JP5882058B2 - 組合せ抗体ライブラリー及びその使用 - Google Patents
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Description
2 008年11月7日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/198、764号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」、並びに2009年3月25日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/211、204号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」に対し、優先権の利益を主張する。上記出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
本出願はまた、米国仮出願番号第61/198、764号及び米国仮出願番号第61/211、204号に対する優先権を主張する、本明細書と同日に出願された国際PCT出願番号(代理人整理番号3800016−00087/703PC)、発明の名称「抗DLL4抗体及びその使用」に関する。
本出願は、本明細書と同日に出願された米国仮出願番号(代理人整理番号3800016−00004/p702)、発明の名称「親和性成熟に基づく抗体の最適化の方法」にも関する。
上記に関する各出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
電子バージョンの配列表は、本明細書で提出されており、その内容は、参照によってそのまま援用される。
電子フィルのサイズは2.92メガバイトで、タイトルは701seq.PC1.txtである。
VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。例えば、Vλヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドは欠失される。別の例において、VλとJλの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドが、Vλヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトJλは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6又はIGLJ7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:442−451のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Jλは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VL鎖をコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Jλのリーディングフレームを維持するため選択され得る。例えば、Jλの5’末端からのヌクレオチドは欠失される。
ペプチド模倣物は、その受容体のEpo活性を模倣する模倣物である。ペプチド模倣物は、更に、アミノ酸などのカルボキシ及び/又はN−末端においてフランキング配列を含むことが可能である。例えば、フランキング配列は、グリシン又はプロリンを含み得る。例示的なペプチド模倣物は、配列識別番号:891及び987−1014のいずれかで示されるどれかである。
ヌクレオチドは、特に、それがグアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。DHセグメントは、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6又はIGHD7及び遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:239−272のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、DH遺伝子セグメントは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VH鎖をコードする核酸のV−D結合部及び/又はD−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有することができる。ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性を最大化するため選択される。例えば、DHの5′末端からヌクレオチドが欠失され、及び/又はDHの3′末端からヌクレオチドが欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、DHとJHの間でヌクレオチドを追加するため、DH配列の3′末端で挿入される。追加されたヌクレオチドは、特にグアニン(G)といったいずれかのヌクレオチドであり得る。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5又はIGHJ6並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号273−285のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーの例において、JH遺伝子セグメントは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VH鎖をコードする核酸配列のD−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、JHのリーディングフレームを維持するため選択される。1つの例を挙げると、JHの5′末端からヌクレオチドが欠失される。他の例を挙げると、JHの3′末端からヌクレオチドが欠失される。
別の例において、ヌクレオチドは、VκとJκの間でヌクレオチドを追加するため、Vκヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトJκは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4又はIGKJ5並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:356−364のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Jκ遺伝子セグメントは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VL鎖をコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Jκのリーディングフレームを維持するため選択される。いくつかの例を挙げると、Jκの5′末端からヌクレオチドが欠失される。ヒトVλは、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10又はIGLV11並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:365−441のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Vλは、
D4−11、IGHD4−17、IGHD4−23、IGHD4−4、IGHD5−12、IGHD5−18、IGHD5−24、IGHD5−5、IGHD6−13、IGHD6−19、IGHD6−25、IGHD6−6及びIGHD7−27;から選択され、並びにDH遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される。
本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるJλ生殖細胞系セグメントにおいては、Jλが、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸分子のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Jλのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Jλの5’末端からヌクレオチドは欠失される。
別の例を挙げると、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各VH、DH及び/又はDH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVH、DH及び/又はDH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1−18、IGHV1−2、IGHV1−24、IGHV1−3、IGHV1−45、IGHV1−46、IGHV1−58、IGHV1−69、IGHV1−8、IGHV2−26、IGHV2−5、IGHV2−70、IGHV3−11、IGHV3−13、IGHV3−15、IGHV3−16、IGHV3−20、IGHV3−21、IGHV3−23、IGHV3−30、IGHV3−33、IGHV3−35、IGHV3−38、IGHV3−43、IGHV3−48、IGHV3−49、IGHV3−53、IGHV3−64、IGHV3−66、IGHV3−7、IGHV3−72、IGHV3−73、IGHV3−74、IGHV3−9、IGHV4−28、IGHV4−31、IGHV4−34、IGHV4−39、IGHV4−4、IGHV4−59、IGHV4−61、IGHV5−51、IGHV6−1及びIGHV7−81遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、DH生殖細胞系セグメントは、IGHD1−1、IGHD1−14、IGHD1−20、IGHD1−26、IGHD1−7、IGHD2−15、IGHD2−2、IGHD2−21、IGHD2−8、IGHD3−10、IGHD3−16、IGHD3−22、IGHD3−3、IGHD3−9、IGHD4−11、IGHD4−17、IGHD4−23、IGHD4−4、IGHD5−12、IGHD5−18、IGHD5−24、IGHD5−5、IGHD6−13、IGHD6−19、IGHD6−25、IGHD6−6及びIGHD7−27遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、並びに/或いはJH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得る。
産生された複数の抗体又はその部分は、VH又はVL或いはその十分な部分を含有し、抗原結合部位を形成して、抗体又はその部分は、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分のものと異なる。
一般的に、N1、N2、N3及びN4は、それぞれ、全て又は一部のVλ、Jλ、Vκ、Jκ生殖細胞系セグメントであり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階b)を数回繰返す方法において、Vλ、Jλ、Vκ、Jκの組合わせの可能な全べての組合わせは、VL鎖をコードするN1xN2又はN3xN4の異なる核酸配列を生成するため構成される。
Jλ遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。
標的タンパク質に結合し、及び/又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を更なる「HIT」として表す。いくつかの例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、それぞれのアドレス内の精製された各抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、アドレス可能なライブラリーである。こうした例において、接触は、アドレス可能なアレイで行われ、「HIT」の同定は、そのアドレスによってわかる。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートといった空間アレイで行われる。
本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVH鎖、並びにVκ及びJκ又はVλ及びJλ生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVL鎖を含む抗DLL4抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1及びIGHV5又はIGHV6或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6及びIGHD5又はIGHD3或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、並びにJH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vκ生殖細胞系セグメントはIGKV3で、並びにJκはIGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子で、Vλ生殖細胞系セグメントはIGLV8又はIGLV5で、並びにJλ生殖細胞系セグメントは、IGLJ1又はIGLJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗DLL4抗体は、DLL4を結合し、及び/又はDLL4の活性を調節する。
Jκは、IGKJ1である。本明細書で提供される抗EpoR抗体は、EpoRを結合し、及び/又はEpoRの活性を調節する。
JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ2或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGKV3又はIGKV4である。Jκは、IGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、ErbB2を結合し、及び/又はErbB2の活性を調節する。
コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体で実行される方法は、(h)段階(e)の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の5′及び3′末端でヌクレオチドを追加することと、並びに(i)制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチドの置換によって組み換えられた核酸配列を修飾することとを更に含むことができる。前記方法は、細菌発現に対するコドン使用を最適化するため、組み換えられた核酸配列を更に修飾することができる。いくつかの例において、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体により実行される方法は、段階(f)の前に、配列の類似性及び相違性に基づいて、組み換えられた核酸配列のライブラリーから組み換えられた核酸配列を選択すること及び段階(f)のアドレス可能な構成における位置へ選択された配列のみを割り当てることを含み得る。
B.概観
2 結果としてのライブラリー
3 ライブラリの応用
C.抗体
1 抗体ポリペプチド
2 抗体の構造と機能ドメイン
3 抗体配列と特異
D コンビナトリアル抗体ライブラリの生成メンバーのメソッド
1 機能組換え生殖細胞の可変領域の製造方法
A 可変遺伝子セグメント
i.生殖細胞セグメント
II 変更された生殖細胞の種類別セグメント
B 選択生殖細胞の種類別セグメントまたは変更されたセグメント及び
c.シーケンス編集
d.再結合された核酸分子のさらなるシーケンス変更
i.コドン使用
II 制限酵素のサイトの追加または削除
III リンカー
IV タグまたは検出可能な部分
V 対変異の多様性
VI 監督ペプチド
e 大腸菌生成可変重鎖および軽鎖配列および核酸分子
i.貯蓄と収集
II 収集の決定配列の多様性
核酸アミノ酸配列
III 核酸分子の生成
a)合成
b)組換え技術
f.表現およびその抗体または一部またはライブラリ内のメンバーの結果によるメンバーフラグメント
2 オートメーション
a.使用者作成データベース
b.シーケンス編集
c.タンパク質の発現および精製の自動化
E ライブラリ
1 VHの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
2 VLの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
3 ペア核酸ライブラリまたはベクトルライブラリ等及び
4 抗体ライブラリ
5 アドレス指定可能なフォーマット
A マルチウェルプレートプレート
B 固体サポート
6 その他の表示方法
A セル表示
B ファージディスプレイ
c.mRNAの表示とリボソームディスプレイ
d.DNAの表示
F 抗体の生産.メソッド
1 ベクトル
2 細胞発現システム
A 原核生物の発現
B 酵母
c 昆虫
d 哺乳動物細胞
e 植物
3 精製
G アプリケーションとライブラリの使用
1 結合分析
2 機能活動
a 分化
b 遺伝子表現の交代
c 細胞毒性活性
3 ターゲット
膜結合タンパク質、受容体とリガンドより
i ノッチとノッチのリガンド
a)ノッチタンパク質
b)DLL4
II ErbBファミリー
上皮成長因子受容体(EGFR)
b)ヒト上皮成長因子受容体2(HER2/neu)
III IGF−R1が(インスリン様成長因子1受容体)
IV c−Met
V CD20−Bリンバ球抗原
VII エリスロポエチン受容体(Epo−R)
VIII カドヘリン
a)P−カドヘリン(P−cad/CDH3)
IX CD44
4 反復スクリーニング
5 指向進化
a ランダム突然変異誘発
i 飽和突然変異誘発
II エラーしやすいPCR
III 細胞株
IV DNAシャフリング/抗体鎖シャッフリング
V CDRワーキング
VI フレームワークの安定化
6 エピトープのマッピング
7 同定された体内での試験
8 製造/キットの記事
9 製剤/主管庁および抗体およびポリペプチドの使用
H 例
定義されている場合を除き、すべての技術および科学用語は、発明に属す芸術のスキルによって理解されているのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開されたアプリケーションや出版物、遺伝子銀行シーケンス、データベース、ウェブサイトやその他の出版物、全体の開示はここで呼ばれます。イベントではこのセクションでは、これらが優先、ここでの情報開示全体を通じて言及されたその他出版された物、その他はそれら全体に言及により結合された。用語の定義が複数存在するイベントにおいて、このセクションは開示される。参照URLまたはそのような他の識別子またはアドレスにあった場合には、そのような識別子は変更することができますしインターネット上の特定の情報の行き来する事ができます、しかし同等の情報はインターネットを検索して見つけることができます。リファレンスはこのような情報の利用可能性をして公開普及を証拠としている。
ここでは”機能的な抗体”または”生産性抗体”を使用しているように本明細書中で説明するコードする核酸抗体またはその一部抗体またはその一部はFabなどの方法によって生成される。機能や生産性の抗体では、V(D)J組生殖細胞のセグメント(つまり、並べ替え)のようなエンコードされた抗体またはその部分は切り捨てられていない/又はアミノ酸の配列が出て枠の外にないものはコンパイルされます。これは、核酸分子が内部終始コドンを含んでいない結果、タンパク質の翻訳機構の結果が途中でタンパク質の集合を終了することにつながる。
ここで使用されるように、抗体の一部は、結合部位の抗原を形成するのに十分なアミノ酸が含まれています。
ここで使用されるように、リーディングフレームは、連続と非オーバーラップの三塩基コドンのDNAまたはRNAの重複を指します。三コドンが1つのアミノ酸をエンコードするために、フレーム1、2または3読んで、特定の塩基配列の3つのリーディングフレームが存在しています。たとえば、シーケンスACTGGTCAはフレーム1を読むことでACTGGTCAになる、AC TGG TCAを読み取る事でフレーム2に、そしてACT GGTCAを読む事でフレーム3になります。
ここで使用されるように、”縮重コドン”親の塩基配列のコドンと同じアミノ酸を指定する3塩基のコドンを意味する。当業者の一つは、遺伝コードの縮重に精通しているコドンの縮退識別することができます。
ここで使われたように、コレクション内の一意のメンバーの数を指し、ここでコレクション内のメンバーに対して”多様性”を使用している。したがって、多様性は、そのコレクションの類似ポリペプチドメンバーの間で、それぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列、の数を指します。たとえば、104の多様性を有するポリヌクレオチドのコレクションは、類似のポリヌクレオチドのメンバーの間で104の異なる核酸配列が含まれています。一例では、ポリヌクレオチドのコレクションを提供する/またはポリペプチドは、少なくともまたは102、103、104、105、106、107、108、109、1010以上の多様性を持っています。
ここで使用されるように、”多様性比は、”ライブラリの総数以上のライブラリ内の別のメンバー数の割合を指します。
したがって、他のライブラリよりも多様性比のライブラリには、総数ごとに別のメンバー、全メンバーごとにこのように多くの多様性が含まれています。提供されているライブラリは、ライブラリが約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、または0.99のような、1に近い多様性比などの高度な多様性比を含みます。
ここで使用されるように、抗体を参照した”変数のドメイン”は別の抗体の間で変化するアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖の特定の免疫グロブリンのドメインです。各軽鎖と、各重鎖(VL、VH)を一つの変数領域のドメインを持っています。可変ドメインは、抗原特異性を提供するため、抗原認識に関与している。各変数の領域は抗原結合部位のドメインとフレームワーク領域(FRS)の一部であるCDRを含んでいます。
FRの領域は超可変領域よりも、そのアミノ酸配列の用語では、比較的多く保存されています。
ここで使用されるように、”抗原結合部位”は1つ以上の相補性決定領域(可変領域と呼ばれるCDR)によって形成されたインターフェイスに関連付けられています。それぞれの抗原結合部位は重鎖可変領域から3つのCDRと軽鎖可変領域から3つのCDRが含まれています。抗体分子は、2つの抗原サイトと、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分の各々を含む部分サイトを持っています。結合抗原はCDRに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含めることができます。
したがって、一般的には配列のメンバは、固相の表面上に特定の遺伝子座で配置されている直接または間接的にリンクされているもしくは微小粒子又はその他のサポートに貼付されてなど(以下と呼ばれるビーズ)を、溶液中で休止し、又は表面に広がる添付物のような特定のラベルに関連付けられている。
ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および/または標的タンパク質の機能活性の変調、または他の測定標的タンパク質その向かって抗体またはその一部の活動を反映するに関連付けられています。
たとえば、束縛は直接検出可能なラベルとその抗体またはその一部のラベルを貼ることによって、あるいは自分自身にラベルが付いていることが二次抗体を用いて決定することができます。加えて、機能の活動は当業者に知られている評価の種々のいずれかを使用して決定することができ、例えば、増殖、細胞毒性そして、ここで説明され不在対存在下で標的タンパク質の活性の比較があります。
たとえば、精製およびスクリーニングの方法は、高スループットをレンダリングすることができます。ハイスループット法は、手動で実行することができます。しかし、一般に、高スループットの方法は自動化、ロボットやソフトウェアを含みます。
プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100以上の核酸の長さになることがあります。
目的のためにここで、核酸配列はまた、ネイティブのシーケンスまたはシーケンスの特定のホストのコドンの好みを提供するために導入することができるのコドンの縮退が含まれています。
ペプチド核酸配列は、周知の方法を使用して調製することができる(例えば、ウェイラーら。核酸研究所25:2792〜2799(1997)を参照)。
ここで使用されるにおいて、ホモログ(核酸およびアミノ酸配列を基準にして)、は25%の配列相同性よりも大きく、25%以上の連続した同属以上に典型的には同等以上または25%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%または95%の配列の相同性より大きい。;必要に応じて正確な割合を指定することができます。この場合、本利用規約”相同性”と”アイデンティティ”は、間¬変更¬ためによく使用されます。一般的には、パーセント相同性またはIDを決定するため、配列は配列の相同性では、保存アミノ酸の数は、標準的な配置アルゴリズムプログラムによって決定されている各業者によって確立されたデフォルトのギャップペナルティーを使用することができます。実質的に相同の核酸分子は、興味のある核酸の長さに沿ってすべて中等度の厳しさ、または高ストリンジェンシーで一般的にハイブリダイズする。また、企図して、ハイブリダイズ核酸分子のコドンの代わりに、コドンの縮退含まれている核酸分子である。
任意の2つの分子は、塩基配列、または少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%”同一”または”であるアミノ酸配列を持っているかどうかを同たとえば、使用して、FASTAの”プログラム”のような既知のコンピュータアルゴリズムを使用して決定することができる”、ピアソンらと同様に、デフォルトのパラメータを設定します。(1988)文集。Natl。Acad。科学。。アメリカ85:2444(他のプログラムは、GCGプログラムパッケージ(デブルー、J.ら、核酸研究12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(アチュール、SFら。JMolec Biol215:403(1990));巨大なコンピュータへのガイド、マーティンJ.ビショップ、エド、アカデミックプレス、サンディエゴ、1994年とキャリロら(1988)シャム、j応用数学48:1073)。
パーセンテージの相同性やタンパク質とのアイデンティティそして/または核酸分子は、GAPのコンピュータプログラム(例えば、ニードルら(1970)j Mol Biol。48:443スミスとウォーターマンにより改訂((1981)前売応。数学2:482)。
簡潔に、GAPプログラムは、simi−lar−ityに分かれて類似している配置シンボルの数(例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸)、同様に2つの配列のうち短い方のシンボルの合計数字によって分けられます。GAPプログラムはデフォルトパラメータを含む事ができます。:(1)単項演算子比較行列と重みcom−parisonグリブクソンらのマトリックス(1986)ニュークル酸解像度14:6745、シュワルツとダイホフによる、
タンパク質配列および構造、国立医学研究財団のアトラス頁353358(1979);(2)各ギャップ30のペナルティと各ギャップ中の各シンボルの追加0.10ペナルティ、(3)最後のギャップにはペナルティなし。
ここで使用されるように、参照ポリペプチドに記載されアミノ酸の指定された割合を含むポリペプチドは、ポリペプチドと基準ポリペプチド間で共有される連続した同一のアミノ酸の割合を指します。たとえば、配列番号を記載設定のアミノ酸配列を有するポリペプチド基準に記載されアミノ酸の70%が含まれていますアイソフォームはSEQ ID NO:XXを持っています、そしてそれは147個のアミノ酸を列挙します、それは基準ポリペプチドが含まれていることを意味し、少なくとも103の連続アミノ酸は配列番号のアミノ酸配列SEQ ID NO:XXの前に置かれます。
配列の整列セットは、対応する位置に配置されゲノムDNA配列と整列のESTおよびその他のcDNAなどのRNAから由来する配列を、合わせて含めることができます2つ以上の配列を指します。
しかし、3′ている拡張機能の水酸基を持っています。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素(RT)が−PCR法は、RNA PCR法、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドルPCR法、キャプチャーPCR、発現PCR法、PCRの中の3′、5′RACE、連結媒介PCRおよびその他の増幅プロトコルを含んでいます。
ここで使用されるように、”プライマーのペアは”(PCRによるなど)および3′(下流)プライマーが増幅されるシーケンスの最後の5′5ハイブリダイズ(上流)プライマーを′が含まれているプライマーのセットを参照してハイブリダイズは、増幅される配列の3′末端の補数を含んでいます。
当業者が容易に標的核酸分子、特定のアプリケーションに適切な核酸分子の特異的なハイブリダイゼーションを達成するためにこれらのパラメータを調整することができます。
ここで使用されるように、実質的に製品と同じ関心のあるプロパティは、十分に実質的に同一の製品は、製品の代わりに使用することができるように変更されていないように十分に類似したことを意味します。
対象は、遺伝子の異なる2つの対立遺伝子を持っている場合は、件名は遺伝子のヘテロ接合体と言われています。
特定の遺伝子の対立遺伝子は、それぞれの単一のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドの他とは異なる場合置換、欠失、ヌクレオチドの挿入を含めることができます。遺伝子の対立遺伝子はまた、変異を含む遺伝子の形式することができます。
任期は実質的に細胞物質の自由タンパク質が、そこから、または隔離され組換え的に生成細胞の細胞成分から分離されている蛋白質の準備が含まれています。一実施形態では、この期間は、実質的に細胞物質の自由を有するプロテアーゼ蛋白質の準備が含まれています。以下、非プロテアーゼタンパク質の約30%(乾燥重量)非プロテアーゼタンパク質(また混入タンパク質と称する)、一般的に以下の約20%以上の非プロテアーゼタンパク質または非プロテアーゼタンパク質の10%以下、非プロテアーゼ蛋白質の約5%。プロテアーゼタンパク質またはアクティブな部分は、その組換え生産されている場合、それはまた、実質的に培養液、すなわち、培養培地は、以下を表す無料ですより約または20%、10%またはプロテアーゼ蛋白製剤の体積の5%。
ここで使用されるように、たとえば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドのような合成体に言及されることは組換え方法および/または化学合成法によって生成される核酸分子またはポリペプチド分子を意味する。
ここで使用されるように、患者が被験者に関連付けられています。
ここで使用されているように、簡略化した保護基、アミノ酸および他の化合物の略語は、その一般的な使用方法と一致して、特に断らない限り、認識された省略形、または生化学命名に関するIUPAC命名−Iubインタフェース委員会を使用することはできません。(バイオ生物学(1972)11:1726参照)。
B 概略
与えられたものは機能抗体のライブラリ(例。コレクション)、と結果としてのライブラリを生成するためのメソッドです。
コレクション、またはライブラリは、先験的に知られているが、ここで、各アドレス内の抗体は、同じシーケンスを持っているアドレスの中で、コレクション内の各他のアドレスで抗体とは異なります。コレクションは、分類されることができる修正された物理的な配列またはメンバーとして提供することができる。抗体の配列のコレクションはその組み合わせ生殖部の完全なレパートリー、その選択した部分、またはコレクションの変更フォームの表すことができます。ライブラリのメンバーは個別に設計されており並べられている。このため、図書館は、他のライブラリよりもはるかに少ないメンバーとライブラリの作成を許可するが、より多様性を有し、非常に多岐にわたっています。ライブラリは、本文書に記載された102メンバーとしていくつか含まれており、一般的に含まれているのが、103、104、2×104 3×104 4×104 5×104、6×104 7×104、8×104 9×104または約106、107、108、109以上のユニークなメンバーを含む105以上のユニークなメンバーです。
U.S.A.、86:3833−3837;ワードら。(1989)自然、341:544−546、ヒューズら。(1989)科学、246:1275−1281、バートンら。(1991)文集。国立、教育。科学、U.S.A.、88:10134−10137;マークら。(1991)jモル、ボル、222:581−591。Hoogenboomら。(1991)J,モルボル、227:381−388。ニシンら。(1994)エンボJ13:692−698。Barbasら。(1992)文集。国立。科学。科学、U.S.A.、89:4457−4461;赤松ら。
(1993)jイミュノル、151:4651−1659;グリフィンら。(1994)エンボJ13:3245−3260。フェロウス(2004)PNA、101:12467−12472。パーソンら。(2006)jモルボル。357:607−620。キナピックら。
(2000)jモルボル。296:57−86;ロザら。(2008)jモルボル。376:1182−1200。モンドンら。バイオサイエンス(2008)フロンティア、13:1117−1129、そしてベアール、アイ(2007)エキスパートオピン。生物。、7;763−779。
アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法
別の方法としては、V(D)Jセグメントは、このような特定のシーケンスまたは配列のサブセットは、ライブラリのメンバーを生成するために使用されていること、または半合理的な合理的なアプローチを使用して再結合することができます。たとえば、生殖細胞のセグメントが配列の類似性や相違点に基づいて選択するか、または共有の特性に基づいて(例えば、V領域の家族、およびCDR3の長さや組成物または他の生化学的属性)。
3 ライブラリの応用
必要に応じて、抗体は、すべて、または(CH1の、CH2のCH3とCH4および/または一定の重鎖(CL)のような1つまたは複数のCHドメインなど)を一定の重鎖の一部を含めることができます。したがって、抗体は、ライブラリに含まれてここでは、全長抗体であるまた、フラグメントまたはその一部を含む、例えば、例えばFab、Fab′を、のF(ab′)2、単鎖Fvs(scFv)を含むものが挙げられる将来価値、dsFv、diabody、FDおよびFdは′Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント、およびscFabの断片を断片化します。たとえば、ライブラリ内の抗体は、ここでFabを含んで提供される。
重鎖および軽鎖の可変領域は、−領域、またはイントロンをコーディング以外で区切られた複数の生殖細胞の遺伝子セグメントによってコードされている多くの場合、異なる染色体上に存在しています。遺伝子、27の多様性(DH)の遺伝子、および6への参加(JH)の遺伝子、たとえば、免疫グロブリン重鎖領域の遺伝子は約65変数(VH)が含まれています。カッパ(・)とラムダ(・)軽鎖はまた、各VLとJL遺伝子セグメント、同様の数によってコードされている任意のD遺伝子セグメントが含まれていません。典型的なVH、DHは、JHとVL(V・またはV・)とJL(J・またはJ・)遺伝子セグメントは表3−5に記載されている生殖細胞です。
D.形容詞抗体ライブラリーの生成会員の身元方法
方法では、追加の多様性は、当技術分野で知られているアプローチの数のいずれかを使用して、ライブラリに導入することができる限定されないために、ランダムな突然変異誘発、半や合理的突然変異誘発合理的として紹介されます。
i.生殖細胞セグメント
本方法を実施するには、セグメントのシーケンスは、抗体生殖細胞系遺伝子セグメントを提供する任意のソースから得られる生殖細胞です。これらは、任意のデータベースや生殖細胞の遺伝子セグメントの記載の配列を設定公表されている文献が含まれています。典型的な抗体の生殖細胞のソースは含まれて国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)の、国際的な免疫情報システムのデータベースに限定されていない▲R▼(IMGT)、カバットのデータベースとトムリンソンのVBaseデータベース(Lefranc(2003)核酸研究所、31:307−310;マーティンら、治療用抗体、ワイリー−VCH(2007)、頁104から107)のハンドブックの抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール。必要に応じて、非ヒト生殖細胞系列のセグメントのための核酸配列はまた、公表されている文献や公開データベースから取得することができます。たとえば、例示的なマウスの生殖細胞のデータベースがibt.unam.mx/vir/v_mice.htmlデータベースを利用可能なクローラ式です。配列リストは、ここIMGTデータベースやその他の公共データベースから収集された配列の例示的なヒト生殖細胞のセグメントのシーケンス(例えば、参照配列番号:10−451および868)を提供できます。
任意の名前付け規則は、抗体の生殖細胞のセグメントを識別するために使用することができます。任意の名前付け規則を使用している核酸配列を識別することができる当業者の一つ(例。表22、参照)、組換え核酸配列を記述するここで目的のために、VHの生殖細胞のセグメントが識別されるすべての対立せずにIMGT命名法を使用して名前が付けられます。表6に、それぞれの対立遺伝子を有するIMGTの命名法とそれに対応するIMGT命名法を記載してあります。VKの生殖細胞のセグメントはツァッハウ命名法を使用して名前が付けられます。表7にツァッハウの命名法とそれに対応するIMGTの名称を示しています。VLの生殖細胞のセグメントは、川崎市の名称を使用して識別されます。表8は、川崎市の命名法とそれに対応するIMGTの名称を示しています。のDH、公団、JKとJLの生殖細胞のセグメントはIMGT命名法を使用して名前が付けられます。
本書で、方法の応用は生殖細胞系の配列セグメントに限定されていないことが認められています。従って、組み換えVH,DH,JH,Vκ,Jκ,Vλおよび/またはJλの配列セグメント、またはそれに類似した配列は方法の適用に使われます。配列セグメントを組み換え、その種類を増加することによって、ライブラリー、およびコンパイルされたセグメントの並べ替えの多様性を増加することもできます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験的に変更することができます。生殖細胞系のセグメントは不規則または経験によって変更することができます。または/加えて、生殖細胞系セグメントは、リンカー、制限酵素部位、あるいはこの方法の応用に必要な他のヌクレオチド配列(ここで指定された)の使用によって変更され、組み換え完全長核酸分子の生成を容易にすることができます。
モノクローナル抗体の抗原特異性がすでに承認されていることを踏まえ、由来の配列をこの方法に取り入れることによって、抗原に対して向上した特異性と機能性をもって抗体の識別が可能なります。生殖細胞系配列から由来するヌクレオチド配列、例えばVH,DH,JH,Vκ,Jκ,Vλおよび/あるいはJλ.の1つあるいはそれ以上に相当する物は、自らで生殖細胞系配列と組み込むことができます。当業者は、生殖細胞系配列から由来する特定の抗体をコードする核酸分子で相当する配列を識別することができます。以下の表9は、由来の生殖細胞系配列に関連するV、DおよびJの局部を特定します。
したがって、D遺伝子セグメント配列においてアミノ酸の変動が見込まれています。したがって、たとえば、DH遺伝子セグメントは、いかなるリーディングフレームに属するいかなるDH遺伝子セグメント、あるいはそれに由来する逆位補完、あるいはDHと指定されるいかなるヌクレオチド配列であるかもしれません。しかし、いくつかの例で、D生殖細胞系配列のリーディングフレームは、結果のエンコードされたアミノ酸は主に親水性であるように選択されます。CDR3が抗原結合部位なので、表面が露出した親水性の残基に富んでいます(参照は、Zanetti and Billetta、Antigenized Antibodies from Concepts to Applications(1996年)、Antibodies、Volume 2(75〜122ページ)、ハーウッドアカデミック出版社、またはPommie et al.(2004年)J Mol.Recognition 17:17〜32)。当業者は、配列における疎水性もしくは親水性を測定する技術に精通しています。たとえば、親水性はタンパク質の水治療法総平均(GRAVY)を利用することによって測定できるが、これは各残基の疎水性値を加えそして配列の長さで割り算を行うことによって疎水性値を測定できます(参照は、Kyte and Doolittle(1982年)、またはbioinformatics.org/sms2/protein_gravy.html)。GRAVY値は低ければ低いほど、配列の下の親水性は高いです。
上述のように、生殖細胞系セグメント配列は、本書のコンパイルを行う前に変更することができます。または、変更は直接に組換え核酸配列に行うことができます。したがって、コンパイルの前に後述の変更は個々の生殖細胞系セグメント配列に行うことができるが、リーディングフレームが維持されること、およびインフレームの組み換え核酸配列を生成するにあたって本書で説明されたコンパイルに当てはまるルールが遵守されることは前提です。
したがって、VH鎖あるいはVL鎖をエンコードする複数の組換え核酸のいずれもがさらに変更されることは可能です。
核酸配列の変更は、ヌクレオチドあるいはそれに由来する合成の交換や置換、挿入、または削除を伴います。核酸分子の変更がこの方法のおかげでできたV(D)Jセグメントのリーディングフレームを維持するための接合部に影響を及ぼさない限り、当業者は適切と見なすいかなる核酸分子の変更を行うことができます。結果の完全長核酸が5’開始コドン(ATG)とフレーム内にあり、完全長のVHもしくはVLの発現、またはそこから抗原結合部位を生成するための十分な部分の発現は可能であることを確保するために、いかなる変更をチェックし、リーディングフレームに影響がないかを確認する必要があります。
たとえば、核酸配列は、コドン使用を細菌発現などのような発現に適用させるように変更することができます。複数のコドンが同一のアミノ酸をエンコードすることで退化します。このように単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされるが、特定の生物内でコドンの使用はアミノ酸によって異なります。ここで取り上げられる完全長核酸は、稀なコドンを特定の発現系で使用されるより豊富なコドンに換えるために変更されています。一般的に、変更はサイレント突然変異を含むおかげで、置換はコドンの特異性に影響を及ぼしません。コドン使用表は、特に一般的な発現系に関するものが当業者に知られています。例えば、細菌発現に関しては、コドン使用表が知られています(例えば、Grantham,R.et al.,Nuc.Acids Res.,8:1892−1912(1980年)、Grantham,R.et al.,Nuc.Acids Res.,9:r43−r74(1981年)、および表14を参考)。コドン使用表は、DNAもしくはRNA向けの3ヌクレオチドの全ての64可能なコドン、およびE.coli K12細菌におけるその使用率を記載します。表は、単一のアミノ酸が複数のコドンにエンコードされる(冗張)にもかかわらず、このコドンは特定のアミノ酸において同じ使用率で使用されていないことを示します。たとえば、アミノ酸のアルギニンが6つのコドンにエンコードされています:CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGG。コドンCGCの使用率は22%である一方、コドンAGAは%2.0%に過ぎません。
別の例で、核酸の追加的な変更は、制限部位を提供する個々の組み換えVHまたはVL核酸配列の5’または3’のいずれかまたは両方の端末にフランキング配列の追加を含みます。そういった変更は、DNA合成中に、またはPCRによって生殖細胞系組み換え核酸分子に組み込むことができます。例えば、制限酵素部位を組み込むことができるプライマーを利用します。いくつかの例で、このような制限部位の追加は、選択されたベクターの方向で核酸のクローニングを容易にします。例えば、制限部位は、当技術分野で知られているあらゆる制限部位を含めます。典型的な制限部位の配列は表15に記載されています。一般的に、選択される制限部位は、発現ベクターと適合性があり、また平滑末端ライゲーション、あるいは付着末端ライゲーションを容易にするために選択されることがあります。制限酵素の選択は普通であり、当業者のいずれかのレベルの範囲内にあります。
単に最後のCをGに変更するだけで、コドンGTC(使用率15.3%)をGTG(使用率26.3%)に変えることができ、これはコドンの使用率の11%の増加を示します。あるいは、最後のCをTに変更することで、アスパラギン(D)をコードするGACコドン(使用率19.2%)をGAT(使用率32.2%)に変更し、コドンの使用率の13%の増加を示します。この例で、上記のいずれの変更を行うことができます。一般的に、変更の目的はコドンの使用率の最も高くかつ有益な増加を達成することです。
追加的な例で、核酸分子はリンカー配列によって変更することができます。例えば、単鎖抗体(例えばscFv抗体)が望ましい場合は、可変重鎖および軽鎖を最初にリンカによって結合することができます。そのつながりは直接またはリンカーを介して行うことができます。たとえば、ペプチドリンカーをエンコードする核酸は、DNA合成中に、あるいは子生物学技術によって、第1配列(例えば可変重鎖)の5’末端、あるいは第2核酸配列(例えば、可変軽鎖)の3’末端に追加することができます。通常に、リンカーは結果のポリペプチドが可溶性があるように十分に長いです。リンカーとして使用される核酸配列は、約2あるいは2〜60、あるいは約60のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーをエンコードすることができます。例えば、約5〜40、あるいは約10〜30、2〜6、7、あるいは8アミノ酸残基。リンカー部分の例には、(GlymSer)n、および(SermGly)nなどのペプチドも含まれるが、ここで、nは1〜6(1〜4、2〜4も含まれる)であり、mは1〜6(1〜4、2〜4も含まれる)です。そういったリンカーの典型的な例は、グリシン−セリン−ポリペプチドなどのペプチドリンカーをエンコードするいかなる物だが、例えば、−Gly−Gly−,GGGGG(配列ID番号:981),GGGGS(配列ID番号:982)あるいは(GGGGS)n(配列ID番号:985),SSSSG(配列ID番号:983)あるいは(SSSSG)n(配列ID番号:1996)。リンク一部分は例えばHuston et al(1988年)PNAS 85:5879−5883、Whitlow et al.(1993年)Protein Engineering 6:989−995、およびNewton et al.,(1996年)Biochemistry 35:545−553で見られます。他の適当なリンカーにはペプチドリンカーを含むいかなるものだが、例えば米国特許4751180号、あるいは4935233号などだが、参考として本書に記載しました。希望のペプチドリンカーをエンコードするポリヌクレオチドの挿入に関しては、適切で在来の技術を利用し、可変重鎖もしくは可変軽鎖の配列のどこでも、またはインフレームで末端5’もしくは3’でできます。たとえば、制限部位が重鎖配列の末端5’、および軽鎖配列の末端3’に追加される一方、リンカーセグメントをエンコードする核酸(例えば(Gly4Ser)3、配列ID番号:984)が重鎖配列の末端3’に追加され、軽鎖配列の末端5’との接続ができます。発現の上で、そういった核酸分子はscFv抗体をエンコードし、重鎖の可変領域が軽鎖の可変領域に機能的にリンクされています。
加えて、小さなエピトープタグ、例えばmycタグ、Hisタグ、Flagタグなど、その他の小さなエピトープタグ、および/またはその他の追加的なDNA配列は、結合のために、可変重鎖、あるいは可変軽鎖をエンコードする核酸配列に追加されます(Arnau et al.(2006年)Protein Expression and Purification,48:1−13)。場合によって、例えば、LPETGタグなど、定着を許すタグは追加され、リガーゼやソルターゼのタンパク質を利用し、領域指定変更を可能にします(Chan et al.(2007年)PLoS ONE,2:e1164)。したがって、そういったタグの挿入では、定着が可能(例えば、ビアコアチップで)、および/またはソルターゼの存在で選択的な分類が可能になります。一般的に、追加的なDNA配列が核酸分子の3’または5’の末端に追加され、組み換え可変配列が直接的または間接的にリンカーによってエンコードされます。あるいは、追加のDNA配列を希望の発現ベクターに組み込むことによって、発現の時に得られた抗体は、追加の配列を含むようになります。例えば、配列ID番号:1に記載されたプラスミドは3265−3306のヌクレオチドに属するHis−Flagタグを含みます(Flagは3265−3288のヌクレオチドに、Hisは3289−3306のヌクレオチドに当たります)。別の例で、配列ID番号:2に記載されているプラスミドDは3265−3288のヌクレオチドに属するFlagタグ、また3289−3303のヌクレオチドに属するLPETGタグを含みます。このように、重鎖が単独であるいは軽鎖と一緒に発現する際に、得られる抗体はFlagタグ反対あるいはHisタグ反対の試薬によって検出することができます。これは、例10に例示されています。当業者は、検出可能な配列あるいは分子部分を、組み換え可変重軽鎖配列をエンコードする核酸分子に追加し、得られる抗体の検出、および/または除去を容易にします。
他の例で、変更は得られる核酸分子の突然変異多様性を促すためにも行われます。アミノ酸の置換、除去、あるいは追加などによって、不規則もしくは試験的にいかなる変更が可能です(例えば、組み換え核酸分子のいかなる領域もしくはセグメントの場合)。変更は、DNA合成中にあるいは分子生物学の通常技術、例えば部位特異的突然変異誘発法、制限酵素消化、および/またはクローニングなどを使用して行うことができます。
いかなる組み合わせが考えられます。当業者は、VHもしくはVLをエンコードする核酸分子のCDR1,CDR2,CDR3,FR1,FR2,FR3およびFR4の領域を知っており、識別することができます(例えば、Chothia et al.(1989年)Nature 342:877−883、Al−Lazikani et al.(1997年)J Mol.Biol.,273:927−948、WO/2007/137616、bioinf.org.uk/abs/、bioc.unizh.ch/antibody/Numbering/NumFrame.html、Martin et al.,Bioinformatics Tools for Antibody Engineering in Handbook of Therapeutic Antibodies,Wiley−VCH(2007年),96−103ページを参考)。たとえば、CDRは、配列アライメントに基づいてKabat番号付けを、または構造トポロジーに基づいてChothia番号付けを利用するVH鎖およびVL鎖に見られます。Kabat番号付け方式が配列アライメントから考案されて以来、番号付け方式に関連する配列への挿入は文字で(例えば、27、27A、27B、27C、など)、そして除去は相当する省略された数字に示されるようになりました。Kabat番号付けに基づく軽鎖と重鎖の6つのCDRに相当する残基はCDR−L1:L24−L34、CDR−L2:L50−L56、CDR−L3:L89−L97、CDR−H1:H31−H35B、CDR−H2:H50−H65、CDR−H3:H95−H102です。当業者は、CDRの長さが変動するものだと了知し、アライメントとKabatの番号付け方式によって、相当する残基を識別することができます。
いくつかの例で、変更は抗体、あるいはその部分もしくは断片の意図的な変更を含むが、その結果は、抗体、あるいはその部分もしくは断片は生物学的に活性なペプチドの対抗性を模倣します(例えば、International published PCT Application No.WO 2004/050017を参考)。受容体結合、活性化、および酵素活性などの重要な生物学的な機能は、アミノ酸残基、一定期間ペプチド、エピトープ、およびミモトープの限られた量を含む大きなタンパク分子の不連続部位に起因しています。ペプチドのこのエピトープとミモトープは、治療薬として使用することができるが、サイズが小さく劣化が早いため、生体内で不安定です。しかし、ペプチドエピトープは、抗体の可変領域に組み込まれ、抗体は生物学的活性ペプチドの活動を模倣することができます。そういった抗体は、より安定で、より長い半減期を見せます。したがって、抗体あるいはその一部は、特定の対象のポリヌクレオチドに属する抗体の可変領域に配列を組み込むことによって、その対象あるいは機能に従って活動するように設定できます。多くの場合は、既知の対象の構造や機能に関する情報は入手可能です。これらのライブラリーは、将来の抗体ライブラリーのためのリード抗体を提供するので重要です。
そして、CDRに挿入されたペプチドは共同、または別々の可能性があります。
グリシンは、最も小さく単純なアミノ酸で、側鎖にただ1つの水素原子を含みます。グリシンはサイズが小さいので限られた空間に入り込んだり、他のアミノ酸ができない特定の構造ができます。プロリンは立体的に拘束されているアミノ酸で、ペプチド配列(REF)を隣接するとペプチドの活性を高める効果を表します。一般的に、フランキング配列はグリシンまたはプロリンをエンコードします。普通は、フランキング配列はプロリンをエンコードします。例えば、核酸分子は、配列ID番号:891に記載されたEPOペプチドのN−あるいはC−末端に追加されたプロリンおよび/またはグリシンを含むペプチドを、エンコードすることができます。フランキング配列を含む核酸分子の典型的な例は配列ID番号874−895に記載されたEPOペプチドのいずれもをエンコードします。
本書の方法によってコンパイルされたVH鎖およびVL鎖をエンコードする組み換え核酸分子配列は収集、保管されています。
収集された配列は、例えば他の組み換え配列との類似性などによって、特定のいかなる特性で分析することができます。そして配列はその多様性に基づいて並べられます。組換え配列の全て、またはそのサブセットは、DNA合成および/または組み換えDNA技術によって、組み換え核酸分子に仕上げることができます。例えば、配列のサブセットは、抗体ライブラリー作成における配列の類似点または相違点に基づいて選択されます。
この方法によって組み換えられた配列は、収集、保存されます。一般的に、収集と保存はアドレス可能な形式で行われ、各配列がそれぞれの遺伝子座によって確認されます。たとえば、配列はデータベースやリストなどで保存できます。さらに、各核酸配列の遺伝子セグメントの個々のコンポーネントが知られており、組換え核酸配列がコンポネントのセグメントによって特定されています。たとえば、VH1−18_IGHD1−26*01_IGHJ2*01と呼ばれる核酸配列は、DH生殖細胞系セグメントIGHD1−26*01、JH生殖細胞系セグメントIGHJ2*01、およびVH生殖細胞系セグメントVH1−18(命名法によってVH1−18*01とも呼ばれる)を含む可変重鎖をエンコードする核酸配列を特定できます。当業者は、希望の命名法によって核酸配列を特定できるが、コンポネントのセグメントの特定は容易であることを前提とします。
上記の方法を執行することで、VH鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、10,100,500,1000(103),2x103,4x103,6x103,8x103,104,2x104,3x104,4x104,5x104,6x104,7x104,8x104,9x104,105,2x105,3x105,4x105,5x105,6x105,7x105,8x105,9x105,106,107あるいはそれ以上のVH核酸配列の生成が可能です。上記の方法を執行することで、VL鎖をエンコードする複数で多様の核酸分子が生成され、これらは組み換えセグメントあるいはそのコンポネントのいかなる可能な置換配列を表します。例えば、10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000(103),2x103,3x103,4x103,5x103,6x103,7x103,8x103,9x103,104,5x104,105あるいはそれ以上のVL核酸配列の生成が可能です。
いくつか例で、組み換え核酸分子は配列の多様性によって収集、保存されます。ライブラリーメンバーの配列の多様性に関する知識は、以下に説明される通り、合成および発現のために、VH鎖およびVL鎖をエンコードする核酸配列の制限されたサブセットの選択に用いることができます。したがって、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相違点によって、その配列多様性を増加することができます。あるいは、得られる抗体ライブラリーはメンバーの間の配列相同性によって、その配列多様性を減少することができます。したがって、たとえば、選択された組み換え核酸の配列がライブラリー内のその他の全ての配列と比較し、異なる物(例えば、10%,20%,30%,40%,50%,60%,65%など70%以下の相同生の物)は選択されます。別の例で、初期的検索で”ヒット”が見つかったら、全てのメンバーがより高い配列相同性(例えば、70%,75%,80%,85%,90%,95%あるいはそれ以上)を共有する別のライブラリーを作成することができます。上記の割合はただの例だけです。当業者は、特定のライブラリーに記載する配列を選択するにあたって、配列相同性に希望に従って限度を付けることができます。
BLOSUM62、gap open:11、gap extension:1、x_dropoff:50、expect:10.0、wordsize:3、filter:on.核酸の配列アライメントはBLASTN2.0.6バージョン(1998年9月16日)と次のパラメータを使用し行うことができます:Match:1、mismatch:−2、gap open:5、gap extension:2、x_dropoff:50、expect:10.0、wordsize:I1、filter:off.当業者は、上記のパラメータにおいて、例えば比較の厳格さを増強したり緩和したりなど、どの変更を行い、2つ以上の配列の関係性を決定できるかを知っています。BLASTプログラムは、BLASTビットスコア−というアウトプット指標を提供するが、これは整列された各配列に関連するギャップや置換の数で計算される指数です。スコアが高いほど、整列の重要性が高まります。ビットスコアは、他の選択された各配列に対して最少の配列多様性、あるいは最多の配列多様性を表す配列を選択するに利用されます。
(例えば、Hein.J.(1990年)Methods Enzymol.183:626−645を参考。)核酸配列の間の相同性は、例えばハイブリダイゼーションの条件を変更することなど、当分野で知られている他の方法でも確定されます。BLASTclustはクラスタ分析に使用できるその他のプログラムです。BLASTclustは、例で説明されたソフトウェアコンパイルプログラムで使用されます。
別の例で、5’リン酸基の追加のために、T4ポリヌクレオチド・キナーゼ(T4PK)などのキナーゼはオリゴヌクレオチドに追加されます。他のオリゴヌクレオチドの変更は、よく知られており、本書で提供される方法と利用できます。
いくつかの例で、組み換えVH配列および/またはVL配列またはそのサブセットは、組み換えDNA技術を利用し組み換え核酸分子に仕上げることができます。当業者は、例えば、PCR、クローニング、および制限酵素消化などをも含み、DNA組み換え技術に精通しています。このような技術は、上記に説明された通り、生殖細胞系セグメントを組み合わせ、インフレームで組み換え核酸分子を生成するために利用できます。一般的に、各ベクトルが個別で生み出され、各ベクトルはクローニングプロセスによって配列のIDを表します。したがって、組み合わせ抗体ライブラリーの組換え生成はアドレス可能です。
本書の例14にあるいうに、リンカーの典型的な例として、DH生殖細胞系セグメントの3’末端とJH生殖細胞系セグメントの5’末端の間にSYをエンコードするヌクレオチド配列が挙げられます。
一般的に、後続の生殖細胞系セグメント、その派生物、あるいはその一部のための核酸配列は、親ベクトルもしくは中間ベクトルへの後続のクローニングに向けて、オリゴヌクレオチドとして生成されます。終止コドンがいかなる段階で挿入される場合、その終止コドンは本書で説明された方法で除去されるか終止コドンを含む特定のセグメントがクローンされないかという結果になると知られています。隣接する核酸配列の結合を容易にするために、オリゴヌクレオチドは3’および/または5’末端で補完的な制限酵素部位を含むように生成されます。
本書の方法では、合成組換え核酸分子、または組み換え生成による組み換え核酸分子などの核酸分子は、発現ベクターにクローン化されます。ポリヌクレオチドは、普通に制限酵素消化およびライゲーションによって、ベクトルに挿入されます。当業者に知られている従来のいかなるベクトルは、真核生物や原核細胞での発現に使用することができます。典型的なベクトルには、以下に記載されている通り、プラスミドA、C、およびDがあります。ベクターは、適合性のある発現系が、核酸の増幅および/またはエンコードされた可変重・可変軽鎖ポリペプチドの発現に利用できるように変更できます。
2.オートメーション
本書の方法を応用するにあたって、生殖細胞系セグメントまたはそれによる派生物が必要です。そういったセグメントは当業者に知られている物で、上記に挙げられた市販のデータベースで入手できます。そういった生殖細胞系セグメントは上記の表3〜5の配列リストに記載されています。変更されたJH生殖細胞系セグメントの例は配列ID番号3450−3455にあります。手軽なアクセスのために、配列はユーザーが作成したデータベースにコンパイルすることもできます。配列の全ての情報を含むファイルまたはデータベースの作成によって、この配列への即時アクセスが可能になります。加えて、配列ファイルは他のシステムやプロセスに接続し、方法の応用を容易にすることができます。例えば、図9、例4で見られるように、データベースは、入力ファイルとして配列コンパイルアルゴリズムにリンクされ、配列コンパイルのためのV(D)Jの重鎖および軽鎖配列を特定しています。
たとえば、図11にあるようにデータベースファイルの略図は制限酵素Mfe I向けの配列を含みます。
配列編集
(a)ユーザーがインシリコで作成した全ての利用可能な生殖細胞系セグメント(VH,DH,JH,Vκ,Jκ,VλおよびJλ)のデータベースへアクセスできます。
(b)アルゴリズムを利用し、重鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’−VH−DH−JH−3’の組み含わせ)を生成、カッパ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’−Vκ−Jκ−3’の組み合わせ)を生成、およびラムダ軽鎖向けの組み換え完全長核酸配列の全ての組み合わせ(5’−Vλ−Jλ−3’の組み合わせ)を生成できます。
(c)アルゴリズムを利用することによって、接合部の核酸配列を変更し、核酸配列がインフレームにある結果を生み出します。
(d)結合によって得られた核酸配列を変更し、偶然に生成された終止コドンを除去します。
(e)結果として得られる完全長核酸を変更し、細菌発現に対するコドンの作用を最適化します。
(d)得られた核酸配列を変更し、不要な制限部位を除去します。
(g)最適化された完全長核酸配列の5’および3’末端でクローニングを行うために、制限部位を含むフランキング核酸を挿入します。
(h)配列多様性に基づいて組み換え核酸配列に順番を付けます。
(g)組み換え核酸配列のライブラリーから組み換え核酸配列(重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含む物)を選択します。
(h)選択された核酸配列を、アドレス可能な形式の特有の遺伝子座に移動します。
(i)個別の重鎖または軽鎖の配列を記載するアドレス形式に基づいて、全ての組み換え核酸配列を含むアウトプットファイルを生成し、各遺伝子座がアドレス可能、またアドレスされた形式の遺伝子座であることを確保します。
また、図17はその順番の例を挙げています。
タンパク質の発現および浄化を自動化する方法は当業者に知られています(例えば、Lesley et al.(2001年)Protein Expression and Purification.22:159−164、Acton TB et al.(2005年)Methods Enzymol.,394:210−43、Nguyen et al.(2004年)Journal of Structural and Functional Genomics,5:23−27を参考)。このようなプロセスは、普通に機械的な方法で行われます。
Piccolo機は溶解および浄化のプロセスを行うために設定されています。細胞は採取され、浄化技術との適合性のある適切な溶解バッファーを使用し溶解されます。溶解バッファーの選択は当業者の基本的な技術です。そして、得られる浮遊物は、カラムクロマトグラフィーによって、anti−flag樹脂あるいはNi−charged樹脂などの適切な改質樹脂で浄化されます。当業者は、本書で説明された通り、タンパク質浄化に適切な樹脂を特定することができます。樹脂は、実行を開始する前に、適切な洗浄バッファーで手動で平衡化する必要があります。結合タンパク質は、適切な溶出バッファーによって溶離され、そしてその溶出液は出力プレートで収集されます。出力プレートは、オペレータに回収されるまで、冷温(例えば、6℃)で保管されます。
ここでライブラリーを紹介します。ライブラリーにはVH鎖およびVL鎖をエンコードする核酸ライブラリー、組み換え核酸分子によって変性したベクトルライブラリー、および抗体ライブラリーがあります。いくつかの例では、各ライブラリーに属するメンバーは、例えばセクションE.2.に取り上げられたいかなるアドレス可能な形式で処理されています。ライブラリーに属するメンバー、そして結果として出来上がるライブラリは上記で挙げられた方法によって作成されます。
ここで、VH鎖をエンコードする組み換え核酸ライブラリーを紹介します。ここで取り上げられるライブラリーは完全にVH,DHおよびJH生殖細胞系セグメントあるいはそれに由来する物で構成されている核酸分子を含みます。VH,DHおよびJH生殖細胞系セグメントは、上記の表3vに記載されているいかなるセグメント、あるいはそれに由来する物を含みます。いかなる置換配列は可能です。ライブラリーの核酸分子は、配列があるが、VHセグメントはDHセグメントの5’で、そしてDHセグメントはJHセグメントの5’です。セグメントは直接的または間接的にペプチドリンカーによって、リンクされています。
さらに他の例で、ここで取り上げられるライブラリーは組み換え核酸分子を含むが、そこで、VH鎖をエンコードする核酸分子の部分あるいは全部、または少なくとも1つあるいはそれ以上のVH,DHおよびJHは既存のモノクローナル抗体(例えば、表9に記載されているいかなる物も含む)から派生します。ここで取り上げられるライブラリーの典型的な例は、例えば、配列ID番号:1043もしくは配列ID番号:1058(末端制限部位配列を含む配列ID番号:453)に記載されているanti−CD20抗体のVH鎖、または配列ID番号:1057(末端制限部位配列を含む配列ID番号:452)に記載されているハーセプチンをエンコードする核酸分子を含むことは可能です。
本発明は再結合されたVLチェーンを含む核酸ライブラリです。ライブラリは、ラムダ或いはガンマライトチェーン、またはその組み合わせが含まれています。したがって、ここでいうライブラリは完全にVκとJκ生殖細胞と・またはVλとJλ生殖細胞のセグメントから再結合された核酸分子です。
VκとJκと・或いはVλとJλの生殖細胞セグメントは上記表4−5のすべてまたはそのひとつのサブセットが含まれています。任意の置換が可能です。
ライブラリ内の核酸分子は生殖細胞セグメントから得たもので、VHチェーンをエンコードする核酸と共同に表現された場合、この核酸ライブラリはナイーブ抗体をエンコードすることができます。
このライブラリは単純で、かつ生殖細胞から由来すると考えられています。それにもかかわらず、この方法を実施した上で、セグメントの共同領域は、結局にフレーム内にて核酸分子がエンコードされることになります。
たとえば、ライブラリは主導ペプチド配列がある核酸分子を含みます。ライブラリはまた、再結合されたアミノ酸置換をエンコードする塩基変異がある核酸分子を含みます。CDRの1つまたは複数のアミノ酸とか挙げられます。
3、核酸ライブラリ対或いはベクターライブラリ
いくつかの例では、核酸分子対の一つは、異種配列(タグやその他の検出可能な部分など)を含めることができます。その他のライブラリ内の核酸分子対は異種配列を含みません。
相補的核酸対ライブラリは対処ライブラリとして提供することができます。これらのライブラリには、対応フォマットの各遺伝子座は、あるVHチェーンをエンコードする一本の核酸分子及びあるVLチェーンをエンコードする一本の核酸分子を含みます。他に対応したすべての遺伝子座の核酸対と比較すると、核酸対(すなわちVHチェーンをエンコードする核酸分子とVLチェーンをエンコードする核酸分子の組合)はそれぞれ異なります。
ここで述べている抗体ライブラリはその部分が少なくともVHチェーンとVLチェーンを含み、あるいは、その一部が十分な抗原結合部位を含みます。VHチェーンあるいは抗体ライブラリの一部の抗体全体は上記E1段落で表示した核酸ライブラリの任意核酸分子にエンコードされます。したがって、抗体ライブラリ内の抗体は生殖セグメント配列の全部或いは一部から派生され、及び/或いは変更された配列から派生されます。いくつかの例では、これらのライブラリは対応ライブラリとして提供されています。
したがって、ナイーブ抗体と比べると、抗体ライブラリ内の抗体は一つ或いはアルミ酸のCDR置換を含めることができます。
当抗体ライブラリ内の一つ或いは複数の抗体は既知の任意のモノクローナル抗体のライトチェーン可変領域或いは重鎖可変領域を有します。
これらの抗体ライブラリは対応ライブラリを含みます。その対応ライブラリはそれぞれ唯一のアドレスを有し、当ライブラリの他の遺伝子座と比べると、他のアドレスを通じて識別される異なる抗体を含みます。例えば、ある遺伝子座での抗体は改めてその唯一をコピーすること、或いは、唯一のマークから認識されます。対応ライブラリは核酸ライブラリの一種であり、遺伝子座ごとに一つの核酸分子を有します。その分子はその他のすべての遺伝子座の核酸分子と異なります。遺伝子座は一つの抗体ライブラリがあります。遺伝子座ごとには一つの抗体或いはその他と異なる抗体の一部、或いは、抗体ライブラリ内のその他の遺伝子座と異なる抗体を含みます。
核酸分子或いは抗体はマルチウェルプレートにおいて空間的な配列を行います。このため、軌跡プレートあたりに一つの抗体を対応します。マルチウェルプレートは12、24、48、96、384、及び1436マルチウェルプレートを含みますが、しかし、これらに限りません。こんなインスタントでは、マルチウェルプレートでの抗体のIDは既知です。当抗体はソリューションを解決する、或いは、ソリューションの解決に役立っています。例えば、当技術の長所の一つは抗体がソリューションの解決を提出するので、当ソリューションは完全に折りたたむとともに、機能化させます。タンパク質は濾過器、ベーンの表面、あるいはベーンに置かれる場合に、その活性の損失が消えたことが認知します。また、抗体である場合、当抗体は任意の目標活動をスクリーニングできます。
抗体はバイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めます。しかしながら、これらを限定しません。すべての抗体のIDが既知であるので、構造活性相関(SAR)の情報はすぐ利用されます。最後、スクリーニングを行う、或いは、「インパクト」を認識または導いて合成する過程に、薬物動態及び/用量反応実験を行います。
ほかの例では、核酸分子と抗体はマルチウェルプレートに空間的に配列できます。このため、すべての奇跡プレートは抗体対を対応します。こんなインスタントで、任意の特定のマルチウェルプレートにある抗体対のIDは既知です。抗体対は2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90,10あるいはさらに多い抗体、或いはさらに多い核酸分子を含めることができます。例えば、抗体或いは核酸分子はランダム或いはニーズに応えて分けられます。例えば、同じVファミリは同じ長さのCDR3のアルミ酸、長さ、或いはその他のすべての生化学属性を有します。抗体である場合、対処した抗体対は目標活動によって、スクリーニングできます。バイディング、細胞の毒性、分化或いは細胞の増殖、遺伝子表示の変化を含めますが、これらを限定しません。抗体ライブラリのスクリーニングにおいて、指定の時間内に、もっと多い抗体をスクリーニングできます。そのため、大部分の抗体の多様性をカバーしてしまいます。また、「インパクト」認識或いはコンビネーション引導を行います。コンビネーション内のすべての抗体のIDは既知であるので、現有の抗体は単一、個体の抗体はすぐコンビネーション内に認識され、その「活性」を確認できます。
核酸と抗体アレーは硬い支持体に固定されたそれらの抗体を含みます。例えばベーンに固定された抗体。例えば、付属物或いは硬い支持体に固定された(この限りでなく)濾過機、ベーン表面或いはセルロースの捺印及び親和性タグベーンの使用。いくつかの例では、変異細胞の表現ペブチドは自然にビーズを吸着することができます。これらのビーズあたりに一つのシングル細胞を有します(フリーマンetal.生物工学。Bioeng(2004)86:196−200)。固定ガラスの支持によると、シングル細胞のクローンを培養できます。色または蛍光気質でスクリーニングすることができます。米国特権番号6372483,6352842,6346416及び6242266を参照ください。
Sjolander,S.及びUrbaniczkyは(1991)Anal.Chem.63:2338−2345 and Szabo et al.(1995)Curr.Opin.結構と訳されます。生物学。5:699−705。Biacoreはタンパク質の相互作用及び親和力を測る方法です。当技術は光学現象のプラズモン共鳴(SPR)の表面によって、リアルタイムに標識なしのタンパク質の相互作用を監視できます。(Welford K.1991,Opt.Quant.Elect.23:1;Morton and Myszka,1998,酵素方法295:268)。性能比生物センサーは生物分子の相互作用をリアルタイムに観測する用であり、両方の親和力と動力学によって、集中、スクリーニング及び認識の積極性を確定します。
BIAcore分析は結合速度定数、解離速度定数、親和定数を便利に得られます。
他の表示方法他の非アドレス可能な形式にライブラリも提供できます。そのようなもので模範的他の非アドレス可能な形式が表示で、特に、いずれもスクリーンするのを容易にする活動か活動のためのライブラリのメンバーの書式を含みます。一般に、抗体ライブラリーにそのような形式を使用しますが、望んでいるなら、また、核酸かベクトルライブラリに提供できます。ライブラリ(表現型)とそれらをコード化する遺伝情報(遺伝子型)の個別分子の間の物理的なリンクがあるように、通常、ライブラリは、ディスプレー技術を使用することでスクリーンされます。これらの方法は、セル表示、ファージ提示法、mRNA表示、リボゾーム表示、およびDNAが表示するということを包含しますが、制限されない。
バクテリアE.coli、イーストS.cerevisiae、および哺乳類細胞を含むセルの表面に細胞表面で急送されるタンパク質でそれらを溶断することによって選別のための抗体ライブラリーを表すことができます。セル表示は、目標抗原の固定が不要である抗体ライブラリーをスクリーンするのに使用される技術です。代わりに、希望の抗体を特定するのに、蛍光活性化細胞分類などのテクニック(FACS)を使用できます。レーザー光線を通り抜けるとき、FACSは彼らの光散乱の特性に基づいてセルの分集団の分離を可能にします。米国が公開した特許出願番号の例を参照してください。E.coli外部の表面で以前に細菌表面に異種タンパク質を向けるために見せられたタンパク質にそれらを溶断することによって、単一のチェーン抗体を表現できます。
(Francisco et al.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:10444−10448).イースト菌の表面に単一のチェーンとFab抗体を表示できます、そして、形質転換細胞のライブラリを発生させるのにイーストの相同組換えを利用できます。e36).(seee.g.Kieke et al.,(1997)Prot.Eng.,10:1303−1310;Weaver−Feldhaus et al.,(2004)FEBS Lett.,564:24−34;and Swers et al.,(2004)Nucleic Acids Res.,32:e36).哺乳類細胞表示は、免疫グロブリンと同様にscFvライブラリをスクリーンるのに利用されました。(Ho et al.,(2005)J.Biol.Chem.,280:07−617).
ファージ提示法は選別抗体ライブラリーへの特定の抗原に付く彼らの能力に関する広く使用された方法です。ファージ提示法はタンパク質かペプチドが融合としてファージの表面で個別にコートタンパク質に急送されるセルベースの方法です;同じファージ粒子がファージのタンパク質かペプチドをコード化するDNAを運ぶ間(スミスG.P.(1985)科学228:1315−1317).ファージ選択は、タンパク質かペプチドためのDNAが回復されて、伝播されるか、または表現されるために特定のファージが隔離されて、クローンを作られるのを可能にして、タンパク質かペプチドの認識にかかわる特定の結合反応とを通して達成されます。ファージ提示法の使用は増幅と伝播のためのE.coliへの依頼ので急速であって、軽快です。典型的な使用法は、固定された抗原に対してファージライブラリーを撮影することを伴います。
mRNA表示とリボゾーム表示の使用は抗体ライブラリーの完全に生体外の建設を許可します。mRNA表示は新生タンパク質がプロマイシンリンクを通してmRNAに電子対を共有して付くことが引き起こされる、タンパク質かペプチドを表示する方法です(Roberts et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.64:12297−12302).プロマイシンは、aminacyl tRNAの物真似として機能して、リボゾームAサイトに入ります、そして、新生タンパク質はリボゾームのペプチジルトランスフェラーゼ活動でそれに電子対を共有して制限されています。選択がリボゾームの解離の後にこれらのタンパク質−mRNA融合に行われます。あるいはまた、リボゾーム表示はリボゾームの表面に初期のフォームにタンパク質かペプチドを表示する方法です、コード化するmRNAのある安定の複合体が形成されるように;複合体がタンパク質かペプチドのために配位子と共に選択されて、遺伝情報が孤立しているmRNAの逆転写によって得られる(United States Patent Nos.US 5,643,768 and US 5,658,754をみてください).選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾーム表示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。
DNA表示では、ペプチドをコード化するDNAは、ペプチドにリンクされます。非共有原子価のDNA表示では、それ自身のテンプレートのDNAと統合された複製配列の起源と同様にバクテリアのRepAタンパク質の認識でDNAタンパク質リンケージを促進します(Odegrip et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci,U.S.A.101:2806−2810).あるいはまた、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用できます。.共有原子価のDNA表示では、抗体フラグメントに遺伝学的に溶かされたバクテリオファージP2タンパク質は、それ自身のDNA配列に固まります(Reiersen et al.(2005)Nucl.酸Res。33:e10).あるいはまた、DNAとペプチドを分類できます、水中油型乳剤などのように。選択のテクニックは固定された抗原に対してリボゾu12540ーム表u31034示ライブラリが撮影されるファージ提示法のものと同様です。例えば、International Patent Publication No.WO98/037186.F.を参考してください。抗体の生成の方法
彼らは遺伝子合成、PCR、血管結紮、クローニング、移入、および浄化のテクニックを含む通常の分子生物学のテクニックを含んでいます。そのような手順の記述を以下に提供します。
ここに提供しているのは、再結合している抗体をコード化する核酸を含むベクトルかそれの部分です。抗体ポリペプチドをコード化する核酸は、原核生物のか真核セルの中への変化の前に通常中間的ベクトルにクローンされます。ベクトルのこの選択は希望のアプリケーション次第であることができます。例えば、核酸の挿入の後に、ベクトルは、例えば、レプリケーション、そして/または、それの表現のための再結合している抗体の遺伝子を拡張するために宿主細胞を変えるのに通常使用されます。
そのような例では、高い平らな表現に適したベクトルは使用されています。他の場合では、細胞表面における表現されたポリペプチドの表示と互換性があるベクトルは選ばれています。
一般的には、発現ベクターは、転写プロモーターおよび必要に応じエンハンサー、翻訳シグナル、転写および翻訳終止シグナルを含めることができます。安定な形質転換に便用される発現ベクターは、形質転換細胞の選択と維持を許す選択可能なマーカーを持ってます。いくつかのケースでは、レプリケーションの起源は、細胞内のベクトルのコピー数を増幅するために使用することができます。一般に、ベクトルも連結核酸分子(例えば、彼のタグ、フラグタグ)に手術可能にリンクされた付加的ヌクレオチド系列を含むことができます。一般に、目的のために、ここに、ベクトルは定常領域をコード化する系列を含んでいます。
したがって、タンパク質融合として再結合している抗体かそれの部分も表現できます。例えば、溶融は、ポリペプチドに追加機能性を加えるために発生できます。例えば融合タンパク質は、タンパク質分泌、そして/または、膜結合性を指示するための信号の系列の融合と、ローカライズ、例えば、his6タグ、mycタグ、または浄化のためのタグ、例えば、GST溶融、およびタンパク質分泌、そして/または、膜結合性を指示するための系列を包含しますが、制限されない。
プラスミドEは、カッパの軽いチェーンに特定であり、とここに説明された再結合している抗体の遺伝子のクローニング許容するためにNcoI制限サイトとAcrII Iを含んでいます。両方のベクトルはレプリケーションの3.3の起源、レプリケーションのColE1タイプの起源、および遺伝子の協議しているクロラムフェニコール耐性を含んでいます。上で説明されたベクトルは、軽いチェーンベクトルに重いチェーンベクトルに共同変成するデュアルなベクター系で利用されるように設計されています。したがって、それらは二つ異なってコンパチブル、利用したレプリケーションのColE1の起源をを含んでいます、重いチェーンと軽いチェーンのためにの2、1。ベクトルが共同変えられて、表されるとき、これは、抗体の両方のチェーンの効率的な発現を許容します。
ベクトルを含むセルも供給します。一般に異種のDNAを表現するために設計できて、分泌経路を持っているどんな細胞種類も、適当です。表現ホストは細菌性細胞(例えば、大腸菌)や、イースト菌や、真菌細胞や、古細菌や、植物細胞や、昆虫細胞やヒト細胞を含む動物細胞などの原核生物のと真核有機体を含みます。表現ホストは表現されたタンパク質に存在している翻訳後修飾のタイプとしてまた、彼らのタンパク質産生レベルにおいて異なることができます。さらに、表現ホストの選択は、ベクトル、転写、および使用した翻訳要素の選択にしばしば関連します。例えば、表現ホストの選択はしばしば、しかし、いつもでない系列が利用した先駆の選択に依存しています。例えば、同じ種の宿主細胞の中に多くの異種のシグナル配列を表すことができるだけです(すなわち、昆虫細胞シグナル配列は昆虫細胞の中に最適に表されます)。対照的に、他のシグナル配列は、次のような異種のホストで使用することができます、例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物宿主細胞とした組織プラスミノーゲン活性化因子プリ/プロのシーケンスだけで動作するヒト血清アルブミン(hHSA)シグナル配列昆虫および哺乳動物細胞内で機能することが実証され(Tanet a(2002)タンパク質工学。15:337)。これらと他の要素に基づいて表現ホストの選択をすることができます、浄化のための規定と安全問題や、生産費や、必要性や方法などのように;したがって、ベクター系は使用される宿主細胞と互換性があるに違いありません。
そのような模範的ベクトルは、プラスミドAを、表現と浄化のプラスミドC、プラスミドD、およびプラスミドE含む、ここに説明されたベクトルです。表現と浄化のオートメーションは高処理量式を容易にすることができます。例えば、自動収穫か溶解させるのと浄化ユニットか、他の同様のロボットシステムかまた全自動のシステムに細胞培養を合併するピッコロ・システムの使用は使うことができます。
大腸菌の変化は当業者によく知られている簡単で急速なテクニックです。大腸菌のための発現ベクターは高いレベルのタンパク質の発現を引き起こして、何らかの毒性を宿主細胞に示すタンパク質を急送することの役に立つ誘導プロモータを含むことができます。誘導性プロモーターの例は、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6のRNAのプロモーターとλPLプロモーター調節温度が含まれています。
いくつかの場合、ペリプラズム表現は表現されたタンパク質の漏出を培地の中に許容します。タンパク質の分泌は培養上清から迅速で簡単な浄化を許します。浸透性の病勢減退はペリプラズムから分泌されないタンパク質を入手できます。細胞表現と同様です、いくつかの場合、タンパク質が解決不能になることができて、変性剤と還元剤は、可溶化を容易にするのに使用されて、リフォールディングすることができます。誘導の温度と成長も表現レベルと溶解度に影響を及ぼすことができます。
25℃と37℃Cの間の温度は通常、使用されています。表現されたタンパク質の溶解度を増加させるのに突然変異も使用できます。通常、バクテリアはaglycosylatedタンパク質を生産します。したがって、タンパク質が機能のために糖鎖付加を必要とするなら、浄化の後に宿主細胞から糖鎖付加を生体外に加えることができます。
出芽酵母、***酵母、解脂耶氏酵母、マルシアヌスダニ、およびピキア酵母などの酵母は、組換え抗体またはその一部のための便利な表現のホストです。エピソーム複製ベクターか相同組換えによる安定した染色体の統合で酵母を変えることができます。通常、誘導プロモータは、遺伝子発現を規制するのに使用されます。そのようなプロモーターの例はCUP1などのAOX1、GAL1、GAL7、GAL5、および金属結合性蛋白質プロモーターを含んでいます。表現ベクターはしばしば変成しているDNAの選択とメンテナンスのためのLEU2や、TRP1や、HIS3や、URA3などの選択可能なマーカーを含んでいます。
イーストで表現されたタンパク質は、しばしば可溶性です。Bipやタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどの分子シャペロンがある共同表現は表現レベルと溶解度を改良できます。さらに、サッカロミセス酵母から酵母の接合型α−因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合とAga2p嵌合接着受容体などの酵母細胞表面タンパク質またはArxula adeninivoransグルコアミラーゼとの融合を使用することで酵母で表現されたタンパク質は指示できます。Kex−2蛋白酵素などの蛋白酵素切断部位、分泌経路を出るとき、表現されたポリペプチドから溶断された系列を取り除くために設計できます。酵母もAsn−X−Ser/Thrモチーフにグリコシル化することができます。
昆虫特にバキュロウイルス表現を使用して、昆虫細胞は抗体かそれの部分を表現することの役に立ちます。昆虫細胞は、
スには、安全を改良して、真核生物発現の規定の関心を減少させる制限している宿主域があります。典型的な発現ベクターはポリヘドリンプロモーターやバキュロ・ウイルスのp10プロモーターなどの高い平らな表現にプロモーターを使用します。一般的に使用されたバキュロウイルス系はタマナギンウワバ californicaの核多角体病ウイルス(AcNPV)や、カイコガ属のmoriの核多角体病ウイルス(BmNPV)などのバキュロ・ウイルスとSpodoptera frugiperdaから得られたSf9やTrichoplusia Niから得られたTNなどの昆虫細胞株を含んでいます。高レベルの発現において、表現されるべき分子のヌクレオチド系列はすぐに、ウイルスのポリヘドリン開始コドンの下流に溶断されます。人間の抗体を表現できるバキュロ・ウイルス組換え型、pAcUW51などの二重表現転送(PharMingen)を発生させるのは、利用されています。哺乳類の分泌シグナルを昆虫細胞の中で正確に処理して、培地の中に表現されたタンパク貿を分泌するのに使用できます。
細胞株もセル培地から分泌タンパク質の浄化を容易にする無血清培地に適合していた状態で利用可能です。その一例は血清の無料のEBNA−1細胞株(ファム他、(2003)Biotechno.Bioeng84:332−42)です。
溶解分、サイズの差動濾過、カラムクロマトグラフィー。
ここに提供しているのは、目標の活動を変更するか、または調節する(増減します)抗体か抗体を特定するか、または選択するためのここに提供されたスクリーニングするための抗体ライブラリーを使用する方法です。上で議論するように、ここに提供された抗体ライブラリーは、ライブラリーに他のすべてのメンバーとそれぞれ異なったメンバー1)そして、それぞれ生産的で機能的な2)を含みます。これらの特性によって、ライブラリは、スクリーニング機能に多様かつ堅牢です。例えば、提供されたライブラリを使用して、機能か活動を望んでいて、ここに、小ライブラリー(例えば、1000人以下のメンバーを含む)をスクリーニンして、抗体を特定するのは、可能です。これは960人のメンバーだけのライブラリが様々な目標に付くのにスクリーニング検定に使用された例13で例示されます、いくつかの高の親近感(ナノモルの親近感)抗体の識別をもたらして。
選別の方法で、ここに、含みますが限られないセルの他の結合、細胞毒性、分化または増殖を含んでいる細胞移動、アポトーシス、新脈管形成、および遺伝子発現変化のためにどんな希望の活動についても検査できます。例えば、治療標的に対してアゴニストか敵対者抗体の発見のために結果として起こるライブラリをスクリーニンできます、例えば細胞増殖と分化にかかわる目標や、細胞移動や、アポトーシスやangiogeneisなどのように。このような目標は、成長因子、サイトカイン、リンパ球抗原、他の細胞活性化と受容体をふくみますが限定されない。
ライブラリ・スクリーニングは、選別数百から数千に関する高処理量か同じスクリーニング検定で、より多くの抗体であるかもしれません。ここに抗体スクリーニングが希望の活動を持っている抗体メンバーを特定するのに当業者に知られているどんなテクニックも使用できます。典型的な高処理量スクリーンに関しては、マイクロタイタープレートのセットは発生されます、それによってマイクロプレートにおける各ウェルは異なったライブラリメンバーを含みます。例えば、プレートのあらゆるウェルが同じ抗体重鎖を含む抗体を含むところでプレートを作成できますが、各ウェルが異なった軽いチェーンを含むので、各ウェルの対にされた抗体(重くて軽いチェーン)はプレートの他のすべてのウェルの抗体と異なっています。すべてのウェルに次に、スクリーニング検定(例えば、標的タンパク質かセル、バッファ、分析評価試薬を表現するターゲットプロテイン、)を実行するのに必要な一定の要素に積んで、適切な時期のためにかえされて、選択の読み取りのために検査されます。シングルの浄化した標的分子またはセルを含む反応が、読み取りを与えるために十分であるところで結合があるか他の機能分析などの活動のための選別にこの方法を使用できます。
当業者に知られているどんな方法でも選択された目標を縛る彼らの能力のために、ここに提供された抗体ライブラリーはスクリーンできます。模範的目標抗原は以下で説明されます。結合アッセイは、溶液、懸濁液または固体支持体上で実行することができます。例えば、目標抗原を固定票(例えば、炭素、プラスチック表面またはチップ)に固定して、抗体で接触できます。
非結合抗体また標的タンパク質は、洗い流すことができる、結合複合体は、次に検出することができます。非特異的結合を抑える条件のもとで結合分析を実行できます、非イオン系洗剤(例えば、0.1%のトリトンX−100かトゥイーン20)がある高イオン強度バッファ(例えば、0.3−0.4M NaCl)を使用する、そして/または、タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンかゼラチン)ををブロックするのなどように。ネガティブコントロールは、背景の尺度の結合などのアッセイを含むことができます。.結合親和力は、スキャッチャードの分析を使用することで決定している場合があります。(マンソンet al、アナル.生物化学、107:220(1980))、ビアコアまたは当業者に知られている他の方法。
電荷撮像素子(CCDs)か光電子増培管やおよび同様のものなどの電子感知器の使用で目視により蛍光を検出できます。
同様に、適切な基板を酵素に提供して、得られた反応生成物を検出することによって、酵素のラベルは検出できます。単にラベルに関連している色を観測することによって、最終的に簡単な比色分析のラベルを検出できます。
科学的文学の分析は容易にセルがどんな希望の目標も表現するのが適当な選択を明らかにすることができます。表18はここに提供された抗体ライブラリーに対してここに機能的活動でスクリーンできる興味がある目標を表現する模範的セル線を記載します。
物理的であるか、化学的であるか表現型な変化の検出を許すどんな分析評価も使用することで細胞分化を分析できます。
様々な分析評価は、量的に外部刺激に対応して細胞増殖と起動を決定するのに使用されます。セル増殖分析は、細胞***で新たに統合されたセルのDNAに試薬を組み入れることによって量的に細胞増殖を決定するのに使用されます。そのような試薬は3H−チミジン、ブロモ−2分の5デオキシウリジン(BrdU)、および蛍光ヘキスト染料に含んでいますが、限られていません。染料でセルに染色して、染料がいくつのセル理解力を基礎づけたかを測定することによって細胞生存率アッセイは、細胞が染料を除くという事実でサンプルの正常細胞の数を測定するのに使用されます。そのような染料が3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−diphenyltetrazolium臭化(MTT)、2,3−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−2Hの−テトラゾリウム−5−carboxanilide内部塩(xtt)、4−[3−(4−ヨードフェニル)−2−(4−ニトロフェニル)−2Hの−5−tetrazolio]−1,3−ベンゼンジスルホン(WST−1)を含みますが限らない。試薬の取り込みは、いずれかの測色分光光度計を使用するか、またはシンチレーションカウンターで放射を測定することによって測定されます。これらのメソッドの詳細はよく、当業者に知られています。たとえば、例12は、細胞の増殖を評価するためにMTTの増殖アッセイを例証します。
生物反応を検出することによって、抗体による結合の検出、そして/または、目標の変調を実行できます、レポーター遺伝子の例えば、測定するCa2+イオン流出、cAMP、IP3、PIP3または転写などのように。また、処理の後のセル(レポーター遺伝子分析評価を使用するセルの遺伝子の1つ以上の表現の測定)の遺伝子型の分析は効力のインディケータか抗体の力として使用されます。ホールマークの遺伝子か、信号変換経路に関連しているように疑われたそれらの遺伝子は、扱われたものと同様に未処置のセルの中で測定されます。
直接アポトーシスかプログラム細胞死を引き起こすか、または増殖因子受容体、その結果事実上人目についている増殖を妨げることによって間接的にアポトーシスを引き起こす彼らの能力のために抗体をスクリーンできます。また、補体依存性細胞傷害(CDC)として知られている、ダイレクト細胞毒性に通じて、抗体は補数を結合します。したがって、補体依存性細胞傷害を評価するために分析評価を実行できます。
生体外に、補数と免疫がある効果細胞がないとき抗体依存性細胞傷害(ADCC)か補体依存性細胞傷害(CDC)によって引き起こされた細胞死を区別することを決定できます。したがって、細胞死のアッセイは、不活化血清(補体の存在下で、すなわち)と免疫エフェクター細胞の非存在下で熱を使用して実行することができます。
ここに提供された選別法で、抗体はどんな活動のためにもスクリーンされます、結合か他の機能的活動などのように、目標に対して。活動は、目標のアゴニストかアンタゴニスト活性であるかもしれません。スクリーニング法は、任意の企図目標に基づいて設計することができます。このようなターゲットの例は膜結合タンパク質、受容体とリガンド物;イオンチャネル、Gタンパク質共役型受容体、新規なエピトープ、および非タンパク質抗原を含みます。どんな活動も、評価できて、目標の興味がある機能です。当業者は、様々な目標の活動になじみ深く、そのような知られている活動に基づくスクリーニング検定を選ぶことができます。模範的目標のためのこれらの活動の多くが以下でここに例示されます。すべての目標のために結合活性を評価できます。
模範的目標は、特に多細胞生物の構成、分化、および維持における重要な役割を果たすことができる、膜結合タンパクと、受容体とそれの配位子です。これらの機能を妨げる抗体を特定するのは熟考されます。例えば、多くの個別細胞の運命(例えば、他のセルとの増殖、移動、分化、または相互作用)は、他のセルから受け取られた情報、そして/または、じかに接する環境によって通常決定されます。さまざまのセル受容体か膜結合タンパクによって順番に受け取られて、解釈される分泌されたポリペプチド(例えば、マイトジェン因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、およびホルモン)によってこの情報はしばしば伝えられます。これらの分泌されたポリペプチド、または、シグナリング分子は、通常それらの細胞外環境における動作の場所に達するようにセル分泌経路を通り抜けます。したがって、そのような目標(受容体か配位子)のいずれか以上に対する抗体の識別は重要な経路疾患を調節できます、その結果、病気を変調して、症状を改善します。
さらにも従うセクションは、ターゲットプロテインの活動と機能を例示します、模範的スクリーニング検定とその結果特定された抗体を含んでいます。ターゲットプロテインへの高い親近感を示す、そして/または、そうでなければターゲットプロテインの活動を調節する抗体を特定するために興味があるどんなターゲットプロテインに対して同様の分析評価を使うことができるのが理解されます。
a)ノッチ蛋白質
ノッチ蛋白質(ノッチ1はSEQ ID番号:2002により;ノッチ2はSEQ ID番号:2003により;ノッチ3はSEQ ID番号:2004により;ノッチ4はSEQ ID番号:2005により)は細胞間交流に決定的な役割を果している一方通行の膜貫通レセプター蛋白質であります。ノッチ族の細胞表面レセプターは各種の幹細胞と無差別前駆細胞など多種の細胞の上に、胎芽にせよ、出生後の自己更新組織にせよ、発見されます。Artavanは−Tsakonasなどの(1995)科学268:225−32をご参照に。例えば、人初代マクロファージは全てのノッチレセプターを搾り出し、マクロファージ差異化の間にノッチ3を選択的に増やします(Fungなどの(2007)循環、115:2948−2956をご参考に)。特に内皮細胞にも発見されたノッチ4は血管新生に役立ちます。ノッチはリンパ細胞の上にも存在します。ここでノッチシグナリングはリンパ細胞の成長や、成熟や、活性化や、転換などに参与します。
ここで提供されたのはノッチ1の活性を調節する抗体であるから、ノッチ1の発見や活性に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はノッチ1と結合親和力を持つ抗体を含みます。そのノッチ1は10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、10−11M、10−12Mまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
ここで提供されたアンチノッチ1抗体はせめて一つのCDRを有する抗体を含み、CDRはCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及び/またはCDRL3であります。例えば、CDRH1はGYTFTSYYMH(アミノ酸26−35、配列同一性番号は1512)であります;CDRH2はIINPSGGSTSYAQKFQG(アミノ酸50−66、配列同一性番号は1512)であります;CDRH3はEGYSSSWYDYFDY(アミノ酸99−111、配列同一性番号は1512)であります;CDRH3はeyyygsgsyyndyfdy(アミノ酸99−114、配列同一性番号は1509)であります;CDRL1はRASQSVSSNLA(アミノ酸24−34、配列同一性番号は1843)であります;CDRL1はRASQSVSSSYLA(アミノ酸24−35、配列同一性番号は1833)であります;CDRL1はRASQSはSWLA(アミノ酸24−34、配列同一性番号は1841)であります;CDRL2はGASTRAT(アミノ酸50−56、配列同一性番号は1843)であります;CDRL2はGASSRAT(アミノ酸51−57、配列同一性番号1833)であります;CDRL2はDASSLES(アミノ酸50−56、配列同一性番号は1841)であります;CDRL3はQQYNNWPPWT(アミノ酸8−98、配列同一性番号は1843)であります;CDRL3はQQYGSSPPWT(アミノ酸90−99、配列同一性番号は1833)であります;CDRL3はQQYんSYSPWT(アミノ酸89−98、配列同一性番号は1841)であります。ここで提供されたもう一つのCDRは以上の各CDRと比べて60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%またはその以上の配列同一性を発見します。
例えば、ノッチ1の活性を調節する抗体はIGHV1(たとえば、配列同一性番号1−43に規定されたもの)であるVH生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む延期配列によりコード化されたVHチェーンを含む抗体を含みます。またはIGHV1(例えば、配列同一性番号268−271に規定されたもの)であるDH生殖細胞セグメント、あるいはIGHJ4(例えば、配列同一性番号278または279に規定されたもの)であるJH生殖細胞セグメントであります。このような抗体はIGKV1(配列同一性番号286−316により規定されたもの)またはIGKV3(配列同一性番号332−350により規定されたもの)であるVκ生殖細胞セグメントからなる生殖細胞成分を含む塩基配列によりコード化されたVLチェーンを含む抗体をも含みます。またはIGKJ1であるJκ塩基セグメント(配列同一性番号356により規定されたもの)であります。このような抗体は上述の生殖セグメントの異形である生殖セグメントを含む塩基配列によりコード化された抗体をも含みます。異形の原因は、保守突然変異または他の突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にノッチ1と結合することであり、それに/または機能性活性を調節することであります。
ノッチ1に反する抗体の例はVHチェーンがIGHV1−46(例えば、IGHV1−46*01、IGHV1−46*02またはIGHV1−46*03)であるVH生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはIGHD3−10(例えば、IGHD3−10*01、IGHD3−10*02)であるDH生殖細胞セグメントであり、IGHJ4(例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)であるJH生殖セグメントであります。VLチェーンはIGKV3−15(例えば、IGKV3−15*01)や、IGKV3−20(例えば、IGKV3−20*01、IGKV3−20*02)や、またはIGKV1−5(例えば、IGKV1−5*01、IGKV1−5*02、IGKV1−5*03)であるVκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはIGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントであります。ノッチ1の活性を調節するここで提供された抗体の例は表18Cにより規定されます。
DLL4(配列同一性番号2010により規定され)はノッチ膜貫通レセプター用の膜貫通蛋白質リガンドであります。それは各種の組織内に幅広く発見されますが、その発見は圧倒的に血管系統に位置しています。DLL4はノッチ1とノッチ4レセプターを活性化します。それは正常の血管発育に対して必要であり、腫瘍血管の上に発見されます。それは腫瘍血管新生の間に血管内に上向き調節され、その発見はVEGFシグナリングを頼りにします。血管新生内皮細胞の上のDLL4発見は血管新生を生産的に進ませることにより血管発育の消極的な調節器のように働きます(Ridgwayなどの(2006)自然、444:1083;Noguera−Troはeなどの(2006)自然、444:1032をご参考に)。それは内皮細胞の増殖を抑制するように働きます。しかしながら、DLL4の妨害は血管の伸ばしや別れを特徴にする血管新生の増加と、血管機能の減少と、その結果としての腫瘍成長の低滅に関わります(Ridgwayなどの(2006)自然、444:1083;Noguera−Troはeなどの(2006)自然、444:1032を参考に)。
これで、DLL4機能は腫瘍成長と腫瘍血管密度の切離しに関わります。DLL4は炎症誘発刺激物に暴露された活性化マクロファージの上にも発見されます。刺激物はリポ多糖や、インターロイキン−1βや、Toll様レセプター4リガンドや、他の炎症誘発刺激物を含みます。ノッチ通路を通過するDLL4のシグナリングはマクロファージ活性化を特徴としての炎症状況に加担します(Fungなどの(2007)循環、115:2948−2956をご参考に)。
FolkmanなどのJ.Biol.Chem.267:10931−34(1992);KlagsbrunなどのAnnu.Rev.Physiol.53:217−39(1991);Garner A.、眼疾病理生物学における「血管疾患」、動態方法、Garner A.、Klintworth GK、eds.、第二版(Marcel Dekker、NY、1994)、ページ1625−1710。
それに加えて、これらの抗体またはその部分は非腫瘍異常の治療に使用されます。非腫瘍異常は望まれないまたは異常肥大や、関節炎や、リウマチ関節炎(RA)や、乾癬や、乾癬性歯垢や、類肉腫症や、動脈硬化や、動脈硬化性歯垢や、心筋梗塞による浮腫や、糖尿病と増殖網膜症(早期網膜症)や、後水晶体線維形成や、血管新生緑内症や、加齢黄斑変性や、糖尿病黄斑浮腫や、角膜血管新生や、角膜移植血管新生や、角膜移植拒絶や、網膜/脈絡血管新生や、隅角血管新生(虹彩)や、眼血管新生疾患や、血管再狭窄や、脳動静脈畸形(AVM)や、髄膜腫や、血管腫や、血管線維腫や、甲状腺肥大や(グレーブス病を含み)や、角膜及びほかの組織移植や、慢性炎症や、肺炎や、急性肺損傷/ARDSや、敗血症や、初期肺高血圧や、悪性肺液浸出や、脳浮腫(例えば、急性発作/閉塞性頭部損傷/創傷に関わる場合)や、滑膜性炎症や、RA内のパンヌス形成や、骨化性筋炎や、肥大骨形成や、変形性関節症(OA)や、難治性腹水や、多嚢胞性卵巣症候群や、子宮内膜症や、液体病の第三間隔(膵炎や、隔壁腔症候群や、火傷や、大腸疾患や)や、子宮筋腫や、早産や、IBD(クローン病と潰瘍性大腸炎)などの慢性炎症や、同種移植腎拒絶や、炎症性大腸疾患や、ネフローゼ症候群や、望まれないまたは異常組織塊生長(非癌)や、肥満や、脂肪組織塊生長や、血友病関節や、肥大傷跡や、髪成長抑制や、オースラ−ウェバー症候群や、化膿性肉芽腫後水晶体線維形成や、強皮症や、トラコーマや、血管癒着や、滑膜炎や、皮膚炎や、子癇前症や、腹水や、心膜液浸出(例えば、芯膜炎に関わり)や、肋膜液浸出などを含みます。
ここで提供された抗体はDLL4活性を調節しますので、DLL4の発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はDDL4と結合親和力を持つ抗体を含みます。このDDL4は10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、10−11M、10−12Mまたはその以下であり、特にナノモルまたはサブナノモルと合親和力を持っています。
典型的な変形は配列同一性番号3736により規定されたDH域におけるアミノ酸置換に対応するG1K、G1R及び/又はG5Tであります(配列同一性番号1803により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにおけるアミノ酸置換G100K、G100R及び/又はG104Tにも対応します)。例えば、ここで提供された抗DLL4抗体は、配列同一性番号3737に規定されたアミノ酸残留物に対応する(配列同一性番号1513に規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにより規定されたアミノ酸残留物S102、S103及び/またはS104にも対応します)S3、S4及び/またはS5の位置における変形を含むDH域をコード化するIGHD6−6*01の変形体からなる生殖細胞セグメントを含むVHチェーンを含むことができます。変形は他の任意のアミノ酸残留物に対するものであり、特にアラニン(A)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)であります。このような変形の例は配列同一性番号3737により規定されたDH域におけるアミノ酸置換に対応するS3A、S4P、S5F及び/又はS5Aであります(配列同一性番号1513により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンにおけるアミノ酸置換S102A、S103P、S104F及びS104Aにも対応します)。
典型的な変形は配列同一性番号3738により規定されたJH域におけるアミノ酸置換に対応するH6F及びH6Yであります(配列同一性番号1513により規定された抗DLL4ヒットのVHチェーンのJH域におけるアミノ酸置換H111F及びH111Yにも対応します)。表18Eにリストされたのは抗DLL4ヒットのVHチェーンのJH域における一つ又はその以上の変形を含む典型的な抗DLL4抗体の変形体であります。
EGFR(ErbB−1)、HER2/c−neu(ErbB−2)、Her3(ErbB−3)及びHer4(ErbB−4)を含むグループIレセプターチロシン・キナーゼは、上皮細胞の、間葉細胞の及び神経細胞の組織において広く発見され、増殖と差異化において根本的な役割をします。彼らは様々にレセプターと結合する一族のリガンドにより活性化されます。例えば、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子アルファー(TGF−alpha)、アンフィレグリンはErbB1と結合しますが、他のレセプターとは結合しません。ニューレグリンはErbB3及びErbB4に結合します。最後に、b−セルリン(BTC)、ヘパリン結合EGF、エピレグリンはErbB1及びErbB4に結合します。ErbB2は特徴付けのリガンドを持っていませんが、他のErbB族のメンバーと一緒にヘテロ二量体化により転送される間にホモ二量体化により活性化されることができます。
(EGFR)
上皮成長因子レセプター(配列同一性番号2000により規定されたEGFR、ErbB−1、人体におけるHER1)は、細胞外蛋白質リガンドの上皮成長因子族(EGF族)の成員を受け入れる細胞表面レセプターであります。リガンド上皮成長因子(EGF)と結合したら、EGFRは二量体化し、その固有細胞内蛋白質チロシン・キナーゼ活性を刺激します。この自己リン酸化は幾つかのほかの蛋白質による下流活性化とシグナリングを誘発します。これらの蛋白質は自分のホスホチロシン結合SH2ドメインを通じてリン酸化チロシンに関連します。これらの下流シグナリング蛋白質はMAPKやAktやJNK経路など幾つかのシグナル転換カスケードを始め、DNA合成及び細胞増殖を引き起こします。これらの蛋白質は細胞変形、癒着、増殖など表現型を調節します。そのゆえ、EGFR発見または活性に影響を及ぼした変形は癌を引き起こします。
EGFRの向上調節は間違った癌予知に関連します。ERBITUX▲R▼(セツキシマブ)は大腸直腸及び/又は頭頚部腫瘍の治療に対して認可されたキメラ型モノクローナル抗体であります。ERBITUX▲R▼はEGFRに結合し、DNA合成及び細胞増殖に関連する細胞内シグナリングを防止します。VECTIBIX▲R▼(パニツムマブ)はEGFR発見の転移性結腸直腸癌の治療に対して認可された完全人モノクローナル抗体であります。ERBITUX▲R▼もVECTIBIX▲R▼も、単独にせよ、化学療法薬と共同にせよ、使用されます。
EGFRに反する抗体の例はVHチェーンがIGHV1−46(例えば、IGHV1−46*01、IGHV1−46*02またはIGHV1−46*03)であるVH生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体であります。またはIGHD2−15(例えば、IGHD2−15*01)であるDH生殖細胞セグメント、IGHJ2*01またはIGHJ4(例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)であるJH生殖セグメントであります。VLチェーンはIGKV1−5(例えばIGKV1−5*01、IGKV1−5*02、IGKV1−5*03)又はIGKV3−15(例えば、IGHV3−15*01)であるVκ生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。またはIGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントであります。EGFR活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Cにより規定されます。
HER2/neu(配列同一性番号1999により規定されたErbB−2)は、細胞成長及び差異化を引き起こすシグナル転換経路に通常に関わる細胞薄膜表面結合のレセプターチロシンキナーゼであります。ErbB−2はEGF族の何のものにも活性化されませんので、オーファン・レセプターだと思われています。しかしながら、ErbBレセプターはリガンド結合の上に二量体化しますが、ErbB−2はErbB族のほかのメンバーに対して優先の二量体化パートナーであります。ErbB2はキナーゼ活性化及び細胞増殖を引き起こします。Erb8−2は乳癌の発病に関わりますから、治療の標的として注意すべきであります。実は、25−30%の初期乳癌にErbB−2蛋白質の過剰発現が見つかりました。HERCEPTIN▲R▼(トラスツズマブ)は組み合えDNAから得る人モノクローナル抗体であり、選択的にErbB−2の細胞内ドメインに結合する乳癌の治療に使用されます。なので、ErbB−2はもう一つの蛋白質治療法における注目すべき標的であります。Carterなど、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89:4285−4289;アメリカパテント番号5、725、856をご参考に。
ここで提供されたのはErbB−2の行動を調整する抗体であるから、ErbB−2の発見や行動に関わる病気または状況の治療に使用されます。この抗体は、生殖細胞系セグメントからなる塩基順列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを有する抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。
この抗体はErbB−2と結合親和力を持つ抗体を含み、または10−6M、10−7M、10−8M、10−9M、10−10M、10−11M、10−12Mまたはその以下で、ナノモルまたはサブナノモルの結合親和力を持っています。
ここで提供された抗ErbB−2抗体はCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及び/またはCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGGSはSGGYYWS(配列同一性番号1760によるアミノ酸26−37)であります、CDRH1はGYTFTSYYMH(によるアミノ酸26−35配列同一性番号:1512);CDRH1はGFSLSTSGVGVG(によるアミノ酸26−37配列同一性番号:1559);CDRH1はGGTFSSYAは(によるアミノ酸26−35配列同一性番号:1522);CDRH2はYIYYSGSTYYNPSLKS(によるアミノ酸52−67配列同一性番号:1760);CDRH2はIINPSGGSTSYAQKFQG(によるアミノ酸50−66配列同一性番号:1512);CDRH2はLIYWNDDKRYSPSLKS(によるアミノ酸52−67配列同一性番号:1559);CDRH2はGIIPIFGTANYAQKFQG(によるアミノ酸50−66配列同一性番号:1522);CDRH3はEGYSSSWYDYFDY(によるアミノ酸100−112配列同一性番号:1760);CDRH3はGYSGSYYYWYFDL(によるアミノ酸99−111配列同一性番号:1512);CDRH3はEEYSSSSAEYKQH(によるアミノ酸99−111配列同一性番号:1513);CDRH3はRPNWGYWYFDL(によるアミノ酸100−110配列同一性番号:1559);CDRH3はGYNWNDDYYYYYGMDV(によるアミノ酸99−114配列同一性番号:1522);CDRL1はRASQSVSSSYLA(によるアミノ酸24−35配列同一性番号:1833);CDRL1はKSSQSVLYSSNNKNYLA(によるアミノ酸24−40配列同一性番号:1838);CDRL1はRASQSVSSNLA(によるアミノ酸24−34配列同一性番号:1843);CDRL1はRSSQSLVYSDGNTYLN(によるアミノ酸24−39配列同一性番号:1828);CDRL2はGASSRAT(によるアミノ酸51−57配列同一性番号:1833);CDRL2はWASTRES(によるアミノ酸56−62配列同一性番号:1838);CDRL2はGASTRAT(によるアミノ酸50−56配列同一性番号:1843);CDRL2はKVSNDRS(によるアミノ酸55−61配列同一性番号:1828);CDRL3はQQYGSSPPWT(によるアミノ酸90−99配列同一性番号:1833);CDRL3はQQYYSTPPWT(によるアミノ酸95−104配列同一性番号:1838);CDRL3はQQYNNWPPWT(によるアミノ酸89−98配列同一性番号:1843);やCDRL3はMQGTHWPPWT(によるアミノ酸94−103配列同一性番号:1828)。以上の各CDRに対して60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
IGF−R1(インスリン様成長因子1レセプター)
インスリン様成長因子1レセプター(配列同一性番号2007により規定されたIGF−R1)は、インスリン様成長因子1(IGF−1)及びインスリン様成長因子2(IGF−2)により活性化された膜組織貫通レセプターであります。インスリン様成長因子レセプター1の過剰発見は幾つかの癌細胞系及び腫瘍組織に見つかりました。IGFR1の過剰発見は40%の乳癌細胞系に(Pandiniなど、(1999)Cancer Res.5:1935をご参考に)、15%の肺癌細胞系に見つかりました。乳癌腫瘍組織において、IGFR1は6−14倍まで過剰発見され、正常の組織より2−4倍高いキナーゼ活性を示します(Websterなど、(1996)Cancer Res.56:2781及びPekonenなど、(1998)Cancer Res.48:1343をご参考に)。それに、報告によりますと、大腸直腸癌組織は強く高まったIGFR1レベルを示します(Weberなど、Cancer95(10):2086−95(2002)をご参考に)。正常の子宮膣部細胞と比べて、初期頚部癌細胞培養及び頚部癌細胞系に対する分析はそれぞれ3倍及び5倍のIGFR1過剰発見を示します(Stellerなど、(1996)Cancer Res.56:1762をご参考に)。滑膜肉腫細胞におけるIGFR1の発見は攻撃表現型と関連します(つまり、腫瘍移転及び増殖の高い比率;Xieなど、(1999)Cancer Res.59:3588をご参考に)
C−Met(又は配列同一性番号2001により規定された肝細胞成長因子レセプターHGFR)上皮由来の細胞(幹細胞及び前駆細胞を含み)において見つかった薄膜レセプターであります。c−Metはそのリガンドである肝細胞成長因子(HGF)により刺激される時、幾つかの生物学反応を引き起こし、それは又有糸***形成や運動形成や器官形成など侵入成長を誘発します。
ここで提供された抗c−Met抗体はCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及び/又はCDRL3であるCDRをせめて一つ持っている抗体を含みます。例えば、CDRH1はGFTFSSYAMS(配列同一性番号によるアミノ酸26−35)であります、CDRH2はSはGSGGSTYYADSVKG(によるアミノ酸50−66配列同一性番号:3353)、CDRH3はEHIVVVIAはYYYYYYGMDV(によるアミノ酸99−118配列同一性番号:3353)、CDRH3はEDIVVVPAAMSYYYYYYGMDV(によるアミノ酸99−119配列同一性番号:3347)、CDRH3はEDIVLMVYAはYYYYYYGMDV(によるアミノ酸99−119配列同一性番号:3349)、CDRH3はEDIVVVVAATSYYYYYYGMDV(によるアミノ酸99−119配列同一性番号:3351)、CDRL1はQGDSLRSYYAS(によるアミノ酸22−33配列同一性番号:1870)、CDRL2はGKNNRPS(によるアミノ酸49−55配列同一性番号:1870)、やCDRL3はNSRDSSGNHLVV(によるアミノ酸88−99配列同一性番号:1870)。以上の各CDRに対して60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
CD20(配列同一性番号2011により規定された人Bリンパ球限定差異化抗原であるBp35)はプレB及び成熟Bリンパ球に位置する恐水病膜組織貫通蛋白質であります。CD20は周辺血液又はリンパ系器官からの90%以上のB細胞の表面に見つかり、早期プレB細胞形成の間に発見され、形質細胞差異化まで止まります。CD20は正常のB細胞にも悪性B細胞にも存在します。特に、CD20は90%以上のB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)に発見されますが(Andersonなど(1984)Blood63(6):1424−1433)、造血幹細胞や、ブプレB細胞や、正常の形質細胞や、または他の正常の組織には見つかりません(Tedderなど(1985)J.Immunol.135(2):973−979)。CD20はNHLなどの腫瘍細胞にも発見されます。
エリスロポエチン(配列同一性番号2009により規定されたEpo)は赤血球系前駆細胞の増殖及び差異化を引き起こす糖蛋白質ホルモンであります。Epoは成熟赤血球細胞を形成させる赤血球系前駆細胞の成長や差異化や残存を促進するという責任を負います。血液及び組織における酸素レベルの変化に対して反応する時、エリスロポエチンは未熟赤芽球の増殖と差異化を刺激しそうであります。それは、成長因子としても働き、赤血球系前駆細胞の有糸***活性(例えば、赤血球激発及び群落を形成させるユニット)を刺激します。これは差異化因子としても働き、赤血球群落を形成させるユニットから前赤芽球への転換を誘発します(Erslev、A.、New Eng.J.Med.、316:101−103(1987)をご参考に)。
Epo活性はエリスロポエチン・レセプター(Epや)と呼ぶ細胞表面レセプターの結合と活性化を通じて調節されます。リガンドがない場合に、Epoレセプターは行われた二量体に存在します。Epoがそのレセプターとの結合は構造変化を引き起こします。例えば、細胞質ドメインが互いに近く置かれます。「二量化」がレセプターの活性化に役立つという考えは不十分な理解であります。
Epoレセプターの活性化は複数の生物学効果を引き起こします。これらの活性の一部は増殖の刺激や、差異化の刺激や、細胞死亡の抑制やを含みます(U.S.Pat.No.6、319、499、Liboiなど、PNAS USA、90:11351(1993)、Koury.Science、248:378(1990)をご参考に)。エリスロポエチン・レセプターの欠陥は赤白血病と一族性赤血球増加を引き起こすことができます。
ここで提供された抗体はEpや活性を調整しますので、Epやの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はEGFRと結合親和力を持つ抗体を含みます。このEpやは10−6M、10−7M、108M、10−9M、10−10M、10−1M、10−12またはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
異形の原因は、保守突然変異または他の塩基突然変異であります。ただし、条件は生じられた抗体は機能性または生産性の抗体である上にEpやと結合することであり、それに/または機能活性を調整することであります。
カドヘリンは一群のカルシウムによるタイプ1の膜組織貫通の糖蛋白質であり、細胞癒着にかかわり、組織内細胞の相互結合を確保します。多数の群のカドヘリン分子があり、Nカドヘリンや、Eカドヘリンや、Pカドヘリンを含みますが、それらに限りません。この一族のメンバーはカルシウムによる同種親和性相互作用を示し、選択性の細胞間認識及び癒着に責任があります。
それは器官形成の間に様々の細胞タイプを適切な位置に配置します。カドヘリンは多細胞構造の統合を維持することに重要な役割をもします。胎芽形態形成の間に、カドヘリン一族の多様なメンバーの発見は空間的に臨時的に制御され、様々の細胞タイプを機能構造へ順序に組み立てることを促進します。カドヘリンは癌の細胞連結及び転移細胞において重大な役割をすると思われます。
P−カドヘリン(配列同一性番号2008により規定されたP−cad)は胎盤において見つかった単スパンタイプ1膜組織貫通糖蛋白質であり、E−カドヘリン(上皮カドヘリン、E−cad)と異形同源であります。P−cadもE−cadもアルファ−カテニンによる細胞骨格と相互に作用します。他のカドヘリンのように、P−カドヘリンは上皮細胞間癒着に役割をします。他の主な役割は細胞表現型の決定及び細胞動態との関連を含みます。細胞動態は腫瘍細胞の移転及び散布を含みます。上皮組織におけるP−cadの発見は細胞群を増殖活性に参与させそうであり、細胞差異化に従って減少します。
ここで提供された抗体はPカドヘリン活性を調整しますので、Pカドヘリンの発見または活性に関連する疾患や症状やの治療にも使われることができます。このような抗体は、生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されたVHチェーンとVLチェーンを持っている抗体、またはそれから最適化された抗体を含みます。その一例はFab抗体であります。この抗体はさらに定常域を含みます。この抗体はPカドヘリンと結合親和力を持つ抗体を含みます。このPカドヘリンは10−6M、10−7M、108M、10−9M、10−10M、10−1M、10−12Mまたはその以下であり、ナノモルまたはサブナノモルと結合親和力を持っています。
以上の各CDRに対して60%、65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はその以上の配列同一性を示したCDRもここで提供されます。
Pカドヘリンに対する典型的な抗体は、VHチェーンが以下の生殖セグメントからなる塩基配列によりコード化される場所である抗体を含みます。IGHV1−46(例えば、IGHV1−46*01、IGHV1−46*01、又はIGHV1−46*03)又はIGHV3−23(例えば、IGHV3−23*01、IGHV3−23*02、IGHV3−3*03、IGHV3−23*04、IGHV3−23*05)であるVH生殖細胞セグメントや、IGHD3−10(例えばIGHD3−10*01、IGHD3−10*02)又はIGHD6−13(例えば、IGHD6−13*01)又はIGHD7−27*01であるDH生殖細胞セグメントや、IGHJ3(例えば、IGHJ3*01、IGHJ3*02)や、IGHJ4(例えば、IGHJ4*01、IGHJ4*02、IGHJ4*03)や、IGHJ6(例えば、IGHJ6*01、IGHJ6*2、IGHJ6*03、IGHJ6*04)や、IGHJ2*01であるJH生殖細胞セグメントや、又は配列同一性番号3458及び3461によりそれぞれに規定されたJH域をコード化するこれらの組換え形式(例えば、配列同一性番号3452及び3455により規定されたもの)であります。VLチェーンは以下の生殖細胞セグメントからなる塩基配列によりコード化されます。IGKV1−5(例えば、IGKV1−5*01、IGKV1−5*02、IGKV1−5*03)、IGKV1−39*01、IGKV3−15(例えば、IGKV3−15*01)、IGKV3−20(例えば、IGKV3−20*01、IGKV3−20*02)又はIGKV3−11(例えば、IGKV3−11*01、IGKV3−11*02)であるVκ生殖細胞セグメントや、IGKJ1*01であるJκ生殖細胞セグメントや、IGLV3−19*01であるVλ生殖細胞セグメントや、ILGJ2*0であるJλ生殖細胞セグメントであります。Pカドヘリン活性を調節する、ここで提供された典型的な抗体は表18Jにより規定されます。
配列ID番号:2006に記載されているCD44は、細胞間作用、細胞接着、および細胞移動に関与している細胞表面内在性膜糖タンパク質です。CD44遺伝子の転写物は、選択的かつ複雑なスプライシングを経て、様々な機能性アイソフォーム変異を生み出します。CD44は様々なアイソフォームで多種多様な細胞種類の表面で発現されるタンパク質です。最小のアイソフォームである標準CD44(CD44s)は、様々な細胞で発現されるほか、細胞外基質成分への細胞接着を仲介したり、リンパ球や単球の活性化に共同刺激を与えたりすると見なされます。一方、細胞外領域でv6ドメイン(CD44v6)を含むCD44のスプライス変異の発現は上皮のサブセットに限ります。
CD44は、ヒアルロン酸の受容体で、E−セレクチンおよびL−セレクチンなどの他のリガンドと、またオステオポンチン、コラーゲン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)などの他のリガンドと相互作用することができます。MMPは、血管壁の強度を維持するタンパク質を分解させ、内皮細胞が間質マトリックスに漏れ出、血管形成の発生につながります。MMPを抑制することによって、新生毛細血管の形成が防止されます。CD44はヒアルロン酸と相互作用し、細胞接着を仲介します。この相互作用を混乱させる治療はいくつかの病状の治療に採用できます。
“ヒット”が取得された後、セクションCで記述された方法で、本書で取り上げられる分析方法を適用するための新規ライブラリーを作成することができます。抗体がアドレス可能な形式で記載されているおかげで、”ヒット”を取得するだけで活性と構成の関係性をすぐに特定、測定することができます。たとえば、”ヒット”が取得される直後に、エンコードされた抗体のコンポーネント生殖細胞系セグメントが特定されます。その後に、特定された”ヒット”に関連する生殖細胞系セグメントから派生した核酸分子によってエンコードされた抗体を含む新規作成のライブラリーを作ることができます。生殖細胞系セグメントは普通に、配列類似性で関連しているが、その他に、CDR、指向性ペプチド、あるいはそれ以外の生化学的性質によって関連していることもあります。
本書のスクリーニング方法によって特定された抗体の”ヒット”が突然変異生成などによって変更され、変更された抗体のライブラリーを作成することができます。そして、機能性が高まった(例えば向上した結合性や安定性、延長したインビボ安定性、および/また向上した機能的活性の調節性)1つあるいはそれ以上の例を特定するために、変更された抗体を測定します。特定のタンパク質に対する向上した機能性を検索、選択するために、新たに変更された”ヒット”のライブラリーを作成することができます。ライブラリーはアドレス可能な形式、または上記に説明された他の表示形式で検索することができます。たとえば、より厳格かつより高度な結合や洗浄の条件を採択することなどによって、2番目のライブラリーでより高親和性結合タンパク質を特定することができます。その他のスクリーニング技術を利用することもできます。
抗体と抗原がCDRの残基によって結合されます。ですから、CDR突然変異誘発は広く、抗体のFabおよびFv断片の親和性を向上させるのに利用されます。ランダム変異導入法には例えば、E.coli XL1red、UV放射、または脱アミノ化、アルキル化、あるいは塩基類似突然変異原などによる化学修飾、またはDNAシャフリング、カセット式変異誘発、部位特異的なランダム変異導入法、変異性PCRなどのPCR法(例えば、米国出願2006−0115874号を参考)、あるいはGeneMorph PCRによるランダム変異導入キット(Stratagene)、あるいは多様化ランダム変異導入キット(Clontech)など、市販のランダム突然変異誘発キットを利用する方法があります。多様化ランダム変異導入キットでは、反応混合物のdGTP、およびマンガン(Mn2+)の量を変更することによって、特定のDNA配列の変異率を調整することができます。増加するマンガンの量は当初、突然変異率を引き上げます。これは増加したdGTPの濃度がもたらしたより高い突然変異率によります。PCRを再び行うことによって突然変異率をさらに高めることができます。以上の全てのアプローチはCDR突然変異の抗体の発現ライブラリーの作成、およびよりいいバインダーの選択が必要です。突然変異生成による指向タンパク進化への様々なアプローチのいずれも採択することができます。このアプローチのいずれも、あるいは組み合わせたアプローチでリード抗原を変更させ、希望の特性を持たせることができます。当分野で知られているいかなる方法でリード抗体を変更、修飾することができます。
典型的な例で、飽和突然変異誘発法はCDRの残基が可能なアミノ酸の全ての20個に突然変異を起こさせる場合に利用されます(例えば、the Kunkle method,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media Pa.および米国特許6,562,594号を参考)。この方法では、選択されたアミノ酸をエンコードする希望のコドンでヌクレオチドがランダム化された縮重変異原性オリゴヌクレオチドプライマーが合成されます。典型的な無作為化方式には、NNS−あるいはNNKNランダム化があるが、ここで、Nはいかなるヌクレオチドを、Sはグアニン、あるいはシトシン、およびKはグアニン、あるいはチミンを表しています。縮重変異原性プライマーは一本鎖DNAテンプレートにアニールされ、そしてテンプレートの相補鎖を合成するためにDNAポリメラーゼが添加されます。ライゲーション後、二本鎖DNAテンプレートを増幅するためにE.coliに変化されます。また、単一アミノ酸の変更は、QuikChange(Stratagene)など、市販の部位特異的突然変異誘発キットを利用し行われます。他の実施形態では、当分野で一般に知られている部位特異的アミノ酸変異の方法を利用することができます。
変異性PCRによって、特定の核酸配列にランダム突然変異を導入することができます(例えば、Hawkins et al.,(1992年)J.Mol.Biol.226(3):889−96を参考)。簡単に言えば、変異性PCRは複製の正確さに悪影響を与える条件の下で行われるので、当業者の能力をもってランダム突然変異が導入されます。生成後、このランダムな変異体を遺伝子表示形式に配置、パンに置かれ、そして評価されます。
E.coli mutD5 またはEpicurian Coli▲R▼ XL1−Red Competent cells(Stratagene,La Jolla,Calif.)などの突然変異誘発株は、プラスミド複製中に、単一ヌクレオチド点変異を含む抗体ライブラリーを作成するのに利用されます。そして、遺伝子表示形式を利用し、生物学的活性に基づいてランダム変異体ライブラリーを分析します。
DNAシャフリングリードによってリード抗体の活性を調節することができます。DNAシャッフルで、変異DNA分子が生成される方法には、インウィトロ相同的組み換え、あるいは親DNAの不規則分解があり、そしてその後に次ぐPCRを利用した再組み立てによって、不規則点変異の導入という結果につながります(例えば、Stemmer(1994年)Nature 370:389−391、Stemmer(1994年)Proc.Natl Acad.Sci.USA 91:10747−10751、米国特許5,605,793号と5,811,238号と5,830,721号、および国際出版WO95/022625号とWO97/20078号を参考)。対立遺伝子多型、あるいは多種のDNA分子などの親DNA分子のファミリーを利用することによって、プロセスの機能性を増やすようにこの方法を変更することができます。希望の活性の選択あるいはスクリーニング、またそれに次ぐ突然変異生成の追加的な繰り返しおよび分析では、希望の突然変異誘発を決めながら、有害な変化を裂けて選択することが可能なので、配列の急速な”進化”を促します。
別の例では、より高い親和性抗体の生成、あるいは選択は、第三免疫選択プロセスを模倣するCDRウォーキング突然変異によって行われます。たとえば、抗体のCDRの飽和突然変異を介して繊維状バクテリオファージの表面上に表示される1つあるいは複数の抗体断片のライブラリーを作成し、そして固定した抗原を利用して重要な抗体を選択します。そして、逐次および並列最適化戦略によって最も高い親和性の抗体を選択できます(例えば、Barbas et al.(1994年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3809−3813、およびYang et al.(1995年)J.Mol.Biol 254(3):392−403を参考)。
フレームワーク領域または定常領域で変異を起こさせ、抗体の半減期を延ばすことができます。フレームワーク領域あるいは定常領域で変異を起こすことはまた、抗体の免疫原性を変更するため、特定の分子への共有結合あるいは非共有結合サイトを提供するため、あるいは補体結合やFcR結合や抗体依存性細胞毒性の特性(ADCC)を変更するために行われます。単一抗体は、1つあるいは複数のCDR、あるいは可変領域のフレームワーク領域、あるいは定常領域で変異を持つことが可能です。例えば、PCT公開WO00/09560号、Ewert et al.(2003年)Biochemistry 42(6):1517−1528、Ewert et al.(2004年)Methods 23(2):184−99、およびKnappik et al.(1995年)Protein Engineering 8:81−89を参考。
“ヒット”が出たら、その結合エピトープを決定することができる。したがって、ここで提供される抗体ライブラリーによって、既知抗原内の未知のエピトープ、あるいは未知抗体内の新たなエピトープ(例えば癌細胞株)など新たなエピトープを特定することができます。エピトープマッピングの方法は当業者に知られています(例えば、Olwyn M.R.Westwood and Frank C.Hay.Epitope Mapping.オックスフォード大学出版局2001年、Sigma Catalog # Z373990 Epitope Mapping Protocols:Methods in Molecular Biology,Vol.66を参考)。抗体によって特定されるエピトープのマッピング方法には、BIAcoreあるいはELISAを利用した結合分析(Reineke et al.1999年)、ELISPOT、予測ソフトウェア、表面台(例えばタンパク質チップ)でのペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成そしてその後に抗体表面への露出、タンパク抗原配列から由来するペプチドライブラリーのファージ提示法、質量分析法、MALDIを利用した方法、水素重水交換(see e.g.Baerga−Ortiz et al.(2002年)Protein Science,11:1300−1308)、および表面プラズマ共鳴などの方法があります。
特定の対象の”ヒット”が特定されたら、対象の異常な活性との関係をインビボ分析で判定できます。一般的に、この方法では、非ヒト動物モデルにある疾患や症状に対して抗原を投与し、そしてその生体モデルで抗体の効果を評価します。インビボ分析は適切な制御対策としては、抗体の欠乏に備えてサンプルを用意しておく方法も含まれます。一般的には、様々な抗体の濃度で様々な分析を組み合わせ、並列に実行することによって、抗体の各濃度に対してそれぞれの反応が得られます。通常、この濃度から適切なものを負の制御として採択されます(例えば、濃度ゼロあるいは検出レベル以下)。望ましい抗体とは、抗体がない場合と比較すると、動物生態モデルの疾患あるいは症状を、約10%以上、約20%以上、約25%以上、約30%以上、約45%以上、約50%以上、約55%以上、約60%以上、約65%以上、約70%以上、約80%以上、約90%以上、またはそれ以上で調節(軽減や増加)できる抗体です。一般的には、望ましい抗体は、疾患や症状にかかった動物生態が健康な動物生態になるように貢献します。
選択された抗体あるいは選択された抗体をエンコードする核酸を含む医薬品、またはそれによる派生物あるいは生物学的に活性のある部分は、製造品として包装され、包装材、および疾患や障害の治療に効果がある医薬組成物、および選択された抗体あるいは核酸分子が該当する疾患あるいは障害の治療に使用できることを表示するラベルを含むべきです。
ここで取り上げられる抗体は投与のために調合される場合があります。活性成分は単独で投与できるにもかかわらず、調合は医薬製剤として提示する方が好ましいです。製剤は少なくとも1つの活性成分、また1つあるいは複数の適切な担体を含みます。各担体は、他の成分と適合性があり患者に薬学的にも生理学的にも害を与えない物でなければなりません。
製剤には、経口投与、経鼻投与、直腸投与、または非経口投与(皮下投与、筋内投与、静脈内投与、および皮内投与を含む)に相応しい物があります。製剤は状況によって単位剤形で提示され薬学分野で知られている方法調製されます。例えば、Gilman,et al.(eds.1990年)Goodman and Gilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics,8th Ed.,Pergamon Press、およびRemington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.(1990年).マック出版社.,Easton,Pa.、Avis,et al.(eds.1993年)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,NY、Lieberman,et al.(eds.1990年)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets Dekker,NY、およびLieberman,et al.(eds.1990年)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,NY.を参考。
投与量は範囲内で投与の方法や経路によって変動します。医師は患者の状態に基づいて正確な製剤、投与経路、および投与量を決定することができます。(例えば、Fingl et al.,1975年,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,Ch.1,p.1を参考)。
1日投与量は以上の条件によって一般的に、1μ/kg〜1000mg/kg以上です。臨床医は通常、希望の効果を生み出す投与量が決まるまで分子の投与を続けます。この治療の進行は従来の分析によって監視されます。
しかし、他の投薬計画も認められます。
次の例は、例示だけで、本発明の範囲を限定するものではありません。
材料と方法
1.プラスミドAおよびC
さらに、同じE.coli細胞で培養されると同様のコピー数で複製されます。プラスミドは、Fabをペリプラズムに移動させ、より優れた折りたたみ機能を生み出すSTIIリーダー配列、並びにアラビノース誘導性遺伝子発現向けのアラ・プロモーターを含みます。プラスミドAはFab重鎖の生成向けの重鎖定常領域、およびタンパク質の純化に向けたFlagとHisタグを含みます。プラスミドDはFab重鎖の生成向けの重鎖定常領域、並びにタンパク質の純化およびタンパク質のリガーゼやソルターゼを利用する部位特異的修飾に向けたFlag、LPETG、およびHisタグを含みます。プラスミドCはカッパFab軽鎖の生成に向けたカッパ軽鎖定常領域を、プラスミドEはラムダFab軽鎖の生成に向けたラムダ軽鎖定常領域を含みます。したがって、プラスミドAとDはFab重鎖を、プラスミドCとEはFab軽鎖をエンコードします。Fabは、E.coliが重鎖をエンコードするプラスミドおよび軽鎖をエンコードするプラスミドとの同時形質転換、および重鎖や軽鎖の遺伝子発現のプロモーターの誘導の上で生成されます。
E.coliのBL21株(EMD Biosciences)およびLMG194株(ATCC)はFabの発現に使用されました。RamosBリンパ球細胞(ATCC)およびJurkat Tリンパ球細胞(ATCC)はアポ−ONE相同性カスパーゼ−3/7アッセイに使用されました。BaF3マウス末梢血細胞株(Harvey Lodish、マサチューセッツ工科大学)はEPO Fabライブラリー細胞に基づいたアッセイに使用されました。
DNA配列編集ソフトウェアここで挙げられます。抗体の生殖細胞系の活性を維持しながら、重鎖V,D,およびJセグメント配列、また軽鎖VおよびJセグメントを組み換えるインシリコの方法を導入ソフトウェアです。本ソフトウェアは、組織的にVH,DHおよびJHおよびVLおよびJL生殖細胞系セグメントをエンコードするDNA、あるいはVH,DHおよびJHおよびVLおよびJL生殖細胞系セグメントのサブセット組み合わせ、Fabライブラリー作成向けの核酸分子の生成のために、組み換え重鎖や軽鎖の可変領域の配列を生み出します。生殖細胞系セグメントはデータベースから入力されます。例2はソフトウェアの説明です。例3は、ソフトウェアの使用方法、例4は、組み換え生殖細胞系配列を編集しDNA合成に使われる配列を出力する説明です。
PiccoloTMシステムは完全に自動化されたシステムで、”The Automation Partnership”(TAP)によって販売されています(例えば、システムを説明するWollerton et al.(2006年)JALA,11:291−303を参考)。本システムは細胞培養、自動化収穫、溶解、および純化機を組み合わせるシステムです。例9は、PiccoloTMのシステム運用を詳しく説明します。
DNA配列編集ソフトウェアデザイン
この例ではDNA配列編集ソフトウェアについて説明します。
VH,DHおよびJHおよびVLおよびJL生殖細胞系セグメントに関しては、配列は例えばSequenceDatabase.txtなどのデータベースファイルを利用して入力されます。ソフトウェアの機能は、1)VH,DHおよびJHおよびVLおよびJLのいかなる可能な組み換えを生成し、可変重(VH)鎖、および可変軽(VL)鎖をエンコードする配列を生成すること、2)配列を翻訳、フレームチェックを行うこと、3)配列をSequenceHistory.txtファイルに保存し、ヌクレオチドフォーマットによる配列追跡を可能にすること、および、4)DNA合成に向けて整列された96ウェルのプレートを代表するファイルとして配列を出力することです。出力は様々な重鎖や軽鎖配列を整列として表示する96ウェルプレートファイルの形で出され、また、整列の各遺伝子座に相当する96ウェルプの各レートが指定されます。この出力に基づいてDNA分子は96ウェルプレートで合成されます。加えて、ソフトウェアは配列に順序を付け、多様のスコアを出すことができます。ソフトウェアは自動的にVH鎖とVL鎖(カッパ及びラムダ)をエンコードする組換え核酸配列のいかなる順列を生成します。ユーザーは必要に応じて、ソフトウェアが組み換える生殖細胞系セグメントを予めに選択すること、あるいは順序付け機能を利用して十分に異なる配列を選択することによって、出力ファイルを手動で制限することができます。
GUI−GUIは、コンピューターオペレータへの情報提示、あるいはコンピューターオペレータとの相互作用です。GUIは多様のコンバーターへのBLAST、DNA配列編集GUI、およびNユニットで構成されています。
GUIコントロール−GUIに再使用されるGUIカスタム表示Windowsコントロール。GUIコントロールはXPエクスプローラーバー、およびDNA配列編集コントロールで構成されています。
編集ルール−DNA配列編集ルールの導入。編集ルールはDNA配列編集ルール、およびDNA配列編集ルールテストで構成されています。
NCBIツール−NCBIで入手可能、ローカルコンピュータでの検索を可能にするツールのセットです。
a.DNA配列編集GUI
DNA配列編集GUIは主なアプリケーションです。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。DNA配列編集GUIは全体的に、配列編集に使われる生殖細胞系セグメントを選択し制限すること、全ての配列を自動的に編集すること、配列多様性、クラスタ、あるいは類似性に基づいて全ての配列に順序を付けること、および96ウェルプレートに配置する編集DNA配列を選択することを可能にします。
DNA配列編集GUIは次のクラスに分けられます:
Program(プログラム)−アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。
SplashScreen(スプラッシュ画面)−アプリケーションの起動時、終了時にスプラッシュ画面を表示するユーザーコントロールです。
MainForm(メインフォーム)−ユーザーに利用可能な機能を全て包括する形態です。MainFormはまた、DNA配列編集コントロールモジュルに導入されたユーザーコントロールを表示したり、DNA配列編集規則モジュールで定義された配列編集シングルトンを初期化します。
設定−自動的に生成されたクラスで、5’制限部位および3’制限部位に関するユーザー設定を含むが、この制限部位はIDT整列を完成するために配列と配置されます。
AboutBox(オートボックス)−アプリケーションの情報をユーザーに表示する形態です。ユーザーと相互作用し、機能性を完全に利用可能にします。
a.DNA配列編集コントロール
FabrusDataGridView−.NETフレームワークDataGridViewの導出クラスで、列のヘッダーに列号を表示します。.NETフレームワークはWindowsオペレーティングシステムの一部で、一般的なプログラミング問題に対する既定のソリューションの大規模なライブラリーを提供するほか、フレームワーク専用のプログラム実行を管理します。DataGridViewコントロールは、カスタマイズ可能なデータ表示テーブルを提供します。
AutoHeavySequenceControl(自動重配列コントロール)−自動的に編集されたDNA配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが96ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、V(D)J配列の識別子、およびDNA配列タンパク質配列も表示できます。
AutoLightSequenceControl(自動軽配列コントロール)−自動的に編集されたDNA配列をデータグリッドで表示し、ユーザーが96ウェルプレートに選択できるようにするカスタムコントロールです。また、表示順位、多様性、スコア、クラスタ、V(D)J配列の識別子、およびDNA配列タンパク質配列も表示できます。
ManualHeavySequenceControl(手動重配列コントロール)−重鎖DNA配列を編集するためにVH,DHおよびJH配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
ManualHeavySequenceControl(手動軽配列コントロール)−重鎖DNA配列を編集するためにVH,DHおよびJHの配列を手動で選択できるようにするカスタムコントロールです。
LightSequenceBlastForm(軽配列BLAST形態)−他の軽鎖に対して軽配列のBLAST結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。
HeavySequenceBlastForm(重配列BLAST形態)−他の重鎖に対して重配列のBLAST結果をグリッド形式で表示するカストムコントロールです。
DNA配列編集規則モジュールは、DNA配列編集向けのビジネスロジックを包括します。このモジュールは、編集、接合部の生成、終止コドン除去、および配列順位付けを含み、機能的かつ組み換えVDJおよびVJ抗体配列編集の規則を包括します。
SequenceCompilerはDNA配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、V(D)J配列、およびその関連情報から、紐み合わせDNA配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。
BlastTableは多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のBLAST検索を行います。
SequenceHistorianはDNA合成会社が注文したDNA配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです(例えば、IDT,Genscript,Invitrogen,およびそれに類似するものです)。SequenceHistory.txtというファイルで持続が可能だが、このファイルはDNA合成会社が注文したDNAの全ての配列をヌクレオチドフォーマットで追跡を続けます。
SequenceContainerは全てのV(D)J配列情報と制限部位をSequencesDatabase.txtテキストファイルで記載された通りに保存するクラスです。
DnaSequenceはHeavyChainDnaSequenceおよびLightChainDnaSequenceクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。
WellPlate_8x12は96ウェルプレートを模倣するクラスです。DNA配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。
加えて、DNA配列編集規則には3つの補充クラスがあります:
CodonUsageTableはE.coli K12向けのコドン使用表を包括するクラスです。
Translatorは64のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。
次はDNA配列編集規則モジュールの主要な6つのクラス(i−vi)、および補充の3つのクラス(vii−ix)をそれぞれ分析したものです。
SequenceCompilerはDNA配列の機能性を全て提供するシングルトンクラスです。このクラスでは、V(D)J配列、およびその関連情報から、組み合わせDNA配列を自動的にまたは手動で生成することは可能になります。
SequenceCompilerには次の機能があります。
SequenceCompilerは図8に示されるアルゴリズムを使用し、軽鎖および重鎖の全ての可能なV(D)J配列の組み合わせを計算することによって、編集された配列を生み出します。アルゴリズムはただ、軽鎖および重鎖の全ての可能なV(D)J配列の組み合わせを計算することに同等です。
たとえば、VHが3つ、DHが3つ、およびJHが3つの配列がある場合、アルゴリズムは3*3*3のコンビを計算し、可能な27コンビを生み出します。同様に、Vκが4つ、およびJκが4つの配列がある場合、アルゴリズムは4*4のコンビを計算し、可能な16コンビを生み出します。加えて、アルゴリズムはラムダ軽鎖、およびカッパ軽鎖を別々で計算します。
個々のセグメントが特定された後で、V(D)J接合部が生成され、ヌクレオチドの部分(セグメントと結合部)が結合され、配列は編集されます(図9を参考)。接合部の生成、終止コドンの除去、および制限部位に関する規則は、”V(D)J接合部生成”、”終止コドンの除去”、および”コドン使用テーブル”セクションのヘッディングの下に記載されています。
個々のV(D)J配列の間の組み換え配列の接合部は、結果の配列がインフレームになるように選択されます。
SequenceCompilerは以下の3つの規則によってリーディングフレームを特定します。
2.D配列は最も負のGRAVY(疎水性総平均)を生み出すフレームを持っています。
3.J配列はSequenceDatabase.txtで指定されたようなリーディングフレームを持っています(例4.1”V(D)J配列データベースファイル作成”で説明されるように、J配列はリーディングフレームの特定のために3つのコドンで表示されます。表13も参考)。
場合によって、V(D)J接合部の生成は終止コドン(TAA,TAGあるいはTGA)を生み出す場合があります。
SequenceCompilerは次の規則に従って、有害な終止コドンを除去し、終止コドンをエンコードするヌクレオチドは指定された新しいコドンに置き換えられます:
SequenceCompilerはV(D)J接合部生成、および終止コドン除去の完了した後で、タンパク質配列は完成で機能的です。
一度配列が編集された後で、各配列が順位づけられ、最高多様性から最低多様性の順番でユーザーに例示されます(表20、図17、図19を参考)。このような配列のランキング表示のおかげで、ユーザーは色々な選択肢から96ウェルプレートの注文書ファイルに配列を選ぶことができます。ユーザーは最も多様な配列、または最も類似性のある配列を選択することができます。
BlastTableは多様性スコア、クラスター番号に関する情報を提供し、特定の配列のBLAST検索を行います。
SequenceHistorianはDNA合成会社が注文したDNA配列をヌクレオチドフォーマットで追跡するクラスです。SequenceHistory.txtというファイルで持続が可能です。
SequenceContainerはテキストファイルからV(D)J配列、および制限部位を読み込み、そして、手動でまたは自動的な編集のための将来の検索に向けてメモリーに保存します。
DnaSequenceはHeavyChainDnaSequenceおよびLightChainDnaSequenceクラスによって、それぞれ重鎖および軽鎖配列を模倣する親クラスです。HeavyChainDnaSequenceとLightChainDnaSequenceクラスの唯一相違点は、配列を編集する方式にあるが、これは各クラスのコンストラクターに実装されています。
各クラスには、フィールド、プロパティ、およびメソッドがあります。加えて、親DnaSequenceクラスはイベントやネストタイプを含みます。したがって、DnaSequenceは重鎖および軽鎖配列に共通されるすべての機能を実装しています。これには、アミノ酸、クラスター、DiversityScore(多様性スコア)、_SEQ_ID(配列ID)、名前、注意項目、ヌクレオチド、順位、およびRestrictionSites(制御部位)などのフィールド、並びに制限部位の除去、終止コドンの除去、および制限部位のサイレンシングなどののメソッドがあります。HeavyChainDnaSequenceクラスは、VH,JHとDH配列、VH−JHとJH−DHの接合部、およびVH−JHとJH−DH接合部を生成するメソッドを含みます。LightChainDnaSequenceクラスは、VLとJL配列、VL−JL接合部、およびVL−JL接合部を生成するメソッドのフィールドを含みます。
WellPlate_8x12は96ウェルプレートを模倣するクラスです。DNA配列の例への参考を含み、また注文ファイルに保存されるようにします。
CodonUsageTableはE.coli K12向けのコドン使用表を包括するクラスです。ソフトウェアはCodonUsageTableを利用し、リーディングフレームの問題を解決したり、制限部位サイレンシングを解除したりできます。ソフトウェアは希望のプラスミドにDNAを挿入するのに使用される制限部位を特定するように設定されています。DNA配列で制限部位が特定されると、ソフトウェアは適切なアミノ酸配列を維持しながら、不要な制限部位を修正するためにヌクレオチド配列を変更します。上記のコドン重複性はコドンを変更するためです。コドンの変更によって、新しく使用された可能なコドンの使用頻度を有利に増加させることができます。また、コドンの1番、2番目の塩基を変更するより、コドンの最後の塩基を変更する方が望ましいです。
Translatorは64のコドンを、遺伝子コードに基づいて相当するアミノ酸に翻訳する静的クラスです。
ProtoParamはGRAVY値を計算する静的クラスです。特定のペプチドあるいはタンパクに対するGRAVY(疎水性総平均)値は、全てのアミノ酸の疎水性を足し配列内の塩基数で割って計算されます。基本的には、GRAVY値はタンパク質の疎水性残基の相対的な値です。V(D)J接合部生成ソフトウェアは、D配列のリーディングフレームを計算する時にこの情報を使用します。このリーディングフレームは最も負のGRAVY値で決定されます。
DNA配列編集規則テストモジュールは、自動化されたN単体の複数のテストで、各クラスの単体テストを実行します。このテストによって、個々のモジュールとクラスが正常に動作していることを確認できます。9つのクラスは:
BlastTableTest;
CodonUsageTableTest;
HeavyChainDnaSequenceTester;
LightChainDnaSequenceTester;
ProtoParamTest;
SequenceCompilerTest,
SequenceContainerTest;
TranslatorTest;and
TranslatorWrapper.
多様性コンバーターへのBLASTは、BLASTの出力ファイルによって多様性のスコアを出力できるプログラムです。5つクラスを含みます:
Program(プログラム)−アプリケーション実行のエントリポイントを含む、自動的に生成された静的クラスです。
Main Form(メインフォーム)−オペレーターが変更するファイルを選択する時に押すボタンです。
リソース−デフォルトで作成される空のファイルリソースです。
設定−ユーザの設定を記録する、自動的に生成されたクラスです。
BLASTコンバーターアルゴリズムはBLAST出力ファイルで次の方程式を行い配列多様性スコアを計算します。
N単体はすべての.Net言語向けの単体テストフレームワークです。N単体テストツールは、オブジェクトモデルをテストする手段の1つで、そのアプリケーションとロジックが正常に動作する限り、有用なツールです。当初はJ単体から移植されたが、現在の2.4.2バージョンの発売はMicrosoft.NET向けのx単体ベーステストツールの5番目重要です。完全にC#で書き込まれました。また、例えば、カスタム属性、およびその他に関連する機能など、様々な.NET言語特徴を取り入れるように再設計されました。N単体はx単体をすべての.Net言語に取り入れます。N単体はN単体機関から公衆に無料で公開されています。
Formatdbは、タンパク質あるいはヌクレオチドのデータベースがblastall,blastpgpあるいはMegaBLASTに検索される前に、そのソースデータベースをフォーマットするために利用されます。ソースデータベースは、FASTAあるいはASN.1形式です。ソースデータベースがformatdbによってフォーマットされたら、BLASTに必要ではなくなります。
次のコマンドラインオプションはformatdbで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−iフォーマットのファイルを入力
−pファイルの種類(T−タンパク質、F−ヌクレオチド、デフォルト=T)
−o構文解析オプション
T−正しい:構文解析配列IDおよびインデックス作成
F−正しくない:IDの構文解析を行わないインデックスを作成しない
現在、win32−ia32(2.2.17)バージョンが使われています。Formatdbは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。
h.基本的局所配列検索ツール(BLAST)
基本的局所配列検索ツール(BLAST)は、なローカル配列検索ツールは、配列間の局所類似の領域を検索します。このプログラムは、ヌクレオチドあるいはタンパク質の配列を配列データベースと対比し、一致件数の統計的有意性を計ります。BLASTは配列の間で機能的または進化的関係を推測するだけでなく、遺伝子族メンバーの特定にも貢献します。
次のコマンドラインオプションはblastallで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−pプログラム名(“blastp”,“blastn”,“blastx”,“tblastn”,あるいは“tblastx”)
−dデータベース
−Iクエリ―ファイル
−oBLAST レポート出力ファイル
−m配列ビューオポション(0=デフォルト、9=コメントライン付き表)
−b(B)[Integer]の配列を表示するデータベース配列番号。
現在、win32−ia32(2.2.17)バージョンが使われています。BLASTは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。
BLASTClustは、タンパク質またはヌクレオチドの配列をクラスターにするためのスタンドアローンBLASTパッケージ内のプログラムの1つです。このプログラムは対マッチで始まり、特定の配列はクラスター内の少なくとも1つの配列と一致する場合、クラスタ内に取り入れられます。ヌクレオチド配列の場合は、Megablastアルゴリズム、タンパク質の場合は、blastpアルゴリズムを利用し、対マッチを計算します。
最も簡単な例ではBLASTClustは入力として、連結FASTA形式の配列を含むファイルを利用し、各配列は定義線の先頭に特有の識別子を持っています。BLASTClustは入力配列をフォーマットし、一時的BLASTデータベースを作成し、クラスタリングを実行し、そして完了時にデータベースを削除します。したがって、BLASTClustを使用する前に予めにformatdbを実行する必要はありません。BLASTClust出力は、1本線当たりに1つのクラスターが付いた、スペースで区切られた配列識別子のファイルです。クラスターは最大から最小への順番で分別されています。
次のコマンドラインオブションはblastclustで出力ファイルを生成する時に利用されます。
−d配列データベース名
−oクラスターリストを保存する出力ファイル
−S類似性境界
もし<3の場合は、境界はBLASTスコア濃度(0.0〜0.3、デフォルト=1.75)に設定されます。
もし>3の場合は、境界は同一の残基のパーセンテージ(3〜100)で設定されます。
現在、win32−ia32(2.2.17)バージョンが使われています。BLASTClustは、国立情報バイオテクノロジーセンターからダウンロードすることができます。
XPExplorerBarは完全にカストム可能なWindows XP式エキスプローラーバーで、Windows XPテーマや動画を使った拡大/縮小機能をサポートします。XPエクスプローラバーはパブリックドメインソフトウェアとして無料で入手可能です。
配列データペース
DNA配列編集ソフトウェアは、配列情報が記録されたファイルが必要で、このファイルを利用して配列編集規則に従って配列編集を実行することができます。このファイルはSequenceDetabase.txtです。全ての組み換え配列はファイル内のは例つデータから生み出されます。したがってファイルは、ソフトウェアが配列編集の実行に使用するすべての配列を含みます。
たとえば、ファイルは希望の生殖細胞系セグメント向けのヌクレオチド配列、および制限酵素向けのヌクレオチド認識配列を含みます。データベース内の配列にはあらゆる既知配列が含まれ、また、配列は随時手動で更新することができます。ヒト由来のV、D、およびJ抗体生殖細胞系配列は、NCBI IgBLASTデータベース(国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能)、および国際免疫遺伝情報システム(IMGT)から得られたもので、配列データベースファイルに入力されました。データベースファイルは配列編集ソフトウェアに入力ファイルとして提供されます。
SequenceDatabast.txtファイルのフォーマットは図11で例示されています.SequencesDatabase.txtファイルは次の規則に従って手動で新しい配列を追加するだけで更新できます:
● すべての配列はFASTA形式で指定するべきです。
● Jの配列に3文字コドンを指定するべきです。
● すべての配列の間に”空線”を引くべきです。
● //は無関係なコメントのある線の先頭に記すべきです。
● セクションのタイトルは次の通りに示すべきです:
○ [VH]−続きのVH配列リスト:
○ [DH]−続きのDH配列リスト:
○ [JH]−続きのJH配列リスト:
○ [VK]−続きのVK配列リスト:
○ [JK]−続きのJK配列リスト:
○ [VL]−続きのVL配列リスト:
○ [JL]−続きのJL配列リスト:
○ [Restriction Sites]−続きの制限部位リスト:
重鎖と軽鎖DNAファイル作成、および順位分析
最後に、編集配列は配列類似性によってクラスター化されました。ソフトウェアの様々なステップはソフトウェアを初期化した直後に行われたのだが、そのステーブは以下のとおりです。
データベースファイルが更新され、全ての必要なV(D)J配列を含んだ後、DNA配列編集ソフトウェアは、例2、セクションB.1.cに説明されている通りにDNA配列編集規則に従って、データベースファイルを入力ファイルとして使用し完全長の重鎖あるいは軽鎖配列を機械的に編集しました。ソフトウェアは、編集された可変重鎖および軽鎖の生殖細胞系セグメントにエンコードされた完全長のアミノ酸配列を含むファイルを作成しました。次のファイルに含まれています:
● TempLightChainSequences.txt−このファイルはアミノ酸フォーマットのカッパおよびラムダの全ての軽鎖配列の組み合わせを含みます。
● TempLightChainSequences.txt−このファイルはアミノ酸フォーマットの全ての重鎖配列の組み合わせを含みます。
編集された軽鎖および重鎖アミノ酸配列は特有のIDによって示されています(gnl|Fabrus|V_(D)_J)。その例は以下にあります。
ソフトウェアによって、組み換え可変重鎖および軽鎖は、配列類似性で、全ての組み換え配列と比較されました。これは、NCBIユーティリティBLASTで実行されます。Blastビットスコアで多様性スコアを計算します。組み換え可変重鎖および軽鎖はまた、クラスター分析ツール(例えばBLASTclust)によって、配列類似性が分析されました。
編集された配列は、配列の間の類似性を測定するために比較されました。この情報に基づいて多様性スコアが測定されたのです。最初は、TempLightChainSequences.txtとTempHeavyChainSequences.txtのファイルがフォルダ(ユーザーが作成したもの)にコピーされ、DOSコマンドプロンプトウィンドウが開かれました。NCBI DNAユーティリティformatdbによって、まず軽鎖や重鎖にそれぞれ相当する次のコマンドプロンプトを使用し、BLAST用のファイルを準備しました。
Run formatdb−i TempLightChainSequences.txt−pT−oF
Run formatdb−i TempHeavyChainSequences.txt−pT−oF
DOSコマンドプロンプトウィンドウを開いたフォルダにFormatdbがインストールされていることは必須条件です。そうでなければ、ユーティリティは見つかりません。また、パスによってDOSコマンドに、formatdbが以前にインストールされたフォルダから直接に利用するように指示できます。例えば、すべてのNCBIユーティリティは”NCBIUtilities”というフォルダにダウンロードされた場合、コマンドプロンプトは次の通りです:
Run NCBIUtilities¥bin¥formatdb−i TempLightChainSequences.txt−pT−oF
Run NCBIUtilities¥bin¥formatdb−i TempHeavyChainSequences.txt−pT−oF
そして、BLASTコマンドプロンプトによって、HeavyChainBlastResults.txtとLightChainBlastResults.txtの出力ファイルが生成されました。コマンドプロンプトは以下の通りです:
● Run blastall−p blastp−d TempLightChainSequences.txt−I TempLightChainSequences.txt−o LightChainBlastResults.txt−m 9−b 500
(−b値はBLASTの配列数より大きくなければなりません)、
● Run blastall−p blastp−d TempHeavyChainSequences.txt−I TempHeavyChainSequences.txt−o HeavyChainBlastResults.txt −m 9 −b 8000
(−b値はBLASTの配列数より大きくなければなりません)。
BLASTの出力ファイルが生成された後、例2、”BLASTコンバーターアルゴリズム”のサブセクションで示されたアルゴリズム、およびBLASTのビットスコアによって、以下のコマンドに従って、各配列の多様性スコアが計算されました。
(a) Run BlastToDiversityConverter.exe(ソフトウェアが起動されるとこのファイルは自動的に実行します)。
(b) LightChainBlastResults.txtファイルを開きます。
(c) ファイルをAllLightChainSequencesDiversityScores.txtとして保存します。
(d) HeavyChainBlastResults.txtファイルを開きます。
(e) このファイルをAllHeavyChainSequencesDiversityScores.txtとして保存します。
最後に、NCBIユーティリティBLASTClustを使用して対マッチを作り、配列類似性に基づいて配列はクラスタ化されます。BLASTClustによってAllLightChainsBLastClust.txtとAllHeavyChainsBlastClust.txt.の2つの出力ファイルが生成されます。この例では、2つの配列は類似性が95%あるいは96%に達して初めて対マッチとして見なされます。コマンドプロンプトは以下の通りです:
● Run blastclust−d TempLightChainSequences.txt −o AllLightChainsBlastClust.txt−S 95
● Run blastclust−d TempHeavyChainSequences.txt−o AllHeavyChainsBlastClust.txt−S 96
BlastClust設定(−S)は必要に応じて変更することができます。
すべてのファイルが(上記の通りに)生成された後、次のファイルはDNA配列編集ツールのインストールフォルダに手動でコピーされます:
(a) AllHeavyChainsBlastClust.txt
(b) AllLightChainsBlastClust.txt
(c) AllLightChainSequencesDiversityScores.txt
(d) AllHeavyChainSequencesDiversityScores.txt
例5
DNA配列編集ツールソフトウェアのインストールとグラフィカルユーザーインタフェース
ソフトウェアは、オペレーティング・システムとしてWindows XP又はWindows Vistaを使用するコンピュータで実行するよう設計されている。ソフトウェアは、実行ファイルsetup.exeを実行し、ユーザ選択のフォルダーにおけるプログラムを設定することによりインストールされる。インストールすると、ユーザは、メイン・メニュー・オプション及びエクスプローラ・バー・オプションが目に入る。詳細については下記で説明する。
DNA配列編集ソフトウェアは、スタンドアロン・アプリケーションとしてローカル・マシンで実行するよう設計されている。
インターネット接続:必要なし
データベース・サーバ:なし
該プログラムをインストールするため、実行ファイルsetup.exeを実行し、各自で選択するフォルダーのプログラムをインストールする。
3つのメイン・メニュー・オプションがある。
ファイル−ファイル・メニューを使用して、アプリケーションを終了させる。
ウェルプレート−ウェルプレート・メニューを使用して、注文を作成し、全プレート又は選択するウェルを消去し、又はウェルプレートの注文作成に対して制限部位を設定する。
ヘルプ−ヘルプ・メニューを使用して、実行中のソフトウェアのバージョンを確認する。
3つのエクスプローラ・バー・オプションがある(図12、左欄を参照):
手動編集−手動編集は、生殖細胞系セグメントのユーザ選択を可能にする軽鎖又は重鎖の手動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
自動編集−自動編集は、軽鎖又は重鎖の自動編集形式を表示するのに使用される項目を含む。
ウェルプレート−ウェルプレートは、ウェルプレート形式を表示するのに使用される項目を含む。
すべてのプログラムのWindowsメニューでFabrusDNA編集ツールをクリック、又はデスクトップでFabrusDNA編集ツールのショートカットをダブルクリックすることのいずれかにより、ソフトウェアを起動させる。
スプラッシュ画面(図13)が、アプリケーションの起動時に現われ、その後目立たなくなる。
DNA配列編集ソフトウェアを使用し、重鎖及び軽鎖抗体配列を組換え、続いて目的の配列を選択して、DNA Synthesis Companyからヌクレオチド形式でDNA配列を入手するための注文ファイルとして役割りを果たす96ウェルプレートの出力ファイルを生成する。プレートファイルに加え、SequenceHistory.txtファイルを作成し、注文される全配列を把握する。ユーザは、配列を生成し、続いて下記のセクションC.2−4に記載のとおり、96ウェルプレートのグリッドへの含有物に対する個々の配列を選択するため、手動編集又は自動編集のいずれかを選択できる。また、ソフトウェアプログラムは、全配列の多様性スコアも算出する。以下のセクションは、DNA合成の注文に対して可変重鎖及び軽鎖をコードする生殖細胞系配列の選択及び編集するユーザオプションについて説明する。
アプリケーションの起動時、96ウェルプレート画面が表示される。図12で示すとおり、96ウェルプレートは、アプリケーションの起動時は空である。メイン・メニューは、DNA配列編集のタイトルの下で、画面上部に沿って横長である。エクスプローラ・バーは、画面の左側で縦長である。ユーザは、手動編集機能又は自動編集機能のいずれかを使用し、本明細書の以下で説明されるとおり、製作用に選択されるだろうDNA配列を空の96ウェルプレートに追加する必要がある。96ウェルプレート画面の追加を可能にする前記プレート内のオペレーティング機能は、以下を含む:
重鎖:
● ウェルプレート>設定>重鎖>5’末端→選択、及びウェルプレート>設定>重鎖>3’末端→選択
カッパ軽鎖:
● ウェルプレート>設定>カッパ軽鎖>5’末端→選択、及びウェルプレート>設定>カッパ軽鎖>3’末端→選択
ラムダ軽鎖:
● ウェルプレート>設定>ラムダ軽鎖>5’末端→選択、及びウェルプレート>設定>ラムダ軽鎖>3’末端→選択
c.ウェル配列情報の表示
ウェルで置かれ、編集された配列は、ウェルをクリックして表示する。選択する配列のウェルはハイライトされる。例えば、図14は、ユーザが注文するため選択した編集配列を含む単一の96ウェルプレートに対するモデル画面を示す。前記図の横列Aにおいて、縦列1−3(中間グレーの影)は、編集された重鎖配列のセルを示し、縦列3−6(薄いグレーの影)は、編集された軽鎖配列のセルを示す。ハイライトされたセルは(横列A、縦列5、濃い影で示す)、個々のデータが画面底部の配列情報ボックスのセルを示す。
96ウェルプレートから注文され得る1から96個の配列など、プレートに入れる試料の数がいくつであっても、注文は96ウェルプレートに対し生成される。注文を生成するためには、ウェルプレート>注文の生成オプションを選択し、ファイル名を必要に応じて入力する。注文ファイルは、カンマ区切り変数(.csv)形式で保存される。実施例4は、ソフトウェア編集のソフトウェアを使用して編集される例示的配列の編集、出力及び注文を説明する。
プレートにおける特定のウェルを消去するため、選択するウェルをクリックし、次いでウェルプレート>消去>選択するウェルを選択し、或いは目的のウェルを右クリックして「選択するウェルの消去」を選ぶ。
ウェルプレートは、注文が生成されると自動的に消去されるわけではない。全ウェルプレートを消去するためには、ウェルプレート>消去>全プレートを選択する。
手動編集オプションを使用するユーザの選択により、編集された配列を手動で生成することができる。
軽鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーから手動編集>軽鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図15で示す。手動編集経鎖の画面は、ユーザがラムダ又はカッパ配列のいずれかを編集することを可能にする。このオプションは、ヘディングタイプにおいて利用可能で、画面上部のラムダ又はカッパのいずれかの前にある丸を選択することで選ぶ。該ソフトウェアは、Vλ及びJκ配列の組合せ又はその逆も認めない。
ラムダ経鎖の編集方法を以下の段階で示す。
● タイプ>ラムダを選択する
● VL配列コンボ・ボックスから目的のVλ配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのVλヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
● JL配列コンボ・ボックスから目的のJλ配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのJλヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
● 「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。
カッパ軽鎖の編集方法を以下の段階で示す。
● タイプ>カッパを選択する。
● VK配列コンボ・ボックスから目的のVK配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのVKヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
● JK配列コンボ・ボックスから目的のJK配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルで入力される利用可能な全てのJKヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
● 「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集された配列を追加する。編集される全配列は、DNA合成の注文のためウェルプレートに追加される。
上記のラムダ軽鎖配列の編集のとおり、DNA配列ヘディングにおいて、2つのボックスが見られる。
「制限部位の抑制なし」ボックスが、個々のVκ及びJκ配列に加え、生成されるあらゆるV−J結合部を表示する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、選択する制限部位を抑制するあらゆる配列の修飾を伴い編集された配列を表示する。ソフトウェアによって抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスに表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。
重鎖を手動で編集するため、エクスプローラ・バーで手動編集>重鎖オプションを選択する。手動編集画面は、図16で示す。手動編集重鎖画面は、ユーザがVH、DH及びJH配列を連結することを可能にする。以下の段階は、重鎖を編集する方法を示す。
● VH配列コンボ・ボックスから目的のVH配列を選択する。ScquenceDatabase.txtファイルに入れられる利用可能な全VHヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
● DH配列コンボ・ボックスから目的のDH配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルに入れる利用可能な全DHヌクレオチド配列が、下のドロップダウン・メニュー・ボックスに現れる。
● DHリーディング・フレーム・ボックスから目的のDHリーディング・フレームを選択する。GRAVY値は、リーディング・フレームの選択によって更新される。ユーザは、最低のGRAVY値に対応するリーディング・フレームを選択すべきである。
● JH配列コンボ・ボックスから目的のJH配列を選択する。SequenceDatabase.txtファイルに入れる利用可能な全JHヌクレオチド配列が、下のボックスに現れる。
● 「ウェルプレートへ追加する」ボタンをクリックし、ウェルプレートに編集配列を追加する。編集される全配列は、DNA合成の注文のためウェルプレートに追加される。
対応のコードされたアミノ酸配列も表示される。例えば、図16において、「制限部位の抑制なし」ボックスで表示される最初の配列は、選択するVH配列に対応する(この場合はV1−18)。これに続くのは、グルタミン酸(E)をコードする3つのヌクレオチド「gag」の記述で、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるV−D連結領域に対応する。表示される次の配列は、選択されるDH配列(この場合はIGLJ1*01)に対応する。その配列は、トレオニン(T)をコードする3つのヌクレオチド「acg」の記述に続き、それは機能的な核酸分子を生成するため、編集法の実行により作成されるD−J連結領域に対応する。表示される最後の配列は、選択されるJH配列(この場合はIGHJ1*01)に対応する。「抑制される制限部位を伴う」ボックスは、現在抑制されるあらゆる制限部位を伴う編集配列を表示する。抑制される全ての制限部位は、「注記」ボックスで表示される。抑制される制限部位を伴う配列は、注文ファイルに入れる配列である。
編集される鎖は、自動編集オプションを使用することで自動的に生成される。実施例4で説明されるとおり、全配列の編集は、初期化においてコンピュータにより機械的に実行され、ファイルに保存される。自動編集機能は、ユーザがこれらの配列を見ることを可能にする。
軽鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集>軽鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図17で表示される。自動編集軽鎖の画面は、VK及びJK並びにVλ及びJλ配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する:
● 選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
● 順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
● 集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
● 多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のBLASTビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
● V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
● J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
● アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
重鎖を自動的に編集するため、エクスプローラ・バーで自動編集>重鎖オプションを選択する。自動編集画面は、図19で表示される。自動編集重鎖の画面は、VH、DH及びJH配列の可能な全ての組合せを表示する。
自動編集画面は、以下の縦列でグリッドを表示する:
● 選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
● 順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
● 集団−この縦列は、配列が分けられる集団を列挙する。集団番号は、単に識別子で、その数値は、いずれの順位付けにも関連しない。
● 多様性スコア−この縦列は、リストの他の全ての配列に対し、本配列のBLASTビットスコア結果の二乗平均に基づいたスコアを列挙する。低値は、より多様な配列を示す。
● V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
● D配列−この縦列は、本配列に対して使用されるD配列識別子を列挙する。
● J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
● アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
a.自動編集画面のソート・オプションを変更
自動編集画面で列挙される配列の一覧は、所望の縦列ヘッダをクリックすることで再編成され得る。例えば、多様性スコアに基ういて配列を表示するため、縦列ヘッダの「多様性スコア」をクリックし、配列は、最低から最高の多様性スコアの観点から再注文される。
b.状態指標
自動編集画面は、編集される配列の状態を識別するため色彩規則を使用する。例えば、灰色は、配列がすでに注文されていることを示し、青色は、配列が注文されておらず、96ウェルプレートに入れられていないことを示し、及び濃い青色は、配列が96ウェルプレートに入れられたことを示す。例えば、図17の横列022、023及び024においてホールドの項目は、編集された配列が、注文のため96ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。例えば、図19の横列0103−0107においてボールドの項目は、編集された配列が、注文のため96ウェルプレートに入れられたことを示し、また「選択する」の縦列にチェックマークを付けることによっても示される。
c.96ウェルプレートに複数の配列を入れること
複数の選択する配列のボックスをクリックすることで、複数の配列を96ウェルプレートに入れることが可能である。これは、マウスで最初の配列を選択し、次いでシフト・キーを押さえ、最後に選択された配列のボックスをクリックして行うことができる。或いは、Ctrlキーを押さえ、選択する全ての配列のそれぞれのボックスをクリックすることで、Ctrlキーを使用して個々の配列を選択することができる。一旦VL配列を選択して96ウェルプレートに加えると、列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」を選択する。選択する全ての配列は、DNA合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる
d.96ウェルプレートに単一配列を入れること
単一配列を96ウェルプレートに入れるため、「選択する」の縦列にあるボックスをクリックし、或いは、配列の列ヘッダを右クリックして「ウェルプレートにコピーする」をクリックする。選択される配列のみが、DNA合成の注文のため、ウェルプレートへ加えられる。
e.編集における他の全ての配列に対し、選択する配列でBLAST
配列が自動編集で編集されると、ソフトウェアは、ユーザがリストの他の全ての配列に対し、単一配列のBLAST検索を実行するオプションを可能にする。この機能は、出力インジケータ、BLASTビットスコアを提供し、それは整列された各配列と関連するギャップ及び置換の数から算出される値である。スコアが高くなればなるほど、アライメントが重要である。このデータは、ユーザが、他の全ての選択する配列に対し、最も高い多様性、或いは最も低い多様性のいずれかを有する配列を選択しようと試みる場合に有用である。選択するVL配列に対し生成されるデータの例は、図18で説明しており、選択するVH配列に対し生成されるデータの例は、図20で説明している。
次いで、編集配列は、編集される各配列と他の全ての編集される配列との類似性を決定するため比較し、この情報を使用して、多様性スコアを生成する。例えば、NCBIユーティリティのBLASTを使用して、ヌクレオチド又はタンパク質の配列を比較し、一致配列の統計的有意性を算出することにより、配列間の局所類似性の領域を見つけることが可能である。
BLASTを実行するため、比較する配列は、配列上でクリックすることで選択される。ユーザは、配列を右クリックしてBLASTオプションを選択できる。例えば、VL配列に対し、図18は、手動編集又は自動編集の画面上のV4−2_IGLJ2*01配列で選択することにより、続いて配列を右クリックしてBLASTを選択することにより、生成されるBLASTグリッド形式を例示する。図18で例示される新しいグリッド形式が生成され、選択する配列と整列する他の編集配列のBLASTビットスコアを提供する。例えば、VH配列に対し、図20では、手動編集又は自動編集の画面のVH4−39_IGHD5−24*01_IGHJ6*01配列で選択することにより、次いで配列を右クリックしてBLASTを選択することにより、生成されるBLASTグリッド形式を例示する。図20で例示する新しいグリッドを生成し、選択する配列と整列する他の編集配列のBLASTビットスコアを提供する。配列は、「選択する」の縦列のボックスにチェックマークを付けることにより、DNA合成を注文するため、96ウェルプレート・ファイルへの挿入に対し、この新しいグリッド形式から選択できる。
BLAST形式は、縦列でのグリッドである:
● 選択する−この縦列は、チェックマークを付ける又はチェックマークを外して、ウェルプレートへ配列を追加又はウェルプレートから配列を排除するボックスを含む。
● 順位−この縦列は、多様性の観点から順位を示す。値1は、最も多様な配列を示す。
● BLASTビットスコア−この縦列は、選択する配列に対し、特にこの配列のBLASTビットスコアを示す。
● V配列−この縦列は、本配列に対して使用されるV配列識別子を列挙する。
● J配列−この縦列は、本配列に対して使用されるJ配列識別子を列挙する。
● アミノ酸配列−この縦列は、タンパク質構成において編集される配列を列挙する。
重鎖及び軽鎖生殖細胞系組換えDNA配列の生成
この実施例では、DNA配列編集ソフトウェアによって、重鎖及び軽鎖DNA配列を生成する方法を説明する。編集の第一段階は、上記の実施例5に記載のとおり、配列の手動編集又は自動編集のいずれかを選択することである。手動編集は、選択する配列においてユーザが完全に制御できるため有用である。これは、全ての配列が、同じ特定のセグメント含むライブラリーを産生し、又は異なる配列を選択することによって多様性をコントロールすることで、ユーザが、希望するあらゆる状況にライブラリーを提供することを可能にする(異なる遺伝子ファミリーなど)。
DNA合成の注文は、注文作成機能を用いて作成した。DNA編集ソフトウェアは、96ウェルフォーマットにマップされるアレイで選択する配列を出力した。このフォーマットでの配列は、合成抗体の可変重鎖及び軽鎖配列を生成するため、DNA合成のベンダー(Genscript Corp.)に送られた。合成された核酸分子が戻り、96ウェル・フォーマットによって同定された。表22は、配列編集ソフトウェアによって作成され、注文されて、合成される配列を列挙している。
異なるリーダー配列によるFab分泌の比較
合成された可変重鎖及び軽鎖のクローニング及び同時形質転換
Fabライブラリーのハイスループット成長及び精製
Fab抗体の直交二次純化
PiccoloTMプロセス後生じられた部分的に純粋なFabを快速にもっと純化させるために、純化の直交方法が開発されました。Fabは前の例9に説明されたようにPiccoloTM機械により発見し、純化されました。PiccoloTM純化から取得されたFabサンプルごとに約1.8mLのIMAC溶出物は、製造者プロトコールに従って、Akta純化装置(GEヘルスケア)及びA−905オートサンプラー(GEヘルスケア)により4°Cで1mLのHi−Trap蛋白質Gカラムの上にもっと純化されました。この蛋白質サンプルは深型ウェルの96ウェル・ブロック(VWR)に移転されました。後者は、蒸発防止のために、アルミニウム・ホイル・テープで覆われました。
オートサンプラーは多段注入(典型として、サンプルごとに450μLの注入四回)のためにHi−Trap蛋白質Gカラムの上に設置されました。それから、このカラムは2カラム容積の50mMのリン酸ソーダpH7.2及び150mMのNaClで洗われました。Fabは六カラム容積の100mMグリシンpH2.8で溶出されました。溶出ピーク部分(約0.8mL)は深型ウェルの96ウェル・プレート・ブロックの中に収集されました。溶出された蛋白質は直ちに飽和二塩基性リン酸ソーダpH9.0により中和されました。蛋白質濃度は、分子動力プレートリーダーの上のA280における吸収率の測量により測定され、対応するFabの消散係数から計算されました。消散係数は、Fab重鎖と軽鎖におけるチロシン+トリプトファン+フェニルアラニンの総数に基づいて計算されました。PiccoloTMシステムを利用する以下の純化において発見された蛋白質は一般に20%以下の純度であります。蛋白質Gによる直交純化の後、Fab純度はSDS−PAGEが示したように95%以上の純度であります。
Fab抗体のアミノ酸配列は、配列同一性番号1475−1826のいずれかにおいて表示された可変重鎖配列、及び配列同一性番号1827−1838、1840−1855、1857−188において表示された可変軽鎖配列を含む配列に対応します。重鎖及び軽鎖Fabライブラリーメンバーの配列はプラスミドA、C、Eに包括された不変地域をも含みます。
リンパ球細胞死亡測定
抗体ライブラリーからの独特なFabを確認するために、測定を通して希望の機能、特性又は活性を評価することができます。蛋白質機能測定の例として、架橋抗CD20Fab(配列同一性番号453において表示された重鎖及び配列同一性番号835において表示された軽鎖)は、細胞を基礎にした測定を通して、リンパ腫の細胞死亡を引き起こす能力をテストされました。抗CD20Fabは 抗CD20カッパ軽鎖のさまざまの部分を識別する等しいモル濃度の多クローン性抗人カッパ軽鎖抗体を添加することにより、架橋されました。
100x[(Fab用蛍光性)−(背景用蛍光性)]/(背景用蛍光性)
エリスロポエチン結合Fabライブラリー
電子化学ルミネッセンス結合測定
VH3−23 重鎖ライブラリー
この例において、重鎖を含む690の違うVH3−23は標準分子生物プロトコールにより生じられました。ライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。(1)6の違うJHセグメントを使用します;(2)各DHセグメントの直接配列及び逆配列(又は逆補足)を包括します;(3)全ての3の読み枠における各直接の及び逆のDHセグメントを翻訳します。これは六つのpF−VH3−23−IGHJプラスミド及び115の違うDHセグメントの初期生成を引き起こしました。各単独DHセグメントを各pF−VH3−23−IGHJプラスミドに同時にクローンするのは690メンバー重鎖ライブラリーを引き起こしました。それで、このライブラリーは、前に生じられた様々な軽鎖(例8をご参考に)により変質され、3012メンバーFabライブラリーを生じました。
この例において、それぞれVH3−23VHセグメント及び六つのJHセグメントをコード化する6のプラスミドは生じられました。これらのプラスミドが組み替えられることにより、BsaI部位は以下のために融合されました。(1)単独JHセグメント(表35をご参考に)を可能にします;(2)それから、単独DHセグメントの何れも(表37をご参考に)のクローニングを可能にします。このために、プラスミドA(配列同一性番号1)及びVHセグメントVH3−23R(配列同一性番号2050)は始めに組み替えられ、内部BsaI部位(配列同一性番号3719)を取り除きました。それから、VH3−23Rはさらに組み替えられ、以下のように二つのBsaI部位を加えました。(1)VH3−23VHセグメントの3’端において;(2)JHセグメントの枠組み地域4(アミノ酸WGQGTLVTVSSAS、配列同一性番号3456−3461、以下の表35をご参考に)を高度化する塩基の5’端において。
それから、VH3−23R(配列同一性番号2050)は標準DNA合成プロトコールにより合成されました。VH3−23RはNcoI(配列同一性番号977)及びNheI(配列同一性番号978)により消化され、組換えられたプラスミドAへ縛られ、プラスミドpF−VH3−23R(配列同一性番号2051)を作りました。
この例において、ペアになったDHオリゴは生じられ、pF−VH3−23−IGHJプラスミドへクローンされ、以下のように690新しいVH3−23重鎖を生じました。二十七(27)のDHセグメント(以下の表37をご参考に)は組み替えられた各pF−VH3−23−IGHJプラスミドへクローニングするために選ばれました。CDR3地域におけるライブラリ多様性が生じられた原因は以下のポイントにあります。(1)各DHセグメントの直接配列及び逆配列(又は逆補足)を包括します;(3)全ての3の読み枠における各直接の及び逆のDHセグメントを翻訳します。若し既知のDHセグメント用読み枠の翻訳はストップ・コドンを引き起こせば、その特定な配列及び読み枠はライブラリーから排除されました。以下の表37は各特定なDHセグメントの開けた読み枠を示します。
これらのDHセグメントはライブラリーに包括され、115の違うDHセグメントを引き起こしました。
直接の5’端:CGAAA;
直接の3’端:T;
間接の5’端:CGAAA;
間接の3’端:T
電子化学ルミネッセンス結合測定
九つの違う抗体の一つと結合することができる抗体のために、以下の表77の22−36行において表示された5376メンバーのFabライブラリー及び15の組換えFab抗体を選り分けました。例13に説明されたように、データは各ウェルの空白に対する抗原用の各ECLシグナルを比べることにより分析されました。空白比率が4又はその以上であるシグナルは「ヒット」Fabだと思われました。
表44は21Fab(Fab番号は表43において確認された各Fabと対応します)、Fab濃度、9組買え人標的/蛋白質抗原、及び既知のFab濃度での初期MSD測定選り分けからのECLシグナルをリストします。
以下の表77はMSD測定の結果を纏めます。表77は、組換え人標的/蛋白質抗原及びこれらのFabを、それぞれの重鎖及び軽鎖(配列同一性番号を包括します)により指定されたように、リストします。以下の表77に示されたように、幾つかのFabは多標的と結合すると確認されました。例えば、Fab VH1−46_IGHD2−15*01_IGHJ2*01 & L12_IGKJ1*01はEGF R、Epo R及びDLL4と結合しますが、Fab VH1−46_IGHD3−10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01はノッチ−1、P−カドヘリン及びDLL4と結合します。以下の表77は、DLL4と結合する15の他の組み替えられたFab(行22−36に表示されます)をリストします。
表面プラスモン共鳴
この例において、選ばれたFab(表78−79をご参考に)が組み替えられた人DLL4(R&Dシステム)との結合親和性は、表面プラスモン共鳴(SPR)(バイオセンサー・ツール、ソルトレイクシティ、ユタ州)により分析されました。これらのFab(表78をご参考に)は、初期ECL選り分けにおいてDLL4と結合すると確認された生殖細胞系抗体、及び初期確認された抗−DLL4Fabと比べて重鎖又は軽鎖において一つ又はその以上の変形を含む組み替えられたFabを包括します。
DLL4−ノッチ相互作用の抑制
このELLSA測定において、組み替えられた人DLL4がプレートと結合した後、Fab及びノッチ−Fcが加えられました。抗人FC−HRPと接合した抗体は、検出分子として使用されましたので、ノッチ−FcがDLL4と結合すれば、強いシグナルがA450で観測されます。代わりに、Fabがノッチ−FcとDLL4との結合を閉鎖することができれば、シグナルが観測されません。測定されたFabは、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F & L6_IGKJ1*01、Fab VH1−46_IGHD6−6*01_IGHJ1*01_S102A_S103P_S104F_H111F & L6_IGKJ1*01、Fab VH5−51_IGHD5−18*01>3_IGHJ4*01_G100K_G104T & V3−4_IGLJ1*01、及びFab VH1−46_IGHD3−10*01_IGHJ4*01 & L12_IGKJ1*01を包括します。
レセプター刺激のためのEpoR細胞を基にする測定
DLL4/Jag1の抑制
p−カドヘリンの抑制
媒介により培養された細胞は重要な「群生」だけを展示しますが、抗−P−カドヘリンFab又は抗体により培養された細胞は分散されます。
Claims (21)
- 下記A.〜C.からなる群より選択されるヒト抗体コンビナトリアルライブラリー:
A.機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
a)各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、可変軽鎖(VL鎖)および可変重鎖(VH鎖)または抗原結合部位を形成するのに十分な軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
i)各VL鎖は、VκおよびJκヒト生殖系列セグメント、またはVλおよびJλヒト生殖系列セグメントを有し、
ii)各VH鎖は、VHおよびJHヒト生殖系列セグメントを有し、
b)前記ライブラリーは、50種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー;
B.機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
a)各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、改変された可変軽鎖(VL鎖)および/または改変された可変重鎖(VH鎖)または抗原結合部位を形成するのに十分な改変された軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
i)各VL鎖は、VκおよびJκヒト生殖系列セグメント、またはVλおよびJλヒト生殖系列セグメントを有し、
ii)各VH鎖は、VH、DHおよびJHヒト生殖系列セグメントを有し、
b)前記VL鎖および/またはVH鎖は、少なくとも1つのアミノ酸の置換または挿入により改変され、
c)前記ライブラリーは、50種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー; および
C.機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを複数有し、アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーであって、前記ライブラリーの各メンバーは、機能するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントであり、
a)各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、可変軽鎖(VL鎖)および可変重鎖(VH鎖)または抗原結合部位を形成するのに十分な軽鎖あるいは重鎖の部分を含み、
i)各VL鎖は、VκおよびJκヒト生殖系列セグメント、またはVλおよびJλヒト生殖系列セグメントを有し、
ii)各VH鎖は、VH、DHおよびJHヒト生殖系列セグメントを有し、
b)前記ライブラリーは、50種類以上の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアミノ酸配列は、各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントのアドレスから、知ることができる、ことを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。 - 前記置換または挿入は、相補性決定領域(CDR)内に少なくとも1つのアミノ酸を置換または挿入することによりなされ、ここで当該CDRはCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2およびCDRL3からなる群より選択される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
- 前記置換または挿入される少なくとも1つのアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応しており、
当該ペプチド模倣物は、TPO、EPO、G−CSF、IL−5、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド(hBNP−32)、エキセンディン4、GLP−1、GLP−2、グルカゴン、PACAP−38、CD209L、TNF、VEGF、MMP阻害剤、およびCTLA−4のペプチド模倣物からなる群より選択される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。 - 前記置換または挿入される少なくとも1つのアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応しており、
当該ペプチド模倣物は、配列番号:891、および987〜1014からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。 - 前記アドレス可能なように配列されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーでは、同じアドレスには同じヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントが配され、当該アドレスと異なる他の全てのアドレスには当該ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントとは異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントが配されている、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
- VH生殖系列セグメントの全部またはサブセットがDH生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結され、当該DH生殖系列セグメントの全部またはサブセットがJH生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されることによって、VH鎖をコードする核酸分子が生成され、
Vκ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがJκ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されるか、Vλ生殖系列セグメントの全部またはサブセットがJλ生殖系列セグメントの全部またはサブセットと連結されることによって、VL鎖をコードする核酸分子が生成される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。 - 下記A.〜M.の少なくとも1つをさらに有する、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー:
A.VH生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該VH生殖系列セグメントは、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6、IGHV7、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該VH生殖系列セグメントは、配列番号:10〜238のいずれか1つから選択される;
B.DH生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該DH生殖系列セグメントは、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6、IGHD7、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該DH生殖系列セグメントは、配列番号:239〜272のいずれか1つから選択される;
C.JH生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該JH生殖系列セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5、IGHJ6、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該JH生殖系列セグメントは、配列番号:273〜285のいずれか1つから選択される;
D.DH生殖系列セグメントが親水性である、ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント;
E.Vκ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該Vκ生殖系列セグメントは、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5、IGKV6、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Vκ生殖系列セグメントは、配列番号:286〜355および868のいずれか1つから選択される;
F.Jκ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該Jκ生殖系列セグメントは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4、IGKJ5、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Jκ生殖系列セグメントは、配列番号:356〜364のいずれか1つから選択される;
G.Vλ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該Vλ生殖系列セグメントは、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10、IGLV11、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Vλ生殖系列セグメントは、配列番号:365〜441のいずれか1つから選択される;
H.Jλ生殖系列セグメントを有するヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント、 ここで、当該Jλ生殖系列セグメントは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6、IGLJ7、およびこれらいずれかの対立遺伝子変異体からなる群より選択される、あるいは、当該Jλ生殖系列セグメントは、配列番号:442〜451のいずれか1つから選択される;
I.免疫グロブリン定常領域の全部、または重鎖および軽鎖と相互作用するのに十分な定常領域の部分を有する、ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメント;
J.ライブラリ中のヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、全長抗体、および抗原結合部位を形成するのに十分な抗体断片あるいは抗体部分からなる群より選択され、ここで、当該抗体断片あるいは抗体部分は、Fab、Fab'、F(ab')2、単一鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、FdおよびFd'フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント、およびscFabフラグメントからなる群より選択される;
K.ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、空間的に配列され、かつアドレス可能である;
L.ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、溶液の状態または固体担体に担持された状態のいずれかである; および
M.ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、識別可能なようにラベルされている。 - ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントの少なくとも1つのVH鎖および/またはVL鎖の少なくとも1つは、配列の相同性または相違性、遺伝子ファミリー、長さ、組成、CDR長または組成、種、機能、特異性、グループ、あるいはサブグループに基づいて選択された生殖系列セグメントのサブセットから生成される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
- 少なくとも1つのVH鎖は、少なくとも下記A.〜C.の1つに基づいて選択される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー:
A.CDR組成、ここで、当該CDRはCDR3である;
B.遺伝子ファミリー、ここで、各VH、DHおよび/またはJH遺伝子ファミリーからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記a)〜c)から選択される、あるいは、VH、DHおよび/またはJH遺伝子ファミリーのサブセットからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記a)〜c)から選択される:
a)VH遺伝子ファミリーは、IGHV1-18、 IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1および IGHV7-81からなる群より選択される;
b)DH遺伝子ファミリーは、IGHD1-1、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6および IGHD7-27からなる群より選択される; および
c)JH遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5および IGHJ6からなる群より選択される; および
C.遺伝子ファミリー、ここで、各Vκおよび/またはJκ遺伝子ファミリーまたは各Vλおよび/またはJλ遺伝子ファミリーからの生殖系列セグメントはそれぞれ下記a)〜d)から選択される、あるいは、Vκおよび/またはJκ遺伝子ファミリーまたはVλおよび/またはJλ遺伝子ファミリーのサブセットからの生殖系列セグメントの1つはそれぞれ下記a)〜d)から選択される:
a)Vκ遺伝子ファミリーは、IGKV1-12、 IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、およびIGKV1-39からなる群より選択される;
b)Jκ遺伝子ファミリーは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4およびIGKJ5からなる群より選択される;
c)Vλ遺伝子ファミリーは、IGLV1-36、 IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61およびIGLV9-49からなる群より選択される; および
d)Jλ遺伝子ファミリーは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6およびIGLJ7からなる群より選択される。 - ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーが、50、102、103、104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、9×104、105、106、107、108または109種類の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有する、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
- ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーが、103、2×103、3×103、4×103、5×103、6×103、7×103、8×103、9×103、104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104、または9×104種類の異なるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを有し、
ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントは、空間的に配列される、請求項1に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。 - 配列はマルチウェルプレートに対応する形で構成され、プレートの各場所は異なる抗体と対応する、請求項11に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリー。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのヒト生殖系列抗体および/または抗原に結合可能な抗体フラグメントをコードする核酸分子を有する、核酸分子ライブラリー。
- 請求項1〜12いずれか1項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーを作成する方法であって、
a)ライブラリー中の各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントごとに、イン・シリコでV H およびJ H ヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、あるいは、イン・シリコでVH、DHおよびJHヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、VH鎖またはその一部分をコードする核酸分子の配列を作成する工程と、
b)ライブラリー中の各ヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントごとに、イン・シリコでVκおよびJκヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、あるいは、イン・シリコでVλおよびJλヒト生殖系列セグメントまたはその部分をインフレームでストップコドンなしで組み合わせて、VL鎖またはその一部分をコードする核酸分子の配列を作成する工程と、
c)上記工程a)およびb)を複数回繰り返して、異なる複数の核酸分子の配列を作成する工程であって、工程a)の前記VH鎖またはその一部分をコードする各核酸分子は、VH鎖またはその一部分をコードする異なる核酸分子を生成するために、V H およびJ H ヒト生殖系列セグメントの異なる組合せ、またはV H 、D H およびJ H ヒト生殖系列セグメントの異なる組合せを有し、および/または、工程b)の前記VL鎖またはその一部分をコードする各核酸分子は、VL鎖またはその一部分をコードする異なる核酸分子を生成するために、V κ およびJ κ ヒト生殖系列セグメントの異なる組合せ、またはV λ およびJ λ ヒト生殖系列セグメントの異なる組合せを有する工程と、
d)前記核酸分子を合成し、当該合成された核酸分子から2つのライブラリーを作成する工程と、 ここで当該ライブラリーは、下記(i)および(ii)で構成される、
(i)VH鎖またはその一部分をコードする各核酸分子を有する第一のライブラリー、および
(ii)VL鎖またはその一部分をコードする各核酸分子を有する第二のライブラリー、
e)上記工程d)で作成した核酸分子を発現させ、VH鎖およびVL鎖またはその断片から構成されるヒト生殖系列抗体または抗原に結合可能な抗体フラグメントを産生する工程と、を有することを特徴とするヒト抗体コンビナトリアルライブラリーを作成する方法。 - 前記抗体または抗体フラグメントを、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の純度に精製する工程、をさらに有する請求項14に記載の方法。
- 標的タンパク質に対する結合または活性によるヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング方法であって、
a)標的タンパク質を、請求項1〜12いずれか1項に記載のヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員の少なくとも1つに接触させる工程と、
b)ヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員のいずれかが前記標的タンパク質に結合するかあるいは機能的活性を調節するかを評価する工程と、を有するヒト抗体コンビナトリアルライブラリーのスクリーニング方法。 - 前記標的タンパク質は、膜結合タンパク質、細胞表面受容体(CSR)、CSRリガンド、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、または細胞接着分子である、請求項16に記載の方法。
- 前記標的タンパク質は、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52、CD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSFおよびEPOからなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記機能的活性は、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成およびシグナル伝達からなる群より選択される、請求項16に記載の方法。
- 標的タンパク質に結合する抗体または抗体フラグメントを同定する工程、をさらに有する請求項16に記載の方法。
- 標的タンパク質に結合するあるいは機能的活性を調節すると評価されたヒト抗体コンビナトリアルライブラリーの一員の結合または機能的活性の調節を最適化する工程、をさらに有する請求項16に記載の方法。
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