JP2008276070A - 拡大撮像装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明では、対物レンズと試料との間に介在するカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料を保持する媒質の厚さや屈折率が異なる場合に生じる諸収差を自動的に補正する撮像装置を提供する。
【解決手段】本発明の上記課題は、観察する試料と、前記試料と対物レンズとの間に介在する透過性を有する試料保持部材と、前記試料保持部材の光学的な厚さの誤差に起因して発生する収差を補正する補正環機構を備えた補正環付き対物レンズと、前記試料保持部材の光学的な厚さを検出する光学厚さ検出手段と、前記光学厚さ検出手段により検出された前記試料保持部材の光学的な厚さをもとに、収差補正量を求める演算手段と、前記演算手段で求めた前記収差補正量に基づいて前記補正環を駆動させる駆動手段と、前記対物レンズと前記試料との距離を変える合焦手段と、前記対物レンズを通った前記試料の像を撮像する撮像手段を備えることによって解決される。
【選択図】 図１

Description

本発明は顕微鏡などの拡大撮像光学系を備えた撮像装置に関し、詳しくは、対物レンズと試料との間に介在するカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料を保持する媒質の厚さが異なる場合に生じる諸収差を自動的に補正する拡大撮像装置に関する。

一般に顕微鏡等の強拡大系の対物レンズは、厚さと屈折率とが規定されたカバーガラスを用いて固定された試料を観察したときに鮮明な像が得られるように設計されている。よって、厚さや屈折率が標準のものから大きく外れたカバーガラスを用いて観察したときには、諸収差が発生して鮮明な像が得られない。この傾向は開口数が大きな対物レンズ程、顕著に現れる。

このため、対物レンズの中には、対物レンズを構成する一部のレンズ系を光軸に沿って移動させることができる対物レンズがある。この対物レンズは補正環付き対物レンズと呼ばれ、次のような対物レンズがある。（１）カバーガラス厚のバラツキにより諸収差の発生が顕著となる開口数の大きな乾燥系対物レンズ。（２）例えば、厚さが０．１７ｍｍから２ｍｍというように、相当に広範囲にわたり異なる厚さのカバーガラスやプラスチック容器を使用することを想定した対物レンズ。これらの補正環付き対物レンズを用いると、補正環なしの対物レンズに比べて、様々なカバーガラス厚に対して鮮明な像が得られる。

しかし実際には、このような顕微鏡対物レンズを用いて収差補正を行うのは容易でなく、熟練者でなければ、最も像が鮮明に見える位置を見つけることは困難である。というのは、収差補正のために一部のレンズを移動させると、諸収差の変化と同時に焦点位置の変化が生じてしまうからである。焦点位置の変化が生じると、当然、像はボケてしまう。そしてボケた像では収差の補正具合は把握できないので、顕微鏡の観察者は常に、収差補正のための操作と、ピント合わせとを繰り返し行わなければならず、連続的に収差量の変化を捉えることができないからである。

上記のような課題に対して特許文献１では、補正環を動かした際に生じる焦点位置の変化を自動で補正する技術に関して述べている。しかしながら、収差補正を自動化することが出来てはいないという点で、観察者の利便性は十分に満たされてはいない。

特許文献２では対物レンズと結像部との間に球面収差補正レンズを配置し、この球面収差補正レンズを光軸に沿って移動させることにより球面収差を補正し得るようにした顕微鏡装置において、テレビカメラがステージ上に載置された被観察物の像を取得し、その画像を電気信号として出力し、第一の制御部がこのテレビカメラからの電気信号に基づいて補正レンズ駆動部を駆動して球面収差補正レンズを移動させる例が示されている。この方法では、取得した被観察物の像を元に補正レンズ駆動部を駆動するので、特に微弱な蛍光像を対象とする場合には、画像取得の為の露光時間が長くなり、繰り返し画像取得を必要とする場合にはさらに長い時間を要する。また、画像取得の為に、試料に励起光を当てる必要があり、試料へ光によるダメージを与えるという課題がある。
特開２００２−１６９１０１号公報 特開２００１−０８３４２８号公報

本発明では、上記問題に鑑み、対物レンズと試料との間に介在するカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料を保持する媒質の厚さや屈折率が異なる場合に生じる諸収差を自動的に補正する拡大撮像装置を提供する。

本発明の上記課題は、観察する試料と、前記試料と対物レンズとの間に介在する透過性を有する試料保持部材と、前記試料保持部材の光学的な厚さの誤差に起因して発生する収差を補正する補正環機構を備えた補正環付き対物レンズと、前記試料保持部材の光学的な厚さを検出する光学厚さ検出手段と、前記光学厚さ検出手段により検出された前記試料保持部材の光学的な厚さをもとに、収差補正量を求める演算手段と、前記演算手段で求めた前記収差補正量に基づいて前記補正環機構を駆動させる駆動手段と、前記対物レンズと前記試料との距離を変える合焦手段と、前記対物レンズを通った前記試料の像を撮像する撮像手段を備えることによって解決される。

本発明によれば、対物レンズと試料との間に介在するカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料を保持する媒質の厚さが、規定値とは異なる場合に生じる諸収差を自動的に補正する撮像装置が提供される。また、収差補正が自動化されることにより、収差補正にかかる手間が大幅に削減され、熟練者ではなくとも収差補正を正確に行うことができて、常に良質の画像を迅速に得ることが可能となる。

また本発明の方法によれば、試料保持部材の厚さや屈折率のみを検出すればよいので、収差補正の為に試料の像を得る必要は無く、試料への刺激が少ない波長の光での厚さ検出が可能であり、迅速且つ、試料へのダメージが少ない自動補正が可能となる。

［第１の実施の形態］
本発明の実施のための顕微鏡全体の構成例を図１に示す。ステージ１６に載置された観察する標本Ｓの下方に対物レンズ５が配置され、この対物レンズ５を保持する対物レンズ保持部材があり、駆動部１７により対物レンズ５が上下する。対物レンズ保持部材は、保持されている対物レンズ５の種類を認識することにより対物レンズ固有の情報を識別する対物レンズ識別手段を有している。

本実施形態の顕微鏡は励起用光源１２とそれを対物レンズ５及び標本Ｓへと導くための照明光学系１３と蛍光キューブ１４を備えている。蛍光キューブ１４の内部にはダイクロイックミラーと励起フィルタと吸収フィルタを備え、蛍光キューブ１４およびそれに付随するフィルタ類は交換及び挿脱可能になっている。対物レンズ５を通った標本Ｓの観察光は結像レンズ６でＣＣＤなどの撮像素子１５に結像される。なお図１の標本Ｓの上方に、透過照明光源及び標本Ｓに光源の照明光を集光させる透過照明系（不図示）を用いて、標本Ｓを照明してもよい。

試料保持部材の測定および合焦などに用いられる光源２から発せられた光線は、コリメータレンズ３を経由してハーフミラー８で反射され、対物レンズ５と蛍光キューブ１４の間に配置されたダイクロイックミラー９で反射され、対物レンズ５を経由して標本Ｓを照明する。コリメータレンズ３とハーフミラー８の間には遮蔽板４があり、遮蔽板４は対物レンズ５の瞳とほぼ共役の位置になっている。遮蔽板４はコリメータレンズ３の光束の光軸を境に半分を遮光し、光源２の光束を半分に制限している。

光源２の照明光の標本Ｓからの戻り光は、対物レンズ５、ダイクロイックミラー９及びハーフミラー８を経て、結像レンズ６で２分割センサ７に結像する。遮蔽板４によって光束の半分が遮光されているので、標本Ｓからの戻り光は照明光とは光軸を中心に対称となる光路を通り、２分割センサ７に投影される。ここで２分割センサ７の分割方向と遮蔽板４の分割方向は対応させて配置されている。

対物レンズ５には補正環５Ａとこの補正環５Ａを駆動する補正環駆動部２５が設けられている。対物レンズ識別手段、補正環駆動部２５、駆動部１７、撮像素子１５及び２分割センサ７は演算装置２７に電気的に接続されている。

図１に示される構成例は倒立型顕微鏡の形態をとるが、標本Ｓを上方から観察する正立顕微鏡の形態をとることもできる。標本Ｓと対物レンズ５との間を調節して合焦させるには、対物レンズ５の上下に限らず、点線で示すようにステージ１６に上下動駆動部を設けてもよい。

対物レンズ５は補正環付き対物レンズであり、（１）カバーガラス厚のバラツキにより諸収差の発生が顕著となる開口数の大きな乾燥系対物レンズ（補正量が０．１１から０．２３ｍｍ）、（２）最大２ｍｍというような相当に広範囲にわたり異なる厚さのガラスシャーレなど使用することを想定した厚ガラス用対物レンズ（補正量が０から２ｍｍ）、（３）最大２ｍｍというような相当に広範囲にわたり異なる厚さのプラスチック容器を使用することを想定したプラスチック用対物レンズ、などがある。

図２は標本Ｓと対物レンズ５の部分を拡大した図である。対物レンズ５の上方に試料保持部材（カバーガラス）２０があり、試料保持部材２０とスライドガラス２４の間に試料１８があり、試料保持部材２０は試料を固定する封入剤１９および封止剤２１で試料１８をスライドガラス２４に固定している。これら試料１８、封入剤１９、試料保持部材２０、封止剤２１及びスライドガラス２４で標本Ｓとする。標本Ｓはスライドガラス２４に固定された試料１８に限らず、シャーレなどの容器に入った試料１８も含み、容器などにパッケージされた状態の試料を標本Ｓとしている。

ここで、試料保持部材２０の対物レンズ５側の面を試料保持部材の空気と接する面２２とし、試料保持部材２０の試料１８側の面を試料保持部材の試料と接する面２３とする。空気と接する面２２と試料と接する面２３の間が試料保持部材（カバーガラス）２０の厚さとなる。これは機械的な厚さであり、この試料保持部材の機械的な厚さをＣＧ厚さとする。

図３は本発明の実施における基本的なフローを示している。まずステージ１６に標本設置をする。標本Ｓすなわち試料１８上の観察場所を対物レンズ５の光軸上に移動させる位置合わせを行う（S1-1）。対物レンズ５の補正環を基準位置に駆動する（S1-2）。

その後、光軸上の保持部材の光学的な厚さを検出するため、後述するサブフローを実行する（S1-3）。サブフローの結果で得られた試料保持部材２０の光学的な厚さと補正環の基準位置での光学的な厚さとの差を求め、この差分に基づいて補正環の駆動方向と量を算出する（S1-4）。

求められた差分の駆動量を基に補正環を駆動し(S1-5)、試料保持部材２０に起因する収差を補正する。これと連動して補正環の差分の駆動に伴い生じる焦点位置の変化量に応じて定められる焦点位置の補正量を算出し、前記駆動部１７で焦点位置の補正を行う（S1-6）。収差を補正した状態で試料１８に焦点を合わせ（S1-7）、試料１８の像を撮像して、このフローは完了する。ここで、特に素早い作動が要求されない場合には（S1-6）を省略してもよい。また、（S1-6）による焦点位置の補正が十分な場合には、（S1-7）を省略してもよい。

図４Ａは、図３の（S1-3）に利用される試料保持部材２０の光学的な厚さを検出するサブフローの一例を示している。本実施例では、後述する瞳分割方式の測長機によって保持部材の空気と接する側の面２２と、試料と接する側の面２３の距離差を測定し、その情報により試料保持部材２０の光学的な厚さ検出を行う。

このサブフローのはじめの処理は瞳分割方式の測長機によって試料保持部材２０の空気と接する側の面２２に対物レンズ５の焦点位置を一致させることからはじめる（S2-1）。駆動部１７の駆動にはステッピングモータが使用されており、この状態をもって、ステッピングモータが駆動したステップ数のカウントをリセット（ゼロに）する（S2-2）。その後、駆動部１７を駆動させ試料保持部材２０の試料と接する面２３に対物レンズの焦点位置を合わせ（S2-3）、このときのステップ数を記録する（S2-4）。このステップ数とステップあたりの焦点の駆動量を掛け合わせた値が、標本保持部材２０の光学的な厚さとなる（S2-5）。

基準となるカバーガラスの機械的な厚さを0.17mmに設定したときの例を示す。実際の標本Ｓのカバーガラスの機械的な厚さを0.13mmとした時、カバーガラスの屈折率（ne=1.5255）で光学的な厚さに換算すると、基準0.17mm は約0.11166 mmに、実際0.13mmは0.08539 mmになり、光学的な差分は0.02627 mm（機械的な差分0.04 mm）となる。光学的な厚さを検出するサブフローで実際の標本Ｓの光学的な厚さ0.08539 mm（機械的な厚さ0.13mm）が求められ、基準カバーガラスに対する光学的な厚さの差分である0.02627 mm（機械的な差分0.04 mm）を基に補正環の駆動量を算出している。前述の（S1-7）。

補正環を厚さの差分である0.02627 mm（機械的な差分0.04 mm）により生ずる収差を補正し得るだけ駆動して、実際のカバーガラスの厚さに合わせる。このとき、試料１８と対物レンズ５の間隔はピントが合った状態からずれることになる。補正環駆動量の算出は対物レンズの種類によって変わり、対物レンズ固有の補正環駆動算出データテーブル又は関数によって計算される。この対物レンズ固有の補正環駆動算出データテーブル又は関数は演算装置２７に格納されていて、補正環の厚さの差分（機械的な差分0.04 mm）と固有の補正環駆動算出データテーブル又は関数で補正環の駆動量を算出している。

補正環を動かすことによって対物レンズ５の収差が変わり、対物レンズ固有の収差補正算出データテーブル又は関数によって計算される。この対物レンズ固有の収差補正算出データテーブル又は関数は演算装置２７に格納されていて、補正環の厚さの差分（機械的な差分0.04 mm）と収差補正算出データテーブル又は関数で焦点位置の補正量を算出している。

図５は上記のフローで利用される瞳分割方式の測長機の仕組みを説明する。図５Ａは対物レンズ５の焦点位置が反射面１に一致している状態の光路を示している。光源２から発射された光線はコリメータレンズ３を経由しておよそ瞳と共役の位置に配置された遮蔽板４によって、光線束を半分に遮られる。その結果、対物レンズ５から焦点位置へ照射される光線は照射角度が制限される。すなわち偏射照明となる。

焦点位置で反射された光線は照射時の光路と光軸対称となる光路を通り、対物レンズ５によって集められる。対物レンズ５より射出された反射光はハーフミラー８と結像レンズ６を通過して、結像レンズ６の焦点位置近傍に配置された２分割センサ７に到達する。このときに２分割センサ７の分割方向と遮蔽板４の分割方向は対応させて配置される。

なお、同図におけるハーフミラー８の代わりに偏光ビームスプリッターが使用される場合には、光源２からの光と２分割センサ７へ向かう光を偏光方向の違いで分離する。ダイクロイックミラー９は観察光路へ向かう光と、２分割センサ７へ向かう光を波長で分離する。また、本方式で利用される光源２は赤外線レーザーなどの長波長光源であることが望ましい。長波長光は生体試料１８へのダメージが少なく、前記ダイクロイックミラー９により、一般的に観察に用いられる可視光との分離が容易だからである。

図５Ａでは反射面１が対物レンズ５の焦点位置にあるので、反射光は２分割センサ７のほぼ一点に近い領域に到達する。このとき２分割センサ７は、センサＡとセンサＢに分割されているとすれば、センサＡとセンサＢに検出される光の強度が等しくなるように配置されている。図５Ａにおける符号１０に示される図は、反射面１からの反射光が到達した２分割センサ７の受光面の様子を示している。

図５Ｂは反射面１が対物レンズの焦点面１１よりも対物レンズ５に近い位置にあるときの光路を示している。反射面１が対物レンズの焦点面１１よりも対物レンズ５に近い側にある場合は、反射面１からの反射光は結像レンズ６の焦点位置よりも遠方に結像する。反射光が結像する位置より手前に２分割センサ７があるので、２分割センサ７の受光面１０ではボケた像となってしまう。ところで、照明光は遮蔽板４によって光束を半分に制限されているので、２分割センサ７の受光面１０に映るボケ像は半分の領域になってしまう。図５Ｂでは、この様子が２分割センサ７の受光面１０のセンサＡにのみに反射面からの光が当たっているものとして図示されている。

一方、図５Ｃは標本面１が対物レンズの焦点面１１よりも対物レンズ５に遠い位置にあるときの光路を示している。反射面１が対物レンズの焦点面１１よりも対物レンズ５から遠い側にある場合は、反射面１からの反射光は結像レンズ６の焦点位置よりも近方に結像する。ところが、反射光が結像する位置より遠方に２分割センサ７があるので、２分割センサ７の受光面１０ではボケ像となってしまう。この場合は、結像位置よりも遠方に２分割センサ７があるので、図５Ｂとは反対のセンサＢのみに反射光が当たっている。

上記のように、瞳分割方式の測長機を用いれば対物レンズの焦点面に反射面１があるのか、近方にあるのか、あるいは遠方にあるのかを判別することが出来る。本発明の実施例ではこの性質を利用し試料保持部材の空気と接する側の面２２と、試料と接する側の面２３の検出を行い、その距離差から試料保持部材２０の光学的な厚さを検出する。試料保持部材の空気と接する側の面２２と、試料と接する側の面２３の距離差を求める方法を以下に示す。

図６に示されるグラフは、厚さが0.16mmのカバーガラスと0.17mmのカバーガラスに対して瞳分割方式を実施した場合のセンサＡとセンサＢの受光強度の差分を示したグラフである。横軸は駆動部１７による対物レンズの焦点面１１の駆動量[μm]を表し、縦軸はセンサＡとセンサＢの受光強度の差を正規化したものをグラフ化した。ただし、横軸の正の向きは対物レンズ５から試料保持部材２０へ向かう方向を正とした。

同図のグラフから読み取れるように、センサＡとセンサＢの受光強度が等しくなっている状態が数箇所で起きている。つまり、縦軸が０を示す点が数箇所ある。この中で負の領域から正の領域へと右上がりに交わる点が、対物レンズの焦点面１１と反射面が一致したことを意味している。なぜなら、反射面が対物レンズの焦点面１１より遠方にある場合はセンサＢの受光強度のほうが高く、つまりグラフの縦軸が負の領域に対応しているからである。これが反転して正の領域に入れ替わる点が反射面である。

例えば実線で表される0.17mmのカバーガラスのグラフの場合は-2μmの位置で右上がりに交わり、109μm付近でもう一度右上がりに交わっている。基準位置より-2μmの位置に検出した１つ目の反射面が試料保持部材の空気と接する側の面２２であり、基準位置より109μmの位置に検出した２つ目の反射面が試料保持部材の試料１８と接する側の面２３である。それぞれの面の距離差は111μmなので、この量にカバーガラスの屈折率（ne=1.5255）を掛けたもの(169μm=約0.17mm)がカバーガラスの厚さとして検出されたことになる。

上記を式で表すと、カバーガラスである試料保持部材２０の機械的な厚さをＣＧ厚、試料保持部材２０の光学的な厚さをＤｘ、試料保持部材２０の屈折率ｎｅとしたとき、ＣＧ厚＝Ｄｘ＊ｎｅ となる。実線で表される0.17mmのカバーガラスの場合は、ＣＧ厚（169μm）＝Ｄｘ（111μm）＊ｎｅ（1.5255）と計算される。

この実施の形態では、試料保持部材２０の光学的な厚さＤｘを用いる。前述の乾燥系補正環付対物レンズ（補正量が０．１１から０．２３ｍｍ）の場合で説明する。点線で表される0.16mmのカバーガラスのグラフの場合はそれぞれの面の距離差は100μmとなっている。補正環の基準位置を0.17mmとした時、試料保持部材２０の光学的な厚さＤｘが100μm（機械的な厚さ0.16mm）と差分は11μmとなる。この差分の11μmが補正環駆動量となる。

図４Ｂは本発明の実施における厚さ検出フローの変形例を示す。同図は図４Ａのフローと同様に瞳分割方式の測長機で試料保持部材の空気に接する側の面２２を検出し（S3-1）、駆動部１７の駆動に用いられるステッピングモータのステップ数をゼロにリセットする（S3-2）。その後、コントラスト検出法（パッシブ方式）にて試料１８への合焦を行う（S3-3）。この方式は観察光路上に配置したCCDなどの撮像手段によって試料１８の像のコントラストが最大になる位置を探し出す。一般には、試料１８は試料保持部材２０に接しているので、試料１８と試料保持部材の試料と接している側の面２３は、同一若しくは極めて近傍にあると見做せる。そして、このときのステッピングモータのステップ数を記録し（S3-4）、そのステップ数から駆動部１７による移動量に換算する（S3-5）。尚、前記ステッピングモータのステップ数は、本発明の構成とは別に設けられたエンコーダー等により検出されるステップ数であってもよい。

図６に示されるグラフにおいて、１つ目の反射面の検出位置に比べて、２つ目の反射面の検出位置でグラフの傾きが小さく、縦軸の変化量が小さいのは、試料保持部材の空気と接する側の面２２に比べて、試料保持部材の試料と接する側の面２３からの反射光が弱いことを表している。これは空気と試料保持部材２０との屈折率差よりも、試料１８や試料を固定する封入剤１９と試料保持部材２０との屈折率差の方が小さいためである。試料保持部材と、試料１８や試料を固定する封入剤１９との屈折率差が極めて小さい場合には、反射光は極めて弱くなり、前記瞳分割式の測長機では、試料と接する側の面２３を検出できない場合がある。試料保持部材の空気に接する面２２から、試料と接する面２３の側に向かって捜索を行い、想定される距離の範囲内に、試料と接する側の面２３を検出できなかった場合には、図４Ｂに示す手順に従い、前記撮像素子１５を利用して、試料保持部材の空気と接している側の面２２と、試料保持部材の試料と接している側の面２３との距離差を求め、この値に基づいて補正環を駆動することにより、光による試料１８へのダメージを最小限に抑えつつ、より多様な標本Ｓに対応することができる。

図１における撮像素子１５は試料１８の撮像に利用することも出来るし、本発明の実施におけるコントラスト検出法の合焦にも利用することが出来る。つまり、撮像素子１５からの出力は、演算装置を介することによって、対物レンズ５の補正環や焦点位置の調節量を決定するのに利用することが出来る。

駆動部１７は、対物レンズ５またはステージ１６を光軸に沿って移動させることにより、対物レンズ５と試料１８との距離を変える機構であり、瞳分割式の測長機による反射面の捜索や、試料１８への合焦、更には補正環の駆動に伴い生じる焦点位置の変化量に応じた、焦点位置の補正に利用する。

また、本構成例における瞳分割方式の測長機とコントラスト検出のための装置は本発明の実施に利用するためだけではなく、試料１８に対する自動焦点検出装置としても活用することが出来る。つまり、本発明によれば補正環の調節だけではなく焦点位置の調節も同じ構成で実施できる。

なお、図１では図示されてはいないが、本構成のほかに透過照明用の光源や肉眼観察用の観察用光路を備えてもよい。
［第２の実施の形態］
図７Ａは本発明の第２の実施の形態における基本的なフローを示す図である。

図７Ａは本発明の実施における基本的なフローを示している。本実施では前もってカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料１８を保持する媒質の情報を取得すればよい。つまり、試料保持部材２０の機械的な厚さと屈折率を、補正環を駆動する前に取得することを意味している。なお、図７Ａの例では機械的な厚さを先に取得するフローとなっているが、屈折率を先に取得するフローを採用しても本質的には変わらない。

図７Ａに示されるフローでは、初期設定として試料１８の位置合わせを行い（S4-1）、補正環を基準位置に駆動する（S4-2）。その後、試料１８の保持部材の機械的な厚さを検出するサブフローを実行し（S4-3）、その結果で得られた試料保持部材２０の機械的な厚さを記録する（S4-4）。その次に試料保持部材２０の屈折率を識別するサブフローを実行する（S4-5）。次の処理で試料保持部材２０の機械的な厚さと屈折率の積を計算することにより、補正環の駆動量を計算する（S4-6）。

求められた駆動量を基に補正環を駆動し（S4-7）、試料保持部材２０に起因する収差を補正する。これと連動して補正環の駆動に伴い生じる焦点位置の変化量に応じて定められる、焦点位置の補正量を算出し、前記駆動部１７焦点位置の補正を行う（S4-8）。収差を補正した状態で試料１８に焦点を合わせ（S4-9）、このフローは完了する。特に素早い作動が要求されない場合には（S4-8）を省略してもよい。また、（S4-8）による焦点位置の補正が十分な場合には、（S4-9）を省略してもよい。

なお、ここで言う機械的厚さとは、試料保持部材の空気に接する面２２とスライドガラスの試料保持部材側の面２４aとを検出したときのその差のことを意味する。
図７Ｂは標本保持部材の機械的な厚さが前もって解っている場合のための厚さ検出フローである。厚さがわかっている場合はその値を演算装置２７につながったＰＣ（パーソナルコンピュータ）などから手入力するのが良い。

ここからは、図７Ａで説明したフローにおける屈折率識別フローに対するいくつかの実施例を説明する。現在の標本保持部材はガラス製とプラスチック製の２つに大別される。そこで、標本保持部材の素材がどちらかであれば必然的に屈折率も解る。

図８に示される屈折率識別フローは、プラスチックの持つ自家蛍光に着目した方法である。まず、励起光を標本保持部材の表面に照射する（S5-1）。この時、試料保持部材がプラスチック製である場合は、強い蛍光が標本保持部材自身より発せられる。前フローで対物レンズの焦点は試料保持部材の表面に合っているため、上記蛍光を発する面がそのままＣＣＤ面に結像する。この試料保持部材の表面をＣＣＤにて撮像し、画面内の輝度分布を求める。輝度分布の中で暗い部分を３点程度選び、その３点の輝度の平均値を求める。この平均値がプラスチックとガラスを識別する輝度値以上であるかを比較する（Ｓ５−２）。この輝度値以上であれば、標本保持部材がプラスチック製であり、屈折率は１．６と判別できる（Ｓ５−３）。もしこの値以下であれば標本保持部材はガラス製であり、屈折率は１．５と判別できる（Ｓ５−４）。

ここで、プラスチックとガラスを識別する輝度値については、対物レンズからＣＣＤ面に至る光学系の性能に依存するため、一概には決めることができない。製品組み立て時にプラスチックとガラスの試料保持部材の蛍光輝度を測定し、製品ごとに識別輝度値を求めることが望ましい。

また、輝度分布の中の暗い部分３点の平均値をとる事で、ゴミなどの強い蛍光輝度の影響を削除することができる。
一方、標本保持部材にＣＣＤ視野範囲全体に至るような大きなゴミが付着していた場合、非常に強い蛍光輝度が検出される。このようなエラーを防ぐために輝度の上限値を決めておけばエラーを検出する事ができる。

前記屈折率識別手段は、前記厚さ検出手段で得られた前記試料保持部材の種別を認識することによりその屈折率を識別するものが考えられる。試料保持部材が一般的なカバーガラスの場合や、プラスチック容器の底に穴を開けてカバーバラスで塞いだグラスボトムディッシュの場合、その屈折率はne=1.5255±0.0015（ISO、JIS規格）と定められているので、この値を識別すればよい。細胞の培養などで使用されるプラスチックシャーレは、一般的にポリスチレン製なので、その屈折率はne=1.59と識別すればよい。

図９に示される屈折率識別フローは、一般的なプラスチック製とガラス製の試料保持部材の厚さの違いに着目した方法である。プラスチックは成型上、薄肉で作成することが難しい。まず、前段で得られている試料支持部材の厚さを取得する（S6-1）。その厚さが0.25mm以上であるかで試料保持部材の素材を判別する（S6-2）。もし厚さが0.25mm以上である場合、試料保持部材はプラスチック製であり、屈折率は1.6と判別できる（S6-3）。もし厚さが0.25mmより小さい場合、標本保持部材はガラス製であり、屈折率は1.5と判別できる（S5-4）。

ただし、将来的には薄肉プラスチックによる標本保持部材が開発され、使用されることも考えられる。したがって屈折率を求めた後に、別表示方法で試料保持部材の素材を表示して、利用者が確認できるようにすることが望ましい。

図１０は屈折率が前もって解っている場合のための屈折率識別フローである。あるいは、通常とは異なる標本保持部材を利用している場合にも利用される。この場合は屈折率を手入力する。

以上のように構成することにより、対物レンズと試料１８との間に介在するカバーガラス、ガラスシャーレ、又はプラスチック容器等の試料１８を保持する媒質の厚さや屈折率が異なる場合に生じる諸収差を自動的に補正する装置を提供される。

本発明の実施のための顕微鏡の構成例である。 一般的な顕微鏡用標本の構成を示す図である。 本発明の第１の実施の形態における基本的なフローを示す図である。 標本保持部材の厚さを検出フローの例である（アクティブ）。 標本保持部材の厚さを検出フローの例である（パッシブ）。 瞳分割方式の仕組みを説明する図である（１）。 瞳分割方式の仕組みを説明する図である（２）。 瞳分割方式の仕組みを説明する図である（３）。 瞳分割方式による検出結果のグラフである。 本発明の第２の実施の形態における基本的なフローを示す図である。 標本保持部材の厚さが前もって解っている場合のための厚さ検出フローである。 標本保持部材の屈折率識別フローの第１実施例である。 標本保持部材の屈折率識別フローの第２実施例である。 標本保持部材の屈折率が前もって解っている場合のための厚さ検出フローである。

符号の説明

１・・・反射面
２・・・光源
３・・・コリメータレンズ
４・・・遮蔽板
５・・・対物レンズ
５Ａ・・・補正環
６・・・結像レンズ
７・・・２分割センサ
８・・・ハーフミラー
９・・・ダイクロイックミラー
１０・・・２分割センサの受光面
１１・・・対物レンズの焦点面
１２・・・励起用光源
１３・・・照明光学系
１４・・・蛍光キューブ
１５・・・撮像素子
１６・・・ステージ
１７・・・駆動部
１８・・・試料
１９・・・試料を固定する封入剤
２０・・・試料保持部材（カバーガラス）
２１・・・封止剤
２２・・・試料保持部材の空気と接する面
２３・・・試料保持部材の試料と接する面
２４・・・スライドガラス
２５・・・補正環駆動手段
２６・・・対物レンズ識別手段
２７・・・演算装置

Claims (11)

1. 観察する試料と、
   前記試料と対物レンズとの間に介在する透過性を有する試料保持部材と、
   前記試料保持部材の光学的な厚さの誤差に起因して発生する収差を補正する補正環機構を備えた補正環付き対物レンズと、
   前記試料保持部材の光学的な厚さを検出する光学的厚さ検出手段と、
   前記光学厚さ検出手段により検出された前記試料保持部材の光学的な厚さをもとに、収差補正量を求める演算手段と、
   前記演算手段で求めた前記収差補正量に基づいて前記補正環機構を駆動させる駆動手段と、
   前記対物レンズと前記試料との距離を変える合焦手段と、
   前記対物レンズを通った前記試料の像を撮像する撮像手段と、
   を備えたことを特徴とする拡大撮像装置。
2. 前記補正環付き対物レンズの前記収差補正量に基づいて、前記補正環機構の駆動量と、焦点位置の移動量を決定するために、前記対物レンズ固有の情報を識別する対物レンズ識別手段を更に備えたことを特徴とする請求項１に記載の拡大撮像装置。
3. 前記光学的な厚さ検出手段は、瞳分割方式の測長器であり、前記試料保持部材の空気と接する面と、前記試料と接する面との距離を検出することにより、前記試料保持部材の光学的な厚さを検出することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の拡大撮像装置。
4. 前記光学的な厚さ検出手段は、
   瞳分割方式の測長器にて、前記試料保持部材の空気と接する面から所定の検索範囲内に前記試料保持部材と試料と接する面を検出できなかった場合に、前記撮像手段により得た画像を用いたコントラスト検出法にて前記試料への合焦を行い、
   試料保持部材の空気と接する面と、試料面との距離を検出し、
   これを前記試料保持部材の光学的な厚さとして検出することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の拡大撮像装置。
5. 前記合焦手段は、前記補正環機構の駆動に伴い生じる焦点位置の変化量に応じて、前記試料と前記対物レンズとの距離を変更することを特徴とする請求項１から請求項４の何れかに記載の拡大撮像装置。
6. 前記光学的厚さ検出手段は、前記試料保持部材の厚さを直接入力する入力装置を備えたことを特徴とする請求項１に記載の拡大撮像装置。
7. 観察する試料と対物レンズとの間に介在する透過性を有する試料保持部材と、
   前記試料保持部材の厚さ及び屈折率の違いや誤差に起因して発生する収差を補正する補正環機構を備えた対物レンズと、
   前記試料保持部材の機械的な厚さを検出する機械的厚さ検出手段と、
   前記試料保持部材の屈折率を識別する屈折率識別手段と、
   前記検出手段により検出された前記試料保持部材の機械的な厚さと前記屈折率識別手段により識別された屈折率をもとに、補正量を求める演算手段と、
   前記演算手段で求めた前記補正量に基づいて前記補正環機構を駆動させる駆動手段と、
   前記対物レンズと前記試料との距離を変える合焦手段と、
   前記対物レンズを通った前記試料の像を撮像する撮像手段と、
   を備えたことを特徴とする拡大撮像装置。
8. 前記屈折率識別手段は、少なくとも吸収フィルタと、励起フィルタと、ダイクロイックミラーとを備え、
   前記試料保持部材に励起光を当てて前記試料保持部材が自家蛍光を発するかどうかを前記撮像手段で検出して、前記試料保持部材の素材がプラスチックかガラスかを判断し屈折率を選択する選択手段を備えることを特徴とする請求項７に記載の拡大撮像装置。
9. 前記屈折率識別手段は、前記試料保持部材の素材がプラスチックかガラスかのいずれかの場合は、前記機械的厚さ検出手段で得られた前記試料保持部材の厚さからプラスチックとガラスを判断してその屈折率を選択することを特徴とする請求項７に記載の拡大撮像装置。
10. 前記屈折率識別手段は、ユーザーが前記試料保持部材の屈折率を直接入力することを特徴とする請求項７に記載の拡大撮像装置。
11. 前記瞳分割方式の測長器は、焦点検出機能と自動焦点調整機能を兼ね備えることを特徴とする請求項３に記載の拡大撮像装置。
    
    
    

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