JP6475630B2 - ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年11月16日に米国特許商標庁に出願された米国仮特許出願第61/727,283号、および2013年8月26日に欧州特許庁に出願された欧州特許出願第13 181 697.7号の優先権を主張するものであり、それらの全内容はすべての目的のために本明細書に組み入れられる。
本発明は、新規なストレプトアビジン突然変異タンパク質、組換えDNA技術によってそのような突然変異タンパク質を生成する方法、ならびに組換えタンパク質などの生体物質または細胞表面上に特異的受容体分子を有する細胞などの生物学的実体を単離する、精製する、および決定するためのこれらのストレプトアビジン突然変異タンパク質の使用に関する。
短いペプチドアフィニティータグは、タンパク質研究において不可欠のものとなっている。それらは、その生化学的特性のいかなる予備知識も必要とせずに、任意の融合組換えタンパク質のアフィニティー精製ばかりでなく、検出およびアッセイにも使用することができる。アフィニティータグStrep-tag(登録商標)II(Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 (非特許文献1);米国特許第5,506,121号(特許文献1)、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys、SEQ ID NO: 100を有する)は、迅速な1段階プロトコールの中で生理的条件を使用することにより高い純度かつ機能性で組換えタンパク質を提供することで、特に評判がよい。Strep-tag(登録商標)IIアフィニティータグに対する現在最も効率的なストレプトアビジンベースの受容体は、結合親和性が改善されたストレプトアビジン突然変異タンパク質であり、Strep-Tactin(登録商標)と命名されている(Voss & Skerra, Protein Engineering 10 (1997), 975-982 (非特許文献2);米国特許第6,103,493号(特許文献2)または欧州特許第0 835 934号(特許文献3))。Strep-tag(登録商標)IIは、ビオチン結合ポケットに結合し、アフィニティー樹脂の反復使用のために、ビオチン誘導体、好ましくはデスチオビオチンによる穏和な競合溶出を可能にする。Strep-tag(登録商標)II:Strep-Tactin(登録商標)システムは、組換えタンパク質(Schmidt & Skerra, Nature Protocols 2 (2007), 1528-1535 (非特許文献1)において概説されている)およびさらには細胞 (Knabel et al., Nature Medicine 8 (2002), 631-637 (非特許文献3)) の精製、検出、およびアッセイに関して、この15年間で効果的な適用を提供してきた。
、またはdi-tag2配列
である(Junttila et al., Proteomics 5 (2005), 1199-1203 (非特許文献4);米国特許第7,981,632号(特許文献4))。結合が改善された生化学的理由は、結合力効果、すなわち四量体Strep-Tactin(登録商標)に対する2つのストレプトアビジン結合部分の組み合わせ相乗的結合である。これにより、非競合的条件下での比較的速い解離速度から、相乗効果を逆転させる競合物の添加による効率的な溶出能を維持したままでの、より安定した結合に切り替わる。実際に、Di-tagは、競合条件下での効率的な溶出を含む、Strep-tag(登録商標)IIのすべての有益な適用特性を備えているが、加えて、より安定した結合を必要とする適用における、より一般的な使用も可能にする。しかしながら、1つの欠点は、それが短いStrep-tag(登録商標)IIよりもかなり大きなサイズ(3倍)を有し、これによって融合組換えタンパク質に対する悪影響がより確実になることである。
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む方法を提供する。
ストレプトアビジンの突然変異タンパク質より選択される突然変異タンパク質であって、
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸115〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
突然変異タンパク質。
[本発明1002]
野生型ストレプトアビジンのアミノ酸117〜121位の領域内に少なくとも1つの変異を含む、本発明1001の突然変異タンパク質。
[本発明1003]
アミノ酸残基が配列位置114に存在し、該アミノ酸残基が野生型スレオニンまたは任意の他のアミノ酸のいずれかである、本発明1001または1002の突然変異タンパク質。
[本発明1004]
配列位置117において芳香族アミノ酸残基を保有する、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1005]
配列位置117の芳香族アミノ酸残基がTrp、Tyr、His、またはPheである、本発明1004の突然変異タンパク質。
[本発明1006]
配列位置117において荷電アミノ酸残基を保有する、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1007]
配列位置117の荷電アミノ酸残基がGlu、Asp、またはArgである、本発明1006の突然変異タンパク質。
[本発明1008]
配列位置117において親水性残基を保有する、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1009]
親水性アミノ酸残基がAsn、Gln、Leu、Met、Ser、Ala、またはGlyである、本発明1008の突然変異タンパク質。
[本発明1010]
配列位置120において小さいアミノ酸残基を保有する、本発明1003〜1009のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1011]
配列位置120の小さいアミノ酸残基がSer、Ala、またはGlyである、本発明1010の突然変異タンパク質。
[本発明1012]
配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、本発明1003〜1011のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1013]
配列位置121において芳香族アミノ酸残基を保有する、本発明1012の突然変異タンパク質。
[本発明1014]
配列位置121のアミノ酸残基がTrp、Tyr、またはPheである、本発明1012または1013の突然変異タンパク質。
[本発明1015]
配列位置120において疎水性アミノ酸残基を保有する、本発明1004〜1009のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1016]
配列位置120の疎水性アミノ酸残基がLeu、Ile、Met、Val、Tyr、またはPheである、本発明1015の突然変異タンパク質。
[本発明1017]
配列位置121において小さいアミノ酸残基を保有する、本発明1015または1016の突然変異タンパク質。
[本発明1018]
配列位置121の小さいアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはGlnである、本発明1017の突然変異タンパク質。
[本発明1019]
配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、本発明1015または1016の突然変異タンパク質。
[本発明1020]
配列位置121の疎水性アミノ酸残基がLeu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe、またはMetである、本発明1019の突然変異タンパク質。
[本発明1021]
118位および/または119位のアミノ酸残基が欠失されている、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1022]
配列位置117において任意のアミノ酸残基を保有する、本発明1021の突然変異タンパク質。
[本発明1023]
配列位置120においてかさ高い疎水性アミノ酸残基を保有する、本発明1022の突然変異タンパク質。
[本発明1024]
配列位置120のアミノ酸残基がPhe、Tyr、Val、またはTrpである、本発明1022または1023の突然変異タンパク質。
[本発明1025]
配列位置121において疎水性アミノ酸残基を保有する、本発明1021〜1024のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1026]
配列位置121のアミノ酸残基がMet、Leu、Tyr、またはPheである、本発明1025の突然変異タンパク質。
[本発明1027]
配列位置121において小さい親水性アミノ酸残基を保有する、本発明1022〜1023のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1028]
小さい親水性残基がヒドロキシル基を有するアミノ酸である、本発明1027の突然変異タンパク質。
[本発明1029]
アミノ酸残基がSerまたはThrである、本発明1027または1028の突然変異タンパク質。
[本発明1030]
配列位置121においてArgまたはAsp残基を保有する、本発明1022〜1024のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1031]
配列位置120においてGly残基 (Gly 120 ) を含む、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1032]
配列位置121においてPheまたはTyr残基を保有する、本発明1031の突然変異タンパク質。
[本発明1033]
配列位置117においてGlu、Asp、Arg、His、Asn、Gln、Thr、Ser、Leu、またはMet残基を保有する、本発明1031または1032の突然変異タンパク質。
[本発明1034]
Aaa177はTyr、Phe、Arg、Trp、またはGlnであってよく、Baa120はTyr、Phe、Leu、Ile、またはMetであってよく、かつCaa121は任意のアミノ酸であってよく、Caa 121 は好ましくはLeu、Ile、Met、Gly、Gly、Trp、Ser、Ala、またはVal残基である、配列モチーフAaa 117 Baa 120 Caa 121 を含む、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1035]
Daa 117 およびHaa 121 は任意のアミノ酸であってよく、Eaa 118 およびFaa 119 はいずれも欠失され、かつGaa 120 はTrpまたはValであってよく、Daa 117 は好ましくはHis、Glu、Gln、Thr、Ala、またはIle残基であり、かつHaa 121 は好ましくはTyr、Leu、Met、またはArg残基である、配列モチーフDaa 117 Eaa 118 Faa 119 Gaa 120 Haa 121 を含む、本発明1001〜1003のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1036]
(a) SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 98) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO: 15)
の各々よりも高い結合親和性を有する、
ストレプトアビジン突然変異タンパク質。
[本発明1037]
2つのシステイン残基が、アミノ酸44〜53位の残基によって形成されるループ内で反対の位置に存在する、本発明1036の突然変異タンパク質。
[本発明1038]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸45位および52位に存在する、本発明1036または1037の突然変異タンパク質。
[本発明1039]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの44位および53位に存在する、本発明1036または1037の突然変異タンパク質。
[本発明1040]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの46位および51位に存在する、本発明1036または1037の突然変異タンパク質。
[本発明1041]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの47位および50位に存在する、本発明1036または1037の突然変異タンパク質。
[本発明1042]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの48位および49位に存在する、本発明1036または1037の突然変異タンパク質。
[本発明1043]
GlyまたはAla残基が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸44位に存在する、本発明1036〜1038および1040〜1042のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1044]
アミノ酸残基46がグリシンである、本発明1036〜1039および1041〜1042のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1045]
アミノ酸残基46がグリシンであり、かつアミノ酸残基47がアルギニンである、本発明1036〜1039および1042のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1046]
配列位置44〜53および/もしくは配列位置117〜121において、表1〜7によって開示される配列を有するか、またはSEQ ID NO: 18〜97のいずれかの配列を有する、本発明1001〜1045のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質。
[本発明1047]
アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、アミノ酸44〜47位においてアミノ酸配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 98) または配列Ile 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 99) を含むストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも少なくとも1.1倍高い(それぞれのK d の比によって表される)結合親和性を有する、本発明1001〜1046のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1048]
配列位置117〜121において、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、またはSEQ ID NO: 65 のアミノ酸配列を含む、本発明1001〜1046のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1049]
SEQ ID NO: 15に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基をさらに含む、本発明1001〜1035のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1050]
2つのシステイン残基が、アミノ酸44〜53位の残基によって形成されるループ内で反対の位置に存在する、本発明1049の突然変異タンパク質。
[本発明1051]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの44位および53位に存在する、本発明1049または1050の突然変異タンパク質。
[本発明1052]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸45位および52位に存在する、本発明1049または1050の突然変異タンパク質。
[本発明1053]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの46位および51位に存在する、本発明1049または1050の突然変異タンパク質。
[本発明1054]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの47位および50位に存在する、本発明1049または1050の突然変異タンパク質。
[本発明1055]
2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの48位および49位に存在する、本発明1049または1050の突然変異タンパク質。
[本発明1056]
GlyまたはAla残基が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸44位に存在する、本発明1050または1052〜1055のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1057]
N末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸10〜16の領域内で始まり、かつC末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸133〜142の領域内で終結する最小ストレプトアビジンの突然変異タンパク質である、前記本発明のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1058]
配列位置44においてGluが疎水性脂肪族アミノ酸によって置換され、配列位置45において任意のアミノ酸が存在し、配列位置46において疎水性脂肪族アミノ酸が存在し、または/かつ配列位置47においてValが塩基性アミノ酸によって置換される、前記本発明のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1059]
Alaが46位に存在する、本発明1058の突然変異タンパク質。
[本発明1060]
Argが47位に存在する、本発明1059の突然変異タンパク質。
[本発明1061]
アミノ酸44〜47位の領域内に配列Val 44 -Thr 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 98) が存在する、本発明1060の突然変異タンパク質。
[本発明1062]
アミノ酸44〜47位の領域内に配列Ile 44 Gly 45 Ala 46 Arg 47 (SEQ ID NO: 99) が存在する、本発明1060の突然変異タンパク質。
[本発明1063]
図4中に示される以下の突然変異タンパク質:m400 (SEQ ID NO: 114)、m402 (SEQ ID NO: 115)、m4001 (SEQ ID NO: 116)、突然変異タンパク質「1」-m36 (SEQ ID NO: 117)、突然変異タンパク質「1」-m23 (SEQ ID NO: 118)、突然変異タンパク質「1」-m41 (SEQ ID NO: 119)、突然変異タンパク質「1」-m4 (SEQ ID NO: 120)、突然変異タンパク質「1」-m12 (SEQ ID NO: 121)、突然変異タンパク質「1」-m22 (SEQ ID NO: 122)、突然変異タンパク質「1」-m31 (SEQ ID NO: 123)、突然変異タンパク質「1」-m32 (SEQ ID NO: 124)、突然変異タンパク質「1」-m35 (SEQ ID NO: 125)、突然変異タンパク質「1」-m38 (SEQ ID NO: 126)、突然変異タンパク質「1」-m40 (SEQ ID NO: 127)、突然変異タンパク質「1」-m42 (SEQ ID NO: 128)、突然変異タンパク質「1」-m45 (SEQ ID NO: 129)、突然変異タンパク質「1」-m46 (SEQ ID NO: 130)、突然変異タンパク質「1」-m47 (SEQ ID NO: 131)、突然変異タンパク質「1」-m7 (SEQ ID NO: 132)、突然変異タンパク質「1」-m10 (SEQ ID NO: 133)、突然変異タンパク質「1」-m17 (SEQ ID NO: 134)、突然変異タンパク質「1」-m21 (SEQ ID NO: 135)、突然変異タンパク質「1」-m24 (SEQ ID NO: 136)、突然変異タンパク質「1」-m27 (SEQ ID NO: 137)、突然変異タンパク質「1」-m28 (SEQ ID NO: 138)、突然変異タンパク質「1」-m30 (SEQ ID NO: 139)、突然変異タンパク質「1」-m33 (SEQ ID NO: 140)、突然変異タンパク質「1」-m1 (SEQ ID NO: 141)、突然変異タンパク質「1」-m3 (SEQ ID NO: 142)、突然変異タンパク質「1」-m8 (SEQ ID NO: 143)、突然変異タンパク質「1」-m15 (SEQ ID NO: 144)、突然変異タンパク質「1」-m6 (SEQ ID NO: 145)、突然変異タンパク質「1」-m9 (SEQ ID NO: 146)、突然変異タンパク質「1」-m20 (SEQ ID NO: 147)、突然変異タンパク質「1」-m34 (SEQ ID NO: 148)、突然変異タンパク質「1」-m14 (SEQ ID NO: 149)、突然変異タンパク質「1」-m18 (SEQ ID NO: 150)、突然変異タンパク質「1」-m19 (SEQ ID NO: 151)、m4001-m8 (SEQ ID NO: 152)、m4001-m21 (SEQ ID NO: 153)、m4001-m9 (SEQ ID NO: 154)、m4001-m1 (SEQ ID NO: 155)、m4001-m2 (SEQ ID NO: 156)、m4001-m3 (SEQ ID NO: 157)、m4001-m5 (SEQ ID NO: 158)、m4001-m13 (SEQ ID NO: 159)、m4001-m14 (SEQ ID NO: 160)、m4001-m24 (SEQ ID NO: 161)、m4001-m4 (SEQ ID NO: 162)、m4001-m6 (SEQ ID NO: 163)、m4001-m7 (SEQ ID NO: 164)、m4001-m10 (SEQ ID NO: 165)、m4001-m15 (SEQ ID NO: 166)、m4001-m23 (SEQ ID NO: 167)、m4001-m17 (SEQ ID NO: 168)、m4001-m12 (SEQ ID NO: 169)、m4001-m20 (SEQ ID NO: 170)、突然変異タンパク質「1」-m101 (SEQ ID NO: 171)、突然変異タンパク質「1」-m106 (SEQ ID NO; 172)、突然変異タンパク質「1」-m111 (SEQ ID NO: 173)、突然変異タンパク質「1」-m100 (SEQ ID NO: 174)、突然変異タンパク質「1」-m110 (SEQ ID NO: 175)、突然変異タンパク質「1」-m104 (SEQ ID NO: 176)、突然変異タンパク質「1」-m108 (SEQ ID NO: 177)、突然変異タンパク質「1」-m207 (SEQ ID NO: 178)、突然変異タンパク質「1」-m212 (SEQ ID NO: 179)、突然変異タンパク質「1」-m202 (SEQ ID NO: 180)、突然変異タンパク質「1」-m204 (SEQ ID NO: 181)、突然変異タンパク質「1」-m206 (SEQ ID NO: 182)、突然変異タンパク質「1」-m208 (SEQ ID NO: 183)、突然変異タンパク質「1」-m203 (SEQ ID NO: 184)、突然変異タンパク質「1」-m209 (SEQ ID NO: 185)、突然変異タンパク質「1」-m200 (SEQ ID NO: 186)、突然変異タンパク質「1」-m201 (SEQ ID NO: 187)、突然変異タンパク質「1」-m211 (SEQ ID NO: 188)、突然変異タンパク質「1」-m300 (SEQ ID NO: 189)、突然変異タンパク質「1」-m301 (SEQ ID NO: 190)、突然変異タンパク質「1」-m302 (SEQ ID NO:191)、突然変異タンパク質「1」-m303 (SEQ ID NO: 192)、突然変異タンパク質「1」-m304 (SEQ ID NO; 193)、およびm1-9 (SEQ ID NO: 194)
のいずれかの配列を含む、本発明1001〜1062のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1064]
ペプチドリガンドに対する結合親和性が、競合溶出が、ビオチン、チオビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA、または/およびジメチル-HABAより選択されるストレプトアビジンリガンドによって起こり得る程のものである、本発明1001〜1063のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1065]
少なくとも1つの標識基を保有する、前記本発明のいずれかの突然変異タンパク質。
[本発明1066]
本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
[本発明1067]
有効な機能的環境中に、本発明1066の核酸の少なくとも1コピーを含むベクター。
[本発明1068]
本発明1067のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
[本発明1069]
本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質を生成する方法であって、
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む、方法。
[本発明1070]
段階 (c) が、宿主細胞を溶解する段階、封入体の形態のストレプトアビジン突然変異タンパク質を単離する段階、および該ストレプトアビジン突然変異タンパク質を再生する段階を含む、本発明1069の方法。
[本発明1071]
段階 (b) における発現が、シグナルペプチド保有ストレプトアビジンの発現、および宿主細胞のペリプラズムまたは培養液中へのその分泌を含む、本発明1070の方法。
[本発明1072]
宿主細胞が大腸菌である、本発明1069〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を単離する、精製する、または決定する方法であって、該タンパク質を含む試料を本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ペプチド配列が該ストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合するのに適した条件下で接触させる段階、および得られた複合体を該試料から分離する段階を含む、方法。
[本発明1074]
ストレプトアビジン突然変異タンパク質が固相に結合しているか、またはそれに結合することができる、本発明1073の方法。
[本発明1075]
複合体から融合タンパク質を放出させるために、複合体を、ビオチンおよびその誘導体より選択される、十分な量のストレプトアビジン突然変異タンパク質のリガンドと共にインキュベートする、本発明1074の方法。
[本発明1076]
ビオチン誘導体がチオビオチンである、本発明1075の方法。
[本発明1077]
ペプチド配列が、
より選択される、本発明1073〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記複合体から前記タンパク質を放出させる段階をさらに含む、本発明1075〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
前記タンパク質を決定する段階をさらに含む、本発明1078の方法。
[本発明1080]
a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を決定する方法であって、該タンパク質を本発明1054のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ストレプトアビジン突然変異タンパク質と結合させるための適切な条件下で接触させる段階、および標識を決定する段階を含む、方法。
[本発明1081]
ペプチド配列が、
である、本発明1080の方法。
[本発明1082]
a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を固定化する方法であって、該タンパク質を固定化するための条件下で、該タンパク質を、本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する固相に接触させる段階を含む、方法。
[本発明1083]
ペプチド配列が、
である、本発明1082の方法。
[本発明1084]
ストレプトアビジンに結合し得る基を保有する物質を決定するまたは単離する方法であって、該物質を本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質と、それに対する結合に適した条件下で接触させる段階、および該物質を決定するまたは単離する段階を含む、方法。
[本発明1085]
本発明1001〜1065のいずれかのストレプトアビジン突然変異タンパク質、ならびに緩衝液、補助物質、および添加物からなる群より選択される少なくとも1つの試薬を含む試薬キット。
本発明のこれらの局面は、以下の説明、図面、および非限定的な実施例を考慮して、より十分に理解されるであろう。
進化的な研究アプローチにおいて、ここで驚くべきことに、Strep-tag(登録商標)IIアフィニティーペプチド (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) に対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性が様々な方法で顕著に増加し得ることが見出された。実験の第1セットでは、アミノ酸44〜53の領域内にジスルフィド架橋を導入することにより、突然変異タンパク質「1」(SEQ ID NO: 112) (44〜47=VTAR) および突然変異タンパク質「2」(SEQ ID NO: 113) (44〜47=IGAR) の、US 6,103,493によって開示された結合親和性と比較して、Strep-tag(登録商標)IIに対する結合親和性が顕著に増加したストレプトアビジン突然変異タンパク質を得ることができた。実験の第2セットでは、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって、Strep-tagIIに対する結合親和性を改善することができた。アミノ酸44〜53の領域においてどのストレプトアビジン突然変異タンパク質、すなわちUS 6,103,493によって開示された突然変異タンパク質「1」または本発明の最も好ましいジスルフィド含有突然変異タンパク質を出発点として用いたかにかかわらず、アミノ酸115〜121位の領域内の同様の変異/アミノ酸交換が観察され、それによって、アミノ酸115〜121位の領域内の変異によって見出される親和性増加がアミノ酸44〜53の配列に依存しないことが示される。このように、本発明のこれら2つの局面の各々によって、野生型ストレプトアビジン(wt-ストレプトアビジン)を含む任意のストレプトアビジン突然変異タンパク質のStrep-tag(登録商標)II結合親和性が改善される。
が欠失されている突然変異タンパク質。この突然変異タンパク質は、Fletcher et alにおいてSAPVと命名されている。2. 欠失された9アミノ酸残基Thr-Thr-Glu-Asp-Asn-Ala-Trp-Lysがアミノ酸配列
によって置換されている、Fletcher et alにおいてSAPV-Alb5およびSAPV-84と命名された2つの突然変異タンパク質。
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該ポリペプチドを単離する段階。
、di-tag2配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 109)、または配列
である。ペプチド配列は好ましくは、タンパク質のN末端または/およびC末端に融合される。ストレプトアビジン突然変異タンパク質は、固相に結合していてよく、またはそれに結合することができる。
、または国際特許出願第WO02/077018号もしくは米国特許第7,981,632号において記載されているような任意の他の配列などの、連続配置されたストレプトアビジン結合モジュールに融合されているアフィニティーリガンドを、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質と共に使用することもまた可能である。本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質のより高い親和性は、安定性および適応性が改善された多量体試薬を提供する。このような細胞精製適用において有用であるためには、本発明の突然変異タンパク質は、好ましくは多量体化され、任意に蛍光色素で直接標識されるか、または磁気ビーズもしくは任意の他の固体支持体上に固定化される。細胞精製に関して、磁気ビーズはマイクロビーズまたはナノビーズであってよく、他の固体支持体は、カラム精製アプローチを遂行するためにカラムクロマトグラフィーにおいて使用される樹脂であってよい。
である。別の態様において、ペプチド配列は、配列
である。この固定化は好ましくは、マイクロタイタープレート、ビーズ(例えば、アガロース、または例えばポリメタクリル酸のような他のポリマーでできている)、有機材料もしくは常磁性材料でできたマイクロビーズ、有機材料もしくは常磁性材料でできたナノビーズ、またはBiacore(商標)チップなどのセンサーチップ、または例えば側方流動アッセイのために、もしくはタンパク質アレイを作製するために用いられるような他の支持体などの、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた固相上で実施される。
表1〜7は、それぞれ異なるライブラリー1〜7のスクリーニングに由来する様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質配列の概要を示すものであり、フィルターサンドイッチアッセイにおいてその様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質から得られた相対シグナル強度も含めてある。ランダム化された位置はXaaで示される。比較のために、対応する位置における、wtストレプトアビジンおよびUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」のアミノ酸配列を示してある(ライブラリー4の結果を示す表4は除くが、ここでは、これらの突然変異タンパク質は本発明のm4001に由来し、US 6,103,493の突然変異タンパク質「1」に由来するものではないという理由で、同じ配列がm4001のものと表示されている)。したがって、表3および5〜7に示される突然変異タンパク質はすべて、US 6,103,496の突然変異タンパク質「1」に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。表4の突然変異タンパク質は、本発明の突然変異タンパク質m4001に由来し、したがってアミノ酸44〜53位の領域に関してこれと同一である。
DNA操作は、従来の遺伝子操作方法によって実施した(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Pressを参照されたい)。分泌型ストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリー発現には大腸菌K12 TG1 (Stratagene) を使用し、クローニングおよびライブラリー発現には大腸菌K12 TOP10 (Life Technologies) を使用し、ならびにいずれもStrep-tagIIに融合された大腸菌シトクロムb562およびアルカリホスファターゼのペリプラズム発現には、大腸菌K12 JM83 (Yanisch-Peron et al., (1985), Gene 33, 103-119) を使用した。Sepharoseに結合させるため、またはマイクロタイタープレートをコーティングするための、その後のタンパク質単離のための突然変異タンパク質のサイトゾル発現は、Schmidt and Skerra (1994)、前記に従って実施した。プラスミド配列決定は、Sequence Laboratories Gottingen GmbHにより、標準的なジデオキシ技法に従って実施した。プライマーおよびオリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems Expedite DNA合成機を使用して合成した。
アミノ酸44〜52位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP1およびP2を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、ここで3'末端のTはホスホロチオエート結合によって連結されている、および
。
アミノ酸44〜52位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、pfuポリメラーゼ (Fermentas) ならびに以下のプライマーP2およびP3を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、ここで3'末端のAはホスホロチオエート結合によって連結されている、および
。
アミノ酸115〜121位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP5を用いて、pASK-IBA2-SAm4001のPCR増幅によって調製した:
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP4およびP6を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP7およびP8を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
アミノ酸115〜121位(wt-ストレプトアビジンを参照)の領域において変異誘発されたストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」誘導体をコードするDNA配列を有するプラスミドバンクを、PfuUltraポリメラーゼ (Stratagene) ならびに以下のプライマーP9およびP10を用いて、pASK-IBA2-SAm1のPCR増幅によって調製した:
、これは5'末端でリン酸化されている、および
、同様に5'末端でリン酸化されている。
ペプチドリガンドに対する増加した結合親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を同定するために、pASK75-phoA (SEQ ID NO. 1) によってコードされる、大腸菌のアルカリホスファターゼ (BAP)、およびそのC末端に付着したStrep-tag(登録商標)IIペプチド (WSHPQFEK) を含む融合タンパク質を調製した。このために、pASK75-phoAをJM83を用いて発現させ、Schmidt and Skerra (2007)、前記の手順によるストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィーの代わりにStrep-Tactin(登録商標)を使用し、溶出剤としてのジアミノビオチンの代わりにデスチオビオチンを使用したことのみ変更して、US 6,103,493に記載されるように組換えタンパク質を精製した。さらなるアッセイにおいてBAP-Strep-tag(登録商標)II融合タンパク質(BAP-StrepIIとしても示される)を使用する前に、デスチオビオチンを透析によって除去した。
組換え最小ストレプトアビジンの公知の発現系(Schmidt and Skerra (1994)、前記)を使用して、ストレプトアビジン突然変異タンパク質を調製規模で生成した。このために、wt-ストレプトアビジンのコード領域およびT7プロモーターを含むベクターpSA1から、唯一のSacIIおよびHindIII制限部位を使用してコード領域の主要部分を除去し、変異型pASK-IBA2-SAm1プラスミドからの対応する領域によって置換した。続いて、Schmidt and Skerra (1994)、前記に記載されているように、wt-ストレプトアビジンおよびストレプトアビジン突然変異タンパク質を細胞質封入体の形態で発現させ、可溶化し、再生し、分画硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。得られたストレプトアビジン突然変異タンパク質の純度を、Agilent 2100 Bioanalyzerによって調べた。本出願において記載されるストレプトアビジン突然変異タンパク質はそれぞれ、> 90%の純度で得られた。エルマン試薬(5,5'-ジチオビス-(2-ニトロ安息香酸))を用いてかつ412 nmの吸光度を測定して、234μM溶液(単量体の理論的モル吸光係数ε280=42060 cm-1M-1を用いて決定)を還元型1,4-ジチオ-D-スレイトール (DTT) 標準物質の段階希釈と比較して探索することにより、精製ストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001における45位と52位のシステインのジスルフィド形成は98.6%であると決定された。
ペプチドリガンドStrep-tagIIに対するストレプトアビジン突然変異タンパク質の結合親和性を決定するために、ELISAを実施した。
実施例9に記載されるように、ストレプトアビジン突然変異タンパク質(ライブラリー1由来のm400;ライブラリー2由来のm4001;ライブラリー3由来のm4、m23、m36、m41、m45;ライブラリー5由来のm111;ライブラリー6由来のm207、m212;およびライブラリー7由来のm301、m302)、ならびにUS 6,103,493のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」およびwt-ストレプトアビジンを調製した。次いで、製造業者の説明書に従って、タンパク質をNHS活性化Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) に結合させた(Schmidt and Skerra, 1994、前記を参照されたい)。製造業者の説明書に従ってBCAアッセイ (Pierce) を用いて、各ストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を決定した。簡潔に説明すると、50μlの緩衝液 (100 mM Tris-Cl pH 8) 中の10% v/v Sepharoseゲル懸濁液を、新たに調製したBCA試薬と混合し、37℃で30分間インキュベートした。各測定においては、平行して、同緩衝液中に溶解した様々な濃度のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」の標準物質を用いて、参照曲線を決定した。適合させた(二次多項式)参照曲線に関して決定された、様々なストレプトアビジン突然変異タンパク質によるSepharoseゲルの負荷を、3回の独立した測定の平均値の結果として表9および10に示す。固相結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質に対するこのBCAアッセイベースの決定方法の妥当性対照として、ストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」による公知の負荷の参照Sepharoseゲルを平行して測定した。結果として得られたBCA由来値は、参照測定値から1%未満しか逸脱しておらず、したがって、BCAアッセイが、Sepharose結合ストレプトアビジン突然変異タンパク質を決定するための信頼性のあるデータを提供することが判明した。
突然変異タンパク質m4001-m9(図4、ストレプトアビジンアミノ酸配列の117〜121位にSEQ ID NO: 58 Glu117Asn118Ala119Gly120Tyr121のアミノ酸配列を含む)は、それぞれ44位、45位、46位、52位にアミノ酸Ala、Cys、Gly、Cysを保有するストレプトアビジン突然変異タンパク質m4001(図4)に基づき、アミノ酸117位、120位、および121位をランダム化したストレプトアビジン突然変異タンパク質のライブラリーのスクリーニングの最上位結果の1つであった。選択基準/品質決定パラメータは、フィルターサンドイッチアッセイにおいて生じたシグナル強度であった(実施例8)。これらの結果に基づき、117位、120位、および121位で同定されたアミノ酸Glu、Gly、およびTyrを、突然変異タンパク質m4001の状況から突然変異タンパク質「1」の状況に移行させて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9を得た(突然変異タンパク質m1-9の完全なアミノ酸配列については図4を参照されたい)。したがって、アミノ酸残基43〜52によって形成されるループのためのある特定のアミノ酸配列の状況において、アミノ酸領域115〜121について得られた結果(ストレプトアビジン結合ペプチドに対する改善された結合親和性)、すなわちm4001の配列を、領域43〜52の別のアミノ酸配列、すなわちこの場合は突然変異タンパク質「1」の配列と組み合わせた。この新たな組み合わせストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9と、2つの異なるStrep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質またはdi-tag3融合タンパク質との相互作用について、親和性をBiaCore(商標)により測定し、これらの融合タンパク質のストレプトアビジン突然変異タンパク質「1」に対する親和性と比較した(表11)。突然変異タンパク質m1-9は、GFP-StrepII(緑色蛍光タンパク質)に対しておよそ10倍、およびCytb562-StrepIIに対しておよそ30倍の親和性増加を提供する。これは、BAP-Strep-tagII (mono-tag) 融合タンパク質との相互作用に関して、ランダムライブラリーから直接行われる本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質の選択について測定された親和性増加と同様の範囲内であり(表8)、本発明の突然変異タンパク質が公知の突然変異タンパク質「1」を上回るという利点が確認される。
本質的に実施例11に記載される通りに、ストレプトアビジン突然変異タンパク質m1-9をアガロース (Superflow) 上に固定化した。得られた樹脂は、233 nmol/mlというビオチン結合能を有した(100%の活性と仮定して、樹脂1 ml当たり3.1 mgの突然変異タンパク質m1-9の負荷密度に相当する)。カラムに0.5 mlの樹脂を充填し、重力流下で粗製大腸菌抽出物からのGFP-StrepIIの反復精製に使用して、反復精製サイクルへのその適合性を試験した。各精製サイクル後に、GFP-StrepIIの収率および純度を決定した。
本発明は、公知のストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも、Strep-tagII融合タンパク質に対する顕著に増加した親和性を有するストレプトアビジン突然変異タンパク質を提供する。しかしながら、所与の適用において、より高い親和性が必要とされる場合には、限界が依然として存在し得る。これは、結合パートナーの少なくとも一方‐Strep-tag(登録商標)II融合タンパク質または各ストレプトアビジン突然変異タンパク質‐が非常に低濃度で存在するかまたは適用される場合の精製状況において起こり得る。このような例は、Strep-tag(登録商標)II融合タンパク質の発現不良、および/または細胞溶解に大きな緩衝液容積を使用する場合、もしくはStrep-tag(登録商標)II融合タンパク質が細胞培養液に分泌される場合である。これらのすべての場合において、低濃度の標的タンパク質を含む大きな試料容積が、アフィニティーカラムに適用される。それに対して、例えばカラム精製と対照的なバッチ精製の場合のような、ストレプトアビジン突然変異タンパク質反応パートナーの希釈もまた、最適以下の性能をもたらす。しかしながら、精製の下流の他の適用もまた、より高い親和性から恩恵を受け得る。その実例は、アッセイ開発のための、ストレプトアビジン突然変異タンパク質でコーティングされた固相上での、解析されるべき専用の標的タンパク質(またはStrep-tagIIと化学的に融合された他の分子)の指向的で、穏和で、かつ安定した固定化である。固相および対応するアッセイの例は、ELISAのためのマイクロプレート、タンパク質:タンパク質、タンパク質:ペプチド、およびタンパク質:小分子相互作用を解析するための無標識のリアルタイム測定を提供する、例えばForteBioのOctet(登録商標)もしくはGEのBiaCore(登録商標)ファミリーの装置のためのバイオセンサー、その表面上に結合している多数の分析物のハイスループット解析のためのチップ、または例えばタンパク質:タンパク質相互作用解析のための、磁気ビーズもしくはalphascreen(登録商標)ビーズもしくはluminex(登録商標)ビーズのようなビーズである。このような例のすべてにおいて、ストレプトアビジン突然変異タンパク質による各固相のコーティングは、該固相に対する任意のタンパク質の簡便で、再現性があり、穏和で、かつ安定した固定化のための一般的プラットフォームを提供すべきである。これは、さもなくば、特定の固定化手順を、固定化されるおよび解析される各タンパク質について個別に開発しなければならないため、極めて役に立つ。
についても試験した。米国特許第7,981,632号はまた、Strep-tag(登録商標)アフィニティーシステムについて、そのようなタンデム配置の利点‐両方のStrep-tag(登録商標)II配列の四量体ストレプトアビジン突然変異タンパク質への同時結合をもたらし、それによって効率的な競合溶出の維持の下で、より高い結合安定性を提供する、を記載している。本実施例では、di-tag3融合タンパク質を用いてデータが作成されたが、利点はこの特定のdi-tag3ストレプトアビジン結合突然変異タンパク質の使用に限定されない。むしろ、結合力効果はまた、米国特許第7,981,632号に記載されている任意の他の連続配置されたストレプトアビジン結合モジュールを用いても達成され、それによって他の親和性特性がさらに増強される。
0,000015 s-1)は、T1/2 = In2/koff = 46,209秒 = 770分 = > 12時間という半減期を伴う相互作用を特定する。一価の相互作用の場合には、このように遅い解離速度は、再結合が起こり得ないという仮定の下で、結合している分子のおよそ95%を放出させるのに2日を要するため、これは競合溶出によって効率的に破壊され得ない。したがって、このような一価の相互作用は、穏和な生理的条件下で達成され得るという理由で、および非特異的結合混入物が溶出中に樹脂から最小限に放出されるために高純度を提供するという理由で好ましい競合溶出を用いるアフィニティークロマトグラフィーには適していないと考えられる。しかしながら、親和性結合相互作用の解離速度は、競合条件下では、最も遅い解離速度を有する単一相互作用部分の解離速度と類似する。したがって、di-tag3融合タンパク質は、本発明のストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する(その上に固定化された)アフィニティー樹脂からなお、かなり効率的に溶出され得る。これらの融合タンパク質を溶出させるこの能力は、突然変異タンパク質「1」と相互作用するストレプトアビジン結合ペプチドdi-tag3について米国特許第7,981,632号においてなされた観察と一致する。その上に突然変異タンパク質m1-9が固定化されているカラムからの溶出挙動は、実際にGFP-StrepIIおよびGFP-di-tag3に関して類似しており、上記でなされた理論的考察が実際に適切であることが示される(データは示さず)。GFP-StrepIIの解離速度は、T1/2 = 161秒を特定し、そのため結合している分子の95%を置換するのにおよそ11分が必要である。これは、アフィニティークロマトグラフィーにおける効率的な溶出に支障を来たさない。できるだけ濃縮された標的タンパク質を得るためには、第1段階において、競合物を含む1カラム体積 (CV) の溶出緩衝液を用いてカラムを浸水させ得る。次に、流動を10〜20分間停止して、結合している標的タンパク質の置換を可能にしてから、溶出緩衝液により流動を再開することによってこれを溶出させることができる。あるいは、溶出を非常に遅い流速で行って、標的タンパク質をより高濃度で提供することもできる。
Claims (42)
- ストレプトアビジンの突然変異タンパク質より選択される突然変異タンパク質であって、
(a) SEQ ID NO:212に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸117〜121位の領域内に少なくとも2つの変異を含み、かつ
(b) アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、
(i) アミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO: 98) を含む、SEQ ID NO:112のストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(ii) アミノ酸44〜47位において、アミノ酸配列Ile44-Gly45-Ala46-Arg47(SEQ ID NO: 99) を含む、SEQ ID NO:113のストレプトアビジン突然変異タンパク質、または
(iii) 野生型ストレプトアビジン (SEQ ID NO:212)
の各々よりも高い結合親和性を有し、
配列位置117における変異残基としてGlu、Asp、Ala、His、Gln、Arg、Gly、Tyr、Phe、IleおよびThrからなる群より選択されるアミノ酸残基を保有し、
配列位置120において野生型Trpを保有するか、または配列位置120における変異残基としてSer、Gly、Met、Phe、TyrおよびProからなる群より選択されるアミノ酸残基を保有し、または
配列位置121における変異残基としてLeu、Tyr、Phe、Ala、Trp、ArgおよびMetからなる群より選択されるアミノ酸残基を保有する、突然変異タンパク質。 - アミノ酸残基が配列位置114に存在し、該アミノ酸残基が野生型スレオニンである、請求項1記載の突然変異タンパク質。
- 118位および/または119位のアミノ酸残基が欠失されている、請求項1または2記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100) を含むペプチドリガンドに対して、アミノ酸44〜47位においてアミノ酸配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) を含むSEQ ID NO: 16のストレプトアビジン突然変異タンパク質またはアミノ酸配列Ile 44 -Gly 45 -Ala 46 -Arg 47 (SEQ ID NO: 99)を含むSEQ ID NO: 17のストレプトアビジン突然変異タンパク質よりも少なくとも1.1倍高い(それぞれのKdの比によって表される)結合親和性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置117〜121において、
SEQ ID NO: 21として表されるTyr 117 Asn 118 Ala 119 Phe 120 Met 121 、
SEQ ID NO: 22として表されるTyr 117 Asn 118 Ala 119 Tyr 120 Ala 121 、
SEQ ID NO: 23として表されるAla 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Tyr 121 、
SEQ ID NO: 33として表されるTyr 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Phe 121 、
SEQ ID NO: 55として表されるGly 117 Asn 118 Ala 119 Met 120 Met 121 、
SEQ ID NO: 56として表されるGlu 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Phe 121 、
SEQ ID NO: 57として表されるAsp 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Tyr 121 、
SEQ ID NO: 58として表されるGlu 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Tyr 121 、
SEQ ID NO: 59として表されるArg 117 Asn 118 Ala 119 Met 120 Met 121 、
SEQ ID NO: 60として表されるArg 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Phe 121 、
SEQ ID NO: 61として表されるAla 117 Asn 118 Ala 119 Pro 120 Ala 121 、
SEQ ID NO: 62として表されるAla 117 Asn 118 Ala 119 Met 120 Val 121 、
SEQ ID NO: 63として表されるGln 117 Asn 118 Ala 119 Ser 120 Ala 121 、
SEQ ID NO: 64として表されるAla 117 Asn 118 Ala 119 Gly 120 Phe 121 、
SEQ ID NO: 65として表されるGln 117 Asn 118 Ala 119 Met 120 Val 121 、
SEQ ID NO: 75として表されるTyr 117 Asn 118 Ala 119 Phe 120 Leu 121 、
SEQ ID NO: 76として表されるPhe 117 Asn 118 Ala 119 Phe 120 Leu 121 、
SEQ ID NO: 77として表されるTyr 117 Asn 118 Ala 119 Leu 120 Trp 121 、
SEQ ID NO: 82として表されるThr 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Leu 121 、
SEQ ID NO: 83として表されるHis 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Leu 121 、
SEQ ID NO: 84として表されるIle 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Arg 121 、
SEQ ID NO: 85として表されるHis 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Thr 121 、
SEQ ID NO: 86として表されるThr 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Arg 121 、
SEQ ID NO: 87として表されるAla 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Arg 121 、
SEQ ID NO: 93として表されるAla 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Tyr 121 、
SEQ ID NO: 94として表されるHis 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Met 121 、
SEQ ID NO: 95として表されるHis 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Tyr 121 、
SEQ ID NO: 96として表されるGlu 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Tyr 121 、または
SEQ ID NO: 97として表されるGln 117 --- 118 --- 119 Trp 120 Tyr 121
のアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。 - SEQ ID NO: 212に記載の野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列を参照して、アミノ酸44〜53位の領域内に少なくとも2つのシステイン残基をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、アミノ酸44〜53位の残基によって形成されるループ内で反対の位置に存在する、請求項6記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの44位および53位に存在する、請求項6または7記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸45位および52位に存在する、請求項6または7記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの46位および51位に存在する、請求項6または7記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの47位および50位に存在する、請求項6または7記載の突然変異タンパク質。
- 2つのシステイン残基が、野生型ストレプトアビジンの48位および49位に存在する、請求項6または7記載の突然変異タンパク質。
- GlyまたはAla残基が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸44位に存在する、請求項7または9〜12のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- N末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸10〜16の領域内で始まり、かつC末端側が野生型ストレプトアビジンのアミノ酸133〜142の領域内で終結する最小ストレプトアビジンの突然変異タンパク質である、請求項1〜13のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 配列位置44においてGluが疎水性脂肪族アミノ酸によって置換され、配列位置45において任意のアミノ酸が存在し、配列位置46において疎水性脂肪族アミノ酸が存在し、または/かつ配列位置47においてValが塩基性アミノ酸によって置換される、請求項1〜14のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- Alaが46位に存在する、請求項15記載の突然変異タンパク質。
- Argが47位に存在する、請求項16記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸44〜47位の領域内に配列Val44-Thr45-Ala46-Arg47 (SEQ ID NO: 98) が存在する、請求項17記載の突然変異タンパク質。
- アミノ酸44〜47位の領域内に配列Ile44 Gly45Ala46 Arg47 (SEQ ID NO: 99) が存在する、請求項17記載の突然変異タンパク質。
- 図4中に示される以下の突然変異タンパク質:突然変異タンパク質「1」-m36 (SEQ ID NO: 117)、突然変異タンパク質「1」-m23 (SEQ ID NO: 118)、突然変異タンパク質「1」-m41 (SEQ ID NO: 119)、突然変異タンパク質「1」-m4 (SEQ ID NO: 120)、突然変異タンパク質「1」-m12 (SEQ ID NO: 121)、突然変異タンパク質「1」-m22 (SEQ ID NO: 122)、突然変異タンパク質「1」-m31 (SEQ ID NO: 123)、突然変異タンパク質「1」-m32 (SEQ ID NO: 124)、突然変異タンパク質「1」-m35 (SEQ ID NO: 125)、突然変異タンパク質「1」-m38 (SEQ ID NO: 126)、突然変異タンパク質「1」-m40 (SEQ ID NO: 127)、突然変異タンパク質「1」-m42 (SEQ ID NO: 128)、突然変異タンパク質「1」-m45 (SEQ ID NO: 129)、突然変異タンパク質「1」-m46 (SEQ ID NO: 130)、突然変異タンパク質「1」-m47 (SEQ ID NO: 131)、突然変異タンパク質「1」-m7 (SEQ ID NO: 132)、突然変異タンパク質「1」-m10 (SEQ ID NO: 133)、突然変異タンパク質「1」-m17 (SEQ ID NO: 134)、突然変異タンパク質「1」-m21 (SEQ ID NO: 135)、突然変異タンパク質「1」-m24 (SEQ ID NO: 136)、突然変異タンパク質「1」-m27 (SEQ ID NO: 137)、突然変異タンパク質「1」-m28 (SEQ ID NO: 138)、突然変異タンパク質「1」-m30 (SEQ ID NO: 139)、突然変異タンパク質「1」-m33 (SEQ ID NO: 140)、突然変異タンパク質「1」-m1 (SEQ ID NO: 141)、突然変異タンパク質「1」-m3 (SEQ ID NO: 142)、突然変異タンパク質「1」-m8 (SEQ ID NO: 143)、突然変異タンパク質「1」-m15 (SEQ ID NO: 144)、突然変異タンパク質「1」-m6 (SEQ ID NO: 145)、突然変異タンパク質「1」-m9 (SEQ ID NO: 146)、突然変異タンパク質「1」-m20 (SEQ ID NO: 147)、突然変異タンパク質「1」-m34 (SEQ ID NO: 148)、突然変異タンパク質「1」-m14 (SEQ ID NO: 149)、突然変異タンパク質「1」-m18 (SEQ ID NO: 150)、突然変異タンパク質「1」-m19 (SEQ ID NO: 151)、突然変異タンパク質「1」-m101 (SEQ ID NO: 171)、突然変異タンパク質「1」-m106 (SEQ ID NO; 172)、突然変異タンパク質「1」-m111 (SEQ ID NO: 173)、突然変異タンパク質「1」-m100 (SEQ ID NO: 174)、突然変異タンパク質「1」-m110 (SEQ ID NO: 175)、突然変異タンパク質「1」-m104 (SEQ ID NO: 176)、突然変異タンパク質「1」-m108 (SEQ ID NO: 177)、突然変異タンパク質「1」-m207 (SEQ ID NO: 178)、突然変異タンパク質「1」-m212 (SEQ ID NO: 179)、突然変異タンパク質「1」-m202 (SEQ ID NO: 180)、突然変異タンパク質「1」-m204 (SEQ ID NO: 181)、突然変異タンパク質「1」-m206 (SEQ ID NO: 182)、突然変異タンパク質「1」-m208 (SEQ ID NO: 183)、突然変異タンパク質「1」-m203 (SEQ ID NO: 184)、突然変異タンパク質「1」-m209 (SEQ ID NO: 185)、突然変異タンパク質「1」-m200 (SEQ ID NO: 186)、突然変異タンパク質「1」-m201 (SEQ ID NO: 187)、突然変異タンパク質「1」-m211 (SEQ ID NO: 188)、突然変異タンパク質「1」-m300 (SEQ ID NO: 189)、突然変異タンパク質「1」-m301 (SEQ ID NO: 190)、突然変異タンパク質「1」-m302 (SEQ ID NO:191)、突然変異タンパク質「1」-m303 (SEQ ID NO: 192)、突然変異タンパク質「1」-m304 (SEQ ID NO; 193)、およびm1-9 (SEQ ID NO: 194)
のいずれかの配列を含む、請求項1〜19のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。 - ペプチドリガンドに対する結合親和性が、競合溶出が、ビオチン、チオビオチン、イミノビオチン、リポ酸、デスチオビオチン、ジアミノビオチン、HABA、または/およびジメチル-HABAより選択されるストレプトアビジンリガンドによって起こり得る程のものである、請求項1〜20のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 少なくとも1つの標識基を保有する、請求項1〜21のいずれか一項記載の突然変異タンパク質。
- 請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする配列を含む核酸分子。
- 有効な機能的環境中に、請求項23記載の核酸の少なくとも1コピーを含むベクター。
- 請求項24記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞。
- 請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質を生成する方法であって、
(a) ストレプトアビジン突然変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターで適切な宿主細胞を形質転換する段階、
(b) ストレプトアビジン突然変異タンパク質の発現が起こる条件下で、該宿主細胞を培養する段階、
(c) 該突然変異タンパク質を単離する段階
を含む、方法。 - 段階 (c) が、宿主細胞を溶解する段階、封入体の形態のストレプトアビジン突然変異タンパク質を単離する段階、および該ストレプトアビジン突然変異タンパク質を再生する段階を含む、請求項26記載の方法。
- 段階 (b) における発現が、シグナルペプチド保有ストレプトアビジンの発現、および宿主細胞のペリプラズムまたは培養液中へのその分泌を含む、請求項27記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌である、請求項26〜28のいずれか一項記載の方法。
- a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を単離する、精製する、または決定する方法であって、該タンパク質を含む試料を請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ペプチド配列が該ストレプトアビジン突然変異タンパク質に結合するのに適した条件下で接触させる段階、および得られた複合体を該試料から分離する段階を含む、方法。
- ストレプトアビジン突然変異タンパク質が固相に結合しているか、またはそれに結合することができる、請求項30記載の方法。
- 複合体から融合タンパク質を放出させるために、複合体を、ビオチンおよびその誘導体より選択される、十分な量のストレプトアビジン突然変異タンパク質のリガンドと共にインキュベートする、請求項31記載の方法。
- ビオチン誘導体がチオビオチンである、請求項32記載の方法。
- ペプチド配列が、
Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 102)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 100)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 103)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 109)またはTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 110)
より選択される、請求項30〜33のいずれか一項記載の方法。 - 前記複合体から前記タンパク質を放出させる段階をさらに含む、請求項31〜34のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質を決定する段階をさらに含む、請求項35記載の方法。
- a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を決定する方法であって、該タンパク質を請求項11記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、該ストレプトアビジン突然変異タンパク質と結合させるための適切な条件下で接触させる段階、および標識を決定する段階を含む、方法。
- ペプチド配列が、
Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 102)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO. 100)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 103)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 109)またはTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 110)
である、請求項37記載の方法。 - a) 式Trp-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa (SEQ ID NO: 101) のペプチド配列、式中、Xaaは任意のアミノ酸を示し、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyを示すか、またはYaaはGluを示しかつZaaはArgもしくはLysを示す、またはb) 少なくとも2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置を含むペプチド配列、この場合、2つのモジュール間の距離は少なくとも0でかつ50アミノ酸以下であり、この場合、一方の結合モジュールは3〜8アミノ酸を有しかつ少なくとも配列-His-Pro-Baa-を含み、ここでBaaはグルタミン、アスパラギン、もしくはメチオニンであり、ならびにこの場合、他方の結合モジュールは、配列-Oaa-Xaa-His-Pro-Gln-Phe-Yaa-Zaa- (SEQ ID NO: 108) を有し、ここでOaaはTrp、Lys、もしくはArgであり、Xaaは任意のアミノ酸であり、かつYaaおよびZaaはいずれもGlyであるか、またはYaaはGluでありかつZaaはLysもしくはArgである、と融合されているタンパク質を固定化する方法であって、該タンパク質を固定化するための条件下で、該タンパク質を、請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質を保有する固相に接触させる段階を含む、方法。
- ペプチド配列が、
Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO: 102)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO. 100)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 103)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 109)またはTrp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2-Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 110)
である、請求項39記載の方法。 - ストレプトアビジンに結合し得る基を保有する物質を決定するまたは単離する方法であって、該物質を請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質と、それに対する結合に適した条件下で接触させる段階、および該物質を決定するまたは単離する段階を含む、方法。
- 請求項1〜22のいずれか一項記載のストレプトアビジン突然変異タンパク質、ならびに緩衝液、補助物質、および添加物からなる群より選択される少なくとも1つの試薬を含む試薬キット。
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