ、及び＋４位のＧ（ＡＵＧコドンの直後）の重要性の証拠を提供する（ＫｏｚａｋＭ．ＥＭＢＯＪ．１９９７；１６（９）：２４８２－９２）。コザックコンセンサス配列は、種間で長さとヌクレオチド組成が異なるが、種内のほとんどの遺伝子で保存されている。驚くことではないが、コザック配列の点突然変異は、高等真核生物（ＫｏｚａｋＭ．Ｃｅｌｌ．１９８６；４４（２）：２８３－９２）と低等真核生物（ＤｖｉｒＳ，ＶｅｌｔｅｎＬ，ＳｈａｒｏｎＥ，ＺｅｅｖｉＤ，ＣａｒｅｙＬＢ，ＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒＡ，ｅｔａｌ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１３；１１０（３０）：Ｅ２７９２－８０１）の両方で翻訳開始に影響を及ぼし、がん及び代謝障害などのヒトの疾患の発症に関連してきた（ＳｏｎｅｎｂｅｒｇＮ，ＨｉｎｎｅｂｕｓｃｈＡＧ．Ｃｅｌｌ．２００９；１３６（４）：７３１－４５；ＭｏｈａｎＲＡ，ｖａｎＥｎｇｅｌｅｎＫ，ＳｔｅｆａｎｏｖｉｃＳ，ＢａｒｎｅｔｔＰ，ＩｌｇｕｎＡ，ＢａａｒｓＭＪ，ｅｔａｌ．ＡｍＪＭｅｄＧｅｎｅｔＡ．２０１４；１６４Ａ（１１）：２７３２－８）。

［０１９７］コザック配列のバリアントが工業化された産生体細胞株におけるタンパク質産生を調整できるかどうかを調査するために、Ｆｃ融合タンパク質をコードするＯＲＦの開始コドンの上流の－３位と、－３位、－２位、－１位の組み合わせとを変化させた。

方法
細胞株及び細胞培養
［０１９８］ＣＨＯ細胞株を、プレートでの一過性トランスフェクションアッセイ、及び標的組み込みを介した構成的抗体産生細胞株に使用した。１５０ｒｐｍ、３７℃及び５％ＣＯ_２の１２５ｍＬの振盪フラスコ容器中のＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中でＣＨＯ細胞を培養した。３～４日毎に３×１０^５細胞／ｍｌの播種密度で細胞を継代した。

一過性トランスフェクション
［０１９９］製造業者の勧告に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、リポフェクタミン２０００ＣＤを使用して一過性トランスフェクションプラスミドでＣＨＯ細胞を形質転換した。内部対照として、高発現抗体及び低発現抗体のＤＮＡも保有した。簡潔には、５００μｌの培地中のＤＮＡベクター（２μｇ）プラス１０μｌのリポフェクタミンを室温で３０分間インキュベートし、複合体の形成を促進させた。ＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中で指数関数的に成長するＣＨＯ細胞プラス５％ＤＦＢＳを含有する９６ウェルプレート（ＦａｌｃｏｎＲ）にトランスフェクション複合体を移し、総作業量がおよそ２．５ｍｌになるようにした。形質転換された細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２、湿度８０％で培養した。トランスフェクションから２４時間後、細胞培養培地を産生培地に交換し、その後、細胞を３３℃で培養した。各トランスフェクションは２つの生物学的複製で実施した。抗体濃度の決定については、上清サンプルをトランスフェクションから４８時間後に培養物から回収し、ＨＴＲＦ（均一時間分解ＦＲＥＴ）アッセイによって複製でアッセイした。

均一時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイ
［０２００］ＨＴＲＦアッセイについては、Ｄｅｇｏｒｃｅ，Ｆ．，ｅｔａｌ．（２００９）ＣｕｒｒＣｈｅｍＧｅｎｏｍｉｃｓ３：２２－３２を参照のこと。

コザック配列バリアントの設計及び構築
［０２０１］コザック（ＫｏｚａｋＭ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８７；１５（２０）：８１２５－４８）によって決定された、脊椎動物の翻訳開始部位周辺のヌクレオチド頻度に基づき、これらの位置で頻度が低い及び頻度が中程度のバリアントを、図１に示すように設計した。Ｆｃ融合タンパク質Ａ又はＢのコザック配列バリアントのＤＮＡは、Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．によって合成された。バリアントを、ＣＭＶプロモーターの転写制御下でアンピシリン耐性マーカーを使用して、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈの一過性トランスフェクションベクター特性でクローン化した。ユニバーサルフォワードプライマー及びユニバーサルリバースプライマーを使用して配列の検証を行った。

ＤＮＡライブラリ設計
［０２０２］Ｆｃ融合タンパク質Ｂを、コザック配列の合成ＤＮＡライブラリのための骨格として使用した。多様化する位置は、４つのヌクレオチドのいずれかに対する開始コドンの－５、－４、－３、－２、－１、及び＋４であった。ライブラリはＧｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ．によって合成された。ライブラリを、ＣＭＶプロモーターの転写制御下でアンピシリン耐性マーカーを使用して一過性トランスフェクションベクターでクローン化した。ライブラリをＭａｘＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換し、個別のコロニーの選択を最適化するために希釈を複数回行った。個別のコロニーのＤＮＡの調製を、製造業者の勧告に従って行った（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。ユニバーサルフォワードプライマー及びユニバーサルリバースプライマーを使用して配列決定を行った。

安定なベクター構築
［０２０３］２つの組み込み抗体発現ベクターを使用して、二重特異性の安定な細胞株を発生させた。発現ベクターは、２つの別個のユニットとして重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）の両方の転写を指示する２つの別個のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｌｂｏｎｉｇｅｒピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ＰＵＲ）（ＶａｒａＪＡ，ＰｏｒｔｅｌａＡ，ＯｒｔｉｎＪ，ＪｉｍｅｎｅｚＡ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９８６；１４（１１）：４６１７－２４）遺伝子を、一方のプラスミドにおける選択マーカーとして使用した。ハイグロマイシン耐性（ＨｙｇＲ）をもたらす正負選択マーカーを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子を、他方のプラスミドにおける選択可能マーカーとして使用した。異なるコザック配列バリアント下で５本の重鎖と５本の軽鎖の組み合わせをクローン化することによって１群当たり２５の発現ベクターを生成して、コザック混合プールを生成した。２つの発現プラスミド（Ｗｔコザック配列下で重鎖と軽鎖を有する各抗体に１つ）を使用して、Ｗｔコザックプールを発生させた。

安定な細胞株の発生
［０２０４］製造業者の勧告に従ってＭａｘＣｙｔｅＳＴＸＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを使用して（ＭａｘＣｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＣＨＯ細胞を形質転換した。形質転換した細胞を２つの別個のプールにプールし、ピューロマイシン５μｇ／ｍｌ及びＦＩＡＵ０．５μＭを含有する選択的培地で選択した。回収後、０．５ｍｍ細孔サイズのＩｎｔｅｇｒａＶｉａｆｉｌｌ滅菌８チャネル管（ＩｎｔｅｇｒΛ）を備えたＷｅｌｌｍａｔｅＭｉｃｒｏｐｌａｔｅディスペンサ（ＴｈｅｒｍｏＭａｔｒｉｘ）を使用して、１細胞／ウェルでの希釈を３８４ウェルの透明な平底組織培養処理プレート（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に制限することにより、１つのプールに単一細胞クローニング（ＳＣＣ）を施した。プレートを３７℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。播種の３～４週間後、７０４の個別のコロニーを９６ウェルプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に採取し、約２日後に均一時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）を使用して抗体産生について評価した。上位４８、続いて上位２４の抗体発現クローンを、ＨＴＲＦを介してアッセイした。上位１１の単一細胞クローンを懸濁液の成長に適応させ、産生アッセイで評価した。上位のクローンと比較して中程度及び低いＨＣＣＦ力価を示したさらに７つのクローンも、さらなる分析のために選択した。

振盪フラスコフェッドバッチ産生アッセイ
［０２０５］化学的に定義された基本培地を含む振盪フラスコ（ＣｏｒｎｉｎｇＩｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で、７日目及び１０日目にボーラス投与を伴って、フェッドバッチ産生培養を実施した。１．０ｘ１０^６細胞／ｍｌで細胞を播種した。３７℃から３５℃への温度変更が３日目に行われた。１４日目の力価は、ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して決定された。０日目、３日目、７日目、１０日目、及び１４日目に、Ｖｉ－ＣｅｌｌＸＲ機器（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して、生存率及び生細胞数を決定した。Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ４００Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮｏｖａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、７日目及び１４日目にグルコース濃度及び乳酸濃度をモニターした。

抗体表面染色プロトコル
［０２０６］抗体表面染色について、約２百万個の細胞をペレット化し、ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。その後、抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，ＷｅｓｔＧｒｏｖｅ，ＰＡ）を１：１００の希釈で含有する０．５ｍＬのＰＢＳに細胞を再懸濁し、振盪しながら３７℃で２０分間インキュベートした。非染色の対照サンプルを、抗体を含まないＰＢＳに再懸濁した。空の宿主も染色してゲートを設定した。染色抗体で２０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４００μｌのＰＢＳに再懸濁した。その後、細胞をＦＡＣｓｃａｎフローサイトメーター（ＡｔｔｕｎｅＮｘＴＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｅｒ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。各分析について、２００００の事象を記録した。

産生物品質分析
［０２０７］総タンパク質Ａ－精製抗体に非還元キャピラリー電気泳動キャピラリードデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）を施すことにより、標準的な産生物品質分析を行った。ＴＥＣＡＮＥｖｏ２００システムを使用して、サンプル調製を自動化した。すべてのサンプルを１ｍｇ／ｍｌに希釈して、一貫した液体処理を確実にし、最適な色素対タンパク質比を維持した。調製した試料をｌａｂＣｈｉｐＧＸＩＩシステムで直ちに分析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアを使用してデータ処理した。シグナル強度、ピークプロファイル、及び相対的なピーク面積の分布を評価した。

質量分光光度法
［０２０８］タンパク質産生物関連バリアントを同定及び定量化するために、ＨＰＬＣ－Ｃｈｉｐ分離及びイオン源を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ６２３０Ｔｉｍｅ－ｏｆ－Ｆｌｉｇｈｔ質量分析計で、定性分析及び質量決定を実施した。ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアを使用してデータデコンボリューションを実施した。我々は、二重特異性並びにＬＣ及びＨＣの化学量論が正しくない種のイオン存在量を決定した。

ゲノムＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、及び配列決定
［０２０９］製造業者のマニュアルに従って、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ゲノムＤＮＡの抽出を実施した。ＳｉｍｐｌｉＮａｎｏＭｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＧＥＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを定量化した。Ｑ５（登録商標）ＨｏｔＳｔａｒｔＨｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ２ＸＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。１μｇのｇＤＮＡをテンプレートとして使用した。ＰＣＲ条件を最適化した。６４℃のアニール温度及び３０サイクルを使用した。各鎖の可変領域の特異的なアニーリングプライマーは、分子間で同じ鎖を区別するように設計されている。以下のフォワードプライマー（Ｆ）及びリバースプライマー（Ｒ）を使用して、Ａｂ１重鎖、Ａｂ１軽鎖、Ａｂ２重鎖、及びＡｂ２軽鎖を増幅させた：ＨＣ－Ａｂ１：Ｆ－５’－ＧＡＴＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴ－３’（配列番号１２）及びＲ－５’－ＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧ－３’（配列番号１３）；ＬＣ－Ａｂ１：Ｆ－５’－ＣＴＧＡＡＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡ－３’（配列番号１４）及びＲ－５’－ＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧ－３’（配列番号１５）；ＨＣ－Ａｂ２：５’－ＧＴＧＡＴＴＴＧＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＡ－３’（配列番号１６）及びＲ－５’－ＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧ－３’（配列番号１７）；及びＬＣ－Ａｂ２：５’－ＧＴＧＣＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧ－３’（配列番号１８）及びＲ－５’－ＡＴＧＧＧＣＧＧＴＡＧＧＣＧＴＧＴＡＣＧＧ－３’（配列番号１９）。製造業者の指示に従ってＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＰＣＲ産生物を洗浄し、１２ウェル、２％の予め作られたアガロースゲルで正しいサイズを分析した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。以下のプライマーを使用して、配列決定を実施した：ＳＥＱ１：５’－ＡＡＣＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧＡＡＣＧＣＧＧ－３’（配列番号２０）及びＳＥＱ２：５’－ＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣ－３’（配列番号２１）。各クローンの各鎖のコザック配列バリアントを少なくとも２回確認した。配列決定により、鎖のうちの一本が存在しないコザック混合クローンが明らかになった。Ａｂ２－ＬＣ、Ａｂ２－ＨＣ、Ａｂ１－ＬＣ、Ａｂ２－ＨＣ、及びＡｂ１－ＬＣについて、これらは、それぞれ、コザック混合クローン３、１１、２９、６０、２１Ｌであった。コザック混合クローン２４は、Ａｂ１のＨＣ及びＬＣを有しない（図２３Ａ－２３Ｃ）。

結果
［０２１０］コンセンサスコザック配列の変化が工業化された産生体細胞株におけるタンパク質産生を調整できるかどうかを調査するために、Ｆｃ融合タンパク質「Ａ」をコードするＯＲＦの開始コドンの上流の－３位と、－３位、－２位、－１位の組み合わせとを変化させた（図１）。ＣＨＯ産生細胞株における一過性トランスフェクションによりコザック配列バリアントを試験し、ＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）アッセイによってＦｃ融合タンパク質産生をトランスフェクションの４８時間後に評価した。十分に発現する抗体及び十分に発現しない抗体もまた、内部アッセイ対照として含まれた。

［０２１１］図２に示すように、コンセンサスコザック配列の変化は、Ｆｃ融合タンパク質Ａの力価を調節した。その結果、－３位でのプリンの存在により（ＧＣＣＡＴＧＧ及びＡＣＣＡＴＧＧ、それぞれ配列番号４及び３）、高レベルのＦｃ融合タンパク質Ａの力価が産生されたことを確認した。評価された最弱のコザック配列バリアント、ＴＴＴＡＴＧＧ（配列番号７）は、コザックコンセンサスの半分のレベルで力価を調節した。以下、野生型（Ｗｔ）コザックと称する。

［０２１２］Ｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｉｆコザック配列バリアントが分子に関係なくタンパク質産生を調節することができるかを決定するために、異なるＦｃ融合タンパク質におけるこれらの組み合わせを試験した：Ｆｃ融合「Ｂ」（図２）。Ｆｃ融合Ａのコザック配列バリアントでトランスフェクトされた細胞と同様に、Ｆｃ融合Ｂのコザック配列バリアントでトランスフェクトされた細胞は、Ｗｔコザックと比較して力価を変化を示し、同様のパターンがＦｃ融合Ｂのバリアントについて観察された。これらの結果は、Ｗｔコザック配列の変化を使用して抗体力価を調整することができることを示唆した。

実施例２：発現レベルの範囲を広げるためのコザック配列のライブラリの設計及びスクリーニング
［０２１３］Ｗｔコザックの０．１×から１．０×倍の包括的な範囲の発現レベルを達成するために、追加のコザック配列バリアントを試験した。正常に機能する分子の代表であるＦｃ融合タンパク質ＢをコードするＯＲＦを使用するコザック配列のバリアントライブラリを設計及びスクリーニングした。ライブラリは、開始コドンの上流（位置－５、－４、－３、－２、及び－１）の５つの塩基及び下流（位置＋４）の１つの塩基の４つのヌクレオチドのいずれかへのランダム化を包含した（図４）。この構築物の予想される多様性は、コザック配列の約４１００のバリアントである。位置＋４のランダム化は、この位置がアデニン（Ａ）又はシトシン（Ｃ）に占有されていたとき、シグナル配列の第２の位置に存在するグリシンからアルギニンへのアミノ酸変化を生み出した。ライブラリはコンピテントな大腸菌細胞に形質転換され、設計されていない変異、欠失、及びシグナル配列の第２のアミノ酸として終止コドンを含有するバリアントを示したものを除外するために個別のバリアントのスクリーニングがなされ、これは、位置＋４がチミン（Ｔ）に占有されていたときに生じた。

結果
［０２１４］ＣＨＯ細胞中における一過性トランスフェクションによる初回のスクリーニングは１１１の正しいバリアントで実施され、これには、シグナル配列の第２のアミノ酸の変化の対照として、Ｗｔコザック及び位置＋４にＣ又はＡを有するＷｔコザックが含まれた。図５に示す通り、ＨＴＲＦアッセイによる一過性トランスフェクションの４８時間後に測定されたＦｃ融合タンパク質力価は、広範な発現レベルを示した。０．０５から１．５４単位の正規化された力価のほぼ連続的な範囲の翻訳が観察された。ここで、１．０はＷｔコザックに相当する。これらのバリアントは、さらなるバリアントスクリーニングが停止されるように、所望の発現範囲の目標を満たした。概して、開始コドンの上流のコザック配列に関係なく、位置＋４におけるＡ又はＣの存在が、Ｗｔコザックにわたる力価を増加させた。スクリーニングは繰り返され、２つの独立した一過性トランスフェクションのデータが表された（図５）。

［０２１５］図６に示す通り、分析されたバリアントのヌクレオチド分布がランダム化され、ライブラリスクリーニングが歪曲しなかったことを示した。次に、バリアントをそれぞれの力価及びパフォーマンスに基づいて５つのグループに分類した。グループの範囲は以下の通りであった：グループＩ、０．０５－０．３；グループＩＩ、０．３１－０．６；グループＩＩＩ、０．６１－０．８；グループＩＶ、０．８１－１．００；及びグループＶ、１．０１－１．３４。最弱のグループのほとんどの位置でのアデニンとチミンの優先度、及び最強のグループのシグナル配列の第２のアミノ酸としてのアルギニンを除いて、抗体産生とコザック配列バリアントとの間の他の相関関係は検出されなかった。バリアントの数を減少させるために、一過性トランスフェクションを数回行った（図７）。バリアントをラウンドツーラウンドで選択するための基準は、一過性トランスフェクション間の再現性、異なるＤＮＡ調製物間の安定性、及びヌクレオチド多様性の保存であった。図８Ａー８Ｂで示すように、このスクリーニングは、１１のコザック配列バリアントを確立した。これは、Ｗｔコザックの０．２から１．３倍の発現範囲を示し、高精度で力価の調節を可能にする。

実施例３：コザック配列バリアントの混合下の二重特異性の安定なクローンの生成
［０２１６］二重特異性抗体のような複雑な抗体フォーマットの工学は進歩してきたが、単一の哺乳動物発現系における製造可能性は低いパフォーマンスを示すことが多い。低い力価と不十分な産生物品質は、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の安定した産生を困難にする要因の２つである。結果として、産生システムの制限ステップを同定する緊急の必要性がある。単一細胞での二重特異性及び他の多重鎖フォーマットの組み立ての効率を制限する１つのボトルネックは、個別の鎖レベルの制御が制限されることである。多重鎖フォーマットで個別の鎖の比を調整できるベクターを設計すると、翻訳開始領域（ＴＩＲ）バリアントを使用して大腸菌で以前に実証されたように組み立て効率を向上させることができる（ＳｉｍｍｏｎｓＬＣ，ＹａｎｓｕｒａＤＧ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６；１４（５）：６２９－３４。例えば、図９に示すとおり、ＢｓＡｂを構成する軽鎖の比（ＬＣ１：ＬＣ２）は、正しく組み立てられたＢｓＡｂの割合がより高くなるように操作され得る。

［０２１７］二重特異性抗体を生成するには、二重特異性フォーマットにマージするための固有の親抗体比を同定する必要があるため、単一細胞でＢｓＡｂのより高い組み立てと産生をもたらすコザック配列バリアントの能力を試験した。タンパク質発現を調節するための技術としてのコザック配列バリアントの上首尾の適用は、安定な宿主細胞株の確立において評価された。そうするためには、Ｗｔコザックを含む５つのバリアントの代表的なパネルを選択した（図１０及び図８Ａ）。これらのバリアントの相対タンパク質産生強度は、それぞれ、コザック配列バリアント＃３、＃１３５、＃１４８、Ｗｔ、及び＃２２８のＷｔコザック配列の約０．３×倍、約０．５×倍、約０．８×倍、約１．０×倍、及び約１．３×倍であった。よって、バリアントのパネルは、一過性トランスフェクションで観察された広範な発現レベルをカバーした（図１０）。

［０２１８］二重特異性抗体Ａｂ１／Ａｂ２をモデルとして選択し、以下の基準に基づいて鎖比の調整に対するコザック配列の効果を評価した。第１に、産物の分析と特性評価を容易にする、十分に特性評価されたプロセス開発プラットフォームがＡｂ１／Ａｂ２で利用可能であった。第２に、Ａｂ１は発現が不十分な分子であり、転写プロセスの下流にボトルネックがあるが、Ａｂ２は十分機能する分子の例である。これは、首尾のよい鎖対合を作成するためのコザック配列バリアントの能力を試験するための適切なシナリオである。

［０２１９］重鎖ヘテロ二量体化を優先的に促進するために、Ａｂ２とＡｂ１の両方の重鎖（ＨＣ）はそれぞれノブ変異及びホール変異を保有していた。点変異を使用して、軽鎖（ＬＣ）誤対合を軽減した（ＤｉｌｌｏｎＭ，ＹｉｎＹ，ＺｈｏｕＪ，ＭｃＣａｒｔｙＬ，ＥｌｌｅｒｍａｎＤ，ＳｌａｇａＤ，ｅｔａｌ．ＭＡｂｓ．２０１７；９（２）：２１３－３０）。５つのコザック配列バリアントの先述のパネル下での重鎖と軽鎖の組み合わせを使用して、２５の組み込み発現ベクターを発生させた（図１１）。５０のプラスミドの混合物をＣＨＯ細胞中にトランスフェクトした（以下、コザック混合と称する）。このアプローチで生成された多様性は、潜在的な６２５の異なる鎖比の組み合わせに達した。基準値として、４本の鎖を、Ｗｔコザック配列下でＢｓＡｂのクローン化し、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトし、並行して保有した（以下、Ｗｔコザックと称する）。各条件について２の異なるトランスフェクションを実施した。

結果
［０２２０］トランスフェクション効率を、総ＩｇＧの細胞表面染色によってモニタリングし、ＦＡＣＳ分析によって測定した。図１２は、同様のトランスフェクション効率が、コザック混合プールとＷｔコザックプールの両方について観察されたことを示す。発現プラスミドのトランスフェクション後、安定な細胞プールを薬物選択によって確立した。図１３Ａ及び１３Ｂに示すとおり、選択薬物の追加後（黒の矢印で示す）、コザック混合プールとＷｔコザックプールの両方について同様の細胞生存率が観察された。次に、各条件の各トランスフェクションの１つの安定したプールを選択し、単一細胞のクローニングを行った。回収後、プレートをクローン回収速度について分析し、１プール及び条件ごとに７０４の回収されたクローンを９６ウェルプレートに採取した。採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）力価に基づく一次スクリーニングでは、条件間でプロファイル及び絶対力価に違いを示した。コザック混合クローンは、Ｗｔコザッククローンよりも絶対力価が低く、力価のより顕著な減少を示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。この結果は、コザック混合クローンにおいて計画された鎖比の組み合わせの多様性と一致するが、Ｗｔコザッククローンのプロファイルは、１つの鎖比の組み合わせのみを保有するクローンについて予想どおりであった。ＨＣＣＦ力価、懸濁液適応、及びスケールアップに基づく数ラウンドのスクリーニングを完了して、各トランスフェクションのプールごと及び各条件について上位１１のクローンを決定し、各条件で合計２２のクローンを作成した。各コザック混合クローンは異なるコザック配列バリアントの組み合わせを保有する可能性を有するという事実により、及び、組み合わせ間の違いを理解するために、上位のクローンと比較して中程度及び低いＨＣＣＦ力価を示したさらに７つのクローンも、さらなる分析のために選択した。

実施例４：コザック配列バリアントの混合に由来する二重特異性の安定なクローンの振盪フラッシュパフォーマンス
［０２２１］１４日間の振盪フラスコフェッドバッチ産生を使用して、上の実施例３から選択された各個別のクローンの産生性及び二重特異性アセンブリを評価した。調査したすべてのクローンは、産生アッセイ全体で同等の生存率を示した。１４日目の最終生存率は、７４％の結果となった１つのコザック混合クローンを除き、両条件でおよそ８０－９５％であった（図１５Ａ＆１５Ｂ）。同様に、すべての個別のクローンについて、生細胞数は、７日目まで指数関数的な成長速度を示し、その後プラトー期に達した（図１６Ａ及び１６Ｂ）。各クローンの全体的な力価について、産生物品質及び組み立て効率を１４日目に測定した。

［０２２２］図１７に示すとおり、個別のＷｔコザッククローンは、両トランスフェクションにおいて個別のコザック混合クローンよりも高い一般的な絶対的抗体力価を示した。この力価では、正しく組み合わされた二重特異性抗体、半抗体、及び他の望ましくない副産物がすべて表されることに留意されたい。産生物品質を評価するために、非還元キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）によりサンプルを分析して、分子量形態及び他の不純物についての情報を提供した。この技法は、２つのフォーマット：正しく組み立てられたＢｓＡｂと正しく組み立てられていないＢｓＡｂのフォーマットの完全抗体（ｆｕｌｌ－ａｂ）と同等視されたメインピークと、異なる分子量の他の種を表すプレピークの合計とを区別及び定量化を可能にした。概して、上位２２のクローン中、Ｗｔコザッククローンと比較して、完全ａｂ形成の割合が高いコザック混合クローンは少ないことが観察された（図１８）。この結果は、鎖比の組み合わせは条件間で異なったが（Ｗｔコザッククローン及びコザック混合クローンについてそれぞれ１対６２５）、同数の個別のクローンが各条件についてスクリーニング及び選択され、これは、産生物品質の高いＷｔコザッククローンをより多く見つけるのに有利に働いたという事実と一致している。完全抗体の割合はクローンごとにさまざまである。トランスフェクション２の４つの個別のコザック混合クローンは、完全抗体のおよそ６０％の範囲であったが、その後３０％まで低下した。

［０２２３］トランスフェクション１の個別のコザック混合クローンのすべては、メインピークのおよそ３０％を示した（図１８）。この結果は、コザック混合プールの鎖比の組み合わせの多様性において、その一部は完全ａｂの産生に関して弱かったという事実と一致している。加えて、コザック混合クローンでは最高の抗体産生クローンのすべて（全体的な力価）が完全ａｂの最高含有量と関連しているわけではない。

［０２２４］概して、最良の単一Ｗｔコザッククローンは、完全ａｂ産生の８０－９０％の範囲であった。コザック混合クローンと同様に、個別のＷｔコザッククローンは、クローンに応じてメインピークの割合のばらつきを示した。また、これらのクローンの高い全体的な力価とメインピークの高い含有量との間の相関関係も観察された（図１８）。

［０２２５］並行して、上位クローンと比較して中程度及び低いＨＣＣＦ力価を有する７つの追加のクローンの産生における性能の評価を行った。これらのクローンの産生力価は、一次スクリーニングにおいて以前観察されたのと同様の挙動を示した（図１９）。ＣＥ－ＳＤＳデータは、産生物品質がクローンごとにさまざまであったことを示した。同じく、一般的な力価と完全抗体の最高含有量との間に直接的な相関関係はなかった。このやり方では、上位１１のクローンと比較してより穏やかな力価を有する一部のコザック混合クローンは、約５０－６０％の完全ａｂの同様の割合を示した（図１９Ｂ）。

実施例５：コザック配列バリアントは、安定なクローンにおいて二重特異性アセンブリを増強した
［０２２６］条件及びトランスフェクションごとのＣＥ－ＳＤＳ分析から上位４つのクローンを分析して、ＨＣ及びＬＣの誤対合を同定及び定量化した。タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して細胞培養培地からＩｇＧを回収し、得られたプールをインタクトな液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。データデコンボリューションの後、半抗体（ＨＣ＋ＬＣ）、ホモ二量体（同じＨＣの２つ）、及び誤対合ＬＣ－ＨＣ種を含む複数の産生物関連バリアントを同定した。方法のセクションで報告された計算を使用して、ＬＣ－ＭＳデータを使用してＣＥ－ＳＤＳの結果を直交的に重み付けし、同様の質量を有するためにＣＥ－ＳＤＳで分析的に重複する種の割合を報告した。

結果
［０２２７］７つの異なる二重特異性抗体フォーマット及び３つの半抗体フォーマットを区別及び定量化した（図２０Ａ）。最良の個別のコザック混合クローンは、正しく組み立てられたＢｓＡｂの約４０％を示した。これは最良の個別のＷｔコザッククローンで観察されたもの（約１８％）の２倍超である（図２０Ａ）。一つ一つのコザック混合クローンがコザック配列バリアントの異なる組み合わせを潜在的に保有するため、すべてのクローンは異なる割合のＢｓＡｂアセンブリを示したが、同じ組み合わせを保有するＷｔコザッククローンは同様の量のＢｓＡｂアセンブリを示した。注目すべきは、正しく組み立てられていない二重特異性フォーマットＡｂ１－ＨＣ＋Ａｂ２－ＨＣ＋２ｘＡｂ２－ＬＣ（軽鎖の誤対合を有した）は、Ｗｔコザッククローンによって産生された完全抗体の４１％から６４％の範囲であった（図２０Ａ）。これらのデータは、単一細胞産生を使用するときにＢｓＡｂアセンブリを達成するために軽鎖の比を調整することの重要性を指摘している。ＣＥ－ＳＤＳによって測定された、最低の完全ａｂ形成収率を有するコザック混合クローンの質量分析による分析は、それらのクローンの産生材料の大部分が半ａｂであることを確認した。フォーマットは、Ａｂ１－ＨＣ＋Ａｂ２－ＬＣ及びホール半Ａｂ１であった。これらのクローンによって示されたＢｓＡｂフォーマットは、ほとんどは正しく組み立てられていないＢｓＡｂ２ｘＡｂ１－ＨＣ＋２ｘＡｂ２－ＬＣであり、少ない割合がＢｓＡｂフォーマット２ｘＡｂ２－ＨＣ＋Ａｂ１－ＬＣ＋Ａｂ２－ＬＣであった（図２０Ａ）。

［０２２８］各フォーマットのパーセンテージを理解して、有効な二重特異性力価を計算した（図２０Ｂ）。一部のコザック混合クローンはＷｔコザッククローンよりもＢｓＡｂの組み立てが高いという事実により、コザック混合クローンは、先に示されている一般的な力価の不足を打開する（図１７及び図２０Ａ－２０Ｂ）。効果的な二重特異性力価は、最良のＷｔコザッククローン及びコザック混合クローンについてそれぞれ０．７ｇ／Ｌ及び０．６ｇ／Ｌの条件ごとに最良のクローン間で同様であった。すべてのコザック混合クローンが異なるコザックバリアントの組み合わせを潜在的に保有するため、各クローンは、異なる割合のｂｓＡｂアセンブリを示したが、同じ組み合わせを保有するＷＴコザッククローンは、ｂｓＡｂ組み立てのはるかに狭い範囲を示した（図２０Ａ）。注目すべきは、正しく組み立てられていない二重特異性フォーマットＡｂ２ＨＣ＋Ａｂ１ＨＣ＋２ｘＡｂ２ＬＣ（軽鎖の誤対合を有した）は、Ｗｔコザッククローンによって産生された完全ａｂの４１－６４％の範囲であった（図２０Ａ）。これらのデータは、単一細胞産生を使用するときに正しいｂｓＡｂアセンブリを達成するために軽鎖の翻訳レベルを調整することの重要性を指摘している。

［０２２９］しかしながら、図２０Ｂに示すとおり、コザッククローンは、Ｗｔコザッククローンと比較して、精製中に除去されるべき少量の不純物を示す。一部のコザック混合クローンはＷｔコザッククローンよりもＢｓＡｂの組み立てが高いという事実により、一部のコザック混合クローンは、図１７で先に示されている一般的な力価の不足を打開する。重要なことに、コザック混合クローンはまた、ＷＴコザッククローンよりも少量の産生物関連不純物を示した（図２０Ｂ）。多数にほぼ同一の潜在的な副産物からの正しく組み立てられたｂｓＡｂの精製は困難である。副産物の一部は標的ｂｓＡｂと酷似しているため、下流でのそれらの除去は、多くの場合、収率又は産生物品質を犠牲にして行われる。目的の産生物とこれらの固有の不純物を差別化するために新しい分析方法が必要であったが、それらには高コストの製造及び複雑な技術が必要である。コザック混合クローンは、不純物及び産生物関連バリアント形成を最小限に抑え（図２０Ｂ及び２２Ｂ）、このアプローチが単一細胞においてｂｓＡｂを産生する利益を実証した。

［０２３０］これらのデータは、コザック配列バリアントを使用して翻訳強度を調整することによって、ＣＨＯ細胞において、二重特異性抗体の組み立てが改善され、産生物関連不純物が減少することを示す。

実施例６：コザック配列バリアントで鎖比を調整することにより高収率のＢｓＡｂが産生される
［０２３１］ＢｓＡｂの組み立て効率及び産生物品質に関してコザック混合クローン間で観察された異質性及び多様性は、各クローンが異なるコザック配列バリアント下で鎖発現を有することを示唆した。各クローンが最良の組み合わせを有する及び決定するコザック組み合わせを同定するために、２９のコザック混合クローンの配列決定を実施した。

結果
［０２３２］データは、産生物の収率が低いコザック混合クローンが、最弱のコザック配列バリアントＫｚ．１３５及びＫｚ．３のどちらかの下でＡｂ２の重鎖の発現を有し、鎖の残りがＷｔ又は最強コザック配列バリアントのいずれかを有することを示した（図２１Ａ－２１Ｂ）。結果として、不十分な量のＡｂ２の重鎖が生成された可能性が高く、結果的に、最終産生物は、優先的には、Ａｂ１－ＨＣ＋Ａｂ２－ＬＣのフォーマットの半ａｂ、又はホール半Ａｂ２であった（図２０Ａ）。言い換えれば、完全ａｂアセンブリを損なう前に重鎖の発現を減少させることができる範囲があった。

［０２３３］あるいは、Ｗｔコザックと最強のコザック配列バリアントの両方の組み合わせが４本の鎖の発現を調節するとき、コザック混合クローンは、高い力価を有する高いＢｓＡｂ組み立てを示した（図２１Ａ）。一方、ＷＴコザックと最強のコザック配列バリアント（Ｋｚ．２２８；１．３の相対強度）との両方の組み合わせが４本の鎖の発現を調節するとき、コザック混合クローンは、高いｂｓＡｂ組み立て及び効果的な力価を示した（図２０Ａ及び２１Ａ、コザック混合クローン６９、６１、及び８８）。興味深いことに、それぞれコザック混合クローン６９及びコザック混合クローン６１によって示される、Ａｂ１の軽鎖の１．３ｘ倍対Ａｂ２の軽鎖の１．０ｘ倍、又はその逆のわずかな軽鎖比は、ＷＴコザッククローンで観察されたＡｂ２軽鎖誤対合を著しく減少させた（図２０Ａ；Ａｂ２ＨＣ＋Ａｂ１ＨＣ＋２ｘＡｂ２ＬＣ）。これらのデータは、選択された鎖の翻訳の減少が、他の鎖の翻訳レベルと比べて、ｂｓＡｂアセンブリを効率的に増加させることができ、亜種の蓄積を制限することによって全体的な産生物の品質を改善できることを示唆した。しかしながら、最強のコザック配列バリアント下での軽鎖のいずれかの発現は、より正確に組み立てられたＢｓＡｂの代わりに、その鎖によって構成されるより多くの副産物の産生を促進した。例えば、最強のコザック配列下で軽鎖Ａｂ１を有するコザッククローン６９は、ホール１／２Ａｂ１として産生物の約３０％を示した（図２０Ａ）。この観察結果は、ＢｓＡｂの製造には、二重特異性フォーマットにマージするために化学量論的な鎖対合が必要であるという事実と一致していた。この点では、タンパク質産生系の飽和は、亜種の蓄積をもたらし得る。

［０２３４］これを考慮すると、理論に拘束されることを望まないが、翻訳の減少は、亜種の蓄積を防止することができ、収率の上昇をもたらすことができると考えられる。この結論と一致して、上位クローンの力価の半分で実施され、弱いコザック配列、バリアント＃１３５下でＡｂ１の重鎖と軽鎖の両方を保有した１つの組み合わせは、検出された最高の二重特異性組み合わせを示した（図２２Ｄ）。このクローンのＣＥ－ＳＤＳデータは、産生品質が、完全ａｂの約４８％及び半ａｂの約５２％であることを示した。ＭＳデータは、完全ａｂの１００％が二重特異性フォーマットのみに対応することを示した。これは正しく組み立てられたＢｓＡｂの約５０％である。一方、半ａｂ種のほぼすべてはノブ１／２Ａｂ２であった（図２２Ａ－２２Ｂ）。これは、Ａｂ２の重鎖及び軽鎖は、それぞれ、Ｗｔコザック配列及び最強のコザック配列バリアント＃２２８の下にあったという事実と一致している。したがって、特定の範囲内では、産生プロセス中に翻訳の下流でボトルネックを示す可能性が高い分子の両鎖の発現の下方制御は、組み立て効率に好影響を有した。

［０２３５］一次ＨＣＣＦ力価は中程度であったが、クローン１７Ｍは先に進められた追加のクローンの１つであった。このクローンは、上位コザッククローンの効果的な力価のおよそ半分のみを有したが、約４８％で最高の二重特異性アセンブリを示した。ＭＳデータは、完全ａｂの１００％が正しい二重特異性フォーマットにのみ対応し、半ａｂ種がほぼ独占的にノブ１／２ｍＡｂ２に限定されていることを示した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。

［０２３６］これらのデータは、配列決定の結果から説明することができる（図２２Ｃ）。Ａｂ１の重鎖及び軽鎖の両方は弱いコザックバリアント（Ｋｚ．１３５）下にあったが、先に記載したとおり、Ａｂ１は分子を発現するのが困難である。両鎖の下方制御は、およそ０．５の相対強度を有するＫｚ．１３５を使用する場合、タンパク質の折り畳みなどの翻訳の下流のボトルネックを緩和することができ、組み立て効率に好影響をもたらした。Ａｂ２に関して、重鎖及び軽鎖は、それぞれ、より強いコザック配列である、ＷＴコザック及び最強のコザックバリアント（Ｋｚ．２２８）の下にあった（図２２Ｃ）。

［０２３７］この組み合わせは、ａＡｂ１のより弱いコザック配列と併せて、他の種の有意な蓄積を制限しながら、Ａｂ２半ａｂの蓄積をもたらす。

［０２３８］同じやり方で、上位クローンと比較して中程度及び低いＨＣＣＦ力価を有する７つの追加のクローンの配列決定を行った。概して、両方の分子のほとんどの鎖の発現は、これらのクローンの中で最弱のコザック配列バリアントによって制御されていることが観察された（図２１Ｃ）。この結果は、上位クローンと比較して、これらのクローンのパフォーマンスが低いことを裏付けている。

［０２３９］Ａｂ種及びＢｓＡｂフォーマットを解明するために、上位１１のクローンとは大きく異なるコザック配列バリアントの組み合わせを保有するこれらのコザック混合クローンのうちの５つを質量分光光度法によって分析した。コザック混合クローン１７を除き、ＢｓＡｂアセンブリの割合は１０％未満であった。各種の絶対的存在数は、各鎖の発現強度と相関した（図２２Ｄ）。

［０２４０］先述の開示を、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によってある程度詳細に記載してきたが、その記載及び実施例は、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その全体が参照により明示的に組み込まれる。

Claims

真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを産生するための方法であって、多量体ポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含み、
以下：
（ａ）真核宿主細胞を用意することであって、
真核宿主細胞が、第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、
各サブユニットが真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットが第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方よりも弱い、
真核宿主細胞を用意することと、
（ｂ）第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、発現時に、第１、第２、第３、及び第４のポリペプチド鎖が多量体ポリペプチドを形成する、真核宿主細胞を培養することと、
（ｃ）真核宿主細胞によって産生された多量体ポリペプチドを回収することと、
を含む、方法。
すべてのサブユニットが同じ宿主細胞において発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖が、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで発現される、請求項１に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべてが、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である、請求項１又は２に記載の方法。
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号３）又はＧＡＡＧＴＡＴＧＡ（配列番号１１）を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
第１の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列が配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列が配列番号１１の配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれが、プロモーターに作用可能に結合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合しており、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合している、請求項７に記載の方法。
第１の翻訳開始配列が第３の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
第２の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
第１の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
第２の翻訳開始配列が第３の翻訳開始配列よりも弱い、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
第１の翻訳開始配列が第２の翻訳開始配列と同じである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
第３の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列と同じである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
多量体ポリペプチドが、一又は複数の標的抗原に特異的に結合する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
多量体ポリペプチドが、多重特異性抗原結合タンパク質である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
真核宿主細胞において二重特異性抗体を産生するための方法であって、二重特異性抗体が、第１の抗体重鎖及び第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体と、第２の抗体重鎖及び第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体とを含み、
以下：
（ａ）真核宿主細胞を用意することであって、
真核宿主細胞が、第１の抗体重鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、第１の抗体軽鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、第２の抗体重鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、第２の抗体軽鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドとを含み、
各半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１の半抗体が第２の半抗体よりも低いレベルで発現され、
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い、
真核宿主細胞を用意することと、
（ｂ）第１及び第２の抗体重鎖及び軽鎖の発現に適した条件下で真核宿主細胞を培養することであって、第１及び第２の抗体重鎖及び軽鎖が二重特異性抗体を形成し、ここで、第１の半抗体が第１の抗原に結合し、かつ第２の半抗体が第２の抗原に結合する、真核宿主細胞を培養することと、
（ｃ）真核宿主細胞によって産生された二重特異性抗体を回収することと、
を含む、方法。
第１の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み；かつ第２の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変され；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変される、請求項１７に記載の方法。
第１の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み；かつ第２の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変され；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変される、請求項１７に記載の方法。
ノブ変異が、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、及びＦ４０５Ｗのうちの少なくとも一つを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
ホール変異が、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３９４Ｓのうちの少なくとも一つを含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
ノブ変異がＴ３６６Ｗを含み、ここで、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つすべてを含む、請求項１８から２１のいずれか一項に記載の方法。
第１の抗体軽鎖が第１の変異を含み、第１の抗体重鎖が第２の変異を含み、第１及び第２の変異が、第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖との選択的会合を促進する、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
第１の変異がＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、第２の変異がＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）、請求項２３に記載の方法。
Ｓ１８３置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、Ｖ１３３置換が、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
Ｓ１８３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらすか、又は、Ｓ１８３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらす、請求項２４又は２５に記載の方法。
第２の抗体軽鎖が第３の変異を含み、第２の抗体重鎖が第４の変異を含み、第３及び第４の変異が、第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖との選択的会合を促進する、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
第３の変異がＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、第４の変異がＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）、請求項２７に記載の方法。
Ｓ１８３置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、Ｖ１３３置換が、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
Ｓ１８３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらすか、又は、Ｓ１８３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらす、請求項２８又は２９に記載の方法。
第１の抗体軽鎖がＶ１３３Ｋ変異を含み、第１の抗体重鎖がＳ１８３Ｅ変異を含み、第２の抗体軽鎖がＶ１３３Ｅ変異を含み、第２の抗体重鎖がＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
第１の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第２の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）、請求項３１に記載の方法。
第２の抗体軽鎖がＶ１３３Ｋ変異を含み、第２の抗体重鎖がＳ１８３Ｅ変異を含み、第１の抗体軽鎖がＶ１３３Ｅ変異を含み、第１の抗体重鎖がＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
第２の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第１の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）、請求項３３に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞の一又は複数の染色体に組み込まれる、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞の同じ染色体座に組み込まれる、請求項３５に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞中の一又は複数の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
真核宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３８に記載の方法。
第１及び／又は第２の翻訳開始配列が、第３及び／又は第４の翻訳開始配列よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％弱い、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
第１のサブユニット又は半抗体が、各サブユニット又は半抗体が真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第２のサブユニット又は半抗体の発現レベルよりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％低いレベルで発現される、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
複数の多量体ポリペプチドであって、複数の多量体ポリペプチドの各多量体ポリペプチドが、請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法によって産生される、複数の多量体ポリペプチド。
第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む非天然多量体ポリペプチドの発現のための組み換え真核細胞であって、
（ａ）第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと；
（ｂ）第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと；
（ｃ）第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと；
（ｄ）第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドと；
を含み、
各サブユニットが組み換え真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１のサブユニットが、第２のサブユニットよりも低いレベルで発現され、
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い、
組み換え真核宿主細胞。
すべてのサブユニットが同じ宿主細胞において発現されるとき、第１のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖が、第２のサブユニットの一方又は両方のポリペプチド鎖よりも低いレベルで発現される、請求項４３に記載の細胞。
第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべてが、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である、請求項４３又は４４に記載の細胞。
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列番号８－１０からなる群より選択される配列を含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の細胞。
第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列の一方又は両方が、配列ＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号３）又はＧＡＡＧＴＡＴＧＡ（配列番号１１）を含む、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の細胞。
第１の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列が配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列が配列番号１１の配列を含む、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の細胞。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれが、プロモーターに作用可能に結合している、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の細胞。
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合しており、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合している、請求項４９に記載の細胞。
第１の翻訳開始配列が第３の翻訳開始配列よりも弱い、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の細胞。
第２の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列よりも弱い、請求項４３から５１のいずれか一項に記載の細胞。
第１の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列よりも弱い、請求項４３から５２のいずれか一項に記載の細胞。
第２の翻訳開始配列が第３の翻訳開始配列よりも弱い、請求項４３から５３のいずれか一項に記載の細胞。
第１の翻訳開始配列が第２の翻訳開始配列と同じである、請求項４３から５４のいずれか一項に記載の細胞。
第３の翻訳開始配列が第４の翻訳開始配列と同じである、請求項４３から５５のいずれか一項に記載の細胞。
折り畳まれ、組み立てられた多量体ポリペプチドが、一又は複数の標的抗原に特異的に結合する、請求項４３から５６のいずれか一項に記載の細胞。
多量体ポリペプチドが、多重特異性抗原結合タンパク質である、請求項４３から５７のいずれか一項に記載の細胞。
第１の抗体重鎖及び第１の抗体軽鎖を含む第１の半抗体と、第２の抗体重鎖及び第２の抗体軽鎖を含む第２の半抗体とを含む二重特異性抗体の発現のための組み換え真核宿主細胞であって、
（ａ）第１の抗体重鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと；
（ｂ）第１の抗体軽鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと；
（ｃ）第２の抗体重鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと；
（ｄ）第２の抗体軽鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドと；
を含み、
各半抗体が組み換え真核宿主細胞において個別に発現されるとき、第１の半抗体が、第２の半抗体よりも低いレベルで発現され、
第１の翻訳開始配列及び第２の翻訳開始配列のうちの一方又は両方が、第３の翻訳開始配列及び第４の翻訳開始配列のうちの一方又は両方よりも弱い、
組み換え真核宿主細胞。
第１の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み；かつ第２の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変され；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変される、請求項５９に記載の細胞。
第１の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第１の抗体Ｆｃ領域を含み；かつ第２の抗体重鎖が、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む第２の抗体Ｆｃ領域を含み；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にホールを生成するように、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変され；かつＣＨ３／ＣＨ３界面内で一又は複数のアミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインと相互作用する第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインの表面上にノブを生成するように、第１の抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメインが改変される、請求項５９に記載の細胞。
ノブ変異が、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、及びＦ４０５Ｗのうちの少なくとも一つを含む、請求項６０又は６１に記載の細胞。
ホール変異が、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、及びＴ３９４Ｓのうちの少なくとも一つを含む、請求項６０から６２のいずれか一項に記載の細胞。
ノブ変異がＴ３６６Ｗを含み、ここで、ホール変異は、ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付けされた、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖのうちの少なくとも一つ、少なくとも二つ、又は三つすべてを含む、請求項６０から６３のいずれか一項に記載の細胞。
第１の抗体軽鎖が第１の変異を含み、第１の抗体重鎖が第２の変異を含み、第１及び第２の変異が、第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖との選択的会合を促進する、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の細胞。
第１の変異がＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、第２の変異がＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）、請求項６５に記載の細胞。
Ｓ１８３置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、Ｖ１３３置換が、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される、請求項６６に記載の細胞。
Ｓ１８３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらすか、又は、Ｓ１８３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらす、請求項６６又は６７に記載の細胞。
第２の抗体軽鎖が第３の変異を含み、第２の抗体重鎖が第４の変異を含み、第３及び第４の変異が、第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖との選択的会合を促進する、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の細胞。
第３の変異がＶ１３３でのアミノ酸置換を含み、第４の変異がＳ１８３でのアミノ酸置換を含む（ＥＵインデックスに基づいた番号付け）、請求項６９に記載の細胞。
Ｓ１８３置換が、Ｓ１８３Ａ、Ｓ１８３Ｔ、Ｓ１８３Ｖ、Ｓ１８３Ｙ、Ｓ１８３Ｆ、Ｓ１８３Ｈ、Ｓ１８３Ｎ、Ｓ１８３Ｄ、Ｓ１８３Ｅ、Ｓ１８３Ｒ、及びＳ１８３Ｋからなる群より選択され、Ｖ１３３置換が、Ｖ１３３Ｅ、Ｖ１３３Ｓ、Ｖ１３３Ｌ、Ｖ１３３Ｗ、Ｖ１３３Ｋ、Ｖ１３３Ｒ、及びＶ１３３Ｄからなる群より選択される、請求項７０に記載の細胞。
Ｓ１８３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらすか、又は、Ｓ１８３でのアミノ酸置換が負電荷を帯びた残基をもたらし、かつＶ１３３でのアミノ酸置換が正電荷を帯びた残基をもたらす、請求項７０又は７１に記載の細胞。
第１の抗体軽鎖がＶ１３３Ｋ変異を含み、第１の抗体重鎖がＳ１８３Ｅ変異を含み、第２の抗体軽鎖がＶ１３３Ｅ変異を含み、第２の抗体重鎖がＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の細胞。
第１の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第２の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）、請求項７３に記載の細胞。
第２の抗体軽鎖がＶ１３３Ｋ変異を含み、第２の抗体重鎖がＳ１８３Ｅ変異を含み、第１の抗体軽鎖がＶ１３３Ｅ変異を含み、第１の抗体重鎖がＳ１８３Ｋ変異を含む（ＥＵインデックスに基づいて番号付け）、請求項５９から６４のいずれか一項に記載の細胞。
第２の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ変異をさらに含み、第１の抗体重鎖が、Ｔ３６６Ｗ変異をさらに含む（ＥＵインデックスによるヒトＩｇＧ１に基づいて番号付け）、請求項７５に記載の細胞。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞の一又は複数の染色体に組み込まれる、請求項４３から７６のいずれか一項に記載の細胞。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞の同じ染色体座に組み込まれる、請求項７７に記載の細胞。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、真核宿主細胞中の一又は複数の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、請求項４３から７６のいずれか一項に記載の細胞。
真核宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項４３から７９のいずれか一項に記載の細胞。
方法が、真核宿主細胞において多量体ポリペプチドの産生をより高くする、請求項８０に記載の細胞。
真核宿主細胞において多量体ポリペプチドを発現するための翻訳開始配列の組み合わせを同定するための方法であって、多量体ポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含み、
（ａ）複数の真核宿主細胞を含むライブラリを用意することであって、複数の真核宿主細胞の各真核宿主細胞が以下：
第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと、
第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと、
第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと、
第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドと
を含み、
ここで、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列の複数の組み合わせが、複数の真核宿主細胞中に表されている、
ライブラリを用意することと、
（ｂ）複数の真核宿主細胞による多量体ポリペプチドの発現に適した条件下で真核宿主細胞のライブラリを培養することと、
（ｃ）複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンによって発現された多量体ポリペプチドの量を測定することと、
（ｄ）多量体ポリペプチドを発現する、一又は複数の、複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞又は複数の真核宿主細胞の単一真核宿主細胞のクローンの、第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列を同定することと、
を含む、
方法。
複数の宿主細胞の各宿主細胞における第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべてが、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である、請求項８２に記載の方法。
多量体ポリペプチドが、一又は複数の標的抗原に特異的に結合する、請求項８２又は８３に記載の方法。
多量体ポリペプチドが、多重特異性抗原結合タンパク質である、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
多量体ポリペプチドが二重特異性抗体であり、第１及び第３のポリペプチド鎖が抗体重鎖であり、第２及び第４のポリペプチド鎖が抗体軽鎖であり、第１のサブユニットが、第１の抗原に結合する第１の半抗体であり、第２のサブユニットが、第２の抗原に結合する第２の半抗体である、請求項８２から８４のいずれか一項に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、複数の真核宿主細胞の各真核宿主細胞の一又は複数の染色体に組み込まれる、請求項８２から８６のいずれか一項に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、複数の真核宿主細胞の各真核宿主細胞の同じ染色体座に組み込まれる、請求項８７に記載の方法。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、複数の真核宿主細胞の各真核宿主細胞中の一又は複数の染色体外ポリヌクレオチドの一部である、請求項８２から８６のいずれか一項に記載の方法。
真核宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項８２から８９のいずれか一項に記載の方法。
哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項９０に記載の方法。
第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む第１のサブユニットと、第３のポリペプチド鎖及び第４のポリペプチド鎖を含む第２のサブユニットとを含む多量体ポリペプチドの発現のためのポリヌクレオチドのキットであって、
（ａ）第１のポリペプチド鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第１の翻訳開始配列を含む第１のポリヌクレオチドと；
（ｂ）第２のポリペプチド鎖をコードする第２のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第２の翻訳開始配列を含む第２のポリヌクレオチドと；
（ｃ）第３のポリペプチド鎖をコードする第３のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第３の翻訳開始配列を含む第３のポリヌクレオチドと；
（ｄ）第４のポリペプチド鎖をコードする第４のオープンリーディングフレームに作用可能に結合した第４の翻訳開始配列を含む第４のポリヌクレオチドと；
を含み、
第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のうちの一又は複数が、それぞれのオープンリーディングフレームが天然に存在する宿主細胞ゲノム中に存在する場合、そのそれぞれのオープンリーディングフレームに作用可能に結合していない、
キット。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドが、一又は複数の発現ベクターの一部である、請求項９２に記載のキット。
第１、第２、第３、及び第４の翻訳開始配列のすべてが、配列（５’から３’）ＮＮＮＮＮＡＴＧＮＧＡを含み、ここで、Ｎは、Ｃ、Ｇ、Ａ、又はＴ／Ｕ（配列番号１）である、請求項９２又は９３に記載のキット。
第１の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第２の翻訳開始配列が配列番号９の配列を含み、第３の翻訳開始配列が配列番号２の配列を含み、第４の翻訳開始配列が配列番号１１の配列を含む、請求項９２から９４のいずれか一項に記載のキット。
第１、第２、第３、及び第４のポリヌクレオチドのそれぞれが、プロモーターに作用可能に結合している、請求項９２から９５のいずれか一項に記載のキット。
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合しており、第３のポリヌクレオチドと第４のポリヌクレオチドとが同じプロモーターに作用可能に結合している、請求項９６に記載のキット。