JP2005526518A - タンパク質ライブラリーのinsilico作成と選択 - Google Patents
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Abstract
Description
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願第10/153,159号(2002年5月20日出願、標題「抗体ライブラリーの構造ベースの選択と親和性成熟」)の一部継続出願であり、また特許出願第10/153,176号(2002年5月20日出願、標題「抗体ライブラリーのin silico(コンピューターによる)作成と親和性成熟」)の一部継続出願であり、これらのいずれも、米国特許出願第10/125,687号(2002年4月17日出願、標題「ヒト抗体ライブラリーの構造ベースの構築」の一部継続出願であり、この出願はまた、米国仮出願第60/284,407号(2001年4月17日出願、標題「ヒト抗体ライブラリーの構造ベースの構築」)の利益を請求する。これらの出願は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は一般に、標的分子に対する結合親和性を有するタンパク質のコンピューター支援設計に関し、さらに詳しくは抗体の偏りのあるライブラリーのコンピューターによる予測と実験によるスクリーニングを組合せることによる、多様な配列と標的抗原に対する高親和性とを有する抗体(または免疫グロブリン)のスクリーニング法と同定法に関する。
抗体は、脊椎動物で種々の内部および外部刺激(抗原)に応答して作成される。抗体はB細胞によってのみ合成され、数百万の型が産生され、それぞれが異なるアミノ酸配列と抗原に対する異なる結合部位とを有する。これらはまとめて免疫グロブリン(Igと省略される)と呼ばれ、血液中の最も多量なタンパク質成分の1つであり、総血漿タンパク質の20重量%を構成する。
本発明は、好ましい生物学的機能(例えば、生物学的および/または治療的に重要な標的分子に対する改良された結合親和性)を有する最適化されたタンパク質について、タンパク質ライブラリーを効率的に作成しスクリーニングするための革新的方法を提供する。この方法は、すべての生物(特にヒト)のタンパク質配列の拡張し続けるデータベースを調べることにより、コンピューターで高速処理される。タンパク質の進化するデータを利用して、in vitroまたはin vivoでの機能性スクリーニングのためにタンパク質ライブラリーの構造と構造空間の両方が拡張される。本発明の方法を使用することにより、極めて多様なタンパク質配列と機能的に関連する構造のin silicoコンピューター評価に基づいて、抗体のようなタンパク質の拡張しているが機能的に偏りのあるライブラリーを構築することができる。
リードタンパク質から得られるアミノ酸配列を提供し(アミノ酸配列はリード配列と呼ばれる);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);そして
リード配列をヒットライブラリーで置換することにより、設計したタンパク質のライブラリーの形成する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成し;そして
ヒット変種ライブラリーから好ましい機能を有するタンパク質を選択する。
また場合によりこの方法は、以下の工程をさらに含む:
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーまたはヒット変種ライブラリーのメンバーが構造的に、リード配列またはリードタンパク質の3次元構造と適合するかどうかを決定し;そして
リード配列またはリードタンパク質とスコアが同等かまたはより優れたメンバーを選択する。
また場合によりこの方法は、以下の工程をさらに含む:
ヒットライブラリー、ヒット変種ライブラリーまたは上記の構造評価に基づき選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築し;
核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。
また場合によりこの方法は、以下の工程をさらに含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築し;
縮重核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。
本発明のさらに別の態様において、リード抗体中の領域のアミノ酸配列に基づく抗体配列(以後「リード配列」と呼ぶ)のin silico選択のための方法が提供される。リード配列は、タンパク質配列のデータベースを検索するのに使用される。データベースの選択は、設計されたモチーフの特異的機能的要求に依存する。例えば、治療的応用のために可変鎖のフレームワーク領域を設計するために、いくつかの構造的に決定的に重要な部位を除いて、完全にヒトの免疫グロブリン配列およびヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列のような進化的に関連するタンパク質配列の集団を使用すべきである。これは、この高度に保存された領域(フレームワーク領域用)中にできるだけ少ない外来変異体を導入することにより、配列の起源を保持しながら免疫応答を低下させるであろう。一方、この高度に可変性の領域の抗原との結合親和性を改良するために、多様なデータベース(例えば、種々の種の免疫グロブリン配列またはジーンバンク(GenBank)中の無関係の配列)を使用してCDRを設計することができる。この方法を使用して、多様な抗体配列のライブラリーを構築し、改良されたかまたは所望の機能を有する抗体変異体について、in vitroまたはin vivoで実験的にスクリーニングすることができる。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDRとFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はCDRリード配列である);
CDRリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のCDRテスタータンパク質配列から、CDRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはCDRヒットライブラリーを形成する);
リード抗体のVHまたはVL領域中に1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はFRリード配列である);
FRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、FRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する);そして
CDRヒットライブラリーとFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
また本発明において複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト起源のアミノ酸配列、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体(例えば、VHまたはVL中に少なくとも50%のヒト配列、好ましくは少なくとも70%のヒト配列、さらに好ましくは少なくとも90%のヒト配列、および最も好ましくは少なくとも95%のヒト配列)、さらに好ましくは完全にヒト抗体、および最も好ましくはヒト生殖細胞系抗体を含んでよい。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第1のFRリード配列である);
第1のリードFR配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第1のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する)。
選択されたFRとは異なるFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第2のFRリード配列である);
第2のFRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第2のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントは第2のFRヒットライブラリーを形成する);そして
第1のFRヒットライブラリーと第2のFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築する。
本発明の別の態様において、リード抗体中の領域のアミノ酸配列(すなわち「リード配列」)に基づく抗体配列のin silico選択のための方法が提供される。リード配列の構造は、同様の3D構造を有するセグメントのタンパク質構造のデータベースを検索するのに使用される。これらのセグメントは、配列プロフィール(本明細書において以後「リード配列プロフィール」と呼ぶ)を与えるように整列される。リード配列プロフィールは、低い配列同一性であるが構造が同様のリード配列の遠い相同体のタンパク質配列のデータベースを検索するのに使用される。この方法を使用して、多様な抗体配列のライブラリーを構築し、改良されたかまたは所望の機能を有する抗体変異体について、in vitroまたはin vivoで実験的にスクリーニングすることができる。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列の3次元構造を提供し;
リード配列の構造に基づいてリード配列プロフィールを作成し;
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根を決定し;
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が5Å未満、好ましくは4Å未満、さらに好ましくは3Å未満、および最も好ましくは2Å未満であるテスタータンパク質セグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
場合により、リード配列プロフィールを作成する工程は以下を含む:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションのZスコアを決定し;
Zスコアが2より大きい、好ましくは3より大きい、さらに好ましくは4より大きい、および最も好ましくは5より大きいテスタータンパク質セグメントのセグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
本方法はさらに以下の工程を含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
核酸または縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1、好ましくは107 M-1、さらに好ましくは108 M-1、および最も好ましくは109 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列より低いかまたは同等の総エネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列より小さい結合フリーエネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
場合により本方法はさらに以下の工程を含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3D構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを作成し;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
出現頻度が4回より大きい、好ましくは6回より大きい、さらに好ましくは8回より大きい、および最も好ましくは10回より大きいアミノ酸変種を選択し(カットオフの頻度の2%〜10%、好ましくは5%であり、カットオフ後に失われた場合は、リード配列からのアミノ酸の一部を含む);そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。
場合によりスコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールド、および他の知識ベースの統計的フォースフィールド(平均フィールド)および構造ベースの熱力学ポテンシャル関数よりなる群から選択されるフォースフィールドを含むものである。
ヒットライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
場合により本方法は以下の工程を含む:
ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーを少なくとも2つのサブヒット変種ライブラリーに分割し;
サブヒット変種ライブラリーを選択し;
選択されたサブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、選択されたサブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード配列と同等かまたはより優れたスコアを有するヒット変種ライブラリーの10〜30メンバーをランダムに選択する(選択されたメンバーはサブ変種ライブラリーを形成する)。
ヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成して、ヒット変種プロフィールを得て;
ある距離のカットオフ(8Å〜4.5Å)以内のリード配列の構造体または構造集合体のCαもしくはCβまたは重い原子の接触地図に基づき、ヒット変種プロフィールをサブ変種プロフィールのセグメントに分解する。4.5Å、好ましくは5Å、さらに好ましくは6Å、および最も好ましくは8Å以内の構造モデルもしくはリード構造鋳型。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
リード抗体以外のVHもしくはVL領域中の異なる配列を有する1つ以上の抗体の3D構造を提供し;
リード抗体と1つ以上の抗体の構造体とを組合せて構造集合体を形成し(構造集合体はリード構造鋳型として定義される);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
f) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
g) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
h) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
i) スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
j) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
k) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
l) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程j)〜l)を繰り返し;
m) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
n) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
o) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
p) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜o)を繰り返す。
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列の1つ以上のアミノ酸残基を1つ以上の異なるアミノ酸残基で置換してリード配列を変異させて、リード配列変異体ライブラリーを作成し;
f) 第1のスコア化関数を使用して、リード配列変異体ライブラリーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
g) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのリード配列変異体を選択し;
h) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
i) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
j) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
k) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種の組合せを生成させ;
l) 選択された配列変異体をヒット変種の組合せと組合せて、ヒット変種ライブラリーを産生させ;
m) 第2のスコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
n) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
o) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
p) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程n)〜p)を繰り返し;
q) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
r) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
s) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
t) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜s)を繰り返す。
入力としてリード抗体のCDR領域中の少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を取り(アミノ酸配列はリード配列である);
コンピューターが実行できるロジックを使用してリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドを作成する。
上記の任意の方法において、リード配列の長さは好ましくは5〜100aa、さらに好ましくは6〜80aa、および最も好ましくは8〜50aaである。
また上記の任意の方法において、リード配列は、リード抗体のVHもしくはVL、CDR1、CDR2もしくはCDR3、またはCDRとFRの組合せ(例えば、CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3)内の特定の領域、および完全長VHもしくはVL配列からのアミノ酸配列を含む。リード配列は好ましくは、選択されたCDR中に少なくとも6つの連続的アミノ酸残基、さらに好ましくは選択されたCDR中に少なくとも7つの連続的アミノ酸残基、およびまた好ましくは選択されたCDR中にすべてのアミノ酸残基を含む。
また上記の任意の方法において、リード配列は、選択されたCDRにフランキングする少なくとも1つのFRをさらに含む。
また上記の任意の方法において、リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる。
また上記の任意の方法において、方法は以下の工程をさらに含む:
核酸もしくは縮重核酸ライブラリーによりコードされるヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体を宿主生物の細胞中に導入し;そして
106 M-1、好ましくは107 M-1、さらに好ましくは108 M-1、および最も好ましくは109 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。
宿主生物は、移動された外来遺伝子配列を発現することができる任意の生物またはその細胞株を含み、特に限定されないが酵母、植物、昆虫および哺乳動物がある。
本発明のさらに別の態様において、コンピューターで読める媒体が提供される。コンピューター媒体には、リード抗体に基づく変異抗体のライブラリーを構築するためのロジックがあり、このロジックは以下を含む:
入力として、リード抗体のCDR中に少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を含み(アミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドセグメントを作成する、ロジック。
別の実施態様においてモノクローナル抗体の重鎖CDR1は、配列番号19〜30よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
場合によりモノクローナル抗体の重鎖CDR3は、配列番号36〜48および63〜125よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、かつモノクローナル抗体の重鎖CDR1は、配列番号19〜30よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
上記の任意の実施態様において、設計されるタンパク質(例えば抗体)は、合成されるか、またはタグタンパク質もしくはペプチドとの融合タンパク質として発現される。タグタンパク質またはペプチドは、設計されるタンパク質を同定、単離、シグナル化、柔軟性の上昇、分解の上昇、分泌、移動、または細胞内保持の上昇、またはその発現の増強をするのに使用される。
構造クラスター:自乗平均の平方根(RMSD)のいくつかの経験的に選択されたカットオフ値(例えば、整列した残基のCα原子の)と統計的有意性(Zスコア)に基づき、ファミリーに集めた一群の構造。これらの値は、目的の構造の間で全体に比較後、経験的に決定される。構造クラスターを検索するのにいくつかのプログラムを使用することができる。CE(コンビナトリアル伸長)アルゴリズム(Shindyalov IN, Bourne PE (1998) Protein Engineering 11:739-747)については、使用される基準はRMSD<2ÅかつZスコア>4である。MAPS(タンパク質構造の多重整列(Multiple Alignment of Protein Structures))は、複数のタンパク質構造の比較のための自動プログラムである。このプログラムは、共通の構造類似性の3Dモデルを自動的に重ね合わせ、すべての構造中でどの残基が構造的に同等であるかを検出し、残基対残基整列を提供する。構造が同等の残基は、すべてのタンパク質の主鎖と側鎖原子のおよその位置に従って定義される。構造類似性に従って、プログラムは構造多様性のスコアを計算し、これは系統樹を構築するのに使用することができる(Lu, G (1998) 「タンパク質構造の多重整列のためのアプローチ」)。構造集合において、ファミリー内の構造鋳型の分布、および構造ファミリー内の配列もしくは配列プロフィールへの制約に関する共通の情報を理解するために、構造クラスター内のメンバーが分析される。
配列レパートリー:タンパク質ファミリーの配列の集まり。
構造空間:構造レパートリーを参照。
機能空間:機能性レパートリーを参照。
変種プロフィール/配列プロフィール/位置変種プロフィール(PVP):あるセットのペプチド配列についての各位置のアミノ酸エントロピーの記載。これは、アミノ酸(AA-PVP)または核酸(NA-PVP)の範囲と頻度の両方を含む。
本発明は、改良された生物学的機能、例えば生物学的および/または治療的に重要な標的分子に対する改良された結合親和性を有する、最適化されたタンパク質について、タンパク質ライブラリーを効率的に作成しスクリーニングするシステムと方法を提供する。この方法は、すべての生物、特にヒトのタンパク質配列の拡大し続けるデータベースを調べることにより、コンピューターにより高速に処理される。自然からの進化的配列のデータベース調査と、天然の配列の構造が関連する変種のコンピューターによる設計とを組合せて、本発明の方法は、タンパク質ライブラリーのコンピューターによる設計と機能的スクリーニングにおいて、他の方法からの明確な飛躍である。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
この方法は以下の工程をさらに含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDRとFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はCDRリード配列である);
CDRリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のCDRテスタータンパク質配列から、CDRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはCDRヒットライブラリーを形成する);
リード抗体のVHまたはVL領域中に1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はFRリード配列である);
FRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、FRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する);そして
CDRヒットライブラリーとFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
場合により本方法は以下の工程をさらに含む:
CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第1のFRリード配列である);
第1のリードFR配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第1のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する)。
選択されたFRとは異なるFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第2のFRリード配列である);
第2のFRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第2のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントは第2のFRヒットライブラリーを形成する);そして
第1のFRヒットライブラリーと第2のFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列の3次元構造を提供し;
リード配列の構造に基づいてリード配列プロフィールを作成し;
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根を決定し;
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が5Å未満、好ましくは4Å未満、さらに好ましくは3Å未満、および最も好ましくは2Å未満であるテスタータンパク質セグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
場合により、リード配列プロフィールを作成する工程は以下を含む:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションのZスコアを決定し;
Zスコアが2より大きい、好ましくは3より大きい、さらに好ましくは4より大きい、および最も好ましくは5より大きいテスタータンパク質セグメントのセグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
核酸または縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1、好ましくは107 M-1、さらに好ましくは108 M-1、および最も好ましくは109 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーがリード配列プロフィールと構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列より低いかまたは同等の総エネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列より小さい結合フリーエネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択する。
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。
ある実施態様において、本方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3D構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを作成し;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
出現頻度が4回より大きい、好ましくは6回より大きい、さらに好ましくは8回より大きい、および最も好ましくは10回より大きいアミノ酸変種を選択し(カットオフの頻度の2%〜10%、好ましくは5%であり、カットオフ後に失われた場合は、リード配列からのアミノ酸の一部を含む);そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。
ヒットライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
リード抗体以外のVHもしくはVL領域中の異なる配列を有する1つ以上の抗体の3D構造を提供し;
リード抗体と1つ以上の抗体の構造体とを組合せて構造集合体を形成し(構造集合体はリード構造鋳型として定義される);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。
本発明は、分子生物学、特にタンパク質折り畳みと設計の分野に長い間存在する問題に対する革新的解答を提供する。本発明者らが開発したアプローチは、タンパク質折り畳みと設計の最良のアイデアを組合せて、強力な統合システムとし、これは、高速処理と低コストで現実的応用のための新規タンパク質製剤を開発することができる。
本発明者らは、分子生物学における中心的課題は、タンパク質、RNAおよびDNA分子のようなバイオポリマーの機能性レパートリーを、その配列と構造で描写することであると考えている。バイオポリマーの機能性レパートリーは、進化の過程の選択的圧力と、種々の環境条件下でのバイオポリマーの折り畳みと安定性に対する部分的制約の複雑な相互作用により作成される。天然のバイオポリマーとランダムポリマーとの差は何か。天然に存在するバイオポリマーの機能、配列および構造空間の豊富な多様性を利用して、安定な構造と正しい生物学的機能を有する新規バイオポリマーを作成するための、最適の方策は何か。これらの問題に対する答は、分子設計と進化、特に結合活性と触媒活性が上昇した新規タンパク質の発見に特に重要である。
タンパク質は、多様な生物学的機能を行うための基本的な分子である。タンパク質は、その線形配列をユニークな3次元構造に折り畳むことにより、その生物学的機能を獲得する。配列からタンパク質構造を予測することは、未解決の問題である。しかし、特に中間体の集合と折り畳み経路の遷移状態の統計的解釈の出現により、タンパク質折り畳みの機構の理解に重要な進展がなされている。
遺伝子型(配列) ← 一致スコア → 表現型(構造)
タンパク質工学の主要な目標は、新規または改良された機能を有するタンパク質を作成することである。このために、所望の性質を有するタンパク質(主に酵素)を得るために2つのアプローチが使用されている:in vitro指令分子進化と構造ベースのコンピューターによる設計。in vitro指令進化のアプローチは、相同配列、ランダム突然変異誘発および遺伝子シャフリングを使用して、多様な配列ライブラリーを作成する。所望の性質を有する変異体は、高速スクリーニングにより選択され、再シャフリングされる。この方法は、所望のレベルの機能的増強が達成されるまで繰り返される。
本発明は、集合ベースの統計的方法を使用することにより、タンパク質配列と構造空間において一致およびエネルギー背景の分布を効率的にマッピングするための革新的アプローチを提供する。
非常に多様なライブラリーからの抗体の選択は、広範囲の配列をカバーすることを可能にし、こうして最適配列を見つける機会を大きくする。しかし、例えばCDR中のリード抗体のランダム突然変異誘発から得られる抗体配列については、ランダム化したCDRの必ずしもすべての構造が、リード抗体の3D構造と適合性があるわけではない。ランダム突然変異誘発からのタンパク質配列とは反対に発現されたタンパク質配列を使用し、本発明の方法を使用して適合しない配列をフィルターにかけることにより、より少ない数の配列が選択される。その結果、スクリーニングされる抗体の配列空間は、変異抗体の親和性結合成熟と安定化に極めて関連する配列を失うことなく、サイズが低下する。
この方法は、配列、構造および機能空間の探索と、これらの間の関係の評価を含む(図1A〜D、1E〜H、2A〜C)。出発点は、利用可能なら、リード構造またはリード配列またはその両方である。方法は、機能的スクリーニングのために最適化された変種プロフィールを同定するために、配列空間と構造空間の両方を系統的に調べる。3つのモードの情報交換がある:i) 配列および/または構造空間中の情報の別々の評価と次に組合せ、ii) 配列から構造へ、または構造から配列へ、またはiii) 配列または構造単独からの連続的評価。配列設計は配列空間と構造空間で別々に調べられる(2つの別のサイクル)が、これらの2つの別々のサイクルからの変種プロフィールを比較し、組合せて、機能的スクリーニングにおける強力候補を産生する可能性のある良好なコンセンサス変種プロフィールを有する最適の全体的変種プロフィールに到達することができる。
配列空間では、目標は、標的機能について最適化された変種プロフィールを決定することである。このサイクルは、データベース配列検索と配列プロフィールを使用した整列によるヒットライブラリーの同定で始まる。これは、単純なBLAST検索またはプロフィールHMMのような確率的アプローチである。ヒットライブラリー内の変動に基づき、配列がフィルター化され分割される。これは、各位置のアミノ酸頻度と分布を評価することにより行われる。通常各位置で最も高い頻度を有する残基ならびに標的配列からの残基が、変種プロフィール内に含まれる。変種の頻度の分布、または各位置で比較的より高くランク付けされるアミノ酸に依存するカットオフ値(それぞれ5%またはそれ以上)を、変種プロフィール内に含めることができる。
構造空間では、目標は、標的機能について最適化されている変種プロフィールを決定することであるが、1つの構造または構造の集合で出発して、次に構造の集合の平均に基づいて配列をスコア化する。このサイクルはあるセットの構造と、コンピューターによりスクリーニングできスコア化関数を使用して評価できる関連する配列に開始する。
設計プロトコールの最初の結果は、最適化変種プロフィールである。これは、配列と構造評価の両方の結果を具体化し、その結果進化的および構造的選択が設計中に取り込まれる。機能空間中の以後の工程は、このプロフィールを評価し改良することを目的とするが、必要であれば、以前の工程を修飾して、設計プロトコール中の種々の工程で、生じるライブラリーの循環濃縮が行われる。
本方法は以下の工程を含む:
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
f) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
g) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
h) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
i) スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
j) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
k) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
l) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程j)〜l)を繰り返し;
m) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
n) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
o) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
p) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜o)を繰り返す。
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列の1つ以上のアミノ酸残基を1つ以上の異なるアミノ酸残基で置換してリード配列を変異させて、リード配列変異体ライブラリーを作成し;
f) 第1のスコア化関数を使用して、リード配列変異体ライブラリーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
g) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのリード配列変異体を選択し;
h) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
i) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
j) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
k) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種の組合せを生成させ;
l) 選択された配列変異体をヒット変種の組合せと組合せて、ヒット変種ライブラリーを産生させ;
m) 第2のスコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
n) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
o) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
p) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程n)〜p)を繰り返し;
q) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
r) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
s) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
t) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜s)を繰り返す。
機能空間では、目標は、最適化変種プロフィールから得られるライブラリーを発現しスクリーニングすることである。機能的サイクルを含む2つの成分がある。機能に直接影響を与えないかも知れないがタンパク質の発現に重要な操作成分は、オリゴヌクレオチドの最適化である。オリゴヌクレオチドライブラリーのサイズに対する現実的制限の決定は、変種の配列分割と再プロフィール化へのガイドとして使用される。
設計プロトコールは、評価される異なる空間に従って分割されるが、すべての操作サイクルは相互に関連し統合されて、情報を交換することができ、任意の空間を自由に循環して、最適化変種プロフィールに基づきライブラリーを連続的に改良および濃縮する。その結果、標的配列または構造から候補配列への経路は単一の経路ではなく、3つのサイクルの間の一連の振動であり、それぞれが最適化変種プロフィールの選択を改良する。
上記したように、ヒット変種ライブラリー中の配列は、抗原の存在下および非存在下でのリード抗体との構造的適合性に基づいて評価することができる。構造評価から得られるスコアとランク付けに従って、ヒット変種ライブラリー中の配列は再プロフィール化されて、機能的配列のための配列および構造空間の試験を最適化する。この工程は、リード配列よりスコアの良いヒット変種ライブラリーのサブ集団の選択と、最適化ライブラリーを作成するためのそれらの再プロフィール化とを含む。1つの選択肢は、リードよりスコアの良いすべての配列の再プロフィール化である。しかしこれは、実験によるスクリーニングのためのライブラリーが大きくなりすぎる。好適な方法は、ある低エネルギー窓またはいくつかのそのようなサブセット中の配列サブセットを選択することである(図7)、これは、後述の欄と図6に概説されるように、実験的核酸ライブラリーの最終的サイズを小さくするであろう。合理的選択と設計とを組合せると、この工程は、スコアの良い配列を有するライブラリーを濃縮するはずである。
サイズを制御する他の方策は、構造空間中の構造的に相関する断片と相関しない断片に基づいて、配列を分割することである。より小さい変種プロフィールを有するこれらの分割した配列は、いくつかの小さいライブラリーを作成するのに使用することができる。この説明は、第1近似として構造が離れたセグメントはしばしば無関係であり、その結果大きく分かれた変異は独立に処理することができるが、空間中で互いに結合する断片は、コンビナトリアル核酸ライブラリーにより同時に標的化すべきであるというものである。ループの場合は、ループの基部を形成する配列は一般にループの閉鎖に関連するが、頂部はしばしばループの基部とは相関しない。そのような場合、アミノ酸サブ変種プロフィールは3つのセグメントに分割され、第1と第3のセグメント(ループの基部)があるプロフィールとライブラリー設計に使用され、第2のセグメント(ループの頂部)は第2のプロフィールとライブラリー設計に使用される。生じるライブラリーの間の小レベルの構造的相関を維持するために、断片間に2または3つの位置重複があるはずである。同様に、より長いプロフィールは、配列と対応するライブラリーの長さにまたがるようにするために、重複セグメントの連鎖に分割することができる。CαまたはCβ距離マトリックスのような単純な基準を調べて、相関するセグメントを同定することができる(図28A)。場合により、より詳細な相互作用マトリックスをマッピングして、相互作用の数と種類を調べることができるが、基礎的原理は相関セグメントを同定するものと同じである。
図1Aに例示されるようにヒットライブラリーは、リード抗体の領域からのリード配列に基づいてin silicoで構築することができる。タンパク質配列のデータベース(例えば、NIHのジーンバンク(GenBank)、または抗体のCDRのKabatのデータベース)からの配列を、リード配列との整列に基づいて、種々の配列整列アルゴリズムを使用して検索する。
さらに、リード抗体について見つかる配列のヒットしたものの上のものは、リード抗体の3D構造と適合性のある最適な「コンセンサス」コンビナトリアル配列を選択するために、コンビナトリアルアプローチで各位置の多重アミノ酸を逆スレッディングすることによりプロフィール化される。コンセンサス配列を捜すこのプロセスは、Knappikら(2000)が記載した各位置の単純な配列平均を使用する方法とは異なる。本発明のコンセンサス配列は、各位置で可能なアミノ酸のすべての可能な組合せを使用して構造ベースの逆操作アプローチを使用して、検索された配列に基づいて作成され、構造鋳型とのその適合性をスコア化することにより最適化される。
タンパク質の構造および配列空間中にコードされる豊富な多様性をさらに調べるために、配列整列に基づいて選択されたヒットは、変種プロフィールを作成するために配列の各アミノ酸位置でプロフィール化される。ヒット変種ライブラリーは、この変種プロフィールを使用してコンビナトリアル的に算出される。図4は、ヒット変種ライブラリーを構築するための方法の例である。ヒットライブラリー(すなわち、配列ヒットまたはフィルターにかけた配列ヒット)から作成される変種プロフィールは、ヒット配列中の各位置に現れるアミノ酸の頻度に基づいて記載される(図11と19B)。プロフィール化された変種は、コンビナトリアルライブラリーを構築するための優れた出発点となる。
上記したようにヒットライブラリーまたはヒットライブラリーからの変種プロフィールの組換えから得られるヒット変種ライブラリーは、リードタンパク質との構造的適合性に基づいて評価してもよい。抗体変種ライブラリーの構造ベースの評価のために本発明は、以下の問題を扱う:i) 抗体とタンパク質複合体を形成する抗原の存在下で、非標準ループのコンフォメーションを如何にモデル化するか;(ii) 抗体および/または抗原構造を最適に適合させるために、CDRループ骨格に側鎖を如何に置くか;(iii) 高親和性を有する安定な抗体−抗原複合体を形成させるために、CDRループを最適なフレームワークモデルと如何に組合せるか。実施法は以下に詳述される。
リード抗体の構造鋳型は、X線またはNMR構造から直接取られるか、または後述の構造的コンピューターエンジンを使用してモデル化される。実施例の欄に示すように、抗VEGF抗体の構造鋳型はPDBデータベースから取られる(親抗体用に1BJ1、そして成熟抗体用に1CZ8)。両方の鋳型を抗原VEGFの存在下と非存在下で使用した。実施例に記載のスコア化は、抗原VEGFの存在下の1CZ8からである。
例として、既知の3D構造を有する抗体がリードタンパク質として機能する。代替法(例えば、相同性ベースのモデル化)を応用して、操作される標的タンパク質について妥当に規定された鋳型構造を作成できるため、充分規定された構造(例えばX線結晶学により得られるもの)のこの要件は絶対的ではない。ヒット変種ライブラリーの作成には、アミノ酸位置変種プロフィールの決定、修飾、および最適化が必要である。リード配列およびヒットライブラリーとヒット変種ライブラリー中の配列は、リード抗体の3D構造の点でスコア化され、これらの配列についてランク付け分布を得るためにスコア化される。実施例の欄のスコア化は経験的な全原子エネルギー関数に基づいているが、任意のコンピューターで扱えるスコア化または一致関数を応用して、これらの配列を構造的に評価できることに注意されたい。
場合により、リード、ヒットライブラリーおよびヒット変種ライブラリーからの配列を、リガンドまたは抗原、例えばVEGFとの複合体中のリード抗VEGF抗体の存在下で、リード構造鋳型に基づいて評価することができる。このアプローチは、リードタンパク質とそのリガンドにより形成される複合体の構造が公知であるかまたは容易に確認できる時、有用である。
抗原とその抗体の間で複合体構造を持ち、抗体ライブラリーを抗原に結合する良好な確率を有する配列に焦点を当てることが好ましい。残存ながら、生物医学的関心のある抗体について、抗体と抗原の複合体構造はまだ利用できない。
リード構造鋳型に対してライブラリーをモデル化し評価するのに多くのプログラムが利用できる。例えばこれらの目的に分子力学ソフトウェアが使用され、さらなる例には、特に限定されないが、CONGEN、SCWRL、UHBD、GENPOLおよびAMBERがある。
本発明のある実施態様において上記セクション3と4に記載の配列評価プロセスからの選択された配列の構造評価のために、コンピューターによる分析が使用される。この評価は、経験的かつパラメータ化したスコア化関数に基づき、以後の必要なin vitroスクリーニングの数を減少させることを目的とする。
ΔEtotal = Ebond + Eangel + Edihed + Eimpr + Evdw + Eelec + Esolvation + Eother
または、結合フリーエネルギーは、改良スコア化関数
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
ここで
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2)
を使用して、結合および非結合状態の差として計算される。
タンパク質のコア内の正しいパッキング相互作用をスコア化するための重要な相互作用であるファンデアワールス(vdw)相互作用を使用して、計算で許容されたロタマー配列を試験することによりタンパク質コア配列を設計した(Ponder JW, Richards FM (1987) J Mol Biol 193, 775-791)。確率アルゴリズムを用いるシミュレートした進化を使用して、ポテンシャル関数下で一群の配列を選択することができる;タンパク質の疎水性コア中の残基について選択された配列のエネルギーのランク順序は、その生物活性とよく相関する(Hellinga HW, Richards FM (1994) PNAS 91, 5803-5807)。
場合により、分子動力学または他のコンピューター法を使用して、配列をランク付けするのに使用される構造集合体や集合平均スコアを生成することができる(Kollman PA, Massova I, Reyes C, Kuhn B, Huo SH, Chong LT, Lee M. Lee TS, Duan Y, Wang W, Donini O, Cieplak P, Srinivasan P, Case DA, and Cheatham TE (2000) Acc. Chem Res. 33, 889-897)。集合構造体から計算される平均的性質は、実験測定からの対応するデータとより良好な相関を示す。
あるいは、リード抗体の3D構造に基づき変異体抗体ライブラリーが直接構築され、次にin vitroまたはin vivoで所望の機能についてスクリーニングされる。このアプローチは、ヒット変種ライブラリーの構築を避けることにより近道をし、タンパク質データベースをスクリーニングすることにより構築されるヒットライブラリーからの配列を直接評価する。このアプローチは、図1Cまたは1E-Hに経路IIIとして記載されている。
場合により、PSI-BLASTを使用して、鋳型抗体のCDR H3の配列相同物を検索してもよい。
ヒットライブラリーの各メンバーは、鋳型抗体中の対応する領域(例えばCDR H3)に移植され、抗体の残りとの構造的適合性について、上記セクション5に記載のスコア化関数を使用して試験される。
in vitroまたはin vivoの機能的スクリーニングを促進するために、本発明の上記方法を使用して選択されるアミノ酸配列をコードする核酸ライブラリーが構築される。核酸ライブラリーのサイズは、アミノ酸配列を選択しプロフィール化するための具体的な方法に依存して変化する。例えば、あまりにも多くのアミノ酸配列が選択され組換えられる場合は、核酸のサイズは>106に達しても良い。実験的に効率的で完全なスクリーニングを促進するために、アミノ酸配列の分割および再プロフィール化を行って、核酸ライブラリーのサイズが小さくされる。上記セクション5に記載のように、例えばヒット変種ライブラリーIIを作成するのに使用されるプロフィールはまた、in vitroもしくはin vivoの実験によるスクリーニングのための核酸ライブラリーのサイズを測定するのに使用される。
配列ライブラリーをより小さい成分に分割することにより、変異体ライブラリーを構築することができる。これは、低分解構造しか利用できないかまたは全く構造が利用できない場合も、有利である。配列を重複する連続的配列セグメントに分割することにより複合体ライブラリーが設計される。各断片は縮重核酸ライブラリーを用いて標的化することができる。低分解構造しか利用できないかまたは全く構造が利用できない場合も、構造が結合していることが測定される変種は、縮重核酸ライブラリーを使用して同時に標的化されることを注意されたい(後述の実施例を参照)。このアイデアはセクション2の7)に記載されており、後述の実施例で例示される(設計については図28A〜D、実験結果については図30と36を参照されたい)。
アミノ酸配列と構造モチーフの大きなコンビナトリアル空間を試験し、タンパク質間の分子間相互作用をスコア化することにより、アミノ酸配列のライブラリーをコンピューターでスクリーニングすることができる。ここで使用される特異的抗体−抗原複合体について、それぞれリード配列単独、抗体構造、および抗体と抗原の複合体構造に基づいて、抗体のいくつかのライブラリーが設計され構築される。すべてのライブラリーは、その配列および/または構造がリード抗体に偏りがある;その一部は複合体中の特異抗原に対する。すなわち抗体ライブラリーは、cDNAライブラリーからまたは特異抗体リードのランダム突然変異誘発からの抗体の集まりより、濃縮されており関連する。これらのライブラリーは、特異抗原を用いる親和性成熟について実験的にスクリーニングされる。CDR中のリード抗体配列とは異なる種々の配列が選択される(図16Aと27を参照)。選択された配列の一部は、リード抗体(または親抗体)より遅いオフレート(より高い親和性を示唆する)を示す。この中で、2つの変異体(図30と36を参照)(例えばH97Yおよび/またはS101T)が、文献で報告された親和性成熟したVH CDR3配列中の決定的に重要な変異体と同一であるが、1つの新規変異体(S101R)は、文献で報告されたS101Tより、2つの独立した実験系で測定すると、オフレートパニングが良好であった(Chen Y, Wlesmann C. Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM (1999) J Mol Biol 293, 865-881)。
抗体ライブラリーのin silico構築のために本発明の方法を使用した。抗体設計において本発明を証明するために、原理の証明実験の抗原として血管内皮増殖因子(VEGF)を選択する。VEGFとその受容体については、豊富な配列および構造情報が利用できる(Muller YA, Christinger HW, Keyt BA, de Vos AM (1997) Structure 5, 1325-1338; Wiesmann C. Fuh G, Christinger HW, Eigenbrot C, Wells JA, de Vos AM (1997) Cell 91 , 695-704)、VEGFとそのヒト化抗体との複合体(Muller YA, Christinger HW, Li B, Cunningharn BC, Lowman HB, de Vos AM (1998) Structure 6, 1153- I167、およびVEGFとその成熟抗体との複合体(Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW. McKay P, de Vos AM (1999) J Mol Biol 293, 865-881)。これらは、本発明の方法を試験するための良好な根拠を提供する。本発明により提供される方法を使用することにより、抗体配列、抗体の構造、抗体とその抗原との複合体構造からの増加してきた情報を利用して、抗VEGF抗体のいくつかのデジタルライブラリーがin silicoで設計された。1本鎖または2本鎖の抗体結合単位を用いる2つの独立の新規ファージ表示系(phage display system)により、VEGFへの高親和性結合について、抗体ライブラリーの集団をin vitroでスクリーニングした。
VEGFは発生における主要な血管形成因子であり、内皮細胞を刺激することにより固形腫瘍の増殖に関与する。マウスモノクローナル抗体はVEGF依存性細胞増殖を阻止し、in vivoで腫瘍増殖を遅らせることがわかった(Kim KJ, Li B, Winer J, Armanini M, Gillett N, Phillips HS, Ferrara N (1993) Nature 362, 841-844)。このマウス抗体はヒト化(Presta LG, Chen H, O'Connor SJ, Chisholm V, Meng YG. Krummen L, Winkler M, Ferrara N (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599; Baca M. Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684)、およびファージ表示とオフレート選択を使用して親和性成熟された(Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B. Christinger HW, McKay P, de Vos AM (1999) J Mol Biol 293, 865-881)。VEGFと親抗体との間で形成された複合体(Muller YA, Chen Y, Christinger HW, Li B. Cunningham, BC, Lowman HB, de Vos AM (1998) Structure 6, 1153-1167)、ならびにVEGFと成熟抗体との間で形成された複合体(Chen Y. Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM, Lowman HB (1999) J. Mol Biol 293, 865-881)のX線構造が報告された。
VH CDR3のリード配列は、Kabat分類に従って親抗VEGF抗体から取られ、隣接フレームワーク領域からのアミノ酸残基CAKとWGがそれぞれN末端とC末端でVH CDR3配列をフランクする(図9B)。図9Bに示すように、親抗体と成熟抗体のVH CDR3は2つのアミノ酸位置のみが異なる。親抗体のVH CDR3配列のみを使用して、タンパク質データベース検索のためのHMMを作成した。
単一のリード配列(配列番号5)(図9B)を使用して作成したHMMを較正し、Kabatデータベース(Johnson, G and Wu, TT (2001) Nucleic Acids Research, 29, 205-206)を検索するのに使用した。予測値すなわちE値より大きいすべての配列ヒットを記載し、HAMMER2.2.1パッケージを使用して整列する。ヒットリストから重複し成熟した配列(すなわち、成熟配列が利用できないと仮定して配列番号6)を除去した後、リードHMMについて残りの107個のヒット配列がヒットライブラリーを形成する。
変種プロフィールは、各位置でおよび好適な順序の具体的な変異体で、好適なアミノ酸残基上で有益であるが、これは、膨大な数の組換え体を具体化する。頻度カットオフを使用するあるフィルター化は、コンピューターによるスクリーニングで評価されるかまたは実験ライブラリーにより直接標的化される必要があるコンビナトリアル配列を減少させる。変種プロフィールに適用されるカットオフを用いてさえ、実験によるスクリーニングのために最終配列でスコア化され評価される必要がある多くのコンビナトリアル配列がある(図13A〜Cおよび28A〜Dに示す)。
ほとんどの好適な残基を維持しながらライブラリー候補のサイズを低下させるために、上記したようにヒット変種ライブラリーからの変種プロフィールをフィルターにかけた。図13Aの上の部分は、カットオフ値より出現頻度が小さいアミノ酸で構造ベースの評価で排除した後の、ヒット変種ライブラリーからのランク上位の10個の選択された配列の低下した変種プロフィールを示す。リストは、標的抗原に結合できる多様な配列の選択における本発明の証明についての盲検法として選択した。変種ライブラリーの1つのコンピューターによるスクリーニングからの10個の選択された配列には、いくつかの共通の特徴がある:例えばVEGF抗原の存在下または非存在下で鋳型構造として1bj1または1cz8を使用してランク上位の200個の配列について、R94、Y97およびR100aはいつも対応するK94、H97およびS100aより優れている。後に実験の欄で示すように、実際H97Yは親和性成熟のための良好な変異体である。しかし。アルギニンへのK94RおよびS100aRのような変異は興味深い例である:一方で、K94Rは親和性成熟の良好な変異体ではないが、K94RはKabat分類に従うとCDRとフレームワークの境界にあり、ヒトフレームワーク配列にとっては進化的に好適である。本発明の実験的選択で証明されるようにK94はR94より好適(図30と36)であり、これは、R94変異が抗VEGF抗体の結合親和性を上昇させるという文献(Baca M, Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684)の観察結果と一致する。他方で、S100aRはVH CDR3成熟の最も重要な単一の変異の1つであり、文献で報告されているようにS100aTより好適であり、ファージ表示において厳しい洗浄条件下でも多数回のラウンドのパニングでも持続する(図30と36を参照)。
好適なスコアおよび/または好適な相互作用に参加する可能性のある残基の存在に基づいて上位の配列を選択する方策を使用して、核酸ライブラリー設計のためのアミノ酸配列のクラスターを同定した(図7)。上記したように、コンピューターによる評価からのそれぞれVH CDR3、CDR1およびCDR2についての図13A〜Cの配列(例えば10個の配列)のクラスターを、in vitroでのさらなる実験のために選択した。ペプチド配列と各位置の変種を図13Aの左上部分に記載する。フィルターにかけた変種プロフィールに基づいてコンビナトリアルライブラリーを作成し、ヒット変種ライブラリーIIを形成した。抗VEGF(図13A)のVH CDR3について、ヒット変種ライブラリーIIのサイズは、リード配列よりスコアの良い選択された上位の10個の配列の変種プロフィールに基づくと72である(使用した変種ライブラリー中の上のランクの10個の配列)。VH CDR1とCDR2については図13BとCを参照されたい。
上記で構築したヒット変種ライブラリーを、単一の縮重核酸ライブラリーを用いて標的化した。図13Aの下の部分は、VH CDR3について最適の大腸菌(E. coli)コドンを使用する逆翻訳から得られる核酸配列プロフィールを示す。このプロフィールに基づき、塩基の混合物を各縮重位置に取り込むことにより縮重核酸ライブラリーを合成した。合成のコンビナトリアル作用の結果として、この縮重核酸ライブラリーは、4608のサイズの拡張したアミノ酸ライブラリーをコードする(「ヒット変種ライブラリーIII」と呼ぶ)。VH CDR1とCDR2については図13BとCを参照されたい。
上記の方法を使用して親抗VEGF抗体のリード配列に基づいてin silicoで設計した抗体ライブラリーを、新規ファージ表示系(phage display system)を使用して抗原VEGFに結合する能力について試験した。親抗体または成熟抗体の構造が、構造ベースのコンピューターによるスクリーニングのために使用された。1本鎖抗体(scFv)の型を取る抗体をスクリーニングする一般的アプローチ(図20と32に示す他の新規方法を参照)に対して、2本鎖抗体ライブラリーを発現させ、バクテリオファージの表面に表示させた。2本鎖抗体は、抗体のFabを機能的に模倣するためにVHとVLのヘテロダイマー化により形成される。この2本鎖抗体を「ccFv」と呼ぶ。上記したようにin silicoで設計した抗体の配列をコードする縮重核酸ライブラリーに基づいて、ccFvライブラリーを構築した。
抗体Fv断片は、全抗原結合部位を含有する最も小さい抗体断片である。Fv断片は2つのVHとVL断片間で非常に小さい相互作用エネルギーを有し、生理学的条件下での多くの応用にはあまりにも不安定なことが多い。当然ながら、VHとVLドメインは、定常ドメイン(CH1とCL)中に位置する鎖間ジスルフィド結合により連結されてFab断片を形成する。VHおよびVL断片はまた、1つの断片のカルボキシ末端と別の断片のアミノ末端とを短いペプチドリンカーにより人工的につないで1本鎖Fv抗体断片(scFv)を形成することもできることは公知である。
本発明は、VHとVLヘテロダイマーを安定化するための新しい方策を提供する。ユニークなヘテロダイマー化配列対を設計し、これを使用して、Fab様機能的人工的Fv断片ccFvを作成した(図20)。ヘテロダイマー配列対のそれぞれは、ヘテロダイマー受容体GABAB R1とR2から得られた。この配列対は特異的にコイルドコイル構造を形成し、GABAB-R1とGABAB-R2受容体の機能的ヘテロダイマー化を仲介する。抗体のVHとVLのヘテロダイマーを操作するために、GABAB R1とGABAB-R2コイルドコイルドメイン(それぞれGR1とGR2)を、それぞれVH断片とVL断片のカルボキシ末端に融合させた。すなわち、VHとVLの機能的対合ccFv(コイルドコイルFv)は、GR1とGR2の特異的なヘテロダイマー化により仲介される。さらに、GR1とGR2ドメインのカルボキシ末端を、柔軟性のあるスペーサーまたはフレキソン「SerArgGlyGlyGlyGly」[配列番号7](または「GlyGlyGlyGlySer」[配列番号18])を加えて修飾した。ヘテロダイマー性ccFvをさらに安定化するために、GR1とGR2コイルドコイルのC末端に「ValGlyGlyCys」[配列番号8]スペーサーを加えて一対のシステイン残基を導入して、コイルドコイルGR1およびGR2介在ヘテロダイマーがジスルフィド結合で共有結合できるようにした(図20〜21)。ccFvは分子量35kDaで大腸菌(E. coli)で発現された。
抗VEGF抗体AM2のVHとVL配列を図22A〜Bに示す。これは、親抗VEGF抗体を修飾して設計した抗体である。設計したCDR配列ライブラリーの効率的なクローニングを促進するために、親抗VEGF抗体のVHとVL遺伝子中にユニークな制限部位を導入した。AM2 VHとVL遺伝子の両方をファジミドベクターにクローン化してファージ表示ベクターpABMD12を構築した。図23Aと23Bは、それぞれベクター地図と配列[配列番号17]を示す。このベクターは2つの融合タンパク質を発現するであろう:VH-GR1とVL-GR2-pIII融合体。発現されたVH-GR1とVL-GR2-pIII融合体は、細胞周辺腔中に分泌され、ここでこれらはヘテロダイマー化して、コイルドコイルドメインを介して安定なccFv抗体(「AM2-ccFv」と呼ぶ)を形成する。
ファージ上にAM2-ccFvを表示するために、pABMD12ベクターを細菌TG1細胞中に形質転換した。pABMD12ベクターを有するTG1細胞をさらにKO7ヘルパーファージで重感染させた。感染したTG1細胞を2×yt/Amp/Kan中で30℃で一晩増殖させた。ファジミド粒子をPEG/NaClにより培養物上清から沈殿させ、PBSに再懸濁して固定化VEGFに対してライブラリー選択をした。2時間結合後、非結合ファージを洗い流し、結合ファージを溶出させ、次のラウンドのパニングのために増幅した。
AM2-ccFv表示ファージがバックグランドファージから濃縮できることを証明するために、我々はパニング実験を行って「モデルライブラリー」からAM2-ccFvファージについて選択した。モデルライブラリーは、AM2-ccFvファージを無関係のAM1-ccFv表示ファージと1:106または1:107の比率で混合して調製した。固定化VEGF抗原について2ラウンドのパニングを行った。100μlの2μg/ml VEGFを96ウェルプレート中の各ウェルに被覆した。PBS中の5%ミルクでブロッキングした後、2%ミルク/PBS中の1×1012ライブラリーファージをウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。ファージ溶液を捨て、ウェルをPBST(PBS中0.05%ツイーン20)で5回洗浄し、PBSで5回洗浄した。結合ファージを100mM トリエチルアミンで溶出させ、TG1培養物に加えて感染させた。感染したTG1細胞から調製したファージを次のラウンドのパニングと上記ファージELISAに使用した。各ラウンドのパニング後、回収されたAM2-ccFvファージ対AM1-ccFvファージの比を、PCRにより感染したTG1コロニーを分析して測定した。AM2-ccFv遺伝子とAM1-ccFv遺伝子の配列の差のために、AM2-ccFv遺伝子を特異的に増幅するがAM1-ccFv遺伝子は増幅しない一対のプライマーを設計した。図25Aに示すように、第2ラウンドのパニングからのファージは非常に高いELISA読み値を与え、2ラウンドのパニング後に1:106と1:107ライブラリーの両方からAM2-ccFvファージの高い濃縮が達成されたことを示唆する。PCR分析は、AM2-ccFvファージの出現率が、第1ラウンドのパニング後の1:107ライブラリーから4.4%であり、第2ラウンドのパニングから100%であることを確認した(図25B)。
図8に概説するように、モジュラー進化的アプローチを使用して、コンピューターによるスクリーニングと実験によるスクリーニングのために抗体ライブラリーを構築した。設計したCDR配列のライブラリーをコードするオリゴを合成し、PCRにより増幅した。増幅用のプライマーは、合成CDR配列をpABMD12ベクター中にクローン化するための制限部位を含有する。CDR1、CDR2、およびCDR3の挿入のためにそれぞれNheIとXmaI、XmaIとSpeII、およびPstIとStyIの制限部位を使用して、AM2-ccFvのために3つのVHライブラリーを調製した。連結後、DNAをTG1細胞中に形質転換した。TG1細胞からKO7ヘルパーファージ感染によりファージを調製した。固定化VEGFに対する3ラウンドのパニングを後述のように行った。100μlの2μg/ml VEGFを96ウェルプレート中の各ウェルに被覆した。PBS中の5%ミルクでブロッキングした後、2%ミルク/PBS中の1×1012ライブラリーファージをウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。ファージ含有溶液を捨て、ウェルをPBST(PBS中0.05%ツイーン20)で5回洗浄し、PBSで5回洗浄した。結合ファージを最後に100mM トリエチルアミンで溶出させ、TG1培養物に加えて感染させた。感染したTG1細胞から調製したファージを次のラウンドのパニングに使用した。各ラウンドのパニング後、94〜376個のクローンをファージELISAのために取り上げた(図26AとB)。ファージELISAからの陽性クローンをPCRにより増幅し配列決定した。次にDNA配列をアミノ酸配列に翻訳した。3つのライブラリーからのコードアミノ酸配列を図27の表に記載する。
CDRライブラリーを設計するための別の方策は、構造空間中でCDR配列を無関係のおよび関係のあるセグメントに分割し、CDRループのN末端およびC末端領域のような構造的に結合した部位で共変変異体を検出することである(ほとんどの場合に低い分解構造で充分である)。例えば図28Aは、VH CDR3のフィルターにかけたヒット変種プロフィールを実験的選択からの他の変種と組合せることにより得られる抗VEGF抗体のVH CDR3の複合変種プロフィールを示す。我々は、多様な供給源からの変種を組合せて、ライブラリー構築のための複合変種プロフィールを作成できることを証明したい。約106〜107の多様性を有する核酸ライブラリーにより各小さい変種プロフィールがカバーできることを確認するために、この変種プロフィールは、より小さい変種プロフィールのいくつかのセグメントに分解できる。分解したセグメントライブラリーでは、VH CDR3成熟配列とH97YおよびS101T(KabatのS100aT)との組合せは意図的に避けたことを注意されたい(図28A〜D)。
高親和性抗体を選択するために、オフレートパニングプロセスを行ってライブラリーL14を選択した(図28A〜Dを参照)。ファージ表面上の抗体断片と固定化抗原との相互作用の強さは、オンレート(結合速度)とオフレート(解離速度)により測定される相互作用性親和性により測定される。前記試験により、高親和性の抗体は通常遅いオフレートを有するが、低親和性の抗体は速いオフレートを有し、これらのオンレートは同様である。固定化抗原からの低親和性を有する抗体の解離を促進するためにオフレートパニングを設計し、洗浄条件の厳しさ(ストリンジェンシー)を徐々に上昇させた。ストリンジェンシーが上昇する洗浄液を適用して、低親和性ファージを洗い流し、親和性が高くなっていく(すなわち、遅いオフレート)ファージを残した。従って、厳しくなる洗浄条件を生き延びるファージは高親和性を有し、その存在が優勢になるファージは存在が低いものより高い親和性を有するはずである。我々はまた、種々のパニング条件下で(図29と35A〜B)2つの独立の表示プラットフォーム(図20と32)を使用して、ファージレベルで匹敵するオフレートパニングを証明する。ファージパニングから生じる陽性クローンまたはクローンのコンセンサスは、ある配列または変種、親配列と比較して抗原に対して増強した親和性を有することを強く示唆する。
後述の独立した系を使用して、オフレートパニング方策をさらに試験した。
図30と36の両方に示した結果は、ここで使用した2つの独立した新規ファージ表示系のオフレートパニングは、新規変異体HR(H97、R101またはKabatでR100a)を選択できることを示唆する。HR変異体は、報告された成熟配列中の対応するHT(H97、T101またはKabatでT100a)変異体より高い結合親和性を有する(図9B)。さらにHR変異体は、YS(Y97、S101またはKabatでS100a)変異体より良く抗原に結合する(図36のパニング4を参照)。YS変異体は以前、WTに対して14倍結合親和性を改良すると報告され、成熟抗VEGF抗体のVH CDR3の単一の最も重要な変異体であると考えられた(Chen Y, Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM, Lowrnan HB (1999) J. Mol Biol 293, 865-881)。この変異体H97Yはまた、データベース検索(図11)とコンピューターによるスクリーニング(図13A)により、設計ライブラリーで重要であることがわかった。
フレームワーク最適化のための抗VEGF抗体ライブラリーの作成
VEGFは発生における主要な血管形成因子であり、内皮細胞を刺激することにより固形腫瘍の増殖に関与する。マウスモノクローナル抗体はVEGF依存性細胞増殖を阻止し、in vivoで腫瘍増殖を遅らせることがわかった(Kim KJ, Li B, Winer J, Armanini M, Gillett N, Phillips HS, Ferrara N (1993) Nature 362, 841-844)。このマウス抗体は、抗原結合ループを移植後にいくつかの主要なフレームワーク位置でランダム突然変異誘発を使用してヒト化された(Presta LG, Chen H, O'Connor SJ, Chisholm V, Meng YG. Krummen L, Winkler M, Ferrara N (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599; Baca M. Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684)。典型的には、部位特異的突然変異誘発と選択後に、いくつかのあらかじめ決められた主要な位置で、ヒトまたはコンセンサスヒトフレームワークを親の非ヒト抗体からの非ヒトアミノ酸で置換することにより作成される。これらのヒト化抗体は通常、親抗体の同起源の抗原に親抗体より弱い親和性で結合する(ヒト化抗VEGFについてはその親マウス抗体より約6倍弱い、Baca M, Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684, および他のバージョンのヒト化抗VEGFについては2倍弱い、Presta LG, Chen H, O'Connor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L. Winkler M, Ferrara N (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599; Baca M, Presta LG, O'Connor SJ. Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684を参照)。この結合親和性の喪失は、CDRの親和性成熟を使用することにより回復されるであろう(Chen Y. Wiesmann C, Fuh G, Li B, Christinger HW, McKay P, de Vos AM, Lowman HB (1999) J. Mol Biol 293, 865-881)。
図38Aの上のパネルは、マウス抗VEGF抗体(そこでは「マウス抗VEGF抗体またはa4.6.1」と呼ばれる)、ヒト化抗体(ライブラリーから選択されたHU2.0とHU2.10、およびVHとVLの両方について主要な位置でヒト化のために使用されたアミノ酸(Baca M, Presta LG, O'Connor SJ, Wells JA (1997) J Biol Chem 272, 10678-10684を参照)のフレームワークfr123のアミノ酸配列を示す。フレームワークとCDRは、Kabat基準(Kabat EA, RediMiller M, Perry HM, Gottesman KS (1987) Sequences of Proteins of Inununological Interest 第4版、国立衛生研究所(National Institutes of Health), ベセスダ、メリーランド州)に従って命名されるが、他の分類も使用できる。図38Aの下のパネルは、マウス抗VEGF抗体(そこでは「マウス抗VEGF抗体」と呼ばれる)およびここで親および参照フレームワークとして使用され、文献(Presta LG, Chen H, O'Counor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, Winkler M, Ferrara N (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599)に報告されたヒト化抗体(そこでは「ヒト化抗VEGF抗体」と呼ばれる)のフレームワークfr123領域のアミノ酸配列を示す。フレームワーク4は関係して一定であるため設計されない。しかし所望であれば、同じアプローチを使用して設計することができる。また、FR1またはFR2またはFR3およびFR4の別々のセグメントを個々に設計でき、所望であれば一緒に貼りつけることができる。CDRとFRの組合せは、ここに記載したアプローチを使用して各セグメントまたはセグメントの組合せを設計することにより、同時に設計することができる。CDR1とCDR2の位置は矢印を使用して示すが、図には記載していない。CDRは、マウス抗VEGFからの図9B中のものと同じである。図38Bは、マウス抗VEGF抗体のVH FR123のリード配列に基づくヒトVH生殖細胞系配列を使用して作成されるヒットライブラリーの変種プロフィールを示す。下の変種プロフィールは、アミノ酸位置の多様性を示す。図の下の部分は、それぞれカットオフ頻度5と13を使用して得られたフィルターにかけた変種プロフィールを示す。ヒットリストのメンバーのうちで5回またはそれ以下、または13回またはそれ以下の出現のすべての位置アミノ酸をフィルターにかける。図38B(続き)は、カットオフ無しでマウス抗VEGF抗体のVH FR123のリード配列に基づくヒトVH生殖細胞系配列を使用して作成したヒットライブラリーの再プロフィール化変種プロフィールを示すが、各位置の変種は、総エネルギーまたはファンデアワールスエネルギーを使用して、抗体構造との構造的適合性に基づいてランク付けされる。一部の参照アミノ酸は、その総エネルギーまたは特異的パッキングに基づいていくつかの位置で好適であることがわかったが、その出現頻度は非常に低い(例えば、矢印で注を付けたF68(F67), L72(L7l), S77(S76) およびK98(K94)を参照)。例えばF68とL72は、選択のためのライブラリーに含まれる。図38Cは、カットオフ19でフィルターにかけた変種プロフィールを有するマウス抗VEGF抗体のVH FR123のリード配列に基づき、Kabat由来ヒトVH配列を使用して作成したヒットライブラリーの変種プロフィールを示す。このプロフィールは、低頻度で出現するが足場形成において重要であるいくつかのアミノ酸の重要性を強調する。マウスVH FR123配列を、連続的数字を使用して示す位置で点線の上に参照として記載する。アミノ酸のすべての変種は点線の下に記載する。変種中の点は、参照と同じアミノ酸である。図38Dは、カットオフ5でヒトVH生殖細胞系配列からのフィルターにかけた変種プロフィールを使用するデザイナーライブラリーを示す(図38Bを参照)。FR123配列の上の配列番号はKabat命名法(kabataa)とそのCDR中のアミノ酸を含む連続順序に基づく。このフィルターにかけた変種プロフィールは、抗体構造のみが使用される場合の構造適合性のランク順序を反映するように、コンピューターでさらにスクリーニングすることができる。カットオフ5でフィルターにかけた変種プロフィールからは無くなっている2つのアミノ酸、F70(F69)とL72(L71)は、構造ベースのスクリーニングに基づいてこれらの位置で最も好適なアミノ酸の仲間であるため、これらも含まれる。構造ベースのスクリーニングからの上位100個の配列の最終的に提出されたライブラリーはまた、F70(F69)、L72(L71)、S77(S76)、およびK98(K94)(カッコ内の数字はKabat命名法に基づく配列番号を示す)を含み、これは、Rのような一部のアミノ酸が、VH CDR3親和性成熟のK94Rについて前記したようにL72(L71)とK98(K94)について計算で過剰に予測されるためである。
本発明者らは、上記の親抗VEGF抗体は、本発明の方法を使用して治療的および他の応用のために、指令抗体最適化のモデル系のリードタンパク質として機能できると考えている。ヒト化抗VEGF抗体(Bacaら、前述;Prestaら、前述)は、本発明の方法を使用して得られた結果を評価するための参照または陽性対照として機能することができる。
VH FR123のリード配列は、Kabat分類に従ってマウス抗VEGF抗体から取られる(図38B)。
単一のリード配列 A4.6.1(図38A)を使用して作成したHMMを較正し、Kabatデータベース(Johnson, G and Wu, TT (2001) Nucleic Acids Research, 29, 205-206)から得られたヒト重鎖生殖細胞系配列データベースおよび/またはヒト配列データベース(ヒト生殖細胞系とヒト化配列とを含む)を検索するのに使用した。予測値すなわちE値より大きいすべての配列ヒットを記載し、HAMMER2.2.1パッケージを使用して整列する。ヒットリストから重複配列を除去した後、リードHMMについて残りのヒット配列がヒットライブラリーを形成する。
変種プロフィールは、各位置でおよび好適な修飾していない順序の具体的な変異体で、好適なアミノ酸残基上で有益であるが、これは、膨大な数の組換え体を具体化する。スコア化は、F70とL72が構造ベースのスコア化で好適であるためプロフィール中に維持すべきであることを示すが、その出現頻度は、データベース検索から得られるプロフィールについて使用されるカットオフより低い(図38B−続き)。すなわち、構造ベースのエネルギースコア化は、元々はタンパク質データベースから選択される進化的配列のプロフィール化に基づいて作成されたヒット変種ライブラリーについて、各位置で変種の出現を再プロフィール化するための別の方法を提供する。頻度カットオフを使用するあるフィルター化は、コンピューターによるスクリーニングで評価されるかまたは実験ライブラリーにより直接標的化される必要があるコンビナトリアル配列を減少させることができる。変種プロフィールに適用されるカットオフを用いてさえ、実験によるスクリーニングのために最終配列でスコア化され評価される必要がある多くのコンビナトリアル配列がある(図38Dの下のパネルに示すように)。
スコア化は、抗原VEGFの構造の存在下および非存在下でCONGEN[Bruccoleri and Karplus (1987) Biopolymers 26: 137-168]のAmber94フォースフィールドを使用して、最適ロタマーを検索しエネルギーを100ステップ最小化することにより行った。
カットオフ値より低い出現頻度を有するか、および/または構造足場形成との適合性に基づいて配列をスクリーニングすることによりアミノ酸を排除後のヒット変種ライブラリーから得られた、図38Bに示す好適な残基のほとんどを維持しながら、ライブラリー候補のサイズを低下させるために、上記したようにヒット変種ライブラリーからの変種プロフィールを、フィルターにかけた。例えば、ヒットライブラリーのフィルター化で使用されるカットオフ値より低いが、野生型からの変種プロフィール中のいくつかの重要な変異体(例えばF70とL72)が含まれる。これらは、構造ベースのプロフィール化を使用して評価され、ファージ表示において厳しい洗浄条件下の多数回のラウンドのパニングでも持続する(図42)。構造ベースのスコア化からの上位100個の配列を、元々のプロフィールの構造ベースのプロフィール化からのF70とL72とともに使用した。
上記で構築したヒット変種ライブラリーを、図40Aに示す縮重オリゴヌクレオチドを用いて標的化した。上記で構築した縮重核酸ライブラリーをファージ表示系にクローン化し、96ウェルプレート上に被覆された固定化VEGFへの結合に基づき、ファージ表示された抗体(ccFv)を選択した。VH抗VEGFの最終的に設計したヒト化配列を図40Aに示す。抗VEGFのVHの約120アミノ酸残基について、コンピューター設計の結果として34アミノ酸を変化させた:そのうち18個を固定(太字で下線を引いた)し、16個は記載のccFv系を使用してファージ表示ライブラリースクリーニング(「X」と表示)による測定の結果として置いた。従ってスクリーニング中の好適なアミノ酸残基の複数の選択肢を作成するために、16個の位置に対応するDNA配列の縮重を作成した。ライブラリーの理論密度は約2.6×105である。ライブラリーをファージ表示ベクターpABMD12中に入れ、ここで抗VEGFのVHをライブラリーにより置換した。その結果、VLとライブラリーにより置換された種々のVHが対合して、抗VEGFの機能性ccFvを形成するであろう。次にファージ表示ライブラリーを、固定化VEGFタンパク質抗原に対するさらなるパニングのために使用した。
上記例に記載の構築したライブラリーをスクリーニングするために、精製したホモダイマーVEGFタンパク質(カルビオケム(Calbiochem))をコーティング緩衝液(0.05M NaHCO3、pH9.6)中の指定濃度で希釈し、マイキシソルブ(Maxisorb)ウェル(ヌンク(Nunc))に4℃で一晩固定化した。次に被覆ウェルを5%ミルク中で37℃で1時間ブロック後、PBSで希釈したファージライブラリーをウェルに適用して37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション混合物はまた、非特異結合を最小にするために2%ミルクを日常的に含有した。インキュベーションの最後に、ウェルを洗浄し、次に結合したファージを1.4%トリエチルアミンで溶出した後、TG1細胞を感染させ、次に増幅のためにKO7ヘルパーファージによりレスキューした。次にファージを増幅するために、感染しレスキューしたTG1細胞を30℃で一晩カルベニシリンとカナマイシンの存在下で増殖させ、次にファージライブラリーを採取した。増幅したファージを、次のラウンドのパニングの供給ライブラリーとして使用した。パニング法は、図41に要約した。一方、5回目以降のパニングからの個々のクローンをファージELISA用にランダムにサンプリングし、固定化VEGFへの特異的結合を確認し、5回目〜7回目のパニングから100%の陽性を示した。最後に、2×YT/カルベニシリン(100μg/ml)/カナマイシン(70μg/ml)のプレートで増殖させた単離したクローンを、5回目のパニング(P5)から開始して配列決定のためにサンプリングして、設計に対するヒット位置とヒット配列を規定した。
図41に要約されるように、高親和性結合体を選択しない洗浄のストリンジェンシーを上昇させるために、洗浄時間の延長、洗浄容量の増加、被覆VEGF濃度の低下、投入ライブラリーファージの減少などの方法を行った。これらのすべての方法は、比較的低親和性の相互作用の解離を促進し、高親和性の相互作用が選択的に残るようにする。次にこのパニングを生き延びるファージのクローンをサンプリングして、配列決定を行う。このパニングからの上位のヒットの抗VEGF VH配列の完全長を図42Aに記載する。記載した我々の本発明の方法を使用して我々は、フレームワーク最適化(図43AとBを参照)により、親もしくは参照抗VEGF抗体より高い結合親和性をccFvフォーマットで有する3つ(D36、D40およびD42)のヒト化フレームワークを発見した(ヒト化抗VEGF抗体については図22AとBを参照(Presta LG, Chen H, O'Counor SJ, Chisholm V, Meng YG, Krummen L, Winkler M, Ferrara N (1997) Cancer Res. 57, 4593-4599)。これらの改良は主に、フレームワークヒト化単独によるオンレートの大きな上昇とオフレートの小さな低下から来る。図43Aは、ccFvファージ表示系(上記図23〜25の説明を参照)を使用して、デザイナーVH最適化ライブラリーから選択される抗VEGF抗体の最適化VHフレームワーク(FR123)の配列を示す。D36、D40およびD42のVH fr123は、元々のマウス抗体VH FR123と、マウス抗体からの同じCDRを有するヒト化配列(Prestaら、前述)とともに。下のパネルの点は、参照と同じアミノ酸を示す(マウスVHフレームワークfr123)。
抗体はまた、診断用もしくは治療用残基と結合した結合体として、または化学療法剤または生物製剤と組合せて使用することもできる。抗体はまた、多様な投与経路を介する投与用に調製することもできる。例えば、抗体は、経口、局所的、非経口、腹腔内、静脈内、動脈内、経皮的、舌下、筋肉内、直腸内、頬内、鼻内、吸入、膣内、眼内、局所的供給(例えばカテーテルまたはステントにより)、皮下、脂肪組織内、関節内、またはくも膜下に、投与または同時投与してもよい。
Claims (156)
- 抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。 - リード配列の長さは5〜100aaである、請求項1の方法。
- リード配列の長さは6〜80aaである、請求項1の方法。
- リード配列の長さは8〜50aaである、請求項1の方法。
- CDR中のアミノ酸配列を同定する工程は、Kabat基準またはチョチア(Chothia)基準を使用して行われる、請求項1の方法。
- リード配列は、CDR1、CDR2、CDR3、FR1-CDR1、CDR1-FR2、FR2-CDR2、CDR2-FR3、FR3-CDR3、CDR3-FR4、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4よりなる群から選択されるリード抗体のVHまたはVL内の領域からのアミノ酸配列を含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも6つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも7つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中にすべてのアミノ酸残基を含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDRにすぐ隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDRにフランクするFR中に少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項1の方法。
- リード配列は、選択されたCDRのC末端またはN末端に隣接する1つ以上のCDRもしくはFRをさらに含む、請求項1の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は抗体配列を含む、請求項1の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列はヒト抗体配列を含む、請求項1の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項1の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項1の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は、抗体のCDRについてNIHのジーンバンク、Swiss-Protデータベース、およびKabatデータベースからなるデータベースから検索される、請求項1の方法。
- リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項1の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項1の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項1の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項1の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項1の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項1の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。 - 遺伝子コドンは、細菌での発現に好適なものである、請求項23の方法。
- 遺伝コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×107 未満であるように選択される、請求項23の方法。
- 遺伝コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×106 未満であるように選択される、請求項23の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項23の方法:
縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
縮重核酸ライブラリーによりコードされるヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1 より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。 - 選択された組換え抗体の親和性は108 M-1より高い、請求項27の方法。
- 選択された組換え抗体の親和性は109 M-1より高い、請求項27の方法。
- 宿主生物は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物よりなる群から選択される、請求項27の方法。
- 組換え抗体は、完全に組み立てられた抗体、Fab断片、Fv断片、または1本鎖抗体よりなる群から選択される、請求項27の方法。
- 組換え抗体はファージ粒子の表面上に表示される、請求項27の方法。
- ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、VHとVLにより形成される2本鎖ヘテロダイマーでもよい、請求項32の方法。
- VHおよびVL鎖のヘテロダイマー化は、それぞれVHとVL鎖に融合した2つの非抗体ポリペプチド鎖の間で形成されたヘテロダイマーにより促進される、請求項33の方法。
- 非抗体ポリペプチド鎖は、それぞれヘテロダイマー受容体GABAB R1(GR1)とR2(GR2)から得られる、請求項34の方法。
- ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、ペプチドリンカーで連結されたVHとVLを含有する1本鎖抗体である、請求項32の方法。
- ファージ粒子の表面上の1本鎖抗体の表示は、1本鎖抗体とGR1との融合体とファージpIIIキャプシドタンパク質とGR2との融合体とで形成されるヘテロダイマーにより促進される、請求項36の方法。
- 標的抗原は、小有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸およびポリ炭水化物よりなる群から選択される、請求項27の方法。
- 抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDRとFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はCDRリード配列である);
CDRリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のCDRテスタータンパク質配列から、CDRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはCDRヒットライブラリーを形成する);
リード抗体のVHまたはVL領域中に1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はFRリード配列である);
FRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、FRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する);そして
CDRヒットライブラリーとFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。 - 複数のCDRテスタータンパク質配列は、ヒトまたは非ヒト抗体のアミノ酸配列を含む、請求項39の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト抗体のアミノ酸配列を含んでよい、請求項39の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項39の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項39の方法。
- 少なくとも1つの複数のCDRテスタータンパク質配列は、複数のFRテスタータンパク質配列とは異なる、請求項39の方法。
- 複数のCDRテスタータンパク質配列はヒトもしくは非ヒト抗体配列であり、複数のFRテスタータンパク質配列はヒト抗体配列である、請求項39の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項39の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項39の方法:
CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、CDRヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを第1の核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重CDR核酸ライブラリーを構築する。 - ライブラリー抗体配列を構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のFR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのFRを選択し;
選択されたFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第1のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第1のFRリード配列である);
第1のリードFR配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、第1のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはFRヒットライブラリーを形成する)。 - 以下の工程をさらに含む請求項48の方法:
選択されたFRとは異なるFR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含む第2のアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列は第2のFRリード配列である);
第2のFRリード配列を複数のFRテスタータンパク質配列と比較し;
複数のFRテスタータンパク質配列から、第2のFRリード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントは第2のFRヒットライブラリーを形成する);そして
第1のFRヒットライブラリーと第2のFRヒットライブラリーとを組合せてヒットライブラリーを形成する。 - リードFR配列は、リード抗体のVH FR1、VH FR2、VH FR3、VH FR4、VL FR1、VL FR2、VL FR3、およびVL FR4よりなる群から選択される選択されたFR中に、少なくとも5つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項48の方法。
- 請求項48の方法であって、以下の工程をさらに含む:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸または縮重核酸ライブラリーを構築する。 - 複数のFRテスタータンパク質配列は、CDRが削除された抗体配列を含む、請求項48の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、CDRが削除されたヒト抗体配列を含む、請求項48の方法。
- リード配列プロフィールに基づいて抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し;
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列の3次元構造を提供し;
リード配列の構造に基づいてリード配列プロフィールを作成し;
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択する(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する)。 - リード配列の3次元構造は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項54の方法。
- リード配列プロフィールを作成する工程は以下の工程を含む請求項54の方法:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根を決定し;
主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が5Å未満であるテスタータンパク質セグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。 - 主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が4Å未満である、請求項56の方法。
- 主鎖コンフォメーションの差の自乗平均の平方根が2Å未満である、請求項56の方法。
- リード配列プロフィールを作成する工程は以下の工程を含む請求項54の方法:
リード配列の構造を複数のテスタータンパク質セグメントの構造と比較し;
リード配列とテスタータンパク質セグメントの主鎖コンフォメーションのZスコアを決定し;
Zスコアが2より大きい、好ましくは3より大きい、さらに好ましくは4より大きい、および最も好ましくは5より大きいテスタータンパク質セグメントのセグメントを選択し;そして
選択されたテスタータンパク質セグメントのアミノ酸配列をリード配列と整列させてリード配列プロフィールを作成する。 - リード配列プロフィールを作成する工程は、CE、MAPS、モンテカルロおよび3Dクラスタリングアルゴリズムよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項54の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項54の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項54の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応するトリヌクレオチドコドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。 - リード配列に基づいて変異抗体のライブラリーを構築するためのコンピューターによる方法であって、この方法は以下の工程を含む:
入力としてリード抗体のCDR領域中の少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を取り(アミノ酸配列はリード配列である);
コンピューターが実行できるロジックを使用してリード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドを作成する。 - リード配列に基づいて変異抗体のライブラリーを構築するためのロジックを含むコンピューターで読める媒体であって、ロジックは、
入力としてリード抗体のCDRの少なくとも3つの連続的アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を取り(アミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し;そして
出力として、ヒットライブラリーを形成する選択されたペプチドを作成する、ロジックを含む上記媒体。 - リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒットライブラリーのメンバーを選択する。 - リード配列の長さは5〜100aaである、請求項65の方法。
- リード配列の長さは6〜80aaである、請求項65の方法。
- リード配列の長さは8〜50aaである、請求項65の方法。
- CDR中のアミノ酸配列を同定する工程は、Kabat基準またはチョチア(Chothia)基準を使用して行われる、請求項65の方法。
- リード配列は、CDR1、CDR2、CDR3、FR1-CDR1、CDR1-FR2、FR2-CDR2、CDR2-FR3、FR3-CDR3、CDR3-FR4、FR1-CDR1-FR2、FR2-CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4よりなる群から選択されるリード抗体のVHまたはVL内の領域からのアミノ酸配列を含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも6つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中に少なくとも7つの連続的アミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDR中にすべてのアミノ酸残基を含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDRにすぐ隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDRにフランクするFR中に少なくとも1つのアミノ酸残基をさらに含む、請求項65の方法。
- リード配列は、選択されたCDRのC末端またはN末端に隣接する1つ以上のCDRもしくはFRをさらに含む、請求項65の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は抗体配列を含む、請求項65の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列はヒト抗体配列を含む、請求項65の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、VHまたはVL中に少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化抗体配列を含む、請求項65の方法。
- 複数のFRテスタータンパク質配列は、ヒト生殖細胞系抗体配列を含む、請求項65の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は、抗体のCDRについてNIHのジーンバンク、Swiss-Protデータベース、およびKabatデータベースからなるデータベースから検索される、請求項65の方法。
- リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項65の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項65の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項65の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項65の方法。
- スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項65の方法。
- スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項65の方法。
- ヒットライブラリーのメンバーを選択する工程は、
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列より低いかまたは同等の総エネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択することを含む、請求項65の方法。 - ヒットライブラリーのメンバーを選択する工程は、改良されたスコア化関数
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列より小さい結合フリーエネルギーを有するヒットライブラリーのメンバーを選択することを含む、請求項65の方法。 - リード構造鋳型は完全に組み立てられたリード抗体である、請求項65の方法。
- リード構造鋳型はリード抗体のVHまたはVLの3D構造である、請求項65の方法。
- リード構造鋳型は、リード抗体のCDRまたはFRの3D構造またはこれらの組合せである、請求項65の方法。
- リード構造鋳型は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項65の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項65の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNA配列を含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項65の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。 - 遺伝子コドンは、細菌での発現に好適なものである、請求項95の方法。
- 遺伝子コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×107 未満であるように選択される、請求項95の方法。
- 遺伝子コドンは、DNAセグメントの縮重核酸ライブラリーの多様性が、1×106 未満であるように選択される、請求項95の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項95の方法:
縮重核酸ライブラリーのDNAセグメントを宿主生物細胞中に導入し;
縮重核酸ライブラリーによりコードされるヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;そして
106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択する。 - 選択された組換え抗体のの親和性が108 M-1より高い、請求項99の方法。
- 選択された組換え抗体のの親和性が109 M-1より高い、請求項99の方法。
- 宿主生物は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳動物よりなる群から選択される、請求項99の方法。
- 組換え抗体は、完全に組み立てられた抗体、Fab断片、Fv断片、または1本鎖抗体よりなる群から選択される、請求項99の方法。
- 組換え抗体はファージ粒子の表面上に表示される、請求項99の方法。
- ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、VHとVLにより形成される2本鎖ヘテロダイマーである、請求項104の方法。
- VHおよびVL鎖のヘテロダイマー化は、それぞれVHとVL鎖に融合した2つの非抗体ポリペプチド鎖の間で形成されたヘテロダイマーにより促進される、請求項105の方法。
- 非抗体ポリペプチド鎖は、それぞれヘテロダイマー受容体GABAB R1(GR1)とR2(GR2)から得られる、請求項0106の方法。
- ファージ粒子の表面上に表示される組換え抗体は、ペプチドリンカーで連結されたVHとVLを含有する1本鎖抗体である、請求項104の方法。
- ファージ粒子の表面上の1本鎖抗体の表示は、1本鎖抗体とGR1との融合体とファージpIIIキャプシドタンパク質とGR2との融合体とで形成されるヘテロダイマーにより促進される、請求項108の方法。
- 標的抗原は、小有機分子、タンパク質、ペプチド、核酸およびポリ炭水化物よりなる群から選択される、請求項99の方法。
- 抗体配列のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列プロフィールを複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーの適用ウイルス粒子を作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを作成し;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。 - ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が4回より大きいアミノ酸変種を選択する。 - ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が6回より大きいアミノ酸変種を選択する。 - ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の5%より大きいアミノ酸変種を選択する。 - ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の10%より大きいアミノ酸変種を選択し;そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。 - ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せる工程は以下を含む請求項111の方法:
出現頻度が各位置で総変種の5%より大きいアミノ酸変種を選択し;
出現頻度が各位置で総変種の5%と等しいかまたはそれより小さい場合、リード配列のアミノ酸を選択し;そして
ヒットライブラリー中の選択されたアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成する。 - スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項111の方法。
- スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項111の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項111の方法:
ヒットライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項111の方法:
ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーを少なくとも2つのサブヒット変種ライブラリーに分解し;
サブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、選択されたサブヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;そして
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築する。 - ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
リード配列と同等かまたはより優れたスコアを有するヒット変種ライブラリーの10〜30メンバーをランダムに選択する(選択されたメンバーはサブ変種ライブラリーを形成する)。 - ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
ヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成して、ヒット変種プロフィールを得て;そして
ある距離のカットオフ(4.5Å〜8Å)を使用して、リード構造鋳型のCα、Cβまたは重い原子の接触地図に基づき、ヒット変種プロフィールをサブ変種プロフィールのセグメントに分解する。 - ヒット変種ライブラリーを分解する工程は以下を含む請求項120の方法:
ヒット変種ライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成して、ヒット変種プロフィールを得て;そして
6Å−8Åの距離カットオフを使用して、リード構造鋳型のCα、Cβまたは重い原子の接触地図に基づき、ヒット変種プロフィールをサブ変種プロフィールのセグメントに分解する。 - 複数の抗体の構造集合体に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
リード抗体以外のVHもしくはVL領域中の異なる配列を有する1つ以上の抗体の3D構造を提供し;
リード抗体と1つ以上の抗体とを組合せて構造集合体を形成し(構造集合体はリード構造鋳型として定義される);
リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列である);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;そして
リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択する。 - リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
f) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
g) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
h) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成させ;
i) スコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
j) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
k) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
l) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程j)〜l)を繰り返し;
m) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
n) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
o) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
p) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜o)を繰り返す。 - リード抗体の構造に基づいて抗体のライブラリーを構築する方法であって、この方法は以下の工程を含む:
a) リード抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)の可変領域のアミノ酸配列を提供し(リード抗体は、リード構造鋳型として定義される既知の3次元構造を有する);
b) リード抗体のCDR中のアミノ酸配列を同定し;
c) リード抗体のVHまたはVL領域中の1つのCDRを選択し;
d) 選択されたCDR中に少なくとも3つの連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供し(選択されたアミノ酸配列はリード配列として定義される);
e) リード配列の1つ以上のアミノ酸残基を1つ以上の異なるアミノ酸残基で置換してリード配列を変異させて、リード配列変異体ライブラリーを作成し;
f) 第1のスコア化関数を使用して、リード配列変異体ライブラリーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
g) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのリード配列変異体を選択し;
h) リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;
i) 複数のテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも10%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);
j) リード配列の各位置に現れるアミノ酸変種の頻度に基づきヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
k) ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種の組合せを生成させ;
l) 選択された配列変異体をヒット変種の組合せと組合せて、ヒット変種ライブラリーを産生させ;
m) 第2のスコア化関数を使用して、ヒット変種ライブラリーのメンバーがリード構造鋳型と構造的に適合性があるかどうかを決定し;
n) リード配列と同等であるかまたはよりすぐれたスコアのヒット変種ライブラリーのメンバーを選択し;
o) ヒット変種ライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む縮重核酸ライブラリーを構築し;
p) 核酸ライブラリーの多様性を決定し、多様性が1×106より大きい場合は、核酸ライブラリーの多様性が1×106と等しいかまたはより小さくなるまで工程n)〜p)を繰り返し;
q) 縮重核酸ライブラリー中のDNAセグメントを宿主生物の細胞中に導入し;
r) ヒットライブラリーのアミノ酸配列を含有する組換え抗体が宿主生物細胞中で産生されるように、DNAセグメントを宿主細胞中で発現させ;
s) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体を選択し;そして
t) 106 M-1より高い親和性で標的抗原に結合する組換え抗体が見つからない場合、工程e)〜s)を繰り返す。 - 以下の工程を含む、設計されるタンパク質のライブラリーを構築する方法:
リードタンパク質から得られるアミノ酸配列を提供し(このアミノ酸配列はリード配列と呼ぶ);
リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較し;そして
複数のFRテスタータンパク質配列から、リード配列と少なくとも15%の配列同一性を有する少なくとも2つのペプチドセグメントを選択し(選択されたペプチドセグメントはヒットライブラリーを形成する);そして
リード配列をヒットライブラリーで置換して設計されるタンパク質のライブラリーを形成する。 - リード配列の長さは好ましくは5〜100aaである、請求項127の方法。
- リード配列の長さは好ましくは6〜80aaである、請求項127の方法。
- リード配列の長さは好ましくは8〜50aaである、請求項127の方法。
- リードタンパク質は、酵素受容体、サイトカイン、腫瘍サプレッサー、ケモカイン、抗体および増殖因子よりなる群から選択される種類のタンパク質である、請求項127の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列はヒトタンパク質配列を含む、請求項127の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は、それぞれ少なくとも70%のヒト配列を有するヒト化タンパク質配列を含む、請求項127の方法。
- 複数のテスタータンパク質配列は、ジーンバンク(GenBank)またはSwiss-Protデータベースのタンパク質データベースから検索される、請求項127の方法。
- リード配列を複数のテスタータンパク質配列と比較する工程は、BLAST、PSI-BLAST、プロフィールHMM、およびCOBLATHよりなる群から選択されるアルゴリズムにより行われる、請求項127の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも25%である、請求項127の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも35%である、請求項127の方法。
- ヒットライブラリー中の選択されたペプチドセグメントとリード配列との配列同一性は、少なくとも45%である、請求項127の方法。
- 以下の工程を含む請求項127の方法:
設計されるタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。 - 所望の機能はリードタンパク質の改良された生物学的機能である、請求項139の方法。
- 改良された生物学的機能は、安定性の増強、酵素活性の増強、リードタンパク質の同種のリガンドへの結合親和性の増強、およびあらかじめ決められた生物の発現の増強よりなる群から選択される、請求項140の方法。
- 以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築する。 - 以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
ヒットライブラリー中のアミノ酸変種を組合せて、ヒット変種ライブラリーを形成するヒット変種の組合せを生成し;そして
ヒット変種ライブラリーから好ましい機能を有するタンパク質を選択する。 - 以下の工程をさらに含む請求項143の方法:
スコア化関数を使用して、ヒットライブラリーのメンバーが構造的に、リード配列またはリードタンパク質の3次元構造と適合するかどうかを決定し;そして
リード配列またはリードタンパク質とスコアが同等かまたはより優れたメンバーを選択する。 - リード配列またはリードタンパク質の3次元構造は、X線結晶解析、核磁気共鳴(NMR)分光法、または理論的構造モデル化から得られる構造である、請求項144の方法。
- スコア化関数は、静電的相互作用、ファンデアワールス相互作用、静電的溶媒和エネルギー、溶媒がアクセス可能な表面溶媒和エネルギー、およびコンフォメーションエントロピーよりなる群から選択されるエネルギースコア化関数である、請求項144の方法。
- スコア化関数は、Amberフォースフィールド(forcefiled)、Charmm フォースフィールド、Discover cvff フォースフィールド、ECEPP フォースフィールド、GROMOS フォースフィールド、OPLS フォースフィールド、MMFF94 フォースフィールド、Tripos フォースフィールド、MM3 フォースフィールド、Dreiding フォースフィールド、およびUNRES フォースフィールドよりなる群から選択されるフォースフィールドを含むスコア化関数である、請求項127の方法。
- メンバーを選択する工程は、
ΔEtotal = Evdw + Ebond + Eangel + Eelectrostatics + Esolvation
の式に基づいて計算されるリード配列またはリードタンパク質より低いかまたは同等の総エネルギーを有するメンバーを選択することを含む、請求項143の方法。 - メンバーを選択する工程は、改良されたスコア化関数
ΔGb = ΔGMM + ΔGsol - TΔSSS
(式中、
ΔGMM = ΔGele + ΔGvdw (1)
ΔGsol = ΔGele-sol + ΔGASA (2))
を使用して、結合状態と非結合状態の差として計算されるリード配列またはリードタンパク質より小さい結合フリーエネルギーを有するメンバーを選択することを含む、請求項143の方法。 - 以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
設計されるタンパク質のライブラリーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーを構築し;
核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。 - 以下の工程をさらに含む請求項127の方法:
ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを作成し;
アミノ酸位置変種を対応する遺伝子コドンに逆翻訳することにより、ヒットライブラリーのアミノ酸位置変種プロフィールを核酸位置変種プロフィールに変換し;
核酸位置変種をコンビナトリアル的に組合せてDNAセグメントの縮重核酸ライブラリーを構築し;
縮重核酸ライブラリーを発現させて組換えタンパク質のライブラリーを作成し;そして
組換えタンパク質のライブラリーから所望の機能を有するタンパク質を選択する。 - 抗体のVEGFへの結合親和性が106 M-1より高く、モノクローナル抗体の重鎖CDR3は、配列番号36〜48および63〜125よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)に対する抗体。
- 抗体の重鎖CDR1は、配列番号19〜30よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項152の抗体。
- モノクローナル抗体の重鎖CDR2は、配列番号31〜305りなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項152の抗体。
- 抗体は、モノクローナル抗体、Fab、Fv、または1本鎖抗体である、請求項152の抗体。
- 抗体のVEGFへの結合親和性が106 M-1より高く、抗体の重鎖可変領域(VH)は、配列番号126、128、129、130、および131よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域(VL)は配列番号127のアミノ酸配列を含む、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)に対する抗体。
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