JP5532193B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、共焦点顕微鏡に関する。

従来、光源から射出された照明光束を被検物に向けて集光するレンズと、ピンホールを有するピンホール部材と、ピンホールを通過した光を検出する光検出手段とを備える共焦点顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１参照。）。ピンホール部材は、ピンホールがレンズの焦点と共役関係におかれるように配置されている。これにより、照明光束がレンズを経て被検物に照射されたとき、レンズの焦点に一致する点において被検物から射出した射出光束のみがピンホールを通過し、焦点からレンズの光軸方向にずれた位置から射出した射出光束の大部分のピンホールへの通過が阻止される。

このような共焦点顕微鏡を用いて被検物の形状を計測する際、被検物の所望の高さ位置においてレンズの光軸に直交する断面上にレンズの焦点に集光された光束を照射し、該光束を前記断面上で走査させる。前記断面上の各点からの射出光束を光検出手段で検出することにより、被検物の所望の高さ位置における断面画像を得ることができる。更に、レンズ又は被検物をレンズの光軸に沿って順次移動させることによりレンズの焦点位置を光軸方向に順次移動させ、移動位置毎にその位置における被検物の断面画像を得る。被検物の各高さ位置で得た断面画像を合成することにより、被検物の三次元画像を得ることができる。
特開２００７−２７９０８５号公報

しかしながら、照明光束の一回の走査で得られる断面画像の数が一つであることから、被検物の三次元画像を取得すべく複数の断面画像を得るためには、被検物の断面上での照明光束の走査及びレンズ又は被検物の光軸方向への移動を、それぞれ得るべき断面画像の数と同数回行う必要がある。このため、被検物の三次元画像を取得するための計測に時間が掛かってしまう。

そこで、本発明の目的は、被検物の三次元画像の取得及び三次元計測の時間の短縮化を図ることができる共焦点顕微鏡を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明は、光源からの光を前記被検物に向けて集光させるレンズと、前記光を透過させる複数の透光部分を有し、該複数の透光部分のうち、少なくとも一つの該透光部分を透過した光に他の前記透光部分を透過した光との間で位相差を付与し、前記レンズを介して、前記レンズの光軸上に少なくとも２つの集光点をそれぞれ形成する集光点形成部材とを含み、前記レンズ及び前記集光点形成部材は単一光路上に配置されてなる照明光学系と、前記２つの集光点からのそれぞれの射出光を、前記集光点形成部材を介すことなく、それぞれ集光する２つの集光レンズと、前記２つの集光点のそれぞれと、前記各集光レンズを介して、共役な位置に配置された２つの遮光部材と、前記各遮光部材をそれぞれ経た前記射出光をそれぞれ検出する光検出手段とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、集光点形成部材により、レンズを経た光をレンズの光軸上に複数の集光点に集光させることから、被検物のレンズの光軸に直交する複数の断面上にそれぞれの光を同時に照射することができる。

これにより、被検物の前記各断面上に照射された照明光束をそれぞれ前記各断面上で同時に走査させることができるので、この一回の走査で集光点の数と同数の断面画像を同時に得ることができる。従って、被検物の三次元画像を取得すべく複数の断面画像を得るために行う被検物の断面上での照明光束の走査及びレンズ又は被検物の光軸方向への移動の回数を従来に比べて半分以下に減らすことができる。

本発明によれば、被検物の三次元画像を取得するための計測に掛かる時間を確実に短縮することができる。

以下、本発明を図示の実施例に沿って説明する。

図１は、例えば生物の細胞のように光の入射により蛍光を発生させる被検物１１を観察するための共焦点顕微鏡１０に本発明を適用した例を示す。

本発明に係る共焦点顕微鏡１０は、図１に示すように、被検物１１に照射される照明光束を射出する光源１２と、該光源からの照明光束を平行光に変換するためのコレクタレンズＣと、該コレクタレンズを経た照明光束を被検物１１に向けて集光させる対物レンズ１３とを備える。対物レンズ１３は、被検物１１の上方に配置されている。

また、共焦点顕微鏡１０は、ダイクロイックミラー１４と、該ダイクロイックミラーを経た光束を二つに分割する光分割部材１５と、該光分割部材から射出する二つの光束をそれぞれ集光するための二つの集光レンズ１６ａ，１６ｂと、該各集光レンズに対応して配置された二つの遮光部材１７ａ，１７ｂと、該各遮光部材に対応して配置された二つの光検出手段１８ａ，１８ｂとを備える。

ダイクロイックミラー１４は、照明光束の波長を含む短波長域の光を反射させ且つ被検物１１から射出する射出光束である蛍光の波長を含む長波長域の光の透過を許す。従って、照明光束はダイクロイックミラー１４で反射し、蛍光はダイクロイックミラー１４を透過する。

光分割部材１５は、一般的にビームスプリッタで構成される。ビームスプリッタには、従来よく知られているように、所定の透過率と所定の反射率とが設定されており、透過率及び反射率の割合で入射光の透過量及び反射量が規定されている。光分割部材１５は、図示の例では、ビームスプリッタのうち透過率と反射率とが等しいハーフミラーで構成されている。従って、ダイクロイックミラー１４を経た照明光束の半分は光分割部材１５で反射され残りの半分は光分割部材１５を透過する。

各遮光部材１７ａ，１７ｂは、それぞれピンホール１９ａ，１９ｂが形成されたピンホール部材１７ａ，１７ｂで構成されている。各ピンホール部材１７ａ，１７ｂのうち一方のピンホール部材１７ａは、そのピンホール１９ａが後述する二つの集光点２４，２５のうち一方の該集光点２４に対して共役関係となる位置に配置されている。他方のピンホール部材１７ｂは、そのピンホール１９ｂが他方の前記集光点２５に対して共役関係となる位置に配置されている。

各光検出手段１８ａ，１８ｂは、例えば光量センサで構成される。

本発明に係る共焦点顕微鏡１０では、光源１２から被検物１１に至る光路上に集光点形成部材２０が配置されている。集光点形成部材２０は、図示の例では、円盤状のガラス基盤からなり、その軸線方向で互いに向き合う一対の面２０ａ，２０ｂのうち一方の面２０ａがダイクロイックミラー１４に対向するようにコレクタレンズＣとダイクロイックミラー１４との間に配置されている。

集光点形成部材２０の前記一方の面２０ａには、図２（ａ）の平面図及び（ｂ）の縦断面図に示すように、集光点形成部材２０の周面２０ｃに開放し且つ集光点形成部材２０の周方向に伸びる段部２１が形成されている。段部２１の深さ寸法ｈは、ガラス基盤の屈折率をｎとし、照明光束の波長をλとすると、ｈ（ｎ−１）＝λ／２の関係を満たすように設定されている。従って、例えば照明光束の波長がλ＝４８８ｎｍであり、屈折率がｎ＝１．５である場合、ｈ＝４８８ｎｍとなる。また、段部２１は、例えば従来よく知られたリソグラフィ技術を用いて形成することができる。この段部２１の形成により、集光点形成部材２０の中央部には円柱状をなした第一の透光部分２２が形成され、集光点形成部材２０の周縁部には第一の透光部分２２の板厚寸法よりも小さい板厚寸法を有する環状の第二の透光部分２３が形成されている。

第一及び第二の各透光部分２２，２３は、それぞれ照明光束が入射する入射面２２ａ，２３ａを有する。各入射面２２ａ，２３ａの大きさは、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されている。図示の例では、各入射面２２ａ，２３ａで構成される集光点形成部材２０の他方の面２０ｂに照明光束が均一に照射されると考えて、各入射面２２ａ，２３ａの面積が互いに等しくなるように段部２１が形成されている。すなわち、集光点形成部材２０の前記他方の面２０ｂの半径をＲとし、第一の透光部分２２の半径をｒとすると、Ｒ及びｒは、Ｒ＝ｒ・２^1/2の関係を満たす。

集光点形成部材２０にその前記他方の面２０ｂ側から照明光束が照射すると、照明光束の半分は第一の透光部分２２を透過し、照明光束の残りの半分は第二の透光部分２３を透過する。このとき、段部２１の深さ寸法ｈが、前記したように、ｈ（ｎ−１）＝λ／２の関係を満たすことから、第一及び第二の各透光部分２２，２３を透過した各照明光束間に位相差πが付与される。位相差が生じた二つの照明光束は、それぞれダイクロイックミラー１４を経た後、対物レンズ１３で球面波に変換されて試料に向けて集光される。

このときの対物レンズ１３の光軸Ｌ上での照明光束の強度は、以下の式１で表される。式１において、ＮＡは、対物レンズ１３の開口数である。式１は、このＮＡが小さいときの近似式であり、図３（ａ）で表される透過率を有する位相マスクを照明光束が透過したあと対物レンズで集光されたときの光軸上の光強度分布を示している。（参考文献：Ｍ．Ｂｏｒｎ ａｎｄ Ｅ．Ｗｏｌｆ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ（５ｔｈ．ｅｄ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９７４））

・・・・・・（式１）

図３（ｂ）は、式１をプロットしたグラフである。図３（ｂ）のグラフの縦軸は照明光束の光強度を示し、横軸は光軸Ｌ上の座標を示す。図３から明らかなように、光軸Ｌ上には、光強度が最大になる二つのピークが対物レンズ１３の幾何光学焦点の前後に現れている。すなわち、互いに位相が異なる二つの照明光束が対物レンズ１３を通過したとき、光軸Ｌ上には、図４に示すように、光強度の値が極大値をとる二つの集光点２４，２５が形成される。両集光点２４，２５の間隔は、図示の例では、対物レンズ１３の開口数をＮＡとすると、４．６λ／ＮＡ²となる。ＮＡの値が大きいときは、式１は成立せず、数値計算をしなければならないが、例えばＮＡ＝０．９である場合、両集光点２４，２５間の間隔は、約２λとなる。従って、例えばλ＝４８８ｎｍである場合、両集光点２４，２５間の間隔は１μｍである。

また、各集光点２４，２５に対応する光学的伝達関数（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：以下、ＯＴＦと称す。）は略同程度になった。図５は、各集光点２４，２５のうち一方のＯＴＦの結果を示す。図５の縦軸はＸＹ平面内の空間周波数を示し、横軸は光軸方向の空間周波数を示す。図５から明らかなように、十分な奥行き分解能を有することが分かる。奥行き分解能とは、従来よく知られているように、格子ベクトルを光軸方向にもつ三次元格子を分解する能力である。

対物レンズ１３を経た各照明光束は、それぞれ被検物１１に照射される。被検物１１への各照明光束の照射により、被検物１１からは、波長がそれぞれ照明光束の波長より長く且つ互いに位相が異なる二つの蛍光が射出する。各蛍光は、それぞれ対物レンズ１３を経て平行光に変換された後、ダイクロイックミラー１４を透過し、光分割部材１５に入射する。各蛍光のそれぞれの半分は光分割部材１５を透過し、各蛍光のそれぞれの残りの半分は光分割部材１５で反射する。光分割部材１５を透過した各蛍光は、それぞれ前記一方の集光レンズ１６ａで前記一方のピンホール部材１７ａに向けて集光する。光分割部材１５で反射した各蛍光は、それぞれ前記他方の集光レンズ１６ｂで前記他方のピンホール部材１７ｂに向けて集光する。このとき、前記したように、各ピンホール部材１７ａ，１７ｂは、それぞれのピンホール１９が各集光点２４，２５に対して共役関係となる位置に配置されている。このことから、前記一方の集光レンズ１６ａを経た各蛍光のうち対物レンズ１３に近い方に位置する一方の集光点２４から射出した蛍光は前記一方のピンホール部材１７ａのピンホール１９を通過し、他方の集光点２５から射出した蛍光はピンホール部材１７ａによりピンホール１９の通過が阻止される。他方、前記他方の集光レンズ１６ｂを経た各蛍光のうち対物レンズ１３から遠い方に位置する他方の集光点２５から射出した蛍光は前記他方のピンホール部材１７ｂのピンホール１９を通過し、他方の集光点２５から射出した蛍光はピンホール部材１７ｂによりピンホール１９の通過が阻止される。すなわち、各ピンホール部材１７ａ，１７ｂは、それぞれと共役関係にある集光点２４，２５で被検物１１から射出する蛍光を通過させ且つそれぞれと共役関係にない集光点２４，２５の位置からの蛍光の通過を阻止する。

従って、前記一方の集光点２４から射出した蛍光は一方の光検出手段１８ａに入射し、前記他方の集光点２５から射出した蛍光は他方の光検出手段１８ｂに入射する。

更に、本発明に係る共焦点顕微鏡１０は、図１に示すように、被検物１１の対物レンズ１３の光軸Ｌに直交し且つ各集光点２４，２５を含む二つの断面上において各集光点２４，２５に集光された照明光束をそれぞれ前記各断面上で走査させるための走査手段２６を備える。

走査手段２６は、反射面２７ａ，２８ａを有し傾動可能な板状の二つの反射部材２７,２８と、該各反射部材をそれぞれ傾動させるべく駆動する駆動部２９と、該駆動部の作動を制御する制御部３０とを有する。

各反射部材２７，２８は、それぞれ互いに直交する軸の周りに傾動する。すなわち、各反射部材２７，２８は、二次元スキャンが可能な所謂ガルバノミラーを構成する。また、各反射部材２７，２８は、それぞれダイクロイックミラー１４と対物レンズ１３との間に配置されている。各反射部材２７，２８のうち一方の反射部材２７は、ダイクロイックミラー１４で反射した照明光束が反射面２７ａに入射するように配置されている。他方の反射部材２８は、前記一方の反射部材２７の反射面２７ａで反射した照明光束が反射面２８ａに入射して該反射面で対物レンズ１３に向けて反射するように配置されている。

駆動部２９は、図示の例では、図示しない電気モータで構成されている。

駆動部２９が制御部３０の制御下で駆動することによって各反射部材２７，２８の傾動角度が変化することにより、各反射面２７ａ，２８ａでの照明光束の反射方向が変化する。これにより、対物レンズ１３を経て被検物１１に照射される各照明光束の集光点２４，２５の位置が該各集光点を含み且つ光軸Ｌに直交する前記各断面内で移動する。

また、本発明に係る共焦点顕微鏡１０は、対物レンズ１３及び被検物１１の少なくとも一方を対物レンズ１３の光軸Ｌに沿って移動させる移動機構３１を備える。

移動機構３１は、図示の例では、制御部３０の制御下で作動し、対物レンズ１３を光軸方向に沿って移動させる。

本発明に係る共焦点顕微鏡１０を用いて被検物１１の観察を行う際、制御部３０は、例えば一方の集光点２４が被検物１１の上面上に位置し且つ他方の集光点２５が被検物１１内の所定の高さ位置に位置している状態で、駆動部２９を駆動させることによって各反射部材２７，２８を傾動させることにより、前記一方の集光点２４に集光された照明光束を前記上面上で走査させ且つ前記他方の集光点２５に集光された照明光束を該集光点を含む前記断面上で走査させる。このとき、前記上面上及び前記断面上で各集光点２４，２５から射出した各蛍光が各光検出手段１８ａ，１８ｂに入射すると、該各光検出手段は、それぞれ入射した各蛍光の光量に応じた信号をコンピュータ３２に出力する。コンピュータ３２は、走査中に各光検出手段１８ａ，１８ｂがそれぞれ出力した信号を取り込み、被検物１１の前記上面及び前記断面の二次元画像の画像データを構築し、その断面画像を表示部３３に表示する。

次に、制御部３０は、各集光点２４，２５がそれぞれ該各集光点間の間隔よりも小さい間隔で光軸方向に下方へ移動するように移動機構３１の作動を制御し、その状態で各集光点２４，２５に集光された照明光束を走査させる。コンピュータ３２は、走査動作が行われる度に、走査された前記断面の画像データの構築及び表示部３３への表示を行う。

続いて、制御部３０は、この走査及び移動を繰り返した後、一方の集光点２４が他方の集光点２５の移動始点に達したとき、各集光点２４，２５をそれぞれ該各集光点間の間隔と等しい距離離れた位置に光軸Ｌに沿って下方へ移動するように移動機構３１の作動を制御する。これにより、前記他方の集光点２５に集光された照明光束が走査した断面を前記一方の集光点２４に集光された照明光束で再度走査することが防止される。

各集光点２４，２５がそれぞれ光軸Ｌに沿って移動するように対物レンズ１３を移動させたとき、各集光レンズ１６ａ，１６ｂの集光点が各ピンホール部材１７ａ，１７ｂのピンホール１９ａ，１９ｂに一致するように各集光レンズ１６ａ，１６ｂ又は各ピンホール部材１７ａ，１７ｂをそれぞれ各集光レンズ１６ａ，１６ｂの光軸Ｌに沿って移動させてもよい。

被検物１１の複数の前記断面毎に上記した動作を繰り返すことにより、各集光点２４，２５のそれぞれ移動位置毎にその位置における被検物１１の前記断面画像を得ることができる。コンピュータ３２は、被検物１１の各高さ位置で得た断面画像を合成することにより、被検物１１の三次元画像を形成し、形成した三次元画像を表示部３３に表示する。

この表示部３３に表示された画像を視認することにより、被検物１１の全体像を観察することができる。

本実施例によれば、前記したように、集光点形成部材２０の一方の透光部分２２を透過した光束と、他方の透光部分２３を透過した光束との間に位相差が生じている。このことから、集光点形成部材２０を経た照明光束が対物レンズ１３により集光されたとき、対物レンズ１３の光軸Ｌ上には、位相差を有する透光部分２２，２３の個数と同数の集光点２４，２５がそれぞれ照明光束の波長に応じて規定される間隔をおいて形成される。これにより、被検物１１の異なる高さ位置において対物レンズ１３の光軸Ｌに直交する二つの断面上にそれぞれ光束を同時に照射することができる。

これにより、被検物１１の前記各断面上に照射された照明光束をそれぞれ前記各断面上で同時に走査させることができるので、この一回の走査で集光点２４，２５の数と同数の断面画像を同時に得ることができる。従って、被検物１１の三次元画像を取得すべく複数の断面画像を得るために行う被検物１１の断面上での照明光束の走査及びレンズ又は被検物の光軸方向への移動の回数を従来に比べてほぼ半分に減らすことができる。

従って、被検物１１の三次元画像を取得するための計測に掛かる時間を従来に比べて確実に短縮することができる。

また、前記したように、第一及び第二の各透光部分２２，２３の入射面２２ａ，２３ａの大きさは、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されていることから、第一の透光部分２２を透過する照明光束の光量と第二の透光部分２３を透過する照明光束の光量とを等しくすることができる。これにより、被検物１１から各集光点２４，２５で射出した各蛍光の光量を互いに等しくすることができる。従って、光検出手段１８ａ，１８ｂで検出される蛍光の光量が互いに異なることによって被検物１１の前記各断面の明度にばらつきが生じることを、確実に防止することができる。

本実施例では、光軸Ｌ上に二つの集光点２４，２５が形成される例を示したが、これに代えて、三つ以上の集光点を光軸Ｌ上に形成することができる。

例えば三つの集光点を光軸Ｌ上に形成する場合、図６（ａ）及び（ｂ）に示すような集光点形成部材２０を用いることができる。

図６に示す例では、集光点形成部材２０の前記一方の面２０ａには、集光点形成部材２０の周面２０ｃに開放し且つ集光点形成部材２０の周方向に伸びる段部３４に加えて、集光点形成部材２０の中央部で凹部３５が形成されている。段部３４の深さ寸法ｈ１と凹部３４の深さ寸法ｈ２とは互いに等しい。深さ寸法ｈ１及びｈ２は、それぞれｈ１・（ｎ−１）＝λ／２及びｈ２・（ｎ−１）＝λ／２の関係を満たすように設定されている。この段部３４及び凹部３５の形成により、集光点形成部材２０には、その周縁部に第一の透光部分３６が形成され、中央部に該第一の透光部分の板厚寸法と等しい板厚寸法を有する第二の透光部分３７が形成され、更に、第一及び第二の透光部分３６，３７間に該各透光部分の板厚寸法よりも大きい板厚寸法を有する環状の第三の透光部分３８が形成されている。

第一乃至第三の各透光部分３６，３７，３８の入射面３６ａ，３７ａ,３８ａの面積は、それぞれ等しい。

図６に示す例によれば、第一の透光部分３６を透過した照明光束と第二の透光部分３７を透過した照明光束との間に位相差πが付与され、第二の透光部分３７を透過した照明光束と第三の透光部分３８を透過した照明光束との間に位相差πが付与される。

この場合、式１を用いて光軸方向に沿った光強度の分布を求めると、図７に示す結果が得られる。図７から明らかなように、光軸Ｌ上には、対物レンズ１３の幾何光学焦点上と該焦点の前後とにそれぞれ光強度の値が極大値をとる集光点３９，４０，４１が現れている。すなわち、図６に示す集光点形成部材２０を通過した照明光束が対物レンズ１３を通過したとき、光強度の値が極大値をとる三つの集光点３９，４０，４１を光軸Ｌ上に形成することができる。

従って、被検物１１の三つの異なる高さ位置において対物レンズ１３の光軸Ｌに直交する三つの断面上にそれぞれ光束を同時に照射することができる。

また、三つの集光点３９，４０，４１を形成した場合、制御部３０による移動機構３１及び走査手段２６の駆動部２９の制御を、二つの集光点２４，２５を形成した場合と同様に行うことができる。

更に、図６（ａ）及び（ｂ）に示すような集光点形成部材２０を用いて三つの集光点３９，４０，４１を形成する場合、共焦点顕微鏡１０の構成に図８に示すような構成を用いることができる。

図８に示す例では、光分割部材１５は、透過率が７０％であり反射率が３０％であるビームスプリッタで構成されている。

光分割部材１５と該光分割部材の光透過側に配置された集光レンズ１６ａとの間には、第二の光分割部材５０が配置されている。第二の分割部材５０は、図示の例では、前記したハーフミラーで構成されている。これにより、光分割部材１５を透過した各蛍光のそれぞれの半分は第二の光分割部材５０を透過し、各蛍光のそれぞれの残りの半分は第二の光分割部材５０で反射する。

第二の光分割部材５０の光反射側には、図１に示す集光レンズ１６ａ，１６ｂと同様の集光レンズ１６ｃ、図１に示すピンホール部材１７ａ，１７ｂと同様のピンホール部材１７ｃ、及び、図１に示す光検出手段１８ａ，１８ｂと同様の光検出手段１８ｃが配置されている。

図示の例では、ピンホール部材１７ａは三つの集光点３９，４０，４１のうち対物レンズ１３に最も近い位置に形成される集光点３９に対して共役関係となる位置に配置され、ピンホール部材１７ｂは集光点４０に対して共役関係となる位置に配置され、ピンホール部材１７ｃは集光点４１に対して共役関係となる位置に配置されている。これにより、被検物１１から集光点３９で射出した蛍光はピンホール部材１７ａのピンホール１９ａを経て光検出手段１８ａにより検出される。また、被検物１１から集光点４０で射出した蛍光はピンホール部材１７ｂのピンホール１９ｂを経て光検出手段１８ｂにより検出される。更に、被検物１１から集光点４１で射出した蛍光はピンホール部材１７ｃのピンホール１９ｃを経て光検出手段１８ｃにより検出される。

図１乃至図８に示す例では、集光点形成部材２０がコレクタレンズＣとダイクロイックミラー１４との間に配置された例を示した。これに代えて、例えば、ダイクロイックミラー１４と被検物１１との間に集光点形成部材２０を配置することができる。このように、光源１２から被検物１１に至る光路上であれば、コレクタレンズＣ及びダイクロイックミラー１４間以外の位置に集光点形成部材２０を配置することもできる。

更に、図２（ａ）及び（ｂ）に示す例では、集光点形成部材２０の周縁部に段部２１を形成することにより集光点形成部材２０に板厚寸法が異なる二つの透光部分２２，２３を形成した例を示した。これに代えて、例えば図９（ａ）及び（ｂ）に示すように、集光点形成部材２０の前記一方の面２０ａの中央部に凹部４２を形成することにより、集光点形成部材２０に板厚寸法が異なる二つの透光部分４３，４４を形成することもできる。

図１乃至図９に示す例では、集光点形成部材２０に段部２１,３４及び凹部３５を形成することにより、集光点形成部材２０に板厚寸法が異なる複数の透光部分２２，２３，３６，３７，３８を形成した例を示した。これに代えて、互いに大きさが異なる複数のガラス板を重ね合わせることより、板厚寸法が異なる複数の透光部分を集光点形成部材２０に形成することもできる。

この場合、例えば図１０（ａ）及び（ｂ）に示すように、二つの集光点を形成すべく二つの透光部分を集光点形成部材２０に形成する場合、互いに径が異なる二つのガラス板４５，４６をそれぞれの間に間隔をおいて配置することもできる。

また、この場合、図６（ａ）及び（ｂ）に示す例では、三つの集光点３９，４０，４１を光軸Ｌ上に形成するために集光点形成部材２０に段部３４及び凹部３５を形成することにより三つの透光部分３６，３７，３８を形成した例を示したが、これに代えて、例えば図１１（ａ）及び（ｂ）に示すように、径がそれぞれ異なる三つのガラス板４７，４８，４９をその径の大きさに関係なく重ね合わせることにより、集光点形成部材２０に三つの透光部分を形成することもできる。

図１０及び図１１に示したように複数のガラス板４５，４６，４７，４８，４９を重ね合わせる場合、屈折力がそれぞれ等しいガラス板を用いることが好ましい。

更に、図１乃至図１１に示す例では、集光点形成部材２０が円盤状をなした例を示したが、これに代えて、例えば図１２（ａ）及び（ｂ）に示すように、矩形状をなす集光点形成部材２０を本発明に適用することもできる。

また、本実施例では、例えば二つの集光点２４，２５を形成した場合、制御部３０は、各集光点２４，２５がそれぞれ該各集光点間の間隔よりも小さい間隔で光軸方向に下方へ移動させた後、一方の集光点２４が他方の集光点２５の移動始点に達したときに、各集光点２４，２５をそれぞれ該各集光点間の間隔と等しい距離離れた位置に光軸Ｌに沿って下方へ移動させる例を示した。これに代えて、各集光点２４，２５間の間隔よりも小さい間隔での各集光点２４，２５の移動を不要とし、各集光点２４，２５をそれぞれ前記各断面の走査が終了する毎に各集光点２４，２５間の間隔の２倍の距離で移動するように移動機構３１及び走査手段２６の駆動部２９の作動を制御することもできる。

更に、本実施例では、例えば二つの集光点２４，２５を形成する場合に、各集光点２４，２５を含む断面上に照射された照明光束を前記断面上で走査させるための走査手段２６が、板状の二つの反射部材２７,２８を有する例を示したが、これに代えて、図１３に示すような円盤部材５１を有する走査手段５２で構成することもできる。

図１３に示すように、円盤部材５１には複数のピンホール５３が形成されている。各ピンホール５３は、それぞれ円盤部材５１の中心の周りに螺旋状に配列されている。円盤部材５１の中心には、軸部材５４が設けられており、電気モータのような図示しない駆動部の駆動により軸部材５４の周りに回転する。すなわち、円盤部材５１は、従来よく知られたニポウディスクである。前記駆動部の作動は、制御部３０により制御される。

円盤部材５１は、図示しないが、軸部材５４の軸線が対物レンズ１３の光軸Ｌからずれた位置で、該対物レンズとダイクロイックミラー１４との間に配置される。

また、図示しないが、ダイクロイックミラー１４と円盤部材５１との間に、ダイクロイックミラー１４で反射した照明光束を円盤部材５１に集光するための集光レンズが配置される。

ダイクロイックミラー１４で反射した照明光束が前記集光レンズを経て円盤部材５１に照射されると、該円盤部材の各ピンホール５３を通過した後、対物レンズ１３を経て被検物１１の表面及び前記断面上、又は、被検物１１の二つの前記断面上に集光される。この状態で円盤部材５１が前記駆動部の駆動により軸部材５４の周りに回転すると、各ピンホール５３を通過した複数の光束がそれぞれ被検物１１の表面及び前記各断面上を円弧を描いて走査する。この前記各光束の円弧状の軌跡同士が途切れることなく被検物１１の表面及び前記各断面を走査することにより、前記各光束で被検物１１の表面及び前記各断面をそれぞれ全面的に走査することができる。

従って、集光点形成部材２０により被検物１１の断面上での照明光束の走査及びレンズ又は被検物の光軸方向への移動の回数を減らすことができることに加えて、被検物１１の表面及び前記各断面の走査速度を速めることができるので、被検物１１の三次元画像を取得するための計測に掛かる時間をより確実に短縮することができる。

三つの集光点３９，４０，４１を形成するための図８に示す構成に図１３に示した円盤部材５１を用いる場合にも、上記したと同様に、被検物１１の表面及び前記各断面をそれぞれ全面的に走査することができる。

図１乃至図１３に示す例では、各集光点２４，２５，３９，４０，４１をそれぞれ対物レンズ１３の光軸方向に移動させるために対物レンズ１３を移動させる例を示したが、これに代えて、各集光点２４，２５，３９，４０，４１の移動のために被検物１１を対物レンズ１３の光軸方向に沿って移動させることもできる。

また、図１乃至図１３に示す例では、例えば生物の細胞のように光の入射により蛍光を発生させる被検物１１を観察するための共焦点顕微鏡１０に本発明を適用した例を示したが、これに代えて、例えば金属のように照明光束が反射する被検物を観察するための共焦点顕微鏡に本発明を適用することができる。この場合、ダイクロイックミラー１４を例えば前記したハーフミラーのようなビームスプリッタに代えることは言うまでもない。

本発明に係る共焦点顕微鏡を概略的に示す説明図である。 （ａ）は本発明に係る集光点形成部材を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のI−I線に沿った縦断面図である。 （ａ）は式１を説明するための説明図であり、（ｂ）は被検物上に集光された照明光束の光強度と光軸上の座標との関係を示すグラフである。 対物レンズの光軸上に二つの集光点が形成された状態を概略的に示す説明図である。 二つの集光点のうち一方の光学的伝達関数の結果を示すグラフである。 （ａ）は三つの集光点を光軸上に形成するための集光点形成部材を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のII−II線に沿った縦断面図である。 対物レンズの光軸上に三つの集光点が形成された状態を概略的に示す説明図である。 図１とは異なる構成を有する共焦点顕微鏡を概略的に示す説明図である。 （ａ）は二つの集光点を形成するための集光点形成部材の変形例を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のIII−III線に沿った縦断面図である。 （ａ）は二つの集光点を形成するための集光点形成部材の変形例を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のIV−IV線に沿った縦断面図である。 （ａ）は三つの集光点を形成するための集光点形成部材の変形例を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のV−V線に沿った縦断面図である。 （ａ）は二つの集光点を形成するための集光点形成部材の変形例を概略的に示す平面図であり、（ｂ）は（ａ）のVI−VI線に沿った縦断面図である。 本発明に係る円盤部材を概略的に示す斜視図である。

符号の説明

１０ 共焦点顕微鏡
１１ 被検物
１２ 光源
１３ レンズ（対物レンズ）
１７ａ，１７ｂ，１７ｃ 遮光部材（ピンホール部材）
１８ａ，１８ｂ，１８ｃ 光検出手段
１９ ピンホール（ピンホール部材に形成されたピンホール）
２０ 集光点形成部材
２２，２３，３６，３７，３８ 透光部分
２２ａ，２３ａ，３６ａ，３７ａ，３８ａ 入射面
２４，２５，３９，４０，４１ 集光点
２６，５２ 走査手段
２７，２８ 反射部材
２７ａ，２８ａ 反射面
５１ 円盤部材
５３ ピンホール（円盤部材に形成されたピンホール）

Claims (6)

1. 光源からの光を被検物に向けて集光させるレンズと、前記光を透過させる複数の透光部分を有し、該複数の透光部分のうち、少なくとも一つの該透光部分を透過した光に他の前記透光部分を透過した光との間で位相差を付与し、前記レンズを介して、前記レンズの光軸上に少なくとも２つの集光点をそれぞれ形成する集光点形成部材とを含み、前記レンズ及び前記集光点形成部材は単一光路上に配置されてなる照明光学系と、
   前記２つの集光点からのそれぞれの射出光を、前記集光点形成部材を介すことなく、それぞれ集光する２つの集光レンズと、
   前記２つの集光点のそれぞれと、前記各集光レンズを介して、共役な位置に配置された２つの遮光部材と、
   前記各遮光部材をそれぞれ経た前記射出光をそれぞれ検出する光検出手段と、を備えることを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記集光点形成部材は、前記光源から前記レンズに至る前記単一光路上に配置されることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記集光点形成部材は、板状をなしており、前記複数の透光部分における前記光の光学的光路長がそれぞれ異なるように形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記複数の透光部分のそれぞれは、前記光が入射する入射面を有し、前記各入射面の面積は、該各入射面への入射光量がそれぞれ等しくなるように設定されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記光を前記標本の面内で走査する走査手段を備えることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記各遮光部材は、ピンホールを有し、該ピンホールが前記各集光レンズを介して、前記集光点と共役関係であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。