JP5517991B2 - 遊離システイン残基を含有するタンパク質をリフォールディングする方法 - Google Patents
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Description
本発明は、一般的にはタンパク質を製造する方法、より具体的には少なくとも1個の「遊離」システイン残基、すなわちジスルフィド結合に関与していないシステイン残基を含有する組み換えタンパク質に関する。
タンパク質治療薬は、一般的に注射によって患者に投与しなければならない。大部分のタンパク質治療薬は身体から急速に消失するため、頻繁な注射、多くの場合毎日の注射を必要とする。タンパク質を頻繁に注射しなくてもよいように、体内におけるタンパク質治療薬の循環半減期を延長する方法の開発にはかなりの関心がある。ポリエチレン・グリコール(PEG)によるタンパク質の共有結合修飾は、体内におけるタンパク質治療薬の循環半減期を延長する有用な方法であることが分かっている(Abuchowski他、1984;Hershfield、1987;Meyers他、1991)。タンパク質へのPEGの共有結合は、タンパク質の有効サイズを増加させ、身体からのタンパク質のクリアランス速度を低下させる。PEGはいくつかのサイズのものが市販されており、異なるサイズのPEGを用いることにより個々の適応症に応じてPEG修飾タンパク質の循環半減期を調整することができる。その他の立証されているPEG修飾のインビボにおける恩恵は、タンパク質の溶解性および安定性の増加、ならびにタンパク質の免疫原性の減少である(Katre他、1987;Katre、1990)。
ンターロイキン(IL)−2(Wang他、1984)、β−インターフェロン(Mark他、1984;1985)、G−CSF(Lu他、1989)および塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF、Thompson、1992)が含まれる。IL−2、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)およびβ−インターフェロン(IFN−β)は奇数個のシステイン残基を含有するが、塩基性線維芽細胞成長因子は偶数個のシステイン残基を含有する。
ェニルアラニンで始まる。天然のhGHタンパク質配列が維持されるのは、stII(またはompA)シグナル配列と成熟hGHタンパク質の出発点との間で細菌の酵素がstII−hGHタンパク質(またはompA−hGHタンパク質)を切断するためである。
[G−CSF(C17S)]、およびstIIシグナル配列を用いた遊離システイン残基(5個のシステイン;2N+1)を含有するG−CSF(C17S)を分泌させた場合には、組み換えG−CSFタンパク質もその大部分が不溶性であることが発見された。不溶性の分泌G−CSFタンパク質を生物活性の形にリフォールディングする方法が記載されたことは未だない。
基において修飾された様々な分子量分子種の不均一な混合物を含んでいた。アミンPEG化G−CSFは、低下した生物活性を示した(Tanaka他、1991)。Kinstler他(1996)は、非天然N末端メチオニン残基で優先的に修飾されたPEG化G−CSFタンパク質について記載した。このタンパク質もまた、低下した生物活性を示した(Kinstler他、1996)。
本発明は一般的に、1個または複数の遊離システイン残基を有し、不溶性または凝集性の形で宿主細胞により発現される、タンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を得るための方法に関する。このようなタンパク質には、GHなどの成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、IFN−α、G−CSFおよびGM−CSFタンパク質、ならびにエンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されるものではない。この方法は一般的に、(a)遊離システイン残基を含有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること;(b)細胞を溶解すること;(c)変性剤、還元剤およびシステイン・ブロッキング剤の存在下で不溶性または凝集性タンパク質を可溶化すること;および(d)変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることによりタンパク質をリフォールディングすることによって行われる。場合によっては、可溶性のリフォールディングされたタンパク質は、リフォールディングされた混合物中の他のタンパク質から単離される。
ステイン・ムテインまたはその誘導体も想定されている。
本発明は、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるGH、IFN−α2、G−CSF、GM−CSFタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製する方法を提供する。本発明を用いて、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現されるGHスーパー遺伝子ファミリーの他のメンバーのリフォールディングされた可溶性の形を調製することができる。本発明を用いて、少なくとも1個の遊離システイン残基を有し、宿主細胞によって不溶性または凝集性の形で発現される、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗血管新生タンパク質を含むがそれらに限定されない他のタイプのタンパク質のリフォールディングされた可溶性の形を調製することもできる。本発明はさらに、新規タンパク質、特にこれらの新規方法によって製造される組み換えタンパク質ならびにこのような組み換えタンパク質の誘導体を提供する。このようなタンパク質を調製するための新規な方法は一般的に、
(a)遊離システインを有するタンパク質を不溶性または凝集性の形で宿主に発現させること;
(b)化学的、酵素的または物理的手段により、宿主細胞を溶解すること;
(c)変性剤、還元剤およびシステイン・ブロッキング剤に不溶性または凝集性タンパク質を暴露することによって、そのタンパク質を可溶化すること;および
(d)可溶化混合物中の変性剤および還元剤の濃度を、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで低下させることにより、タンパク質をリフォールディングすることによって行われる。
ステイン変異体を包含する。これらのタンパク質には、GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバー、およびこれらのタンパク質のシステイン変異体が含まれる。以下のタンパク質(「まとめてGHスーパー遺伝子ファミリーと呼ぶ」)がGHスーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされる(Bazan(1990;1991;1992);MottおよびCampbell(1995);SilvennoinenおよびIhle(1996);Martin他(1990);Hannum他(1994);Blumberg他、2001):GH、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、エリスロポエチン(EPO)、トロンボポエチン(TPO)、インターロイキン−2(IL−2)、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−9、IL−10、IL−11、IL−12(p35サブユニット)、IL−13、IL−15、IL−19、IL−20、IL−TIF、MDA−7、AK−155、オンコスタチンM、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF)、マクロファージ・コロニー刺激因子(M−CSF)、カルジオトロフィン−1(CT−1)、幹細胞刺激因子およびflt3/flk2リガンド。将来的には遺伝子クローニングおよびシークエンシングによりGHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーがさらに同定されることが予想される。GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーは、一般的にはアミノ酸またはDNA配列の同一性が限られているかかわらず類似した二次および三次構造を有している。GHスーパー遺伝子ファミリーのメンバーの共有する構造的特徴はBazan(1990;1991;1992)、MottおよびCampbell(1995)およびSilvennoinenおよびIhle(1996)に記載されており、遺伝子ファミリーの新しいメンバーの同定を容易にしている。Shanafelt他(2000)によって記載された選択的IL−2拮抗薬などのこれらのタンパク質の変異体も本発明に包含される。
、回収および精製を促進することができる。他の種に由来する免疫グロブリンも同様に、発現、回収および精製することができる。ChamowおよびAshkenazi(1996)に記載されているように、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン領域と遺伝的に融合したタンパク質も同様に、発現、回収および精製することができる。
Methods and
Applications edited by White、B.A.(1993)Humana Press、Inc.、Totowa、NJおよびPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications
edited by Innis、M.A.他(1990)Academic Press、Inc. San Diego、CAに一般論として記載されている。
体配置および天然のジスルフィド結合を得ることである。リフォールディングは、タンパク質を可溶性の生物学的に活性な形に再生させるのに十分なレベルまで変性剤および還元剤の濃度を低下させることにより行われる。これは、透析、希釈、ゲル濾過、タンパク質の沈殿を介して、または樹脂上への固定化と続く緩衝液洗浄によって行うことができる。このステップの条件は、タンパク質の天然ジスルフィド結合の再生が行えるように選択する。これは、ジスルフィド交換反応を触媒するために、酸化剤、または酸化剤と還元剤の酸化還元混合物を添加することによって行うことができる。天然のジスルフィド結合形成および可逆的にブロックされた遊離システイン残基をもたらす試薬または試薬の組合せが選択される、すなわち試薬および試薬の組合せがシステイン・ブロッキング剤としての役割を果たすことが好ましい。有用な酸化剤の例には、酸素、シスチン、酸化型グルタチオン、シスタミン、およびジチオグリコール酸が含まれる。有用な酸化還元混合物の例には、システイン/酸素、システイン/シスチン、システイン/シスタミン、システアミン/シスタミン、還元型グルタチオン/酸化型グルタチオンなどが含まれる。任意選択で、DTTまたは2−メルカプトエタノールなどの還元剤をリフォールド混合物に添加し、ジスルフィド交換を促進することができる。任意選択で、銅(Cu++)またはコバルト(Co++)などの金属イオンをリフォールド混合物に添加し、タンパク質酸化を促進することができる。リフォールド混合物中の金属イオンの有用な濃度は1μMから1mMであり、40μMが好ましい濃度である。リフォールド混合物のpHはpH6とpH10の間であることが好ましい。
初めて提供する。
)未満、より好ましくは約20pg/ml(約1pM)未満および最も好ましくは約15pg/ml(約0.7pM)未満のEC50を有する。あるいは、G−CSFのヘリックスDに対して遠位の領域にポリエチレン・グリコール部分を結合させることができ、得られるモノPEG化G−CSFは、約1000pg/ml(約50pM)未満、好ましくは約100pg/ml(約5pM)未満、より好ましくは約20pg/ml(約1pM)未満および最も好ましくは約15pg/ml(約0.7pM)未満のEC50を有する。Kinstler他(1996)は、アミンまたはアミド結合を介して、タンパク質がN末端非天然メチオニン残基で優先的にモノPEG化されるモノPEG化野生型G−CSFについて記載した。モノPEG化G−CSFの生物活性は、非修飾G−CSFに比べて約30%低下したと報告されているが、EC50は示されなかった(Kinstler他、1996)。Kinstler他(1996)は、G−CSF中のヘリックスAに近接する領域の他のアミノ酸を修飾することが、生物学的に活性なG−CSFタンパク質をもたらすか否かについては解決していない。本発明の一目的は、PEGを結合させることができるG−CSF中のヘリックスAに近接する領域、および他の領域にあり、生物学的に活性なモノPEG化G−CSFタンパク質をもたらす他のアミノ酸位置を開示することである。
からなる合成ポリマーである。エチレンオキシド単位は、約10,000から500,000kDa以上までのサイズ排除クロマトグラフィによる見かけの分子量でPEG化タンパク質変異体を得ることができるように変えることができる。PEG部分のサイズは循環半減期に直接影響する(Yamaoka他、1994)。したがって、一般にはPEG部分のサイズまたは構造を変えることにより特定の治療応用または好ましい投与計画のために異なる循環半減期を有するタンパク質変異体を設計することになる。すなわち、本発明は、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDa以上、より好ましくは約70kDa以上の見かけの分子量を有し、EC50が約400ng/ml(約18nM)未満、好ましくは100ng/ml(約5nM)未満、より好ましくは約10ng/ml(約0.5nM)未満およびさらにより好ましくは約2.2ng/ml(約0.1nM)であるGHタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、EC50が約100ng/ml(5nM)未満、好ましくは1000pg/ml(50pM)未満、より好ましくは100pg/ml(6pM)未満およびさらにより好ましくは約15pg/ml(0.7pM)であるG−CSFタンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、IC50が約1900pg/ml(100pM)未満、好ましくは400pg/ml(21pM)未満、より好ましくは100pg/ml(5pM)未満、およびさらにより好ましくは約38pg/ml(2pM)であるアルファIFN(IFN−α)タンパク質変異体を包含する。本発明はさらに、サイズ排除クロマトグラフィにより測定すると約30kDaより大きい、より好ましくは約70kDaより大きい見かけの分子量を有し、EC50が約14,000pg/ml(約1000pM)未満、好ましくは1400pg/ml(約100pM)未満、より好ましくは280pg/ml(20pM)未満、およびさらにより好ましくは約140pg/ml(約1pM)であるGM−CSFタンパク質変異体を包含する。
定することができる。このような決定を行うに際しての要素には、投与するタンパク質の性質、治療される状態、潜在的な患者のコンプライアンス、患者の年齢および体重などが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の化合物はまた、結合した治療薬の循環半減期を高めるための送達手段として、または体内の特異的標的への直接的送達のために使用することができる。
実施例1
成長ホルモン・ムテインT3Cのリフォールディング
組み換えヒト成長ホルモン(hGH)およびhGHシステイン・ムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。hGHのシステイン・ムテインを構築する方法もPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。大腸菌でhGHを発現するための好ましい方法の一つは、STIIリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌されたhGHは可溶性であり、PCT/US00/00931に記載されているようにカラム・クロマトグラフィにより精製することができる。hGHのある種のシステイン・ムテインは、STIIリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。不溶性の分泌hGHタンパク質をリフォールディングする方法はこれまで記載されたことは未だない。不溶性のhGHシステイン・ムテインを生物学的に活性な形にリフォールディングするために以下のプロトコルを開発した。
成長ホルモンT3Cムテインをリフォールディングするために使用した還元剤の比較
T3Cムテインを発現する大腸菌株の培養液(200ml)を培養し、PCT/US00/00931に記載したようにT3Cを発現させた。実施例5および14に記載のように、細胞の界面活性剤/リゾチーム処理で細胞を溶解することにより不溶性T3Cを単離した。この材料を8M尿素、20mMトリス、pH9
20mLに懸濁し、3管に等分した。第一管(「リフォールド A」)には還元剤を加えず、第二管(「リフォールド B」)には5mMDTTを加え、第三管(「リフォールド C」)には20mMシステインを加えた。室温で1時間混ぜた後、可溶化物を10%グリセロール、20mMトリス、pH8 30mL中に希釈した。リフォールドを一夜4℃に保った。翌日、遠心分離によってリフォールドを透明にし、PCT/US00/00931に記載したようにQ−セファロース Hi Trapカラム5mLに載せた。回収されたカラム分画を非還元SDS−PAGEにより分析した。「リフォールドA」(還元剤なし)から回収されたT3Cタンパク質は、Q−セファロース・カラムからいくつかの幅広いピークとして溶出した。SDS−PAGEによれば、回収タンパク質生成物には多少の単量体T3Cタンパク質が存在したが、大部分は凝集性T3C二量体(210mM NaClで溶出する)およびT3C三量体(300mMと1000mM
NaClの間で溶出する)からなっていた。単量体および二量体T3Cタンパク質の最終的な回収率を表1に示す。「リフォールドB」(5mM DTTを含む)から回収されたT3Cタンパク質は、Q−セファロース・カラムから単一の幅広いピークとして溶出したが、非還元SDS−PAGE分析によると不均一であった。単量体T3Cバンドは、下垂体hGHバンドよりはるかに幅広く、T3Cの様々なジスルフィド・アイソフォームに相当すると思われる多くの異なる分子量の単量体分子種を含んでいた。いくつかの分画では少量の二量体T3Cタンパク質も検出された。「リフォールドC」(還元剤としてシステインを使用)からは主に単量体T3Cタンパク質が得られ、160mM NaClでQ−セファロース・カラムから溶出するピークの鋭さおよび非還元SDS PAGEにより分析した場合の正しい分子量(標準の下垂体hGHに対して)におけるタンパク質バンドの鋭さによって立証されるように、単一で均一な分子種であるように見えた。単量体および二量体形態のT3Cの各リフォールドからの最終的な回収率を表1に示す。データは、システインの存在下でT3Cタンパク質を可溶化/リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはDTTの存在下でタンパク質を可溶化/リフォールディングするよりも可溶性単量体T3Cタンパク質が高収率で得られることを示している。この結果はまた、システインの存在下でT3Cタンパク質を可溶化/リフォールディングすることにより、還元剤の非存在下またはDTTの存在下でタンパク質を可溶化/リフォールディングするよりも可溶性単量体T3Cタンパク質がより安定で均一な調製物として得られることを示している。
化剤をタンパク質に添加する条件、またはpHが中性もしくはアルカリ性に近い場合にジスルフィド転位を受けることができる第二のジスルフィド結合試薬の添加による条件が含まれる。使用することができた酸化剤の例には、テトラチオン酸ナトリウムまたは酸素が含まれる。任意選択で、銅またはコバルトなどの微量の二価金属イオンを添加して反応を触媒することができる。有用なジスルフィド結合試薬には、シスチン、シスタミン、酸化型グルタチオン、ジチオグリコール酸、または他の低分子量ジチオールが含まれる。あるいは、単量体T3Cタンパク質を酸性pHで維持し、凝集および望ましくないジスルフィド転位を防ぐことができる。
PEG化および遊離システイン残基を含有するPEG化形のタンパク質を精製するための一般法
遊離システイン残基を含有するタンパク質は、市販されている様々なシステイン反応性PEG−マレイミド(またはPEG−ビニルスルホン)を用いてPEG化することができる。組み換えタンパク質は一般的に、遊離システインの最適なPEG化を行うためにジチオスレイトール(DTT)、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン−HCl(TCEP)、またはいくつかの他の還元剤で部分的に還元する。この部分的還元ステップを行わない場合には、遊離システインはシステイン反応性PEGに対して比較的非反応性である。各ムテインを部分的に還元するのに必要な還元剤の量は、様々なpHおよび温度における還元剤濃度の範囲を用いて経験的に決定することができる。還元剤濃度は通常、0.5モル当量から10倍モル過剰量まで変化する。好ましい温度は4℃から37℃である。pHは6.5から9.0までの範囲でよいが、7.5から8.5であることが好ましい。
最適条件は、還元剤および暴露時間によって異なる。適切な条件下では、熱力学的により安定な天然ジスルフィドではなくて最も安定性の低いジスルフィド(通常は分子間ジスルフィドおよび混合ジスルフィド)が最初に切断される。通常、室温で30分間のDTT5〜10倍モル過剰が効果的である。部分的還元は、逆相カラムからのタンパク質の溶出プロフィールにおける僅かなシフトによって検出することができる。部分的還元はまた、タンパク質試料の非還元SDS−PAGE分析による見かけの分子量の僅かなシフトによっても検出することができる。タンパク質を「過還元(over−reduce)」したり別のシステイン残基を暴露しないように注意しなければならない。過還元は、逆相HPLCにより(過還元されたタンパク質は完全に還元され変性したタンパク質に類似した保持時間を有するはずである)、およびPEG化反応後に2個のPEGを含有するタンパク質分子の出現により(SDS−PAGE上の見かけ分子量の変化により検出可能)検出することができる。システイン・ムテインの場合には、対応する野生型タンパク質が対照としての役割を果たすが、それは天然の分子内ジスルフィドを還元しない条件下でPEG化してはならないからである。過剰の還元剤は、PEG化の前にサイズ排除クロマトグラフィまたは透析によって除去することができる。TCEPは、遊離チオール基を含有しないことからPEG化試薬の添加前に除去する必要はない。部分的に還元されたタンパク質を様々な濃度のPEG−マレイミドまたはPEG−ビニルスルホン(通常、PEG:タンパク質モル比は1:1、5:1、10:1および50:1)と反応させ、2種類の試薬の最適な比を決定する。タンパク質のPEG化は、例えばSDS−PAGEを用いて分子量シフトによってモニターすることができる。ジPEG化生成物を与えることなく有意な量のモノPEG化生成物をもたらす最少量のPEGが通常望ましいと考えられる。一部の例では、ある種の添加物がPEG化収率を向上することがある。これらの添加物には、EDTA、ホウ酸塩、カオトロープ(尿素、グアニジン、有機溶媒)、界面活性剤、浸透圧分解(osmolytic)安定剤(ポリオール、糖、ポリマー、アミノ酸およびその誘導体)、および他のイオン性化合物(クエン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、四級アミン、塩化物、硝酸塩、チオシアン酸塩、他)が含まれるが、これらに限定されるものではない。EDTAの有用な濃度は0.01〜10mMであり、0.5〜1mMが好ましい濃度である。一般的に、モノPEG化タンパク質は、サイズ排除、イオン交換、アフィニティ、逆相、または疎水性相互作用クロマトグラフィによって非PEG化タンパク質および未反応PEGから精製することができる。モノPEG化タンパク質(単一PEG分子がシステイン・ムテインに結合した)に富んだ分画は、SDS−PAGEおよび/またはウエスタンブロット法により同定することができる。これらの分画をプールし、冷凍保存することができる。PEG部分の存在は一般的に、樹脂に対するタンパク質の親和性を変化させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。2相有機抽出または塩沈殿などの他の精製プロトコルを用いることもできる。精製されたPEG化タンパク質は、本明細書に記載の様々な実施例ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の細胞増殖/阻害アッセイで試験することができる。PEG化タンパク質のインビボにおける有効性は、本明細書に示す実施例ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載したように決定することができる。PEG分子が適切な部位でタンパク質と結合していることを確認するための実験を行うことができる。この実験は、タンパク質の化学的またはタンパク質分解的消化、サイズ排除、イオン交換または逆相クロマトグラフィによるPEG化ペプチド(大きな分子量を有しているはずの)の精製と、続くアミノ酸配列決定によって行う。PEGとカップリングしたアミノ酸は、アミノ酸配列決定実行中にブランクとして出現するはずである。
してのTCEP[トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン]−HCl、およびShearwater Polymers(Huntsville、Alabama)製の5kDaシステイン反応性PEGを用いて決定した。精製されたT3Cの一部2μgを、様々な過剰量の5kDAマレイミド−PEGまたは5kDaビニルスルホン−PEGの存在下で100mMトリス、pH8.5中室温でTCEP濃度を増加させながらインキュベートした。120分後、反応物の一部を直ちに非還元SDS−PAGEによって分析した。pH8.5では、5倍モル過剰量のTCEPおよび15倍モル過剰量の5kDAマレイミドまたは5kDaビニルスルホンPEGにより2時間後に、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化T3Cタンパク質が得られた。PEG化のためにTCEPなどの還元剤で処理することによりT3Cムテインを部分的に還元する必要があった。野生型GHは同一の部分的還元条件下でPEG化されず、このことはPEG部分がムテインに導入されたシステイン残基に結合していることを示している。これらの条件を用い、精製および生物活性の評価のためにPEG化反応をスケール・アップした。5倍過剰量のTCEPおよび15倍の10kDaマレイミドPEGを用い、より大きなPEG化反応(300μg)を室温で2時間行った。反応時間の終了時にPEG化混合物を氷冷20mMトリス、15%グリセロール、pH8.0で2倍に希釈し、直ちにQ−セファロース・カラム(1mL、HiTrap)上に載せた。20mMトリス、15%グリセロール、pH8.0に溶かした0〜0.2M NaCl20mLグラジエントを実行することによりカラムからPEG化T3Cを溶出した。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。モノPEG化T3C(単一PEG分子がT3C単量体に結合した)に富んだ分画をSDS−PAGEによって同定し、プールして冷凍した。モノPEG化T3Cタンパク質は80mM NaClで溶出し、SDS−PAGEによる見かけの分子量は約30kDaであった。
PEG−T3C成長ホルモンは、成長ホルモン欠損ラットにおける体成長を促進する
A.PEG−T3Cの体成長を促進する能力は、下垂体の除去により成長ホルモンの合成ができない下垂体摘出(HYPOX)ラットで測定した。HYPOX雄Sprague−Dawleyラットは民間の供給メーカーから購入し、体重は約90gであった。ラットを13日間馴化させた。馴化の間に4g以上増加した動物は試験から除いた。体重測定は毎日同じ時間に行った(9:30AM)。ラットを体重別に様々な試験群に無作為割り付けした。1群当たり5匹のラットとしたが、ただし20kDa−PEG−T3Cを毎日投与する群は4匹のラットのみであった。ラットの体重を毎日測定し、プラセボ(ラット血清アルブミン(Sigma Chemical Company)200μg/mlを含有するリン酸緩衝食塩水(PBS))、市販の組み換えヒト成長ホルモン、ニュートロピン(登録商標)、または様々な投与量の実施例3に記載のように調製した20kDa−PEG−T3Cを毎日または1日おきに皮下注射で投与した。すべてのタンパク質溶液は、ラット血清アルブミン200μg/mlを含有するPBS中で調製した。動物は連続9日間処理した。10日目に動物を屠殺し頸骨を採取した。頸骨を10%中性緩衝ホルマリン中で固定した。5%ギ酸中で固定した頸骨から石灰質を除き、前面の近接端部で分割した。頸骨をパラフィン包埋のために加工して8ミクロンの薄片を作り、トルイジンブルーで染色した。頸骨の骨端幅を左の脛骨で測定した(1頸骨当たり5回測定)。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端測定を表2に示す。この結果は、20kDa−PEG−T3Cが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。
ラット血清アルブミン200μg/mlを含有するPBS中で調製した。動物は連続9日間処理した。10日目に動物を屠殺し頸骨を採取し、実施例4のAに記載したように薄片を作るために調製した。様々な試験群についての累積体重増加および頸骨の骨端幅を表3に示す。この結果は、20kDa−PEG−T3Cおよび40kDa−PEG−T3Cが成長ホルモン欠損ラットにおける体重増加および骨成長を促進することを示している。
IFN−α2システイン・ムテインのリフォールディングおよび精製
組み換えヒト・α−インターフェロン2(IFN−α2)およびIFN−α2システイン・ムテインの発現、精製およびインビトロおよびインビボにおける生物活性を測定する方法はPCT/US00/00931に記載されている。IFN−α2のシステイン・ムテインを構築する方法および付加システイン残基の位置として好ましいIFN−α2タンパク質内の部位もPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載されている。これらの方法を用い、大腸菌中で以下のムテインを構築した。C1S、Q5C、43C44、N45C、Q46C、F47C、Q48C、A50C、D77C、C98S、Q101C、T106C、E107C、T108C、S163C、E165C、*166C、D2C、L3C、T6C、S8C、T52C、G102C、V103C、G104C、V105C、P109C、L110C、M111C、S160C、L161C、R162CおよびK164C。大腸菌でIFN−α2を発現するための好ましい方法の一つは、STIIリーダー配列を用いて周辺質中にタンパク質を分泌させることである。分泌したIFN−α2の分画は可溶性であり、PCT/US00/00931に記載されているようにカラム・クロマトグラフィにより精製することができる。IFN−α2のある種のシステイン・ムテインは、STIIリーダー配列を用いて大腸菌周辺質中に分泌された場合には不溶性のままである。ムテインの浸透圧衝撃上清のSDS−PAGE分析は、大部分が19kDa rIFN−α2バンドのレベルを低下(野生型に比べて)させたことを示した。浸透圧衝撃からの全細胞溶解物および不溶性材料のSDS−PAGE分析は、これらのムテインが比較的高レベルで分泌されたが、主に不溶性の形でおそらく周辺質中に蓄積したことを示した。これらのタンパク質は還元条件下で野生型rIFN−α2標準品と一緒に移動し、STIIリーダーが除去されたことを示した。ムテインの相対的発現レベルの定性的評価を表4に要約する。不溶性の分泌IFN−α2タンパク質をリフォールディングする手順がこれまで記載されたことは未だない。IFN−α2システイン・ムテインを生物学的に活性な形で発現しリフォールディングするために以下のプロト
コル(ここでは「プロトコルI」と呼ぶ)を開発した。
20mM
Mes、2%Tween20、pH3の10mLに懸濁し、均一な懸濁液が存在するまで混ぜる。次いで、pHをpH8〜9に上げ、可溶化混合物を3時間撹拌する。次に、細胞溶解物を氷冷した再生緩衝液(20mMトリス、pH 0.3Mグアニジン、1M尿素、40μm硫酸銅、pH8)で1:20に希釈した。濁った懸濁液を4℃で1〜2日放置した。リフォールドを遠心分離と、続く3へのpH調整および2回目の遠心分離により透明にする。上清を冷水で1:4に希釈し、S−Seph Hi Trap5mL上に載せる。イオン交換カラムを、緩衝液Aが20mM Mes、pH5で緩衝液Bが10%エチレングリコール、500mM NaCl、20mM Mes、pH5である0〜70%緩衝液Bの100mLグラジエントで溶出する。あるいは、リフォールディングされたIFN−αシステイン・ムテインは、フェニル−セファロース・カラムなどのHICカラムを用いてリフォールド混合物から捕捉することができる。リフォールド混合物をまず遠心分離し、上清に硫酸アンモニウムを最終濃度10%まで加え、混合物を遠心分離し、10%硫酸アンモニウム、20mMトリス、pH8で平衡化したフェニル・セファロース・カラム10mL上に載せる。10%硫酸アンモニウム、20mMトリスpH8から30%エチレングリコール、20mMトリス、pH8までの線形グラジエント100mLを用いてIFN−αシステイン・ムテインをカラムから溶出する。フェニル−セファロース・カラムからのインターフェロン・プールは、銅キレート・カラム、S−セファロース・カラムまたは両方を用いてさらに精製することができる。
IFN−α2システイン・ムテインの生物活性
実施例5のプロトコルIを用いて精製した精製Q5C、C98S、Q101C、T106C、E107C、および*166C IFN−α2システイン・ムテインの生物活性をPCT/US00/00931に記載のDaudi増殖阻害アッセイで測定した。タンパク質濃度はBradfordまたはBCAタンパク質アッセイ・キット(Bio−Rad
LaboratoriesおよびPierce)を用いて決定した。市販の野生型rIFN−α2およびPCT/US00/00931に記載されたように調製したrIFN−α2は、アッセイ中の日間変動を抑えるために同日に並行して分析した。ムテインは、アッセイの誤差の範囲内で野生型rIFN−α2対照タンパク質と同程度にDaudi細胞
の増殖を阻害した。ムテインのうち5種類(Q5C、Q101C、T106C、E107Cおよび*166C)の平均IC50は、野生型rIFN−α2タンパク質の平均IC50と類似しており、15〜18pg/mlの範囲であった。C98Sタンパク質の平均IC50は28pg/mlであった。これらのデータを表4に要約する。
IFN−α2システイン・ムテインのPEG化
実施例3ならびにPCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載の手順を用いて、精製IFN−α2システイン・ムテインをPEG化することができる。遊離システイン残基で精製IFN−α2システイン・ムテインをモノPEG化することができる条件を特定するために、2種類の精製IFN−α2システイン・ムテインについて小スケールのPEG化実験を行った。タンパク質の過還元は、タンパク質のアンフォールディングによる予想より大きな見かけ分子量へのシフト、または天然ジスルフィドの還元により生じるいくつもがPEG化された分子種の出現を探索する非還元SDS−PAGEによりモニターした。精製野生型およびrIFN−α2ムテインT106CおよびE107Cの一部1μgを、10倍モル過剰のTCEPおよび20倍モル過剰の5kDAaマレイミドPEGと共に室温で1時間、pH8.5でインキュベートした。60分後反応を止めてすぐに非還元性SDS−PAGEにより分析した。反応混合物のSDS−PAGE分析によれば、両ムテインともこれらの条件下でモノPEG化タンパク質を与えた。非還元SDS−PAGEによれば、モノPEG化タンパク質の見かけの分子量は約28kDaであった。野生型rIFN−α2には、これらの条件下で検出可能なPEG化は見られなかった。対照実験は、T106CおよびE107Cシステイン・ムテインをPEG化するには、TCEPなどの還元剤で部分的に還元する必要があることを示した。これらのデータは、T106CおよびE107Cタンパク質に導入されたシステイン残基にPEG分子が結合することを示している。
の精製には、大量のPEG化反応を上述のように室温で1時間行い、20mM MES、pH5.0で10倍に希釈し、pH3.0に調整し、次いで、rIFN−α2ムテインの最初の精製について記載した条件と類似した条件を用いS−セファロース・カラム上に素早く載せなければならない。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。S−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、2本の主要なタンパク質ピークを示すはずである。早く溶出する主要ピーク(230mM未満のNaCl濃度で溶出する)はモノPEG化IFN−αタンパク質のはずであり、これは非還元SDS−PAGE分析によって確認することができる。5kDaシステイン反応性PEGで修飾されたモノPEG化IFN−α2の見かけの分子量は、SDS−PAGEによれば約28kDaである。後に溶出する主要ピーク(約230mMNaClで溶出する)は未反応IFN−α2タンパク質のはずである。主にPEG−IFN−α2を含有する早く溶出するピークからの分画をプールし、生物活性測定に使用することができる。精製PEG−IFN−α2タンパク質の生物活性は、PCT/US00/00931に記載のDaudi細胞アッセイで測定することができる。タンパク質の濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて決定することができる。PEG化IFN−α2システイン・ムテインのインビボにおける生物活性は、PCT/US98/14497およびPCT/US00/00931に記載のように決定することができる。
野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S)のクローニング、発現および精製
A.G−CSFをコードするDNA配列のクローニング。
A単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、Boehiringer Mannheim Corp製のRT−PCR用1st Strand cDNA Synthesis Kit(AMV)を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のPCR反応は、順方向プライマーBB91(5>CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACC TGCCACCCAG>3;配列番号1)および逆方向プライマーBB92(5>CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGT GGCGTAG>3;配列番号2)で行った。プライマーBB91は、G−CSF分泌シグナル用のコード配列の5′末端とアニールし、逆方向プライマーBB92は、G−CSFコード配列の3′末端とアニールする。得られた約640bpのPCR産物をHindIIIおよびBamHIで消化し、ゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化されたpCDNA3.1(+)ベクター中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいDNA配列のクローン(Souza他、1986;Nagata他、1986a、b)は、pCDNA3.1(+)::G−CSFfusまたはpBBT165と名付けた。
マーBB117(5>GGCCCGGCCAGCTCCCTGCCGCAGAGCTTCCTGCTTAAGTGCCTCGAGCAAGTGCGTAAGATCCAG>3;配列番号5)および逆方向プライマーBB114(配列は上記のとおり)と、テンプレートとしてクローン化G−CSF cDNAを用いた。BB117は、天然に存在するC17コドン、TGCが存在し、使用されるL15コドンがCTTであることを除けばBB116と同一である。このCTTは、AflII制限酵素認識部位を生み出し、C17S変異体から野生型C17クローンを区別するための迅速かつ便利な方法を提供する。このC17Sクローンは、15位にCTGコドンを有し、したがってAflII制限酵素認識部位を欠く。これらの反応の各々からの約530bpのPCR産物をゲル精製し、第二のPCR反応用テンプレートとして用いた。
ンドが抗ヒトG−CSF抗血清(R&D Systems)と強力に反応することを示した。この抗体は、BOB213およびBOB268の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB130の誘導および非誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタン・ブロットはまた、この約19kDaのバンドがR&D Systemsから購入した市販のヒトG−CSF標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、STIIリーダー・ペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。実施例10に示すN末端配列決定試験は、STIIシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。
をプールした。野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S)の最終的な収量をBradford分析により測定すると、それぞれ培養液400mlから約1.1mgおよび3.3mgであった。精製野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S)は、SDS−PAGEの還元および非還元条件下で一緒に移動した。誘導および非誘導G−CSFおよびG−CSF(C17S)の見かけの分子量は、それぞれ約19および17kDaであった。
G−CSF(C17S)システイン・ムテインの構築、発現、精製および生物活性
A.G−CSFシステイン・ムテインの構築
PCT/US00/00931ならびにInnis他(1990)およびWhite(1993)に記載の手順と類似した、部位特異的PCRをベースとする変異誘発手順を用い、15種類の変異G−CSF遺伝子を構築した。発明者らは、ヘリックスAから近位のアミノ末端領域中の5種類のムテイン[*−1C(天然アミノ末端へのシステイン残基の
付加)、T1C、L3C、A6CおよびS7C];B−Cループ中の2種類のムテイン[E93CおよびS96C];C−Dループ中の6種類のムテイン[A129C、T133C、A136、A139C、A141CおよびS142C];およびヘリックスDから遠位のカルボキシ末端領域中の2種類のムテイン[Q173Cおよび*175C(天然カルボキシ末端へのシステイン残基の付加)を構築した。G−CSFシステイン・ムテインはすべて、野生型G−CSF中の17位に通常存在する無対のシステインによって引き起こされる可能性のある潜在的な困難および/またはあいまい性を避けるためにC17Sバックグラウンドで構築した。G−CSF(C17S)は、既に報告されているように完全な生物活性を有しており(Ishikawa他、1992;Lu他、1992)、発明者らの大腸菌発現系においても、精製C17Sの収率が精製野生型G−CSFの収率よりも高いことを発見している。さらに、インビトロにおけるアッセイでも、発明者らの組み換えC17Sは、発明者らによって製造された野生型G−CSFおよび民間供給メーカー(R&D Systems、Inc.)から入手した大腸菌発現による組み換え野生型G−CSFよりも活性である。
BioLabs)で消化した。QIAquick PCR Purification
Kitを用いる追加のクリーン・アップの後、MluIおよびXhoIで切断されたpBBT277と消化生成物を連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ(New England BioLabs)で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。L3C変異および約70bpのMluI−XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定
した。
Purification(Qiagen)を用い、供給メーカーのプロトコルに従って「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってStyIおよびEcoRI(New England BioLabs)で消化した。QIAquick PCR
Purification Kitを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を1.5%アガロース・ゲル上に展開し、約220bpの当該StyI−EcoRIフラグメントをQIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってゲル精製した。ゲル精製したフラグメントを、StyIおよびEcoRIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ(New England BioLabs)で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定した。Q173C変異および約220bpのStyI−EcoRIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
extension)による変異誘発」の技術を用いて構築した。A6C構築の最初の、すなわち「一次」PCR反応は、1.5mM MgCl2、各プライマー0.4μM、dATP、dGTP、dTTPおよびdCTPを各200μM、テンプレート・プラスミドpBBT227 1ng、Taqポリメラーゼ(Promega)1.5単位、およびPfuポリメラーゼ(Stratagene)0.25単位を含有する1X Promega PCR緩衝液中、反応体積50μlで行った。反応は、Perkin−Elmer
GeneAmp(登録商標)PCR System2400サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、96℃3分、[95℃60秒、60℃30秒、72℃45秒]25サイクルおよび4℃保持とした。用いたプライマー対は、[BB173×BB18
8]および[BB174×BB125]とした。BB188(5>GCCATGGCCCTGGATCTTACG>3;配列番号10)はpBBT227中で成熟G−CSFのアミノ酸残基21−27をコードするDNA配列にアニールする。BB125(5>CTATGCGGCATCAGAGCAGATA>3;配列番号17)は、クローン化G−CSF配列の約20bp上流のpUC18ベクター配列にアニールする。BB173およびBB174は、A6のGCCコドンをシステインのTGCコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。BB173の配列は(5>CCGCTGGGCCCGTGCAGCTCCCTGCCG>3;配列番号15)であり、BB174の配列は、(5>CGGCAGGGAGCTGCACGGGCCCAGCGG>3;配列番号16)である。PCR産物を2%アガロース・ゲル上で展開すると、[BB173×BB188]および[BB174×BB125]PCR反応で[BB173×BB188]については約80bpおよび[BB174×BB125]については約140bpである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、QIAquick Gel Extraction
Kit(Qiagen)を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロース・ゲル切片から一緒に溶出し、10mMトリス−HCl(pH8.5)30μl中に回収した。次いで、これら2種類の変異誘発されたフラグメントを、次の、すなわち「二次」PCR反応で一緒に「スプライシング」した。この反応では、ゲル精製した一次反応のPCR産物3μlをテンプレートとして用い、BB125およびBB188をプライマーとして用いた。反応体積は100μlとし、Taqポリメラーゼ2.5単位およびPfuポリメラーゼ0.5単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次PCRのアリコートをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、予想した約190bpのバンドを観察した。二次PCR反応の全体を、QIAquick PCR Purification(Qiagen)を用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってNdeIおよびXhoI(New England BioLabs)で消化した。QIAquick PCR Purification Kitを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、NdeIおよびXhoIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ(New England
BioLabs)で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、A6C変異を含み約130bpのNdeI−XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
れていた。反応プログラムは、95℃3分、[94℃60秒、60℃30秒、72℃45秒]25サイクルおよび4℃保持とした。一次反応の産物は、調製用2%アガロース・ゲル上に直接ロードした。一次反応により、[BB206×BB188]については約100bpおよび[BB207×BB125]については約125bpである予想サイズの産物が得られた。二次PCRでは、反応体積を100μlとし、ゲル精製した一次反応のPCR産物5μlをテンプレートとして用い、BB187およびBB126をプライマーとして用い、Taqポリメラーゼ4単位およびPfuポリメラーゼ0.25単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。
するDNA配列にアニールする。順方向の非変異誘発性プライマーBB210(5>TTCGTTTTCTCTATCGCTACCAAC>3;配列番号36)は、pBBT227中でSTIIリーダー・ペプチドのアミノ酸残基13〜20をコードするDNA配列にアニールする。BB218およびBB219は、E93のGAAコドンをシステインのTGTコドンに変える相補的変異誘発性オリゴヌクレオチドである。BB218の配列は(5>CTGCAGGCCCTGTGTGGGATCTCCCCC>3;配列番号37)であり、BB219の配列は、(5>GGGGGAGATCCCACACAGGGCCTGCAG>3;配列番号38)である。一次反応の産物を、調製用2%アガロース・ゲル上に直接ロードすると、PCR反応により[BB218×BB211]については約115bpおよび[BB219×BB210]については約325bpである予想サイズの産物が得られたことを示した。これらのフラグメントをゲルから切り取り、プールし、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用い、供給メーカーのプロトコルに従ってアガロース・ゲル切片から一緒に溶出し、10mMトリス−HCl(pH8.5)30μl中に回収した。二次PCR反応では、ゲル精製した一次反応のPCR生成物プール5μlをテンプレートとして用い、BB211およびBB210をプライマーとして用いた。反応体積は100μlとし、Taqポリメラーゼ4単位およびPfuポリメラーゼ0.25単位を用いた。その他の点では、反応条件を一次反応で用いた条件と同一にした。二次PCRのアリコートをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、予想した約415bpのバンドを観察した。二次PCR反応の全体を、QIAquick PCR Purification(Qiagen)を用いて「クリーン・アップ」し、供給メーカーのプロトコルに従ってStyIおよびXhoI(New England BioLabs)で消化した。QIAquick PCR Purification Kitを用いる追加のクリーン・アップの後、消化生成物を、StyIおよびXhoIで切断されたpBBT227と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ(New
England BioLabs)で処理してゲル精製した。連結反応を用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体からのプラスミドを配列決定し、E93C変異を含み約260bpのStyI−XhoIセグメントの全体にわたり正しい配列を有するクローンを同定した。
き換えても、またはG−CSFコード配列中のどこか、2個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。G−CSFにシステイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスA、A−Bループ、B−Cループ、C−Dループに先行する領域、およびDヘリックスから遠位の領域中である。他の好ましい部位は、A、B、C、およびDヘリックスの最初または最後の3個のアミノ酸である。上述した変異の他に、システイン置換を作成するためにこれらの領域中で好ましい他の残基は、P2、G4、P5、S8、L9、P10、Q11、S12、T38、K40、S53、G55、I56、W58、A59、P60、L61、S62、S63、P65、S66、Q67、A68、Q70、A72、Q90、A91、L92、G94、I95、S96、E98、G100、G125、M126、A127、Q131,Q134、G135、S142、A143、Q145、およびP174である。本実施例に記載の変異体はすべて、天然タンパク質配列または天然に存在する「遊離」システイン残基(システイン−17)が別のアミノ酸、好ましくはセリンまたはアラニンに変えられた変異体タンパク質であるという状況で提供される。
ラムから溶出した。一つの例外E93Cは、グラジエント中の後半で(NaCl濃度約400mM)溶出したが、これは荷電アミノ酸であるグルタミン酸でシステインを置換したためと思われる。
2個以上の付加的遊離システイン残基を含有する多重変異体は、実施例9、14および15に記載の手順を用いる連続的な変異誘発により、あるいは2個以上の遊離システイン残基を含有するムテインをコードする組み換え発現プラスミドを構築するための個々の変異体のインビトロにおける組み換えにより構築することができる。好ましい多重変異体は、PEG化された場合に各々が高活性を維持する2個以上のシステイン・ムテインが組み合わされた変異体であろう。その例は、L3CプラスT133C、L3Cプラス*175C、ならびにT133Cおよび*175Cであろう。他の好ましい多重変異体は、表3お
よび表4からのデータに基づいて推論でき、L3C、T133C、A141Cおよび*175Cからなる群から選択される2個以上の変異を含有する組合せが含まれるであろう。
L3C X−R1−Cipベクターと連結した。連結反応で大腸菌JM109を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。
System2400サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、95℃5分、[94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒]22サイクル、72℃保持7分および4℃保持とした。PCR20μlをアガロース・ゲル電気泳動によって分析し、約630bpのフラグメントをゲルから単離した。このフラグメントをXhoIおよびEcoRIで消化し、Qiagen PCRクリーンアップ・キットを用いて抽出した。このDNAを、pBBT227のT133C誘導体をXhoIおよびEcoRIで消化することによって調製したベクターに連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼで処理し、Qiagen PCRクリーンアップ・キットを用いて抽出した。連結反応で大腸菌JM109を形質転換し、正しい配列を有するクローンを同定した。
G−CSFシステイン・ムテインのPEG化、精製および生物活性
A.予備的PEG化試験。
がらインキュベートした。60分後、反応物を直ちに非還元SDS−PAGEによって分析した。野生型G−CSFを修飾することなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質を与えたTCEPおよび特定のPEG試薬の量を、他の実験に使用した。滴定実験は、pH8.5では、10倍モル過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミドPEGにより、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質(SDS−PAGEによる見かけの分子量28kDa)が得られたことを示した。野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S)は同一のPEG化条件で修飾されなかった。これらの反応条件を用い、他のG−CSFムテインのPEG化をスケール・アップした。対照実験は、T1Cタンパク質をPEG化するには、TCEPなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があることを示した。
13種類の精製G−CSFシステイン・ムテインのアリコート200から300μgを5kDaマレイミドPEGでPEG化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大規模のPEG化反応はまた、上述の条件を用いて室温で1時間行った。これらの反応条件により、すべてのムテインについてモノPEG化タンパク質が得られた。モノPEG化ムテインのうち11種類は、以下に記載する手順を用いて精製した。反応時間の終了時に、PEG化混合物を40mMリン酸ナトリウム(一塩基)で10倍に希釈し、pHを4.0に調製した後、G−CSFムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件(20mLグラジエント、40mMリン酸ナトリウムpH4に溶かした0〜0.5M NaCl)を用い、S−セファロース・カラム(1mL、HiTrap)上に素早く載せた。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。S−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、大部分のムテインについて約275mM NaClおよび300〜325mM NaClで溶出する2本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピークは、SDS−PAGEによりモノPEG化G−CSF(C17S)ムテインであると決定した。後に溶出する主要ピークは、G−CSF(C17S)ムテインであると決定した。PEG−E93Cムテインは約325mM NaClで溶出し、これに対して未反応E93Cタンパク質の場合は約400mM NaClであった。モノPEG化G−CSF(C17S)ムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。5種類のシステイン・ムテイン(L3C、T133C、A141C、Q173Cおよび*175C)もまた、20kDa PEG−マレイミドならびに上述のPEG化および精製手順を用いてPEG化した。20kDa−PEG化タンパク質は、約250mM NaClでS−セファロース・カラムから溶出した。SDS−PAGE分析は、精製PEG化タンパク質が10%未満およびおそらく5%未満の非PEG化タンパク質を含んでいることを示した。システイン・ムテインをPEG化するには、TCEPなどの還元剤で処理することにより部分的に還元する必要があった。野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S)は同一の部分還元条件ではPEG化されず、ムテインに導入されたシステイン残基にPEG部分が結合していることを示している。
L3Cについて、リフォールドおよびPEG化反応の時間的経過を追った。この特定ムテインのリフォールドは、4時間までに完了することが分かった。リフォールド反応の進行は、逆相HPLC(C4カラム)によりモニターした。収量は、実施例8に記載のように培養した培養液400mL当たり約10mgであった。10kDa、20kDaおよび40kDa PEGでL3CムテインのPEG化について時間的経過を追った。0.5mM EDTAをPEG化緩衝液に含有させたことを除いて、PEG化反応条件は、実施例10で上述した通りとした。反応物0.5〜1mgの場合には、室温で2〜4時間の長い反応時間で多量のPEG化生成物が得られた。PEG化の効率は、時間延長で約80%であった。大量の(5mgまで)PEG化反応を同等な効率で行った。実施例10で既に記
載した精製方法を用い、S−セファロース・カラム5mL上の非PEG化タンパク質からPEG化タンパク質を精製した。20kDaのPEG化タンパク質は、約200mM NaClで溶出し、40kDa−PEGタンパク質および10kDa−PEGタンパク質は、それぞれ約150mMおよび約220mMで溶出した。非PEG化G−CSF L3Cムテインは、約260mMで溶出した。EDTAの存在は、PEG化反応におけるタンパク質二量体の生成を有意に減少させた。
CD分析は、光路長1cmの300μlセル中、周囲温度でJasco 720 CD分光偏光計で行った。データは、感度50m゜および32回の積算により260nm〜200nmから集めた。最初の実験は、L3Cムテインおよび10K PEG−L3Cタンパク質について行った。どちらも野生型G−CSFについて文献に見られるスペクトルと極めて類似したCDスペクトルを有していた。同様の分析は、他のG−CSFシステイン・ムテインおよびそれらのPEG化誘導体に対しても行うことができる。
ke−Ishikawa他、1992)。Bowen他(1999)は、5kDa−、10kDa−および20kDa−アミン反応性PEGで修飾したG−CSF変異体は、非修飾G−CSFに比べて約6分の1、10分の1、20分の1に低下したと報告した。Bowen他(1999)は、20kDa−アミン反応性PEGで修飾したPEG化G−CSF変異体の単一分子量分子種を精製し、その生物活性が非修飾G−CSFに比べて約4分の1に低下していることを見いだした。Bowen他(1999)によって単離された単一分子量分子種は単一PEG分子で修飾されたG−CSF変異体に対応するが、複数の部位でタンパク質に結合したPEG分子のためにPEGタンパク質調製物は不均一であった。Kinstler他(1996)は、アミンまたはアミド結合を介して、大腸菌発現のMet−G−CSF(細胞質中発現)の非天然アミノ末端メチオニン残基において優先的に修飾されるPEG化Met−G−CSF分子種を精製した。このPEG化Met−G−CSFタンパク質は、野生型Met−G−CSFのインビトロにおける生物活性の68%を有しているに過ぎなかった(Kinstler他、1996)。
システイン・ブロッキング剤の使用は、適切に折り畳まれたG−CSFシステイン・ムテインの回収率を改善する
不溶性、大腸菌発現野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S/Q173C)は、触媒量の硫酸銅の存在下および非存在下に還元剤の量およびタイプを変化させる手順によってリフォールディングした。G−CSFについての最適化リフォールド・プロトコル(Kuga他、1989)でその使用法を記載する参考文献に基づき、5mMジチオスレイトール(DTT)を標準的還元剤として選択した。Lu他(1992)は、可溶化ステップ中は還元剤を存在させないが再生緩衝液中には40μM硫酸銅を含める、不溶性G−CSFをリフォールディング/再生するプロトコルについて記載している。
含まない40mMリン酸ナトリウム、15%グリセロール、pH8 25mL中に希釈した。リフォールドを4℃に2日間保った。この時点で各々のpHを4に調整した。リフォールドを遠心分離し、上清をS−セファロース・カラム上に載せ、実施例8に記載したようにG−CSF野生型およびQ173Cタンパク質を精製した。実施例8に記載したように、カラム分画を非還元SDS−PAGEに基づいてプールした。クロマトグラフィ後に回収された各タンパク質の量を表5に示す。
システインの存在下および非存在下で調製されたG−CSFタンパク質安定性の比較
リフォールド手順A(還元剤なし、硫酸銅なし)およびリフォールド手順F(25mMシステイン、40μM硫酸銅)を用いて実施例11に記載のように調製された野生型G−CSFおよびG−CSF(C17S/Q173C)タンパク質をpH4およびpH8で50℃に置いた。0、5分、30分、1、2、3、4、5、および20時間目に、タンパク質試料を遠心分離して変性したタンパク質沈殿をすべて除去した。アリコートを上清から抜き取り冷凍した。実験の終了時に非還元SDS−PAGEによってすべてのアリコート
を分析し、元のG−CSFタンパク質試料のうちどれほどの部分が溶液中にあり、かつ単量体であるかを測定した。ゲル上の目に見える相対的バンド強度に基づき、各タンパク質の可溶性半減期を測定した。
PEG−G−CSFシステイン・ムテインのインビボにおける有効性
各々が約320gの体重である3匹の雄生Sprague Dawleyラットからなる群に、1回の静注(外側尾静脈)で野生型組み換えG−CSF(Bolder Bio
Technologyにより調製)、ニューポジェン(登録商標)(Amgen、Inc.より販売の組み換えG−CSF)またはPEG−L3Cを100μg/kgの用量で投与した。タンパク質濃度は、Bradford染料結合アッセイを用いて測定した。選択された時点に、血液試料(0.3から0.4ml)をラットからEDTA抗凝血管中に採取した。血液試料のアリコートを、全血球(CBC)計算のために民間会社に送った。血液試料の残りを遠心分離し、血漿を−80℃で冷凍した。注射して0.25、1.5、4、8、12、16、24、48、72、96、120および144時間後に血液試料を採取した。0時間の基準値試料は、試験化合物の注射約24時間前に入手した。表10および11は、様々な試験群についての経時的な平均血中好中球および全白血球数を示す。3種類の試験化合物はすべて、ベースライン値を上回る末梢性白血球および好中球の増加を刺激した。野生型組み換えG−CSFおよびニューポジェン(登録商標)を投与された試験群の白血球および好中球数は注射後約24時間で最高になり、約48時間までに基準値に戻った。対照的に、PEG−L3Cを投与されたラットの白血球および好中球数は注
射後約48〜72時間で最高になり、注射後約120時間まで基準値に戻らなかった。PEG−L3Cを投与されたラットで観察された最高白血球および好中球レベルは、野生型組み換えG−CSFまたはニューポジェン(登録商標)を投与された群よりも有意に高値であった(p<0.05)。このデータは、PEG−L3Cには循環する好中球および白血球の増加を刺激する能力があり、その末梢白血球数および好中球における絶対的増加は、野生型G−CSFまたはニューポジェン(登録商標)で見られるよりも大きく持続性であることを示している。同様の実験を行い、他のPEG化G−CSFシステイン・ムテイン(C17またはC17Sバージョン)の有効性を証明することができる。同様の試験はまた、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。
することができる。滴定実験を行い、野生型G−CSF、非修飾G−CSFシステイン・ムテインおよびPEG化G−CSFシステイン・ムテインを検出するためのELISAの相対的感度を測定することができる。同様の実験は、タンパク質の投与に皮下経路を用いて行うことができる。
Systems、Inc.から購入したヒトG−CSF ELISAキットを用いて測定した。結果を表12に示す。この結果は、20kDa−PEG−L3Cが、ラットにタンパク質を静脈内投与した後に野生型G−CSFまたはニューポジェン(登録商標)よりも有意に長い循環半減期を有していることを示している。
めには一元配置分散分析を用いて行うこととした。P<0.05を有意と見なすこととした。PEG化G−CSFシステイン・ムテインは、媒体処置のマウスに比べ、マウスの循環好中球レベルおよび顆粒球形成の大きな増加を刺激するはずである。5kDa、10kDa、20kDaまたは40kDa PEGで修飾したPEG化G−CSFシステイン・ムテインの有効性は、1回、1日1回、1日おき、または2日おきに投与してテストすることができる。最初の実験では、マウスの様々な群に、1回の注射でPEG化G−CSFシステイン・ムテイン0.0032,0.016、0.08、0.4および2μgを皮下注射で投与することができる。対照マウスには、媒体溶液のみを投与することができる。追加の対照群には、PEG化G−CSFシステイン・ムテインと同一の投与計画を用い、野生型G−CSF(2μg/毎日(ED)を5日間)および野生型G−CSF2μgを投与することができる。
髄の採取のためにラットを屠殺し、顆粒球生成増加の証拠を調べることができる。PEG化G−CSFシステイン変異体は、媒体注射、CPA注射対照群に比べて、ラットにおける循環する好中球レベルおよび顆粒球生成の増加を刺激して加速するはずである。
野生型GM−CSFのクローニング、発現、精製および生物活性
A.GM−CSFをコードするクローン化DNA配列
発明者らは、ヒトGM−CSFをコードするcDNAを、ヒト膀胱癌細胞株5637(American Type Culture Collectionから入手)から単離した全RNAのRT−PCRによりクローニングして配列決定した。G−CSFをコードするcDNAは、ヒト膀胱癌細胞系5637(American type Culture Collection)から単離した全RNAのPCRにより増幅した。10%FBS、50単位/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI1640培地中で細胞を培養した。Qiagen、Inc.(Santa Clarita、CA)から購入したRNeasy Mini RNA単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、Boehiringer Mannheim Corp製のRT−PCR用1st
Strand cDNA Synthesis Kit(AMV)を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生成物をテンプレートとして用いる次のPCR反応は、順方向プライマーBB267(5>GACACTGCTGCTGAGATGAATG>3;配列番号75)および逆方向プライマーBB268(5>CTTGTAGTGGCTGGCCATCATG>3;配列番号76)で行った。プライマーBB268は、GM−CSF分泌シグナル用のコード配列の5′末端にアニールし、逆方向プライマーBB268は、GM−CSFコード配列の3′末端にアニールする。得られた約450bpのPCR産物をHindIIIおよびBamHIで消化し、ゲル精製し、HindIIIおよびBamHIで消化されたpCDNA3.1(+)ベクター中にクローニングし、アルカリ・ホスファターゼ処理し、ゲル精製した。正しいDNA配列のクローンは、pCDNA3.1(+)::GM−CSFfusまたはpBBT267と名付けた。発明者らはPCRを用い、大腸菌における周辺質発現のためにこのGM−CSFクローンを修飾した。周辺質への分泌を介して大腸菌で発現させる場合に、GM−CSFは、付加的N末端メチオニンを含まず、天然に存在するGM−CSFと同一なアミノ酸配列を有する(Lee他、1985)。分泌型のGM−CSFを発現させるためにPCRを用い、NdeI制限酵素認識部位の後ろの大腸菌の耐熱性エンテロトキシン(STII)遺伝子(Picken他、1983)のリーダー配列を、成熟GM−CSFのアミノ末端コード配列に融合させた。さらに、カルボキシ末端残基E127の後に、EcoRI制限酵素認識部位に直ぐ続けてTAA終止コドンを付加した。同時に、2、6、8、12、117および124位のプロリンのコドンをすべてCCGに変え、114位のロイシンのコドンをCTGに変えた。PCR反応は、順方向プライマーBB300(5>CGCAACGCGTACGCAGCACCGGCCCGCTCGCCGAGCCCGAGCACGCAGCCGTGGGAG>3;配列番号77)および逆方向プライマーBB301(5>CGCGAATTCTTACTCCTGGACCGGCTCCCAGCAGTCAAACGGGATGACCAGCAGAAA>3;配列番号78)を用い、pBBT267をテンプレートとして行った。得られた約400bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、ゲル精製し、上記実施例9に記載のpBBT227中にクローニングした。pBBT227 DNAをMluIおよびEcoRIで消化し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、1%アガロース・ゲル上に展開させた。約2.4kbのベクター・フラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はGM−CSFに融合した完全stIIリーダーを有し、この「stII−GM−CSF」構築物を約450bpのNdeI−EcoRIフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローンは、pUC18::stII−GM−CSFと名付けた。発現試験の場合には、このプラスミドのNd
eI−EcoRIフラグメントを発現ベクターpBBT257中にサブクローニングしたが、それを以下に記載する。得られたプラスミドpBBT257;stII−muGM−CSF、すなわちpBBT271を発現用の大腸菌W3110中に導入した。
GM−CSF]およびpBBT257親ベクターを大腸菌W3110中に形質転換した。得られた菌株をBOB340:W3110(pBBT257)、およびBOB350:W3110(pBBT271)と名付けた。新鮮な飽和した前夜の培養液を、A600におけるO.D.約0.05で10μg/mlテトラサイクリンを含有するLB中に接種した。これらの培養液100mlを、500mLのバッフル付き振とうフラスコ中28℃で、約250rpmのジャイロトリー・シェーカー用水浴中で培養した。培養液の密度が約0.6ODに達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えた。次いで、誘導培養液を約16時間一夜インキュベートした。誘導および非誘導培養液の試料を既製の16%トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。BOB350(野生型)の誘導培養液は、約14kDaにバンドを示し、これは成熟GM−CSFの分子量と一致する。このバンドは、BOB350の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB340の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。ウェスタン・ブロット分析は、この約14kDaのバンドが抗ヒトGM−CSF抗血清(R&D Systems)と強力に反応することを示した。この抗血清は、BOB340およびBOB350の非誘導培養液ならびにベクターのみの対照であるBOB340の誘導培養液中のタンパク質を認識しなかった。これらのウェスタン・ブロットはまた、この約14kDaのバンドがR&D Systemsから購入した市販の大腸菌由来のヒトGM−CSF標準品と一緒に移動することを示した。この結果は、STIIリーダー・ペプチドが除去されたことを示し、周辺質に分泌されたタンパク質と一致する。以下に示すN末端配列決定試験は、STIIシグナル配列が適切にプロセシングされたことを示す。
この混合物を室温で30分間撹拌し、次いで20mMトリス、40μM硫酸銅、15%グリセロール、pH8.0 100ml中に希釈した。このリフォールド混合物を4℃に2日間保ち、次いで遠心分離し、20mMトリスpH8.0(緩衝液A)で平衡化したQ−セファロース・カラム(Pharmacia Hi Trap)5ml上に載せた。0〜35%緩衝液B(1M NaCl、20mMトリス、pH8)の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。非還元SDS−PAGEによりカラム分画を分析した。GM−CSFは約230mM NaClで溶出した。主にGM−CSFを含有する分画をプールした。
A.GM−CSFシステイン・ムテインの構築。
GM−CSFシステイン・ムテインのPEG化、精製および生物活性
A.予備的PEG化試験。 最初のPEG化反応条件は、試験タンパク質としてA1C、S7CおよびS69C、還元剤としてTCEP[トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン]−HCl、およびShearwater Polymers製の5kDaシステイン反応性PEGを用いて決定した。精製システイン・ムテインまたは野生型GM−CSFのアリコート3μgを、過剰の5kDAマレイミド−PEGまたは5kDaビニルスルホン−PEG(ポリマー末端の一方に反応性マレイミドまたはビニルスルホン基を有する平均分子量5kDaの直線型ポリエチレン・グリコール・ポリマー)の存在下で100mMトリス、pH8.5中室温でTCEP濃度を増加させながらインキュベートした。マレイミドおよびビニルスルホン基は、Michael求核試薬と反応し、システイン側鎖上にあるようなメルカプタン基に高い選択性がある。90分後、反応物を直ちに非還元SDS−PAGEによって分析した。野生型G−CSFを修飾することなく有意な量のモノPEG化T1Cタンパク質を与えたTCEPおよび特定のPEG試薬の量を、続く実験に使用するため選択した。滴定実験は、pH8.5では、15倍モル過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミドPEGにより、ジまたはトリPEG化タンパク質が検出されることなく有意な量のモノPEG化A1Cタンパク質が得られたことを示した。GM−CSF S69Cの場合には、5kDaビニルスルホン−PEGが5kDAマレイミド−PEGより好ましく、有意な量のモノPEG化S69Cタンパク質を与える。組み換え野生型GM−CSFは、50倍モル過剰のTCEPが存在してもPEGと反応しなかった。対照実験は、ムテインをPEG化するには、部分的に還元する必要があることを示した。
10種類の精製GM−CSFシステイン・ムテインのアリコート200から300μgをPEG化し、精製および特徴付けに十分な材料を得た。大量のPEG化反応はまた、室温で1.5時間行った。各変異体の場合、15倍過剰のTCEPおよび20倍過剰の5kDAマレイミド−PEGを用いた。唯一の例外は、5kDaビニルスルホン−PEGを用いたS69Cであった。これらの反応条件により、10種類のすべてのムテインについて
モノPEG化タンパク質が得られた。反応時間の終了時に、PEG化混合物を氷冷20mMトリス、pH8.0で20倍に希釈した後、GM−CSFムテインの初期の精製について記載した条件に類似した条件(25mLグラジエント、20mMトリスpH8に溶かした0〜0.35M NaCl)を用い、Q−セファロース・カラム(1mL、HiTrap)上に素早く載せた。PEG部分の存在は、樹脂に対するタンパク質の親和性を減少させ、PEG化タンパク質を非PEG化タンパク質から分離することを可能にしている。PEG化反応の非還元SDS−PAGE分析は、唯一のPEG化分子種が、見かけの分子量約26kDaで移動するPEG−GM−CSFシステイン・ムテイン単量体であることを示していた。Q−セファロース・カラムからのクロマトグラムは、2本の主要なタンパク質ピークを示した。早く溶出する主要ピーク(160〜200mM NaCl)は、SDS−PAGEによりモノPEG化GM−CSFタンパク質であると決定した。二番目の主要ピーク(200〜230mM NaCl)は、未反応GM−CSFタンパク質であると決定した。モノPEG化GM−CSFシステイン・ムテインを主に含有する早く溶出したピークからの分画をプールし、生物活性測定に用いた。すべてのGM−CSFムテインを同一のプロトコルによりPEG化し、精製した。PEG化タンパク質は、SDS−PAGEにより類似した見かけの分子量を示したが、PEG−E93CムテインおよびPEG−T94Cムテインは例外で、わずかに小さな見かけ分子量を示した。N末端領域における4種類のシステイン・ムテイン(*−1C、A1C、A3C、およびS7C)も、10−および20kDaマレイミドPEGを用い、小スケールでPEG化した。これらの反応は、上述の条件を用いて各ムテイン3μgについて行い、SDS−PAGEにより分析した。これらの各ムテインは、10kDaおよび20kDaPEG試薬と容易に反応し、モノPEG化タンパク質が得られた。40kDa−PEG−A3Cも上述のプロトコルに従って調製した。このプロトコルをスケール・アップすると多量の10kDa−、20kDa−および40kDa−PEG−A3Cタンパク質が得られた。
野生型マウスGM−CSFおよびマウスGM−CSFのシステイン・ムテインのクローニング、発現、精製および生物活性
発明者らは、成熟マウスGM−CSFをコードするcDNAを、American Type Culture Collection(Rockville、MD)から入手したマウスEL4.IL−2細胞株(カタログ番号TIB−181)から単離した全RNAのRT−PCRによりクローニングして配列決定した。10%FBS、50単位/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で細胞を培養した。RNA単離の前に、DMEM培地中の1μg/ml PHA−L(Sigma−Aldrich Chemical Company、カタログ番号L−4144)および10ng/mlPMA(Sigma−Aldrich Chemical Company、カタログ番号P−1585)、10%FBS、50単位/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシンにより37℃で6または24時間、細胞を誘導した。Qiagen、Inc.(Santa Clarita、CA)から購入したRNeasy
Mini RNA単離キットを用い、製造者の指示書に従って細胞からRNAを単離した。一本鎖cDNAの第一鎖合成は、Boehiringer Mannheim Corp製のRT−PCR用1st Strand cDNA Synthesis Kit(AMV)を用いて行い、ランダムな六量体をプライマーとして用いた。第一鎖合成の生
成物をテンプレートとして用いる続くPCR反応は、順方向プライマーBB481(5>GCGACGCGTACGCAGCACCCACCCGCTCACCCATCACT>3;配列番号43)および逆方向プライマーBB482で行った。BB481は、成熟マウスGM−CSFの最初の8個のアミノ酸をコードする24個のヌクレオチドにアニールする。BB481はまた、上記の実施例7およびPicken他(1983)に記載の大腸菌stIIシグナル配列のカルボキシ末端の4個のアミノ酸をコードする配列と重なり合うヌクレオチドを、自身の配列の5′へ直に付加する。11個のこれらのヌクレオチドには、MluI制限酵素認識部位が含まれる。BB482(5>GCGGAATTCTTATTTTTGGACTGGTTTTTTGCATTCAAAGGG>3;配列番号44)は、マウスGM−CSFの10個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドにアニールし、コード配列の直後にTAA翻訳終止コドンおよびEcoRI制限酵素認識部位を付加する。6時間と24時間RNA試料は共に、GM−CSF RT−PCR産物を与えた。6時間RNA試料から得られた約400bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、ゲル精製し、上記実施例8に記載のpBBT227[pUC18::stII−GM−CSF(C17S)]中にクローニングした。pBBT227 DNAをMluIおよびEcoRIで消化し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、1%アガロース・ゲル上に展開した。約2.4kbのベクター・フラグメントを精製し、連結反応に用いた。得られた組み換え体はマウスGM−CSFに融合した完全stIIリーダーを有し、この「stII−muGM−CSF」構築物を約450bpのNdeI−EcoRIフラグメントとして切り取ることができる。正しい配列の一クローン(Gough他、1984)は、pUC18::stII−muGM−CSFまたはpBBT435と名付けた。発現試験の場合には、pBBT435のNdeI−EcoRIフラグメントを、上記の実施例14に記載する発現ベクターpBBT257中にサブクローニングした。得られたプラスミドpBBT257::stII−muGM−CSF、すなわちpBBT456を発現用の大腸菌W3110中に導入した。上記実施例14に記載のヒトGM−CSFの発現および精製用のプロトコルを用い、野生型マウスGM−CSFを発現させ精製した。
る置換変異、マウスGM−CSFコード配列中の天然に存在する2個のアミノ酸の間にシステイン残基を挿入する挿入変異、またはマウスGM−CSFコード配列の一番目のアミノ酸の前にシステイン残基を付加する、もしくはマウスGM−CSFコード配列の末端アミノ酸残基の後ろにシステイン残基を付加する付加変異のいずれであってもよい。システイン残基でどのアミノ酸を置き換えても、またはマウスGM−CSFコード配列中のどこか、2個のどのアミノ酸の間にシステイン残基を挿入してもよい。システイン残基を置き換えたり挿入するのに好ましい部位は、ヘリックスA、A−Bループ、B−Cループ、C−Dループに先行する領域、およびヘリックスDから遠位の領域中にある。他の好ましい部位は、A、B、C、およびDヘリックスの最初または最後の3個のアミノ酸である。一般に、天然に存在し通常はジスルフィド結合を形成するGM−CSF中のシステイン残基の一つを別のアミノ酸で置き換えることによって、遊離システインを含有するムテインを構築することができる。天然に存在し、置き換えられたシステイン残基と通常はジスルフィド結合を形成するシステイン残基は今や遊離である。システイン残基は、他の19個のどのアミノ酸で置き換えてもよいが、セリンまたはアラニン残基であることが好ましい。遊離システイン残基はまた、Sytkowski他(1998)によって記載された手順などの手順を用い、天然に存在するアミノ酸の化学的修飾によってGM−CSFに導入することもできる。
野生型ヒトエリスロポエチンの大腸菌発現および精製
A.大腸菌中への分泌によるエリスロポエチンの発現。
CCCACCACGCCTCATC>3;配列番号46)、および遺伝子のC末端コード領域にアニールするBB585(5>CCGGAATTCTTAACGGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号47)あるいはBB586(5>CCGGAATTCTTAGTCACCTGTGCGGCAGGC>3;配列番号48)とした。BB585には、cDNA配列によって予測されるC末端アミノ酸であるArg166のコドンが含まれるが、BB586はArg166コドンを削除し、C末端アミノ酸としてAsp165をコードする。得られた約600bpのPCR産物をMluIおよびEcoRIで消化し、同様に消化したpBBT227(実施例9)ベクター中にクローニングし、STIIリーダー配列と野生型Epoのアミノ末端コード配列との間の融合物を作成した。BB583およびBB585を用いるPCRによって形成される遺伝子をSTII−Epo−完全長(STII−Epo−FL)と呼び、BB583およびBB586を用いるPCRによって形成される遺伝子をSTII−Epo−desArg(STII−Epo−dR)と呼ぶ。次いで、正しい配列のSTII−Epo−FLクローンおよびSTII−Epo−dRクローンをNdeI−EcoRIフラグメントとしてpBBT257(実施例14に記載)中にサブクローニングし、それぞれpBBT477およびpBBT478を作成した。
ぞれpBBT479およびpBBT480を作成した。
エリスロポエチン・システイン・ムテインの構築、大腸菌発現、精製および生物活性
A.Epoシステイン・ムテインの構築。
システイン・ムテインのジスルフィド結合性三量体およびジスルフィド結合性高次多量体の構築
2個以上の「遊離」システインを有するGH変異体を構築し、それらを用いてPCT/US00/00931に記載のようにhGHの高次ジスルフィド結合性多量体を作成できると考えられる。このような変異体は、実施例1および2ならびにPCT/US00/00931に記載のように、大腸菌中で発現させ、リフォールディングして精製することができるであろう。次いで、続くプロセシングステップを用い、実施例2およびPCT/US00/00931に記載のように、ジスルフィド結合形成を誘導することができるであろう。このような条件下では、T3Cなどの1個の遊離システインを有するいくつかのhGH変異体は、ほぼ定量的にジスルフィド結合性二量体に変換される。同一または類似の条件下では、2個の遊離システインを有するhGH変異体、例えばT3Cと別のシステイン・ムテインを組み合わせた二重変異体による分子間ジスルフィド形成により、hGH分子の重合が起こり、このようなポリマーの鎖長は原則として無制限と考えられる。T3C変異体および/または他のシステイン・ムテインなどのただ1個の遊離システインを有するhGH分子を重合反応に加えることにより、鎖長を制限したりある程度制御することができるであろう。成長するポリマーとただ1個の遊離システインを有する分子との間のジ
スルフィド結合形成が、未完成ポリマー中の2個の重合部位のうちの1個を「キャップする」か、それ以上の伸長を防いでくれるはずである。続いてのただ1個の遊離システインを有する第二のhGH分子と未完成ポリマーの他の重合部位との反応は、重合を終了させてポリマー分子の長さを確定する。平均ポリマー長は、反応剤の化学量論、すなわち2個の遊離システインを含むhGH分子と1個の遊離システインを含むhGH分子との比率によって制御できると考えられる。平均して短めのポリマーは小さな比率によることが好ましく、平均して長めのポリマーが大きな比率によるのが好ましい。より複雑な「分枝」ポリマーは、3個以上の遊離システインを含むhGH変異体とただ1個の遊離システインを有するhGH変異体が関与する反応から構築されると考えられる。
野性型ヒト・エンドスタチンのクローニング、発現および精製
A.エンドスタチンをコードするクローン化DNA配列。
を250ml振とうフラスコ中で培養した。培養液のO.D.が約0.3〜0.5に達したら、IPTGを最終濃度0.5mMまで加えてヒトmet−エンドスタチンの発現を誘導した。最初の実験の場合には、誘導後0、4および約19時間に培養液をサンプリングした。試料を既製の14%トリス−グリシン・ポリアクリルアミド・ゲル上のSDS−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(SDS−PAGE)により分析し、クーマシー・ブルーで染色した。BOB460とBOB461の誘導培養液は共に、約20kDaにバンドを示し、これは成熟ヒト・エンドスタチンと一致する。このバンドは、ベクターのみの対照であるBOB460とBOB461の非誘導培養液ならびにBOB490およびBOB340の誘導および非誘導培養液では検出されなかった。約20kDAのバンドは、Calbiochemから購入した商品として調製されたヒト・エンドスタチンと同時に移動した。
ヒト・エンドスタチン・システイン・ムテインの構築、発現、精製および生物活性
A.エンドスタチン・システイン・ムテインの構築。
PCR Cleanup Kitを用いて抽出し、これらと同一の制限酵素により切断されたpBBT370ベクターDNAと連結し、アルカリ・ホスファターゼ処理し、Qiagen PCR Cleanup Kitを用いて抽出した。これらの核酸連結による形質転換体を培養し、プラスミドDNAを単離して配列決定した。全体のクローン化され変異誘発をうけたPCRフラグメントの配列を決定し、当該変異の存在、およびPCR反応または合成オリゴヌクレオチド・プライマーによって導入される可能性のある余分な変異が存在しないことを確認した。
単位、およびPfuポリメラーゼ(Stratagene)0.1単位を含有する1X Promega PCR緩衝液中、25μl反応で行った。反応は、Perkin−Elmer GeneAmp(登録商標)PCR System2400サーマル・サイクラー中で行った。反応プログラムは、95℃5分、[94℃30秒、55℃30秒、72℃45秒]22サイクル、72℃保持7分および4℃保持とした。
u36IおよびEcoRIで切断したpBBT370と連結し、子ウシ腸アルカリ・ホスファターゼ(New England BioLabs)で処理し、QIAquick PCR Purification Kitを用いて「クリーン・アップ」した。
心分離によって集めて洗浄し、水への再懸濁および再度の遠心分離により、可溶化した細胞の破片の大部分を除去した。リフォールディングのために、不溶性のエンドスタチンを含有する得られたペレットを、20mMトリス・ベース中の8M尿素、10mMシステイン20mlに溶かした。この混合物を室温で120分間撹拌した。シスチンを最終濃度10mMまで加えた後、氷冷した3M尿素、40μM硫酸銅、20mMトリス、pH7.5
200ml中に希釈した。このリフォールド混合物を4℃で3日間ゆっくりと撹拌した。リフォールド混合物のpHを希HClで5.0に調整し、混合物を遠心分離した後、40mMリン酸ナトリウムpH5.0(緩衝液A)で平衡化したS−セファロース・カラム(Pharmacia HiTrap)5ml上に載せた。0〜100%緩衝液B(500mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH5.0)の線形塩グラジエントにより結合したタンパク質を溶出した。主にエンドスタチンを含有するS−セファロース分画をプールし、pHを7.4に調整した後、20mMトリス、pH7.4中で予め平衡化したヘパリン−セファロース(Hi trap)カラム上に載せた。このカラムを0〜1M
NaCl塩グラジエントで溶出した。純粋なエンドスタチンを含むヘパリン・カラム分画を集めて冷凍した。エンドスタチン・システイン変異体G90C、G98C、H112C、およびR157Cも、ヘパリン・カラムのステップを省略した上記のプロトコルを用いて部分的に精製した。
組み換えアンジオスタチン・システイン・ムテインのリフォールディング
アンジオスタチンは、グリコシル化されていない場合にも十分に活性であり、したがってその製造に真核生物の発現系を必要としない。ヒト・プラスミノーゲンの最初の4個のクリングル(kringle)・サブユニットからなるヒト・アンジオスタチンのコード配列は、ヒト・プラスミノーゲンcDNAテンプレート(American Type Culture Collection、Rockville、MDから入手できる)からPCR増殖させることができる。野生型アンジオスタチンおよびアンジオスタチン・システイン・ムテインは、周辺質空間にタンパク質を運ぶためにSTIIまたはompAタンパク質由来の細菌シグナル配列を成熟アンジオスタチンのN末端上に融合することにより、大腸菌から分泌させることができる。この方法はまた、アンジオスタチンのフラグメ
ント(クリングル(K)1、K2、K3、およびK2−3、(Cao他、1996))についてもうまく用いられている。あるいは、アンジオスタチンおよびアンジオスタチン・システイン・ムテインは、大腸菌または他の宿主細胞の細胞質に発現させることができる。アンジオスタチンは、13個のジスルフィドを形成する26個のシステインを有する。したがって、システイン・ブロッキングを付加しない従来のリフォールド・プロトコルは、アンジオスタチンのようにシステインに富んだタンパク質では成功しないであろう。アンジオスタチン中にシステイン残基を導入する好ましい部位には、K97C(成熟アンジオスタチンのN末端上に付加されたシステイン残基)、T365C、371C、S460C、A463C、および*466C(成熟アンジオスタチンタンパク質のC末端上に付加されたシステイン残基)が含まれる。
PEG化タンパク質のペプチド・マッピング
多くの場合、ペプチド・マップを用いてPEG化の部位を確認することができる。通常、PEG化タンパク質は、システイン・ムテインが他にシステイン残基を含まないペプチド中に存在するように特異的に消化される。ペプチドと共有結合したPEGの存在は、消化混合物を逆相HPLCによりアッセイする場合に保持時間を劇的に変えるはずである。文献(Clark他、1996)による条件を用いてトリプシンでGHを消化した場合、可能性のあるトリプシンによって生じた21種類のペプチド(T1〜T21、連続して番号付けされた)を単離することができる。変異T3Cを含む残基1〜8に相当するT1は、野生型(64分)すなわち下垂体成長ホルモンに対してシステイン変異体(61分)のわずかに早い保持時間にシフトする。5K PEGでPEG化された場合には、T1ペプチドはクロマトグラムの最後に移動し、保持時間は100分を超える。GHをエンドプロテアーゼLys−Cで消化する場合には、10種類のペプチド(L1〜10、連続して番号付けした)残基1〜38に相当するL1は、野生型GHの場合には約59分に、ムテインT3Cの場合には61分に溶出する。20K PEGでPEG化された場合には、L1はクロマトグラムから消える。これらのデータは、PEG部分が天然システインではなく、予想通りに3位のシステイン残基に結合していることを支持している。PEG化前後のIFN(トリプシンおよびエンドプロテアーゼGlu−C)、GM−CSF(エンドプロテアーゼGlu−C)、およびG−CSF(エンドプロテアーゼLys−C)のシステイン・ムテインの酵素的消化およびRP HPLC分析もまた、新たに導入されたシステイン残基における単一部位のPEG化に一致するデータを示した。
組み換えG−CSFおよび組み換えGM−CSFによる処理は、化学療法後の好中球および血小板のより急激な産生および移植を引き起こす末梢血前駆細胞(PBPC)を動員することが分かっている。PBPC動員(および潜在的動員速度)の亢進は、PEG化G−CSFおよびPEG化GM−CSFシステイン・ムテインの存在下で評価することができる。明確な骨髄細胞プロフィールおよび増殖速度を有することが知られている脾臓摘出(spleenctomized)マウスに、G−CSF(野生型またはニューポジェン(登録商標))またはPEG化G−CSFシステイン・ムテインを静脈内または皮下で1回または1日1回(7日まで)投与することができる。各実験はまた、等張性食塩水に懸濁したマウス血清アルブミンからなる担体のみで処理される一群のマウスを含むことができる。処理後、末梢血を心臓穿刺によって採取し、EDTA含有試験管中に集めることができる。CBC分析を行うことができる。大腿骨および骨髄の内容物を洗い流すことにより骨髄細胞を採取することができる。クリスタル・バイオレットによる染色および血球計計数により白血球数を測定することができる。血液密度勾配分画を用いて低密度細胞を単離し、前駆細胞アッセイで用いることができる。前駆細胞アッセイのプロトコルは、Briddell他(1993)に概略が述べられている。基本的には、二重層寒天をベースとするシステム(Bradley他、1978)を用い、原始的(高増殖性コロニー形成細胞)前駆細胞と成熟(顆粒球マクロファージ・コロニー形成細胞)前駆細胞を共に評価することができる。Iscove他(1974)によって開発されたメチルセルロースをベースとするアッセイ系を用い、赤芽球コロニー形成を評価することができる。PEG化G−CSFシステイン・ムテインは前駆細胞および幹細胞の動員を促進するはずである。同様の試験は、PEG化GM−CSFシステイン・ムテインおよび野生型GM−CSFについても行うことができる。最終的には、PEG化G−CSFおよびPEG化GM−CSFシステイン・ムテインの存在下における致命的に照射を受けたマウスにおける移植の効率および移植過程を促進する能力を検討することができる。
Claims (11)
- 単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)システイン・ムテインを調製する方法であって、
(a)大腸菌stIIシグナル配列が融合された、1個または複数の追加の遊離システイン残基を有するG−CSFシステイン・ムテインをコードするDNAで形質転換された大腸菌宿主細胞を得る工程と、
(b)前記大腸菌宿主細胞が前記G−CSFシステイン・ムテインを発現するとともに該G−CSFシステイン・ムテインを該大腸菌宿主細胞の周辺質中に分泌する条件下で、該大腸菌宿主細胞を培養する工程と、
(c)前記宿主細胞を溶解する工程と、
(d)溶解された前記宿主細胞から不溶性の前記G−CSFシステイン・ムテインを単離する工程と、
(e)前記不溶性のG−CSFシステイン・ムテインを変性剤および還元剤に暴露することにより、該不溶性のG−CSFシステイン・ムテインを変性且つ還元する工程と、
(f)前記G−CSFシステイン・ムテインを、システイン・ブロッキング剤の存在下で生物学的に活性な形にリフォールディングする工程と、
(g)リフォールディングされた前記G−CSFシステイン・ムテインを単離する工程であって、該G−CSFシステイン・ムテインは、可逆的な混合ジスルフィドを含む工程と
を含む方法。 - 前記単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)システイン・ムテインは、
G−CSF成熟タンパク質のT1(1番目の位置のスレオニン:以下同様に、アルファベットはアミノ酸の一文字記号を指し、数字は成熟タンパク質内の置換されるアミノ酸の位置を指す)、P2、L3、A6、S7、W58、A68、E93、A129、Q131、T133、Q134、A136、A139、A141およびQ173から選択されたアミノ酸と置換されているシステイン残基を含むか、または
システイン残基が、G−CSF成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されており、
前記G−CSFシステイン・ムテインはヒトG−CSFに応答して増殖する細胞系統を
用いたインビトロ増殖バイオアッセイで100pg/mL未満のEC50を有する、請求項1に記載の方法。 - 前記単離ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)システイン・ムテインの前記置換されたシステイン残基または前記付加されたシステイン残基に、ポリエチレングリコールが取り付けられている
請求項2に記載の方法。 - 前記システイン残基は、前記G−CSF成熟タンパク質の最初のアミノ酸の前かまたは最後のアミノ酸の後に付加されている
請求項2または3に記載の方法。 - 前記システイン残基は、前記G−CSF成熟タンパク質のT1、P2、L3、A6、およびS7から選択されたアミノ酸と置換されている
請求項2または3に記載の方法。 - 前記システイン残基は、前記G−CSF成熟タンパク質のW58およびA68から選択されたアミノ酸と置換されている
請求項2または3に記載の方法。 - 前記システイン残基は、前記G−CSF成熟タンパク質のE93およびQ173から選択されたアミノ酸と置換されている
請求項2または3に記載の方法。 - 前記システイン残基は、前記G−CSF成熟タンパク質のA129、Q131、T133、Q134、A136およびA139から選択されたアミノ酸と置換されている
請求項2または3に記載の方法。 - 前記システイン残基は、A141と置換されている
請求項2または3に記載の方法。 - 17番目の位置のシステインは、アラニンおよびセリンから選択されたアミノ酸に置換されている
請求項2から9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記大腸菌宿主細胞は、大腸菌W3110である
請求項1に記載の方法。
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