JP5623272B2 - 抗notch1nrr抗体とその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2007年6月4日に出願の米国仮特許出願第60/933072号、及び2007年9月20日に出願の米国仮特許出願第60/994646号の優先権を主張するものであり、これらの開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
本発明は概して分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、抗Notch1ネガティブ制御領域(NRR)抗体及びその使用に関する。
Notch経路は、ハエ及び脊椎動物の神経発生に作用するプロセスなど、多様な発達上及び生理学上のプロセスに際に機能する。通常は、Notchシグナル伝達は、側方抑制、系統決定及び複数の細胞群間の境界の形成に関与する(例としてBray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006を参照)。癌及び神経変性障害を含む多様なヒトの疾患は、Notchレセプター又はそのリガンドをコードする遺伝子の突然変異によるものであることが示されている(例としてNam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002を参照)。ヒトNotch1の切断された構造的に活性な変異体を造る反復性のt(7;9)(q34;q34.3)染色体転座がヒト急性リンパ性白血病(T−ALL)のサブセットにおいて同定された時に、無制限のNotchシグナル伝達と悪性腫瘍との関連が初めて認識された。マウスモデルでは、Notch1シグナル伝達はT細胞発達に必須であり、Notch1が媒介するシグナルがB細胞発達を犠牲にしてT細胞の発達を促すことが示された。また、マウスモデルでは、発達の間の過剰なNotchシグナル伝達によりT細胞腫瘍形成が引き起こされる。
特許出願及び出版物を含む本明細書において引用されるすべての文献は出典明記によって本明細書中に援用される。
本発明は、Notch1 NRRに結合する抗体を提供する。一態様では、本発明はNotch1 NRRを結合する単離された抗体を特徴とする。特定の態様では、本発明は、1×10−7Kd以上の強さでNotch1 NRRを結合する単離された抗Notch1 NRR抗体を特徴とする。望ましい実施態様では、抗Notch1 NRR抗体は1×10−8Kd以上又は1×10−9Kd以上の強さでNotch1 NRRを結合する。他の態様では、本発明は単離された抗Notch1 NRR抗体であって、該抗体の完全長IgG形態は1×10−7Kd以上の強さでヒト及びマウスのNotch1 NRRを結合する抗体を提供する。当分野で十分に確立されているように、そのレセプターに対するリガンドの結合親和性は、様々なアッセイを用いて決定し、様々な定量値で表すことができる。したがって、一実施態様では、結合親和性はKd値として表され、本質的な結合親和性を(例えば、最小の結合活性効果によって)表す。一般に、そして好ましくは、無細胞環境又は細胞関連の環境のいずれであっても、結合親和性はインビトロで測定される。例えば、Biacore、ラジオイムノアッセイ(RIA)及びELISAなど、本明細書に記載のものを含め、当分野で公知の多くのアッセイの何れかを用いて、結合親和性測定値を得ることができる。
(a)
(i) RASQDVSTAVA(配列番号:7)である配列A1−A11を含むHVR−L1
(ii) SASFLYS (配列番号:8)である配列B1−B7を含むHVR−L2
(iii) QQSYTTPPT(配列番号:9)である配列C1−C9を含むHVR−L3
(iv) GFTFSSYWIH(配列番号:1)である配列D1−D10を含むHVR−H1
(v) ARINPSNGSTNYADSVKG(配列番号:2)である配列E1−E18を含むHVR−H2、及び
(vi) ARGSGFRWVMDY(配列番号:6)である配列F1−F14を含むHVR−H3から選択される少なくとも1、2、3、4又は5の高頻度可変領域(HVR)配列と、
(b) 配列番号:1から12に示す配列の少なくとも1の残基の修飾を含む少なくとも1の変異HVR配列
とを含む、単離された抗Notch1 NRR抗体を特徴とする。望ましくは修飾は置換、挿入又は欠失である。
望ましい実施態様では、HVR−L3変異体は、1〜4(1、2、3又は4)の置換を、C3(S又はF)、C4(Y又はF)、C5(T又はS)、及びC8(P又はA又はS)のいずれかの組合せの位置に含む。他の望ましい実施態様では、HVR−H2変異体は、1〜4(1、2、3又は4)の置換を、E6(S又はP又はA);E8(G又はR);E10(T又はA又はN);及びE11(N又はH又はQ又はR)のいずれかの組合せの位置に含む。
他の態様では、本発明は、1、2、3、4、5又は6のHVRを含む単離された抗Notch1 NRR抗体であって、このとき各HVRは配列番号1から12から選択される配列を含むか、これらからなるか、又はこれらから基本的になり、配列番号:7はHVR−L1に対応し、配列番号:8はHVR−L2に対応し、配列番号:9、10、11又は12はHVR−L3に対応し、配列番号:1はHVR−H1に対応し、配列番号:2、3、4又は5はHVR−H2に対応し、そして配列番号:6はHVR−H3に対応するものであることを特徴とする。
一態様では、本発明は、配列番号:1の配列を含むHVR−H1領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号:2、3、4又は5の配列を含むHVR−H2領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号:6の配列を含むHVR−H3領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号:10、11又は12の配列を含むHVR−L3を含む抗体を提供する。
(i) 配列番号:1の配列を含むHVR−H1配列;
(ii) 配列番号:2、3、4又は5の配列を含むHVR−H2配列;
配列番号:6の配列を含むHVR−H3配列;
配列番号:10、11又は12の配列を含むHVR−L3配列
を含む抗体を提供する。
望ましい実施態様では、抗体はHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、9、1、2、6を含む。他の望ましい実施態様では、抗体はHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、10、1、3、6を含む。他の望ましい実施態様では、抗体はHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、11、1、4、6を含む。更なる望ましい実施態様では、抗体はHVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、12、1、5、6を含む。
配列番号:1から12のアミノ酸配列は図1に示す個々のHVR(すなわち、H1、H2又はH3)について番号付けしたもので、この番号付けは以下に記載のカバット番号付けシステムと一致する。
(HVR残基を下線で示す)
一実施態様では、huMAb4D5-8軽鎖可変ドメイン配列は、位置30、66及び91の一又は複数(それぞれ、上記に太字/斜体で示されるAsn、Arg及びHis)において修飾される。特定の実施態様では、修飾huMAb4D5-8配列は、位置30にSer、位置66にGly及び/又は位置91にSerを含む。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、以下の配列番号:54に示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
(HVR残基を下線で示す)
huMAb4D5-8に関する置換された残基を上記に太字/斜体で示す。
特定の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:38、39、40及び/又は41の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は9である。他の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:38、39、40及び/又は41の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は10である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:38、39、40及び/又は41の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は11である。更なる他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:38、39、40及び/又は41の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は12である。
一実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、17及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は9である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、17及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は10である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、17及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は11である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、17及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2、及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は12である。
一実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、47及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は9である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、47及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は10である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、47及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は11である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号:15、16、47及び/又は18の配列を含み、HVR L1、L2及びL3配列はそれぞれ配列番号:7、8及び/又は12である。
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号:58の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:59の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:58の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号:59の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号:60の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:61の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:60の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号:61の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号:62の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:63の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:62の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号:63の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号:64の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:65の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号:64の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号:65の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
当分野で公知、そして、以下により詳細に記述されるように、(後述のような)当分野の様々な定義及び前後関係に従って、抗体の高頻度可変領域を表すアミノ酸位/境界は異なってもよい。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ある判断基準の下では高頻度可変領域内にあると判断されるが、異なるある判定基準の下では高頻度可変領域の外にあると判断される、ハイブリッド高頻度可変位置と見られうる。また、これらの位置の一又は複数は、伸展した高頻度可変領域内にありうる(以下にさらに定義する)。
いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される。ある実施態様では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2又はscFvである。
本発明のヒト化抗体は、融合したCDR内に変異を有する親和性成熟変異体及びFR内にアミノ酸置換を有するものを含む。CDR又はFR内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエントの抗体に存在するものに限らない。他の実施態様では、本発明の抗体はさらに、CDC及び/又はADCCの機能及びB細胞の殺傷の亢進を含め、エフェクター機能の改善を生じるFc領域内のアミノ酸残基に変異を含有する。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。他の実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能の低減、例えばCDC及び/又はADCC機能の低減及び/又はB細胞殺傷の低減を生じるFc領域内のアミノ酸残基に変化を含有する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー(NK)細胞上のヒトFcレセプター及び/又はヒト補体因子C1qへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのFcγRI、FcγRIIA及び/又はFcγRIIIAへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、IgGクラスのもの(例えばIgG1又はIgG4)であり、そしてE233、L234、G236、D265、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331及び/又はP329(EUインデックスに従った番号付け)の少なくとも一つの突然変異を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗体は、突然変異L234A/L235A又はD265A/N297Aを含んでなる。
本発明の抗体は、Notch1 NRRを結合し(例えば特異的に結合し)、ある実施態様では、Notch1シグナル伝達及び/又は任意の生物学的に関連するNotch1の破壊及び/又はNotch1リガンド生物学的経路、腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び/又は予防;及び/又はNotch1の発現及び/又は活性(例えばNotch1の発現及び/又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は予防の一又は複数の態様を調節しうる。ある実施態様では、Notch1 NRR抗体は、Notch1 NRRからなるかないしは基本的になるポリペプチドに特異的に結合する。ある実施態様では、抗体は1×10−7Kd以上の強さでNotch1を特異的に結合する。ある実施態様では、本発明の抗体は、インビボ及び/又はインビトロでNotch1活性を低減する、阻害する、及び/又は遮断する。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗体と担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の抗Notch1 NRR抗体をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の一又は複数の核酸と担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、何れの型のもの、例えば発現ベクターなどの組換えベクターでもよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞などの哺乳類細胞である。
一態様では、本発明は、容器、と容器内に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数の抗Notch1 NRR抗体を含有するものである、製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様では、抗体を含有してなる組成物は、さらに担体を含有するものであって、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示書をさらに具備する(例えば、本明細書に記載の何れかの方法のための指示書)。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗Notch1 NRR抗体を含有してなる組成物を包含する第一容器、と、バッファを包含する第二容器を具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、抗体を含有してなる組成物はさらに担体を含有するものであって、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、キットは、個体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示書をさらに具備する。
ある態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び/又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
更なる他の態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び/又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。他の望ましい実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び/又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
また、本発明は、活性化されたNotch1レセプターと関係する疾患を調整するために有用な方法及び組成物を提供する。このような疾患は、Notch1アミノ酸配列の転座又は活性化する突然変異と関係しうる。活性化されたNotch1レセプターと関係する疾患の例にはT細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)が含まれる。
一態様では、本発明は、個体のNotch1の発現及び/又は活性の増加と関連する腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患の治療方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患はNotch1活性化突然変異を伴う。
一態様では、本発明は、個体の細胞(癌ないし腫瘍の細胞など)を殺傷するための方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、個体の腫瘍又は癌の増殖を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、個体の血管新生を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、個体の神経障害又は神経変性疾患の治療又は予防、又は損傷神経細胞ないし軸索の離断及び/又は脱髄が生じる疾患の修復のための方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、個体のニューロンの発達、増殖、維持又は再生の促進方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、個体の抗原への免疫応答の増強方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、免疫応答が望まれる抗原は抗Notch1 NRR抗体と同時に投与される。他の実施態様では、本発明は、個体の抗原への免疫応答の増強方法であって、個体に抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含み、このとき該抗Notch1 NRRアゴニスト抗体が、抗原による免疫細胞(T細胞など)の刺激の間又は直後に個体の免疫細胞(T細胞など)に対して提示されるように組成物が個体に投与され、これによって免疫応答が増強される方法を提供する。いくつかの実施態様では、抗原は癌のものである。
更なる態様では、本発明は、個体の抗原に対する免疫応答を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、免疫応答は、異常なT細胞発達又は調節による免疫学的疾患である。
更なる態様では、本発明は、個体の自己免疫性疾患の治療方法であって、個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、自己免疫性疾患は、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症、移植拒絶反応又は関節リウマチである。
一実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞及び大腸腺腫細胞からなる群から選択されうる。一実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は過剰増殖及び/又は過形成細胞である。他の実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は転移性細胞である。
一態様では、本発明は、有効量の他の治療薬(例えば、抗血管新生剤、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、細胞毒性放射線治療、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖抑制剤)と組み合わせた、有効量の抗Notch1 NRR抗体の投与を含む方法を提供する。例えば、抗Notch1 NRR抗体は、多様な腫瘍性又は非腫瘍性の状態を治療するために、抗癌剤又は抗血管新生剤と組み合わせて用いられる。特定の例では、抗Notch1 NRR抗体は、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、エルロチニブ、ベバシズマブ、ビンクリスチン、イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ又はトラスツズマブと組み合わせて用いられる。
抗Notch1 NRR抗体は、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の治療薬と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。抗Notch1 NRR抗体及び他の治療薬(例えば、抗癌剤)の投与は、例えば単一の組成物として、又は、2以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。あるいは又はさらに、前記工程はいずれかの順序で連続的及び同時的を組み合わせて行われうる。ある実施態様では、2以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、抗癌剤がまず投与され、その後抗Notch1 NRR抗体が投与されてもよい。しかしながら、抗Notch1 NRR抗体の同時投与又は第一投与も考慮される。ある実施態様では、2以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。
ある態様では、本発明は、試料中のNotch1-抗Notch1 NRR抗体複合体を検出することを含んでなる、Notch1の検出のための方法を提供する。本明細書中で使用する「検出」なる用語は、コントロールへの参照の有無にかかわらず、定性的及び/又は定量的な検出(例えば測定レベル)を含む。
他の態様では、本発明は、個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することによる、癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患を有する個体の治療方法であって、さらに抗Notch1 NRR抗体の投与の前、投与中又は投与後に、Notch1発現及び/又はNotch1リガンド発現が個体の生体試料中で検出されるものである方法を提供する。いくつかの実施態様では、生体試料は、癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患のものである。いくつかの実施態様では、Notch1過剰発現は、抗Notch1 NRR抗体の投与の前、投与中及び/又は投与後に検出される。いくつかの実施態様では、Notch1リガンド発現は、抗Notch1 NRR抗体の投与の前、投与中及び/又は投与後に検出される。発現は、抗Notch1 NRR抗体の前、最中、後、前と最中、前と後、最中と後、又は前、最中及び後に検出されてもよい。
他の態様では、本発明は、個体のための治療の選択方法であって、(a) 個体の生体試料において、存在するならば、Notch1発現又はNotch1リガンド発現を検出し、そして、(b) 工程(a)の後に、個体のための治療を選択することを含み、このとき治療の選択が工程(a)において検出されたNotch1又はNotch1リガンド発現に基づいている方法を提供する。いくつかの実施態様では、参照値又はコントロール試料と比較して個体の生体試料におけるNotch1又はNotch1リガンド発現の増加が検出される。いくつかの実施態様では、参照値又はコントロール試料と比較して個体の生体試料におけるNotch1又はNotch1リガンド発現の減少が検出される。いくつかの実施態様では、Notch1又はNotch1リガンド発現が検出され、抗Notch1抗体による治療が選択される。いくつかの実施態様では、個体は、腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患を有する。
検出を伴ういくつかの実施態様では、Notch1の発現は、Notch1遺伝子欠失、遺伝子増殖及び/又は遺伝子突然変異の検出を含む。検出を伴ういくつかの実施態様では、Notch1リガンドの発現は、Notch1遺伝子欠失、遺伝子増殖及び/又は遺伝子突然変異の検出を含む。
生体試料は、本明細書中、例えば、生体試料の定義において記述される。いくつかの実施態様では、生体試料は、血清又は腫瘍のものである。
Notch1及び/又はNotch1リガンド発現の検出を伴ういくつかの実施態様では、Notch1及び/又はNotch1リガンド発現の存在及び/又は欠如及び/又はレベルが検出されうる。Notch1及び/又はNotch1リガンド発現は増加されうる。Notch1及び/又はNotch1リガンド発現の欠如はわずかなレベルを含むか、最少のレベルであると解釈される。いくつかの実施態様では、試験生体試料中のNotch1発現は、コントロール生体試料(又は、コントロール又は参照の発現レベル)について観察されるものより高い。いくつかの実施態様では、Notch1発現は、コントロール生体試料よりも試験生体試料において、少なくともおよそ2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、75倍、100倍、150倍以上である。いくつかの実施態様では、Notch1ポリペプチド発現は、免疫組織化学(「IHC」)アッセイにおいて決定され、染色強度について少なくとも2以上にスコア化される。いくつかの実施態様では、Notch1ポリペプチド発現は、IHCアッセイにおいて決定され、染色強度について少なくとも1以上又は少なくとも3以上にスコア化される。いくつかの実施態様では、試験生体試料では、コントロール生体試料(又は、コントロール発現レベル)で観察されるものより低い。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載のいずれかの抗Notch1 NRR抗体であって、該抗Notch1 NRR抗体が検出可能な標識を含むものである抗体を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載のいずれかの抗Notch1 NRR抗体とNotch1との複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含む。いくつかの実施態様では、抗Notch1 NRR抗体は検出可能に標識されている。
本明細書中の発明は、例えば、Notchの発現及び/又は活性の増加又は望ましくない発現及び/又は活性などのNotchの発現及び/又は活性に関連する疾患状態の治療又は予防に有用な、抗Notch1 NRR抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患を治療するために用いられる。
他の態様では、本発明の抗Notch1 NRR抗体は、様々な組織及び細胞型でのNotch1の検出などのNotch1の検出及び/又は単離のための試薬としての有用性を見出す。
さらに、本発明は、抗Notch1 NRR抗体の作製方法、及び抗Notch1 NRR抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(1)ローリー法で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を超えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15のN末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
望ましくは、2以上のアミノ酸配列は、少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%の同一性である。さらに望ましくは、2以上のアミノ酸配列は、少なくとも95%、97%、98%、99%又はさらに100%の同一性である。特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られる。
本明細書中で使用する「Notch1リガンド」なる用語は、特別に又は文脈上別途示さない限り、任意の天然の又は変異体の(天然であっても合成であっても)Notch1リガンド(例えば、Jagged1、Jagged2、デルタ様1、デルタ様3、及び/又はデルタ様4)ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、具体的には、天然に生じた切断型(例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列)、天然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライス型)及び天然に生じる対立遺伝子変異型を包含する。「野生型Notch1リガンド」なる用語は、一般に、天然に生じるNotch1リガンドタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型Notch1リガンド配列」なる用語は、一般に、天然に生じるNotch1リガンドに見られるアミノ酸配列を指す。
本明細書中で用いる「Notch1シグナル伝達の減少」なる用語は、例えば実施例5及び6に記載されるルシフェラーゼアッセイを用いて、同一条件下でコントロールにおいて観察されるNotch1シグナル伝達のレベルを少なくとも2倍下回るNotch1シグナル伝達の減少を指す。望ましくは、Notch1シグナル伝達の減少は、コントロールで観察されるレベルの少なくとも3分の1、4分の1、5分の1又はさらに10分の1(又はそれ以下)である。
「Notch1活性化変異」及び「Notch1シグナル伝達を活性化する変異」なる用語は、Notch1野生型アミノ酸配列と比較して一又は複数のアミノ酸の挿入、一又は複数のアミノ酸の欠失、又は一又は複数のアミノ酸の置換であって、これによって対応するNotch1野生型アミノ酸配列からのNotch1シグナル伝達と比較してNotch1シグナル伝達の増加が引き起こされるものであるか、又は、Notch1野生型核酸配列と比較して一又は複数のヌクレオチドの挿入、一又は複数のヌクレオチドの欠失、一又は複数のヌクレオチドの転位、又は一又は複数のヌクレオチドの置換であって、これによって対応するNotch1野生型核酸配列を含む細胞におけるNotch1シグナル伝達と比較して変異核酸配列を含む細胞におけるNotch1シグナル伝達の増加が引き起こされるものを指す。活性化突然変異を含むNotch1レセプターからのNotch1シグナル伝達はリガンド依存性でもリガンド非依存性でもよい。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のFv種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Fv種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(CH1)を有する。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でFab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているFab'に対するここでの命名である。F(ab')2抗体断片は、間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには5つの主なクラスがある:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM、更にそれらは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFv断片;ダイアボディ;線形抗体;単鎖抗体分子;及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばFc領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のFc領域に通常関連する生物学的な機能、例えばFcRn結合、抗体半減期の調節、ADCC機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるFc配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「FR」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び/又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
FcRnへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトFcRnへの結合とヒトFcRn高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトFcRnを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はFc変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
Fc領域アミノ酸配列を変更してC1q結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第6194551号B1及び国際公開公報99/51642に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本明細書中で用いられる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を擬態する抗体である。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (配列番号:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (配列番号:44)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:45)。
「VLサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、VHサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:15)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:17)-L3-FGQGTKVEIK (配列番号:18)。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
本明細書中で用いる「免疫学的疾患」は、個体の免疫系の異常な発達や異常な制御を伴う病態である任意の疾患を意味する。望ましくは、免疫学的疾患は、異常なT細胞発達又は制御を伴う。
「医薬」は、問題の疾患ないしその症状、又は副作用を治療するために活性な薬剤である。
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本発明の物質/分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質/分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の個体に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
Notch1レセプターはフリン様プロテアーゼによって膜貫通ドメインの外側の部位S1およそ70のアミノ酸で細胞表面への輸送中にタンパク質分解的にプロセシングされ、細胞外Notch(ECN)サブユニットとNotch膜貫通サブユニット(NTM)が生成される。これら2つのサブユニットは非共有的に結合したままで、成熟したヘテロダイマー細胞−表面レセプターを構成する。Notch1 ECNサブユニットは、36のN末端EGF様リピートの後に3つのタンデムリピートLNRモジュール(LNR_A、LNR_B及びLNR_C)を含む。各LNRモジュールは、カルシウムイオンを調整することが予測される保存された酸性かつ極性の残基の基と3つのジスルフィド結合を含有する。EGFリピート領域内に、活性化するリガンドのための結合部位が位置する。LNRモジュールは、リガンドが誘導する活性化の前に静止高次構造にNotchを維持することに関与する。Notch1 NTMは、細胞外領域と、膜貫通部分と、RAM(RBP Jκ結合分子)ドメイン、アンキリンリピート、トランスアクチベーションドメイン及びカルボキシ末端PEST配列を含む大きな細胞内部分とを含む。ECN及びNTMサブユニットの安定な結合は、ECNのカルボキシ終末端(HDCと称される)とNTMの細胞外アミノ末端(HD-Nと称される)とを含むヘテロ二量体化ドメイン(HD)に依存している。ECNサブユニットへのNotchリガンドの結合により、制御された細胞内タンパク質分解により生じる2つの連続的なタンパク質分解性切断が開始する。部位S2(NTM内に位置する)のメタロプロテアーゼによる第一切断によって、Notch膜貫通サブユニットの、原形質膜の内側の小葉の近くの部位S3での第二切断が起こりやすくなる。プレセニリンとニカストリンを含む多タンパク質複合体により触媒される部位S3切断は、Notch膜貫通サブユニット(細胞内Notch、「ICN」とも称される)の細胞内部分を遊離し、核に転位させ、標的の遺伝子の転写を活性化する。
リガンド結合がない場合にシグナル伝達するがリガンド結合への応答能は保持しているリガンド非依存性変異の例は、Notch1のHD領域内の変異である。ヒトNotch1のHD−N領域内の活性化変異には、例えば、L1575P、V1577E、F1593S、L1594P、L1597H、R1599P、L1601P、及びI1617T/Nが含まれる。ヒトNotch1のHD−C領域内の活性化変異の例には、V1677D、L1679P、I1681N、A1702P、I1719T、及びS2切断部位での挿入(ARLGSLNIPYKIEA;配列番号:52)(P12挿入)が含まれる。L1575P、V1577E、F1593S、L1594P、L1597H、R1599P、L1601P、I1617T/N、V1677D、L1679P、I1681N、A1702P及びI1719Tの変異、及びP12挿入により、S2及びS3の切断が増加し、Notch1シグナル伝達は野生型Notch1レセプターのシグナル伝達よりも大きい。
リガンド依存性であるNotch1活性化変異の例には、リーディングフレームないの変化を引き起こす挿入や欠失又は成熟前の停止コドンを生じさせるポイント変異のような、PESTドメイン内の変異が含まれる。阻害性PESTドメインの除去は、ICNの半減期を増やすと考えられる。PESTドメイン内の変異の例は、ヒトNotch1アミノ酸配列(配列番号:57)のアミノ酸2473で始まるカルボキシ末端欠失であるDelPESTである。PESTドメイン内の他の変異は当分野で公知であり、例えばWeng et al. (Science 306:269-271, 2004)に記載されている。
本発明は、医薬組成物を含む組成物であって、抗Notch1 NRR抗体を含んでなる組成物、及び、抗Notch1 NRR抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書で用いられるように、組成物は、Notch1 NRRに結合する一又は複数の抗体、及び/又はNotch1 NRRに結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、適切な担体、例えばバッファなどの薬学的に受容可能な賦形剤を含みうる。これは当分野で周知である。
本発明の抗Notch1 NRR抗体は望ましくはモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗Notch1 NRR抗体のFab、Fab'、Fab'-SH及びF(ab')2断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
本発明の抗Notch1 NRRモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えDNA法(米国特許第4816567号)によって作製することができる。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
Notch1 NRRを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したNotch1 NRRを付着させることが可能である。基質へのNotch1 NRRタンパク質の付着は、Methods in Enzymology, 44巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第1級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4816567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのFR残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
本発明のヒト抗Notch1 NRR抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したFvクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗Notch1 NRR抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は,例えば,Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984);Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987);及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはNotch1 NRRに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、Notch1 NRRの2つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はNotch1 NRRを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はNotch1 NRR結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばF(ab')2二重特異性抗体)として調製することができる。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び/又は異化)されうる。本発明の抗体は、3又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(IgMクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと3又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはFc領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はFc領域と、Fc領域のアミノ末端に3又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は3ないし8、好ましくは4の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも1つのポリペプチド鎖(好ましくは2つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は2又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はVD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fcを有し、ここでVD1は第1の可変ドメインであり、VD2は第2の可変ドメインであり、FcはFc領域のポリペプチド鎖の一つであり、X1及びX2はアミノ酸又はポリペプチドを表し、nは0又は1である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は:VH-CH1-柔軟なリンカー-VH-CH1-Fc領域鎖;又はVH-CH1-VH-CH1-Fc領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも2つ(好ましくは4つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約2〜約8の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはCLドメインを更に有する。
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び/又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性の親水性:cys、ser、thr、asn、gln;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro; 及び
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばFc領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、国際公開99/51642などに記載のようにC1q結合及び/又は補体依存性細胞障害(CDC)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるFc領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Fc領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988);米国特許第5648260号;米国特許第5,624,821号;及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報00/42072(Presta)及び国際公開公報2004/056312(Lowman)は、FcRへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性IgGの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Fcレセプター(FcRn)への結合が改善している抗体は、米国特許公開2005/0014934A1 (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するFc領域を含んでなる。Fc領域アミノ酸配列が変更されてC1q結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第6194551号B1、国際公開公報99/51642に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(n-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び/又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的/化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、Notch1活性化の低減又はブロック、Notch1下流分子のシグナル伝達の低減又はブロック、リガンド(例えばJagged1、Jagged2、デルタ様1、デルタ様3、又はデルタ様4)へのNotch1結合の破壊又はブロック、及び/又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び/又は予防;及び/又はNotch1の発現及び/又は活性(例えばNotch1の発現及び/又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は予防の何れか一又は複数に特徴がある。他の実施態様では、抗体は、Notch1活性化の誘導ないし増加、Notch1下流分子シグナル伝達の誘導ないし増加、及び/又はNotch1の発現及び/又は活性と関連する疾患の治療又は予防のいずれか一又は複数に特徴がある。
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするDNAは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はPCR法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(RBS)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、DNAを原核生物宿主中に導入し、そのDNAを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール/DMSOを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である:免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相HPLC、シリカ又はDEAEなどの陽***換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、SDS−PAGE、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む:シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのN末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のDNAは、多価抗体をコードするDNAに読み取り枠を一致させて結合される。
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、SV40開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
例えば、DHFR選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、DHFRの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Mtx)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、DHFR活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするDNA配列、野生型DHFRタンパク質、及びアミノグリコシド3'-ホスホトランスフェラーゼ(APH)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性DHFRを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはG418のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4965199号を参照のこと。
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ25ないし30塩基上流に見出されるATリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から70ないし80塩基上流に見出される他の配列は、Nが任意のヌクレオチドであるCNCAAT領域である。大部分の真核生物遺伝子の3'末端には、コード配列の3'末端へのポリA尾部の付加に対するシグナルであるAATAAA配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
SV40ウィルスの初期及び後期プロモーターは、SV40ウイルスの複製起点を更に含むSV40制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、HindIIIE制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でDNAを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の5'又は3'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから5'位に位置している。
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第94/11026号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
ここに記載のベクター中のDNAをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));ハムスター乳児腎細胞(BHK, ATCC CCL10);チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));サルの腎細胞 (CV1 ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(VERO-76, ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞 (HELA, ATCC CCL2);イヌ腎細胞 (MDCK, ATCC CCL34);バッファローラット肝細胞 (BRL3A, ATCC CRL1442);ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL75);ヒト肝細胞 (Hep G2, HB8065);マウス***腫瘍細胞 (MMT060562, ATCC CCL51);TRI細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982));MRC5細胞;FS4細胞;及びヒト肝癌株(HepG2)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のF10(シグマ)、最小必須培地((MEM),(シグマ)、RPMI-1640(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号;同4657866号;同4927762号;同4560655号;又は同5122469号;国際公開第90/03430号;国際公開第87/00195号;又は米国再発行特許第30985号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び/又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、pH等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第1の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はPelliconの限外濾過装置を用いて濃縮する。PMSFなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をpH約2.5−4.5、好ましくは低塩濃度(例として、約0−0.25M塩)の溶出緩衝液を用いて低pH疎水性作用クロマトグラフィを行う。
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗Notch1 NRR抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ADC」と交換可能に称される)を提供する。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びCC1065、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する***阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第3896111号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びC-3メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第4151042号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号;同4,248,870号;同4,256,746号;同4,260,608号;同4,265,814号;同4,294,757号;同4,307,016号;同4,308,268号;同4,308,269号;同4,309,428号;同4,313,946号;同4,315,929号;同4,317,821号;同4,322,348号;同4,331,598号;同4,361,650号;同4,364,866号;同4,424,219号;同4,450,254号;同4,362,663号;及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するC-3位、ヒドロキシメチルで修飾されたC-14位、ヒドロキシル基で修飾されたC-15位、及びヒドロキシル基を有するC-20位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のC-3位で形成される。
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号;同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、GTP加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のN(アミノ)末端又はC(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、N末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分DE及びDFを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖DNA破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ1 I、α2 I、α3 I、N-アセチル-γ1 I、PSAG及びθI 1(Hinman等, Cancer Research, 53:3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58:2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシン及びQFAは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び5-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にLL-E33288複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素A鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-19を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばtc99m又はI123、Re186、Re188及びIn111は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-90はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80:49-57)は、ヨウ素-123の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤:市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したADCが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ADC)において、抗体(Ab)を、リンカー(L)を介して、一つ以上の薬剤部分(D)、例えば抗体につき約1〜約20の薬剤部分にコンジュゲートする。式IのADCはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる:(1) 共有結合の後に薬剤部分Dと反応してAb-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応;及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してD-Lを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ADCを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ab−(L−D)p I
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、6-マレイミドカプロイル(「MC」)、マレイミドプロパノイル(「MP」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(「PAB」)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(「SPP」)、N-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1カルボキシレート(「SMCC」)、及びN-スクシンイミジル(4-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「SIAB」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。DNAの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの2つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート化剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質複合体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
本発明の抗体を、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法に用いてもよい。
一態様では、本発明は、Notch1の発現及び/又は活性(シグナル伝達)の増加と関係する腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患を治療するか又は予防するための方法であって、このような治療を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
他の態様では、本発明は、腫瘍又は癌の増殖の低減、阻害又は予防のための方法であって、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
本発明の抗体を、一又は複数の抗原分子の発現及び/又は活性に関連する疾患、障害ないし症状を治療、阻害、進行を遅延、再発を予防/遅延、寛解、又は予防するために用いることができる。
また、本発明の抗体は、病態に細胞性変性ないしは機能不全を伴う疾患の治療(予防を含む)、例えば様々な(慢性)神経変性性疾患及び急性神経細胞傷害の治療に有用である。このような神経変性性疾患には、限定するものではないが、末梢神経障害、運動神経疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ALS、Lou Gehrig's病)、Bell's麻痺、及び脊髄筋萎縮又は麻痺を伴う様々な症状、及び、他のヒト神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴、及びメニエール病、及び急性神経細胞傷害、例えば外傷や脊髄損傷によるものが含まれる。
本発明の増殖させた幹細胞群は、疾患又は損傷の治療のため、又は、移植される幹細胞及び移植部位の種類に適切である当分野で公知のいずれかの方法による遺伝子治療のために、個体に移植されてもよい。肝臓に位置する肝臓幹細胞がそうであるように、造血性幹細胞は静脈内に移植されてもよい。神経幹細胞は、脳の損傷又は疾患の部位に直接移植されてもよい。
一態様では、本発明は、免疫学的疾患の治療又は予防のための方法であって、処置が必要な個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、免疫学的疾患が、異常なT細胞発達又は調節から生じる疾患である(例としてMcKenzie et al., Expert. Opin. Ther. Targets 9:395-410, 2005を参照)。
他の態様では、本発明は、自己免疫性疾患の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、自己免疫性疾患は、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症又は関節リウマチである。
更なる態様では、本発明は、移植拒絶反応の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、組織再生及び/又は修復の促進方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRRアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、骨格又は心筋又は骨の再生及び/又は修復を促進することを伴う。
一態様では、本発明は、Notch1の発現及び/又は活性の増加と関連する腫瘍、癌及び/又は細胞増殖性疾患の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、血管新生の阻害方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、血管新生と関連する病的状態の治療方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Notch1 NRR抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び/又は細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、血管新生と関連する病的状態は眼内新生血管疾患である。
上記のように、本発明は、抗Notch1 NRR抗体が他の療法によって投与される併用療法を提供する。例えば、抗Notch1 NRR抗体は、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の症状を治療するために抗癌療法又は抗脈管新生療法と組み合わせて用いられる。一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の症状は異常ないしは望ましくない血管新生に関連する病的状態に特徴がある。抗Notch1 NRR抗体は、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の薬剤と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。あるいは又はさらに、Notch1の複数のインヒビターが投与されてもよい。
抗Notch1 NRR抗体の投与は、例えば単一の組成物として、又は、2以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。ある実施態様では、2以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、抗癌剤がまず投与され、その後Notch1インヒビターが投与されてもよい。しかしながら、抗Notch1 NRR抗体の同時投与又は第一投与も考慮される。
例示的な抗癌剤には、アルキル化剤、葉酸塩アンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、細胞障害性抗生物質、白金化合物ないし白金ベースの化合物、タキサン、ビンカアルカロイド、c−Kitインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、抗血管新生インヒビター、例えば抗VEGFインヒビター、HER-2インヒビター、EGFRインヒビター又は二重EGFR/HER-2キナーゼインヒビター、抗卵胞ホルモン、例えばフルベストラント、及びホルモン療法剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ゲムシタビン、カペシタビン、エピルビシン、タモキシフェン、アロマターゼインヒビター及びプレドニゾンが含まれる。いくつかの実施態様では、癌は結腸直腸癌であり、第二医薬はエルロチニブなどのEGFRインヒビター、ベバシズマブなどの抗VEGFインヒビターであるか、又はセツキシマブ、アリノテカン、イリノテカン又はFOLFOXであるか、又は癌が乳癌であり、第二医薬がフルベストラントなどの抗卵胞ホルモン調節剤、タモキシフェン又はレトロゾール、エキセメスタン又はアナストロゾールなどのアロマターゼインヒビターであるか、又はベバシズマブなどの抗VEGFインヒビターであるか、又はドキソルビシンなどの化学療法剤及び/又はパクリタキセルなどのタキサンであるか、又はトラツズマブなどの抗HER−2インヒビター、又はラパチニブなどの二重EGFR/HER-2キナーゼインヒビターないしは17AAG(熱ショックタンパク質[Hsp]90毒であるゲルダナマイシン誘導体)(例えばトラスツズマブに進行した乳癌のために)などのHER−2ダウンレギュレーターである。他の実施態様では、癌は小細胞肺癌などの肺癌であり、第二医薬はベバシズマブなどのVEGFインヒビター、又は例えばエルロチニブなどのEGFRインヒビター又は例えばイマチニブなどのc−Kitインヒビターである。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。
本発明のある態様では、抗Notch1 NRR抗体による併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は2以上の異なる抗原を結合する2以上の抗体が個体に同時に投与されてもよい。また、個体に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
ある態様では、本発明は、有効量のNotch1のアンタゴニスト及び/又は血管新生インヒビター(一又は複数)と一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい個体又は癌と診断された個体に投与することによって、腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示し、いくつかを上記する。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び/又は生物学的療法/免疫療法、抗VEGF抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている個体ないしはこれらによって治療された個体が臨床的に治療に不十分であるか、又は個体がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性/再発性の」個体の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する個体、耐性を生じる個体、治療に応答しない個体、治療に満足に応答しない個体などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。再発性腫瘍増殖のある例は抗VEGF治療に耐性のある腫瘍である。
さらに、抗体は、特に抗体の用量を漸減するパルス注入によって好適に投与されてよい。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか長期であるかにいくらか依存して、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によってなされる。
あるいは、抗Notch1 NRR抗体をコードする核酸配列を含む阻害性核酸分子ないしはポリヌクレオチドは、個体の適切な細胞に運搬されうる。ある実施態様では、核酸は腫瘍自体に方向付けられうる。
核酸は、用いるベクターに適切な任意の手段によって、細胞に導入されてもよい。このような方法の多くは当分野で周知である(Sambrook et al., supra, and Watson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992)。遺伝子運搬方法の例には、リポソーム媒介形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム/DEAEデキストラン方法、ジーンガン(gene gun)、マイクロインジェクションが含まれる。
他の態様では、本発明は、試料中のNotch1−抗Notch1 NRR抗体複合体を検出することを含む、Notch1の検出方法を提供する。本明細書において、用いられる「検出」なる用語は、コントロールに対する参照の有無にかかわらず、定性的及び/又は定量的な検出(測定レベル)を含む。
他の態様では、本発明は、Notch1の発現及び/又は活性に関連する疾患を診断するための方法であって、該疾患を有する又は有すると思われる患者からの生体試料において、Notch1−抗Notch1 NRR抗体複合体を検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、Notch1発現は、発現の増加又は異常な(望ましくない)発現である。いくつかの実施態様では、疾患は癌、腫瘍、及び/又は細胞増殖性疾患である。あるいは、又はNotch1発現の検出に加えて、本明細書中に記載の診断又は治療の方法では、生体試料におけるNotch1リガンドの発現を決定してもよい。Notch1リガンド発現は当分野の標準的な方法を用いて決定されてよい。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗Notch1 NRR抗体とNotch1の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗Notch1 NRR抗体は検出可能に標識される。
Notch1についての分析法では、すべて、1つ又はそれより多い次の試薬を用いる:標識Notch1アナログ、固定化Notch1アナログ、標識抗Notch1 NRR抗体、固定化抗Notch1 NRR抗体及び立体コンジュゲート。標識試薬は、「トレーサー」としても知られている。
試料におけるタンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて試験しうる。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「IHC」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。試料の調整では、哺乳動物(典型的にはヒト)の組織又は細胞試料を用いてもよい。試料の例には、限定するものではないが、大腸、***、前立腺、子宮、肺、胃、膵臓、リンパ腫、及び白血病癌細胞などの癌細胞が含まれる。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引又は生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい。当分野の通常の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の通常の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び/又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばHRPO)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
表2
競合アッセイは、限られた数の抗Notch1 NRR抗体抗原結合部位について試験試料Notch1 NRRと競合するトレーサーNotch1 NRR類似体の能力に依存する。一般的に、抗Notch1 NRR抗体は、競合の前又は競合の後に不溶化して、次いで抗Notch1 NRR抗体に結合したNotch1又はNotch1 NRRとトレーサーを結合していないトレーサーとNotch1又はNotch1 NRRから分離する。この分離は、別の容器へ移す(結合パートナーが予め不溶化された場合)か、又は遠心分離する(結合パートナーが競合反応の後で沈殿した場合)ことにより達成される。マーカー物質の量で測定されるように、試験試料Notch1又はNotch1 NRRの量は結合したトレーサーの量に反比例する。Notch1 NRRの既知量による用量-反応曲線を作成して、試験結果と比較して試験試料に存在するNotch1又はNotch1 NRRの量を量的に決定する。検出可能なマーカーとして酵素が用いられる場合に、これらのアッセイはELISAシステムと呼ばれている。
「均質な」アッセイと称される競合アッセイの他の種類は、相分離を必要としない。ここで、Notch1又はNotch1 NRRと酵素とのコンジュゲートが調製され、抗Notch1 NRR抗体がNotch1又はNotch1 NRRに結合する場合に抗Notch1 NRR抗体の存在により酵素活性が修飾されるように用いられる。この場合、Notch1又はNotch1 NRR又はその免疫学的に活性な断片は、二機能性有機架橋によって、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされる。抗Notch1 NRR抗体の結合が標識の酵素活性を阻害するか又は強化するために、抗Notch1 NRR抗体により使用についてコンジュゲートを選別する。この方法自体は、EMITという名前で広く実施される。
サンドイッチアッセイは、Notch1、Notch1 NRR又は抗Notch1 NRR抗体の測定のために特に有用である。一連のサンドイッチアッセイにおいて、固定された抗Notch1 NRR抗体を用いて、試験試料Notch1又はNotch1 NRRを吸着し、洗浄によって、試験試料を除去し、結合したNotch1又はNotch1 NRRを用いて第二の標識した抗Notch1 NRR抗体を吸着して、次いで結合した材料を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、試験試料Notch1又はNotch1 NRRに正比例する。「同時」サンドイッチアッセイにおいて、試験試料は、標識した抗Notch1 NRRを加える前に分離されない。一抗体として抗Notch1 NRRモノクローナル抗体を、他方の抗体としてポリクローナル抗Notch1 NRR抗体を用いる一連のサンドイッチアッセイは、試料をNotch1又はNotch1 NRRについて試験する際に有用である。
前述は、単にNotch1又はNotch1 NRRのための例示的な検出アッセイにすぎない。Notch1又はNotch1 NRRの測定のために抗Notch1 NRR抗体を用いる、現在の他の方法又は今後開発される方法は、本明細書に記載のバイオアッセイを含め、本願の権利内に包含される。
ポリヌクレオチド(例えばmRNA)の検出方法は周知であり、例えば、相補的DNAプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識したNotch1のリボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション)、ノーザンブロット及び関連した技術、及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、Notch1に特異的な相補的プライマーを用いたRT-PCR及び、他の増幅型の検出法、例えば枝分れDNA、SPIA(単一プライマー等温増幅法)、Ribo-SPIA、SISBA、NASBA(核酸配列ベースの増幅法)、TMA(転写媒介性増幅法)など)が含まれる。
プローブ及び/又はプライマーは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素にて標識されてもよい。このようなプローブ及びプライマーを、試料中のNotch1のポリヌクレオチドの存在を検出するため、及び、Notch1のタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として用いることができる。技術者に理解されるように、多数の異なるプライマー及びプローブは、(例えば、本願明細書中で示される配列に基づいて)調製されてもよく、Notch1のmRNAの有無及び/又は量を増幅、クローン化及び/又は決定するために効率的に用いてもよい。
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器;と(b)さらに細胞障害剤を含有してなる組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
hNotch1 NRR
ヒトNotch1 NRR(hNotch1 NRR)を含むイムノゲンを以下のように得た。
発現サブクローニング
参照配列および鋳型としてのヒトNotch1(GenBank受託番号NM_017617)の完全長クローンを使用して、4つのPCRプライマの一セットを設定し、配列番号:56のアミノ酸V1307からQ1733にわたるNotch1の領域を増幅した。この領域はEGFリピート34−36を含み、膜貫通ドメインの直前で終わる。5'プライマーは、遺伝子特異的な配列の上流の直近にN末端Flagタグを加えるように設定した。このドメインに対応するPCR産物は、制限酵素依存性クローニング(RIC;Restriction Independent Cloning)手順を用いてSf-9昆虫細胞からの分泌された発現のためにベクターB9.1にクローニングした。簡単にいうと、プライマーは、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)を用いて作製した2つの独立したPCR産物に、BamHIとEcoRIの制限酵素部位の部分を付加するために必要な5'伸展を含んでいた。これらPCR産物の変性及び再アニーリングにより、この産物の25%がその5'末端及び3'末端のそれぞれにBamHI及びEcoRI突出を表すように適切なヌクレオチドを含んでいるDNA群が生成された。次いで、このDNA混合物を、BamHIおよびEcoRIによる制限酵素消化によって調製したB9.1ベクターにライゲーションした。結果として生じたコンストラクトは、DNA配列を確認し、696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N−Flag ).B9なる名称にした。ベクターB9.1は、BamHIクローニング部位の前にGp67分泌シグナル、C末端トロンビン切断部位およびHisタグを含有するpACGP67バキュロウイルスDNA導入ベクター(BD Pharmingen)の変更バージョンである。
ヒトNotch1コンストラクトのクローニングに関連する配列を以下に示す。
フォワード:[Phosp]gatccGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG (配列番号:48)
リバース:cCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG (配列番号:49)
フォワード:cGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG (配列番号:50)
リバース:[phosp]aattcCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG (配列番号:51)
大文字はNotch1遺伝子特異的な配列を表し、小文字は付加された制限酵素部位を表し、下線はFlagタグを表す。
発現されたタンパク質配列:
大文字はNotch1遺伝子特異的な配列を表し、小文字はGp67分泌シグナル、N末端Flagタグ、トロンビン部位、C末端Flagタグおよび発現ベクターによって付加されたいずれかの残基を表す。
ヒトNotch1のアミノ酸V1307−Q1733をコードするコンストラクトはSf-9細胞において発現された。バキュロウイルス株は、DNA導入ベクター[101V-1]:696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N−Flag ).B9.1を用いて作製した(発現サブクローニングの項目を参照のこと)。製造業者の勧告に従って、導入ベクターDNAは、BacPak6TM直線化ウイルスDNA(BD Clontech, Palo Alto CA)とBacfectinTM(BD Clontech)とともに、ESF921無タンパク質培地(Expression Systems LLC, Woodland CA.)中で27℃で培養した接着性Sf-9昆虫細胞に同時形質移入した。生じたP1ウイルス株は2回増幅して、大規模なタンパク質産生のために使用するP3ウイルス株を生産した。ESF921培地の懸濁液中で培養したSf-9細胞は、細胞当たり0.3ウイルス粒子の予測感染効率(MOI)を用いて1から2×106細胞/mlの密度で感染させ、感染時の3〜5日後に回収した。Sf-9細胞は遠心分離法にて取り除き、生じたウイルス株を濾過し確実に無菌にし、3%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)をウイルス安定性のために加えた。すべてのウイルス株は4℃で保存した。[101V-1]:696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1コンストラクトを含むウイルス株は、Sf-9細胞に効率よく感染し、組み換えタンパク質を発現することが示された。
[101V-1]:696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1コンストラクトは、11及び16リットルのスケールで2回の発酵において発現された。無タンパク質培地の懸濁液増殖に適応するSf-9細胞が、発酵に使われた。細胞は、同様な操作条件下にて種バイオリアクターから2×106細胞/ml以下の濃度の細胞を生産容器に播種した。ESF921培地中で27℃で発酵を行い、応需及び継続ヘッドスペース通気の散布酸素を用いて溶存酸素レベルを50%の空気飽和度に調節した。バイオリアクターは、用いる容器に応じて、2ピッチの羽根又は1つの平らな羽根を用いて100rpmの撹拌で操作した。細胞は、24から48時間にわたって、2.0から2.7×106細胞/ml以下の濃度の感染ポイントまで生育し、次いで、Notch1ポリペプチドコード化ウイルス株にて、0.5ウイルス粒子/細胞のMOIで感染させた。細胞は、感染の兆候(成長の停止、細胞直径の増加)についてモニターし、更に65〜72時間生育させた。結果として生じた培地を冷やし、遠心分離にて回収し、すぐにタンパク質精製を行った。
コンストラクト696.G40.V2.Notch1.V1307-Q1733(N-Flag).B9.1によってコードされるポリペプチドを発現するSF9細胞の上清培地を、氷冷バッファA(50mM Hepes、pH7.5、150mM NaCl、5mM CaCl2、及び0.5mM フッ化フェニルメチルスルホニル)にて希釈し(v/v=1:4)、15〜20分間バッチ結合させ、培地1リットルにつき2mlの樹脂の割合で予めNi−NTAスーパーフロー樹脂(Qiagen, Product No. 30450)を平衡化した。0.8μmフィルター(Nalgene, Product No. 450-0080)による濾過によってNi−NTA親和性樹脂を回収し、その後適切な重力点滴カラム(gravity drip)(d:h 1:10)に詰めた。カラムは、10カラム容量(CV)の氷冷バッファB(50mM Hepes、pH 7.5、1000mM NaCl、5mM CaCl2及び10mM イミダゾール)にて洗浄した後、10CVの無PMSFバッファAにて洗浄した。次いで、カラムは、250mMのイミダゾール(無PMSF)を含む5CVのバッファAにて溶出した。溶出されたタンパク質は、製造業者の勧告に従って、Amiconウルトラ濃縮器(3000 MWCO)を用いて濃縮し、バッファをPD−10カラム(GE Healthcare)を用いて貯蔵バッファ(10mM Hepes pH 7.5、150mM NaCl及び5mM CaCl2)に交換した。タンパク質純度は、クーマシー染色によるSDS−PAGEによるところ90%を上回ると推定された。精製されたタンパク質の濃度は、標準物質としてBSAを用いたBradfordアッセイ(Coomassie Plus kit, Pierce、カタログ番号23236)によって推定した。タンパク質のトリプシン消化の質量分析によるペプチド配列決定を用いて同一性を確認した。
マウスNotch1 NRR(mNotch1 NRR)を含むイムノゲンを以下のように得た。
マウスNotch1(配列番号:57)のアミノ酸V1307からQ1723にわたる配列をサブクローニングし、一般にヒトNotch1イムノゲンについて上記したように発現させた。マウスNotch1のこの領域はEGFリピート34−36を含み、膜貫通ドメインの直前で終わる。このイムノゲンを発現するコンストラクトを64794.G1.Notch1.V1307-Q1723 (N-Flag, C-His).pRK5-GNEと称する。マウスNotch1 NRRに対する抗体を生成するために用いたイムノゲンのための発現タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りであり、N末端FLAGタグ及びC末端Hisタグを含む。
上記の配列のN末端(配列番号:14のアミノ酸MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRG)はタンパク質を発現する細胞によって切り離される。それ自体は、マウスNotch1 NRR特異的な抗体を生成するために用いたイムノゲンはこのN末端配列を欠く。
マウスNotch1のアミノ酸V1307からQ1723をコードするコンストラクトは、無血清懸濁培地 (FreeStyle 293-F Cells Invitrogen カタログ#R790−07)に適用したFreestyle 293-F細胞において過渡的に発現させた。
細胞は、GIBCO(登録商標)FreeStyle293発現培地(Invitrogen カタログ#12338−018)にて培養した。細胞は、125rpmで回転する環状振とうプラットフォーム上で8%CO2の加湿大気中で37℃でインキュベートした振とうフラスコ中で0.3から3×106生細胞/mlの濃度に維持した。形質移入の前日に、5×105生細胞/mlの濃度の細胞を播いた。形質移入の日に、生存率と濃度について細胞を調べた(>90%、1×106細胞/ml)。各々の形質移入のために、脂質−DNA複合体を以下のように調製した。1×106細胞/mlの細胞500mlにつき、500μgのプラスミドDNAを、40mlのOpti−MEM(登録商標) I (Invitrogen カタログ#51985−034)、500μlのポリエチレンイミン 1.5μg/ml溶液(PEIポリエチレンイミン、線状、MW25000 Polysciences カタログ#9002−98−6)にゆっくりと加えた。混合物を穏やかに混合し、室温で20〜30分間インキュベートして、DNA−脂質複合体を形成させた。次いで、DNA−脂質複合体を細胞にゆっくり加え、3日間のインキュベートの後に培地を回収した。
mNotch1コンストラクトは1リットルにて2回行い発現させた。細胞は、0.9〜1×106細胞/mlの濃度で形質移入し、65〜75時間後、細胞が2.2〜2.5×106/mlの濃度かつ75〜78%生存率の時に培地を回収した。
結果として得た培地を冷やし、遠心分離にて回収した後すぐにNRRを含むマウスNotch1ポリペプチドの精製に用いた。
抗FLAG M2アガロース(Sigma-Aldrich、製造番号A2220)を用いたバッチモードにより、イムノゲンをHEK293分泌培地から精製した。バッファB(50mM HEPES pH7.5、150mM NaCl、5mM CaCl2)の抗FLAG M2アガロースは、EDTAプロテアーゼインヒビター(培地1リットルにつき20錠、Roche)を含まない分泌培地含有完全培地に、培地1リットルにつき5mlのアガロースの比率で加えた。次いで培地を一定の回転で3時間4℃でインキュベートした。0.8μmフィルター(Nalgene、製造番号450−0080)による濾過によって抗FLAGアガロースを回収し、重力フローカラム(gravity flow)(BioRad、製造番号731−0003)に詰めた。アガロースは、10カラム容量のバッファBにて洗浄し、その後タンパク質を4カラム容量の0.1mg/ml FLAGペプチド(Sigma-Aldrich、製造番号F3290)を含むバッファBにて溶出した。溶出されたタンパク質は、Amiconウルトラ濃縮器(10000 MWCO、Millipore、製造番号UFC901096)を用いて濃縮し、バッファをPD−10カラム(GE Healthsciences、製造番号17−0851−01)を用いて貯蔵バッファ(10mM Hepes pH7.5、150mM NaCl、5mM CaCl2、5%グリセロール)に交換した。純度は、逆相HPLCにて92%を上回ると推定された。濃度は、標準物質としてBSAを用いたBradfordアッセイ(Coomassie Plus kit、Pierce、カタログ番号23236)によって推定した。タンパク質の同一性は、質量分析によるタンパク質トリプシン消化のペプチド配列決定により確認した。
抗Notch1 NRR抗体は以下のように生成した。
抗Notch1 NRR抗体を同定するためのライブラリ選別とスクリーニング
ヒトNotch1 NRRタンパク質イムノゲン(上記のもの)を抗原として用いた。NUNC96ウェルMaxisorpイムノプレートを標的抗原(10μg/ml)にて4℃で終夜コートして、ファージ遮断(ブロック)バッファPBST(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)と0.05%(v/v)Tween20)にて室温で1時間かけて遮断した。Fab断片を表示する抗体ファージライブラリ(例としてLee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004を参照)を抗原プレートに加え、室温で終夜インキュベートした。翌日、抗原コートプレートをPBT(0.05%Tween20を含むPBS)にて10回洗浄し、結合したファージを50mM HClと500mM NaClにて30分間かけて溶出し、等量の1Mトリス塩基pH7.5にて中和した。回収したファージを大腸菌XL-1ブルー細胞中で増幅させた。その後の選別ラウンドの間、抗原コートプレートとの抗体ファージのインキュベートを2〜3時間に短縮し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に上げた。
4回のパニングの後、顕著な濃縮が観察された。190のクローンを拾い、これらがヒトNotch1 NRRに特異的に結合したか否かを決定し、190すべてのクローンをPCR配列決定し、固有の配列クローンを同定した。
抗体A、BおよびCは、LPG3およびLPG4ベクターのそれぞれに別々のクローンのVL及びVH領域をクローニングし、哺乳類のCHO細胞において過渡的に発現させ、プロテインAカラムにて精製することによって、再編成した。これらクローンは、ヒト及びマウスのNotch2 NRR、Notch3 NRR及びNotch4 NRRの一又は複数への交差反応、及び実施例5に記載の共培養アッセイを用いたブロック活性について試験した。この特徴づけの結果を表3に示す。
表3:抗Notch1 NRR IgGの特徴付け
* IC50〜100ng/ml
ND=未測定
抗体Aを親和性改善のために選択した。プラスミドpW0703(プラスミドpV0350-2b由来(Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))、すべてのCDR−L3位置に停止コドン(TAA)を含み、M13バクテリオファージの表面上に一価のFabを提示している)を、親和性成熟のためのVHライブラリからの対象のクローンの重鎖可変ドメイン(VH)のためのライブラリテンプレートとして用いた。ハード及びソフトランダム化方策を親和性成熟のために用いた。ハードランダム化(hard randomization)では、3つの軽鎖CDRの選択した位置を有する1つの軽鎖ライブラリを、天然のヒト抗体を模倣するように設定したアミノ酸を用いてランダム化し、設定したDNA縮重はLee et al. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))に記載される通りであった。ソフトランダム化(soft randomization)では、CDR-L3の位置91−94及び96、及びCDR-H1の28−31及び34−35、CDR-H2の50、52及び53−58、CDR-H3の95−99及び100Aの残基を標的とし、2つの異なるCDRループの組合せであるL3/H1/H2およびL3/H3をランダム化のために選択した。選択した位置でおよそ50%の変異率となるソフトランダム化状態を達成するために、突然変異誘発DNAを、70−10−10−10混合の野生型ヌクレオチドを好む(favoring)塩基により合成した(Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994))。
親和性改善選別のために、ファージライブラリは、第1ラウンドではプレート分類に、その後3回のラウンドでは溶液分類に用いた。プレート分類の第1ラウンドでは、3つのライブラリを、標的(ヒトNotch1 NRR−ECD)コートプレート(NUNC Maxisorpプレート)に対して別々に分類した。ファージインプットは、37℃、2時間で、1%BSAおよび0.1%Tween20中でおよそ3O.D/mlであった。プレート分類の第1ラウンドの後、溶液分類を3〜4回行って、選別のストリンジェンシーを上げた。溶液分類では、プレート分類の第1ラウンドにて増殖した1O.D./mlのファージを、20nMのビオチン化標的タンパク質(ここでは濃度は親のクローンファージIC50値を基にしている)を含む、1%Superblock(Pierce Biotechnology)と0.05%Tween20を含む100μlのバッファ中で室温で30分間インキュベートした。さらに、混合物を1%Superblockにて10倍に希釈し、100μl/ウェルをニュートラビジンコートウェルに添加し(5μg/ml)、室温で5分間、ゆっくりと撹拌しながら、ビオチン化標的をファージに結合させた。ウェルをPBS−0.05%Tween20にて10回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化していない標的を有するファージを含むコントロールウェルをニュートラビジンコートプレート上で捕獲した。結合したファージを0.1N HClにて20分間溶出し、1/10量の1M トリスpH11にて中和し、力価を測定して、次のラウンドのために増殖させた。次に、2回又は3回目以降のラウンドの溶液分類はともに、選択ストリンジェンシーを高めた2つの方法により実施した。その一つ目は、2nMから0.1nMにビオチン化標的タンパク質濃度を減少することによるオンレート(on-rate)選択であり、その二つ目は、弱い結合物を完全に除くために過剰量(100〜1000倍以上)の非ビオチン化標的タンパク質を添加することによるオフレート(off-rate)選択である。また、ファージインプットはバックグラウンドファージ結合を低くするために低くした(0.1〜0.5O.D/ml)。
第3および第4ラウンドのスクリーニング物からコロニーを拾い、96ウェルプレート(Falcon)中で50μg/mlカルベニシリンと1E10/mlのKO7を含む150μl/ウェルの2YT培地にて37℃で終夜生育させた。同じプレートから、XL-1感染親ファージのコロニーをコントロールとして拾った。96ウェルNunc Maxisorpプレートを、100μl/ウェルの標的タンパク質(2μg/ml)を含むPBSにて、4℃で終夜又は室温で2時間かけてコートした。65μlの1% BSAにて30分間、そして40μlの1% Tween20にてさらに30分間置いて、プレートをブロックした。
ファージ上清を、10nMの標的タンパク質を含む又は含まないELISA(酵素結合吸着アッセイ)バッファ(0.5%BSAと0.05%Tween20を含むPBS)にて1:10に希釈して全量を100μlとし、Fプレート(NUNC)にて室温で少なくとも1時間インキュベートした。標的タンパク質を含む又は含まない75μlの混合物を、標的タンパク質コートプレートに並んで移した。プレートを15分間緩やかに振とうし、標的タンパク質コートプレートに結合していないファージを捕獲させた。プレートを、PBS−0.05%Tween20にて少なくとも5回洗浄した。結合は、ELISAバッファ(1:5000)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合抗M13抗体を加えて定量し、室温で30分間インキュベートした。PBS−0.05%Tween20にて少なくとも5回ウェルを洗浄した。次に、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)ペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液B(H2O2)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を1:1の比率で含む100μl/ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて5分間インキュベートした。各ウェルに100μlの1Mリン酸(H3PO4)を加えることによって反応を止め、室温で5分間インキュベートした。各ウェルの黄色の450nmのOD(光学密度)を、標準的なELISAプレート読み込み器を用いて定量した。OD減少(%)は、以下の方程式によって算出した。
OD450nm減少(%)=[(競合物質を含むウェルのOD450nm)/(競合物質を含まないウェルのOD450nm)]*100
表4:親和性成熟抗体クローンの特徴付け
NRR1=Notch1 NRR
さらに抗Notch1 NRR Mabの結合親和性と結合動態を特徴付けるために、BIAcoreTM-3000にて表面プラスモン共鳴(SRP)測定値を用いた(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)とN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)にて活性化した。ウサギ抗ヒト抗体(Pierce)を10mM 酢酸ナトリウム(pH4.8)にて20μg/mlに希釈し、結合した抗体の反応単位(RU)がおよそ3000になるように5μl/分の流速で注入した。次に、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入した。およそ200反応単位(RU)を達成するために、抗NRR1 mab(完全長IgGとしてフォーマットしたもの)をチップ上にコートしたウサギ抗ヒトIgGによって捕獲させた。動力学的な測定のために、2倍の段階希釈したヒトNRR1−ECD又はマウスNRR1−ECDタンパク質(3.9nMから500nM)を、25℃、30μl/分の流速でPBTバッファ(0.05%Tween20を含むPBS)に注入した。単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出した。平衡解離定数(KD)をkoff/kon比として算出した。
この実験の結果を表5に示す。「NA」は測定が行われなかったことを表す。
表5:抗Notch1 NRR抗体のヒト及びマウスのNotch1 NRR含有ポリペプチドに対する結合の結合親和性と動態
抗体A、A−1及びA−2の結合決定因子を調べるために、ヒト及びマウスのNotch1断片を用いて結合実験を行った。
これらの実験において以下のタンパク質を用いた。
(1) 上掲の実験1に記載の、hFLAG−EGF34+NRR−His6 (101V)−ヒトNotch1イムノゲン。
(2) hFLAG−NRR−His6 (102V):ヒトNotch1のアミノ酸E1447−Q1733、FLAGタグ、HISタグ及びトロンビン切断部位を含む。Notch1タンパク質はLNR_A、LNR_B、LNR_C、HD_N、HD_Cの配列を含む。このタンパク質はいずれのEGF様リピート配列も含まない。
(3) hFLAG−HD−His6(103V);ヒトNotch1のアミノ酸R1568−Q1733、FLAGタグ、トロンビン切断部位及びHISタグを含む。Notch1タンパク質はLHD_N及びHD_Cの配列を含む。このタンパク質はいずれのEGF様リピート配列も含まず、3つのLNR領域も含まない。
(4) mFLAG−EGF34+NRR−His6:上記の実施例1に記載の、マウスイムノゲン。
(5) mEGF34+NRR−L1597H−FLAG−TEV−Fc:L1597H変異を有するマウスNotch1のアミノ酸V1307−Q1723、Flagタグ、Fcタグ及びTEVプロテアーゼ部位を含む。L1597H変異によりNotch1が活性化され、この変異は例えば Weng et al., Science 306:269-271, 2004に記載されている。
(6) Flagコントロール:Flagタグを含むコントロールポリペプチドである。
(7) Hisコントロール:HISタグを含むコントロールポリペプチドである。
4℃で終夜をかけて、1μg/mlのタンパク質を含むPBS, pH7.4をELISAプレート(Nunc Maxisorp)上にコートした。室温で1時間かけて、カゼインブロッカーを含むPBS(リン酸緩衝生理食塩水;Pierce)にてプレートをブロックした。PBSTバッファ(0.5%(w/v)BSAを含むPBTバッファ(PBS+0.05%(v/v)Tween20))にて段階的に3倍希釈した抗Notch1 NRR IgG又は無関係のIgGをプレートに加え、室温で1時間インキュベートした。次いで、プレートをPBSTにて洗浄し、結合した抗体をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトFab特異的IgG(Sigma)にて検出した。TMB基質(3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を用いて、標準的なELISAプレート読み取り機を用いて650nMの吸光度を読み取った。吸光度は、KaleidaGraph(Synergy Software)を用いてIgGの濃度に対してプロットした。
この実験の結果を、図12A(抗体A−hIgG1)、12B(抗体A−1−hIgG1)、および12C(抗体A−2−hIgG1)に示す。抗体A、A−1及びA−2は、ポリペプチドhFLAG−EGF34+NRR−His6(101V)、hFLAG−NRR−His6(102V)、hFLAG−HD−His6(103V)、mFLAG−EGF34+NRR−His6を結合し、Notch1配列を欠くコントロールポリペプチドを結合しなかった。これらの結果は、Notch1 NRRドメインが抗体A、抗体A−1及び抗体A−2の結合に十分であることを示す。また、抗体A、A−1及びA−2は、Notch1活性化変異L1597Hを含むタンパク質mEGF34+NRR−L1597H−FLAG−TEV−Fcを結合した。この結果は、抗体が変異Notch1レセプターに結合することができることを示す。
Notch1レポーターアッセイ
Notch1レポーターアッセイ(「共培養アッセイ」とも称される)を行って、抗Notch1 NRR抗体のNotch1シグナル伝達阻害能を測定した。簡単にいうと、アッセイは以下の工程を伴う。
(1) ヒトNotch1を発現するNIH−3T3細胞はNotchシグナル伝達に応答するルシフェラーゼレポータープラスミドにより形質移入された。
(2) 細胞を抗体又は様々なコントロール試薬にて処理した。
(3) ヒトJagged1を安定して発現するNIH−3T3細胞を加えることによりシグナル伝達を開始した。
(4) レポータープラスミドから発現されるルシフェラーゼ活性を測定することにより、Notchシグナル伝達のレベルを評価した。
(1) ヒトNotch1(N1)を安定して発現するNIH−3T3細胞を、黒色壁の透明ウェルの96ウェルプレートに、10%FBSを含むが抗生物質を含まないDMEM高グルコース培地に、1ウェル当たり5000細胞をプレーティングした。細胞は5%CO2、37℃で16時間インキュベートした。次いで、培地を無血清のDMEMに交換し、100ng/ウェルのTP−1(CSLプロモーター、Notch活性化に応答性)ルシフェラーゼプラスミド(例えばMinoguchi et al., Mol. Cell. Biol. 17:2679-2687 (1997)を参照)と5ng/mlのpRL−CMVウミシイタケルシフェラーゼレポーター(Promega)にて、細胞を形質移入した。形質移入は5%CO2、37℃で6時間続け、4時間目に血清を戻し添加した。
(2) 6時間の終わりに、形質移入試薬を含む培地を吸引によって除去し、50μlのDMEM/FBSを以下のように加えた。A.新鮮培地(偽刺激のためのコントロールNIH−3T3細胞親細胞を投与した後)、B.新鮮培地(10%FBSを有するDMEM)、C.400ng/mlのヒトIgGアイソタイプコントロール抗体、4つの異なる濃度(D.16ng/ml、E.80ng/ml、F.400ng/ml、G.2000ng/ml)の抗Notch1 NRR抗体A、H.精製したNotch1 NRRタンパク質(1ウェル当たり5μg)とともに30分間予めインキュベートした400ng/mlの抗Notch1 NRR抗体A、I.Hのように処理したNotch1 NRRタンパク質と400ng/mlのヒトIgGアイソタイプコントロール抗体、J.BSAタンパク質を戻し添加して(6.5μg/ウェル)30分間予めインキュベートした400ng/mlの抗Notch1 NRR抗体A、K.1μMの化合物E(γ-分泌酵素インヒビター;C27H24F2N4O3;Seiffert et al., J. Biol. Chem. 275:34086, 2000)、及び、L.DMSOコントロール(化合物E溶媒のみ)。上記した試薬は、5%CO2、37℃で1時間形質移入したNIH−3T3−Notch1細胞とともにインキュベートした。
ホタル(TP1)およびウミシイタケ(pRL-CMV)ルシフェラーゼ活性は、Dual-Gloルシフェラーゼキット(Promega)により測定した。Notchシグナル伝達のレベルは、ホタル読み値をウミシイタケ読み値にて除し、各条件の8回分を平均化することによって算出した。結果を図7に示し、ここで誤差バーは8回分の標準偏差を表す。
図7に示すように、抗体Aは強力なNotch1インヒビターである。TP1−Lucレポーターを用いて測定されるように、抗体AはNotchシグナル伝達を阻害する。抗体の力価を示す。400ng/mlの抗体では、Notchシグナル伝達はコントロールの18%、「オン」レベル(400ng/mlのアイソタイプコントロールを用いて観察されるシグナル伝達のレベル)にまで抑制される。さらに、BSAコントロールでなく溶液NRRの添加により、シグナル伝達への抗体が誘導するブロックが低減したことから、シグナル伝達の抗体阻害は抗体−Notch1 NRR相互作用によるものであることが示唆された。γ-分泌酵素インヒビターである化合物Eを、阻害を示すためのコントロールとして用いた。他のコントロールとして、Jagged1発現細胞を親細胞(NIH−3T3単独、Jagged1なし)と置き換えると、完全なシグナル伝達を誘導しなかったことから、シグナル伝達はJagged1が必要であることを示唆する。
先に用いた共培養アッセイ法を用いて、様々な濃度の処理による、その親和性成熟相対物である抗体A−1、抗体A−2及び抗体A−3と抗体Aとを比較した。80ng/mlの抗体で明らかなように、抗体A−2及び抗体A−3は、抗体AよりもNotchシグナル伝達を強力にブロックした(図8)。
分化培地にて処理した場合、マウスC2C12筋芽細胞は筋管に分化する。Jagged1リガンド発現細胞とともに培養すると、Notchシグナル伝達を刺激することによって分化が阻害される。以下に詳細に示すように、抗体AのNotch1シグナル伝達阻害能と一致して、抗体Aの添加により分化が回復された。コントロールとして、γ分泌酵素インヒビターも分化を回復した。
特に、マウスC2C12筋芽細胞は、滅菌丸底の10mmカバースリップを有する24ウェル組織培養ディッシュに、1ml当たり2.5×104細胞を、1ウェルに1ml用いてプレーティングした。次いで、細胞を接着させ、5%CO2、37℃で成長培地(10%FBSを含むDMEM)中で22時間生育させた。次いで、成長培地を吸引し、分化培地(DM)(6%ウマ血清を含むDMEM)を加えた。A. DM単独、B.3T3−J1細胞を含むDM、C.NIH−3T3−Jagged1とヒトIgGアイソタイプコントロール抗体を含むDM、D.3T3−J1細胞と200ng/mlの抗体Aを含むDM、E.NIH−3T3−Jagged1細胞とDMSO(ベヒクル)を含むDM、F.3T3−J1細胞と1μMの化合物E(γ-分泌酵素インヒビター)を含むDMにより、細胞を処理した。これらの条件下で5%CO2、37℃で4日間細胞をインキュベートした。カバースリップを回収し、細胞を4%パラホルムアルデヒドにて固定し、0.2%トリトンX-100を含むPBSにて透過処理した。次いで、細胞を10%FBSを含むPBSにてブロックした。ミオシン重鎖を認識する抗体(Millipore、抗ミオシンHC、クローンA4.1025腹水)と、Alexa(登録商標)488に結合したヤギ抗マウスIgG(H+L)二次抗体(Molecular Probes)を用いて分化した筋管を染色した。DAPIを用いて核を対比染色した。各条件について3つの異なるフィールドの画像を撮った。画像のサブセットを図10に示す。Metamorphソフトウェア(Molecular Devices)を用いて核の数とAlexa(登録商標)488染色の領域を数えた。Alexa(登録商標)488染色の領域を、核の数で除し、平均してグラフ化した。誤差バーは、3つの画像の標準偏差を表す。これらの結果を図9に示す。
基本的には上記のように、リポフェクタミン及びリポフェクタミンプラス試薬(Invitrogen)とヒトJagged1を安定して発現するNIH−3T3細胞とを用いて、L1594P変異Notch1レセプター、DelPEST変異Notch1レセプター及び野生型(wt)Notch1レセプターをコードするTP−1及びpRL−CMVプラスミドにて過渡的に形質移入したNIH−3T3細胞を用いて、ルシフェラーゼレポーター共培養アッセイを行った。L1594P変異は、HD−Nドメインのアミノ酸(aa)1594で、ロイシンからプロリンへの突然変異を意味する(例としてWeng et al., Science 306:269-271, 2004を参照)。DelPESTは、aa2473から始まるPESTドメインのカルボキシル末端欠失を意味する(例としてMalecki et al., Mol. Cell. Biol. 26:4642-4651, 2006を参照)。発表されている結果と一致して、図13に示す結果から、L1594PとDelPEST変異がNotch1シグナル伝達を活性化することが確認される。同じアイソタイプの無関係なファージ由来モノクローナル抗体を使用したネガティブコントロールと関連して、抗体Aは、用量依存的な様式で各々3つのレセプターによるシグナル伝達を阻害した。DMSOに溶解したγ分泌酵素インヒビターである化合物E(CmpE)は、Notchシグナル伝達の阻害のポジティブコントロールとして用いた。黒色バーは2000ng/mlのコントロール抗体を用いて得られた結果を示し、荒いドットのバーは80ng/mlの抗体Aを用いて得られた結果を示し、細かい縞のバーは400ng/mlの抗体Aを用いて得られた結果を示し、荒い縞のバーは2000ng/mlの抗体Aを用いて得られた結果を示し、斜交平行線のバーは10μMの化合物Eを用いて得られた結果を示し、細かいドットのバーはDMSO(化合物Eのベヒクル)を用いて得られた結果を示す。各条件の結果は8回の実施で測定され、次いで標準偏差を示す誤差バーとともに平均値として表した。
血管形成及び脈管形成に対する抗Notch1 NRR抗体の作用を、HUVEC細胞出芽アッセイを用いて調べた。このアッセイは、Nakatsu et al. (Microvasc. Res. 66 (2): 102-112, 2003)によって記載されたものと類似している。HUVEC細胞を、Cytodex 3(登録商標)ビーズ(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey)上にコートし、次いでそれをフィブリンゲルに移植した。ヒトの皮膚線維芽細胞をフィブリンゲル層上にプレーティングし、次いでそれに組織培養液をかぶせた。HUVEC細胞からの脈管出芽を4〜9日後に調べた。抗Dll4処理で観察された結果と同様に、図14Aに示すように、抗Notch1 NRR処理により脈管出芽と長さの顕著な増加が生じた。示すように、コントロールとしてPBS、又は抗体AないしA−2にて処理した細胞についての結果を示す。抗Notch1 NRR抗体は、脈管出芽と脈管構造ネットワーク密度を増加することによって、脈管形成と血管形成を阻害する。
また、脈管形成及び血管形成に対する抗Notch1 NRR抗体の作用を、血管新生の角膜ポケットアッセイを用いて調べた。図14Bにまとめたプロトコールに示すように、通常血管のない齧歯類の角膜をVEGFペレットとともに移植して(#63、#132及び#390)、血管新生を誘導するか、ネガティブコントロールとして無処理のまま放置した(#381)。その後、脈管ネットワーク密度の増加についてのポジティブコントロールとして抗Dll4にて(#132)、又は抗体A−2にて(#390)、角膜を処理した。脈管は、抗CD31ベースの免疫蛍光染色法(赤)によって視覚化した。図14Bに示すように、抗Notch1 NRR処理により脈管ネットワーク密度が有意に増加した。図14Bについて上記のように処理した角膜内の血管もまたFITC−デキストラン(緑)にて還流し、血管によるフローを評価した。図14Cに示すように、抗Dll4処理血管及び抗Notch1 NRR処理血管による還流は制限された。
また、血管新生のマウス網膜モデルにおける抗Notch1 NRR抗体の作用を調べた。図14Dにまとめたプロトコールに示すように、P1(出生後1日)又はP3(出生後3日)からのマウス網膜を、示した濃度の抗体A−2又はネガティブコントロールとしての抗ブタクサ抗体にて処理した。P5(出生後5日)で網膜を採取した。イソレクチンB4を用いて脈管構造を視覚化した。図14A−14Cに示す結果と一致して、抗Notch1 NRR処理により脈管構造密度が増加し、過剰な出芽表現型が生じた。図14Dについて上記のように処理したマウス網膜はDAPIにて染色して、核DNAを可視化した。図14Eに示すように、抗Notch1 NRR処理により核の数が増加したことから、増殖の増加の可能性が示唆された。
腫瘍増殖に対する抗Notch1 NRR抗体の作用をインビボマウスモデルを用いて調べた。免疫欠損マウス(Balb−C Nu/Nu)を、HM7細胞株(大腸腺癌)による移植片試験に用いた。5000000細胞を0.1mlのマトリゲル(BD Biosciences, San Jose, California)に移植し、それをマウスの皮下に接種した。腫瘍をおよそ250〜300立方ミリメートルまで成長させた後、示すように投与を開始するために3つの処理群にマウスをランダムに分けた。図15Aに示すように、抗体A−2による処理は腫瘍増殖を抑制した。抗ブタクサと抗VEGFは、それぞれネガティブとポジティブのコントロールとした。図15Aについて上記と類似する実験では、様々な用量の抗体A−2を腫瘍増殖を停止又は緩徐化する能力について試験した。結果を図15Bに示す。HM7細胞株の代わりにCALU6細胞株(非小細胞肺癌細胞株)を用いたことを除き、図15Aについて上記したのと同じ実験では、図15Cに示すように、抗体A−2は腫瘍体積を低減することが明らかとなった。まとめると。図15A−15Cに示す結果は、抗Notch1 NRR抗体が腫瘍増殖を阻害することを示す。
図15Bについて上記したのと同じ実験では、図15Dに示すように、抗体A−2による処理は、用量依存的な様式で体重損失を引き起こすことが明らかとなった。図15Bについて上記したのと同じ実験では、抗体A−2のクリアランスは、示された時間点で処置したマウスの血清中のヒトFcの濃度を測定することによって調べた。結果を図15Eに示す。
マウス腸管内の細胞に対する抗Notch1 NRR抗体の作用を調べた。3〜4日ごとに抗体A−2を投与したおよそ10日後の処置マウスとコントロールマウス(ベヒクル)から腸を単離した。。ヘマトキシリンとエオジン、並びにムチンに対してはアルシアンブルー(青、分泌細胞のマーカー)又は共通して用いられる増殖マーカータンパク質であるKi−67に対しては抗Ki−67(茶、抗体ベースの免疫組織化学染色手順)にて、試料を染色した。図16A及び16Bは、示した濃度の抗体A−2又はコントロール抗体(ベヒクル)にて処置したマウスの、それぞれ小腸又は大腸からの陰窩及び絨毛の例を示す。結果は、抗Notch1 NRRが移行増幅細胞の増殖を停止し、杯細胞及びパネート細胞を含む分泌細胞の数を増加させることを示す。
癌細胞株のパネルに対する抗Notch1 NRR及びγ分泌酵素インヒビターDAPT及び「化合物E」(CmpE)の作用を調べた。図17に示す細胞株(x軸)は、示すように抗体A−2、DAPT、CpmE又はDMSO(コントロール、γ分泌酵素インヒビターのベヒクル)の存在下又は非存在下で増殖させ、CellTiter−GloTM発光細胞生存率アッセイ(Promega, Madison, WI)を用いて細胞の生存率を評価した。このアッセイにより、代謝活性のある細胞を表すATP存在の定量化に基づき、培地中の生細胞数が決定される。発光は、図17の「相対的な発光の単位」(y軸)として定量化される。図17に示すように、乳腺癌株であることが報告されたMT−3と卵巣癌細胞株であるOVCAR−3がATPレベルの低減を示した。このATPレベルはDAPT、CmpE又は抗Notch1 NRRの存在下でインキュベートした後の増殖低減及び/又は細胞死増加を表す。
Claims (30)
- (i) RASQDVSTAVA(配列番号:7)である配列A1-A11を含むHVR-L1
(ii) SASFLYS (配列番号:8)である配列B1-B7を含むHVR-L2
(iii) QQSYTTPPT(配列番号:9)である配列C1-C9を含むHVR-L3
(iv) GFTFSSYWIH(配列番号:1)である配列D1-D10を含むHVR-H1
(v) ARINPSNGSTNYADSVKG(配列番号:2)である配列E1-E18を含むHVR-H2、及び、
(vi) ARGSGFRWVMDY(配列番号:6)である配列F1-F14を含むHVR-H3
を含んでなる、Notch1シグナル伝達を低減する単離された抗Notch1 NRR抗体であって、
該Notch1 NRRは、配列番号:56のアミノ酸残基1446から1735のアミノ酸配列を有するヒトNotch1 NRR、又は配列番号:57のアミノ酸残基1446から1725のアミノ酸配列を有するマウスNotch1 NRRである、抗体。 - (i) 配列番号:1の配列を含むHVR-H1配列、
(ii) 配列番号:2、3、4及び5から選択される配列を含むHVR-H2配列、
(iii) 配列番号:6の配列を含むHVR-H3配列、
(iv) 配列番号:7の配列を含むHVR-L1配列、
(v) 配列番号:8の配列を含むHVR-L2配列、及び
(vi) 配列番号:10、11及び12から選択される配列を含むHVR-L3配列
を含んでなる、Notch1シグナル伝達を低減する単離された抗Notch1 NRR抗体であって、
該Notch1 NRRは、配列番号:56のアミノ酸残基1446から1735のアミノ酸配列を有するヒトNotch1 NRR、又は配列番号:57のアミノ酸残基1446から1725のアミノ酸配列を有するマウスNotch1 NRRである、抗体。 - HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、10、1、3、6を含む、請求項2に記載の抗体。
- HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、11、1、4、6を含む、請求項2に記載の抗体。
- HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及びHVR-H3を含み、これらは順に配列番号:7、8、12、1、5、6を含む、請求項2に記載の抗体。
- Notch1 NRRへの結合について、請求項3から5のいずれか一に記載の抗体と競合する抗体。
- フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトのコンセンサスフレームワーク配列である、請求項1から5のいずれか一に記載の抗体。
- ヒトのκサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項1から5のいずれか一に記載の抗体。
- 重鎖ヒトのサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項1から5のいずれか一に記載の抗体。
- コンセンサスフレームワーク配列における位置71、73又は78の一又は複数に置換を含む、請求項9に記載の抗体。
- 置換がコンセンサスフレームワーク配列におけるR71A、N73T又はN78Aの一又は複数である、請求項10に記載の抗体。
- 請求項1から11のいずれか一に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 発現ベクターである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項13又は14に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 原核生物である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 真核生物である、請求項15に記載の宿主細胞。
- 哺乳動物細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- (a) 請求項14に記載のベクターを好適な宿主細胞において発現させ、そして(b) 抗体を回収することを含む、抗Notch1 NRR抗体の製造方法。
- 宿主細胞が原核生物である、請求項19に記載の方法。
- 宿主細胞が真核生物である、請求項19に記載の方法。
- 医薬としての使用のための請求項1から11のいずれか一に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- Notch1のシグナル伝達又は発現の増加と関連する疾患を有する個体の治療方法における使用のための、請求項1から11のいずれか一に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 前記疾患が癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患である、請求項23に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 前記癌、腫瘍及び/又は細胞増殖性疾患が癌である、請求項24に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 前記疾患が神経変性疾患である、請求項23に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 疾患が血管新生と関連する病的状態を含む、請求項23に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 前記個体がヒトである、請求項23から27のいずれか一に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 前記疾患が、個体におけるNotch1アミノ酸配列の活性化変異と関連している、請求項23に記載の抗Notch1 NRR抗体。
- 請求項1から11のいずれか一に記載の抗Notch1 NRR抗体と薬理学的な担体とを含有してなる組成物。
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