JP5621259B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は顕微鏡装置に関し、特に、顕微鏡における標本の観察環境を向上させることができるようにした顕微鏡装置に関する。

従来のオートフォーカス装置には、オートフォーカス用の光源から射出された参照光を標本上に集光させ、標本において反射した参照光を光検出器において受光し、その受光強度に基づいて、対物レンズの焦点の位置合わせを行うものもある（例えば、特許文献１参照）。このオートフォーカス装置には、反射面を回動させることで、参照光の光路を変更させる板ばねアクチュエータミラーが設けられており、板ばねアクチュエータミラーの反射面を回動させることで、参照光を対物レンズの観察中心（光軸）とは異なる位置に移動させることができる。したがって、標本上における対物レンズの観察視野内に段差があるような場合においても、参照光の結像位置を移動させることにより、安定して対物レンズの焦点の位置合わせを行うことができる。

特開２００２−３２８２９７号公報

しかしながら、上述した技術では、良好な環境で標本を観察することができない場合があった。例えば、蛍光観察用顕微鏡において、標本の励起波長と、参照光の波長とが近い（ほぼ同じ）場合、参照光が標本を励起してしまい、蛍光が退色したり標本がダメージを受けたりすることになる。ところが観察者は、可視域外の参照光を目視で確認することができないので、どのように板ばねアクチュエータミラーを操作すれば、観察したい標本の観察視野外に参照光を移動させることができるかを知ることができなかった。

また、標本を蛍光観察する場合、標本から発現した蛍光の波長と、参照光の波長とが近いときには、蛍光と参照光とが重なって観察（撮像）されることになるため、観察者が蛍光だけを観察（画像分析）することは困難であった。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、顕微鏡での標本の観察環境を向上させることができるようにするものである。

本発明の顕微鏡装置は、標本からの光を対物レンズを介して撮像手段で撮像する観察光学系を備えた顕微鏡と、前記顕微鏡に装着され、前記対物レンズの焦点を前記標本に対する所望の位置に維持させるオートフォーカス装置とを有する顕微鏡装置であって、前記オートフォーカス装置は、前記対物レンズを介して前記標本へ焦点検出用の光を照射するフォーカス用照明光学系と、前記対物レンズを介して、前記標本で反射した反射光を結像するフォーカス用結像光学系とを備え、前記フォーカス用照明光学系は、前記焦点検出用の光の前記標本における照射位置を、前記対物レンズの観察視野内であって、前記撮像手段の観察視野外の領域に変更し、かつ前記照射位置が前記撮像手段の観察視野外に移動されたことにより生じる前記対物レンズの焦点の前記所望の位置に対する位置ずれを補正するように構成されていることを特徴とする。

本発明によれば、対物レンズと標本とを一定に保持することができる。特に、本発明によれば、顕微鏡での標本の観察環境を向上させることができる。

本発明を適用した顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。 オートフォーカスの原理について説明する図である。 視野内における参照光の像の位置を説明する図である。 蛍光と参照光の波長について説明する図である。 オートフォーカスユニットの構成例を示す図である。 ガラスボトムディッシュについて説明する図である。 顕微鏡の光学系について説明する図である。 観察システムの構成例を示す図である。 オートフォーカスユニットの他の構成例を示す図である。 顕微鏡およびオートフォーカスユニットの機能の構成例を示す図である。 参照光移動処理を説明するフローチャートである。 参照光移動処理を説明するフローチャートである。

符号の説明

１１ 顕微鏡， ２３ 対物レンズ， ２７ カメラ， ２８ 接眼レンズ， ２９ 励起用光源， ３０ オートフォーカスユニット， ６１ LED， ６２ オフセットレンズ群， ６３ ダイクロイックミラー， ６４ CCD， ６５ フィルタ， １３５ 電動操作ミラー， １９３ 絞り， ２３１ ミラー制御部， ２３２ ミラー駆動部， ２３３ 制御部， ２６１ 手動操作ミラー， ２６２ 操作部

以下、図面を参照して、本発明を適用した実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用した顕微鏡の一実施の形態の構成例を示す図である。

顕微鏡１１は、例えば標本に所定の波長の励起光を照射して、標本から発現した蛍光を観察するための蛍光顕微鏡である。顕微鏡１１には、電動ステージ２１が設けられており、この電動ステージ２１上には観察の対象となる標本２２が配置される。また、電動ステージ２１の図中、下側における標本２２と対向する位置には対物レンズ２３が設けられており、観察者であるユーザは、顕微鏡１１の左下に設けられた対物上下動操作部２４を操作することにより、対物レンズ２３を図中、上下方向に移動させることができる。

さらに、顕微鏡１１の上側には、標本２２を明視野観察する場合に、標本２２に照明される照明光を射出する照明光学系２５が設けられている。照明光学系２５から射出された照明光は、照明光学系２５の直下に設けられたレンズ２６により集光されて、電動ステージ２１上に配置された標本２２に照射される。また、標本２２に照射された照明光は、標本２２を透過して観察光となり、その観察光は、対物レンズ２３により集光され、図示せぬ光学系を介してカメラ２７および接眼レンズ２８に入射する。

カメラ２７は、対物レンズ２３から入射した観察光を光電変換することにより標本２２を撮像し、撮像により得られた画像を、図示せぬ装置に供給する。また、対物レンズ２３から接眼レンズ２８に入射した観察光は、接眼レンズ２８により集光されて、標本２２の像が結像される。これにより、ユーザは、接眼レンズ２８から標本２２を観察することができる。また、ユーザは、カメラ２７に接続された装置に表示される画像を見ることでも、標本２２を観察することができる。

また、顕微鏡１１は、標本２２を励起するための励起光を射出する励起用光源２９、およびオートフォーカスにおける対物レンズ２３の移動を制御するための情報を取得するオートフォーカスユニット３０を内蔵している。

標本２２が蛍光観察される場合、励起用光源２９は、励起光を射出して、励起光を図示せぬ光学系および対物レンズ２３を介して標本２２に照射する。これにより、標本２２は蛍光を発現し、標本２２から発現した蛍光は、対物レンズ２３および図示せぬ光学系を介して、カメラ２７および接眼レンズ２８に入射する。したがって、ユーザは、カメラ２７に接続された装置に表示される画像を見て標本２２からの蛍光を観察したり、接眼レンズ２８から蛍光を観察したりすることができる。

スリット撮影方式のオートフォーカスユニット３０は、例えばオートフォーカスに用いられる近赤外光などの参照光を射出して、参照光を図示せぬ光学系および対物レンズ２３を介して標本２２に照射する。そして、標本２２に照射されて反射された参照光は反射光となり、対物レンズ２３および図示せぬ光学系を介してオートフォーカスユニット３０に入射するので、オートフォーカスユニット３０は、入射した反射光を受光する。そして、顕微鏡１１は、オートフォーカスユニット３０が受光した反射光の受光強度に基づいて、常に標本２２の所望する位置に対物レンズ２３の焦点が位置するように、つまり対物レンズ２３と標本２２との間隔が一定となるように、対物レンズ２３を上下方向に移動させる。

なお、オートフォーカスユニット３０は、顕微鏡１１に設けられているようにしてもよいし、顕微鏡１１とは異なる装置とされ、オートフォーカスユニット３０が必要に応じて顕微鏡１１に装着されるようにしてもよい。

次に、図２を参照して、オフセット方式のオートフォーカスの原理について説明する。

図２に示すように、オートフォーカスユニット３０には、参照光を射出する光源としてのLED（Light Emitting Diode）６１、参照光を集光するオフセットレンズ群６２、集光された参照光を対物レンズ２３に入射させるダイクロイックミラー６３、反射光を受光するCCD（Charge Coupled Devices）６４、および反射光（参照光）と標本２２からの蛍光とを透過するフィルタ６５が設けられている。

LED６１から射出された参照光は、オフセットレンズ群６２（凸レンズ，凹レンズからなる望遠鏡系）を介してダイクロイックミラー６３に入射する。そして、ダイクロイックミラー６３に入射した参照光の一部は、ダイクロイックミラー６３において反射されて対物レンズ２３に入射する。また、対物レンズ２３に入射した参照光は、対物レンズ２３により集光され、対物レンズ２３上に満たされた液体６６を介して、電動ステージ２１上に配置されたガラスボトムディッシュ６７に入射する。さらに、ガラスボトムディッシュ６７に入射した参照光は、ガラスボトムディッシュ６７の底に設けられたガラスカバー６８の境界面Ｓにおいて反射する。

すなわち、電動ステージ２１の中央には、穴が設けられており、その穴の部分にガラスカバー６８が位置し、かつガラスカバー６８が対物レンズ２３に近接するように、ガラスボトムディッシュ６７が電動ステージ２１に配置される。そして、ガラスカバー６８と対物レンズ２３との間の空間は、対物レンズ２３とほぼ同じ屈折率のオイルや水などの液体６６により満たされている。

また、ガラスボトムディッシュ６７内には、例えば培養液が満たされており、ガラスボトムディッシュ６７の底に設けられた透明なガラスカバー６８上には、標本２２としての細胞が接着している。

対物レンズ２３は、入射した参照光を集光し、集光した参照光を液体６６を介してガラスカバー６８に入射させる。ここで、ガラスボトムディッシュ６７に満たされた培養液の屈折率とガラスカバー６８の屈折率とには、ある程度の差がある。したがってガラスカバー６８に入射した参照光は、図中の矢印により示されるように、ガラスカバー６８の図中、上側の表面、つまり標本２２（培養液）とガラスカバー６８との境界面Ｓにおいて反射する。

参照光がガラスカバー６８の境界面Ｓにおいて反射して反射光となると、反射光は、液体６６および対物レンズ２３を介してダイクロイックミラー６３に入射する。ダイクロイックミラー６３は、入射した反射光の一部を反射させてオフセットレンズ群６２に入射させるとともに、残りの反射光を透過させてフィルタ６５に入射させる。

フィルタ６５は、入射した光のうち、標本２２から発現した蛍光の波長と同じ波長の光だけを透過させる。したがって、参照光（反射光）が蛍光と同じ波長の場合には、ダイクロイックミラー６３からフィルタ６５に入射した参照光（反射光）は、フィルタ６５を透過して、顕微鏡１１に設けられた結像レンズ６９に入射する。さらに、結像レンズ６９に入射した参照光（反射光）は、結像レンズ６９により集光されてカメラ２７に入射し、カメラ２７により撮像されてしまう。

ここで、対物レンズ２３と結像レンズ６９との間の光学系は、平行光学系とされる。

一方、ダイクロイックミラー６３において反射された参照光（反射光）は、オフセットレンズ群６２を介してCCD６４に入射する。CCD６４は、例えばラインCCDなどからなり、オフセットレンズ群６２から入射した参照光（反射光）を受光する。不図示の焦点検出回路は、CCD６４からの光電変換信号に基づき、参照光が境界面Ｓ上に結像されるように対物レンズ２３の移動を制御する。なお、オフセットレンズ群６２は凸レンズと凹レンズとからなる望遠鏡光学系から構成されている。

より詳細には、LED６１から射出された参照光は、LED６１とオフセットレンズ群６２との間の光学系においてスリット状（長方形状）の光とされるため、CCD６４は、スリット状の反射光を受光する。

そこで、顕微鏡１１の不図示の焦点検出回路は、CCD６４が反射光を受光することで得られた信号、つまりCCD６４の受光面の各画素における受光強度を示す信号に基づいて、対物レンズ２３を光軸方向に移動させる。これにより、対物レンズ２３は境界面Ｓ上を観察することができる。

その後、オフセットレンズ群６２を移動させることで、対物レンズ２３の焦点位置とオートフォーカスユニット３０の光学系の焦点位置との間にオフセットを持たせることができ、標本２２の内部を観察できる。オフセットレンズ群６２が移動されていない状態（以下、初期状態と称する）において、オートフォーカスユニット３０の光学系は、参照光の像の結像位置が対物レンズ２３の焦点位置と同じ位置となるようになされている。

この初期状態においては、対物レンズ２３の焦点位置および参照光の像の結像位置は境界面Ｓ上に位置するが、観察の対象となっている標本２２は、境界面Ｓよりも図中、上側に位置しているため、カメラ２７により撮像された画像上において、標本２２はぼけて見えることになる。

そこで、オフセットレンズ群６２を、オフセットレンズ群６２の光軸方向、つまり図中、左右方向に凸凹レンズを相対移動させることで、参照光の像の結像位置を対物レンズ２３の光軸方向に移動させ標本２２の内部を観察することができる。

また、参照光の像の結像位置と対物レンズ２３の焦点位置との距離が所定オフセット量となった状態で、ユーザがオフセットレンズ群６２を移動させずに固定しておくと、電動ステージ２１を作動して観察ポイントをＸＹ方向に移動した際にガラスボトムディッシュ６７が傾いた等の理由により参照光の像の位置がずれたとしても、顕微鏡１１により直ちに対物レンズ２３が移動されるので、対物レンズ２３の焦点は常に標本２２上に位置する。

このように常時、オフセット方式のオートフォーカスを作動させた状態において、電動ステージ２１を作動し観察ポイントを移動させても、ユーザは、何ら操作を必要とせずに、常にピントの合った標本２２を観察（撮像）することができる。

なお、オフセットレンズ群６２の配置位置は、図５の位置に限らず、例えば図５のハーフミラー１３４とレンズ１３６との間、および／または、ミラー１３３とレンズ１３１との間に配置してもよい。

ここで問題となるのが、参照光の像が、対物レンズ２３の光軸上に位置すると、図３に示すように、参照光の像は顕微鏡１１の視野の中心に位置することになる。なお、図において、領域１０１は顕微鏡１１の視野の領域を示している。

オートフォーカスユニット３０には、標本２２からの蛍光および反射光を透過するフィルタ６５が設けられているため、境界面Ｓにおいて反射された参照光（反射光）が蛍光の波長に近い帯域波長を有している場合は、対物レンズ２３、ダイクロイックミラー６３、フィルタ６５、および結像レンズ６９を介してカメラ２７に入射し、カメラ２７により蛍光の像および参照光の像が撮像される。したがって、例えば、図４に示すように、標本２２（培養細胞１０３）から発現する蛍光の波長が、参照光の波長と近い場合には、図３の参照光の像１０２とその一部または全部が重なっている培養細胞１０３については、その培養細胞１０３からの蛍光の強度を正しく計測することができなくなってしまう。

なお、図４において、縦方向は標本２２から発現する蛍光の相対強度を示しており、横方向は波長を示している。また、曲線Ｋ１は、各波長における蛍光の相対強度を示しており、矢印Ｋ２は、参照光の波長を示している。

図４では、標本２２から発現した蛍光は、630nmから850 nmの範囲の波長の光からなり、蛍光には、波長が700nm前後である光が多く含まれている。また、矢印Ｋ２により示されるように参照光の波長は770nmであるので、蛍光には参照光と同じ波長の光が含まれることになる。したがって、図３に示したように、顕微鏡１１の視野の中心付近において観察される光には、培養細胞１０３から発現した蛍光と、参照光とが含まれるため、正しく蛍光の強度を計測することができなくなる。

顕微鏡１１の視野である領域１０１内では、標本２２としての培養細胞だけでなく、参照光の像１０２も観察（撮像）されてしまい、標本２２の蛍光像の分析に悪影響を与える。

また、図３では、参照光の像１０２は、顕微鏡１１の視野の中心に位置している。そのため、例えば標本２２に照射される励起光の波長が、参照光の波長とほぼ同じである（近い）場合には、参照光の像１０２の周囲の培養細胞１０３−１乃至培養細胞１０３−３がダメージを受けてしまう恐れがある。なお、以下、培養細胞１０３−１乃至培養細胞１０３−３のそれぞれを個々に区別する必要のない場合、単に培養細胞１０３と称する。

そこで、ユーザがよりよい観察環境で標本２２を観察することができるように、オートフォーカスユニット３０では、参照光の像１０２、つまり参照光の結像位置を、図３中、上下左右方向の任意の位置に移動させることができるようになされている。

例えば、オートフォーカスユニット３０には、図５に示すように、参照光の光路を変更する回動可能な電動操作ミラーが設けられている。なお、図５は、オートフォーカスユニット３０のより詳細な構成例を示す図であって、図２のオートフォーカスユニット３０を、図２中、上から下方向に見た図を示している。また、図５において、図２における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜、省略する。さらに、図５において、一点鎖線は光軸を表している。

オートフォーカスユニット３０は、LED６１、オフセットレンズ群６２、ダイクロイックミラー６３、CCD６４、フィルタ６５（図示せず）、レンズ１３１、ハーフマスク１３２、ミラー１３３、ハーフミラー１３４、電動操作ミラー１３５、レンズ１３６、およびステッピングモータ１３７から構成される。

レンズ１３１は、LED６１から射出された参照光を視準して平行光に変換し、平行光とされた参照光をミラー１３３に入射させる。また、レンズ１３１とミラー１３３との間には、ハーフマスク１３２が設けられており、ハーフマスク１３２は、レンズ１３１から射出された参照光の半分を遮光する。図５においては、レンズ１３１から射出された参照光のうち、光軸から下側の部分が遮光されている。

ミラー１３３は、レンズ１３１から入射した参照光を反射して、ハーフミラー１３４に入射させる。ハーフミラー１３４は、ミラー１３３から入射した参照光の一部をそのまま透過させてオフセットレンズ群６２を介して電動操作ミラー１３５に入射させる。

電動操作ミラー１３５は、回動可能なミラーであり、オフセットレンズ群６２から入射した参照光を反射してダイクロイックミラー６３に入射させる。ダイクロイックミラー６３に入射した参照光は、ダイクロイックミラー６３により、図中、手前側に反射され、図示せぬ対物レンズ２３に入射する。

電動操作ミラー１３５は、その反射面の中心がオフセットレンズ群６２の光軸上に位置し、かつ反射面が、オフセットレンズ群６２の光軸に対して４５度の角度をなすように配置されており、図示せぬモータ等により駆動されて回動する。例えば、電動操作ミラー１３５の反射面の中心を通り、その反射面の法線と平行な直線をｘ軸とし、反射面の中心を通り、オフセットレンズ群６２の光軸およびｘ軸に垂直な直線をｚ軸とする。また、反射面の中心を通り、ｘ軸およびｚ軸と垂直な直線をｙ軸とすると、電動操作ミラー１３５は、ｙ軸またはｚ軸を軸として回動する。

したがって、例えば、電動操作ミラー１３５がｚ軸を軸として回動すると、電動操作ミラー１３５により反射される参照光の光路は、図中、上下方向に傾くように変化し、境界面Ｓ上における参照光の像の位置も上下方向に移動する。また、例えば、電動操作ミラー１３５がｙ軸を軸として回動すると、電動操作ミラー１３５により反射される参照光の光路は、ｚ軸と平行な方向に傾くように変化し、境界面Ｓ上における参照光の像の位置は、左右方向に移動する。

また、境界面Ｓにおいて反射された参照光は、反射光となってダイクロイックミラー６３に入射するが、一部が透過してしまう。ダイクロイックミラー６３に反射した反射光は、ダイクロイックミラー６３において反射されて電動操作ミラー１３５に入射する。電動操作ミラー１３５は、ダイクロイックミラー６３から入射した反射光を反射してオフセットレンズ群６２に入射させる。

ハーフミラー１３４は、オフセットレンズ群６２から入射した反射光を反射し、レンズ１３６に入射させる。レンズ１３６は、ハーフミラー１３４からの反射光を集光し、CCD６４に結像させる。

また、ステッピングモータ１３７は、オフセットレンズ群６２を駆動し、オフセットレンズ群６２を光軸方向に移動させる。

このように、電動操作ミラー１３５を揺動させて参照光の光路を変更することで、参照光の像を目視により確認しながら、CCD６４の受光面上の反射光の結像位置を変えることなく、境界面Ｓ上における参照光の像を図中、上下左右方向に移動させることができる。したがって、電動操作ミラー１３５を揺動させて、対物レンズ２３のオートフォーカスに何ら支障をきたすことなく、例えば、図３の参照光の像１０２を、視野の中心からできるだけ遠く標本２２のない位置など、視野内の任意の位置に移動させることができる。これにより、少なくとも視野の中心付近にある標本２２が参照光によりダメージを受けたり、参照光と、視野の中心付近にある標本２２からの蛍光とが重なったりするようなことを防止することができ、標本２２の観察環境を向上させることができる。

また、例えば図６に示すように、ガラスボトムディッシュ６７のガラスカバーに、予め参照光の像を結像させるための領域を設けるようにしてもよい。なお、図６において、図３における場合と対応する部分には同一の符号を付してある。

図６の上側には、底の部分に、参照光の像を結像させるための領域が設けられたガラスボトムディッシュ６７が示されており、図６の下側には、顕微鏡１１の視野の領域が示されている。

ガラスボトムディッシュ６７の底に設けられたガラスカバー１６１の図中、上側の表面には、その右端に上側に突出した領域１６２が設けられている。この領域１６２には、標本２２としての培養細胞が生えにくく、つまり培養細胞が接着されにくくなされている。したがって、ガラスカバー１６１の上側の表面のうち、領域１６２には、培養細胞が接着せず、その表面の領域１６２の左側の部分に培養細胞が接着している。

このように、領域１６２には培養細胞が接着しないので、図６の下側に示すように、ユーザは、電動操作ミラー１３５を揺動させて、領域１０１の中央に位置していた参照光の像１０２を、矢印Ａ１１に示す方向、つまり図中、右方向に領域１６２内まで移動させる。また、参照光の像１０２が培養細胞の接着していない領域１６２内に移動されると、図６の上側における矢印により示されるように、ガラスカバー１６１の上側の表面のうち、参照光が反射する位置が、その表面の中央付近から領域１６２に移動する。したがって、参照光は、ガラスボトムディッシュ６７に満たされた培養液と、ガラスカバー１６１の領域１６２との境界面において反射し、その面が境界面Ｓとされる。

このようにして、ガラスカバー１６１の表面に、標本２２としての培養細胞を接着させる領域とは別に、参照光の像を結像させるための領域１６２を設けることで、標本２２が参照光によりダメージを受けることを防止することがで、また標本２２からの蛍光の強度を正しく計測することができる。これにより、顕微鏡１１における標本２２の観察環境を向上させることができる。

次に、図７は、顕微鏡１１の全体における参照光、反射光、励起光、および蛍光の光路を示す図である。なお、図７において、図１、図２、および図５における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は適宜、省略する。また、図において、一点鎖線は光学系の光軸を示している。

図７では、顕微鏡１１には、カメラ２７の直前に位置する結像レンズ６９と、フィルタ６５との間に、ダイクロイックミラー１９１およびミラー１９２が設けられている。また、励起用光源２９と、ダイクロイックミラー１９１との間には、絞り１９３が設けられている。

励起用光源２９は励起光を射出して、励起光を絞り１９３を介してダイクロイックミラー１９１に入射させる。絞り１９３は、励起用光源２９から入射した励起光の一部を遮光して、絞り１９３を通過する励起光の光量、すなわち励起光の光束の太さを調整する。ダイクロイックミラー１９１は、絞り１９３から入射した励起光を反射して、励起光をフィルタ６５、ダイクロイックミラー６３、および対物レンズ２３を介してガラスボトムディッシュ６７上の標本２２に照射する。

ここで、従来の顕微鏡においては、標本の励起用の励起光は、顕微鏡の視野内にある標本全体に照射されるようになされていたため、標本からの蛍光の波長と参照光の波長とが近い場合には、それらの光を識別することが困難であった。また、標本全体に励起光が照射されるため、特定の標本だけを観察したい場合にも、他の標本にまで励起光が照射されてしまい、観察の対象とはならない標本にダメージを与えてしまう恐れがあった。

そこで、顕微鏡１１においては、励起用光源２９とダイクロイックミラー１９１との間に絞り１９３を設けて、絞り１９３を通過する励起光の光量を調節することにより、視野内において励起光が照射される範囲、すなわち標本に照射される励起光の光束の太さを適宜、変更することができる。したがって、標本２２に無駄に励起光が照射されてしまうことを防止することができる。

また、ダイクロイックミラー１９１を回動可能とする機構を設けて、ダイクロイックミラー１９１を回動させるようにしてもよい。ダイクロイックミラー１９１を回動可能とすると、ダイクロイックミラー１９１を回動させて励起光の光路を変更し、顕微鏡１１の視野内、つまりガラスカバー６８上における励起光が照射される位置を任意の位置に移動させることができる。したがって、ユーザは、カメラ２７により撮像された画像、または接眼レンズ２８を見ながら、励起光の照射される位置、すなわち蛍光が観察される位置や、参照光の像の位置を自由に移動させて、それらの光を明確に識別することができる。

また、ガラスカバー６８上の標本２２に励起光が照射されると、標本２２は蛍光を発現する。発現された蛍光は、対物レンズ２３を介してダイクロイックミラー６３に入射する。さらに、LED６１から射出された参照光も境界面Ｓにおいて反射されて反射光となり、対物レンズ２３を介してダイクロイックミラー６３に入射する。

すなわち、LED６１から射出された参照光は、レンズ１３１およびミラー１３３を介してハーフミラー１３４に入射する。さらに、ハーフミラー１３４を透過した参照光がオフセットレンズ群６２、電動操作ミラー１３５、ダイクロイックミラー６３、および対物レンズ２３を介して境界面Ｓに入射する。そして、境界面Ｓにおいて反射された参照光は、反射光として対物レンズ２３を介してダイクロイックミラー６３に入射する。

ダイクロイックミラー６３は、対物レンズ２３から入射した蛍光を透過させてフィルタ６５に入射させる。また、ダイクロイックミラー６３は、対物レンズ２３から戻って来た参照光を反射させて電動操作ミラー１３５、オフセットレンズ群６２、ハーフミラー１３４、およびレンズ１３６を介してCCD６４に入射させるとともに、対物レンズ２３から戻って来た参照光の一部を透過させてフィルタ６５に入射させる。

ここで、ダイクロイックミラー６３において反射された参照光は、電動操作ミラー１３５およびオフセットレンズ群６２を介してハーフミラー１３４に入射する。

フィルタ６５は、ダイクロイックミラー６３から入射した蛍光および反射光を透過させてダイクロイックミラー１９１に入射させる。ダイクロイックミラー１９１は、フィルタ６５からの蛍光および参照光を透過させてミラー１９２に入射させる。なお、より詳細には、ダイクロイックミラー１９１とミラー１９２との間には、蛍光および参照光の一部を反射させて接眼レンズ２８に入射させるとともに、蛍光および参照光の一部を透過させてミラー１９２に入射させるダイクロイックミラーが設けられている。したがって、そのダイクロイックミラーからの蛍光および参照光を接眼レンズ２８が集光して、それらの光の像を結像させるので、ユーザは、接眼レンズ２８から蛍光および参照光の像を観察することになる。

ミラー１９２は、ダイクロイックミラー１９１から入射した蛍光および参照光を反射して結像レンズ６９を介してカメラ２７に入射させる。顕微鏡１１に接続された図示せぬ装置には、カメラ２７において撮像された画像が表示されるので、ユーザは、その画像を見ることで、蛍光および参照光の像を観察することができる。

また、電動操作ミラー１３５を回動させると、参照光の光路は変化するので、境界面Ｓ上の参照光の像の位置は視野の中心の位置から移動する。例えば、図７においては、電動操作ミラー１３５が回動することにより、参照光の像１９４は、視野の中心（光軸と境界面Ｓとの交点の位置）から、図中、左側にずれた位置に結像されている。

参照光の像１９４の位置が視野の中心からずれると、ダイクロイックミラー６３上の反射光が入射する位置も変化するので、カメラ２７の受光面における反射光の像の位置も変化する。図７では、参照光の像１９４が境界面Ｓ上に結像される場合、参照光は境界面Ｓにおいて反射されて、対物レンズ２３乃至結像レンズ６９を介してカメラ２７に入射し、参照光（反射光）の像１９５がカメラ２７の受光面上に結像されている。この参照光の像１９５は、カメラ２７の受光面の中心（光軸と受光面との交点の位置）から、図中、下側にずれた位置に結像されている。したがって、境界面Ｓ上の参照光の像の位置が移動すると、カメラ２７の受光面上における参照光の像の位置も移動し、ユーザは、撮像された画像上において、移動された参照光の像を観察することができる。

さらに、顕微鏡１１において、ダイクロイックミラー６３は、参照光（反射光）と同じ波長の光の一部を反射するとともに、参照光と同じ波長の光の一部、つまり残りの反射されなかった光をそのまま透過させる。また、ダイクロイックミラー６３は、蛍光と同じ波長の光、および励起光と同じ波長の光をそのまま透過させる。例えば、励起光の波長と参照光の波長とが同じである場合には、参照光（励起光）の一部は、ダイクロイックミラー６３において反射され、残りの光はダイクロイックミラー６３を透過する。

また、フィルタ６５は、参照光（反射光）と同じ波長の光、蛍光と同じ波長の光、および励起光と同じ波長の光だけを透過させ、他の波長の光を吸収する。さらに、ダイクロイックミラー１９１は、励起光と同じ波長の光を反射し、蛍光と同じ波長の光および参照光（反射光）と同じ波長の光をそのまま透過させる。なお、励起光の波長と、参照光の波長とが同じである場合には、ダイクロイックミラー１９１は、励起光および参照光の一部を反射するとともに、残りの光（励起光および参照光の一部）を透過させる。

さらに、以上において説明した顕微鏡１１は、例えば、図８に示す観察システムに適用することができる。図８において、観察システムは、顕微鏡１１、ミラー操作部２２１、パーソナルコンピュータ２２２、およびモニタ２２３から構成される。また、オートフォーカスユニット３０には、ミラー制御部２３１およびミラー駆動部２３２が設けられている。

ミラー操作部２２１は、例えば電動操作ミラー１３５を回動させるためのコントローラなどからなり、ユーザの操作に応じた信号をオートフォーカスユニット３０のミラー制御部２３１に供給する。例えば、ユーザが、ミラー操作部２２１を操作して、電動操作ミラー１３５の回動を指示すると、ミラー操作部２２１からミラー制御部２３１には、ユーザの操作に応じた信号が供給される。すると、ミラー制御部２３１は、ミラー操作部２２１からの信号に応じて、ミラー駆動部２３２を制御し、電動操作ミラー１３５の回動を制御する。ミラー駆動部２３２は、ミラー制御部２３１の制御の基に、電動操作ミラー１３５を駆動して回動させる。

また、パーソナルコンピュータ２２２は、ユーザにより操作され、ユーザの操作に応じて、顕微鏡１１の動作を制御する。例えば、パーソナルコンピュータ２２２は、顕微鏡１１に設けられた制御部２３３に、オートフォーカスの入り切りを指示したり、LED６１の点灯を指示したりする。また、例えばパーソナルコンピュータ２２２は、カメラ２７に標本２２の撮像を指示する。

顕微鏡１１の制御部２３３は、パーソナルコンピュータ２２２の指示に応じて、LED６１を制御し、LED６１から参照光を射出させたり、CCD６４から供給された、反射光の撮像により得られた信号に基づいて、対物レンズ２３の移動を制御したりする。すなわち、制御部２３３は、CCD６４からの信号に基づいて、参照光の像が境界面Ｓ上に結像されるように、対物レンズ２３を光軸方向に移動させる。

また、カメラ２７は、パーソナルコンピュータ２２２の指示に応じて、入射した蛍光や参照光（反射光）の像を撮像し、撮像により得られた画像をパーソナルコンピュータ２２２に供給する。パーソナルコンピュータ２２２は、カメラ２７から供給された画像を、接続されているモニタ２２３に供給して画像を表示させる。

このような観察システムによれば、ユーザは、モニタ２２３に表示される顕微鏡１１の視野の画像を見ながら、ミラー操作部２２１を操作して、電動操作ミラー１３５を回動させ、参照光の像の位置を任意の位置に移動させることができる。また、ユーザは、パーソナルコンピュータ２２２または顕微鏡１１を操作して、絞り１９３を動作させ、標本２２に照射される励起光の範囲（光束の太さ）を調整したりすることができる。

なお、以上においては、オートフォーカスユニット３０に、モータ等により駆動される電動操作ミラー１３５を設けると説明したが、ユーザが操作部を操作することにより手動で回動させることのできる回動ミラーを設けるようにしてもよい。

そのような場合、例えば、オートフォーカスユニット３０は、図９に示すように構成される。なお、図９において、図５における場合と対応する部分には、同一の符号を付してあり、その説明は省略する。

図９に示すオートフォーカスユニット３０には、図５の電動操作ミラー１３５に替えて手動操作ミラー２６１が設けられており、また、手動操作ミラー２６１を回動させるための操作部２６２も設けられている。

操作部２６２は、ユーザにより操作され、ユーザの操作に応じて、手動操作ミラー２６１を回動させる。例えば、手動操作ミラー２６１の反射面の中心を通り、その反射面の法線と平行な直線をｘ軸とし、反射面の中心を通り、オフセットレンズ群６２の光軸およびｘ軸に垂直な直線をｚ軸とする。また、反射面の中心を通り、ｘ軸およびｚ軸と垂直な直線をｙ軸とすると、手動操作ミラー２６１は、操作部２６２によりｙ軸またはｚ軸を軸として回動される。

手動操作ミラー２６１は、その反射面の中心がオフセットレンズ群６２の光軸上に位置し、かつ反射面が、オフセットレンズ群６２の光軸に対して４５度の角度をなすように、オフセットレンズ群６２と、ダイクロイックミラー６３との間に配置されている。手動操作ミラー２６１は、操作部２６２により回動され、オフセットレンズ群６２から入射した参照光を反射してダイクロイックミラー６３に入射させるとともに、ダイクロイックミラー６３から入射した反射光を反射してオフセットレンズ群６２に入射させる。

また、上記図５の実施形態の変形例として、オートフォーカスユニット３０にオフセットレンズ群６２が設けられないようにしてもよい。

具体的には、オートフォーカスユニット３０は、LED６１、ダイクロイックミラー６３、CCD６４、フィルタ６５（図示せず）、レンズ１３１、ハーフマスク１３２、ミラー１３３、ハーフミラー１３４、電動操作ミラー１３５、およびレンズ１３６が設けられている点において、図５のオートフォーカスユニット３０と一致し、オフセットレンズ群６２およびステッピングモータ１３７が設けられていない点において異なる。

したがって、LED６１から射出された参照光は、レンズ１３１およびミラー１３３を介してハーフミラー１３４に入射し、さらにミラー１３３からハーフミラー１３４に入射した参照光の一部がハーフミラー１３４を透過して、電動操作ミラー１３５に入射する。また、ダイクロイックミラー６３から電動操作ミラー１３５に入射した反射光は、電動操作ミラー１３５において反射されてハーフミラー１３４に入射する。

また、オートフォーカスユニット３０には、オフセットレンズが設けられていないので、電動操作ミラー１３５が回動されていない状態において、参照光の像の位置は、対物レンズ２３の焦点の位置と同じ位置となり、参照光の像は、対物レンズ２３の光軸方向には移動されない。

さらに、以上においては、電動操作ミラー１３５を設けて参照光の像の位置を移動させると説明したが、電動操作ミラー１３５を設けずに、ダイクロイックミラー６３を回動させることで、境界面Ｓ上における参照光の像の位置を移動させるようにしてもよい。

また、フィルタ６５は、ダイクロイックミラー６３とダイクロイックミラー１９１との間に限らず、ダイクロイックミラー１９１とミラー１９２との間に設けられるようにしてもよいし、ミラー１９２と結像レンズ６９との間に設けられるようにしてもよい。

以上のように、オートフォーカスユニット３０に参照光の光路を変更させる電動操作ミラー１３５または手動操作ミラー２６１を設けるようにしたので、境界面Ｓ上における参照光の像の位置を移動させることができる。しかも、標本２２に対向して設けられた対物レンズ２３と、カメラ２７または接眼レンズ２８との間の光学系に、境界面Ｓにおいて反射された参照光である反射光の波長の光を透過させるフィルタ６５を設けたので、ユーザは、顕微鏡１１の視野内において参照光の像を観察することができる。したがって、ユーザは参照光の像を見ながら、その像の位置を視野内の任意の位置に移動させることができ、これにより、顕微鏡１１における標本２２の観察環境を向上させることができる。

ところで、顕微鏡１１では、対物レンズ２３のオートフォーカス制御に用いられる参照光は、フィルタ６５により可視化されるため、ユーザは、標本２２とともに参照光の像を目で確認し、参照光を任意の位置に移動させることができる。

例えば、参照光が標本２２に照射されると標本２２がダメージを受けてしまい、標本２２から発現する蛍光の劣化が生じるため、参照光を観察対象となる標本２２の領域外に移動させれば、標本２２の観察環境をより向上させることができる。

具体的には、参照光を顕微鏡１１の観察視野内の領域であって、かつカメラ２７の観察視野外の領域に移動させればよい。

すなわち、対物レンズ２３の有効視野は、例えば半径２２乃至２５ｍｍの円形の領域であり、この領域が顕微鏡１１の観察視野となる。つまり、顕微鏡１１の観察視野は、ユーザが接眼レンズ２８から観察することのできる標本２２の領域である。これに対して、カメラ２７の観察視野は、顕微鏡１１の観察視野の領域内の一部の領域とされ、対物レンズ２３の有効視野（倍率）の大きさと、カメラ２７が有する撮像素子の受光面の大きさとから定まる。例えばカメラ２７の観察視野は、６．６ｍｍ×８．８ｍｍの矩形の領域とされる。

したがって、参照光を顕微鏡１１の観察視野内であり、かつカメラ２７の観察視野外となる領域に移動させれば、少なくともカメラ２７の観察視野内の標本２２は、参照光による影響を受けることはない。また、この場合、ユーザは、カメラ２７により撮像された標本２２の画像上では、参照光の像を確認することはできないが、接眼レンズ２８からは参照光の像を確認することができる。なお、以下、標本２２上の領域であって、顕微鏡１１の観察視野内、かつカメラ２７の観察視野外となる領域を退避領域とも称する。

ところが、参照光を顕微鏡１１の観察視野の中心からより離れた位置に移動させると、参照光の光路は対物レンズ２３の光軸からより離れた位置に移動するため、対物レンズ２３の収差により、参照光の結像位置にずれが生じてしまう。すると、対物レンズ２３の焦点位置から参照光の結像位置までの距離にずれが生じて、オートフォーカスにより対物レンズ２３が移動されてしまい、標本２２にピントが合わなくなってしまう。

そこで、参照光の移動前の対物レンズ２３の位置を記録しておき、その位置を利用して、参照光の移動により生じる標本２２へのピントのずれを補正するようにしてもよい。そのような場合、顕微鏡１１およびオートフォーカスユニット３０は、図１０に示すように構成される。

図１０は、顕微鏡１１およびオートフォーカスユニット３０の機能の構成例を示す図である。なお、図１０において、図１における場合と対応する部分には同一の符号を付してあり、その説明は省略する。

顕微鏡１１には、パーソナルコンピュータ３０１が接続され、顕微鏡１１の制御部３１１は、パーソナルコンピュータ３０１からの指示や、オートフォーカスユニット３０からの指示に応じて、顕微鏡１１全体の動作を制御する。

例えば、制御部３１１は、位置検出部３１２に対物レンズ２３の位置を検出させたり、対物レンズ２３を、対物レンズ２３の光軸方向（以下、Ｚ方向と称する）に移動させたりする。位置検出部３１２は、例えば、リニアエンコーダなどからなり、対物レンズ２３のＺ方向の位置を検出し、その検出結果を示す位置情報を制御部３１１に供給する。

パーソナルコンピュータ３０１は、カメラ２７に標本２２を撮像させて、撮像により得られた画像をカメラ２７から取得して表示したり、ユーザの操作に応じて、制御部３１１に顕微鏡１１の動作の制御を指示したりする。

オートフォーカスユニット３０には、対物レンズ２３のオートフォーカス制御の入り切りを指示するときに操作されるオートフォーカススイッチ３１３と、参照光を移動させるときに操作される参照光移動スイッチ３１４が設けられている。オートフォーカス制御部３１５は、オートフォーカススイッチ３１３の操作に応じて、オフセットレンズ制御部３１６にオフセットレンズ群６２の移動を指示したり、制御部３１１に対物レンズ２３の移動を指示したりして、オートフォーカス制御を行う。

また、オートフォーカス制御部３１５は、参照光移動スイッチ３１４の操作に応じて、ミラー制御部３１７に電動操作ミラー１３５の回動を指示し、ミラー制御部３１７は、その指示に応じて電動操作ミラー１３５を回動させ、参照光の光路を振る。

さらに、オートフォーカス制御部３１５は、参照光の移動前後における対物レンズ２３の位置の差分を求める差分算出部３２１、その差分からオフセットレンズ群６２を移動させるべき移動量を算出する移動量算出部３２２、および対物レンズ２３の焦点位置を検出する焦点検出回路３２３を備えている。

焦点検出回路３２３は、CCD６４に接続されており、CCD６４からの光電変換信号に基づいて対物レンズ２３の焦点位置を検出し、オートフォーカス制御部３１５は、その検出結果に基づいて、制御部３１１に対物レンズ２３の移動を指示する。

ユーザが標本２２を蛍光観察しようとする場合、ユーザは、パーソナルコンピュータ３０１を操作して、標本２２の画像の表示を指示する。すると、パーソナルコンピュータ３０１は、ユーザの操作に応じて制御部３１１に、標本２２への励起光の照射を指示し、制御部３１１は、その指示に応じて励起用光源２９から励起光を射出させる。

励起用光源２９からの励起光が標本２２に照射され、標本２２から蛍光が発現すると、カメラ２７は、標本２２からの蛍光を受光することで標本２２を撮像し、撮像により得られた画像をパーソナルコンピュータ３０１に供給する。

このようにして、パーソナルコンピュータ３０１が標本２２の画像を取得して表示すると、ユーザは、標本２２にピントを合わせるためにオートフォーカススイッチ３１３を操作し、オートフォーカス制御の開始を指示する。すると、オートフォーカスユニット３０および顕微鏡１１は、オートフォーカス制御を行いながら参照光を移動させ、標本２２へのピントのずれを補正する処理である参照光移動処理を開始する。

以下、図１１のフローチャートを参照して、参照光移動処理について説明する。

ステップＳ１１において、オートフォーカス制御部３１５は、対物レンズ２３のオートフォーカス制御をオンする。すなわち、オートフォーカススイッチ３１３からオートフォーカス制御部３１５に、ユーザの操作に応じた信号が供給されるとオートフォーカス制御が開始される。

オートフォーカス制御部３１５は、焦点検出回路３２３による焦点位置の検出結果に基づいて、制御部３１１に対物レンズ２３の移動を指示する。制御部３１１は、対物レンズ２３の焦点が標本２２上に位置するように、対物レンズ２３を移動させる。

なお、ユーザの操作等により、オフセットレンズ群６２の移動が指示された場合には、オートフォーカス制御部３１５は、オフセットレンズ制御部３１６にオフセットレンズ群６２の移動を指示する。そして、オフセットレンズ制御部３１６は、その指示に応じてステッピングモータ１３７を駆動させ、オフセットレンズ群６２を移動させる。

このようにしてオートフォーカス制御が開始されると、対物レンズ２３の焦点が標本２２上に位置し、標本２２にピントが合った状態となる。なお、この状態において、参照光は、顕微鏡１１の観察視野の領域の中心に位置するようになされている。また、以下、顕微鏡１１の観察視野の領域の中心の位置を、視野中心位置とも称する。

標本２２の観察開始直後は、参照光が視野中心位置あるので、ユーザは、参照光移動スイッチ３１４を操作して、参照光の退避領域への移動を指示する。

これにより、参照光移動スイッチ３１４からオートフォーカス制御部３１５には、ユーザの操作に応じた信号が供給され、この信号に応じてオートフォーカス制御部３１５は、制御部３１１に対物レンズ２３のＺ方向の位置を示す位置情報を要求する。すると、制御部３１１は、位置検出部３１２に対物レンズ２３の位置の検出を指示する。

ステップＳ１２において、位置検出部３１２は、対物レンズ２３の位置を検出し、その位置を示す位置情報を、制御部３１１を介してオートフォーカス制御部３１５に供給する。なお、以下、参照光が移動される前、つまり参照光が視野中心位置にある状態で検出された対物レンズ２３のＺ方向の位置を、基準位置とも称する。

ステップＳ１３において、オートフォーカス制御部３１５は、位置検出部３１２からの位置情報を保持する。そして、オートフォーカス制御部３１５は、ミラー制御部３１７に、電動操作ミラー１３５の回動を指示する。

ステップＳ１４において、ミラー制御部３１７は、参照光の像を標本２２上の視野中心位置から退避領域に移動させるための電動操作ミラー１３５の回動角度を求める。すなわち、ミラー制御部３１７は、予め記録している対物レンズ２３の倍率と、カメラ２７の撮像素子の受光面の大きさ（面積）とに基づいて、視野中心位置から退避領域までの距離を求める。換言すれば、標本２２をカメラ２７で観察する場合における、標本２２の観察光学系の観察倍率に基づいて、参照光の移動距離が求められる。さらに、ミラー制御部３１７は、求められた距離から、その距離だけ参照光を移動させるために必要な、電動操作ミラー１３５を回動させるべき回動角度を求める。

例えば、第２対物の焦点距離が２００ｍｍであり、倍率がＭである対物レンズ２３の視野内で、参照光をｘ（μｍ）だけ移動させると、参照光の標本２２への入射角度は、角度θ＝Arctan（x/（200/M））だけ変化する。したがって、角度θの半分の角度だけ電動操作ミラー１３５を傾ければ（回動させれば）、参照光の標本２２への入射角度がθだけ変化し、参照光を対物レンズ２３の視野内でｘ（μｍ）だけ移動させることができる。

ミラー制御部３１７は、標本２２の観察光学系の観察倍率に基づいて、参照光の移動距離ｘを求めると、次式（１）を計算して、電動操作ミラー１３５の回動角度θ’を求める。

θ’＝0.5×Arctan（x/（200/M）） ・・・（１）

ステップＳ１５において、ミラー制御部３１７は、求めた回動角度だけ電動操作ミラー１３５を回動させて、参照光を退避領域に移動させる。参照光が移動すると、対物レンズ２３の収差により、Ｚ方向に対して参照光の結像位置にずれが生じる。すると、オートフォーカス制御により、対物レンズ２３が移動されて、標本２２にピントが合っていない状態となる。

ここで、対物レンズ２３のＺ方向の位置が、ステップＳ１２において検出された基準位置となれば、標本２２にピントが合った状態となる。そこで、対物レンズ２３が、オートフォーカス制御部３１５に保持されている位置情報に示される基準位置に移動されるように、オフセットレンズ群６２が移動される処理が行われる。

すなわち、オートフォーカス制御部３１５は、制御部３１１に位置情報を要求し、制御部３１１は、その要求に応じて、位置検出部３１２に対物レンズ２３の位置の検出を指示する。すると、ステップＳ１６において、位置検出部３１２は、対物レンズ２３のＺ方向の位置を検出し、その検出結果を示す位置情報を、制御部３１１を介してオートフォーカス制御部３１５に供給する。

ステップＳ１７において、差分算出部３２１は、オートフォーカス制御部３１５が保持している参照光移動前の位置情報と、新たに位置検出部３１２から取得した、参照光移動後の位置情報とを用いて、基準位置を基準とする対物レンズ２３の移動した距離を求める。すなわち、対物レンズ２３のＺ方向の位置の差分が求められる。

ステップＳ１８において、移動量算出部３２２は、差分算出部３２１により求められた位置の差分を用いて、オフセットレンズ群６２を移動させるべき移動量を求める。

例えば、移動量算出部３２２は、対物レンズ２３の位置の差分の値と、その値に対して予め実測により求められた、オフセットレンズ群６２を移動させるべき移動量とが対応付けて記録されているオフセットテーブルを保持している。移動量算出部３２２は、保持しているオフセットテーブルを参照して、差分算出部３２１により求められた位置の差分に対応付けられている移動量を読み出すことで、オフセットレンズ群６２を移動させるべき移動量を求める。

この移動量だけオフセットレンズ群６２が移動されれば、参照光の移動により生じた、対物レンズ２３の焦点から標本２２までの距離のずれが補正され、オートフォーカス制御により、標本２２に対物レンズ２３のピントが合う状態となる。オートフォーカス制御部３１５は、移動量算出部３２２により求められた移動量だけオフセットレンズ群６２が移動されるように、オフセットレンズ制御部３１６に、オフセットレンズ群６２の移動を指示する。

ステップＳ１９において、オフセットレンズ制御部３１６は、オートフォーカス制御部３１５の指示により指示された移動量だけ、オフセットレンズ群６２を移動させる。このようにしてオフセットレンズ群６２が移動されると、対物レンズ２３の焦点が、標本２２上に位置していない状態であると、焦点検出回路３２３により検知される。すると、オートフォーカス制御により、対物レンズ２３が基準位置に移動されて、標本２２にピントが合った状態となり、パーソナルコンピュータ３０１には、標本２２にピントが合った鮮明な画像が表示される。

このように、オフセットレンズ群６２を移動させて、対物レンズ２３の位置を、参照光の光路を振る直前の基準位置に維持することは、参照光の移動前後において、標本２２にピントが合うように、対物レンズ２３の焦点位置を維持することである。

パーソナルコンピュータ３０１に、カメラ２７により撮像された標本２２の画像が表示され、ユーザが標本２２の蛍光観察を終えると、例えば、ユーザは標本２２を取り換えたり、顕微鏡１１での観察自体を終了させたりするために、参照光移動スイッチ３１４を操作する。すなわち、参照光が視野中心位置に戻るように操作がなされ、その操作に応じた信号が、参照光移動スイッチ３１４からオートフォーカス制御部３１５に供給される。

ステップＳ２０において、オートフォーカス制御部３１５は、参照光移動スイッチ３１４からの信号に応じて、オートフォーカス制御をオフし、ミラー制御部３１７に参照光の移動を指示する。

ステップＳ２１において、ミラー制御部３１７は、オートフォーカス制御部３１５の指示に応じて電動操作ミラー１３５を回動させ、参照光を視野中心位置に移動させる。さらに、オートフォーカス制御部３１５は、保持している位置情報に基づいて、制御部３１１に、対物レンズ２３の基準位置への移動を指示する。

ステップＳ２２において、制御部３１１は、オートフォーカス制御部３１５の指示に従って対物レンズ２３を基準位置に移動させ、参照光移動処理は終了する。

このようにして、顕微鏡１１およびオートフォーカスユニット３０は、参照光を退避領域に移動させるとともに、対物レンズ２３の焦点位置が、参照光の移動前の位置で維持されるように、オフセットレンズ群６２を移動させる。これにより、参照光をカメラ２７の観察視野外に移動させて標本２２がダメージを受けることを防止するとともに、参照光の移動に伴うピントのずれを補正することができ、顕微鏡１１の観察環境を向上させることができる。

なお、パーソナルコンピュータ３０１または顕微鏡１１が、オフセットテーブルを用いて、オフセットレンズ群６２を移動させるべき移動量を求めるようにしてもよい。

また、オフセットテーブルを用いずにオフセットレンズ群６２を少しずつ移動させ、対物レンズ２３の位置が基準位置となった時点で、オフセットレンズ群６２の移動を停止するようにしてもよい。

そのような場合において行われる参照光移動処理を、図１２のフローチャートを参照して説明する。なお、ステップＳ５１乃至ステップＳ５５の処理のそれぞれは、図１１のステップＳ１１乃至ステップＳ１５の処理のそれぞれと同様であるため、その説明は省略する。すなわち、これらの処理により、オートフォーカス制御がオンされて、参照光が退避領域に移動される。

ステップＳ５６において、オフセットレンズ制御部３１６は、オートフォーカス制御部３１５の指示に応じて、予め定められた移動量だけオフセットレンズ群６２を移動させる。ここで、オフセットレンズ群６２を移動させる方向は、例えば、最後に取得された対物レンズ２３の位置情報により示される位置と、基準位置とから定められる。なお、これらの２つの位置に基づいて、オフセットレンズ群６２の移動量が定められるようにしてもよい。

このようにしてオフセットレンズ群６２が移動されると、対物レンズ２３の焦点が、標本２２上に位置していない状態であると焦点検出回路３２３により検知されて、オートフォーカス制御により、対物レンズ２３が移動される。

また、オフセットレンズ群６２が移動されると、オートフォーカス制御部３１５は、制御部３１１に位置情報を要求し、制御部３１１は、その要求に応じて、位置検出部３１２に対物レンズ２３の位置の検出を指示する。

ステップＳ５７において、位置検出部３１２は、対物レンズ２３のＺ方向の位置を検出し、その検出結果を示す位置情報を、制御部３１１を介してオートフォーカス制御部３１５に供給する。

ステップＳ５８において、オートフォーカス制御部３１５は、オフセットレンズ群６２を移動させるか否かを判定する。すなわち、オートフォーカス制御部３１５は、新たに位置検出部３１２から取得した位置情報に示される位置と、保持している位置情報に示される基準位置とを比較する。そして、オートフォーカス制御部３１５は、それらの位置が一致している場合、対物レンズ２３の焦点が標本２２上に位置し、標本２２にピントが合っている状態になったとして、オフセットレンズ群６２を移動させないと判定する。

ステップＳ５８において、オフセットレンズ群６２を移動させると判定された場合、まだ標本２２にピントが合っていないので、処理はステップＳ５６に戻り、上述した処理が繰り返される。

一方、ステップＳ５８において、オフセットレンズ群６２を移動させないと判定された場合、参照光の移動により生じたピントのずれが補正されたので、処理はステップＳ５９に進む。その後、ステップＳ５９乃至ステップＳ６１の処理が行われるが、これらの処理は、図１１のステップＳ２０乃至ステップＳ２２と同様であるので、その説明は省略する。

ステップＳ６１の処理が行われて、対物レンズ２３が基準位置に移動されると、参照光移動処理は終了する。

このようにして、顕微鏡１１およびオートフォーカスユニット３０は、参照光を退避領域に移動させるとともに、対物レンズ２３の焦点位置が、参照光の移動前の位置で維持されるように、少しずつオフセットレンズ群６２を移動させる。これにより、参照光をカメラ２７の観察視野外に移動させて標本２２がダメージを受けることを防止するとともに、参照光の移動に伴うピントのずれを補正することができ、顕微鏡１１の観察環境を向上させることができる。

なお、以上においては、オフセットレンズ群６２を移動させて、参照光の移動により生じる対物レンズ２３と標本２２との距離のずれを補正すると説明したが、CCD６４が標本２２からの反射光を受光して得られる信号に基づいて補正されるようにしてもよい。

CCD６４が標本２２からの反射光を受光して得られる信号を、検出信号と呼ぶこととすると、CCD６４の受光面における検出信号の分布強度と、その分布強度の分割位置および分割比とに基づいて、オートフォーカス制御時の対物レンズ２３の移動量が求まる。

そこで、焦点検出回路３２３は、検出信号の分布強度の分割位置または分割比を変更することによって、対物レンズ２３の焦点位置を擬似的に移動させ、オートフォーカス制御により、対物レンズ２３の焦点が標本２２上に位置するようにする。

また、オートフォーカススイッチ３１３および参照光移動スイッチ３１４は、オートフォーカスユニット３０に限らず、顕微鏡１１に設けられていてもよい。例えば、参照光移動スイッチ３１４が、電動ステージ２１に設けられた、標本２２の入ったガラスボトムディッシュ６７を固定する把持部などに設けられるようにしてもよい。この場合、ユーザは、観察に用いるガラスボトムディッシュ６７を交換するときに、簡単に参照光移動スイッチ３１４の操作を行うことができる。

さらに、オートフォーカスユニット３０は、スリット投影式のオートフォーカス制御を行うものであってもよい。そのような場合、例えば、図５に示したオートフォーカスユニット３０のLED６１と、レンズ１３１との間にスリットが配置され、スリット状の参照光が標本２２に照射されることになる。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

Claims (10)

1. 標本からの光を対物レンズを介して撮像手段で撮像する観察光学系を備えた顕微鏡と、
   前記顕微鏡に装着され、前記対物レンズの焦点を前記標本に対する所望の位置に維持させるオートフォーカス装置と
   を有する顕微鏡装置において、
   前記オートフォーカス装置は、
   前記対物レンズを介して前記標本へ焦点検出用の光を照射するフォーカス用照明光学系と、
   前記対物レンズを介して、前記標本で反射した反射光を結像するフォーカス用結像光学系と
   を備え、
   前記フォーカス用照明光学系は、前記焦点検出用の光の前記標本における照射位置を、前記対物レンズの観察視野内であって、前記撮像手段の観察視野外の領域に変更し、かつ前記照射位置が前記撮像手段の観察視野外に移動されたことにより生じる前記対物レンズの焦点の前記所望の位置に対する位置ずれを補正するように構成されている
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
2. 請求項１に記載の顕微鏡装置において、
   前記フォーカス用照明光学系は、
   前記焦点検出用の光の前記標本における照射位置を、前記対物レンズの光軸方向と垂直な方向に沿って移動させるための照射光路変更手段と、
   前記焦点検出用の光の前記標本における照射位置を、前記対物レンズの光軸方向に沿って移動させるためのオフセット光学系と
   を備え、
   前記照射光路変更手段は、前記焦点検出用の光の前記標本における照射位置を、前記対物レンズの観察視野内であって、前記撮像手段の観察視野外の領域に変更し、
   前記オフセット光学系は、前記位置ずれを補正する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
3. 請求項２に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段は、前記フォーカス用照明光学系と前記フォーカス用結像光学系の共通光路内に配置されている
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
4. 請求項２または請求項３に記載の顕微鏡装置において、
   前記オフセット光学系が、前記焦点検出用の光の前記撮像手段の観察視野外の領域への移動前後における前記対物レンズの位置の差分に対応する移動量だけ移動されることで、前記位置ずれが補正される
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
5. 請求項２乃至請求項４の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段は、前記対物レンズと前記オフセット光学系との間に配置されている
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
6. 請求項２乃至請求項５の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段および前記オフセット光学系は、前記対物レンズから射出される平行光束の光路上に配置されている
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
7. 請求項２乃至請求項６の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段は、
   前記焦点検出用の光を反射する反射面と、
   前記反射面の中心を通り、前記反射面の法線に垂直な直線を軸として前記反射面を回動させる回動制御手段と
   を有する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
8. 請求項２乃至請求項７の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段は、前記観察光学系の観察倍率に基づいて、前記焦点検出用の光に対する、前記照射位置の設定のための制御量を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
9. 請求項２乃至請求項８の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
   前記照射光路変更手段は、前記観察光学系の観察倍率に基づいて、前記焦点検出用の光の振り角を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡装置。
10. 請求項１乃至請求項９の何れか一項に記載の顕微鏡装置において、
    前記顕微鏡は蛍光顕微鏡であり、前記オートフォーカス装置は、前記顕微鏡の前記撮像手段が前記標本を撮像している間、フォーカス動作している
    ことを特徴とする顕微鏡装置。

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