WO2016121701A1 - 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス - Google Patents

免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス Download PDF

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WO2016121701A1
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acid sequence
variable region
peptide
chain variable
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吉田　慎一
大 村田
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株式会社カネカ
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to an affinity separation matrix having as its ligand a protein binding peptide containing immunoglobulin ⁇ chain variable region, which has an extremely excellent ability to bind to the ⁇ chain variable region of immunoglobulin, and ⁇ chain of immunoglobulin using the affinity separation matrix
  • the present invention relates to a method for producing a variable region-containing peptide, DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • Protein A affinity separation matrix (hereinafter referred to as “SpA”), which is used for purifying (capturing) antibody drugs from animal cell cultures at a high purity at once.
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs comprising antibody derivatives (fragment antibodies) having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively developed, and various fragment antibody drugs have been clinically developed (Non-patent Document 3).
  • SpA affinity separation matrix is used for the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • SpA is basically a protein that specifically binds to the Fc region of IgG. Therefore, a fragment antibody that does not contain an Fc region cannot be captured using the SpA affinity separation matrix. Therefore, from the viewpoint of developing a platform for antibody drug purification process, there is a great industrial need for an affinity separation matrix capable of capturing a fragment antibody that does not contain the Fc region of IgG.
  • Non-Patent Document 4 A plurality of peptides that bind to regions other than the Fc region of IgG are already known (Non-Patent Document 4). Among them, a peptide that can bind to a variable region (antigen-binding domain) is most preferable from the viewpoint of the variety of fragment antibody formats that can be bound and the ability to bind to IgM and IgA.
  • protein L is sometimes abbreviated as “PpL”).
  • PpL is a protein containing a plurality of ⁇ chain variable region binding domains (hereinafter, the ⁇ chain variable region may be abbreviated as “VL- ⁇ ”), and the amino acid sequences of individual VL- ⁇ binding domains are different.
  • the number of VL- ⁇ binding domains and individual amino acid sequences differ depending on the type of strain.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of Peptostreptococcus magnus 312 strain is 5, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of Peptostreptococcus magnus strain 3316 Is four (Non-Patent Documents 5 to 7, Patent Documents 1 and 2).
  • these nine VL- ⁇ binding domains there are no domains having the same amino acid sequence.
  • JP 7-506573 A Japanese National Patent Publication No. 7-507682
  • an object of the present invention is to provide an affinity separation matrix having high affinity for the kappa chain variable region of immunoglobulin and useful for purification of immunoglobulin kappa chain variable region-containing protein.
  • the present invention also provides a method for producing an immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing peptide using the affinity separation matrix, a DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector. The purpose is to do.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems.
  • PpL protein L
  • the chromatographic reaction was performed depending on the type of fragment antibody, although the light chain was a ⁇ chain.
  • the profiles were very different.
  • the present inventors have compared and examined a total of nine VL- ⁇ binding domains of PpL derived from Peptostreptococcus magnus 312 and 3316 derived from the characteristics of affinity ligands.
  • PpL derived from 312 A method of using the B5 domain of or a part thereof as a ligand was found.
  • the present invention is shown below.
  • [1] comprising a water-insoluble substrate and a ligand,
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate,
  • An affinity separation matrix wherein the ligand is an antibody ⁇ chain variable region-binding peptide containing the B5 domain of protein L derived from Peptostreptococcus magnus 312 strain or a part thereof.
  • amino acid sequence of the antibody ⁇ chain variable region binding peptide is the following amino acid sequence: (1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 16; (2) an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to 10 amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 16 and the ability to bind to an antibody ⁇ chain variable region; (3) An amino acid sequence having a sequence homology of 85% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 16 and binding ability to the antibody ⁇ chain variable region.
  • amino acid sequence of the antibody ⁇ chain variable region binding peptide the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is glutamic acid at position 17, isoleucine at position 19, tyrosine at position 20, glutamic acid at position 22, The affinity separation matrix according to the above [2], wherein the amino acid sequence is threonine at position 25, valine at position 26, threonine at position 30, serine at position 50, and histidine at position 53.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 is glutamic acid at position 7, isoleucine at position 9, tyrosine at position 10, glutamic acid at position 12, The affinity separation matrix according to the above [2], wherein the amino acid sequence is threonine at position 15, valine at position 16, threonine at position 20, serine at position 40, and histidine at position 43.
  • [6] A method for producing a protein comprising an antibody ⁇ chain variable region, Contacting the affinity separation matrix according to any one of [1] to [5] above with a liquid sample containing a protein having an antibody ⁇ chain variable region; and Separating the protein bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the affinity separation matrix according to the present invention makes it possible to expand the types of fragment antibodies that can be purified, thereby making it easier to develop a platform when constructing an industrial purification process.
  • the B5 domain derived from Peptostreptococcus magnus 312 strain has been studied mainly in the constructs consisting of B1 to B4 domains in Patent Document 1 and Non-Patent Document 4, and therefore a ligand containing the B5 domain and a part thereof. It is a surprising effect that the affinity separation matrix in which is immobilized has the above-mentioned characteristics.
  • FIG. 1 shows LB5t-Wild. It is a figure which shows the preparation methods of the expression plasmid of 1d.
  • FIG. 2 is a graph in which the affinity constant (K A ), association rate constant (k ON ), and dissociation rate constant (k OFF ) of various VL- ⁇ binding domains of PpL to various IgG-Fab are plotted in logarithm form. is there.
  • FIG. 3 shows LB5t-Wild. It is the chromatography chart which eluted with the elution buffer and the strong wash buffer after making polyclonal Fab act on 4d fixed support
  • FIG. 4 is an enlarged view of a portion in which the polyclonal Fab is applied in the chromatography chart of FIG.
  • the affinity separation matrix according to the present invention comprises a water-insoluble substrate and a ligand, wherein the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate, and the ligand is a B5 domain of protein L derived from Peptostreptococcus magnus 312 strain Alternatively, it is an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide containing a part thereof.
  • the affinity separation matrix according to the present invention exhibits affinity for various immunoglobulin ⁇ chain variable regions, and is useful for, for example, purification of fragment antibodies.
  • Immunoglobulin is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • the immunoglobulin has a function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and a function of detoxifying and removing factors having the antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and have a basic structure of a “Y” -shaped four-chain structure (two polypeptide chains each consisting of a light chain and a heavy chain).
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the Fab region and Fc region of the heavy chain are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions (fragments) and one Fc region.
  • variable region The portion (domain) near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region
  • variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region
  • the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • Protein L binds to a variable region in which the light chain is a ⁇ chain (sometimes abbreviated as “VL- ⁇ ” in the present specification) (
  • the Fab region-binding peptide according to the present invention binds to the ⁇ chain variable region (VL- ⁇ region) of immunoglobulin.
  • VL- ⁇ region-containing protein to be bound by the peptide of the present invention is not limited as long as it contains the VL- ⁇ region, and may be IgG containing the Fab region and the Fc region without deficiency, or IgM, IgD, and IgA. Other Igs may be used, or they may be a derivative of an immunoglobulin molecule that has been modified by protein engineering.
  • the immunoglobulin molecule derivative to which the VL- ⁇ region-binding peptide according to the present invention binds is not particularly limited as long as it is a derivative having a VL- ⁇ region.
  • Fab fragments fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G, scFv consisting only of the variable region of immunoglobulin G, and partial domains of human immunoglobulin G are replaced with immunoglobulin G domains of other species.
  • Examples include fused chimeric immunoglobulin G, immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and scFv fragment covalently bound to a drug.
  • peptide includes all molecules having a polypeptide structure, and includes not only so-called proteins, but also fragments and those in which other peptides are linked by peptide bonds.
  • a “domain” is a unit of protein conformation, which is composed of a sequence of tens to hundreds of amino acid residues, and is a unit of a peptide sufficient to express some physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition or deletion is introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • the amino acid of a wild type or a non-mutation type is attached
  • the mutated amino acid is attached
  • G29A a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala.
  • the affinity separation matrix according to the present invention includes a water-insoluble substrate and a ligand.
  • the “water-insoluble carrier” is insoluble in an aqueous solvent used in a peptide solution and can be used for purification of a peptide that specifically binds to a ligand by supporting the ligand.
  • water-insoluble carrier used in the present invention examples include inorganic carriers such as glass beads and silica gel; synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene; crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cross-linked dextran; and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl an acrylate carrier
  • Sepharose CL4B an agarose crosslinking carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size, in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the term “ligand” refers to a substance that selectively collects (binds) a target molecule from a set of molecules based on a specific affinity between molecules represented by binding of an antigen and an antibody.
  • the term refers to a functional group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to an immunoglobulin.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • the present invention includes the use of the peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulins and fragments thereof, particularly the VL- ⁇ region.
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • the ligand according to the present invention is an antibody ⁇ chain variable region-binding peptide containing the B5 domain of protein L derived from Peptostreptococcus magnus strain 312 or a part thereof.
  • Protein L is a protein derived from the cell wall of anaerobic gram-positive cocci belonging to the genus Peptostreptococcus.
  • PpL derived from Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus magnus
  • Peptostreptococcus magnus Peptostreptococcus magnus
  • Peptostreptococcus magnus 312 strain Peptostreptococcus magnus 312 strain
  • two types of PpL derived from Peptostreptococcus magnus 3316 strain are preferable. Derived PpL is particularly preferably used.
  • PpL of the Peptostreptococcus magnus 312 strain may be abbreviated as “PpL312”
  • PpL derived from the Peptostreptococcus magnus 3316 strain may be abbreviated as “PpL3316”.
  • the amino acid sequence of PpL312 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of PpL3316 is shown in SEQ ID NO: 2 (including the signal sequence).
  • PpL contains a plurality of VL- ⁇ binding domains consisting of 70 to 80 residues in a protein.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 is five, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL3316 is four.
  • the VL- ⁇ binding domains of PpL312 are, in order from the N terminus, B1 domain (SEQ ID NO: 3), B2 domain (SEQ ID NO: 4), B3 domain (SEQ ID NO: 5), B4 domain (SEQ ID NO: 6), B5 domain (
  • the VL- ⁇ binding domain of PpL3316 is C1 domain (SEQ ID NO: 8), C2 domain (SEQ ID NO: 9), C3 domain (SEQ ID NO: 10), C4 domain (SEQ ID NO: 11) (Non-Patent Documents 5 to 6).
  • the amino acid sequence of the B5 domain of PpL312 shown herein is preferably the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 7.
  • Non-patent Document 7 Studies have shown that about 20 residues at the N-terminus of the VL- ⁇ binding domain do not have a specific secondary structure, and even when the N-terminus is deleted, It retains its three-dimensional structure and exhibits VL- ⁇ binding.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 for the B1 domain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 for the B2 domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 for the B3 domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 for the B4 domain, and the B5 domain
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 for the C1 domain
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 for the C2 domain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 for the C3 domain
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 for the C4 domain The peptide represented by also functions as a VL- ⁇ binding domain.
  • the amino acid sequence of the B5 domain of PpL312 shown herein is also preferably the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16.
  • amino acid sequence obtained by deleting several residues at the N-terminal and / or C-terminal of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-2 is also included in the scope of the present invention.
  • the number of residues to be deleted is preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, even more preferably 1 or more and 3 or less, even more preferably 1 or 2, More preferably 1.
  • the phrase “having a (specific) amino acid sequence” means that the peptide only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the peptide is maintained. To do.
  • sequences other than the amino acid sequence specified in the peptide include a signal peptide, a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a crosslinked structure such as a disulfide bond.
  • one embodiment includes a fusion peptide characterized in that the VL- ⁇ region-binding peptide obtained by the present invention is fused with another peptide having a different function as one component.
  • other peptides include, but are not limited to, albumin, glutathione S-transferase (GST), signal peptides, histidine tags, and the like.
  • GST glutathione S-transferase
  • signal peptides histidine tags
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer
  • a drug such as an antibiotic
  • a polymer such as PEG (polyethylene glycol)
  • amino acid sequence of the antibody ⁇ chain variable region-binding peptide used in the present invention include the following amino acid sequences (1) to (3).
  • the number of amino acid deletions, etc. is preferably 8 or less, 6 or less or 5 or less, more preferably 4 or less or 3 or less, still more preferably 2 or less, and particularly preferably 1. preferable.
  • amino acid sequence (3) of the present invention “sequence identity” in the “amino acid sequence having 85% or more homology with the amino acid sequence defined in (1) above” is the homology of the amino acid sequence. Is not particularly limited as long as the peptide having an ability to bind to the antibody ⁇ chain variable region.
  • the homology of the amino acid sequence is not particularly limited as long as it is 85% or more, but is preferably 86% or more, 88% or more or 90% or more, more preferably 92% or more, 94% or more or 95% or more, and 96% or more. 98% or more or 99% or more is more preferable, and 99.5% or more or 99.8% or more is particularly preferable.
  • sequence homology refers to the degree of amino acid identity between two or more amino acid sequences. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences. Whether or not two kinds of amino acid sequences have a specific homology can be analyzed by direct comparison of the sequences. Specifically, Clustal (http: // www.clustal.org/omega/) and commercially available sequence analysis software.
  • “having the binding ability to the antibody ⁇ chain variable region” means, for example, affinity for IgG-Fab using the biosensor in Example 2 (2) described later. In a test, it means that an improvement in affinity for IgG-Fab is observed at least as compared with a control.
  • amino acid sequence of the antibody ⁇ chain variable region binding peptide used in the present invention include, for example, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, glutamic acid at position 17, isoleucine at position 19, An amino acid sequence wherein the position is tyrosine, position 22 is glutamic acid, position 25 is threonine, position 26 is valine, position 30 is threonine, position 50 is serine, position 53 is histidine; In the amino acid sequence, position 7 is glutamic acid, position 9 is isoleucine, position 10 is tyrosine, position 12 is glutamic acid, position 15 is threonine, position 16 is valine, position 20 is threonine, position 40 is A preferred example is an amino acid sequence in which serine at position 43 is histidine.
  • the VL- ⁇ region-binding peptide according to the present invention also includes, as one embodiment, two or more, preferably three or more, VL- ⁇ region-binding peptides that are monomers or single domains. Preferably, it may be a multimer of multiple domains linked with 4 or more, more preferably 5 or more.
  • the upper limit of the number of domains to be linked includes 10 or less, preferably 8 or less, more preferably 6 or less.
  • These multimers may be homopolymers such as homodimers and homotrimers that are ligated conjugates of a single VL- ⁇ region-binding peptide, the B1-B4 domain of PpL312 and the C1-C4 of PpL3316. If none of the domains is contained, it may be a heteropolymer such as a heterodimer or heterotrimer which is a conjugate of a plurality of types of VL- ⁇ region binding peptides.
  • Examples of how the monomeric peptides according to the present invention are linked include a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly linking without interposing amino acid residues, but are limited to these methods. Is not to be done.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably 5 residues. Or even more preferably 2 residues or less.
  • These amino acid sequences are preferably those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomer peptide.
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate.
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate directly or via a linker group by a covalent bond.
  • the affinity separation matrix according to the present invention can be produced by immobilizing the ligand on the water-insoluble carrier.
  • the method for immobilizing the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxyl group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, for immobilization, the VL- ⁇ region binding peptide according to the present invention may be chemically modified, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • VL- ⁇ region binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand, and how it is modified for immobilization. -Modifications are included in the scope of the present invention.
  • VL- ⁇ -containing proteins peptides containing proteins containing immunoglobulin ⁇ chain variable regions
  • Purification of these VL- ⁇ -containing proteins can be achieved by a procedure according to an immunoglobulin affinity column chromatography purification method, for example, a purification method using an SpA affinity separation matrix (Non-patent Document 1).
  • the method for producing a VL- ⁇ -containing protein according to the present invention comprises a step of bringing the affinity separation matrix into contact with a liquid sample containing the VL- ⁇ -containing protein, and the above-described binding to the affinity separation matrix. Separating the protein from the affinity separation matrix.
  • the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention, and the VL- ⁇ -containing protein is passed through.
  • Adsorb Next, an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed. At this point, the desired VL- ⁇ -containing protein is adsorbed to the affinity separation matrix of the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix of the present invention is excellent in the ability to adsorb and retain the target VL- ⁇ -containing protein from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired VL- ⁇ -containing protein, thereby achieving high-purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used to elute the peptide.
  • the affinity separation matrix of the present invention is washed by passing an appropriate strong acidic or alkaline alkaline pure regeneration buffer that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. Can be reused. An appropriate denaturing agent or an organic solvent may be added to the regeneration buffer.
  • the present invention also relates to DNA encoding the antibody ⁇ chain variable region-binding peptide.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any one as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide.
  • An example of such a base sequence is the base sequence of SEQ ID NO: 21.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • a genetically modified organism into which the DNA has been introduced, or a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can be obtained.
  • the VL- ⁇ region-binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein having an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the VL- ⁇ region binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR for example, using a double-stranded plasmid encoding the peptide of the present invention as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + strand and the ⁇ strand.
  • the double primer method can be used.
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer peptide (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into the DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • the DNA encoding a multimeric peptide if the base sequences encoding each monomer peptide are the same, homologous recombination may be induced in the host.
  • sequence identity between the base sequences of DNA encoding the peptide is, for example, 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at a low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus (Streptomyces), Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the VL- ⁇ region-binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, and in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (outside the cells).
  • the peptide of the present invention can be produced and accumulated, and the desired peptide can be collected from the culture.
  • the peptide of the present invention comprises the peptide of the present invention in the cultured cells (including the periplasm region) or in the culture solution (outside the cells) by culturing the above-described transformed cells in a medium. It can be produced by producing and accumulating a fusion peptide, collecting the fusion peptide from the culture, cleaving the fusion peptide with an appropriate protease, and collecting the desired peptide.
  • the method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) -benzonesulfonyl. Fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediaminetic acid acid (EDTA) and / or other commercially available protease inhibitors may be used.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, and Hsp104 / ClpB may be used to correctly fold the VL- ⁇ region binding peptide according to the present invention (for example, co-expression) Or coexisting with the peptide of the present invention by a technique such as fusion proteinization).
  • a technique such as fusion proteinization
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but it is not limited thereto. Absent.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract) 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the peptide of the present invention is cultured aerobically under aeration and stirring conditions for several hours to several days. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cell and the supernatant containing the secreted peptide by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement peptide can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the purification of the peptide according to the present invention can be carried out by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target peptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the mutant peptide obtained in the following examples is expressed in the form of “peptide name—introduced mutation”, and the wild-type peptide that does not introduce displacement is expressed in the form of “peptide name—Wild”.
  • the B5 domain of wild-type PpL312 shown in SEQ ID NO: 7 is indicated by “LB5-Wild”.
  • the number linked after the period is added with “d”, and the single domain is written as “1d”.
  • the B5 domain of PpL312 represented by SEQ ID NO: 16 from which the N-terminal region known to have no secondary structure was deleted was mainly used in the experiment. In order to distinguish from the number 7, “LB5t-Wild” is used.
  • Example 1 Preparation of N-terminal region-deleted B5 domain of PpL312 (LB5t-Wild.1d)
  • Expression plasmid preparation LB5t-Wild. Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 16), and a base sequence (SEQ ID NO: 21) encoding the peptide was designed.
  • SEQ ID NO: 16 amino acid sequence of 1d
  • SEQ ID NO: 21 a base sequence
  • FIG. LB5t-Wild The DNA encoding 1d is prepared by linking two types of double-stranded DNAs (f1 and f2) having the same restriction enzyme site, and incorporated into the multicloning site of the expression vector.
  • coding DNA preparation and vector integration were simultaneously performed by three-fragment ligation in which a total of three types of double-stranded DNA, ie, two types of double-stranded DNA and an expression vector, were ligated.
  • the method for preparing two types of double-stranded DNA includes two types of single-stranded oligo DNAs (f1-1 / f1-2 or f2-1 / f2-2) containing complementary regions of about 30 bases each other,
  • the target double-stranded DNA was prepared by extension by overlap PCR.
  • the specific experimental operation is as follows.
  • Single-stranded oligo DNA f1-1 (SEQ ID NO: 22) / f1-2 (SEQ ID NO: 23) was synthesized by outsourcing (Sigma Genosys), and Pyrobest (Takara Bio Inc.) was used as a polymerase to perform an overlap PCR reaction. It was.
  • the double-stranded DNA extracted by subjecting the PCR reaction product to agarose electrophoresis and cutting out the target band was cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII (both were Takara Bio Inc.).
  • single-stranded oligo DNA f2-1 (SEQ ID NO: 24) / f2-2 (SEQ ID NO: 25) was synthesized by outsourcing, and the double-stranded DNA synthesized and extracted through the overlap PCR reaction was subjected to restriction enzyme HindIII. And EcoRI (both were Takara Bio).
  • HindIII HindIII
  • EcoRI both were Takara Bio
  • the above two double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multicloning site of the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Bioscience).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product.
  • plasmid vector pGEX-6P-1 transformation of competent cells (Takara Bio Inc. “E. coli HB101”) was performed according to the protocol attached to this competent cell product.
  • GST glutathione-S-transferase
  • plasmid DNA was amplified and extracted using a plasmid purification kit ("Wizard Plus SV SV Minipreps DNA Purification System” manufactured by Promega) according to the standard protocol attached to the kit.
  • the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was confirmed using a DNA sequencer (“3130xl3Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems). Using gene analysis kit (Applied Biosystems “BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit) and plasmid vector pGEX-6P-1 sequencing DNA primer (GE Healthcare Bioscience) according to the attached protocol A sequencing PCR reaction was performed, and the sequencing product was purified using a plasmid purification kit (“BigDye XTerminator Purification Kit” manufactured by Applied Biosystems) according to the attached protocol and used for base sequence analysis.
  • the cells were collected by centrifugation and resuspended in 5 mL of PBS buffer. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction (cell-free extract) and an insoluble fraction.
  • cell-free extract When the gene of interest is introduced into the multiple cloning site of the pGEX-6P-1 vector, GST is expressed as a fusion peptide attached to the N-terminus.
  • each fraction was analyzed by SDS electrophoresis, all of the various cell-free extracts prepared from the respective transformed cell cultures were found to have peptides that were thought to have been induced by IPTG at a molecular weight of about 25,000 or more. I confirmed the band.
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap FF column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST. Each cell-free extract is added to the GSTRap FF column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer ( The target GST fusion peptide was eluted with 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • the amino acid sequence that can cleave GST with the sequence-specific protease PreScission Protease is between GST and the target peptide.
  • GST cleavage reaction was performed using PreScience Protease according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Bioscience) from the sample used in the assay in such a manner that GST was cleaved. .
  • Each reaction solution was added to a Superdex 75 10/300 GL column equilibrated with a standard buffer, and the target peptide was separated and purified from cleaved GST and PreScission Protease.
  • Example 2 LB5t-Wild. 1d affinity evaluation to IgG-Fab (1) Preparation of IgG-derived Fab fragment (IgG-Fab) Using humanized monoclonal IgG as a raw material, this was fragmented into Fab fragment and Fc fragment by papain, and only Fab fragment was prepared by separation and purification. The total number of Fabs prepared this time is 6, and the names and the humanized monoclonal IgG preparations that are raw materials are summarized in Table 1 for each Fab.
  • IgG-Fab derived from an anti-RSV monoclonal antibody (generic name “palivizumab”) is representatively shown.
  • the humanized monoclonal IgG preparation was dissolved in papain digestion buffer (0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA, 1 mM cysteine, pH 5.5), and papain-immobilized agarose (SIGMA “Papain Agarose from”). was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for about 8 hours while mixing with a rotator.
  • papain digestion buffer 0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA, 1 mM cysteine, pH 5.5
  • SIGMA papain-immobilized agarose
  • IgG-Fab is recovered in the flow-through fraction by affinity chromatography using MabSelect SuRe column (GE Healthcare Bioscience). Separated and purified. The collected IgG-Fab solution was purified by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (standard buffer was used for equilibration and separation) to obtain an IgG-Fab solution. As in Example 1, the peptide purification by chromatography was performed using the AKTAprime plus system.
  • Immobilization of IgG-Fab on sensor chip CM5 is performed by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC). And ethanolamine was used for blocking (sensor chips and immobilization reagents were all manufactured by GE Healthcare Biosciences).
  • the IgG-Fab solution was diluted about 10 times using an immobilization buffer (10 mM CH 3 COOH—CH 3 COONa, pH 4.5), and fixed to the sensor chip according to the protocol attached to the Biacore 3000.
  • a reference cell serving as a negative control was prepared by immobilizing human serum albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) after activation with EDC / NHS for another flow cell on the chip.
  • LB5t-Wild. 1d is a concentration of 0.01, 0.1, 1, 10 ⁇ M using a running buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4).
  • a running buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4
  • binding reaction curve at the time of addition (binding phase, 1 minute) and after completion of the addition (dissociation phase, 1 minute) was observed sequentially. After each observation, washing was performed by adding about 20 mM NaOH.
  • the analysis results are shown in Table 2.
  • FIG. 2 shows a graph summarizing the results of comparison with the IgG-Fab binding strength of other VL- ⁇ binding domains, reflecting the analysis results of Comparative Example 2.
  • LB5t-Wild. 1d showed higher binding force than other domains for some Fabs such as aRSV-Fab and aTNFa-Fab.
  • some Fabs such as aRSV-Fab and aTNFa-Fab.
  • aTNFa-Fab binding cannot be detected for some VL- ⁇ binding domains
  • the strongest binding shows the possibility of expanding the types of Fab that can be supported by the affinity separation matrix in which the ligand based on the B5 domain is immobilized.
  • Comparative Example 1 Preparation of other N-terminal region-deleted VL- ⁇ binding domains of PpL As comparison targets of the B5 domain (LB5t-Wild.1d) of PpL312 deleted from the N-terminus, B1 to B4 and C1 to A C4 domain N-terminal region-deleted construct was prepared. The name of each construct and amino acid sequence number are LB1t-Wild. 1d (SEQ ID NO: 12), LB2t-Wild. 1d (SEQ ID NO: 13), LB3t-Wild. 1d (SEQ ID NO: 14), LB4t-Wild. 1d (SEQ ID NO: 15), LC1t-Wild.
  • Comparative Example 2 Evaluation of affinity of various N-terminal region-deficient VL- ⁇ binding domains to IgG-Fab Regarding the various N-terminal region-deficient VL- ⁇ binding domains prepared in Comparative Example 1, Example 2 (1 Affinity with a total of 6 types of IgG-Fab prepared in (1) was analyzed by the same method as in Example 2 (2). The analysis results are shown in Tables 3 and 4.
  • the B1-B4 domain and the C1-C4 domain derived from Peptostreptococcus magnus may show a high affinity for a specific Fab region, but other Fab regions It did not show affinity for it, or the affinity was very low.
  • the B5 domain derived from Peptostreptococcus magnus according to the present invention showed high affinity by pushing against all Fab regions tested. Therefore, it was revealed that the B5 domain according to the present invention is useful for purification of a peptide containing a Fab region.
  • Example 3 Preparation of the 4-domain type of the B5 domain of PpL312 (LB5t-Wild.4d) Using the amino acid sequence between the VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 shown in SEQ ID NO: 1, shown in SEQ ID NO: 16 The amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (“LB5t-Wild.4d”) in which four amino acid sequences of the B5 domain were linked was designed. LB5t-Wild. Back translation was performed from the amino acid sequence of 4d (SEQ ID NO: 26), and a base sequence (SEQ ID NO: 27) encoding the peptide was designed.
  • An artificially synthesized gene of DNA having a PstI recognition site at the 5 ′ end and an XbaI recognition site at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 28) of the DNA of SEQ ID NO: 27 was totally synthesized by outsourcing to Eurofin Genomics.
  • the expression plasmid after this subcloning was digested with restriction enzymes PstI and XbaI (Takara Bio Inc.), and the obtained DNA fragment was ligated to the Brevibacillus expression vector pNCMO2 (Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzyme, and LB5t -Wild.
  • An expression plasmid was prepared in which DNA encoding the 4d amino acid sequence was inserted into the Brevibacillus expression vector pNCMO2.
  • the ligation reaction was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product, and Escherichia coli JM109 strain (Takara Bio) was used for plasmid preparation.
  • Each expression plasmid DNA base sequence was confirmed using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). BigDye Terminator v.
  • each plasmid DNA was subjected to a sequencing PCR reaction, and the sequencing product was converted into a plasmid purification kit (Applied Biosystems, “BigDye XT Terminator Kit”). )) According to the attached protocol and used for sequence analysis.
  • Brevibacillus choshinensis strain SP3 (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and LB5t-Wild.
  • a gene recombinant that secreted 4d was bred.
  • the cells were subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days in manganese 0.001% and zinc chloride 0.0001%. After the culture, the cells were separated by centrifuging the culture solution at 15,000 rpm and 25 ° C. for 5 minutes.
  • the obtained culture supernatant was subjected to LB5t-Wild. Cation by cation exchange chromatography using UnoSphere S (BioRad). 4d was purified. UnoSphere S was used by filling Tricorn 10/200 (GE Healthcare Bioscience).
  • cation exchange buffer A 50 mM CH 3 COOH—CH 3 COONa, pH 4 0.0
  • cation exchange buffer B 50 mM CH 3 COOH—CH 3 COONa, 1M LB5t-Wild. Eluted in the middle of a salt concentration gradient using NaCl, pH 4.0). 4d was collected.
  • 4d was collected. Sorted LB5t-Wild. 4d was dialyzed again against ultrapure water, and LB5t-Wild. An aqueous solution containing only 4d was used as the final purified sample. In addition, protein purification by chromatography using the above-described column was performed using the AKTA york 25 system (GE Healthcare Bioscience).
  • Example 4 Preparation of 4-domain type immobilization support of Bp domain of PpL312 LB5t-Wild. 4d was immobilized on a commercially available agarose carrier. At this time, LB5t-Wild. A bond between a reactive amino acid residue of 4d and maleimide was used.
  • N- [ ⁇ -Maleimidocaic acid] hydrazide.TFA (EMCH, Thermo Fisher Scientific) solution adjusted with a coupling buffer and adjusted to a concentration of 10 mM is added to a centrifuge tube containing a carrier, and the solution is mixed with 1 Reacted for hours. Thereafter, the carrier is transferred to a glass filter, 10 mL of washing buffer A (0.5 M ethanolamine, 0.5 M sodium chloride, pH 7.2), 10 mL of coupling buffer, and 10 mL of washing buffer A in this order. Was washed and allowed to stand at 25 ° C. for 15 minutes. Further, the carrier was washed with a coupling buffer (10 mL). By the operation so far, maleimide was bound to the carrier.
  • washing buffer A 0.5 M ethanolamine, 0.5 M sodium chloride, pH 7.2
  • LB5t-Wild An operation to immobilize 4d was performed. Before using for immobilization, LB5t-Wild. 4d was reduced under 100 mM DTT conditions, and further, pretreatment was performed such that DTT was removed by a desalting column (GE Healthcare Bioscience, “HiTrap Desalting”) and the buffer was changed to a coupling buffer. . The carrier conjugated with maleimide was transferred to a centrifuge tube, and LB5t-Wild. The 4d solution was added and the support was reacted at 25 ° C. for 2 hours.
  • a desalting column GE Healthcare Bioscience, “HiTrap Desalting”
  • washing buffer B 50 mM L-cysteine, 100 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 0.5 M sodium chloride, pH 7.2
  • 10 mL of coupling buffer 10 mL
  • 10 mL of washing buffer B After washing the carrier in order, it was allowed to stand at 25 ° C. for 15 minutes.
  • the carrier was washed with 10 mL of coupling buffer, 10 mL of ultrapure water, and 10 mL of 20% ethanol, and then suspended and recovered with 20% ethanol carrier, whereby LB5t-Wild. A 4d-immobilized support was obtained.
  • Example 5 LB5t-Wild. Confirmation of Adsorption of 4d Immobilized Carrier on Polyclonal Fab LB5t-Wild. In order to confirm the binding characteristics of the 4d-immobilized carrier, adsorption confirmation of human polyclonal Fab was performed.
  • a human polyclonal Fab a polyclonal Fab derived from a human polyclonal antibody (product name “Gamma globulin”, Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was prepared.
  • human polyclonal antibody contains a non-adsorbed component to Protein A carrier, and therefore, affinity chromatography using a Kaneka Kaneka KanCap ATM column (Kaneka Corp.) prior to papain digestion.
  • affinity chromatography using a Kaneka Kaneka KanCap ATM column (Kaneka Corp.) prior to papain digestion.
  • IgG as an adsorbing component was recovered, and the recovered IgG was subjected to papain digestion.
  • Tricorn 5/50 column (GE Healthcare Bioscience) packed with 1 mL-gel carrier was connected to the chromatographic system AKTA marc 25 and equilibration buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 at a flow rate of 0.25 mL / min).
  • HPO 4 150 mM sodium chloride, pH 7.4
  • 35 mL of a 1 mg / mL human polyclonal Fab solution was flowed at a flow rate of 0.25 mL / min.
  • the difference A indicates that there is a Fab containing a kappa chain variable region that is adsorbed on the carrier of Example 4 but not adsorbed on the carrier of Comparative Example 3. Therefore, it can be seen that although the amount of human polyclonal Fab loaded on each carrier is the same, the elution peak of Example 4 is larger than that of Comparative Example 3, that is, the amount of adsorbed Fab is larger.
  • Example 6 LB5t-Wild. Evaluation of Binding Capacity of Monoclonal Fab of 4d Immobilized Carrier LB5t-Wild.
  • the 4d-immobilized carrier was evaluated for the binding capacity to the monoclonal Fab.
  • the aTNFa-Fab prepared in (1) of Example 2 was adjusted to a concentration of 1 mg / mL with an equilibration buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM sodium chloride, pH 7.4). The adjusted solution was used.
  • Trichrom 5/50 column (GE Healthcare Bioscience) packed with 1 mL-gel carrier was connected to the chromatographic system AKTA van 25, and equilibration buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 ) was flowed at a flow rate of 0.25 mL / min. HPO 4 , 150 mM sodium chloride, pH 7.4) was allowed to equilibrate by flowing 3 CV. The aTNFa-Fab solution was then flowed at a flow rate of 0.25 mL / min and continued until the monitoring absorbance exceeded 55% of 100% Abs 280 .
  • Example 4 was much larger than the support of Comparative Example 3 with respect to 55% DBC for aTNFa-Fab.
  • This result shows that the affinity separation matrix using the antibody ⁇ chain variable region-binding peptide of the present invention as a ligand can be adsorbed and purified with respect to the Fab containing the ⁇ chain variable region that is difficult to adsorb in Comparative Example 3. It can be said that it shows that.

Abstract

　本発明は、抗体のκ鎖可変領域に対する結合能が優れているペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、および当該アフィニティー分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含むペプチドを利用することによって、上記課題を解決する。

Description

免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス
　本発明は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に対する結合能が極めて優れている免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有タンパク質結合性ペプチドをリガンドとして有するアフィニティー分離マトリックス、当該アフィニティー分離マトリックスを用いる免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有ペプチドの製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用されるプロテインＡアフィニティー分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。
　抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティー分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティー分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ－κ結合ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ－κ結合ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合ドメインの数は４個である（非特許文献５～７、特許文献１～２）。そして、それら計９個のＶＬ－κ結合ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。
　ＰｐＬをリガンドとするアフィニティー分離マトリックスもすでに複数市販されている。しかし、ＳｐＡの場合には、特定の１種類の抗体結合ドメインを複数連結した組換えペプチドをリガンドとする研究が進んでいるが（非特許文献１）、ＰｐＬの場合には、個々のＶＬ－κ結合ドメインのアミノ酸配列の違いによる物性・機能の違いに関してはほとんど研究されておらず、改良の余地が残っている。
特表平７－５０６５７３号公報 特表平７－５０７６８２号公報
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Kastern W. ら, J. Biol. Chem., 1992，267巻，12820-12825頁 Murphy J. P. ら，Mol. Microbiol., 1994，12巻，911-920頁 Housden N. G. ら, Biochemical Society Transactions, 2003, 31巻，716-718頁
　上記の状況下、本発明の目的は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に高い親和性を有し、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の精製に有用なアフィニティー分離マトリックスを提供することを目的とする。また、本発明は、当該アフィニティー分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有ペプチドの製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を進めた。その結果、本発明者らは、プロテインＬ（ＰｐＬ）をリガンドとするアフィニティー分離マトリックスを予備的に評価した際に、軽鎖がκ鎖であるにもかかわらず、断片抗体の種類によってクロマトグラフィー・プロファイルが大きく異なることを発見した。具体的には、断片抗体の種類（配列）によって、結合容量が低い、中間洗浄での漏出が見られる、酸溶出時により強い酸が必要といった問題が挙げられる。そこで本発明者らは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来および３３１６由来のＰｐＬのＶＬ－κ結合ドメイン計９種を、アフィニティー・リガンドとしての特性に特化して比較検討した結果、３１２株由来ＰｐＬのＢ５ドメインまたはその一部をリガンドとして利用する方法を見出した。
　本発明を以下に示す。
　［１］　水不溶性基材とリガンドを含み、
　上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、
　上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
　［２］　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列である上記［１］に記載のアフィニティー分離マトリックス：
　（１）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
　（２）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
　（３）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
　［３］　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である上記［２］に記載のアフィニティー分離マトリックス。
　［４］　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である上記［２］に記載のアフィニティー分離マトリックス。
　［５］　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、上記アミノ酸配列の２個以上の繰り返しである上記［２］～［４］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
　［６］　抗体κ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
　上記［１］～［５］のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、抗体κ鎖可変領域を有するタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［７］　上記［１］～［５］のいずれかに記載の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［８］　上記［７］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［９］　上記［８］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明に係るアフィニティー分離マトリックスにより、精製可能な断片抗体の種類を拡張することが可能となる為、産業用精製プロセス構築時のプラットフォーム開発がより容易となる。特に、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来Ｂ５ドメインは、特許文献１や非特許文献４では、主にＢ１～Ｂ４ドメインからなるコンストラクトを中心に研究されていたため、Ｂ５ドメインやその一部を含むリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスが上記のような特性を有していることは、驚くべき効果といえる。
図１は、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図２は、ＰｐＬの各種ＶＬ－κ結合性ドメインの各種ＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和定数（ＫA）、結合速度定数（ｋON）、および解離速度定数（ｋOFF）を対数化してプロットしたグラフである。 図３は、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体または市販Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ担体にポリクローナルＦａｂを作用させた後、溶出緩衝液および強洗浄緩衝液で溶出したクロマトグラフィチャートである。 図４は、図３のクロマトグラフィチャートのうち、ポリクローナルＦａｂを作用させた部分の拡大図である。
　本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、水不溶性基材とリガンドを含み、上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とする。本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、様々な免疫グロブリンκ鎖可変領域に対して親和性を示し、例えば断片抗体の精製に有用である。
　「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域（断片）と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分（ドメイン）は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）に結合する（非特許文献５～７）。
　本発明に係るＦａｂ領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域（ＶＬ－κ領域）に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＶＬ－κ領域含有タンパク質は、ＶＬ－κ領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ－κ領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
　本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
　本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、水不溶性基材とリガンドを含む。本発明において「水不溶性担体」とは、ペプチドの溶液に用いられる水溶媒に対して不溶性を示し、且つリガンドを担持することにより、リガンドへ特異的に結合するペプチドの精製に用いることができるものをいう。
　本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、分子間の特異的な親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
　本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ－κ領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティー分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
　本発明に係るリガンドは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３１２由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドである。
　「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。本発明では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましく、３１２株に由来するＰｐＬを特に好ましく用いる。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と略記することがある。ＰｐＬ３１２のアミノ酸配列を配列番号１に、ＰｐＬ３３１６のアミノ酸配列を配列番号２に示す（シグナル配列も含む）。
　ＰｐＬは、タンパク質中に７０～８０残基からなる複数のＶＬ－κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１ドメイン（配列番号３）、Ｂ２ドメイン（配列番号４）、Ｂ３ドメイン（配列番号５）、Ｂ４ドメイン（配列番号６）、Ｂ５ドメイン（配列番号７）と呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ－κ結合ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１ドメイン（配列番号８）、Ｃ２ドメイン（配列番号９）、Ｃ３ドメイン（配列番号１０）、Ｃ４ドメイン（配列番号１１）と呼ぶ（非特許文献５～６）。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列であることが好ましい。
　また、ＶＬ－κ結合性ドメインのＮ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端を欠失させた場合にも、ＶＬ－κ結合ドメインとして、三次元構造を保持し、ＶＬ－κ結合性を示す（非特許文献７）。例えば、Ｂ１ドメインに関しては配列番号１２のアミノ酸配列、Ｂ２ドメインに関しては配列番号１３のアミノ酸配列、Ｂ３ドメインに関しては配列番号１４のアミノ酸配列、Ｂ４ドメインに関しては配列番号１５のアミノ酸配列、Ｂ５ドメインに関しては配列番号１６のアミノ酸配列、Ｃ１ドメインに関しては配列番号１７のアミノ酸配列、Ｃ２ドメインに関しては配列番号１８のアミノ酸配列、Ｃ３ドメインに関しては配列番号１９のアミノ酸配列、Ｃ４ドメインに関しては配列番号２０のアミノ酸配列で示されるペプチドも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして機能する。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であることも好ましい。
　また、配列番号１～２のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端の数残基を欠失させたアミノ酸配列であっても、本発明の範囲に含まれる。欠失させる残基数は、好ましくは、１以上５以下であり、より好ましくは１以上４以下であり、さらにより好ましくは１以上３以下であり、さらにより好ましくは１または２であり、さらにより好ましくは１である。
　本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。そのペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、シグナルペプチド、ヒスチジンタグ、固定化のためのリンカー配列の他、ジスルフィド結合などの架橋構造などが挙げられる。
　また、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ－κ領域結合性ペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。当該他のペプチドとしては、例えば、アルブミン、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、シグナルペプチド、ヒスチジンタグなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明で用いる上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、以下のアミノ酸配列（１）～（３）を挙げることができる。
　（１）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
　（２）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
　（３）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
　本発明の上記アミノ酸配列（２）において、アミノ酸の欠失などの数としては、８以下、６以下または５以下が好ましく、４以下または３以下がより好ましく、２以下がさらに好ましく、１が特に好ましい。
　本発明の上記アミノ酸配列（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、当該アミノ酸配列の相同性を有するペプチドが抗体κ鎖可変領域への結合能を有する限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の相同性は８５％以上であれば特に限定されないが、８６％以上、８８％以上または９０％以上が好ましく、９２％以上、９４％以上または９５％以上がより好ましく、９６％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上または９９．８％以上が特に好ましい。本発明において「配列の相同性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が特定の相同性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）や市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。
　上記アミノ酸配列（２）および（３）において、「抗体κ鎖可変領域への結合能を有する」とは、例えば、後記の実施例２（２）におけるバイオセンサーを用いたＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和性試験において、少なくともコントロールに比してＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和性の向上が認められることをいう。
　また、本発明で用いる上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列、および、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列を好ましい例として挙げることができる。
　ＰｐＬは、ＶＬ－κ領域結合ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含まれるタンパク質である。従って、本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ－κ領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が挙げられ、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ－κ領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、ＰｐＬ３１２のＢ１～Ｂ４ドメイン、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１～Ｃ４ドメインのいずれも含まなければ、複数種類のＶＬ－κ領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明に係る単量体ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　本発明に係るアフィニティー分離マトリックスでは、上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されている。
　上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性基材に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、エーテル基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－）、ウレア基（－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
　本発明に係るアフィニティー分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間にスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ－κ領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ－κ含有タンパク質）を含むペプチドをアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ－κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティー分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
　具体的には、本発明に係るＶＬ－κ含有タンパク質の製造方法は、上記アフィニティー分離マトリックスと、ＶＬ－κ含有タンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする。
　より詳しくは、ＶＬ－κ含有タンパク質を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、ＶＬ－κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ－κ含有タンパク質はカラム内の本発明のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明のアフィニティー分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ－κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ－κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な再生用緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。
　本発明は、上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。かかる塩基配列としては、例えば、配列番号２１の塩基配列を挙げることができる。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
　即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
　また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が例えば９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
　本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係るＶＬ－κ領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
　また、培養温度は、例えば１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティークロマトグラフィー、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－１２６６３号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－１２６６３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名－導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名－Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号７で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５－Ｗｉｌｄ」で示す。また、単ドメインを複数連結したタンパク質については、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記し、単ドメインは「１ｄ」と表記する。さらに、本実施例においては、二次構造を取らないことが分かっているＮ末端領域を欠失させた配列番号１６で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用しており、これを配列番号７と区別するため、「ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ」と表記する。
　実施例１：　ＰｐＬ３１２のＮ末端領域欠失型Ｂ５ドメイン（ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
　（１）　発現プラスミド調製
　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２１）を設計した。次に、発現プラスミドの作製方法を図１に示す。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込む。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１／ｆ１－２、または、ｆ２－１／ｆ２－２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１－１（配列番号２２）／ｆ１－２（配列番号２３）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２－１（配列番号２４）／ｆ２－２（配列番号２５）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キット（Applied Biosystems社製「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
　（２）　ペプチドの発現・精製
　上記（１）で得られた、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに３７℃にて１８時間培養した。
　培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
　ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的ペプチドの間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。
　なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィーによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡ　ｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のペプチドのＮ末端側には、ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが付加される。
　実施例２：　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのＩｇＧ－Ｆａｂへの親和性評価
　（１）　ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメント（ＩｇＧ－Ｆａｂ）の調製
　ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。今回調製したＦａｂは計６種類であり、各々のＦａｂについて、名称、原料となるヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤などを表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ここでは、抗ＲＳＶモノクローナル抗体（一般名「パリビズマブ」）由来のＩｇＧ－Ｆａｂの調製方法を代表的に示す。なお、明細書中において、他のＩｇＧ－Ｆａｂを評価に用いている場合においても、基本的には同様の方法で調製している。具体的には、ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、パパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社「Ｐａｐａｉｎ　Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｐａｙａ　ｌａｔｅｘ」）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、素通り画分でＩｇＧ－Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ－Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにて精製し、ＩｇＧ－Ｆａｂ溶液を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィーによるペプチド精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
　（２）　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和性の解析
　表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの計６種ＩｇＧ－Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ－Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ－ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、および、Ｎ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ－Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄは、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．００５％　Ｐ－２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１、１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相、１分）、および、添加終了後（解離相、１分）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ　ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ヒトＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。解析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　比較例２の解析結果も反映し、他のＶＬ－κ結合ドメインのＩｇＧ－Ｆａｂ結合力と比較する形でまとめたグラフを図２に示した。
　表２と図２、および後記の表３と表４に示す結果のとおり、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄは、ａＲＳＶ－Ｆａｂ、ａＴＮＦａ－Ｆａｂなど、いくつかのＦａｂに対して、他のドメインよりも高い結合力を示した。このような事実は今まで知られておらず、驚くべき結果であるといえる。特に、ａＴＮＦａ－ＦａｂやａＥＧＦＲ－Ｆａｂなど、全体的に結合力が弱い（一部のＶＬ－κ結合ドメインに関しては結合が検出できない）傾向にあるＦａｂ類に対して、試験されたペプチドの中で最も強い結合を示したことは、Ｂ５ドメインをベースとしたリガンドを固定化したアフィニティー分離マトリックスが対応可能なＦａｂの種類を拡大できる可能性を示す結果といえる。
　比較例１：　ＰｐＬの他のＮ末端領域欠失型ＶＬ－κ結合ドメインの調製
　Ｎ末端を欠失させたＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン（ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）の比較対象として、Ｂ１～Ｂ４およびＣ１～Ｃ４ドメインのＮ末端領域欠失型のコンストラクトを調製した。各々のコンストラクト名とアミノ酸配列番号は、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）、ＬＢ２ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１３）、ＬＢ３ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１４）、ＬＢ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１５）、ＬＣ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１７）、ＬＣ２ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１８）、ＬＣ３ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１９）、および、ＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２０）となる。各々に関して、実施例１と同様の手法にて、発現プラスミド・形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、各種タンパク質溶液を調製した。なお、制限酵素に関して、ＨｉｎｄＩＩＩ以外の制限酵素を用いた場合もあったが、詳細は省略する。
　比較例２：　各種Ｎ末端領域欠失型ＶＬ－κ結合ドメインのＩｇＧ－Ｆａｂへの親和性評価
　比較例１で調製した各種Ｎ末端領域欠失型ＶＬ－κ結合ドメインに関し、実施例２（１）で調製した計６種ＩｇＧ－Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、表３と表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表３，４に示す結果のとおり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のＢ１～Ｂ４ドメインとＣ１～Ｃ４ドメインは、特定のＦａｂ領域に対して高い親和性を示すことがあるものの、他のＦａｂ領域に対して親和性を示さないか或いは親和性が非常に低かった。それに対して、表２に示す結果のとおり、本発明に係るペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のＢ５ドメインは、試験したすべてのＦａｂ領域に対して押し並べて高い親和性を示した。よって、本発明に係るＢ５ドメインは、Ｆａｂ領域を含むペプチドの精製に有用であることが明らかとなった。
　実施例３：　ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインの４ドメイン型（ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ）の調製
　配列番号１に示されるＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号１６で示されるＢ５ドメインのアミノ酸配列を４個連結した配列番号２６のアミノ酸配列（「ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ」）を設計した。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ（配列番号２６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２７）を設計した。配列番号２７のＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２８）の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を用いた。各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，「ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」）を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。
　ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン　３．０％，酵母エキス　０．５％，グルコース　３％，硫酸マグネシウム　０．０１％，硫酸鉄　０．００１％，塩化マンガン　０．００１％，塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃で５分間遠心分離することにより菌体を分離した。
　得られた培養上清から、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ　Ｓ（バイオラッド社）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを精製した。ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ　ＳはＴｒｉｃｏｒｎ　１０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに酢酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＵｎｏＳｐｈｅｒｅ　Ｓカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換緩衝液Ａと陽イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを分取した。次に、Ｎｕｖｉａ　Ｑカラム（バイオラッド社）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを精製した。Ｎｕｖｉａ　ＱはＴｒｉｃｏｒｎ　１０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、分取したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａにて平衡化したＮｕｖｉａ　Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換緩衝液Ａと陰イオン交換緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１．０Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを分取した。分取したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを再び超純水に透析し、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄのみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、上記のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡａｖａｎｔ　２５システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用して実施した。
　実施例４：　ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインの４ドメイン型固定化担体の作製
　実施例３で調製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを、市販のアガロース担体へ固定化した。この際、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの反応性アミノ酸残基とマレイミドとの結合を利用した。
　具体的には、まず、市販のＮＨＳ活性化担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＮＨＳ　Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ」）１．５ｍＬ－ｇｅｌをガラスフィルターに移し、保存溶液であるイソプロパノールを吸引除去した後、氷冷した１ｍＭ塩酸（５ｍＬ）で洗浄した。続いて、カップリング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）５ｍＬで担体を洗浄した後、カップリング緩衝液に懸濁させながら担体を回収し遠沈管に移した。カップリング緩衝液で溶解し、１０ｍＭの濃度に調整したＮ－［ε－Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ　ａｃｉｄ］ｈｙｄｒａｚｉｄｅ・ＴＦＡ（ＥＭＣＨ，サーモフィッシャーサイエンフィティック社）溶液を担体の入った遠沈管に加え、２５℃で１時間反応させた。その後、担体をガラスフィルターに移し、洗浄緩衝液Ａ（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ、洗浄緩衝液Ａを１０ｍＬの順で担体を洗浄し、２５℃で１５分間静置した。さらにカップリング緩衝液（１０ｍＬ）で担体を洗浄した。ここまでの操作で担体にマレイミドを結合させた。
　次に、マレイミドを結合させた担体にＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを固定化する操作を行った。固定化に使用する前に、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを、１００ｍＭ　ＤＴＴ条件下で還元し、さらに脱塩カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社，「ＨｉＴｒａｐ　Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ」）によるＤＴＴの除去と、カップリング緩衝液へ緩衝液交換をするという前処理を行った。マレイミドを結合させた担体を遠沈管に移し、さらにＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ溶液を加えて担体を２５℃で２時間反応させた。その後、反応させた担体をガラスフィルターに移し、７ｍＬのカップリング緩衝液で洗浄することで未反応ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄを回収した。その後、洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｌ－システイン，１００ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，０．５Ｍ塩化ナトリウム，ｐＨ７．２）を１０ｍＬ、カップリング緩衝液を１０ｍＬ、洗浄緩衝液Ｂを１０ｍＬの順で担体を洗浄した後、２５℃で１５分間静置した。さらに、カップリング緩衝液１０ｍＬ、超純水１０ｍＬ、２０％エタノール１０ｍＬで担体を洗浄した後、２０％エタノール担体を懸濁、回収することにより、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体を得た。
　回収した未反応ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの量を算出した。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの仕込み量と定量した未反応ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの量の差からＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄの固定化量を算出し、さらに担体の体積からリガンド密度を算出した。表５に、作製した担体である試作１のリガンド密度と、比較例３として使用する市販Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ」）のリガンド密度をまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　実施例５：　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体のポリクローナルＦａｂに対する吸着確認
　実施例４で作製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体の結合特性を確認するために、ヒトポリクローナルＦａｂの吸着確認を行った。ヒトポリクローナルＦａｂとして、ヒトポリクローナル抗体（製品名「ガンマグロブリン」，日本製薬社）由来のポリクローナルＦａｂを調製した。実施例２の（１）に準じて調製したが、ヒトポリクローナル抗体はＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ担体への非吸着成分を含むため、パパイン消化の前に、ＫＡＮＥＫＡ　ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＡＴＭカラム（カネカ社）を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより、吸着成分のＩｇＧを回収し、回収したＩｇＧについてパパイン消化を行った。
　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体の結合特性の確認方法の具体的な操作を以下に示す。１ｍＬ－ｇｅｌの担体を充填したＴｒｉｃｏｒｎ　５／５０　ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）をクロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ　２５に接続し、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで、１ｍｇ／ｍＬのヒトポリクローナルＦａｂ溶液を３５ｍＬ流した。その後、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ３．０）を１０ＣＶ流し、ヒトポリクローナルＦａｂを溶出した。さらに流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで３ＣＶの平衡化緩衝液を流した後、強洗浄緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を５ＣＶ流し、最後に平衡化緩衝液を５ＣＶ流した。比較例３として市販Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ」）も同様の操作を行った。得られたクロマトグラフィチャートを図３に、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷工程の拡大クロマトグラフィチャートを図４に示す。
　図３の溶出画分（２）を見ると、比較例３と比べて実施例４の担体を用いた場合は明らかにピーク面積が大きい。また、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷工程（１）を拡大した図４の差異Ａで示すように、比較例３の担体はヒトポリクローナルＦａｂ負荷時に漏出が継続的に上昇する傾向がある一方で、実施例４の担体では漏出が一定であることが分かる。ヒトポリクローナルＦａｂにはλ鎖可変領域を含むＦａｂが存在するため、λ鎖可変領域を含むＦａｂは比較例３および実施例４の担体には吸着されず、ヒトポリクローナルＦａｂ負荷時には漏出することが分かる。さらに差異Ａは、実施例４の担体には吸着されるが比較例３の担体には吸着されないκ鎖可変領域を含むＦａｂが存在することを示している。そのため、各担体に負荷したヒトポリクローナルＦａｂの量が同じであるにも関わらず、比較例３よりも、実施例４の溶出ピークが大きい、すなわち吸着したＦａｂの量が多いということが分かる。
　これらの結果は、本発明の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスは、精製可能な断片抗体の種類の拡張が可能であることを示す結果であるといえる。
　実施例６：　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体のモノクローナルＦａｂに対する結合容量評価
　実施例４で作製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．４ｄ固定化担体について、モノクローナルＦａｂに対する結合容量の評価を行った。モノクローナルＦａｂとしては、実施例２の（１）で調製したａＴＮＦａ－Ｆａｂを平衡化緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）で１ｍｇ/ｍＬの濃度に調整した溶液を用いた。
　クロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ　２５に１ｍＬ－ｇｅｌの担体を充填したＴｒｉｃｏｒｎ　５／５０　ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を接続し、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎで平衡化緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，ｐＨ７．４）を３ＣＶ流して平衡化した。次に、流速０．２５ｍＬ/ｍｉｎでａＴＮＦａ－Ｆａｂ溶液を流し、モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ280の５５％を超えるまで続けた。その後、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎで平衡化緩衝液を１０ＣＶ流し、続いて、溶出緩衝液（５０ｍＭクエン酸，ｐＨ２．５）を３ＣＶ流し、ａＴＮＦａ－Ｆａｂを溶出した。モニタリング吸光度が１００％Ａｂｓ280の５５％を超えたときまでに流したａＴＮＦａ－Ｆａｂの総量をａＴＮＦａ－Ｆａｂに対する５５％ＤＢＣとした。比較例として市販Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ担体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社「ＨｉＴｒａｐ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌ」）にも同様の操作を行った。測定結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６に示す結果のとおり、ａＴＮＦａ－Ｆａｂに対する５５％ＤＢＣについて、実施例４の担体は比較例３の担体よりも非常に大きいという結果が得られた。本結果は、比較例３では吸着が困難なκ鎖可変領域を含むＦａｂに対して、本発明の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをリガンドとしたアフィニティー分離マトリックスは、吸着および精製が可能であることを示すものであるといえる。

Claims (9)

  1. 　水不溶性基材とリガンドを含み、
    　上記リガンドが上記水不溶性基材に固定化されており、
    　上記リガンドが、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株由来プロテインＬのＢ５ドメインまたはその一部を含む抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドであることを特徴とするアフィニティー分離マトリックス。
  2. 　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、以下のアミノ酸配列である請求項１に記載のアフィニティー分離マトリックス：
    　（１）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列；
    　（２）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列において１以上１０以下のアミノ酸の欠失、置換および／または付加を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列；
    　（３）　配列番号７または配列番号１６のアミノ酸配列に対して８５％以上の配列相同性を有し、且つ、抗体κ鎖可変領域への結合能を有するアミノ酸配列。
  3. 　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号７のアミノ酸配列において、第１７位がグルタミン酸、第１９位がイソロイシン、第２０位がチロシン、第２２位がグルタミン酸、第２５位がトレオニン、第２６位がバリン、第３０位がトレオニン、第５０位がセリン、第５３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である請求項２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  4. 　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１６のアミノ酸配列において、第７位がグルタミン酸、第９位がイソロイシン、第１０位がチロシン、第１２位がグルタミン酸、第１５位がトレオニン、第１６位がバリン、第２０位がトレオニン、第４０位がセリン、第４３位がヒスチジンであるアミノ酸配列である請求項２に記載のアフィニティー分離マトリックス。
  5. 　上記抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドのアミノ酸配列が、上記アミノ酸配列の２個以上の繰り返しである請求項２～４のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックス。
  6. 　抗体κ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    　請求項１～５のいずれかに記載のアフィニティー分離マトリックスと、抗体κ鎖可変領域を有するタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　上記アフィニティー分離マトリックスに結合した上記タンパク質を、上記アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  7. 　請求項１～５のいずれかに記載の抗体κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  8. 　請求項７に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  9. 　請求項８に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017191747A1 (ja) * 2016-05-06 2017-11-09 株式会社カネカ κ鎖可変領域を含むタンパク質の製造方法
WO2019187602A1 (ja) * 2018-03-29 2019-10-03 株式会社カネカ 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
US10808013B2 (en) 2015-01-26 2020-10-20 Kaneka Corporation Mutant immunoglobulin K chain variable region-binding peptide
US10844112B2 (en) 2016-05-09 2020-11-24 Kaneka Corporation Method for purifying antibody or antibody fragment containing κ-chain variable region
US10858392B2 (en) 2015-01-26 2020-12-08 Kaneka Corporation Affinity separation matrix for purifying protein containing immunoglobulin K chain variable region

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108291220B (zh) * 2015-10-22 2022-10-28 普罗泰纳瓦株式会社 免疫球蛋白结合多肽

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07506573A (ja) * 1992-04-28 1995-07-20 ハイテク　レセプター　アーベー プロテインｌおよびそのハイブリッドプロテイン類
CN1634990A (zh) * 2004-10-14 2005-07-06 上海润龙生物科技有限公司 一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法
WO2005113584A1 (en) * 2004-04-29 2005-12-01 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting
WO2015190457A1 (ja) * 2014-06-09 2015-12-17 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌を用いた組換え蛋白質の製造方法
WO2015190458A1 (ja) * 2014-06-09 2015-12-17 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
AU672794B2 (en) 1992-05-07 1996-10-17 Affitech As Immunoglobulin binding proteins derived from L protein and their uses
SE9503925D0 (sv) 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
EP1114161B1 (en) 1998-09-14 2004-03-03 Affitech As Immunoglobulin binding protein
GB9823071D0 (en) 1998-10-21 1998-12-16 Affibody Technology Ab A method
AU2003210802B2 (en) 2002-02-05 2009-09-10 Genentech Inc. Protein purification
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US7709209B2 (en) 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
ES2558303T3 (es) 2002-09-11 2016-02-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de purificación de proteínas
AU2003903317A0 (en) * 2003-06-27 2003-07-10 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd Method of isolating a protein
GB0323238D0 (en) 2003-10-03 2003-11-05 Domantis Ltd Synthetic LG binding domains of protein L
JP5787461B2 (ja) 2004-12-14 2015-09-30 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ 免疫グロブリンの精製方法
US8728828B2 (en) 2004-12-22 2014-05-20 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of immunoglobulins
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
AU2006250120A1 (en) 2005-05-24 2006-11-30 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Regeneration of a chromatography matrix
JP2009503115A (ja) * 2005-08-03 2009-01-29 アールキュー バイオサイエンス インク ＩｇＡ及びＩｇＭを媒介する腎臓症を診断するための方法及び組成物
JP4179517B2 (ja) 2006-02-21 2008-11-12 プロテノバ株式会社 イムノグロブリン親和性リガンド
EP1992692B1 (en) 2006-02-21 2013-01-09 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin affinity ligand
CN102171237A (zh) 2008-08-14 2011-08-31 默沙东公司 使用蛋白a亲和色谱法纯化抗体的方法
US10273270B2 (en) 2010-03-24 2019-04-30 Kaneka Corporation Protein capable of binding specifically to immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
EP2691411B1 (en) 2011-03-29 2020-02-26 GlaxoSmithKline LLC Buffer system for protein purification
AU2014229280B2 (en) 2013-03-15 2017-01-05 Glaxosmithkline Intellectual Property (No.2) Limited Methods for purifying antibodies
EP3048109A4 (en) 2013-09-17 2017-04-19 Kaneka Corporation Novel antibody purification method and antibody obtained therefrom, and novel antibody purification method using cation exchanger and antibody obtained therefrom
WO2015077605A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 Seattle Genetics, Inc. Preparing antibodies from cho cell cultures for conjugation
US20170334947A1 (en) 2014-08-28 2017-11-23 Kaneka Corporation Affinity separation matrix for fab region-containing peptide
JP6369807B2 (ja) 2014-10-21 2018-08-08 株式会社プロテイン・エクスプレス プロテインｌ変異体
JP6843438B2 (ja) 2014-12-17 2021-03-17 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 改変κ軽鎖結合ポリペプチド
WO2016121701A1 (ja) 2015-01-26 2016-08-04 株式会社カネカ 免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質精製用アフィニティー分離マトリックス
GB201503578D0 (en) 2015-03-03 2015-04-15 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Sanitization method for affinity chromatography matrices

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07506573A (ja) * 1992-04-28 1995-07-20 ハイテク　レセプター　アーベー プロテインｌおよびそのハイブリッドプロテイン類
WO2005113584A1 (en) * 2004-04-29 2005-12-01 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting
CN1634990A (zh) * 2004-10-14 2005-07-06 上海润龙生物科技有限公司 一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法
WO2015190457A1 (ja) * 2014-06-09 2015-12-17 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌を用いた組換え蛋白質の製造方法
WO2015190458A1 (ja) * 2014-06-09 2015-12-17 株式会社カネカ 組換えブレビバチルス属細菌による組換え蛋白質の製造方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Capto(TM) L", August 2014 (2014-08-01), Retrieved from the Internet <URL:https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1346418936586/litdoc29010008_20141004004020.pdf> *
BOTTOMLEY S. P. ET AL.: "Cloning, expression and purification of Ppl-1, a kappa-chain binding protein, based upon protein L from Peptostreptococcus magnus.", BIOSEPARATION, vol. 5, no. 6, 1995, pages 359 - 367 *
GRAILLE M. ET AL.: "Complex between Peptostreptococcus magnus Protein L and a Human Antibody Reveals Structural Convergence in the Interaction Modes of Fab Binding Proteins", STRUCTURE, vol. 9, no. 8, 2001, pages 679 - 687 *
KIHLBERG B. M. ET AL.: "Protein LG: A Hybrid Molecule with Unique Immunoglobulin Binding Properties", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 267, no. 35, 1992, pages 25583 - 25588 *
SVENSSON H. G. ET AL.: "Protein LA, a novel hybrid protein with unique single-chain Fv antibody- and Fab-binding properties", EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 258, no. 2, 1998, pages 890 - 896 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10808013B2 (en) 2015-01-26 2020-10-20 Kaneka Corporation Mutant immunoglobulin K chain variable region-binding peptide
US10858392B2 (en) 2015-01-26 2020-12-08 Kaneka Corporation Affinity separation matrix for purifying protein containing immunoglobulin K chain variable region
WO2017191747A1 (ja) * 2016-05-06 2017-11-09 株式会社カネカ κ鎖可変領域を含むタンパク質の製造方法
US10844112B2 (en) 2016-05-09 2020-11-24 Kaneka Corporation Method for purifying antibody or antibody fragment containing κ-chain variable region
WO2019187602A1 (ja) * 2018-03-29 2019-10-03 株式会社カネカ 改変型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド

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