ES2317843T3 - Proteinas de fusion de eritropoyetina-inmunoglobulina. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende eritropoyetina unida a un dominio de inmunoglobulina (Ig) sin un enlazador peptídico intermedio donde el dominio de inmunoglobulina no contiene una región variable.

Description

Proteínas de fusión de eritropoyetina-inmunoglobulina.

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a procedimientos para construir proteínas quiméricas y, más específicamente, a procedimientos para construir proteínas de fusión de inmunoglobulina recombinantes.

Antecedentes de la invención

La prolongación de las vidas medias circulantes de agentes farmacéuticos proteicos es de interés para los pacientes y proveedores de asistencia sanitaria. Los agentes terapéuticos proteicos de acción prolongada deben requerir inyecciones menos frecuentes y pueden ser eficaces a dosis menores que proteínas con vidas medias circulantes más cortas. Se conoce que el aumento del tamaño eficaz de una proteína puede aumentar su vida media circulante evitando la eliminación de la proteína por el riñón (Knauf et al., 1988; Mahmood, 1998). Un procedimiento que se puede usar para aumentar el tamaño eficaz de una proteína es usar la tecnología de ADN recombinante para fusionar de forma covalente la proteína de interés con una segunda proteína. La proteína de fusión de mayor tamaño a menudo tiene una vida media circulante más prolongada que la proteína no fusionada (Capon et al., 1989; Zeng et al., 1995). Una clase de proteínas que se ha usado frecuentemente para generar proteínas de fusión son las inmunoglobulinas (1g), que son componentes principales de la sangre. Las inmunoglobulinas aparecen en diversas clases conocidas como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE (Roitt et al., 1989). Las IgG humanas pueden dividirse adicionalmente en diversos tipos conocidos como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, que son productos de genes diferentes. La 1gG1 es la inmunoglobulina más común en el suero (el 70% de 1gG total) y tiene una vida media sérica de 21 días (Capon et al., 1989; Roitt et al., 1989). Aunque menos abundante, la IgG4 también tiene una vida media circulante prolongada de 21 días (Roitt et al., 1989).

Las IgG humanas tienen una estructura multidominio, que comprende dos cadenas ligeras unidas por enlace disulfuro a dos cadenas pesadas (denominadas en este documento un "tetrámero"; revisado en Roitt et al., 1989). Cada cadena ligera y cada cadena pesada contiene una región variable unida a una región constante. Las regiones variables se localizan en los extremos N-terminales de las cadenas ligeras y pesadas. La región constante de la cadena pesada se divide adicionalmente en los dominios CH1, Bisagra, CH2 y CH3. Los dominios CH1, CH2 y CH3 son dominios separados que se pliegan en una estructura característica. La región Bisagra es una región de flexibilidad considerable. La flexibilidad de la bisagra puede variar dependiendo del isotipo de IgG (Oi et al., 1984; Dangl et al., 1988). Las cadenas pesadas de IgG forman normalmente dímeros unidos por enlaces disulfuro por restos de cisteína localizados en la región Bisagra. Los diversos dominios de cadena pesada están codificados por diferentes exones en los genes de IgG (Ellison et al., 1981; 1982).

Se han fusionado proteínas a la región constante de la cadena pesada de IgG en la unión de las regiones variable y constante (que contienen por tanto los dominios CH1-Bisagra-CH2-CH3 - denominadas en este documento las fusiones de IgG-C_{H}), en la unión de los dominios CH1 y Bisagra (que contienen por tanto los dominios Bisagra-CH2-CH3 - denominadas en este documento fusiones de IgG-Fc) y en el extremo C terminal de la cadena pesada de IgG (denominadas en este documento fusiones de IgG-C-terminal).

Más frecuentemente se han generado proteínas de fusión de IgG con los dominios extracelulares de receptores de superficie celular (revisado en Chamow y Ashkenaki, 1996). Los ejemplos de dominios extracelulares de receptores de superficie celular que se han unido usando tecnología de ADN recombinante con los dominios C_{H} o Fc de IgG humanas o de ratón incluyen CD4 (Capon et al., 1989), receptores de factor de necrosis tumoral (Mohler et al., 1993), CTLA4 (Linsley et al., 1991a), CD80 (Linsley et al., 1991b) y CD86 (Morton et al., 1996). Los dominios extracelulares de receptores evolucionaron para funcionar cuando se fusionaban con otros aminoácidos, es decir, los dominios transmembrana e intracelular del receptor; por lo tanto, no es sorprendente que los dominios extracelulares conserven sus propiedades de unión a ligando cuando se fusionan con otros dominios proteicos tales como dominios de IgG. A pesar de esto, se han señalado diferencias en las propiedades de unión a ligando para determinados dominios extracelulares. Por ejemplo, una proteína de fusión compuesta por el dominio extracelular CD4 con IgG1-C_{H} humana tiene una afinidad 2 veces reducida por el ligando de CD4 gp120 que el CD4 no fusionado (Capon et al., 1989).

Existen bastantes menos ejemplos de proteínas que normalmente son solubles, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas y similares, que se han fusionado con dominios de IgG y han conservado su actividad biológica completa. Las proteínas solubles no evolucionaron para funcionar cuando se fusionaban con otras proteínas y no hay razón para esperar que conserven su actividad biológica cuando se fusionan con otras proteínas. De hecho, en la mayoría de los ejemplos publicados, la actividad biológica de la citoquina/factor de crecimiento fusionada se redujo significativamente con respecto a la citoquina/factor de crecimiento no fusionada. Si la citoquina/factor de crecimiento funcionará o no de forma apropiada cuando se fusione con otra proteína dependerá de muchos factores, incluyendo de si el extremo aminoterminal o el extremo carboxiterminal de la citoquina/factor de crecimiento están expuestos en la superficie de la proteína, de si estas regiones son importantes para la actividad biológica de la citoquina/factor de crecimiento y de si la citoquina/factor de crecimiento es capaz de plegarse apropiadamente cuando se fusiona con otra proteína. Por su propia naturaleza, dichos factores serán altamente específicos de proteína e impredecibles. Los resultados con las pocas proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina que se han estudiado han demostrado cómo puede ser la actividad biológica específica de proteína de la proteína. En la mayoría de los casos, la actividad biológica del factor de crecimiento/citoquina fusionado está seriamente reducido, mientras que en la menor parte de los casos se conserva la actividad biológica completa del factor del crecimiento/citoquina. En un caso en el que la actividad biológica de la proteína de fusión se redujo significativamente, la modificación de los aminoácidos en la unión entre la citoquina/factor de crecimiento y el dominio de IgG dio como resultado una proteína de fusión con una actividad biológica mejorada (Chen et al., 1994). Esta misma modificación no mejoró la actividad biológica de una segunda citoquina fusionada con el mismo dominio de IgG. [(Chen et al., 1994)].

Los factores de crecimiento que se han fusionado con IgG incluyen factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y factor de crecimiento similar a insulina (IGF-I). Se generó una proteína de fusión de KGF-IgG1-Fc de ratón por LaRochelle et al. (1995). En una base molar, la proteína de fusión era 4-5 veces menos activa que el KGF en la estimulación de la proliferación de células Balb/MK en un bioensayo in vitro. La fusión de KGF-IgG-Fc también tenía una afinidad aproximadamente 10 veces menor por el receptor de KGF en células que el KGF. Se construyó una fusión de factor de crecimiento de fibroblastos-IgG-Fc humana por Dikov et al. (1998). En una base molar, la proteína de fusión de FGF-IgG1-Fc era aproximadamente 3 veces menos activa que el FGF en ensayos in vitro en la estimulación de la síntesis de ADN en células NIH 3T3. Shin y Morrison (1990) fusionaron IGF-I en el extremo C terminal de IgG y descubrieron que la proteína de fusión de IGF-I-IgG C-terminal tenía menos del 1% de la actividad biológica in vitro de IGF-I.

Los ejemplos de citoquinas que se han fusionado con dominios de IgG incluyen IL-2, IL-4, IL-10 y GM-CSF. Landolphi (1991; 1994) describió una proteína de fusión de IL-2-IgG1-C_{H}, que incluía una serina adicional entre el extremo C terminal de IL-2 y el extremo N terminal del dominio IgG-C_{H}. Se pretendía que la proteína de fusión de IL-2-IgG1-C_{H} fuera tan activa, en una base molar en bioensayos in vitro, como IL-2, pero no se proporcionaron detalles de cómo se cuantificaron las concentraciones de proteína (Landolphi, 1991; 1994). Zeng et al. (1995) fusionaron IL-10 de ratón directamente en la región Fc de la IgG2a de ratón; sin embargo, el primer aminoácido de la región bisagra de Fc se cambió de Glu a Asp. Zeng et al (1995) describieron que la proteína de fusión de IL-10-IgG2a era completamente activa en bioensayos in vitro; sin embargo, solamente se estudiaron dos concentraciones de la proteína de fusión, siendo ambas saturantes. Dadas estas elevadas concentraciones de proteína, solamente se podían haber detectado diferencias enormes (por ejemplo, de 100 veces) en las bioactividades entre la proteína de fusión de 1L-10-IgG2a de ratón e IL-10. Para detectar diferencias menores en bioactividades se necesita analizar diluciones seriadas de las proteínas en bioensayos in vitro y calcular las CE_{50} (la concentración de proteína necesaria para la mitad de la estimulación máxima) o CI_{50} (la concentración de proteína necesaria para la mitad de la inhibición máxima). Las CE_{50} de la IL-10-IgG2a e IL-10 no se describieron por Zheng et al. (1995). Chen et al. (1994) también construyeron una proteína de fusión de IL-2-IgG y describieron que esta proteína de fusión era completamente activa. Gillies et al. (1993) también describieron la generación de una proteína de fusión de IL-2 completamente activa que comprendía IL-2 fusionada con el extremo C-terminal de un anticuerpo IgG antigangliósido. Inesperadamente, Gillies et al. (1993) descubrieron que una fusión entre el mismo anticuerpo y GM-CSF presentaba solamente el 20% de bioactividad de GM-CSF de tipo salvaje. Chen et al. (1994) fueron capaces de generar una proteína de fusión de IgG-C-terminal-GM-CSF completamente activa insertando cuatro aminoácidos entre la molécula de anticuerpo y GM-CSF. Inesperadamente, describieron que la fusión de IL-4 para el mismo anticuerpo usando el mismo enlazador de cuatro aminoácidos dio como resultado una proteína IL-4 con una actividad biológica reducida 25 veces (Chen et al., 1994).

Qiu et al. (1998) describieron proteínas de eritropoyetina (EPO) homodimérica en los que dos proteínas EPO se fusionaron entre sí usando enlazadores peptídicos flexibles de 3-7 restos de glicina. El enlazador peptídico unió el extremo C de una proteína EPO con el extremo N-terminal de la segunda proteína EPO. Las bioactividades in vitro de las proteínas de fusión se redujeron significativamente (al menos de 4 a 10 veces) con respecto a la EPO de tipo salvaje (Qiu et al., 1998).

Por tanto, la bibliografía indica que los aminoácidos en la unión entre el dominio de factor de crecimiento/citoquina y el dominio de IgG pueden tener una profunda influencia sobre la actividad biológica del factor de crecimiento/citoquina fusionado.

Para el uso como terapéuticos en seres humanos, es deseable que la bioactividad de una proteína de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgG sea tan próxima a la de tipo salvaje, es decir, la proteína no fusionada, como sea posible. Las proteínas de fusión con alta actividad pueden producir mayores beneficios terapéuticos a dosis menores que las proteínas de fusión con menores actividades específicas. Esto reducirá el coste de medicinas y proporcionará a los pacientes mayores beneficios terapéuticos. Para el uso como un agente terapéutico en seres humanos también es ventajoso que la proteína sea tan homogénea y pura como sea posible. Las proteínas de fusión de Ig se sintetizan como monómeros, que se pueden ensamblar para formar dímeros unidos por enlaces disulfuro y tetrámeros, dependiendo del tipo de proteína de fusión. Las proporciones relativas de monómeros, dímeros y tetrámeros pueden variar de un lote a otro, dependiendo de las condiciones de fabricación. La variabilidad entre lotes puede dar como resultado mezclas de producto heterogéneas con actividades variables. Debido a su mayor tamaño, se espera que los tetrámeros tengan vidas medias circulantes más prolongadas en el cuerpo que los dímeros o monómeros y se espera que los dímeros tengan vidas medias circulantes más prolongadas que los monómeros. Por esta razón, los tetrámeros, dímeros y monómeros pueden producir diferentes efectos terapéuticos in vivo. Se prefieren preparaciones homogéneas purificadas de tetrámeros, dímeros o monómeros como terapéuticos porque tendrán actividades específicas definidas. Para el uso como terapéuticos en seres humanos también puede ser beneficioso mantener la longitud de cualquier secuencia enlazadora que una el dominio de factor de crecimiento/citoquina o el dominio de Ig en el mínimo para reducir la posibilidad de desarrollar una respuesta inmune contra los aminoácidos no naturales en la secuencia enlazadora. La unión de las dos proteínas sin una secuencia enlazadora intermedia, denominada en este documento una "fusión directa", elimina la posibilidad de desarrollar una respuesta inmune contra un enlazador no natural y, por tanto, es una forma preferida de una proteína de fusión de Ig.

La bibliografía sobre proteínas de fusión de Ig simplemente proporciona ejemplos para preparar una proteína de fusión "no directa" de citoquina/factor de crecimiento-Ig, es decir, proteínas de fusión en las que el factor de crecimiento/citoquina se une con un dominio de Ig a través de un enlazador peptídico. El documento WO 99/02709 proporciona ejemplos para unir EPO con un dominio de Ig usando un sitio de enzima de restricción Bam HI para unir secuencias de ADN que codifican las proteínas. Este procedimiento puede usarse para generar proteínas de fusión de EPO-Ig que contienen enlazadores. Debido a que Bam HI tiene una secuencia de reconocimiento de ADN específica, GGATCC, que no está presente en las uniones de la EPO o las regiones constantes Ig-Fc, Ig-C_{H} o de la cadena ligera, este procedimiento no es útil para construir fusiones directas de EPO-Ig.

El documento EP 0464533A proporciona ejemplos para preparar proteínas de fusión de Ig que contienen el enlazador de tres aminoácidos específicos, AspProGlu, entre la citoquina y los dominios de Ig. Los procedimientos descritos en el documento EP 0464533A dependen del corte y empalme del ARN de exones separados que codifican la citoquina y el dominio de Ig para generar la proteína de fusión. El enlazador AspProGlu era necesario en el extremo de la región codificante de citoquina/factor de crecimiento debido a que la reacción de corte y empalme del ARN tiene requerimientos de secuencia específicos en el sitio de corte y empalme; el enlazador AspProGlu está codificado por nucleótidos que pueden permitir que se produzca el corte y empalme del ARN. El documento EP proporciona un ejemplo para preparar una proteína de fusión de EPO-Ig que contiene un enlazador AspProGlu usando este procedimiento. La región codificante de EPO se modificó para delecionar la Arg166 y añadir el enlazador aminoacídico, ProGlu, inmediatamente después de Asp165 de la secuencia codificante de EPO. Esto dio como resultado la generación de una proteína de fusión de EPO-Ig que contenía un enlazador AspProGlu (el Asp165 de la secuencia codificante de EPO proporcionaba el Asp de la secuencia enlazadora). Los procedimientos descritos por el documento EP 0464533A, por lo tanto, no son útiles para generar fusiones directas de Ig o fusiones de Ig que no contienen enlazadores AspProGlu o ProGlu.

La Patente de Estados Unidos Nº 5.349.053 describe procedimientos para generar una proteína de fusión de IL-2-IgG-C_{H} que contiene un enlazador de Ser entre la IL-2 y los dominios de Ig. Los procedimientos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.349.053 dependen del corte y empalme del ARN de exones separados que codifican la IL-2 y el dominio IgG-C_{H}. Debido a que la reacción de corte y empalme del ARN tiene requerimientos de secuencia específicos en el sitio de corte y empalme, la región codificante de IL-2 tenía que modificarse para añadir un codón TCA que codifica serina en el extremo carboxiterminal de la región codificante de IL-2. El codón TCA se modificó por ingeniería genética para que estuviera seguido por una secuencia de unión de corte y empalme de intrones. Esto dio como resultado la generación de una proteína de fusión de IL-2-IgG-C_{H} que contenía un enlazador de Ser. Los procedimientos descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.349.053 no son útiles para generar fusiones directas de citoquina/factor de crecimiento-Ig o fusiones de citoquina/factor de crecimiento de Ig que no contienen un enlazador de Ser.

Se contemplan proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgG, incluyendo las proteínas de fusión de EPO-IgG y G-CSF-IgG, en los documentos EP 0 464 533 A, WO99/02709 y Landolphi (1991; 1994). Ninguna de estas referencias presenta ningún dato con respecto a la expresión, purificación y a las bioactividades de las proteínas de fusión EPO-IgG y G-CSF-IgG contempladas. Landolphi (1991; 1994) presenta datos de actividad para una proteína de fusión de IL-2-IgG1-C_{H}, pero no para ninguna otra proteína de fusión de IgG. La proteína de fusión de EPO-IgG1-Fc contemplada por el documento EP 0 464 533 A contiene el enlazador de dos aminoácidos, ProGlu, entre el Asp 165 de la secuencia codificante de EPO y el comienzo de la región bisagra de IgG1-Fc. El aminoácido carboxiterminal en EPO, Arg166, se delecionaría. El documento EP 0 464 533 A no proporciona ninguna información de cómo se uniría la región codificante de G-CSF a la región bisagra de IgG1-Fc. No se proporcionan datos de bioactividad para ninguna de las dos proteínas en el documento EP 0 464 533. El documento WO 99/02709 describe una proteína de fusión EPO-IgG2a-Fc de ratón, pero no una proteína de fusión de EPO-IgG humana. No se presentan datos de bioactividad para la proteína de fusión de EPO-IgG2a-Fc de ratón. El documento WO 99/02709 tampoco proporciona detalles con respecto a la procedencia del ADNc de EPO o de los genes de IgG humana usados para construir las proteínas de fusión contempladas o de los aminoácidos concretos usados para unir la EPO al dominio de IgG. La referencia citada en el documento WO 99/02709 (Steurer et al., 1995) tampoco proporciona esta información.

El documento WO 99/02709 postula que se puede usar un enlazador peptídico flexible de 1-20 aminoácidos para unir la EPO con un dominio de Ig; sin embargo, no se especifican los aminoácidos a usar para generar los enlazadores flexibles en el documento WO 99/02709. Qiu et al. (1998) describieron que proteínas de fusión de EPO unidas por enlazadores flexibles de 3-7 restos de glicina tienen actividades biológicas significativamente reducidas (4-10 veces) con respecto a la EPO de tipo salvaje.

El documento WO 99/02709 proporciona procedimientos para usar medios acondicionados de plásmidos que se habían introducido por transfección en células COS que codifican proteínas de fusión hipotéticas EPO-IgG para aumentar el hematocrito de un ratón. Tales medios acondicionados contendrán mezclas de proteínas de fusión monoméricas y diméricas de EPO-IgG así como muchas otras proteínas. El documento WO 99/02709 no proporcionan ninguna evidencia que demuestre que los procedimientos descritos son eficaces.

Por tanto, a pesar de un esfuerzo considerable, todavía existe la necesidad de procedimientos mejorados para generar proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-Ig, directamente o con una diversidad de tipos de enlazadores diferentes, que conserven la actividad biológica del dominio de factor de crecimiento/citoquina de la proteína de fusión de Ig. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona ventajas relacionadas.

Breve descripción del dibujo

La Figura 1 es un diagrama que muestra la amplificación de dos fragmentos de ADN (CH1-Bisagra y Bisagra-CH2-CH3) que comparten una región de solapamiento parcial (una porción de la región Bisagra) usando PCR y los cebadores oligonucleotídicos a y b para generar un fragmento de ADN de mayor tamaño que incluye CH1-Bisagra-CH2-CH3.

Resumen de la invención

La presente invención describe nuevas proteínas de fusión de Ig en las que una proteína soluble se une directamente a un dominio de Ig o mediante un enlazador aminoacídico que no sea AspProGlu o Ser. La proteína soluble es un factor de crecimiento, una citoquina o una variante activa de un factor de crecimiento o citoquina. Los enlazadores útiles incluyen una mezcla de restos de Glicina y Serina, preferiblemente SerGly y Ser(GlyGlySer)_{n} (SEC ID Nº: 1), donde n puede ser 1-7. El dominio de Ig incluye preferiblemente la región constante y se selecciona preferiblemente de IgG-Fc, IgG-C_{H} o C_{L}. Los ejemplos de factores de crecimiento y citoquinas y sus fragmentos activos que conservan sustancialmente la actividad biológica de las proteínas no fusionadas cuando se unen a dominios de Ig como fusiones directas o a través de estas secuencias enlazadoras incluyen miembros de la familia de supergenes de hormona de crecimiento (GH) tales como, por ejemplo, G-CSF, EPO, GH, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, GM-CSF, IL-11, TPO, SCF y ligando Flt3.

Por ejemplo, las proteínas de fusión de EPO-IgG-Fc y las proteínas de fusión de G-CSF-IgG-Fc tienen actividades biológicas, en una base molar, equivalentes a EPO y G-CSF sin fusionar. Las fusiones de IgG-C_{H} de EPO y G-CSF tienen sorprendentemente actividades biológicas in vitro en el intervalo de 2-4-veces las de EPO y G-CSF sin fusionar. Las proteínas de fusión de Hormona de Crecimiento-IgG-Fc y Hormona de Crecimiento-IgG-C_{H} tienen inesperadamente actividades biológicas en el intervalo de 4 a 17 veces las de la Hormona de Crecimiento sin fusionar. De forma similar, también se proporcionan construcciones de fusión de IgG-Fc, IgG-C_{H} e Ig-C_{L} biológicamente activas usando IFN-\alpha2 e IFN-\beta.

Las fusiones de IgG-Fc de EPO, G-CSF y Hormona de Crecimiento son más activas que fusiones de IgG-C_{H} idénticas de estos factores de crecimiento/citoquinas. Las fusiones de Ig-C_{L} de IFN-\alpha son más activas que las fusiones de IgG-Fc o IgG-C_{H} idénticas de IFN-\alpha. También fueron inesperadas las diferencias de bioactividad entre proteínas de fusión de IgG-Fc, IgG-C_{H} e Ig-C_{L}. Además, actualmente se han identificado sitios preferidos para construir proteínas de fusión de EPO-IgG, G-CSF-IgG, Hormona de Crecimiento-IgG e IFN-\alpha-Ig que maximizan la bioactividad de los dominios de EPO, G-CSF, Hormona de Crecimiento e IFN-\alpha fusionados.

La invención proporciona además nuevas proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-Ig novedosas que comprenden multímeros de proteínas de fusión de cadena pesada y ligera, así como procedimientos para generar preparaciones de proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-Ig diméricas que estén esencialmente libres de proteínas de fusión monoméricas, agregados y proteínas contaminantes. La expresión "esencialmente libre" se usa en este documento para referirse a una pureza de al menos el 90%. La invención también proporciona nuevos factores de crecimiento/citoquinas multiméricos en los que se unen dos o más citoquinas/factores de crecimiento como fusiones directas o usando un enlazador aminoacídico.

También se proporcionan métodos de tratamiento de diversas afecciones en los que se administra una cantidad eficaz de una proteína de fusión de Ig de la presente invención a un paciente que necesita dicha terapia.

Descripción detallada de la invención

En el trabajo que se describe en este documento, se ha descubierto ahora que las bioactividades de proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-Ig pueden variar dependiendo del isotipo del dominio de IgG, cuando el factor de crecimiento/citoquina está unido al dominio de IgG, tanto si la proteína está unida a la región constante de una cadena ligera de Ig o a una cadena pesada de Ig. Estos resultados no se predijeron a partir de la bibliografía. Aunque sin desear ligarse a ninguna teoría en particular, los inventores postulan que la variabilidad de bioactividad que observaron puede estar relacionada con la flexibilidad y otras propiedades físicas de la región en el dominio de Ig usado para unirse a las proteínas de fusión. Basándose en estos descubrimientos, se piensa que la bioactividad de una proteína de fusión de Ig generada usando dominios de Ig de ratón no puede usarse para predecir la bioactividad de una proteína de fusión de Ig generada usando dominios de Ig humanos.

Por consiguiente, la invención se refiere generalmente a nuevos procedimientos para construir proteínas de fusión de Ig que comprenden una proteína soluble unida a un dominio de Ig y a las nuevas proteínas de fusión de Ig obtenidas mediante los procedimientos. Los procedimientos implican la unión de una proteína soluble a un dominio de Ig como una fusión directa o con un enlazador aminoacídico intermedio.

Los procedimientos de la presente invención son útiles para construir proteínas de fusión de Ig que contienen uno o más factores de crecimiento y/o citoquinas, incluyendo, sin limitación, EPO, Hormona de Crecimiento (GH), G-CSF, IL-11, trombopoyetina (TPO), Factor de Células Madre, Ligando Flt3, GM-CSF e interferón, especialmente alfa, beta y gamma. Otras proteínas para las que son útiles los procedimientos incluyen otros miembros de la familia de supergenes de GH. Los miembros de la familia de supergenes de GH incluyen GH, prolactina, lactógeno placentario, eritropoyetina (EPO), trombopoyetina (EPO), interleuquina-2 (IL-2), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 (subunidad p35), IL-13, IL-15, oncostatina M, factor neurotrófico ciliar, factor inhibidor de leucemia, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interferón omega, interferón tau, factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), cardiotrofina-1 (CT-1), Factor de Células Madre y el ligando flt3/flk2 (Bazan (1990; 1991; 1992; Mott y Campbell (1995); Silvennoinen e Ihle (1996); Martin et al., 1990; Hannum et al., 1994). Se espera que en el futuro se identificarán miembros adicionales de esta familia de genes a través de clonación y secuenciación de genes. Los miembros de la familia de supergenes de GH tienen estructuras secundarias y terciarias similares, a pesar del hecho de que generalmente tienen una identidad de secuencia de aminoácidos o de ADN limitada. Las características estructurales compartidas de miembros de la familia de supergenes de GH, que se describen en Bazan (1990; 1991; 1992), Mott y Campbell (1995) y Silvennoinen e Ihle (1996), permiten identificar fácilmente nuevos miembros de la familia de genes. Los procedimientos descritos en este documento también son útiles para generar proteínas de fusión de Ig con proteínas que normalmente son solubles y que no son miembros de la familia de supergenes de GH. También pueden usarse variantes activas de estas proteínas en la construcción de las proteínas de fusión de Ig de la presente invención. La expresión "variante activa" se refiere a un fragmento de una proteína soluble que conserva sustancialmente la actividad biológica de la proteína de longitud completa y se describe con más detalle a continuación.

Los procedimientos descritos en este documento también pueden usarse para unir un factor de crecimiento/citoqui-
na con un dominio de Ig usando un enlazador de cualquier secuencia de aminoácidos y de cualquier longitud, siempre que los enlazadores no sean AspProGlu o Ser. Los enlazadores preferidos tienen 1-50 aminoácidos de longitud y, más preferiblemente, 1-22 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, el enlazador no afectará desfavorablemente a la bioactividad del factor de crecimiento/citoquina o del dominio de Ig. Los enlazadores preferidos contienen mezclas de restos de glicina y serina. Otros aminoácidos que se podrían incorporar en enlazadores útiles incluyen restos de treonina y alanina. Un enlazador preferido descrito en este documento es el enlazador de dos aminoácidos SerGly. Otros enlazadores preferidos descritos en este documento son enlazadores del motivo Ser(GlyGlySer)_{n} (SEC ID Nº: 1), donde n puede ser 1-7.

Los dominios de Ig de la presente invención incluyen la región constante tal como, por ejemplo, una IgG-Fc, IgG-C_{H}, un dominio Fc o C_{H} de otra clase de Ig, es decir, IgM, IgA, IgE, IgD o un dominio constante de la cadena ligera. En esta invención también se incluyen truncamientos y variantes aminoacídicas o sustituciones de estos dominios.

En otro aspecto de la invención, las proteínas de fusión de IgG-Fc e IgG-C_{H}, por ejemplo, se sintetizan como monómeros que se pueden ensamblar para formar dímeros. Típicamente, los dímeros se unen mediante enlaces disulfuro en la región Bisagra de IgG. Los medios acondicionados de células que secretan las proteínas de fusión de IgG pueden contener mezclas de monómeros y dímeros de proteína de fusión de IgG. Para el uso como terapéuticos en seres humanos, será deseable usar poblaciones homogéneas de monómeros o dímeros de proteína de fusión de IgG, pero no mezclas de ambas formas. También se proporcionan procedimientos para obtener preparaciones esencialmente puras de proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgG diméricas. Los procedimientos se llevan a cabo generalmente por obtención de una célula hospedadora capaz de expresar la proteína de fusión de IgG, recogida de los medios acondicionados y purificación de la proteína de fusión dimérica de la proteína de fusión monomérica, agregados y proteínas contaminantes mediante procedimientos de cromatografía en columna. Las células hospedadoras adecuadas para expresar las proteínas de fusión de IgG incluyen células de levadura, insecto, mamífero u otras células eucariotas. Preferiblemente, la célula hospedadora es una célula de mamífero, particularmente células COS o
CHO.

En una realización, la EPO se une directamente a un dominio de Ig-Fc, por ejemplo, un dominio de IgG-Fc, y tiene una CE_{50} inferior a 1.000 ng/ml, preferiblemente inferior a 100 ng/ml, más preferiblemente inferior a 10 ng/ml y, lo más preferiblemente, inferior a 4 ng/ml. En otra realización, la EPO se une preferiblemente a un dominio de IgG-Fc o IgG-C_{H} a través de un enlazador peptídico de 2 a 7 aminoácidos y tiene una CE_{50} inferior a 1.000 ng/ml, preferiblemente inferior a 100 ng/ml, más preferiblemente inferior a 10 ng/ml y, lo más preferiblemente, inferior a 4 ng/ml.

Actualmente se ha descubierto que las proteínas de fusión de GH-, EPO- y G-CSF-IgG-C_{H} purificadas tienen actividades específicas reducidas en ensayos biológicos in vitro en comparación con las proteínas sin fusionar y con las proteínas de fusión de IgG-Fc. La invención proporciona además nuevas proteínas de fusión de IgG-C_{H}/dominio constante de la cadena ligera de Ig multiméricas con actividades biológicas mejoradas. La invención también se refiere a proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgG en las que el dominio de IgG se ha modificado para reducir su capacidad para activar el complemento y unirse a receptores de Fc. La modificación del dominio de IgG con este fin se describe en el Ejemplo 6 a continuación.

También se proporcionan nuevas proteínas de fusión de factor de crecimiento y/o citoquina multiméricas. Dos o más factores de crecimiento y/o citoquinas se unen directamente entre sí sin un enlazador peptídico intermedio. En otra realización, dos o más factores de crecimiento y/o citoquinas se unen entre sí a través de un enlazador peptídico de 1 a 50 aminoácidos y, más preferiblemente, a través de un enlazador peptídico de 1 a 7 aminoácidos. Los enlazadores particularmente útiles con este fin incluyen SerGly y Ser(GlyGlySer)_{n} (SEC ID Nº: 1), donde n puede ser 1-7.

Esta invención incluye variantes activas de las proteínas y dominios de inmunoglobulina que poseen algunas o todas las propiedades biológicas correspondientes de las proteínas o dominios de inmunoglobulina de longitud completa o de tipo salvaje. Dichas variantes incluyen, pero sin limitación, variantes aminoacídicas, sustituciones de aminoácidos, truncamientos, adiciones, cambios en carbohidratos, fosforilación u otros grupos unidos que se encuentran en proteínas naturales y cualquier otra variante descrita en este documento. En algunos casos, las variantes pueden poseer propiedades adicionales, por ejemplo, una estabilidad o bioactividad mejorada, no compartidas por la proteína original. Por ejemplo, Mark et al. (1984) describen una muteína de IFN-\beta en la que la cisteína en la posición 17 se sustituye por serina. El IFN-\beta (Ser-17) presenta una estabilidad mejorada con respecto al IFN-\beta de tipo salvaje. De forma similar, la sustitución de la cisteína-125 de IL-2 produce una proteína IL-2 más estable (Landolphi, 1991; 1994). Lu et al. (1992) describen una muteína de G-CSF en la que la cisteína en la posición 17 se sustituye por serina. Kuga et al. (1989), Hanazono et al. (1990) y Okabe et al. (1990) describen muteínas de G-CSF adicionales con propiedades biológicas mejoradas. Elliot y Byrne (1995) han descrito mutantes de EPO con actividades biológicas mejoradas.

También se proporcionan procedimientos de producción y purificación de las proteínas de fusión de Ig. Generalmente dichos procedimientos se llevan a cabo mediante la obtención de una célula hospedadora transformada o transfectada con al menos un ácido nucleico que codifique un factor de crecimiento o una citoquina que no sea IL-10 y un dominio de Ig. La célula hospedadora se cultiva hasta que se expresa la proteína de fusión deseada, seguido de la purificación o aislamiento de la proteína de fusión de Ig mediante cualquier medio conocido en la técnica o como se describe en los Ejemplos a continuación. En una realización, los procedimientos de purificación de las proteínas de fusión incluyen obtener una composición que contiene proteínas de fusión de Ig producidas de forma recombinante y aislar las proteínas de fusión de Ig deseadas de diversos contaminantes usando procedimientos de cromatografía en columna, por ejemplo, una columna de separación por tamaño con un límite de peso molecular deseado. La célula hospedadora puede ser cualquier línea celular procariota o eucariota adecuada conocida por los expertos en la técnica, incluyendo, sin limitación, células bacterianas, de insecto o de mamífero. Son células particularmente útiles células eucariotas, preferiblemente células de mamífero y, más preferiblemente, células COS o CHO.

Las proteínas de fusión de Ig producidas mediante los presentes procedimientos se pueden usar para una diversidad de usos in vitro e in vivo. Las proteínas de la presente invención se pueden usar para los fines de investigación, de diagnóstico o terapéuticos que se conocen para sus homólogas de tipo salvaje, naturales o modificadas conocidas previamente.

Los usos in vitro incluyen, por ejemplo, el uso de la proteína para seleccionar, detectar y/o purificar otras proteínas. Las proteínas de fusión de Ig descritas en este documento también son útiles como reactivos de diagnóstico para identificar células que expresan receptores para EPO, G-CSF y GH, GM-CSF, IL-11, TPO, SCF, ligando Flt3 e interferón alfa, beta y gamma. Las proteínas de fusión de Ig también son útiles como reactivos in vitro para estudiar la proliferación y diferenciación celular.

Las proteínas de fusión de Ig descritas en este documento se pueden usar para tratar las mismas afecciones humanas que las proteínas sin fusionar. Por ejemplo, las proteínas de fusión de EPO-IgG se pueden usar para tratar la anemia que produce como resultado de una insuficiencia renal, quimioterapia, radiación y complicaciones farmacológicas. Las proteínas de fusión de EPO-IgG también pueden usarse para estimular la formación de glóbulos rojos en individuos normales que deseen aumentar su recuento de glóbulos rojos o hematocrito antes de una cirugía. Las proteínas de fusión de G-CSF-IgG se pueden usar para tratar la neutropenia que se produce como resultado de quimioterapia, radiación y complicaciones farmacológicas, para la movilización de células progenitoras para recogida en trasplantes de células progenitoras de sangre periférica y para el tratamiento de una neutropenia crónica grave. Las proteínas de fusión de GH-IgG se pueden usar para tratar la talla baja y la caquexia. Las proteínas de fusión de IFN-\alpha-IgG se pueden usar para tratar enfermedades víricas y cáncer. La proteína de fusión de IFN-\beta-IgG se puede usar para tratar la esclerosis múltiple, enfermedades víricas y cáncer. Las proteínas de fusión de GM-CSF-IgG se pueden usar para tratar la neutropenia que se produce como resultado de quimioterapia, radiación y complicaciones farmacológicas, para la movilización de células progenitoras para recogida en trasplantes de células progenitoras de sangre periférica, para el tratamiento de una neutropenia crónica grave y como adyuvante para vacunas contra el cáncer. Las proteínas de fusión de SCF-IgG y de ligando Flt3-IgG se pueden usar para movilizar células progenitoras hematopoyéticas para recogida en trasplantes de células progenitoras de sangre periférica. Las proteínas de fusión de IL-11-IgG y de TPO-IgG se pueden usar para tratar la trombocitopenia.

Las proteínas de fusión de Ig descritas en este documento poseerán vidas medias circulantes más prolongadas en pacientes, que permitirán que las proteínas de fusión se administren menos frecuentemente y/o en dosis eficaces menores que las proteínas sin fusionar. Típicamente, la GH y el G-CSF se administran mediante inyecciones diarias y la EPO se administra mediante inyecciones tres veces por semana. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente la dosis, la frecuencia de dosificación y la vía de administración adecuadas. Los factores en la realización de dichas determinaciones incluyen, sin limitación, la naturaleza y la actividad específica de la proteína que se va a administrar, la afección a tratar, la conformidad potencial del paciente, la edad y el peso del paciente y similares. Los compuestos de la presente invención también se pueden usar como vehículos de administración para mejorar la vida media circulante de los terapéuticos que están unidos o para dirigir la administración a una diana específica dentro del cuerpo.

También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen las proteínas de fusión de Ig de la presente invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica pueden identificar fácilmente dichos vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen, sin limitación, solución salina fisiológica, solución de Ringer y similares. También pueden incluirse otros agentes en las composiciones farmacéuticas, incluyendo fármacos, reactivos y agentes terapéuticos.

En los siguientes ejemplos, que tienen por objeto ilustrar sin limitar la presente invención, se proporcionan procedimientos detallados para construir las proteínas de fusión de Ig de la presente invención.

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Ejemplo 1 y ejemplos comparativos

Construcción de Fusiones de Genes de Factor de crecimiento/Citoquina-IgG A. Estrategia General

Se construyeron fusiones de genes de factor de crecimiento/citoquina (GF)-IgG como se describe a continuación. Se describe aquí la estrategia general empleada para estas construcciones y los aspectos concretos de las etapas de clonación individuales se detallan a continuación. La clonación de la secuencia codificante de IgG4-C_{H} implicó variaciones adicionales a la estrategia general y estas variaciones se describen a continuación. Los genes de factores de crecimiento humano (GH, EPO y G-CSF) se clonaron como ADNc de diversas fuentes de ARN que se detallan a continuación. Los cebadores de PCR usados en estas clonaciones añadían una secuencia de Kozak optimizada (GCCACC; Kozak, 1991) y un sitio de restricción Hind III en el extremo 5' de cada uno de estos clones y una porción de un enlazador peptídico (ser-gly-gly-ser) (SEC ID Nº: 1) que termina en un sitio de restricción Bam HI en el extremo 3' de cada uno de estos clones. Los genes de factores de crecimiento se clonaron como fragmentos Hind III-Bam HI en el vector de expresión de células de mamífero pCDNA3.1 (+) (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y se secuenciaron. En paralelo, se clonaron secuencias codificantes de IgG (IgG1-Fc, IgG1-C_{H}, IgG4-Fc, IgG4-C_{H}) de ADNc generados a partir de ARN de leucocitos humanos. Los cebadores directos de PCR usados en estas clonaciones incorporaban una porción de un enlazador peptídico (gly-ser-gly-gly-ser) (SEC ID Nº: 2) que contenía un sitio de restricción Bam HI en el extremo 5' de cada uno de estos clones. Los cebadores de PCR inversos se diseñaron para hibridar en las regiones no traducidas 3' de los ARNm de IgG1 e IgG4 (aproximadamente 40 pb cadena abajo del codón de terminación de la traducción) e incluían un sitio de restricción Xba I. Las secuencias codificantes de IgG se clonaron en pCDNA3.1 (+) como fragmentos Bam HI-Xba I y se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Después, se construyeron los genes de fusión por escisión de las secuencias codificantes de IgG como fragmentos Bam HI-Xba I y clonación de estos fragmentos en los plásmidos recombinantes pCDNA::GF que se habían cortado con Bam HI y Xba I. En las construcciones de pCDNA3.1 resultantes, los genes de fusión se transcriben por el promotor fuerte temprano inmediato de citomegalovirus presente en pCDNA3.1(+) cadena arriba del gen de fusión clonado. La ligación de los dos fragmentos por el sitio Bam HI dentro de la secuencia enlazadora da como resultado un enlazador de siete aminoácidos (ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser) (SEC ID Nº: 3) en la unión de fusión.

B. Clonación de Hormona de Crecimiento, EPO y G-CSF

1. Clonación de Hormona de Crecimiento humana: Se amplificó un ADNc que codifica la Hormona de Crecimiento humana (GH) a partir de ADNc monocatenario de hipófisis humana (CLONTECH, Inc., Palo Alto, CA), usando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los cebadores BB87 (5>GCAAGCTTGCCACCATGGCTACAG
GCTCCCGGACG>3) (SEC ID Nº: 4) y BB88 (5>CGCGGATCCTCCGGAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC>3) (SEC ID Nº: 5). El cebador BB87 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante para la señal de secreción de hGH, mientras que el cebador inverso, BB88, hibrida en el extremo 3' de la secuencia codificante de GH. El producto PCR de -680 pb resultante se digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel y se clonó en vector pCDNA3.1(+) (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) que se había digerido con HindIII y BamHI, se trató con fosfatasa alcalina y se purificó en gel. Un clon con la secuencia de ADN correcta (Martial et al., 1979; Roskam y Rougeon, 1979; Seeburg, 1982; DeNoto et al., 1981) se denominó pCDNA3.1(+)::GHfus o pBBT159.

2. Clonación de Eritropoyetina humana. Se clonó un ADNc que codifica eritropoyetina (EPO) humana mediante PCR usando el cebador directo BB45 (5>CCCGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG>3) (SEC ID Nº: 6) y el cebador inverso BB47 (5>CCCGAATTCTATGCCCAGGTGGACACACCTG>3) (SEC ID Nº: 7). BB45 hibrida con la secuencia de ADN que codifica la metionina iniciadora y la porción aminoterminal de la secuencia señal de EPO y contiene un sitio Bam HI con fines de clonación. BB47 hibrida en la región no traducida 3' del ARNm de EPO inmediatamente cadena abajo de la señal de terminación de la traducción y contiene un sitio de restricción Eco RI para fines de clonación. Se usó el ARN total aislado a partir de la línea celular hepática humana Hep3B en la síntesis de la primera cadena de ADNc monocatenario para PCR. Para la preparación del ARN celular total se cultivaron células Hep3B (disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD) en medio de Eagle modificado por Delbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino al 10% (FBS). Se indujo la expresión de EPO mediante el tratamiento de las células durante 18 h con Deferoxamina 130 \muM o cloruro de cobalto 100 \muM (Wang y Semenza, 1993). Se aisló el ARN de las células usando un RNeasy Mini kit (Qiagen, Santa Clarita, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aislaron aproximadamente 320 \mug de ARN total a partir de 1,4 x 10^{7} células tratadas con cloruro de cobalto y 270 \mug de ARN total aislado a partir de 1,4 x 10^{7} células tratadas con Deferoxamina.

Se consiguió la síntesis de la primera cadena de ADNc monocatenario usando un Kit de Síntesis de ADNc de 1ª Cadena para RT-PCR (AMV) de Boehringer Mannheim Corporation (Indianapolis, IN) y se usaron hexámeros aleatorios como el cebador. Se realizaron reacciones de PCR posteriores usando los productos de las síntesis de primera cadena como moldes con los cebadores BB45 y BB47. Se observó el producto de PCR esperado de aproximadamente (-) 600 pb cuando los productos de reacción se procesaron en un gel de agarosa. Ambas preparaciones de ARN produjeron un producto de PCR de EPO. El producto de PCR se digirió con Bam HI y Eco RI y se clonó en el vector pUC19 que se había cortado con Bam HI y Eco RI y tratado con fosfatasa alcalina. La secuenciación de ADN identificó un clon que contenía la secuencia codificante correcta para el gen de EPO. Este plásmido se denominó pBBT131.

Se usó el plásmido pBBT131 como molde en una reacción de PCR con los cebadores BB89 (5>CGCAAGCTTGC
CACCATGGGGGTGCACGAATGTCCT>3) (SEC ID Nº: 8) y BB90 (5>CGCGGATCCTCCGGATCTGTCCCCTG
TCCTGCAGGC>3) (SEC ID Nº: 9) para construir un ADNc de EPO modificado adecuado para la fusión con genes de IgG. El cebador BB89 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante para la señal de secreción de EPO y el cebador inverso, BB90, hibrida en el extremo 3' de la secuencia codificante de EPO. El producto de PCR de -610 pb resultante se digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel y se clonó en vector pCDNA3.1(+) que se había digerido con Hind III y Bam HI, tratado con fosfatasa alcalina y purificado en gel. Un clon con la secuencia de ADN correcta (Lin et al., 1985) se denominó pCDNA3.1(+)::EPOfus o pBBT176.

Se pueden usar procedimientos similares para generar ADNc de EPO modificados en los que se deleciona la Arg166. En este caso, se puede usar un cebador con la secuencia (5>CGCGGATCCTCCGGATCTGTCCCCTGTCC
TGCAGGCCTC>3) (SEC ID Nº: 10) en lugar del cebador BB90.

3. Clonación de Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos Humano. Se amplificó un ADNc que codifica el Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos humano (G-CSF) mediante PCR a partir del ARN total aislado de la línea celular de carcinoma de vejiga humano 5637 (disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD). Las células se cultivaron en medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml. Se aisló el ARN de las células usando un kit de aislamiento de ARN RNeasy Mini adquirido de Qiagen, Inc. (Santa Clarita, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aislaron aproximadamente 560 \mug de ARN total de 4,5 x 10^{7} células. Se consiguió la síntesis de la primera cadena de ADNc monocatenario usando un Kit de Síntesis de ADNc de 1ª Cadena para RT-PCR (AMV) de Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN) y se usaron hexámeros aleatorios como el cebador. Se realizaron reacciones de PCR posteriores usando los productos de las síntesis de primera cadena como molde con el cebador directo BB91 (5>CGCAAGCTTGCCACCATGGCTGGACCTGCCACCCAG>3) (SEC ID Nº: 11) y el cebador inverso BB92 (5>CGCGGATCCTCCGGAGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG>3) (SEC ID Nº: 12). El cebador BB91 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante para la señal de secreción de G-CSF y el cebador inverso, BB92, hibrida en el extremo 3' de la secuencia codificante de G-CSF. El producto de PCR de -640 pb resultante se digirió con Hind III y Bam HI, se purificó en gel y se clonó en el vector pCDNA3.1(+) que se había digerido con Hind III y Bam HI, tratado con fosfatasa alcalina y purificado en gel. Un clon con la secuencia de ADN correcta (Souza et al., 1986; Nagata et al., 1986a,b) se denominó pCDNA3.1(+)::G-CSFus o pBBT165.

C. Clonación de secuencias codificantes de IgG

1. Clonación de secuencias codificantes de IgG1-Fc. Se amplificó un ADNc que codifica IgG1-Fc (dominios bisagra-CH2-CH3) a partir de ADNc monocatenario de leucocitos humanos (CLONTECH, Inc., Palo Alto, CA) mediante PCR usando los cebadores BB83 (5>CGCGGATCCGGTGGCTCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACT>3) (SEC ID Nº: 13) y BB82 (5>CGCTCTAGAGGTACGTGCCAAGCATCCTCG>3) (SEC ID Nº: 14). El cebador directo BB83 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante del dominio bisagra de IgG1, mientras que el cebador inverso BB82 hibrida en la región no traducida 3' del ARNm de IgG1 e IgG4 \sim 45 pb cadena abajo del codón de terminación de la traducción. Las secuencias de IgG1 e IgG4 son idénticas a lo largo del segmento de 21 pb con el que hibrida BB82. El producto de PCR de -790 pb se digirió con Bam HI y Xba I, se purificó en gel y se clonó en vector pCDNA3.1 (+) que se había digerido con Bam HI y Xba I, tratado con fosfatasa alcalina y purificado en gel. Se secuenciaron dos clones pero cada uno contenía una sustitución de un solo par de bases que daba como resultado una mutación de sustitución de aminoácido. Por lo demás las secuencias coincidían con la secuencia de ADN genómico de IgG1 humana publicada (Ellison et al., 1982). Las posiciones relativas de las mutaciones en los dos clones permitieron usar sitios de restricción únicos convenientes (Sac II en el dominio CH2 de IgG1 y Bgl II en el vector pCDNA3.1(+)) para construir un clon de IgG1-Fc de longitud completa en pCDNA3.1(+) mediante recombinación in vitro. El clon resultante, que tenía la secuencia de IgG1-Fc correcta se denominó pCDNA3.1(+)::fusIgG1-Fc o
pBBT167.

2. Clonación de secuencias codificantes de IgG4-Fc. Se amplificó un ADNc que codifica IgG4-Fc (dominios bisagra-CH2-CH3) de ADNc monocatenario de leucocitos humanos (CLONTECH) mediante PCR usando los cebadores BB84 (5>CGCGGATCCGGTGGCTCAGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGC>3) (SEC ID Nº: 15) y BB82 (5>CGCTCTAGAGGTACGTGCCAAGCATCCTCG>3) (SEC ID Nº: 14). El cebador directo BB84 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante del dominio bisagra de IgG4. El cebador inverso BB82 se ha descrito anteriormente. El producto de PCR de -790 pb se digirió con Bam HI y Xba I y se clonó en pCDNA3.1(+) que se había digerido de forma similar. Un clon con la secuencia de ADN correcta (Ellison et al., 1981) se denominó pCDNA3.1(+)::fusIgG4-Fc o pBBT158.

3. Clonación de secuencias codificantes de IgG1-C_{H}. Se amplificó un ADNc que codifica IgG1-C_{H} (dominios CH1-bisagra-CH2-CH3) a partir de ADNc monocatenario de leucocitos humanos (CLONTECH) mediante PCR usando BB81 (5>CGCGGATCCGGTGGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATC>3) (SEC ID Nº: 16) y BB82 (5>CGCT
CTAGAGGTACGTGCCAAGCATCCTCG>3) (SEC ID Nº: 14). El cebador directo BB81 hibrida en el extremo 5' de la secuencia codificante del dominio CH1 de IgG1 e IgG4. Las secuencias en el extremo 5' de los dominios CH1 de estos dos exones son prácticamente idénticas: coinciden 19/20 nucleótidos. El cebador inverso, BB82, se ha descrito anteriormente. El producto de PCR de \sim1080 pb se digirió con Bam HI y Xba I, se purificó en gel y se clonó en pCDNA3.1(+) que se había digerido de forma similar. Estos cebadores, en principio, podían amplificar secuencias tanto de IgG1 como de IgG4. Puesto que la IgG1 es mucho más abundante en suero que la IgG4 (Roitt et al., 1989) se esperaba que la mayoría de los clones codificaran IgG1. Los dos primeros clones secuenciados eran de IgG1 pero contenían cada uno una sustitución de un solo par de bases que daba como resultado una mutación de sustitución de aminoácido. Por lo demás, las secuencias obtenidas coincidían con la secuencia de ADN genómico de IgG1 humana publicada (Ellison et al., 1982). Las posiciones relativas de las mutaciones en los dos clones permitieron usar sitios de restricción únicos convenientes (Age I en el dominio CH1 de IgG1 y Bst BI en el vector pCDNA3.1(+)) para construir un clon de IgG1-C_{H} en pCDNA3.1(+) mediante recombinación in vitro. Un clon con la secuencia de IgG1-C_{H} correcta se denominó pCDNA3.1(+)::fusIgG1-C_{H} o pBBT166.

4. Clonación de secuencias codificantes de IgG4-C_{H}. La identidad similar de las secuencias de ADN que codifican los extremos 5' de los dominios CH1 de IgG1 e IgG4 y la abundancia relativamente baja del ARNm de IgG4 condujo a una estrategia alternativa para clonar las secuencias codificantes de IgG4-C_{H}. Se usó mutagénesis dirigida basada en PCR para cambiar la secuencia de ADN del dominio CH1 de IgG1 clonado para coincidir con la secuencia de aminoácidos del dominio CH1 de IgG4. Los dominios CH1 difieren solamente en 8 de 98 aminoácidos y estas posiciones están agrupadas, de tal forma que un ciclo de PCR usando dos oligonucleótidos mutagénicos puede convertir la secuencia de CH1 de IgG1 en la secuencia de CH1 de IgG4. Un segundo ciclo de PCR añadía el sitio Bam HI y la secuencia enlazadora en el extremo 5' de la CH1 de IgG4 y 21 pb de secuencia del dominio Bisagra de IgG4 en el extremo 3'. Después, se empleó la técnica de "corte y empalme de genes por extensión solapante" (Horton et al., 1993; Innis et al., 1990) para recombinar el dominio CH1 de IgG4 obtenido por ingeniería genética con la secuencia de Fc (Bisagra-CH2-CH3) de IgG4. En esta técnica, dos fragmentos separados que comparten un segmento de secuencia idéntica, el "solapamiento" en un extremo se extiende a través de las regiones solapantes hibridadas en una reacción de PCR como se representa en la Figura 1.

Para construir la secuencia de CH1 de Ig4, se usaron los cebadores mutagénicos BB119 (5>TCCACCAAGGGCC
CATCCGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC>3) (SEC ID Nº: 17) y
BB120 (5>TCTCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTGATCTACGTTGCAGGTGTAGGTCTTCGTGCC
CAA>3) (SEC ID Nº: 18) en reacciones de PCR con pBBT166, que lleva la secuencia de IgG1-C_{H} clonada como se ha descrito anteriormente. El cebador directo BB119 hibrida con la secuencia que codifica los aminoácidos 2 a 23 del dominio CH1 y codifica 4 sustituciones de aminoácidos: S14C, K16R, G20E y G21S. El cebador inverso BB120 hibrida en la secuencia que codifica los aminoácidos 76 a 97 del dominio CH1 y codifica 4 sustituciones de aminoácidos adicionales: Q79K, 182T, N86D y K97R. El producto de -290 pb de esta reacción de PCR se purificó en gel y se usó como molde en una reacción de PCR con los cebadores BB81 (véase anteriormente; Ejemplo 1, C.3) y BB121 (5>TGGGGGACCATATTTGGACTCAACTCTCTTGTCCACCTT>3) (SEC ID Nº: 19). El cebador inverso BB121 hibrida en el extremo 3' del dominio CH1 de IgG4, añade el aminoácido 98 del dominio CH1 y 21 pb que se extienden hacia el dominio Bisagra de IgG4. El producto de -330 pb de esta reacción se purificó en gel y se usó como una de las moléculas de molde en la reacción de corte y empalme de PCR. El otro molde para la reacción de corte y empalme se generó mediante PCR de la secuencia de IgG4-Fc clonada de pBBT158 (descrita anteriormente, Ejemplo 1, C2) con los cebadores BB84 y BB82, que amplifican el dominio Fc de IgG4, como se ha descrito anteriormente. El producto de \sim 790 pb resultante consiste en la secuencia bisagra-CH2-CH3 de IgG4. Este fragmento se purificó en gel y se usó como una de las moléculas de molde en la reacción de corte y empalme de PCR. Esta reacción empleaba los cebadores BB81 y BB82 y generaba un producto "de corte y empalme" de longitud completa de -1075 pb. Para minimizar la secuenciación de ADN necesaria para confirmar este producto, el fragmento de PCR se digirió con Bam HI y Sac II y el fragmento de -530 pb (que contiene los dominios CH1 y bisagra completos y una porción del dominio CH2) se clonó en pBC-SK+ (Stratagene) para la secuenciación. La secuencia del fragmento Bam HI-Sac II se confirmó para un clon que era el denominado pBBT182. El fragmento Bam HI-Sac II de pBBT182 se usó después para convertir los clones de GF-IgG4-Fc en clones de GF-IgG4-C_{H} de longitud completa como se detalla a continua-
ción.

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D. Construcción de Fusiones de Hormona de Crecimiento-, EPO- y G-CSF-IgG

La mayoría (9/12) de las fusiones de genes de EPO-, G-CSF- y GH-IgG se generaron por escisión de las secuencias codificantes de IgG clonadas en pCDNA3.1(+) como fragmentos Bam HI-Xba I y clonación de estos fragmentos en los plásmidos recombinantes pCDNA::[GF] que se habían cortado con Bam HI y Xba I. Las fusiones de los tres genes de factores de crecimiento con IgG4-C_{H} se construyeron por escisión del fragmento Bam HI-Sac II de -530 pb de pBBT182 y sustitución de los fragmentos Bam HI-Sac II de -240 pb de los tres clones de pCDNA::[GF]-IgG4-Fc por este fragmento Bam HI-Sac II de -530 pb. Los plásmidos resultantes y las proteínas de fusión de GF-IgG que codifican se enumeran en la Tabla 1.

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E. Proteínas de Fusión de G-CSF (C17S)-IgG

Pueden construirse fusiones de G-CSF-IgG en las que la cisteína 17 de G-CSF se sustituye por serina [G-CSF (C17S)] mediante mutagénesis por PCR usando los siguientes dos cebadores oligonucleotídicos: C17S-F (5'TTCCTG
CTCAAGTCCTTAGAGCAAGTG-3') (SEC ID Nº: 20) y C17S-R (5'CACTTGCTCTAAGGACTTGAGCAGGAA-3') (SEC ID Nº: 21). Por ejemplo, se puede construir una fusión de G-CSF (C17S)-IgG1-Fc realizando dos reacciones de PCR separadas usando pBBT174 como molde. Una reacción puede usar el oligonucleótido C17S-F en combinación con BB82. La segunda reacción de PCR puede usar el oligonucleótido C17S-R en combinación con BB91. Los productos de PCR de estas reacciones se pueden purificar en gel, mezclar y reamplificar con BB82 y BB91. El producto de \sim1300 pb puede digerirse con HindIII y PflMI, la banda de HindIII/PflMI purificarse en gel y clonarse en el plásmido pBBT174 cortado de forma similar. Después de la transformación de E. coli DH5\alpha, se puede identificar un clon plasmídico que contenga la mutación C17S por secuenciación de ADN. Se pueden usar procedimientos de mutagénesis similares para cambiar la cisteína 17 a otro aminoácido por sustitución de los nucleótidos subrayados en los oligonucleótidos C17S-F y C17S-R por los nucleótidos apropiados (nucleótidos con sentido y antisentido que codifiquen el aminoácido deseado).

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Ejemplo 2 y ejemplos comparativos

Expresión y Purificación de Proteínas de Fusión de GF-IgG A. Transfección a Pequeña Escala de Células COS

La expresión y bioactividad de las proteínas de fusión de GF-IgG se evaluaron inicialmente mediante transfección a pequeña escala de células COS. Se prepararon ADN plasmídicos sin endotoxina usando un "Endo-Free Plasmid Purification Kit" (Qiagen, Inc) de acuerdo con el protocolo del proveedor y se usaron para transfectar células COS-1 (disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, MD). Las células COS-1 se cultivaron en Medio de Eagle modificado por Delbecco con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml y glutamina 2 mM (medio de cultivo de células COS). Se realizaron experimentos de transfección iniciales en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos Costar (VWR Scientific) usando el siguiente protocolo. En resumen, se sembraron 2-3 x 10^{5} células en cada pocillo en 2 ml de medio de cultivo de células COS y se dejaron incubar durante una noche a 37ºC y CO_{2} al 5%, momento en el que las células habían alcanzado una confluencia del 50-60%. Para cada pocillo, se combinaron 0,8 \mug de ADN plasmídico con 6 \mul de reactivo LipofectAMINE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) en 186 \mul de medio de suero reducido OPTI-MEM1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Las células COS-1 se lavaron una vez con 2 ml de OPTI-MEM I por pocillo y después se añadieron 1,8 ml de OPTI-MEM I a cada pocillo. Después, la mezcla compleja se añadió al pocillo y se dejó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante aproximadamente 4-5 horas. Después del periodo de incubación, la mezcla se sustituyó por 2 ml de medio de cultivo de células COS por pocillo y se dejó durante una noche a 37ºC, CO_{2} al 5%. Al día siguiente las células se lavaron dos veces con 2 ml de DMEM (sin aditivos) por pocillo. Después de las etapas de lavado, se añadieron 2 ml de medio de cultivo de células COS sin suero a cada pocillo y las células se dejaron a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se recogieron los medios acondicionados que contenían las proteínas de fusión de GF-IgG después de 72 horas y se analizaron mediante SDS-PAGE y transferencia de Western para confirmar la expresión de las proteínas de fusión de GF-IgG. El plásmido parental, pCDNA 3.1(+) (Invitrogen) se usó como control negativo. Se estimó que la eficacia de transfección era de -15% usando pCMV\beta (Clontech), que expresa \beta-galactosidasa de E. coli. Se identificaron las células transfectadas que expresan \beta-galactosidasa usando un conjunto de tinción \beta-Gal (Boehringer Mannheim, Indianápolis,
IN).

Las muestras de los medios acondicionados se prepararon en tampón de muestras de SDS-PAGE con la adición de \beta-mercaptoetanol (BME) al 1% cuando era conveniente y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida Tris-glicina al 14% premoldeados (Novex). Las transferencias de Western usando antisueros apropiados demostraron expresión de todas las proteínas de fusión de GF-IgG. Las proteínas de fusión de GH-IgG se detectaron usando un antisuero policlonal de conejo anti-hGH sintética (suministrado por cortesía del Dr. A. F. Parlow y el National Hormone and Pituitary Program). Las proteínas de fusión de EPO- y G-CSF-IgG se detectaron usando antisueros policlonales adquiridos en R&D Systems (Minneapolis, MN). Se analizaron diluciones seriadas de los medios acondicionados en los bioensayos in vitro apropiados descritos a continuación. Estos ensayos demostraron una actividad significativa en los medios acondicionados.

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B. Transfección a Gran Escala de Células COS-1

Se realizaron transfecciones a gran escala usando placas de cultivo de tejidos de 100 mm Coming o matraces de cultivo de tejidos T-75 Coming (VWR Scientific). Para placas de 100 mm, se sembraron 1,6 x 10^{6} células en 10 ml de medio de cultivo de células COS por placa y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante una noche. Para cada placa de 100 mm se combinaron 6,7 \mug de ADN plasmídico sin endotoxina con 50 \mul de reactivo LipofecAMINE en 1,5 ml de OPTI-MEM I durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Las células COS-1 se lavaron una vez con 10 ml de OPTI-MEM por placa y después se sustituyó por 6,6 ml de OPTI-MEM I. Después de la formación del complejo, se añadieron 1,67 ml a cada placa y se dejaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4-5 horas. Después del periodo de incubación, la mezcla de reacción se sustituyó por 10 ml de medio de cultivo de células COS que contenía suero por placa y se dejó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante una noche. Al día siguiente, las células se lavaron dos veces con 10 ml de DMEM (sin aditivos) por placa. Después de las etapas de lavado, se añadieron 10 ml de medio de cultivo de células COS sin suero a cada placa y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5%. Los medios acondicionados se recogieron de forma rutinaria cada tres días (los días 3, 6, 9 y 12) y se añadió medio de cultivo de células COS sin suero fresco a las células. Las transfecciones en matraces de cultivo T-75 eran idénticas al protocolo de placas de 100 mm con las siguientes excepciones: Las células se sembraron a 2 x 10^{6} células por matraz y se combinaron 9,35 \mug de ADN plasmídico sin endotoxina con 70 \mul de reactivo LipofectAMINE en 2,1 ml de OPTI-MEM I para cada matraz T-75. Después de la formación del complejo, se añadieron 2,3 ml del complejo a cada matraz que contenía 7,7 ml de OPTI-MEM I. Se determinó que la eficacia de transfección era de -15% usando pCMV\beta y tinción para expresión de \beta-galactosidasa, como se ha descrito anteriormente. Los 12 plásmidos enumerados en la Tabla 1 se transfectaron en células COS-1 usando el formato a gran escala para generar proteína para purificación. Los medios acondicionados se aclararon por centrifugación y se almacenaron a -80ºC para la purificación posterior. Se usaron transferencias de Western para confirmar la expresión de las proteínas de fusión de IgG.

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C. Purificación de Proteínas de Fusión de GF-IgG

Se combinaron aproximadamente 300 ml de medios acondicionados de células COS-1 transfectadas para cada proteína de fusión de IgG y se concentraron usando una celda de Ultrafiltración y una membrana de Ultrafiltración DIAFLO YM3 o YM30 (Amicon, Beverly, MA). Después, las combinaciones concentradas se cargaron en una columna de Proteína A recombinante HiTrap de Pharmacia de 1 ml equilibrada previamente con fosfato de sodio 20 mM a pH 7,0. La columna se lavó con fosfato de sodio 20 mM hasta que la A_{280} alcanzó las medidas basales. La proteína unida se eluyó con citrato de sodio 100 mM a pH 3,0 y se recogió en Tris 1 M a pH 9,0 suficiente para conseguir un pH final de aproximadamente 7,0. Cada proteína de fusión se purificó usando una columna dedicada para evitar cualquier posibilidad de contaminación cruzada. Todas las proteínas de fusión de IgG se comportaron de forma similar en la cromatografía, produciendo un pico único en la etapa de elución. Se analizaron fracciones de columna usando SDS-PAGE Tris-glicina premoldeado al 8-16% y las fracciones enriquecidas para la proteína de fusión de IgG se combinaron. Se determinaron las concentraciones de proteína de las fracciones combinadas mediante ensayo de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) usando albúmina de suero bovino (BSA) como el
patrón.

Las proteínas de fusión de GF-IgG purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y se tiñeron con azul de Coomassie. Todas las proteínas de fusión de GF-IgG se recuperaron principalmente como dímeros unidos por enlaces disulfuro (típicamente, >90% de las proteínas de fusión de IgG recuperadas eran diméricas). Los pesos moleculares aparentes de las proteínas variaban entre 115-190 kDa kDa en condiciones no reductoras (dímeros unidos por enlaces disulfuro) y 50-75 kDa en condiciones reductoras (monómeros) y concordaban en gran medida con los pesos moleculares predichos en la Tabla 1. Las diferencias de tamaño entre monómeros y dímeros permitieron diferenciar fácilmente monómeros y dímeros mediante SDS-PAGE. Los pesos moleculares aparentes de las proteínas de fusión de GH-IgG-Fc monoméricas y diméricas eran de aproximadamente 50 kDa y 115 kDa, respectivamente. Los pesos moleculares aparentes de las proteínas de fusión de G-CSF-IgG-Fc monoméricas y diméricas también eran de aproximadamente 50 kDa y 115 kDa, respectivamente. Los pesos moleculares aparentes de las fusiones de IgG-C_{H} diméricas eran mayores de lo esperado: de aproximadamente 160 kDa para las fusiones de GH-IgG-C_{H} y G-CSF-IgG-C_{H} y de aproximadamente 180 kDa para las fusiones de EPO-IgG-C_{H}. El monómero fusión de EPO-IgG-C_{H} también era mayor de lo esperado, poseyendo un peso molecular aparente de aproximadamente 74 kDa. Los pesos moleculares de las proteínas de fusión de EPO-IgG-Fc también eran mayores de lo predicho (pesos moleculares aparentes de monómero y dímero de 62 kDa y 130 kDa, respectivamente). Los tamaños mayores de lo esperado de las proteínas de fusión de EPO-Ig se supone que se deben a la amplia glicosilación del dominio EPO. Estaban presentes proteínas de fusión monoméricas en todas las muestras de proteína purificada, pero eran más abundantes con las proteínas de fusión de IgG4. Los tamaños de las bandas de proteína de fusión de IgG principales eran diferentes de los pesos moleculares de la IgG bovina, indicando que las proteínas purificadas no eran IgG bovinas contaminantes del suero usado en los experimentos. Las bandas de proteína de fusión de IgG principales también reaccionaban con antisueros específicos para GH, EPO y G-CSF en transferencias de Western de las muestras. Se estimó que la pureza de las proteínas de fusión de IgG era al menos del 90% por tinción con azul de Coomassie de los geles.

Todas las fusiones de GF-IgG-C_{H} contenían un gran agregado que migraba en la parte superior del gel cuando las muestras se analizaron en condiciones no reductoras. Este agregado desaparecía cuando las muestras se analizaron en condiciones reductoras y la cantidad de proteína en el peso molecular de las bandas de GF-IgG-C_{H} principales parecía aumentar de forma proporcional. Los agregados también reaccionaban con antisueros específicos para los diversos factores de crecimiento. Estos datos sugieren que los agregados son multímeros unidos por enlaces disulfuro de las proteínas de fusión de GF-IgG-C_{H}. En condiciones de SDS-PAGE reductoras, todas las fusiones de GF-IgG-C_{H} muestran una banda difusa aproximadamente 20 kDa mayor que la banda de GF-IgG-C_{H} principal. Esta banda reaccionaba con antisueros contra los factores de crecimiento y puede estar relacionada con los
agregados.

TABLA I Pesos Moleculares Predichos y Recuperaciones de Proteínas de Fusión de GF-IgG

1

Ejemplo 3 y ejemplos comparativos

Bioactividades In Vitro de Proteínas de Fusión de GF-IgG Purificadas A. Estrategia General

Se desarrollaron ensayos de proliferación celular para medir bioactividades in vitro de las proteínas de fusión de IgG. Los ensayos miden la captación y biorreducción de la sal de tetrazolio MTS [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-3-carboxifenil)-2-(4-sulfenil)-2H-tetrazolio]. En presencia de un acoplador de electrones tal como metosulfato de fenazina (PMS), el MTS se convierte en un producto de formazano que es soluble en medio de cultivo de tejidos y puede medirse directamente a 490 nM. El número de células es lineal con valores de absorbancia de hasta aproximadamente 2. Para la EPO y el G-CSF se pudieron usar líneas celulares existentes para desarrollar los bioensayos. Para la GH, fue necesario una línea celular que prolifera en respuesta a GH. Dicha línea celular se generó por transformación de forma estable de una línea celular de leucemia murina con un receptor de GH de conejo.

En general, los bioensayos se prepararon por lavado de las células apropiadas tres veces con medio (sin aditivos) y resuspensión de las células a una concentración de 0,7-1 x 10^{5}/ml en medio con aditivos (el medio usado para cada línea celular se proporciona a continuación). La suspensión celular se dividió en alícuotas de cincuenta \mul (3,5-5 x 10^{3} células) por pocillo de ensayo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos de fondo plano. Se prepararon diluciones seriadas de las muestras de proteína a ensayar en medio que contenía suero. Se añadieron cincuenta \mul de las muestras de proteína diluidas a los pocillos de ensayo y las placas se incubaron a 37ºC en un incubador de cultivo de tejidos humidificado con CO_{2} al 5%. Las muestras de proteína se ensayaron en pocillos por triplicado. Después de 60-72 h se añadieron 20 \mul de una mezcla de MTS/PMS (CeIlTiter 96 AQueous One Solution, Promega Corporation, Madison, WI) a cada pocillo y las placas se incubaron a 37ºC en el incubador de cultivo de tejidos durante 1-4 h. La absorbancia de los pocillos se leyó a 490 nM usando un lector de microplacas. Los pocillos de control contenían medio pero sin células. Los valores medios de absorbancia para los pocillos de control por triplicado se restaron de los valores medios obtenidos para los pocillos de ensayo. Se calcularon para cada muestra las CE_{50}, la cantidad de proteína necesaria para la mitad de la estimulación máxima, y se usaron para comparar las bioactividades de las proteínas. Se usaron los pesos moleculares no glicosilados en los cálculos de proporción molar para uniformidad. Se asumieron pesos moleculares no glicosilados de 18,936, 18,987 y 22,129 para EPO, G-CSF y GH, respectivamente. Se usaron pesos moleculares de monómeros en los cálculos para las proteínas de fusión de IgG. El uso de pesos moleculares de las proteínas de fusión monoméricas estimados a partir de geles de SDS (50-70 kDa) y de pesos moleculares glicosilados de 35 kDa para EPO y de 19,7 kDa para G-CSF (la GH no está glicosilada) dio proporciones de actividad similares.

B. Bioactividades de proteínas de fusión de EPO-IgG

Se obtuvo la línea celular UT7/epo humana del Dr. F. Bunn de la Escuela Médica de Harvard, Boston, MA. Esta línea celular prolifera en respuesta a EPO y depende de EPO para la supervivencia celular (Boissel et al., 1993). Las células se mantuvieron en medio de Delbecco modificado por Iscove (IMDM) suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml y EPO humana recombinante 1 unidad/ml (expresada en células CHO; R&D Systems). Se realizaron bioensayos en medio de mantenimiento de células usando los procedimientos que se han descrito anteriormente. Se analizaron diluciones seriadas de rEPO humana expresada en células CHO recombinante (R&D Systems) en paralelo.

La línea celular UT7/epo muestra una fuerte respuesta proliferativa a rEPO, como se demuestra por un aumento dependiente de la dosis en el número de células y los valores de absorbancia. En ausencia de rEPO, la mayoría de células UT7/epo muere, dando valores de absorbancia inferiores a 0,1. La rEPO expresada en células CHO comercial tenía una CE_{50} media de aproximadamente 0,6 ng/ml en el bioensayo (Tabla 2). Este valor concuerda con los valores de CE_{50} descritos en las especificaciones de R&D Systems (0,05-0,1 unidades/ml o aproximadamente 0,4-0,8 ng/ml). Las proteínas de fusión de EPO-IgG1-Fc e IgG4-Fc tenían CE_{50} idénticas de aproximadamente 1,3 ng/ml en el bioensayo (Tabla 2). En una base molar, las CE_{50} de la rEPO expresada en células CHO y de las fusiones de EPO-IgG-Fc eran indistinguibles (aproximadamente 30 pM; Tabla 2). La proteína de fusión de EPO-IgG1-C_{H} tenía una CE_{50} de 3,1 ng/ml o 60 pM (Tabla 2), que representa una reducción de aproximadamente 2 veces en la actividad específica con respecto a las proteínas de fusión de EPO-IgG-Fc y a la rEPO sin fusionar. La proteína de fusión de EPO-IgG4-C_{H} tenía una CE_{50} media de 2,05 ng/ml.

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TABLA 2 Bioactividades de Proteínas de Fusión de EPO-IgG

2

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C. Bioactividades de Proteínas de Fusión de G-CSF-1gG

La línea celular NFS60 murina se obtuvo del Dr. J. Ihle de la Escuela de Medicina de la Universidad de Tennessee, Memphis Tennessee. Esta línea celular prolifera en respuesta a G-CSF o IL-3 humanos o de ratón (Weinstein et al., 1986). Las células se mantuvieron en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml e IL-3 de ratón (R&D Systems) 17-170 unidades/ml. Se realizaron ensayos en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10%, penicilina 50 unidades/ml y estreptomicina 50 \mug/ml usando los procedimientos que se han descrito anteriormente. Se analizaron diluciones seriadas de G-CSF humano recombinante (expresado en E. coli; R&D Systems) en paralelo.

La línea celular NFS60 muestra una fuerte respuesta proliferativa a rhG-CSF, como se demostraba por un aumento dependiente de la dosis en el número de células y los valores de absorbancia. El rhG-CSF tenía una CE_{50} media de 18 pg/ml en el bioensayo (Tabla 3). Este valor concuerda con el valor de CE_{50} descrito en las especificaciones de R&D Systems (10-30 pg/ml). Las proteínas de fusión de G-CSF-IgG1-Fc y G-CSF-IgG4-Fc tenían CE_{50} medias de 38 y 57 pg/ml, respectivamente, en el bioensayo (Tabla 3). En una base molar, las CE_{50} del rhG-CSF y de las fusiones de G-CSF-IgG1-Fc eran similares (de aproximadamente 0,9 pM; Tabla 3), mientras que la CE_{50} de la proteína de fusión de G-CSF-IgG4-Fc se redujo ligeramente (1,25 pM). La proteína de fusión de G-CSF-IgG1-C_{H} tenía una CE_{50} media de 182 pg/ml o 3,2 pM (Tabla 3), que representa una reducción aproximada de 3 veces en la actividad específica con respecto a la proteína de fusión de G-CSF-IgG1-Fc y al rhG-CSF sin fusionar. La proteína de fusión de G-CSF-IgG4-C_{H} tenía una CE_{50} media de 182 pg/ml o 3,9 pM (Tabla 3).

TABLA 3

3

D. Bioactividades de Proteínas de Fusión de GH-IgG

La línea celular GH-R4 se describe en los documentos PCT/US98/14497 y PCT/US00/00931. Esta línea celular es un derivado de la línea celular FDC-P1 murina que está transformada de forma estable con el receptor de GH de conejo. La línea celular prolifera en respuesta a hGH. La línea celular se mantiene en medio RPMI 1640 que contiene suero de caballo al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml, glutamina 2 mM, G418 400 \mug/ml y hGH hipofisiaria 2-5 nM. Las muestras de proteína de fusión de GH-IgG se ensayaron como se describe en los documentos PCT/U598/14497 y PCT/US00/00931, incorporados en este documento como referencia, usando medio RPMI suplementado con suero de caballo al 10%, penicilina 50 unidades/ml, estreptomicina 50 \mug/ml y G418 400 \mug/ml. Todos los ensayos incluían un patrón de GH hipofisiaria humana. La GH hipofisiaria estimula la proliferación de células GH-R4, con una CE_{50} de 0,75-0,85 ng/ml (0,03-0,04 nM), similar a lo que se ha descrito en la bibliografía (Rowlinson et al., 1995).

Todas las proteínas de fusión de GH-IgG ensayadas estimularon la proliferación de células GH-R4 (Tabla 4). La proteína de fusión de GH-IgG1-Fc era la más activa, poseyendo una CE_{50} de 7-8 ng/ml (-0,16 nM). La proteína de fusión de GH-IgG4-Fc era aproximadamente dos veces menos activa que la proteína de fusión de IgG 1 con una CE_{50} media de 17 ng/ml (0,35 nM). La proteína de fusión de GH-lgG1-C_{H} tenía la menor actividad, con una CE_{50} de 35 ng/ml (0,6 nM). En una base molar, las bioactividades de las proteínas de fusión se redujeron 4 veces (GH-IgG1-Fc), 10 veces (GH-IgG4-Fc) y 17 veces (GH-IgG1-C_{H}) con respecto a la hGH hipofisiaria.

TABLA 4 Bioactividades de Proteínas de Fusión de GH-IgG

4

Ejemplo 4 y ejemplos comparativos

Eliminar o Minimizar el Enlazador en las Proteínas de Fusión de GF-IgG

Pueden construirse proteínas de fusión de GF-IgG en las que el enlazador de 7 aminoácidos [ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser] que fusiona el GF con el dominio de IgG se elimina (fusiones directas) o se reduce a 2 a 4 aminoácidos, como se describe más adelante. Se pueden usar procedimientos similares para crear enlazadores más cortos que 7 aminoácidos, para crear enlazadores más largos que 7 aminoácidos y para crear enlazadores que contienen otras secuencias de aminoácidos. Los experimentos descritos más adelante usan IgG1-Fc, y EPO y G-CSF como ejemplos, sin embargo, se pueden usar procedimientos similares para otros GF o dominios de IgG, y dominios para otros subtipos de IgG y dominios de anticuerpos IgM, IgA, IgD e IgE. Las proteínas de fusión modificadas se pueden expresar y purificar y sus actividades específicas se pueden determinar en bioensayos in vitro como se describe en los Ejemplos.

1. Fusiones directas: se pueden crear fusiones de GF-IgG sin un enlazador usando "corte y empalme de genes por extensión solapante" basada en PCR como se describe en el Ejemplo 1 (Horton et al., 1993). Se pueden generar productos de PCR que consisten en la secuencia codificante de IgG1-Fc con una extensión 5' corta, que consiste en las 15 pb 3' terminales de la secuencia codificante de EPO o G-CSF fusionadas directamente a la secuencia codificante de bisagra. Al mismo tiempo se pueden generar productos de PCR que consisten en las secuencias codificantes de EPO o G-CSF con una extensión 3' corta que consiste en las primeras 15 pb de la secuencia codificante de bisagra fusionadas directamente a la secuencia codificante de EPO o G-CSF. Después, los fragmentos de factor de crecimiento y los fragmentos de IgG1-Fc se pueden empalmar mediante "costura" de PCR (Horton et al., 1993) para generar fusiones directas. Estos productos de PCR se pueden digerir con enzimas de restricción apropiadas para generar segmentos de ADN relativamente pequeños que incluyen el punto de fusión y que se pueden clonar fácilmente en vectores cortados de forma similar pCDN3.1(+)::EPO-IgG1-Fc y pCDNA3.1(+)::G-CSF-1gG1-Fc para la confirmación de la secuencia y la expresión en células COS. La clonación de estos fragmentos de ADN menores minimizará la secuenciación que se necesitará realizar para confirmar las secuencias de las fusiones directas.

1.A. Fusiones Directas de EPO-IgG

Se creó una fusión directa de EPO-IgG1-Fc mediante PCR usando el plásmido pBBT180 como molde de ADN. Una reacción de PCR usó oligonucleótidos BB198 (5'-AGGACAGGGGACAGAGAGCCCAAATCTFGTGACAAA-3') (SEC ID Nº: 22) y BB82. La segunda reacción de PCR usó oligonucleótidos BB 199 (5'ACAAGATTTGGGCTCT
CTGTCCCCTGTCCTGCAGGC-3') (SEC ID Nº: 23) y BB89. Los productos de estas reacciones de PCR se purificaron en gel, se mezclaron y se sometieron a una tercera reacción de PCR usando oligonucleótidos BB82 y BB89. El producto de PCR de aproximadamente 1300 pb se purificó en gel, se digirió con Bsr GI y Sac II y se clonó en pBBT180 cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Se identificó un clon con el inserto correcto mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT356.

Se creó una fusión directa de EPO-IgG4-Fc mediante PCR usando el plásmido pBBT181 como molde de ADN. Una reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB200 (5'-AGGACAGGGGACAGAGAGTCCAAATATGGTCCCC
CA-3') (SEC ID Nº: 24) y BB82. La segunda reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB201 (5'-ACCATATTTG
GACTCTCTGTCCCCTGTCCTGCAGGC-3') (SEC ID Nº: 25) y BB89. Los productos de estas reacciones de PCR se purificaron en gel, mezclaron y sometieron a una tercera reacción de PCR usando los oligonucleótidos BB82 y BB89. El producto de PCR de aproximadamente 1300 pb se purificó en gel, se digirió con Bsr GI y Sac II, y se clonó en pBBT181 cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Se identificó un clon con el inserto correcto mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT357. Un clon con una secuencia correcta de EPO pero con una mutación en la región de IgG4-Fc (Phe-25 cambiada a Ser) se denominó pBBT 273.

Se transfectaron células COS con pBBT273 y la proteína de fusión de EPO-IgG4-Fc se purificó como se describe en el Ejemplo 2. La proteína purificada, que consistía principalmente en un dímero unido por enlaces disulfuro (>90%), estimuló la proliferación de células UT7/epo con una CE_{50} de 2 ng/ml. El bioensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 3.

Se puede crear una fusión directa de EPO (des-Arg-166)-IgG1-Fc como se ha descrito anteriormente para la fusión directa de EPO-IgG1-Fc, con la excepción de que se puede usar el oligonucleótido EPODFE (5'-TGCAGGA
CAGGGGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA-3') (SEC ID Nº: 26) en lugar de BB198 y se puede usar EPODFF (5'-ACAAGATTTGGGCTCGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTC-3') (SEC ID Nº: 27) en lugar de BB199. De forma similar, se pueden construir fusiones directas de EPO(des-Arg-166)-IgG4-Fc como se ha descrito anteriormente para fusiones de EPO-IgG4-Fc con la excepción de que puede usarse EPODFG (5'-TGCAGGACAGGGGACGAGTC
CAAATATGGTCCCCCA-3') (SEC ID Nº: 28) en lugar de BB200 y puede usarse EPODFH (5'-ACCATATTTG
GACTCGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTC-3') (SEC ID Nº: 29) en lugar de BB201.

1.B. Fusiones Directas de G-CSF

Se creó una fusión directa de G-CSF-IgG1-Fc mediante PCR usando el plásmido pBBT174 como molde de ADN. Una reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB202 (5'-CACCTTGCCCAGCCCGAGCCCAAATCTTGT
GACAAA-3') (SEC ID Nº: 30) y BB82. La segunda reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB203 (5'-ACAA
GATTTGGGCTCGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG-3') (SEC ID Nº: 31) y BB91. Los productos de estas reacciones de PCR se purificaron en gel, se mezclaron y se sometieron a una tercera reacción de PCR usando los oligonucleótidos BB82 y BB91. El producto de PCR de aproximadamente 1300 pb se purificó en gel, digirió con PflMI y Sac II y el fragmento PflMI/Sac II de - 400 pb se purificó en gel. Este fragmento se clonó en pBBT174 cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Se identificó un clon con el inserto correcto mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT299.

Se creo una fusión directa de G-CSF-IgG4-Fc mediante PCR usando el plásmido pBBT175 como molde de ADN. Una reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB204 (5'-CACCTTGCCCAGCCCGAGTCCAAATATGGTCCCC
CA-3') (SEC ID Nº: 32) y BB82. La segunda reacción de PCR usó los oligonucleótidos BB205 (5'-ACCATATTTG
GACTCGGGCTGGGCAAGGTGGCGTAG-3') (SEC ID Nº: 33) y BB91. Los productos de estas reacciones de PCR se purificaron en gel, se mezclaron y se sometieron a una tercera reacción de PCR usando los oligonucleótidos BB82 y BB91. El producto de PCR de aproximadamente 1300 pb se purificó en gel, digirió con PflMI y Sac II, y el fragmento PflMI/Sac II de - 400 pb se purificó en gel. Este fragmento se clonó en pBBT175 cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Se identificó un clon con el inserto correcto mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT300.

Las células COS se transfectaron con pBBT299 y pBBT300 y las proteínas de fusión directa de G-CSF-IgG1-Fc y G-CSF-IgG4-Fc se purificaron como se describe en el Ejemplo 2. Las proteínas purificadas, que consistían principalmente (>90%) en dímeros unidos mediante enlaces disulfuro, estimularon la proliferación de células NFS60 con una CE_{50} de 50-60 pg/ml (fusión directa de G-CSF-IgG1-Fc) y 43-50 pg/ml (fusión directa de G-CSF-IgG4-Fc). El bioensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 3.

2. Proteínas de Fusión de GF-IgG Que Contienen Enlazadores de Dos o Cuatro Aminoácidos

Para construir un enlazador dipeptídico [ser-gly], se puede someter a PCR la secuencia de IgG1-Fc con un oligonucleótido 5' que añade la extensión 5' CGCTCCGGA a la secuencia codificante de la bisagra. El hexanucleótido TCCGGA es un sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Bsp EI y codifica los aminoácidos ser-gly. Este fragmento de PCR se puede digerir con Bsp EI y Sac 11 y el fragmento de - 240 pb puede clonarse en pCDN3.1(+)::EPO-IgG1-Fc y pCDNA3.1(+)::G-CSF-IgG1-Fc cortados de forma similar. El sitio Bsp EI único en cada uno de estos plásmidos está en la primera secuencia ser-gly en el enlazador [ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser], de tal forma que los recombinantes resultantes contendrán este enlazador de 2 aminoácidos, ser-gly. La secuencia del fragmento recién insertado Bsp EI - Sac II de - 250 pb se puede verificar.

Se puede usar un procedimiento similar para construir el enlazador de 4 aminoácidos [ser-gly-gly-ser]. Se puede someter a PCR la secuencia de IgG1-Fc con un oligonucleótido 5' que añade la extensión 5' CGCGGATCC a la secuencia codificante de la bisagra. El hexanucleótido GGATCC es un sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Bam HI que codifica los aminoácidos gly-ser. Este fragmento de PCR se puede digerir con Bam HI y Sac II y el fragmento de - 240 pb se puede clonar en pCDN3.1 (+)::EPO-IgG1-Fc y pCDNA3.1(+)::G-CSF-IgG1-Fc cortados de forma similar. El sitio Bam HI único en cada uno de estos plásmido está en la primera secuencia gly-ser en el enlazador [ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser] de tal forma que los recombinantes contendrán el enlazador de 4 aminoácidos (ser-gly-gly-ser). La secuencia de la pieza insertada Bam HI - Sac II de - 250 pb se puede verificar.

Se creó un dominio de IgG1-Fc que se puede usar para construir proteínas de fusión que contienen un enlazador de 2 aminoácidos SerGly entre el dominio de factor de crecimiento/citoquina y el dominio de IgGI-Fc mediante PCR. La reacción de PCR usó cebadores BB 194 (5'-CGCGAATTCCGGAGAGCCCAAATCTTGTGACAAA3') (SEC ID Nº: 34) y BB 82. El molde de ADN fue pBBT195. Los productos de PCR se pasaron a través de un kit de limpieza de PCR (Qiagen, Inc.) y se digirieron con EcoRI y SacII. El producto de digestión de restricción se pasó a través de un kit de limpieza de PCR y se clonó en ADN de pBC SK(+) (Stratagene, Inc.) cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Las ligaciones se usaron para transformar la cepa JM109 de E. coli. Se seleccionaron transformantes en placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de cloranfenicol. Se identificó un clon con la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT242.

Se creó mediante PCR un dominio de IgG1-Fc que se puede usar para construir proteínas de fusión que contienen el enlazador de 4 aminoácidos, Ser-Gly-Gly-Ser (SEC ID Nº: 1), entre el dominio de factor de crecimiento/citoquina y el dominio de IgG1-Fc. La reacción de PCR usó los cebadores de BB 195 (5'-CGCGGATCCGAGCCCAAATCTTGT
GACAAA-3') (SEC ID Nº: 35) y BB 82. El molde de ADN fue pBBT195. Los productos de PCR se pasaron a través de un kit de limpieza de PCR (Qiagen, Inc.) y se digirieron con BamHI y Sac II. El producto de digestión de restricción se pasó a través de un kit de limpieza de PCR y se clonó en ADN de pBC SK (+) cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Las ligaciones se usaron para transformar JM109 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol. Se identificó un clon con la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT243.

Se creó mediante PCR un dominio de IgG4-Fc que se puede usar para construir proteínas de fusión que contienen el enlazador de 2 aminoácidos, SerGly, entre el dominio de factor de crecimiento/citoquina y el dominio de IgG4-Fc. La reacción de PCR usó los cebadores BB 196 (5'-CGCGAATTCCGGAGAGTCCAAATATGGTCCCCCA-3') (SEC ID Nº: 36) y BB 82. El molde de ADN era pBBT196. Los productos de PCR se pasaron a través de un kit de limpieza de PCR (Qiagen, Inc.) y se digirieron con EcoRI y SacII. El producto de digestión de restricción se pasó a través de un kit de limpieza de PCR y se clonó en ADN de pBC (SK+) cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Las ligaciones se usaron para transformar JM109 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol. Se identificó un clon con la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT244.

Se creó un dominio de IgG4-Fc que se puede usar para construir proteínas de fusión que contienen el enlazador de 4 aminoácidos, ser-gly-gly-ser, entre el dominio de factor de crecimiento/citoquina y el dominio de IgG4-Fc mediante PCR. La reacción de PCR usó los cebadores BB 197 ((5'-CGCGGATCCGAGTCCAAATATGGTCCCCCA-3'XSEC ID Nº: 37) y BB 82. El molde de ADN fue pBBT196. Los productos de PCR se pasaron a través de un kit de limpieza de PCR (Qiagen, Inc.) y se digirieron con BamHI y Sac II. El producto de digestión de restricción se pasó a través de un kit de limpieza de PCR y se clonó en ADN de pBC (SK+) cortado de forma similar que se había tratado con fosfatasa intestinal de ternero. Las ligaciones se usaron para transformar JM109 de E. coli. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenía 50 \mug/ml de cloranfenicol. Se identificó un clon con la secuencia correcta mediante secuenciación de ADN y se denominó pBBT245.

Los dominios de IgG modificados que se han descrito anteriormente se usaron para construir proteínas de fusión de EPO-IgG y G-CSF-IgG que contenían enlazadores de 4 aminoácidos. Se digirieron los plásmidos pBBT174 y pBBT180 con BamHI y SacII y se trataron con fosfatasa intestinal de ternero. Las bandas de vector de \sim 6 kb se purificaron en gel y se ligaron con el inserto de - 800 pb de IgG de pBBT243, que se había purificado en gel después de la digestión del ADN de pBBT243 con BamHI y SacII. De forma similar, los plásmidos pBBT175 y pBBT181 se digirieron con BamHI y SacII y se trataron con fosfatasa intestinal de ternero. Las bandas de vector de - 6 kb se purificaron en gel y se ligaron con el inserto de - 800 pb de IgG de pBBT245, que se había purificado en gel después de la digestión de ADN de pBBT245 con BamHI y SacII. Las ligaciones se usaron para transformar DH5\alpha de E. coli y los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB que contenían 100 \mug/ml de ampicilina. Los clones que contenían las secuencias correctas se identificaron mediante mapeo de restricción y secuenciación de ADN. Las fusiones de EPO-IgG1-Fc, y EPO-IgG4-Fc que contenían el enlazador de 4 aminoácidos se denominaron pBBT279 y pBBT280, respectivamente. Las fusiones de G-CSF-IgG1-Fc y G-CSF-IgG4-Fc que contenían el enlazador de 4 aminoácidos se denominaron pBBT277 y pBBT278, respectivamente.

Los dominios de IgG modificados que se han descrito anteriormente se pueden usar para construir proteínas de fusión de EPO-IgG y G-CSF-IgG que contienen enlazadores de 2 aminoácidos. Los plásmidos pBBT174 y pBBT180 se pueden digerir con BspEI y SacII y tratarse con fosfatasa intestinal de ternero. Las bandas de vector de - 6 kb se pueden purificar en gel y ligar con el inserto de - 800 pb de IgG de pBBT242, que se había purificado en gel después de la digestión del ADN de pBBT242 con BspEI y Sac II. De forma similar, los plásmidos pBBT175 y pBBT181 se pueden digerir con BspEI y SacII y tratar con fosfatasa intestinal de ternero. Las bandas de vector de \sim 6 kb se pueden purificar en gel y ligar con el inserto de - 800 pb de IgG de pBBT244, que se ha purificado en gel después de la digestión de ADN de pBBT244 con Bsp EI y Sac II. Las ligaciones se pueden seleccionar para transformar DH5\alpha de E. coli y los transformantes se pueden usar en placas de agar LB que contienen 100 \mug/ml de ampicilina.

Las proteínas de fusión recombinantes se pueden usar para transfectar células COS y se pueden purificar como se describe en el Ejemplo 2. Se pueden determinar las bioactividades in vitro e in vivo de estas proteínas de fusión como se describe en los Ejemplos 3 y 8.

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Ejemplo 5 y ejemplos comparativos

Procedimientos para Mejorar Bioactividades de Proteínas de Fusión de IgG-C_{H}

Todas las proteínas de fusión de IgG-C_{H} parecieron agruparse durante la purificación y las actividades específicas de los factores de crecimiento fusionados disminuyeron 2-3 veces en comparación con las fusiones de IgG-Fc análogas. La agregación se puede deber a interacciones hidrófobas en las que está implicado el dominio CH1 que normalmente se comunica con la cadena ligera. La co-expresión de cadenas ligeras de Ig con las fusiones de GF-IgG-C_{H} puede prevenir la agregación. Más adelante se describen tres maneras para co-expresar cadenas ligeras y cadenas pesadas de Ig. Los experimentos descritos a continuación usan IgG-Fc, IgG-C_{H}, EPO y G-CSF como ejemplos, sin embargo, se pueden usar procedimientos similares para otros dominios de GF o IgG, para dominios para otros subtipos de IgG y para dominios de anticuerpos IgM, IgA, IgD e IgE. Se conocen las secuencias de ADN de las cadenas ligeras humanas kappa y lambda (Heiter et al., 1980). Las secuencias de ADNc que codifican las regiones constantes de cadena ligera (CL) humana kappa y lambda se pueden obtener mediante amplificación de PCR a partir de ADNc monocatenario de leucocitos humanos (Clontech) o de ADN genómico humano (Clontech). Las secuencias de ADN de los dominios CL clonados se pueden confirmar antes del uso en los experimentos que se describen más adelante. Las proteínas de fusión modificadas se pueden expresar y purificar y sus actividades específicas se pueden determinar en bioensayos in vitro como se describe en los Ejemplos 2 y 3.

1. Co-expresión de la región constante de cadena ligera. Se pueden añadir una secuencia Kozak (Kozak, 1991) y una señal de secreción al extremo 5' de la región constante de cadena ligera para aumentar el inicio de traducción y dirigir la secreción de la región constante de cadena ligera. Se puede añadir un codón de terminación de la traducción al extremo 3' de la secuencia. Se pueden añadir sitios de clonación apropiados a los extremos 5' y 3' para permitir la clonación en el vector de expresión de células de mamífero pREP4 (Invitrogen) bajo el control del promotor de RSV y precediendo al sitio de adición de poliA obtenido a partir de SV40. Esta construcción se puede usar para co-transfectar células COS junto con derivados de pCDNA3.1 (+) que expresan, por ejemplo, EPO-IgG-C_{H} y G-CSF-IgG-C_{H}. Como alternativa, tanto la cadena ligera como la pesada se pueden expresar por una única construcción plasmídica. En este caso, la secuencia de cadena ligera y el promotor flanqueante y los sitios poliA de pREP4 se pueden escindir con enzimas de restricción apropiadas y clonar en pCDNA3.1 (+). Las secuencias codificantes de EPO-IgG-C_{H} y G-CSF-IgG-C_{H} se podrían clonar después en el polienlazador de pCDNA3.1 (+) bajo el control del promotor de CMV. El ADN que codifica la región constante de la cadena ligera Kappa humana (IgKC) se amplificó a partir de ADN genómico humano como se describe más adelante en la Sección 2 de este Ejemplo. Esta secuencia se modificó mediante PCR para crear una construcción adecuada para la expresión de la región constante de cadena ligera. Se añadieron una secuencia Kozak (Kozak, 1991) y las señales de secreción de la Hormona de Crecimiento humana al extremo 5' de la región constante de cadena ligera. Estas modificaciones se realizaron mediante dos reacciones de PCR secuenciales. En la primera, el ADN clonado y secuenciado de pCDNA3.1 (+)::fusIgKC se usó como molde. Los cebadores
fueron BB169 (5>GCTTTTGGCCTGCTCTGCCTGCCCTGGCTTCAAGAGGGCAGTGCCACTGTGGCTGCAC
CATCT>3) (SEC ID Nº: 38) y BB150 BB150 (5>CGCTCTAGACTAACACTCTCCCCTGTTGAA>3) (SEC ID Nº: 39). El cebador directo BB169 hibrida con el extremo 5' de la región constante de cadena ligera y añade la secuencia codificante de 15 aminoácidos de la secuencia líder de hGH. El cebador inverso BB150 hibrida con el extremo 3' de la secuencia codificante de la región constante de la cadena ligera Kappa humana e incluye un codón de terminación de la traducción seguido de un sitio Xb\alpha I. El producto de esta reacción de PCR se purificó en gel y se usó como molde en una segunda reacción de PCR con cebadores BB168 (5>CGCAAGCTTGCCACCATGGCTACAGGCTCCCGGACGTC
CCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTGC>3) (SEC ID Nº: 40) y BB150. El cebador directo BB168 añade el resto de la secuencia líder de hGH así como una secuencia Kozak y contiene un sitio Hin dIII para propósitos de clonación. El cebador inverso BB150 se ha descrito anteriormente. El producto de esta reacción de PCR se digirió con Hin dIII y Xb\alpha I y se clonó en el vector pCDNA3.1 (+) que se había digerido con Hin dIII y Xb\alpha I y tratado con fosfatasa alcalina. Se verificó la secuencia de ADN para un clon de este tipo.

2. Co-expresión de proteínas de fusión de GF-región constante de cadena ligera. Un modo alternativo de expresión de cadena ligera sería modificar el extremo 5' para añadir una parte de una secuencia enlazadora peptídica flexible fusionada con el extremo amino de la secuencia codificante de CL y añadir un codón de terminación de la traducción al extremo 3' de la secuencia. También se pueden añadir sitios de clonación apropiados a los extremos 5' y 3' para permitir la clonación como una fusión en fase con los genes de EPO y G-CSF clonados en los plásmidos pCDNA3.1 (+)::EPOfus y pCDNA3.1(+)::G-CSFfus. Este plásmido se puede introducir por co-transfección en células COS con plásmidos que expresan, por ejemplo, EPO-IgG1-C_{H} y G-CSF-IgG I-C_{H}. En este caso, tanto la cadena pesada como la ligera contendrán fusiones con factor de crecimiento. Las cadenas ligera y pesada también se podrían expresar a partir de una construcción única de pCDNA3.1 (+) como se ha descrito anteriormente. La EPO y el G-CSF también se pueden expresar como fusiones directas con Ig-C_{L} usando procedimientos similares a los descritos en otro lugar en los Ejemplos. El ADN que codifica la región constante de la cadena ligera Kappa humana (IgKC) se amplificó a partir de ADN genómico humano (CLONTECH, Inc., Palo alto, CA) mediante PCR usando los cebadores BB149 (5>CGCGGATCCGGTGGCTCAACTGTGGCTGCACCATCTGT>3) (SEC ID Nº: 41) y BB150 (5>CGCTCTAGACTAACACTCTCCCCTGTTGAA>3) (SEC ID Nº: 42). El cebador directo BB149 hibrida con el extremo 5' de la secuencia codificante para la región constante de la cadena ligera Kappa humana e incluye una parte del enlazador peptídico (gly-ser-gly-gly-ser) (SEC ID Nº: 2) que contiene un sitio Bam HI en el extremo 5'. El cebador inverso BB 150 hibrida con el extremo 3' de la secuencia codificante para la región constante de la cadena ligera Kappa humana e incluye un codón de terminación de la traducción seguido de un sitio Xb\alpha I. El producto resultante de PCR de - 330 pb se digirió con Bam HI y Xb\alphaI, se purificó en gel y se clonó en el vector pCDNA3.1 (+) que se había digerido con Bam HI y Xb\alpha I, tratado con fosfatasa alcalina y purificado en gel. Se secuenció un clon y se observó que coincidía con la secuencia de ADN genómico de IgKC humana publicada (Hieter et al., 1980). El fragmento Bam HI -Xb\alpha I de -330 se escindió posteriormente de este plásmido, denominado pCDNA3.1(+)::fusIgKC, y se clonó en pBBT190, pBBT191 y PBBT192 (descritos más adelante en el Ejemplo 10) dando como resultado la fusión del dominio de IgKC con IFN-\alpha, IFN-\beta e IFN-\gamma respectivamente. Se pueden usar procedimientos similares para construir otras proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgKC.

3. Fusiones de cadena ligera-cadena pesada. Un tercer modo de "co-expresión" sería modificar los extremos 5' y 3' de la secuencia codificante de CL para incorporar partes de un enlazador peptídico flexible en ambos extremos. Incorporando también sitios de clonación apropiados (por ejemplo, Bsp EI y Bam HI), una construcción de este tipo se puede insertar en los sitios Bsp EI y Bam HI dentro de los enlazadores peptídicos flexibles de las fusiones de EPO-IgG-C_{H} y G-CSF-IgG-C_{H} en pCDNA3.1(+). Las construcciones resultantes codificarían, por ejemplo, fusiones únicas polipeptídicas [EPO]-[CL]-[IgG-C_{H}] y [G-CSF]-[CL]-[IgG-C_{H}]. La fusión del extremo carboxi de la región constante de cadena ligera con el extremo amino del dominio CHI de cadena pesada sería análoga a polipéptidos Fv de cadena única. Se han usado enlazadores peptídicos flexibles del motivo (ser-gly-gly) del orden de 14 a 20 restos de longitud para fusionar el extremo carboxi de la región variable de cadena ligera con el extremo amino del dominio variable de cadena pesada (Stewart et al., 1995) y se podrían usar para unir el dominio de CL con el dominio de IgG-C_{H}.

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Ejemplo 6

Proteínas de Fusión de GF-IgG con Propiedades de unión a Complemento y Unión a Receptor Fc Reducidas

Determinadas proteínas de fusión de GF-IgG1 pueden ser tóxicas o carecer de eficacia en los modelos animales debido a la activación del complemento o de procesos inmunes relacionados con la unión al receptor Fc. Por este motivo, las proteínas de fusión de GF-IgG4 se pueden preferir debido a que IgG4 es menos eficaz en la activación del complemento y en la unión al receptor Fc que IgG1 (Roit et al.., 1989). Las proteínas de fusión de EPO- y G-CSF-IgG4-Fc son tan potentes o prácticamente tan potentes como las proteínas de fusión de IgG1-Fc en bioensayos in vitro. Como alternativa, se pueden realizar experimentos de mutagénesis in vitro, como se detalla más adelante, para cambiar aminoácidos específicos en los dominios de IgG que se consideran responsables de la activación del complemento y la unión al receptor Fc. Las proteínas de fusión modificadas se pueden expresar, purificar y sus actividades específicas se pueden determinar en bioensayos in vitro como se describe en los Ejemplos 2 y 3.

A. Unión al Complemento. Los aminoácidos de las IgG que desempeñan un papel en la activación del complemento se han localizado en el dominio CH2 de IgG. Específicamente, los aminoácidos Glu318, Lys320, Lys322, Ala330 y Pro331 de la IgGI humana se han implicado en la activación del complemento como factores contribuyentes (Isaacs et al., 1998). La sustitución de Glu318, Lys320 y Lys 332 en IgG1 por restos de alanina da como resultado proteínas de IgG que poseen una menor capacidad de activar el complemento (Isaacs et al., 1998). La secuencia de aminoácidos de la IgG4 es idéntica a la de la IgG1 en esta región, aunque IgG4 no activa el complemento. Como una alternativa al uso de IgG4, se pueden cambiar los aminoácidos Glu318, Lys320 y Lys322 (solos o en combinación) de IgG que tienen estos restos por restos de alanina u otros aminoácidos que reducen la activación del complemento usando las estrategias de mutagénesis basadas en PCR descritas en el Ejemplo 1.

B. Unión al Receptor Fc. Las subclases de IgG humanas difieren en su capacidad de unirse a receptores Fc y de estimular la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Las IgG1, IgG3 e IgG4 son las mejores para estimular la ADCC, mientras que la IgG2 tiene una capacidad significativamente menor para estimular la ADCC (Roit et al., 1989). La ADCC se produce mediante un mecanismo que implica la unión del anticuerpo a receptores Fc presentes en células inmunes. Se han localizado aminoácidos responsables del receptor Fc en el dominio CH2 de la molécula de IgG. Específicamente, los aminoácidos 233-235 se han implicado en la unión al receptor Fc. La IgG1 humana tiene la secuencia de aminoácidos GluLeuLeu en esta región, mientras que la IgG2, que no se une a receptores Fc, tiene la secuencia ProAlaVal. La IgG4 tiene la secuencia GluPheLeu en esta región y es diez veces menos eficaz al unirse a receptores Fc que la IgG1. La sustitución de la secuencia GluLeuLeu por ProAlaVal de IgG2 en las posiciones 233-235 en la IgG1 o IgG4 da como resultado anticuerpos IgG1 e IgG4 con una capacidad significativamente reducida para la unión al receptor Fc y para la creación de ADCC (Isaacs et al., 1998). Se pueden introducir algunos o todos estos cambios de aminoácidos en las construcciones de proteínas de fusión de GF-IgG usando la estrategia de mutaciones basada en PCR descrita en el Ejemplo 1. Como alternativa, se pueden construir proteínas de fusión de GF-IgG modificadas en las que se impide la glicosilación de asparagina 297 en el dominio CH2 de IgG1 (o el resto de asparagina equivalente en las demás subclases de IgG). Los anticuerpos IgG1 aglicosilados presentan una unión significativamente reducida a receptores Fc y una capacidad de lisar células diana significativamente menor en comparación con los anticuerpos IgG1 glicosilados (Isaacs et al., 1998). Se pueden construir versiones aglicosiladas de las proteínas de fusión de GF-IgG cambiando la asparagina-297 por glutamina u otro aminoácido, o cambiando la treonina 299, que es parte de la secuencia de reconocimiento de glicosilación (Asparagina-X-Serina/Treonina) por alanina u otro aminoácido diferente de serina. El aminoácido en la posición X de la secuencia de reconocimiento de glicosilación, es decir, el aminoácido 298, también se podría cambiar por prolina para prevenir la glicosilación de la asparagina 297 en el dominio CH2 de IgG.

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Ejemplo 7 y ejemplos comparativos

Experimentos Farmacocinéticos con Proteínas de Fusión de GF-IgG

Se pueden realizar experimentos farmacocinéticos para demostrar que las proteínas de fusión de GF-IgG tienen vidas medias circulantes más prolongadas que las proteínas no fusionadas correspondientes. Se pueden obtener datos farmacocinéticos tanto intravenosos como subcutáneos. Los parámetros farmacocinéticos terminales se pueden calcular a partir de los datos de administración intravenosa.

Para los estudios de administración intravenosa, las ratas (\sim350 g) pueden recibir una inyección intravenosa en embolada (0,1 mg/kg) de la proteína de fusión de IgG1-Fc (EPO o G-CSF) o de la proteína no fusionada correspondiente (EPO o G-CSF) y los niveles circulantes de las proteínas se pueden medir a lo largo de un periodo de 144 h. Se pueden usar tres ratas para cada muestra de proteína. Se pueden extraer muestras de sangre a las 0, 0,08, 0,5, 1,5, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120 y 144 h después de la administración intravenosa. Los niveles séricos de las proteínas de ensayo se pueden cuantificar usando kits de ELISA de EPO y G-CSF disponibles en el mercado (R & D Systems). Se pueden analizar diluciones seriadas de cada muestra de sangre inicialmente en los bioensayos in vitro para identificar diluciones que entrarán dentro del intervalo lineal de los ELISA (de 0,025 a 1,6 ng/ml para EPO y de 0,04 a 2,5 ng/ml para G-CSF). Se pueden realizar experimentos de titulación para determinar las sensibilidades relativas de los ELISA para detectar las proteínas de fusión de IgG1-Fc y las proteínas no fusionadas correspondientes. Los estudios de administración subcutánea pueden seguir el mismo protocolo que los estudios intravenosos excepto por la vía de administración. Se pueden cuantificar los niveles séricos de las proteínas de ensayo mediante ELISA como se ha descrito anteriormente.

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Ejemplo 8 y ejemplos comparativos

Modelos de Eficacia Animales

La eficacia in vivo de las proteínas de fusión de EPO-IgG1-Fc y G-CSF-IgG1-Fc se puede demostrar en ratas y ratones normales. Estos estudios pueden usar una diversidad de dosis y programas de dosificación para identificar las dosis y los programas de dosificación apropiados. La eficacia de las proteínas de fusión de EPO-IgG1 y G-CSF-IgG también se puede demostrar en modelos de enfermedad apropiados - anemia para EPO-IgG1-Fc y neutropenia para G-CSF-IgG1-Fc. Los experimentos farmacocinéticos proporcionarán una directriz para decidir los programas de dosificación para las proteínas de fusión de IgG1 que se tienen que usar para los estudios animales. A partir de los resultados publicados con otras proteínas de fusión de IgG-Fc (Richter et al., 1999; Zeng et al., 1995), las proteínas de fusión EPO-IgG y G-CSF-IgG pueden ser eficaces cuando se administran cada dos días o cada tres días y posiblemente con menos frecuencia, por ejemplo, una única inyección. Los programas de dosificación se pueden tener que modificar dependiendo de los resultados de los estudios farmacocinéticos y de los resultados de eficacia animal iniciales. La dosis de proteína administrada por inyección a los roedores también puede tener que modificarse basándose en los resultados de los experimentos farmacocinéticos y los resultados de eficacia animal iniciales.

A. Modelos de Eficacia Animal de EPO - Ratas Normales 1. Inyección Única

Grupos de tres ratas macho Sprague Dawley, que pesaban -320 g cada una, recibieron una sola inyección intravenosa (en la vena lateral de la cola) de EPO recombinante de tipo salvaje que contenía la secuencia de aminoácidos ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser-asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys (SEC. ID. Nº. 43) en su extremo carboxi (rEPO-FLAG) o EPO-IgG1-Fc a una dosis de 100 \mug/kg. La rEPO-FLAG se expresó mediante transfección de células COS-1 y se purificó mediante cromatografía de afinidad usando un anticuerpo monoclonal anti-FLAG. Las concentraciones de proteína de rEPO-FLAG y EPO-IgG1-Fc se determinaron usando un ensayo de unión a colorante Bradford y albúmina sérica bovina como patrón. En momentos seleccionados se extrajeron muestras de sangre (de 0,3 a 0,4 ml) de las ratas en tubos con anticoagulante EDTA. Se analizaron alícuotas de las muestras de sangre para un hemograma completo (CBC). El resto de la muestra de sangre se centrifugó y el plasma se congeló a -80ºC. Se extrajeron muestras de sangre a las 0,25, 2, 4, 10, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 192 h después de la inyección. Se obtuvo una muestra de nivel basal a las 0 h-24 h antes de la inyección de los compuestos de ensayo. La tabla 4 muestra los hematocritos sanguíneos medios (+/- ET) para los diferentes grupos de ensayo a las 0 horas y a las 192 h después de la inyección. El grupo que recibió EPO-IgG1-Fc mostró un aumento significativo en los niveles de hematocrito a las 192 horas en comparación con la hora 0 (p<0,05). Los grupos que recibieron rEPO-FLAG no mostraron un aumento significativo en los niveles de hematocrito entre los puntos de tiempo de 0 y 192 horas.

TABLA 4

5

Se pueden realizar estudios similares usando dosis inferiores o superiores (de 0,001 a 10 mg/kg) de las proteínas. También se pueden realizar estudios similares usando la vía de administración subcutánea de las proteínas.

2. Programas de Dosificación Diario, Cada Dos Días o Cada Tres Días

Se pueden adquirir ratas Sprague Dawley (\sim200 g) de un proveedor comercial tal como Charles River (Wilmington, MA). Estudios previos han demostrado que la administración de 100-1.000 UI/kg (aproximadamente 800 ng - 8 \mug/kg) de rEPO una vez al día (160 ng - 1,6 \mug SID/200 g de rata) mediante inyección subcutánea proporciona un aumento significativo en el hematocrito y la eritropoyesis en roedores (Matsumoto et al., 1990; Vaziri et al., 1994; Baldwin et al., 1998; Sytkowski et al., 1998). Grupos de cinco ratas pueden recibir inyecciones subcutáneas de rEPO, rEPO-FLAG, EPO-IgG1-Fc o placebo (solución de vehículo) a intervalos especificados (diario, cada dos días o cada tres días) durante un periodo de cinco a nueve días. Se puede ensayar una dosis equivalente a una proporción molar de EPO (400 ng - 4 \mug/200 g de rata de la proteína de fusión EPO-IgG1-Fc). También se pueden ensayar dosis superiores o inferiores. Se puede ensayar un amplio intervalo de dosis de EPO-IgG1-Fc (con una variación de más de 500 veces) en estos experimentos iniciales para aumentar la probabilidad de que una de estas dosis sea eficaz. Es posible que la administración de demasiado EPO-IgG1-Fc impida la eritropoyesis debido a la toxicidad. Las ratas de control pueden recibir solamente solución de vehículo. Los grupos de control adicionales pueden recibir inyecciones diarias de rEPO (160 ng-1,6 \mug/200 g de rata durante 5-9 días) y 160 ng-1,6 pg de rEPO usando el mismo régimen de dosificación que EPO-IgG1-Fc. Uno o dos días después de la inyección final, los animales se pueden sacrificar y se pueden recoger muestras de sangre para el análisis del hematocrito y el hemograma completo (CBC). Se pueden recoger tejidos hematopoyéticos (hígado y bazo), pesar y fijar en formalina para realizar análisis histopatológicos para buscar indicios de una eritropoyesis aumentada. Se puede retirar la médula ósea de diversos huesos largos y el esternón para realizar preparaciones de partículas unitarias y un análisis histopatológico para buscar indicios de una eritropoyesis aumentada. Se pueden realizar comparaciones entre grupos usando un ensayo T de Student para comparaciones únicas y análisis de varianza de una vía para comparaciones múltiples. Se puede considerar significativo P<0,05.

Las inyecciones diarias de rEPO pueden estimular aumentos en el hematocrito y la eritropoyesis en ratas, mientras que una administración menos frecuente de la misma dosis de rEPO puede no hacerlo o hacerlo en un menor alcance. Se pueden observar aumentos dependientes de la dosis en estos parámetros en los animales tratados con EPO-IgG-Fc. Se pueden observar mayores aumentos en estos parámetros en los animales tratados con EPO-IgG1-Fc en comparación con los animales tratados con EPO usando los programas de dosificación menos frecuentes. Se puede requerir significativamente menos EPO-IgG1-Fc para conseguir los mismos aumentos en estos parámetros obtenidos con inyecciones diarias de EPO.

Se podrían realizar experimentos adicionales con una dosificación menos frecuente, por ejemplo, una inyección única.

B. Experimento de Eficacia de EPO - Modelo de Rata Anémica

La anemia inducida por cisplatino es un modelo de roedor bien caracterizado de anemia inducida por quimioterapia y tiene una relevancia directa para el entorno clínico humano. La rEPO invierte la anemia en este modelo cuando se administra a dosis diarias de 100-1.000 unidades/kg (Matsumoto et al., 1990; Vaziri et al., 1994; Baldwin et al., 1998). La EPO-IgG-Fc también será eficaz para revertir la anemia en este modelo usando programas de dosificación de una vez al día, cada dos días o cada tres días. El programa de dosificación para EPO-IgG-Fc a usar en este experimento podría ser el que mejor funcione en los experimentos de rata normales. Se pueden tratar ratas Sprague-Dawley (\sim200 g) el día 0 con una inyección intraperitoneal de Cisplatino (3,5 mg/kg) para inducir anemia y se pueden distribuir aleatoriamente a diversos grupos de tratamiento. Las ratas pueden recibir inyecciones diarias, cada dos días o cada tres días de EPO-IgG-Fc, rEPO o solución salina durante un periodo de hasta 9 días a una dosis de 2 \mug-20 \mug/kg. Un grupo de control de ratas puede recibir inyecciones subcutáneas diarias de rEPO (100-1.000 unidades/kg). Otro grupo de control puede no recibir la inyección de Cisplatino inicial pero puede recibir inyecciones de solución salina usando el mismo programa de dosificación que las demás proteínas de ensayo. Las ratas se pueden sacrificar el día 9 y se pueden obtener muestras de sangre y tejido para realizar análisis de CBC e histopatología exhaustivos. También se podrían ensayar dosis de diez a cien veces mayores o menores de las proteínas de fusión de EPO-IgG1-Fc.

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Ejemplo 9

Purificación Adicional de Dímeros de Proteína de Fusión de IgG

El esquema de purificación final de las proteínas de fusión de factor de crecimiento/citoquina-IgG podría incluir etapas de cromatografía en columna adicionales además de la cromatografía de afinidad para eliminar contaminantes proteicos y agregados y para preparar preparaciones más puras de tetrámeros, dímeros y monómeros de proteína de fusión. Las preparaciones más puras de las proteínas de fusión de IgG pueden mejorar sus actividades específicas en bioensayos in vivo. Para el uso como agentes terapéuticos humanos será preferible obtener preparaciones de monómeros de factor de crecimiento/citoquina-IgG sustancialmente sin dímeros de proteína de fusión y preparaciones de dímeros de proteína de fusión de IgG sustancialmente sin monómeros de proteína de fusión. Los dímeros de factor de crecimiento/citoquina-IgG se pueden separar de los monómeros de proteína de fusión de IgG usando una diversidad de procedimientos de cromatografía en columna conocidos por los expertos en la técnica. También se pueden usar procedimientos de cromatografía para purificar proteínas de fusión de Ig de agregados y otras proteínas contaminantes. Los ejemplos de tales procedimientos de cromatografía incluyen cromatografía de intercambio iónico, exclusión molecular, interacción hidrófoba, fase inversa, quelación con metales, columnas de afinidad, afinidad por lectina, hidroxiapatita y cromatografía de afinidad por colorante inmovilizado. Otros procedimientos de separación útiles conocidos por los expertos en la técnica incluyen precipitación con sales, precipitación/extracción con disolvente y precipitación con polietilenglicol. Los niveles de endotoxina en las proteínas purificadas se pueden ensayar usando kits disponibles en el mercado para garantizar que no sean pirogénicas.

La fusión directa de EPO-IgG4-Fc descrita en el Ejemplo 4 (codificada por pBBT273) se purificó mediante cromatografía de afinidad de Proteína A como se describe en el Ejemplo 2. La proteína purificada se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 HR 10/30. El tampón era NaPO_{4} 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM. El volumen de la columna era de 24 ml. La columna se eluyó con 1,5 volúmenes de columna de tampón a un caudal de 0,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 0,5 ml. Se observó un solo pico de proteína principal, que eluyó con un peso molecular aparente de 204 kDa. La columna se calibró usando patrones de proteína adquiridos en Sigma Chemical Company (nº de catálogo MW-GF-200). El análisis de SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras indicó que el pico de proteína principal consistía principalmente en dímeros de EPO-IgG4-Fc unidos por enlaces disulfuro (al menos en un 90%, y probablemente en >95% por SDS-PAGE no reductora). Los contaminantes de alto peso molecular (pesos moleculares aparentes >200 kDa mediante SDS-PAGE no reductora) y los contaminantes de bajo peso molecular (pesos moleculares aparentes <50 kDa mediante SDS-PAGE no reductora) se eliminaron en gran medida mediante esta etapa en columna.

Se realizaron experimentos similares con la proteína de fusión de EPO-IgG1-Fc codificada por pBBT180, la proteína de fusión de G-CSF-IgG1-Fc codificada por pBBT174 y la proteína de fusión de G-CSF-IgG4-Fc codificada por pBBT175. Estas proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad de Proteína A como se describe en el Ejemplo 2 y se purificaron después por cromatografía de exclusión molecular como se ha descrito anteriormente. La proteína de fusión de EPO-IgG1-Fc eluyó de la columna de exclusión molecular con un peso molecular aparente de 219 kDa y consistía principalmente en dímeros de EPO-IgG1-Fc (>95% por SDS-PAGE no reductora). La proteína de fusión de G-CSF-IgG1-Fc eluyó con un peso molecular aparente de 148 kDa y consistía principalmente en dímeros de G-CSF-IgG1-Fc (>95% por SDS-PAGE no reductora). La proteína de fusión de G-CSF-IgG4-Fc eluyó con un peso molecular aparente de 135 kDa y consistía principalmente en dímeros de G-CSF-IgG4-Fc (al menos en un 90% y probablemente en >95% por SDS-PAGE no reductora). Los contaminantes de alto peso molecular (pesos moleculares aparentes >200 kDa mediante SDS-PAGE no reductora) y los contaminantes de bajo peso molecular (pesos moleculares aparentes <50 kDa por SDS-PAGE no reductora) se eliminaron en gran medida mediante esta etapa en columna.

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Ejemplo 11

Proteína de Fusión Multimérica de Citoquina y Factor de Crecimiento

También se pueden crear proteínas de fusión bioactivas construyendo proteínas de fusión multiméricas de los factores de crecimiento y las citoquinas mencionadas en esta solicitud. Estas proteínas de fusión multiméricas se pueden construir como se ha descrito para las proteínas de fusión de IgG excepto porque una segunda proteína de factor de crecimiento/citoquina puede sustituir al domino de IgG. Los dos factores de crecimiento/citoquinas se pueden unir entre sí con o sin aminoácidos enlazadores entre los dos factores de crecimiento/citoquinas. Los enlazadores peptídicos adecuados incluyen los descritos en los Ejemplos 1 y 4. Las proteínas de fusión pueden ser homodiméricas, heterodiméricas, homomultiméricas (comprendiendo tres o más copias del mismo factor de crecimiento/citoquina) o heteromultiméricas (comprendiendo dos o más factores de crecimiento/citoquinas diferentes). El dominio de citoquina/factor de crecimiento más carboxi-terminal se pude modificar usando procedimientos tales como PCR para delecionar la secuencia señal natural de la proteína y añadir, si se desea, una secuencia enlazadora peptídica corta que precede al primer aminoácido de la secuencia de la proteína madura. La secuencia enlazadora podría incluir un sitio de enzima de restricción para facilitar la unión al dominio amino terminal de citoquina/factor de crecimiento. En proteínas de fusión multiméricas, los dominios de citoquina/factor de crecimiento que no están en el extremo amino o carboxi de la proteína se pueden modificar para delecionar la secuencia señal natural y el codón de terminación y añadir, si se desea, enlazadores peptídicos a los extremos amino y carboxi de la proteína. Las proteínas de fusión pueden expresarse en células COS después de la transfección, purificarse y ensayarse en bioensayos in vitro apropiados. Las proteínas de fusión también se pueden expresar en células eucariotas transformadas de forma estable tales como células de mamífero, como se describe en el Ejemplo 12.

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Ejemplo 12

Expresión de Proteínas de Fusión de IgG y Factores de Crecimiento/Citoquinas Multiméricos en Células Eucariotas Transformadas de Forma Estable

Las proteínas de fusión de IgG y citoquinas/factores de crecimiento multiméricos que se han descrito en los anteriores Ejemplos también se pueden expresar en células eucariotas transformadas de forma estable tales como células de insecto o células de mamífero usando procedimientos bien establecidos. Las proteínas de fusión de IgG y citoquinas/factores de crecimiento multiméricos se purifican después del medio acondicionado. Para la expresión de alto nivel de proteínas recombinantes se usan ampliamente líneas de células CHO transfectadas de forma estable (Geisse et al. 1996; Trill et al. 1995). En células CHO, puede conseguirse la expresión de alto nivel de genes heterólogos integrados cromosómicamente mediante amplificación génica. Típicamente, el gen de interés se une a un gen marcador para el que se puede seleccionar la amplificación. Se ha descrito una diversidad de genes que proporcionan selecciones para la amplificación (Kaufman 1990) pero frecuentemente se emplea dihidrofolato reductasa (dhfr) murina. La amplificación de este gen confiere resistencia al análogo de folato metotrexato (MTX) y el nivel de resistencia aumenta con el número de copias del gen de dhfr (Alt et al., 1978). La utilidad de la selección por MTX aumenta por la disponibilidad de líneas de células CHO que son deficientes en dhfr (Urlaub y Chasin, 1980).

El experto en la técnica puede construir vectores de expresión para las proteínas de fusión de IgG o citoquinas/factores de crecimiento multiméricos que incorporan el gen de dhfr murino en el vector de expresión disponible en el mercado pCDNA3.1 (Invitrogen), que incluye el gen de la neomicina fosfotransferasa (NPT) que confiere resistencia a G418. El vector de expresión de dhfr murino pdhfr2.9 está disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Nº de catálogo 37165). Este gen de dhfr se puede seleccionar en líneas de células CHO dhfr y se pueden amplificar por selecciones convencionales para resistencia a MTX (Crouse et al 1983). La secuencia codificante de dhfr se puede escindir de pdhfr2.9 como un fragmento Bgl II de \sim 900 pb y se puede clonar en el sitio único Bam HI del polienlazador del vector de expresión pREP4 (Invitrogen). Esta construcción colocará el gen cadena abajo del promotor fuerte de RSV, que se sabe que funciona en células CHO (Trill et al, 1995) y cadena arriba de un sitio de poliadenilación obtenido a partir de SV40. Después, este casete de expresión de dhfr se puede escindir de pREP4 como un fragmento Sal I ya que los sitios Sal I flanquean de forma estrecha el promotor y el sitio de adición de poliA. Usando enlazadores oligonucleotídicos, este fragmento Sal I se puede clonar en el sitio único Bgl II de pCDNA3.1, creando pCDNA3.1(+)::dhfr^{+}. El ADN que codifica la proteína de fusión de IgG o citoquina/factor de crecimiento multimérico se puede clonar posteriormente en la región del polienlazador de este derivado de pCDNA3. (+) bajo el control del promotor de CMV. Por ejemplo, los genes de EPO-IgG1-Fc o G-CSF-IgG1-Fc se podrían escindir de los plásmidos pBBT180 y pBBT174, respectivamente, como fragmentos Hind III-Xb\alpha I y se podrían clonar en pCDNA3.1(+)::dhfr^{+} cortado en Hind III-Xb\alpha I. Se pueden usar otros sitios de enzimas de restricción únicos si estos sitios de enzimas de restricción están presentes en los genes de interés. Como alternativa, la cotransfección de pCDNA3.1(+)::dhfr^{+} y derivados de pCDNA3.1 que expresan las proteínas de fusión de IgG o citoquinas/factores de crecimiento multiméricos se podrían emplear para obtener líneas de células CHO dhfr^{+} que expresan la proteína de interés (Kaufmann, 1990).

Los ADN plasmídicos sin endotoxina se prefieren para transfectar células de mamífero tales como células COS o CHO dhfr^{-}. Las líneas de células CHO dhfr^{-} se pueden obtener de varias fuentes tales como Dr. L. Chasin en la Universidad de Columbia (CHO K1 DUKX B11) o de la Colección Americana de Cultivos Tipo (CHO duk^{-}, ATCC Nº. CRL-9096). Las células se pueden cultivar en medio F12/DMEM suplementado con FBS al 10%, glutamina, glicina, hipoxantina y timidina (Lucas et al., 1996). Se pueden realizar transfecciones mediante electroporación o usando reactivos de transfección bien conocidos por los expertos en la técnica tales como LipofectAMINE (Gibco BRL), usando los protocolos del vendedor y/o los descritos en la bibliografía (Kaufman, 1990). Se pueden seleccionar los transfectantes dhfr^{+} en F12/DMEM suplementado con FCS dializado al 7% y que carece de glutamina, glicina, hipoxantina y timidina (Lucas et al., 1996). Como alternativa, se puede seleccionar con respecto a la resistencia a G418 (codificada por el gen de NPT de pCDNA3.1) y posteriormente identificar los transfectantes con el fenotipo dhfr^{+}. Los clones dhfr^{+} se pueden expandir en medio de selección y los sobrenadantes del cultivo se pueden explorar con respecto a la expresión de las proteínas de fusión de IgG o citoquinas/factores de crecimiento multiméricos usando kits ELISA disponibles en el mercado para el factor de crecimiento o la citoquina (disponible en R & D Systems, Endogen, Inc. y Diagnostic Systems Laboratories) o mediante transferencia de Western usando antisueros apropiados (disponibles en R&D Systems, Endogen, Inc. y Diagnostic Systems Laboratories). Los clones que expresan las proteínas de fusión de IgG o citoquinas/factores de crecimiento multiméricos después se pueden agrupar y someter a múltiples ciclos de selección con respecto a la resistencia a MTX a concentraciones crecientes de fármaco como se describe por Kaufman (1990). Después de cada ciclo de selección por MTX, los clones individuales se pueden ensayar con respecto a la expresión de las proteínas de fusión de IgG o citoquinas/factores de crecimiento multiméricos. Estos procedimientos están bien descritos en la bibliografía y se han usado para expresar una diversidad de proteínas heterólogas en células CHO (revisado en Kaufman, 1990).

Las proteínas de fusión de IgG se pueden purificar a partir del medio acondicionado de células CHO. Después de retirar las células CHO mediante centrifugación, las proteínas de fusión de IgG se pueden purificar a partir del sobrenadante por cromatografía en columna de afinidad de Proteína A, usando protocolos similares a los descritos en el Ejemplo 2, seguido de etapas de cromatografía adicionales si es necesario. Las fusiones diméricas de IgG-Fc e IgG-C_{H} se pueden purificar adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular para eliminar monómeros y agregados. Las etapas de cromatografía en columna adicionales podrían incluir cromatografía de Blue Sepharose, hidroxiapatita, fase inversa, interacción hidrófoba e intercambio iónico. Estas técnicas se conocen bien por los expertos en la técnica.

Las citoquinas/factores de crecimiento multiméricos y las fusiones de citoquina/factor de crecimiento-región constante de cadena ligera también se pueden purificar a partir del medio acondicionado de células CHO. Después de la eliminación de células CHO mediante centrifugación, las citoquinas/factores de crecimiento multiméricos y las fusiones de citoquina/factor de crecimiento-región constante de cadena ligera se pueden purificar a partir del sobrenadante mediante cromatografía en columna usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas etapas de cromatografía en columna podrían incluir cromatografía de Blue Sepharose, hidroxiapatita, fase inversa, interacción hidrófoba, exclusión molecular e intercambio iónico. Las proteínas también se pueden purificar mediante cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales específicos para la citoquina/factor de crecimiento o región constante de cadena ligera.

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Aunque se han descrito con detalle diversas realizaciones de la presente invención, es evidente que a los expertos en la técnica se les ocurrirán modificaciones y adaptaciones de esas realizaciones.

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Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto. Documentos de patentes citados en la descripción

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Claims (20)

1. Una proteína de fusión que comprende eritropoyetina unida a un dominio de inmunoglobulina (Ig) sin un enlazador peptídico intermedio donde el dominio de inmunoglobulina no contiene una región variable.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, donde el dominio de inmunoglobulina es un dominio Fc, un dominio C_{H} o un dominio constante de cadena ligera.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el dominio de Ig se selecciona del grupo que consiste en IgG-Fc, IgG-C_{H} e IgG-C_{L}.

4. Una proteína de fusión purificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la proteína de fusión purificada es dimérica y esencialmente libre de proteína de fusión monomérica.

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha proteína de fusión tiene una CE_{50} de menos de aproximadamente 1.000 ng/ml en un ensayo de células dependiente de EPO.

6. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha proteína de fusión tiene una CE_{50} de menos de aproximadamente 100 ng/ml en un ensayo de células dependiente de EPO.

7. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha proteína de fusión tiene una CE_{50} de menos de aproximadamente 10 ng/ml en un ensayo de células dependiente de EPO.

8. Un procedimiento para producir una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

a.

transfectar o transformar una célula hospedadora con al menos un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7;

b.

cultivar la célula hospedadora; y

c.

recoger la proteína de fusión expresada por la célula hospedadora.

9. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

10. Una célula hospedadora transfectada o transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 9, que permite que la célula hospedadora exprese la proteína de fusión.

11. La célula hospedadora de la reivindicación 10, donde la célula hospedadora es una célula eucariota.

12. La célula hospedadora de la reivindicación 11, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.

13. La célula hospedadora de la reivindicación 11, donde la célula eucariota es una célula COS.

14. La célula hospedadora de la reivindicación 11, donde la célula eucariota es una célula CHO.

15. Un procedimiento para purificar la proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende:

a.

obtener una composición que comprende la proteína de fusión; y

b.

aislar la proteína de fusión de contaminantes mediante cromatografía en columna.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, donde la proteína de fusión se aísla de contaminantes mediante cromatografía de exclusión molecular.

17. El procedimiento de la reivindicación 15, donde la proteína de fusión se aísla de contaminantes mediante cromatografía de intercambio iónico.

18. El procedimiento de la reivindicación 15, que comprende además purificar la proteína de fusión dimérica de la proteína de fusión monomérica.

19. Uso de la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para fabricar un medicamento para tratar un hematocrito deficiente.

20. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión o una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en un portador farmacéuticamente aceptable.