ES2727137T3 - Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario - Google Patents

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Abstract

Una combinación, que comprende: una primera composición que comprende una hialuronidasa, en donde la hialuronidasa se conjuga con un polímero o se formula para la liberación lenta o se codifica en un vector para su suministro en un tumor; y una segunda composición que comprende un inhibidor de puntos de control inmunitario, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-Ll o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia combinada con una enzima de degradación de hialuronano y un inhibidor de puntos de control inmunitario
Campo de la invención
En la presente memoria se proporcionan combinaciones de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, y un inhibidor de puntos de control inmunitario. Las combinaciones se pueden utilizar en la terapia combinada para mejorar cualquier terapia que incluya la administración de inhibidores de puntos de control inmunitario. La terapia combinada se puede utilizar en métodos de tratamiento del cáncer, incluidos tumores sólidos y no sólidos.
Antecedentes
Las enzimas que degradan hialuronano, tales como PH20, se utilizan en los métodos para el tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con el hialuronano, incluidos los cánceres y, en particular, los cánceres o tumores asociados con el hialuronano. El hialuronano (ácido hialurónico; HA) es un glicosaminoglicano que existe predominantemente en los tejidos conectivos, la piel, el cartílago y el líquido sinovial en los mamíferos. En el tejido conectivo, el agua de hidratación asociada con el hialuronano crea matrices hidratadas entre los tejidos. E1HA se encuentra en la matriz extracelular de muchas células, especialmente en los tejidos conectivos blandos. Ciertas enfermedades están asociadas con la expresión y/o producción de hialuronano, incluidos los tumores sólidos. Las hialuronidasas son enzimas que degradan el hialuronano. Al catalizar la descomposición de1HA, las hialuronidasas se pueden utilizar para tratar enfermedades o trastornos asociados con la acumulación de HA u otros glicosaminoglicanos, incluidos los cánceres y los tumores. Para el tratamiento de cánceres, y en particular cánceres de tumores sólidos, existe la necesidad de tratamientos terapéuticos mejorados o alternativos.
Scodeller P. (Hyaluronidase and other Extracellular Matrix Degrading Enzymes for Cancer Therapy: New Uses and nano-Formulations. Journal of Carcinogenesis & Mutagenesis. (2014) 5(178)) es una revisión sobre el uso de hialuronidasa combinada con fármacos convencionales contra el cáncer, por ejemplo, gemcitabina, carboplatino, adriamicina, doxorrubicina liposomal, adenovirus oncolítico ICOVIR5 y radioterapia. La revisión describe cómo se pueden utilizar las enzimas que degradan la matriz extracelular, tales como las hialuronidasas, para mejorar la penetración en los tumores y la administración de fármacos contra el cáncer convencionales.
Chiu et al. (Advanced Pancreatic Cancer: Flourishing Novel Approaches in the Era of Biological Therapy. The Oncologist. (2014) 19(9): 937-950) proporcionan una visión general de la terapia del cáncer de páncreas. Explican que los tratamientos principales para este tipo de cáncer incluyen gemcitabina, FOLFIRINOX y nab-paclitaxel, pero que se necesitan tratamientos mejorados. La inmunoterapia y los enfoques personalizados para el tratamiento se sugieren como formas de mejorar el tratamiento para este tipo de cáncer.
Callahan et al. At the Bedside: CTLA-4- and PD-1-blocking antibodies in cancer immunotherapy. Journal of Leukocyte Biology. (2013) 94(1): 41-53) describen el uso de los anticuerpos bloqueadores de CTLA-4 y PD-1 en el tratamiento del cáncer.
Compendio
La presente invención proporciona una combinación que comprende:
una primera composición que comprende una hialuronidasa, en donde la hialuronidasa se conjuga con un polímero o se formula para la liberación lenta o se codifica en un vector para su suministro a un tumor; y una segunda composición que comprende un inhibidor de puntos de control inmunitario, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Adicionalmente, se proporciona un inhibidor de puntos de control inmunitario para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde:
el sujeto ha sido tratado con una hialuronidasa;
la hialuronidasa se conjuga con un polímero o se formula para la liberación sostenida,
en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-L1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Las combinaciones y la terapia combinada incluyen una primera composición que comprende una enzima de degradación de hialuronano; y
una segunda composición que comprende el inhibidor de puntos de control inmunitario como se define en las reivindicaciones. Las composiciones se pueden administrar por separado o juntas o secuencialmente o intermitentemente. Las composiciones se pueden formular como una única composición. Los cánceres incluyen tumores sólidos y también tumores no sólidos, tales como los cánceres hematológicos. Como saben los expertos en la técnica, los cánceres pueden ser inmunosupresores. Se han desarrollado modalidades de tratamiento que revierten, inhiben o disminuyen los efectos inmunosupresores de los cánceres para mejorar o restaurar de ese modo la respuesta inmunitaria contra tumores y células tumorales. Las combinaciones y combinaciones para su uso en la presente memoria combinan estos tratamientos con agentes que reducen la cantidad de hialuronano asociado con tumores y células tumorales. Tales agentes son enzimas que degradan el hialuronano. Las enzimas que degradan el hialuronano se formulan, modifican o producen de modo que tengan suficiente semivida en el suero para efectuar el tratamiento.
En la presente memoria se proporcionan combinaciones de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en el tratamiento del cáncer. Las combinaciones contienen un primer agente que disminuye la cantidad de hialuronano presente en las células tumorales/cancerosas y un segundo agente que mitiga el microentorno del cáncer inmunosupresor. El primer y el segundo agentes pueden estar en composiciones separadas o se pueden formular en la misma composición;
el primer y el segundo agentes se pueden administrar de forma simultánea, secuencial, intermitente o en cualquier orden.
En realizaciones particulares, se proporcionan combinaciones de acuerdo con las reivindicaciones para su uso en terapia combinada de cánceres que incluyen tumores sólidos y otros tumores. Las combinaciones contienen una primera composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano, es decir, hialuronidasa, que se conjuga con un polímero o se formula o se proporciona de una manera que aumenta la semi-vida sérica de la misma, y una segunda composición que contiene el inhibidor de puntos de control inmunitario. Las composiciones se pueden formular juntas, pero típicamente se proporcionan por separado y se administran por separado. Se pueden administrar de forma secuencial, intermitente o simultánea o en cualquier orden. La enzima de degradación de hialuronano, es decir, la hialuronidasa, se administra secuencialmente, antes o después del inhibidor de puntos de control, tal como antes del inhibidor de puntos de control. En tales realizaciones, generalmente la enzima de degradación de hialuronano, es decir, la hialuronidasa, se administra menos de 1 o 2 días antes, tal como 48 horas o menos, tal como menos de 40, 35, 30, 25, 24, 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 o menos horas antes del inhibidor de puntos de control. Los inhibidores de puntos de control son anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben el ligando 1 de muerte programada (PD-L1), la proteína de muerte celular programada 1 (PD-1) o la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocida como CD152). La inhibición de proteínas y otros factores que suprimen el sistema inmunológico previenen o disminuyen la regulación por disminución del sistema inmunológico, por lo que el sistema inmunológico sigue reconociendo y atacando a las células tumorales. En la presente memoria se muestra, por ejemplo, que la administración de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, o un inhibidor de la síntesis de hialuronano, y un inhibidor de puntos de control inmunitario, puede aumentar la respuesta de una célula tumoral o célula cancerosa al tratamiento con el inhibidor. Por ejemplo, en una realización ilustrativa, la administración de un enzima de degradación de hialuronano, antes de la administración del inhibidor de CTLA4 o PD-L1 mejora el tratamiento de tumores en comparación con el inhibidor solo.
En la presente memoria se proporcionan combinaciones de la enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, e inhibidores de puntos de control de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en el tratamiento de cánceres. Para efectuar el tratamiento o uso de las composiciones en las combinaciones, los usos incluyen la administración de una primera composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano, particularmente una enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero, seguida de la administración de una segunda composición que contiene el inhibidor de puntos de control inmunitario. En cualquiera de tales usos, la composición de enzima de degradación de hialuronano y la composición inhibidora de puntos de control inmunitario se pueden administrar por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración. La composición enzimática de degradación de hialuronano y la composición inhibidora de puntos de control inmunitario se pueden administrar por la misma vía de administración. En cualquiera de las combinaciones proporcionadas para su uso, la composición de enzima de degradación de hialuronano y la composición inhibidora de puntos de control inmunitario se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, por administración intravenosa. En ciertas realizaciones de las combinaciones para uso, la composición que contiene la enzima de degradación de hialuronano se administra antes de la administración del inhibidor de puntos de control. El inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar en el plazo de las 48 horas posteriores a la administración de la enzima de degradación de hialuronano, tal como al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente a los 5 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En algunos usos, la enzima de degradación de hialuronano se administra de 6 horas a 30 horas o de 12 horas a 24 horas, cada uno inclusive, antes de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario. El momento y el orden de administración se pueden determinar empíricamente, si es necesario, para los inhibidores de puntos de control inmunitario concretos.
Cualquiera de las combinaciones proporcionadas que se vaya a emplear se puede utilizar para tratar un cáncer que es un tumor, tal como un tumor que es un tumor sólido. En algunos ejemplos, el tumor se caracteriza por tener un contenido de hialuronano de moderado a alto, tal como un alto contenido de hialuronano. Los cánceres ilustrativos que se pueden tratar con las combinaciones proporcionadas para su uso incluyen, pero no se limitan a, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, mesotelioma, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) y cáncer de colon.
Las enzimas de degradación de hialuronano utilizadas en las combinaciones proporcionadas que se van a emplear pueden ser hialuronidasas solubles, que se formulan o modifican para aumentar la semi-vida en suero. Por ejemplo, la hialuronidasa puede ser una PH20 soluble, tal como la PH20 ovina o bovina o una forma truncada C-terminal de PH20 humana que carece de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una parte del sitio de anclaje de GPI, por lo que La forma truncada muestra actividad hialuronidasa y es soluble. Entre las enzimas de degradación de hialuronano PH20 humanas se encuentran las enzimas que son solubles, conservan la actividad de la hialuronidasa y tienen una secuencia contigua de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 217 que contiene los residuos de aminoácido 36-464 de SEQ ID NO: 217, y residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217 o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia. En algunos ejemplos, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia contigua de aminoácidos en SEQ ID NO: 217 que contiene los residuos de aminoácido 36-464 de SEQ ID NO: 217, y residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36­ 509 de SEQ ID NO: 217, que es soluble y conserva la actividad hialuronidasa. Los polipéptidos PH20 ilustrativos tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85%, tal como al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia y conserva la actividad hialuronidasa.
La enzima de degradación de hialuronano para las combinaciones que se van a utilizar en la presente memoria se modifica con un polímero. En algunos ejemplos, el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa. Los polímeros de polialquilenglicol, que pueden modificar la enzima de degradación de hialuronano, incluyen polietilenglicol (PEG) y metoxipolietilenglicol (mPEG). En los ejemplos en los que la enzima de degradación de hialuronano se modifica por PEG, el PEG puede ser ramificado o lineal. En cualquiera de los ejemplos, el polímero se puede producir por reacción con metoxi-poli(etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (5 kDa); metoxipoli (etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (20 kDa); metoxi-poli (etilenglicol)-butanoato de succinimidilo (mPEG-SBA) (30 kDa); metoxi-poli (etilenglicol)-a-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (20 kDa); metoxi-poli (etilenglicol)-a-metilbutanoato de succinimidilo (mPEG-SMB) (30 kDa); metoxi-poli (etilenglicol) -butiraldehído (mPEG-butiraldehído) (30 kDa), metoxi-poli (etilenglicol)-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (20 kDa); metoxi-poli (etilenglicol)-propionato de succinimidilo (mPEG-SPA) (30 kDa); (metoxi-poli (etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (10 kDa ramificada); (metoxi-poli (etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (20 kDa ramificada); (metoxi-poli (etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (40 kDa ramificada); (metoxi-poli (etilenglicol))2-éster de N-hidroxisuccinimida (mPEG2-NHS) (60 kDa ramificada); biotin-poli (etilenglicol)- éster de N-hidroxisuccinimida (biotina-PEG-NHS) (5 kDa biotinilada); poli (etilenglicol)-carbonato de pnitrofenilo (PEG-carbonato de p-nitrofenilo) (30 kDa); o poli (etilenglicol)-propionaldehído (PEG-propionaldehído) (30 kDa). En cualquiera de los ejemplos, el polímero puede ser un PEG que tiene un peso molecular de 30 o aproximadamente 30 kilodalton.
En cualquiera de los ejemplos de tratamiento del cáncer de la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se puede administrar en un intervalo de dosificación de entre o aproximadamente entre 0,01 pg/kg y 100 |jg/kg (peso corporal (PC) del sujeto), de 0,01 pg/kg a 50 pg/kg, de 0,01 pg/kg a 15 pg/kg, de 0,05 pg/kg a 10 pg/kg, de 0,75 pg/kg a 7,5 pg/kg, de 1,0 pg/kg a 5,0 o de 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg o en un intervalo de dosificación de entre aproximadamente 0,1 y 5.000 Unidades/kg PC del sujeto, de 0,5 a 4.000 Unidades/kg, de 1 a 1.000 Unidades/kg, de 1 a 500 Unidades/kg, de 5 a 500 Unidades/kg, de 10 a 500 Unidades/kg o de 20 a 400 Unidades/kg de peso corporal (PC) del sujeto.
Alternativamente, las enzimas de degradación de hialuronano descritas anteriormente se pueden formular para su liberación sostenida, tal como en vesículas lipídicas, incluyendo liposomas y otros vehículos similares. Las vesículas pueden estar dirigidas al suministro de células seleccionadas, tales como linfocitos y/o células tumorales, dependiendo del inhibidor de puntos de control utilizado combinado con las mismas. El inhibidor de puntos de control se puede formular con la enzima de degradación de hialuronano. La enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, como se describe en la presente memoria, puede estar codificada en un vector, tal como un vector oncolítico para el suministro a tumores y la expresión en los mismos o puede ser dirigida para el suministro a otras células y tejidos; el inhibidor de puntos de control, si es una proteína, también puede estar codificada en el vector para su expresión.
En cualquiera de las combinaciones para su uso en el tratamiento del cáncer proporcionado en la presente memoria, el inhibidor de puntos de control inmunitario administrado bloquea la actividad de una proteína de puntos de control inmunitario, en donde la proteína de puntos de control inmunitario es cualquiera de CTLA4, PD-1 y PD-L1, y el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo o un fragmento de unión a proteínas de puntos de control inmunitario del mismo.
Un anticuerpo contra la proteína de puntos de control autoinmunitario ilustrativo es un anticuerpo anti-PD-L1, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos contra PD-L1 ilustrativos incluyen BMS-936559, derivados de los mismos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 92 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 94, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 94.
Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos también incluyen MEDI4736, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 102 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 104; y
Los anticuerpos contra PD-L1 ilustrativos también incluyen MPDL3280A, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 114 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 115, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 115.
Un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario ilustrativo es un anticuerpo anti-CTLA4, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos incluyen, por ejemplo, Ipilimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24.
Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos también incluyen Tremelimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos indicados en SEQ ID NO: 36 o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 36.
Otro anticuerpo contra proteína de puntos de control inmunitario ilustrativo es un anticuerpo anti-PD-1, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos incluyen Nivolumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54 y un dominio variable de cadena ligera con un secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 56 o una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de amino ácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 56.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos también incluyen MK-3475, derivados del mismo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO ID NO: 70.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos también incluyen Pidilizumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 84.
Los intervalos de dosificación para los inhibidores de puntos de control inmunitario y cualquier otro inhibidor de los efectos inmunosupresores de los tumores pueden ser los conocidos por los expertos en la técnica o se pueden determinar empíricamente para la terapia combinada. En virtud de cualquier aumento en la eficacia de los inhibidores de puntos de control inmunitario y otros inhibidores de la supresión inmunitaria, la dosificación puede ser menor. De manera similar, las dosificaciones de la enzima de degradación de hialuronano y los inhibidores de hialuronano pueden ser aquellas dosis conocidas por los expertos en la técnica. Las dosificaciones ilustrativas en modelos animales se describen en los ejemplos. Los expertos en la técnica pueden extrapolar o predecir las dosificaciones en seres humanos a partir de modelos animales (véase, p. ej., Huang et al. (2014) The application of allometric scaling principles to predict pharmacokinetic parameters across species, Expert Opin Drug Metab Toxicol.
10:1241-53). Por ejemplo, una dosificación equivalente en seres humanos de PEGPH20 utilizada en los ejemplos en la presente memoria en el modelo de roedor es de 37,5 pg/kg. La dosificación en seres humanos es de 3 pg/kg. Por lo tanto, en algunas realizaciones, cuando la enzima de degradación de hialuronano es PEGPH20, la dosificación en seres humanos para la administración con un inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-PD-L1, es o es de aproximadamente 1-10 pg/kg, tal como 2 -4 pg/kg, y particularmente 3 pg/kg. Se entiende que la dosificación dependerá del sujeto, el régimen de tratamiento, del agente particular, de la cantidad de efectos secundarios tolerados, de los agentes adicionales administrados que contrarrestan los efectos secundarios y de otros parámetros similares. El experto en la técnica puede, a la vista de la descripción de la presente memoria, seleccionar las dosificaciones apropiadas de cada agente.
Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar en un intervalo de dosificación que está entre o aproximadamente entre 0,1 mg por kg de peso corporal (mg/kg de peso corporal) y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg PC, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg PC, de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 10 mg/kg de PC, de aproximadamente 0,5 mg/kg a 5 mg/kg PC o de 0,5 mg/kg a 1 mg/kg PC. Las dosis ilustrativas de un inhibidor de puntos de control inmunitario incluyen una dosis que es al menos o es al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg o 50 mg/kg de peso corporal (PC) del sujeto a tratar.
En cualquiera de las combinaciones o combinaciones para su uso en el tratamiento proporcionado en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se puede administrar a cualquier frecuencia adecuada, tal como, por ejemplo, la frecuencia de una vez al día, una vez cada dos días, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas o una vez cada 4 semanas; y el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar a la misma frecuencia que la enzima de degradación de hialuronano o a una frecuencia diferente, en donde cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de enzima de degradación de hialuronano por no más de 48 horas. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada 6 semanas, una vez cada 2 meses, una vez cada 3 meses, una vez cada 4 meses, una vez cada 5 meses, o una vez cada 6 meses; en donde cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de enzima de degradación de hialuronano en no más de 48 horas.
Un régimen de dosificación ilustrativo que se puede emplear implica la administración de la enzima de degradación de hialuronano dos veces por semana, mientras que el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra no más de una vez a la semana, donde cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de enzima de degradación de hialuronano en no más de 48 horas. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar no más de una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas, mientras que la enzima de degradación de hialuronano se administra dos veces por semana. En otros ejemplos, la enzima de degradación de hialuronano se administra dos veces por semana y el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra dos veces por semana, en donde cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de enzima de degradación de hialuronano en no más de 48 horas. En algunos ejemplos, cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de la enzima de degradación de hialuronano en no más de 24 horas.
En la presente memoria también se proporcionan combinaciones de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en el tratamiento de un cáncer que incluye adicionalmente la administración de un corticosteroide, tal como un glucocorticoide. El glucocorticoide se puede seleccionar entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas. En cualquiera de los ejemplos, el corticosteroide se puede administrar antes, concurrentemente, intermitentemente o después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En algunos ejemplos, el corticosteroide se administra antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano y después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano. En otros ejemplos, el corticosteroide se coadministra con la enzima de degradación de hialuronano. En algunos ejemplos, el corticosteroide, tal como un glucocorticoide, se puede administrar, por ejemplo, al menos o aproximadamente al menos 1 hora antes de la administración de la enzima de degradación de hialuronano, o al menos 8 horas a 12 horas después de la administración del agente anti-hialuronano. En cualquiera de los ejemplos, el corticosteroide se puede administrar en una cantidad que está entre aproximadamente 0,1 y 20 mg, de 0,1 a 15 mg, de 0,1 a 10 mg, de 0,1 a 5 mg, de 0,2 a 20 mg, de 0,2 a 15 mg, de 0,2 a 10 mg, de 0,2 a 5 mg, de 0,4 a 20 mg, de 0,4 a 15 mg, de 0,4 a 10 mg, de 0,4 a 5 mg, de 0,4 a 4 mg, de 1 a 20 mg, de 1 a 15 mg o de 1 a 10 mg. En cualquiera de los métodos proporcionados, el corticosteroide se puede administrar por vía oral.
En la presente memoria también se proporcionan combinaciones de acuerdo con las presentes reivindicaciones que incluyen una primera composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano formulada o modificada para tener una mayor semi-vida en suero en comparación con la enzima de degradación de hialuronano sola; y una segunda composición que contiene un inhibidor de puntos de control inmunitario u otro inhibidor de la supresión inmunitaria. La enzima de degradación de hialuronano puede estar conjugada con polímeros o puede estar formulada para una liberación prolongada, por ejemplo, en o asociada con una vesícula, tal como un liposoma o micela o vesícula multilaminar o una vesícula multilamelar, o codificada en un vector, tal como un vector de terapia génica o un vector oncolítico para el suministro a una célula tumoral.
En la presente memoria se proporcionan combinaciones de acuerdo con las presentes reivindicaciones que incluyen una primera composición que contiene una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y una segunda composición que contiene un inhibidor de puntos de control inmunitario. En cualquiera de las combinaciones proporcionadas, la enzima de degradación de hialuronano es una hialuronidasa, tal como una PH20 o una forma truncada de la misma que carece de un sitio de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una parte del sitio de anclaje a GPI. En cualquiera de las combinaciones proporcionadas, la enzima de degradación de hialuronano puede ser una PH20 humana o no humana. Entre las enzimas de degradación de hialuronano PH20 humanas se encuentran enzimas que son solubles, conservan la actividad de la hialuronidasa y tienen una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 que contiene los residuos de aminoácido 36-464 de SEQ ID NO: 217, y los residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217 o tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 85% con la misma. En algunos ejemplos, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97 %, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia contigua de aminoácidos en SEQ ID NO: 217 que contiene los residuos de aminoácido 36-464 de SEQ ID NO: 217, y residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217, que es soluble y conserva la actividad hialuronidasa. Los polipéptidos PH20 ilustrativos tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85%, tal como al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia y conserva la actividad hialuronidasa.
La enzima de degradación de hialuronano proporcionada en las combinaciones de la presente memoria se modifica con un polímero. En algunos ejemplos, el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa. Los polímeros de polialquilenglicol, que pueden modificar la enzima de degradación de hialuronano, incluyen polietilenglicol (PEG) y metoxipolietilenglicol (mPEG). En los ejemplos en los que la enzima de degradación de hialuronano se modifica mediante PEG, el PEG puede ser ramificado o lineal. En cualquiera de los ejemplos, el polímero se puede producir por reacción con succinimidil butanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (5 kDa); succinimidil butanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (20 kDa); succinimidil butanoato de metoxipoli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (30 kDa); succinimidil a-metilbutanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SMB) (20 kDa); succinimidil a-metilbutanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SMB) (30 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butiraldehído (mPEG-butiraldehído) (30 kDa), succinimidil propionato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SPA) (20 kDa); succinimidilo propionato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SPA) (30 kDa); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli(etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (10 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxipoli(etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (20 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli(etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (40 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli (etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (60 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de biotina-poli(etilenglicol) (biotina-PEG-NHS) (5 kDa biotinilado); pnitrofenil carbonato de poli(etilenglicol) (p-nitrofenil carbonato de PEG) (30 kDa); o poli(etilenglicol)-propionaldehído (PEG-propionaldehído) (30 kDa). En cualquiera de los ejemplos, el polímero puede ser un PEG que tiene un peso molecular de 30 o aproximadamente 30 kilodalton.
La composición de la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, en cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, puede contener una cantidad de enzima de degradación de hialuronano que está en una cantidad dentro del intervalo entre o entre aproximadamente 0,1 pg/mL y 100 pg/mL, de 1 pg/mL a 50 pg/mL o de 1 pg/mL a 20 pg/mL de enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero o una cantidad de enzima de degradación de hialuronano dentro del intervalo de aproximadamente 10 U/mL a 5.000 U/mL, de 50 U/mL a 4.000 U/mL, de 100 U/mL a 2.000 U/mL, de 300 U/mL a 2.000 U/mL, de 600 U/mL a 2.000 U/mL o de 100 U/mL a 1.000 U/mL de enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero. Los volúmenes no limitantes de la composición de la enzima de degradación de hialuronano en el método proporcionado incluyen intervalos de aproximadamente 0,5 mL a 50 mL, de 1 mL a 10 mL o de 1 mL a 5 mL.
Las combinaciones proporcionadas también incluyen una composición que contiene un inhibidor de puntos de control inmunitario. La diana del inhibidor de puntos de control inmunitario es una proteína de puntos de control inmunitario seleccionada entre CTLA4, PD-1 y PD-L1.
El inhibidor de la proteína de puntos de control inmunitario, en las combinaciones proporcionadas, es un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario ilustrativo, en las combinaciones proporcionadas, es un anticuerpo anti-CTLA4, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos incluyen Ipilimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen una cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24.
Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos, en las combinaciones proporcionadas, también incluyen Tremelimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36 o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 36.
Otro anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario ilustrativo, en las combinaciones proporcionadas, es un anticuerpo anti-PD-1, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos PD-1 ilustrativos incluyen Nivolumab, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 56 o una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 56.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos, en las combinaciones proporcionadas, también incluyen MK-3475, derivados del mismo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia identidad de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 70.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos, en las combinaciones proporcionadas, también incluyen Pidilizumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 84.
Otro anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario ilustrativo es un anticuerpo anti-PD-L1, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos PD-L1 ilustrativos incluyen BMS-936559, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 92 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 94, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 94.
Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos, en las combinaciones proporcionadas, también incluyen MEDI4736, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 102 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 104.
Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos, en las combinaciones proporcionadas, también incluyen MPDL3280A, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 114 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 115, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia identidad de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 115.
En cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, el inhibidor de puntos de control inmunitario en la composición se puede proporcionar en una cantidad que se selecciona entre o aproximadamente entre 0,5 mg/mL y 50 mg/mL, de 1 mg/mL a 10 mg/mL o de 2 mg/mL a 6 mg/mL. El inhibidor de puntos de control inmunitario también se puede proporcionar en la combinación en una cantidad que sea al menos o aproximadamente al menos 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL o 10 mg/mL. La composición que contiene el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede proporcionar en un volumen que es de o de aproximadamente 0,5 mL a 500 mL, de 1 mL a 50 mL o de 10 mL a 40 mL. En algunos ejemplos, la composición del inhibidor de puntos de control inmunitario se proporciona en un volumen de al menos o al menos aproximadamente 1 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL o 100 mL.
Cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria puede contener adicionalmente un corticosteroide además de las composiciones de enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero e inhibidor de puntos de control inmunitario. Un corticosteroide ilustrativo que se puede incluir en las combinaciones proporcionadas incluye un glucocorticoide. Los glucocorticoides ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas.
En la presente memoria también se proporcionan combinaciones, tales como combinaciones farmacéuticas, para su uso en el tratamiento de un cáncer. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan combinaciones para su uso en el tratamiento de un cáncer en un animal, en donde el animal se expone primero a la enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero y a continuación se pone en contacto con el inhibidor de puntos de control inmunitario. También se describen los usos de cualquiera de las combinaciones proporcionadas para la preparación de un medicamento para tratar el cáncer en un animal, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario y la enzima de degradación de hialuronano están cada uno en una forma farmacéuticamente aceptable, y el animal, tal como un ser humano, está expuesto a la enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero u otra forma de enzima de degradación de hialuronano que presenta un incremento de la semi-vida en suero, y también se pone en contacto con el inhibidor de puntos de control inmunitario. La enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, se puede administrar con el inhibidor de puntos de control, antes del inhibidor de puntos de control, intermitentemente con el mismo o secuencialmente. En algunas realizaciones, el animal, tal como un ser humano, se expone primero a la enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero y a continuación se pone en contacto con el inhibidor de puntos de control inmunitario.
En cualquiera de las combinaciones proporcionadas o combinaciones para su uso, la enzima de degradación de hialuronano y el inhibidor de puntos de control inmunitario se pueden formular para la administración por la misma vía de administración o por diferentes vías de administración. En algunos ejemplos de las combinaciones proporcionadas y las combinaciones para su uso, la enzima de degradación de hialuronano y el inhibidor de puntos de control inmunitario se administran por la misma vía de administración. Por ejemplo, en cualquiera de las combinaciones proporcionadas o combinaciones para su uso, la enzima de degradación de hialuronano y el inhibidor de puntos de control inmunitario están formulados para administración oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal, intratecal o sub-epidérmica. En ejemplos particulares, la enzima de degradación de hialuronano y el inhibidor de puntos de control inmunitario están formulados para la administración sistémica, tal como la administración intravenosa.
En cualquiera de las combinaciones proporcionadas o combinaciones para su uso, la enzima de degradación de hialuronano se puede exponer al animal hasta 48 horas antes de que el inhibidor de puntos de control inmunitario se exponga al animal, tal como al menos o al menos aproximadamente 5 minutos, minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas, o 48 horas antes de que el inhibidor de puntos de control inmunitario se exponga al animal, por lo que la enzima de degradación de hialuronano se formula para su administración al menos 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas antes del inhibidor de puntos de control inmunitario.
Cualquiera de las combinaciones o combinaciones para su uso en el tratamiento de un cáncer proporcionado en la presente memoria puede ser para tratar un cáncer que es un tumor, tal como un tumor sólido. Las combinaciones para su uso también se pueden utilizar para el tratamiento de otros cánceres en los que el hialuronano desempeña un papel. Por ejemplo, el hialuronano (HA), un componente importante de la progresión del cáncer, se sintetiza mediante las hialuronano sintasas (HAS). En las células cancerosas, el pre-ARNm de hialuronano sintasa 1 (HAS1) se empalma de manera anormal para generar una familia de variantes de empalme aberrantes (HASIV), que se producen casi exclusivamente en células malignas y que sintetizan HA extracelular e intracelular. La expresión de los HASIV aberrantes pronostica una mala supervivencia, por ejemplo, en el mieloma múltiple (véase, por ejemplo, Adamia et al. (2014) Adv. Cancer Res. 123: 67-94). La HA extracelular puede participar en la diseminación maligna; y la HA intracelular puede desempeñar un papel en la oncogénesis (véase p. ej., Adamia et al. (2014) Adv. Cancer Res. 123: 61-94). En ejemplos particulares, el tumor se caracteriza por tener un contenido de hialuronano de moderado a alto, tal como un alto contenido de hialuronano. Los ejemplos no limitantes de cánceres que van a ser tratados por las combinaciones y combinaciones para su uso en la presente memoria incluyen cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, mesotelioma, CPCNP y cáncer de colon.
En la presente memoria también se proporcionan inhibidores de puntos de control inmunitario para su uso en el tratamiento de un cáncer en un sujeto de acuerdo con las presentes reivindicaciones, en donde el sujeto ha sido tratado con una enzima de degradación de hialuronano, y la enzima de degradación de hialuronano se conjuga con un polímero. En tales inhibidores de puntos de control inmunitario para su uso, el inhibidor de puntos de control inmunitario puede bloquear la actividad de una proteína de puntos de control inmunitario. Las dianas del inhibidor de puntos de control inmunitario, para los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso, son CTLA4, PD-1 y PD-L1. Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso en el tratamiento del cáncer incluyen inhibidores de la proteína de puntos de control inmunitario seleccionados de entre los anticuerpos, y fragmentos de unión a la proteína de puntos de control inmunitario. En ejemplos particulares, el inhibidor de la proteína de puntos de control inmunitario proporcionado para su uso incluye un inhibidor de puntos de control inmunitario que es un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso incluyen un anticuerpo anti- proteína de puntos de control inmunitario que es un anticuerpo anti-CTLA4, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de anticuerpos anti-CTLA4 incluyen Ipilimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de amino ácidos expuesta en SEQ ID NO: 24; o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24.
Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos también incluyen Tremelimumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos indicados en SEQ ID NO: 36 o una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 36.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso también incluyen un anticuerpo antiproteína de puntos de control inmunitario que es un anticuerpo anti-PD-L1, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos contra PD-L1 ilustrativos incluyen BMS-936559, derivados del mismos y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 92 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 94, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 94.
Los anticuerpos contra PD-L1 ilustrativos también incluyen MEDI4736, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 102 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 104.
Los anticuerpos contra PD-L1 ilustrativos también incluyen MPDL3280A, derivados del mismo, y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 114 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 115, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 115.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso también incluyen un anticuerpo antiproteína de puntos de control inmunitario que es un anticuerpo anti-PD-1, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 incluyen Nivolumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de los aminoácidos establecidos en SEQ ID NO: 56 o una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 56.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos también incluyen MK-3475, derivados del mismo, o fragmentos de unión a antígeno del mismo, que tienen un dominio variable de cadena pesada con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de cadena ligera con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos el 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO ID NO: 70.
Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos también incluyen Pidilizumab, derivados del mismo y fragmentos de unión a antígeno del mismo que tienen un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84, o una cadena pesada variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera variable que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 84.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso incluyen un inhibidor de la proteína de puntos de control inmunitario que está formulado para la administración a una concentración seleccionada entre o aproximadamente entre 0,5 mg/mL y 50 mg/mL, de 1 mg/mL a 10 mg/mL o de 2 mg/mL a 6 mg/mL; y al menos 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL o 10 mg/mL. Tales formulaciones pueden incluir el inhibidor de puntos de control inmunitario en un volumen que es de o de aproximadamente 0,5 mL a 500 mL, de 1 mL a 50 mL, o de 10 mL a 40 mL; o al menos 1 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL o 100 mL.
En cualquiera de los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso, el sujeto está expuesto a una enzima de degradación del hialuronano. La enzima de degradación de hialuronano puede ser una hialuronidasa, tal como una PH20 o una forma truncada de la misma que carece de un sitio de anclaje a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C terminal o una parte del sitio de unión de GPI. Dicha PH20 puede ser una PH20 humana o no humana. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano puede ser una PH20 truncada C terminal que tiene una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 que contiene los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 217 y residuos hasta un residuo de aminoácido C terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217 o una variante del mismo que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con esta, que es soluble y conserva la actividad hialuronidasa. En algunos ejemplos, la variante de PH20 puede tener una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos en SEQ ID NO: 217 que contiene los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 217 y residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido se trunca en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se presenta como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217, siempre que sea soluble y conserve la actividad hialuronidasa. Los ejemplos de tales enzimas PH20 incluyen cualquier PH20 que tenga una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestre al menos 85% de identidad de secuencia, tal como al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia, con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158 y conserve la actividad hialuronidasa.
Los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados para su uso en el tratamiento del cáncer incluyen una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímeros. Los polímeros ilustrativos no limitantes que se pueden conjugar con la enzima son polialquilenglicol, dextrano, pululano y celulosa. En algunos ejemplos, el polímero es un polialquilenglicol, seleccionado entre polietilenglicol (PEG) y metoxipolietilenglicol (mPEG), en el que el PEG es un PEG lineal o ramificado. El polímero que se conjuga con la enzima de degradación de hialuronano se puede producir por reacción con succinimidil butanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (5 kDa); succinimidil butanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (20 kDa); succinimidil butanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SBA) (30 kDa); succinimidil a-metilbutanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SMB) (20 kDa); succinimidil a-metilbutanoato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SMB) (30 kDa); metoxi-poli(etilenglicol)-butiraldehído (mPEG-butiraldehído) (30 kDa), succinimidil propionato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SPA) (20 kDa); succinimidilo propionato de metoxi-poli(etilenglicol) (mPEG-SPA) (30 kDa); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxipoli(etilenglicol))2 (1T1PEG2-NHS) (10 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli(etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (20 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli(etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (40 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de (metoxi-poli (etilenglicol))2 (mPEG2-NHS) (60 kDa ramificado); éster de N-hidroxisuccinimida de biotina-poli(etilenglicol) (biotina-PEG-NHS) (5 kDa biotinilado); p-nitrofenil carbonato de poli(etilenglicol) (p-nitrofenil carbonato de PEG) (30 kDa); o poli(etilenglicol)-propionaldehído (PEG-propionaldehído) (30 kDa). En cualquiera de los ejemplos, el polímero puede ser un p Eg que tiene un peso molecular de 30 o aproximadamente 30 kilodalton.
El inhibidor de puntos de control inmunitario proporcionado para su uso en el tratamiento del cáncer se puede formular para administración oral, intravenosa (IV), subcutánea, intramuscular, intratumoral, intradérmica, tópica, transdérmica, rectal, intratecal o subepidérmica. En ejemplos particulares, el inhibidor de puntos de control inmunitario para su uso está formulado para administración sistémica, tal como la administración intravenosa. El inhibidor de puntos de control inmunitario proporcionado se puede formular para su uso hasta 48 horas después de que el sujeto haya sido tratado con la enzima de degradación de hialuronano, tal como al menos o al menos aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas o 48 horas después de que el sujeto sea tratado con la enzima de degradación de hialuronano.
El cáncer tratado por cualquiera de los inhibidores de puntos de control inmunitario puede ser un tumor, tal como un tumor sólido. En ejemplos particulares, el tumor se caracteriza por tener un contenido de hialuronano de moderado a alto, tal como un alto contenido de hialuronano. Los cánceres ilustrativos tratados con los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, mesotelioma, CPNM y cáncer de colon.
Descripción detallada
Esquema
A. Definiciones
B. Terapia combinada de puntos de control inmunitario y enzima de degradación de hialuronano 1. Tumores sólidos y respuesta inmunitaria
2. Modulación de puntos de control inmunitario de la actividad de células T en tumores a. CTLA-4 y cebado de células T
b. PD-1 y fase efectora de células T
c. Otros agentes inmunomoduladores (p. ej., LAG-3)
3. Enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero en terapia combinada con un inhibidor de puntos de control inmunitario
C. Agentes de terapia combinada
1. Inhibidores de puntos de control inmunitarios y formulaciones de los mismos
a. Terapias anti-CTLA-4
(i) Ipilimumab y derivados del mismo
(ii) Tremelimumab y derivados del mismo
b. Terapias anti-PD-1 y anti PD-1-L
(i) Anticuerpos anti-PD-1
(a) Nivolumab y derivados del mismo.
(b) MK-3475 y derivados del mismo.
(c) Pidilizumab y derivados del mismo.
(ii) Anticuerpos anti-PD-Ll
(a) BMS-936559 y derivados del mismo.
(b) MPDL3280A y derivados del mismo.
(c) MEDI4736 y derivados del mismo.
c. Otras terapias inmunomoduladoras
2. Enzimas de degradación de hialuronano y enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero
a. Hialuronidasas
i. Hialuronidasas PH20 de tipo mamífero
ii. Hialuronidasa bacteriana
iii. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos b. Otras enzimas de degradación de hialuronano
c. Enzimas de degradación de hialuronano solubles
i. PH20 soluble humana
ii. rHuPH20
d. Glicosilación de enzimas de degradación de hialuronano
e. Formulaciones de liberación sostenida o controlada y vectores que codifican hialuronidasas solubles
i. Enzimas de degradación de hialuronano modificadas (conjugadas con polímeros)
Enzimas de degradación de hialuronano solubles PEGiladas
ii. Formulaciones de liberación sostenida o controlada y vectores que codifican hialuronidasas solubles
a) Liposomas multivesiculares (MVL)
b) Co-Formulaciones con MVL
D. Métodos para producir ácidos nucleicos y polipéptidos codificados de enzimas de degradación de hialuronano e inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpos)
1. Aislamiento o preparación de polipéptidos que codifican ácido nucleico
a. Enzima de degradación de hialuronano
b. Inhibidor de puntos de control inmunitarios (p. ej., anticuerpos)
2. Vectores
3. Células y expresión
a. Células procariotas
b. Células de levadura
c. Células de insectos
d. Células de mamífero
e. Plantas
4. Técnicas de purificación
5. PEGilación de polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano
E. Composiciones y formulaciones farmacéuticas
1. Formulaciones
a. Inyectables, soluciones y emulsiones.
b. Polvos liofilizados
c. Composiciones para otras vías de administración
2. Cantidades de formulación
a. Formulaciones de enzimas que degradan el hialuronano
b. Formulaciones de inhibidores de puntos de control
3. Empaquetamiento y artículos de manufactura
F. Métodos de seguimiento y evaluación de la actividad, biodisponibilidad y farmacocinética
1. Actividad hialuronidasa
2. Actividad del inhibidor de puntos de control inmunitario
3. Actividad anticancerosa de la terapia combinada
a. Crecimiento y volumen del tumor
b. Presencia de marcadores tumorales
c. Seguimiento inmunológico
(i) Frecuencia de tipos celulares específicos en sangre periférica
(ii) Detección de marcadores de células inmunitarias
(iii) Respuestas inmunitarias específicas de antígeno
4. Ensayos farmacocinéticos y farmacodinámicos
G. Métodos y usos de la terapia combinada
1. Cánceres
2. Selección de sujetos para tratamiento
a. Medición del contenido de hialuronano en tumores
(i) Proteína de unión a hialuronano (HABP)
(ii) Métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos
(iii) Ensayos de unión en fase sólida
(iv) Ensayos de imagen in vivo
b. Recuento de linfocitos pre-tratamiento
2. Dosificación y administración
3. Régimen de dosificación: frecuencia y ciclo de administración
4. Terapia combinada adicional
a. Corticosteroide
b. Agentes anticancerosos y otros tratamientos
H. Ejemplos
A. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. En el caso de que haya una pluralidad de definiciones para los términos de la presente memoria, prevalecerán las de esta sección. Cuando se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección de este tipo, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información concreta en Internet puede ir y venir, pero se puede encontrar información equivalente buscando en Internet. La referencia a esto evidencia la disponibilidad y difusión pública de semejante información.
Como se emplea en la presente memoria, "terapia combinada" se refiere a un tratamiento en el que a un sujeto se le administran dos o más agentes terapéuticos, como al menos dos o al menos tres agentes terapéuticos, para tratar una sola enfermedad. Para los fines de la presente memoria, la terapia combinada incluye la terapia con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y un agente bloqueador de la proteína de puntos de control inmunitario.
Como se emplea en la presente memoria, "puntos de control inmunitario" se refiere a las vías inhibidoras del sistema inmunológico que son responsables de mantener la tolerancia y modular la duración y amplitud de las respuestas inmunitarias fisiológicas en los tejidos periféricos para minimizar el daño colateral en los tejidos. Los puntos de control inmunitarios están regulados por proteínas de puntos de control inmunitarios.
Como se emplea en la presente memoria, una "proteína de puntos de control inmunitario" es una proteína, típicamente un receptor (p. ej., CTLA4 o PD-1) o un ligando (p. ej., PD-L1) que regula o modula el alcance de una respuesta inmunitaria. Las proteínas de puntos de control inmunitario pueden ser inhibidoras o estimuladoras. En particular, las proteínas de puntos de control inmunitario son inhibidoras de la activación de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, la inhibición de una proteína de puntos de control inmunitario inhibidora actúa para estimular o activar una respuesta inmunitaria, tal como la activación y proliferación de células T.
Como se emplean en la presente memoria, un "inhibidor de puntos de control inmunitario" o "agente inhibidor de puntos de control inmunitario" o "agente bloqueador de puntos de control inmunitario" se refieren a un agente que se une a una proteína de puntos de control inmunitario inhibidora y bloquea su actividad. La inhibición puede ser competitiva o no competitiva, que puede ser estérica o alostérica. En los casos en los que una proteína de puntos de control inmunitario es una proteína estimuladora inmunitaria, un inhibidor de puntos de control inmunitario actúa para promover la actividad de la proteína estimuladora inmunitaria, por ejemplo uniendo y activando la proteína de puntos de control inmunitario estimuladora o inhibiendo por interferencia, por ejemplo uniéndose o desactivando, los inhibidores de la proteína de puntos de control inmunitario estimuladora. Un ejemplo de un inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario.
Una "diana" de un inhibidor de puntos de control inmunitario es la proteína de puntos de control inmunitario a la que se une el inhibidor de puntos de control inmunitario o el agente inhibidor de puntos de control inmunitario para bloquear la actividad. Normalmente, el inhibidor de puntos de control inmunitario se une específicamente a la diana. Por ejemplo, la diana del anticuerpo anti-CTLA4 ilustrativo designado ipilimumab es CTLA4.
Como se emplea en la presente memoria, "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas y fragmentos de inmunoglobulina, ya sean naturales o parcial o totalmente sintéticos, tales como los producidos de forma recombinante, incluyendo cualquier fragmento de los mismos que contenga al menos una porción de la cadena pesada variable y la región de la cadena ligera de la molécula de inmunoglobulina que sea suficiente para formar un sitio de unión al antígeno y, cuando se ensambla, para unirse específicamente al antígeno. Por lo tanto, un anticuerpo incluye cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo o sustancialmente homólogo a un dominio de unión a antígeno de inmunoglobulina (sitio de combinación con anticuerpos). Por ejemplo, un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas (que se pueden designar H y H') y dos cadenas ligeras (que se pueden designar L y L'), donde cada cadena pesada puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina completa o una porción de la misma suficiente para formar un sitio de unión a antígeno (p. ej., las cadenas pesadas incluyen, pero no se limitan a, cadenas Vh , cadenas Vh-Ch1 y cadenas Vh-Ch1-Ch2-Ch3), y cada cadena ligera puede ser una cadena ligera completa o una porción de la misma suficiente para formar un sitio de unión a antígeno (p. ej., las cadenas ligeras incluyen, pero no se limitan a, cadenas Vl y cadenas Vl-Cl). Cada cadena pesada (H y H') se empareja con una cadena ligera (L y L', respectivamente). Típicamente, los anticuerpos incluyen mínimamente toda o al menos una porción de la cadena variable pesada (Vh) y/o la cadena ligera variable (Vl). El anticuerpo también puede incluir toda o una porción de la región constante.
Para los fines de la presente memoria, el término anticuerpo incluye anticuerpos completos y porciones de los mismos que incluyen fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, Fv unidos por disulfuro (dsFv), fragmentos Fd, fragmentos Fd', Fv de cadena sencilla (scFv), Fab de cadena sencilla (scFab), diacuerpos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) o fragmentos de unión a antígenos de cualquiera de los anteriores. El anticuerpo también incluye anticuerpos sintéticos, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (p. ej., anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, anticuerpos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos e intracuerpos. Los anticuerpos proporcionados en la presente memoria incluyen miembros de cualquier tipo de inmunoglobulina (p. ej., IgG, IgM, IgD, IgE, IgA e IgY), cualquier clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase (p. ej., IgG2a e IgG2b).
Como se emplea en la presente memoria, una forma de un anticuerpo se refiere a una estructura particular de un anticuerpo. Los anticuerpos en la presente memoria incluyen anticuerpos completos y porciones de los mismos, tales como, por ejemplo, un fragmento Fab u otro fragmento de anticuerpo. Por lo tanto, un Fab es una forma concreta de un anticuerpo.
Como se emplea en la presente memoria, la referencia a una "forma correspondiente" de un anticuerpo significa que al comparar una propiedad o actividad de dos anticuerpos, la propiedad se compara utilizando la misma forma del anticuerpo. Por ejemplo, si se afirma que un anticuerpo tiene menos actividad en comparación con la actividad de la forma correspondiente de un primer anticuerpo, eso significa que una forma particular, tal como un Fab de ese anticuerpo, tiene menos actividad en comparación con la forma Fab del primer anticuerpo.
Como se emplea en la presente memoria, un anticuerpo completo es un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas completas (p. ej., Vh-Ch1-Ch2-Ch3 o Vh-Ch1-Ch2-Ch3COh4) y dos cadenas ligeras completas (Vl-Cl) y regiones bisagra, tales como los anticuerpos humanos producidos por las células B que secretan anticuerpos y anticuerpos con los mismos dominios que se producen sintéticamente.
Como se emplea en la presente memoria, el fragmento de anticuerpo o la porción de anticuerpo se refiere a cualquier porción de un anticuerpo completo que sea menor que la longitud completa pero que contenga al menos una porción de la región variable del anticuerpo suficiente para formar un sitio de unión a antígeno (p. ej., una o más CDR) y, por lo tanto, conserve la especificidad de unión y/o una actividad del anticuerpo completo; los fragmentos de anticuerpos incluyen derivados de anticuerpos producidos por el tratamiento enzimático de anticuerpos completos, así como sintéticamente, p. ej., derivados producidos de forma recombinante. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab)2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y fragmentos de Fd (véase, por ejemplo, Methods in Molecular Biology, Vol. 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Capítulo 1; pág. 3-25, Kipriyanov). El fragmento puede incluir múltiples cadenas unidas entre sí, por ejemplo mediante puentes disulfuro y/o mediante conectores peptídicos. Un fragmento de anticuerpo generalmente contiene al menos aproximadamente 50 aminoácidos y típicamente al menos 200 aminoácidos.
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento de anticuerpo Fv se compone de un dominio pesado variable (Vh) y un dominio ligero variable (Vl) unidos por interacciones no covalentes.
Como se emplea en la presente memoria, un dsFv se refiere a un Fv con un enlace disulfuro intermolecular diseñado, que estabiliza el par Vh-Vl.
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento Fd es un fragmento de un anticuerpo que contiene un dominio variable (Vh) y un dominio de región constante (Ch1) de una cadena pesada de anticuerpo.
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo que resulta de la digestión de una inmunoglobulina completa con papaína, o un fragmento que tiene la misma estructura que se produce sintéticamente, p. ej., por métodos recombinantes. Un fragmento Fab contiene una cadena ligera (que contiene una Vl y Cl) y otra cadena que contiene un dominio variable de una cadena pesada (Vh) y un dominio de región constante de la cadena pesada (Ch1).
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo que resulta de la digestión de una inmunoglobulina con pepsina a pH 4,0-4,5, o un fragmento que tiene la misma estructura que se produce sintéticamente, p. ej., por métodos recombinantes. El fragmento F(ab')2 contiene esencialmente dos fragmentos Fab donde cada porción de cadena pesada contiene unos pocos aminoácidos adicionales, incluidos los residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro que unen los dos fragmentos.
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento Fab' es un fragmento que contiene una mitad (una cadena pesada y una cadena ligera) del fragmento F(ab')2.
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento Fd' es un fragmento de un anticuerpo que contiene una porción de cadena pesada de un fragmento F(ab')2 .
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento Fv' es un fragmento que contiene solamente los dominios Vh y Vl de una molécula de anticuerpo.
Como se emplea en la presente memoria, hsFv se refiere a fragmentos de anticuerpos en los cuales los dominios constantes normalmente presentes en un fragmento Fab han sido sustituidos por un dominio de bobina en espiral heterodimérico (véase, p. ej., Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7: 312: 221-228).
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento scFv se refiere a un fragmento de anticuerpo que contiene una cadena ligera variable (Vl) y una cadena pesada variable (Vh), covalentemente conectadas por un conector polipeptídico en cualquier orden. El conector tiene una longitud tal que los dos dominios variables se unen mediante puentes sin una interferencia sustancial. Los conectores ilustrativos son residuos de (Gly-Ser)n con algunos residuos de Glu o Lys dispersados para aumentar la solubilidad.
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , lo s d ia c u e rp o s s o n s c F v d im é r ic o s ; lo s d ia c u e rp o s t íp ic a m e n te t ie n e n conectores peptídicos más cortos que los scFv, y preferentemente forman dímeros.
Como se emplea en la presente memoria, un "dominio" polipeptídico es una parte de un polipéptido (una secuencia de tres o más, generalmente 5, 10 o más aminoácidos) que es estructural o funcionalmente distinguible o definible. Un dominio polipeptídico ilustrativo es una parte del polipéptido que puede formar una estructura plegada independientemente dentro de un polipéptido formado por uno o más motivos estructurales (p. ej., combinaciones de hélices alfa y/o cadenas beta conectadas por regiones de bucle) y/o que es reconocida por una actividad funcional concreta, tal como la actividad enzimática, la dimerización o la unión a antígeno. Un polipéptido puede tener uno o más dominios distintos, típicamente más de uno. Por ejemplo, el polipéptido puede tener uno o más dominios estructurales y uno o más dominios funcionales. Un único dominio polipeptídico se puede distinguir basándose en la estructura y la función. Un dominio puede abarcar una secuencia lineal contigua de aminoácidos. Alternativamente, un dominio puede abarcar una pluralidad de porciones de aminoácidos no contiguas, que no son contiguas a lo largo de la secuencia lineal de aminoácidos del polipéptido. Típicamente, un polipéptido contiene una pluralidad de dominios. Por ejemplo, cada cadena pesada y cada cadena ligera de una molécula de anticuerpo contiene una pluralidad de dominios de inmunoglobulina (Ig), cada uno de aproximadamente 110 aminoácidos de longitud. Los expertos en la técnica están familiarizados con los dominios polipeptídicos y pueden identificarlos en virtud de la homología estructural y/o funcional con otros dominios similares. Para la ilustración en la presente memoria, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está dentro de la técnica reconocer los dominios particulares por su nombre. Si es necesario, se puede emplear el soporte lógico adecuado para identificar los dominios. Como se emplea en la presente memoria, un dominio variable con referencia a un anticuerpo es un dominio de Ig específico de una cadena pesada o ligera de anticuerpo que contiene una secuencia de aminoácidos que varía entre diferentes anticuerpos. Cada cadena ligera y cada cadena pesada tienen un dominio de región variable (Vl y Vh). Los dominios variables proporcionan especificidad de antígeno y, por lo tanto, son responsables del reconocimiento del antígeno. Cada región variable contiene CDR que forman parte del dominio del sitio de unión al antígeno y regiones marco (FR).
Como se emplea en la presente memoria, "región hipervariable", "HV", "región determinante de la complementariedad", "CDR" y "CDR de anticuerpo" se utilizan de manera indistinta para hacer referencia a una de una pluralidad de porciones dentro de cada región variable que forman juntas un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Cada dominio de región variable contiene tres CDR, denominadas CDR1, CDR2 y CDR3. Las tres CDR no son contiguas a lo largo de la secuencia de aminoácidos lineal, pero están próximas en el polipéptido plegado. Las CDR se encuentran dentro de los bucles que unen las hebras paralelas de las láminas beta del dominio variable.
Como se emplea en la presente memoria, "dominio de unión a antígeno", "sitio de unión a antígeno", "sitio de combinación con el antígeno" y "sitio de combinación con el anticuerpo" se utilizan de forma indistinta para hacer referencia a un dominio dentro de un anticuerpo que reconoce e interactúa físicamente con el antígeno relacionado. Una molécula de anticuerpo completo convencional nativa tiene dos sitios de unión a antígeno convencionales, cada uno de los cuales contiene porciones de una región variable de cadena pesada y porciones de una región variable de cadena ligera. Un sitio de unión a antígeno convencional contiene los bucles que conectan las hebras beta anti­ paralelas dentro de los dominios de región variable. Los sitios de combinación con antígenos pueden contener otras porciones de los dominios de región variable. Cada sitio de unión a antígeno convencional contiene tres regiones hipervariables de la cadena pesada y tres regiones hipervariables de la cadena ligera. Las regiones hipervariables también se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR).
Como se emplea en la presente memoria, "porción del mismo" en referencia a una cadena pesada o ligera de anticuerpo o una cadena pesada o ligera variable se refiere a una porción contigua del mismo que es suficiente para formar un sitio de unión al antígeno tal que, cuando se ensambla en un anticuerpo que contiene una cadena pesada y ligera, contiene al menos 1 o 2, típicamente 3, 4, 5 o las 6 CDR de las cadenas pesada variable (Vh) y ligera variable (Vl) suficientes para conservar al menos una porción de la especificidad de unión del correspondiente anticuerpo completo que contiene las 6 CDR. En general, un sitio de unión a antígeno suficiente requiere la CDR3 de la cadena pesada (CDRh3). Por lo general, requiere adicionalmente la CDR3 de la cadena ligera (CDRl3). Como se describe en la presente memoria, un experto en la técnica sabe y puede identificar las CDR basándose en la numeración de Kabat o Chothia (véase p. ej., Kabat, E.A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU., Publicación de NIH Núm. 91-3242 y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917).
Como se emplea en la presente memoria, las regiones marco (FR) son los dominios dentro de los dominios de la región variable del anticuerpo que están localizados dentro de las láminas beta; las regiones FR están comparativamente más conservadas, en términos de sus secuencias de aminoácidos, que las regiones hipervariables.
Como se emplea en la presente memoria, un dominio de región constante es un dominio en una cadena pesada o ligera de anticuerpo que contiene una secuencia de aminoácidos que está comparativamente más conservada entre los anticuerpos que el dominio de la región variable. Cada cadena ligera tiene un solo dominio de la región constante de cadena ligera (Cl) y cada cadena pesada contiene uno o más dominios de las regiones constantes de cadena pesada (Ch), que incluyen, Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4. Los isotipos IgA, IgD e IgG completos contienen Ch1, Ch2, Ch3 y una región bisagra, mientras que IgE e IgM contienen Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4. Los dominios Ch1 y Cl extienden el brazo Fab de la molécula de anticuerpo, contribuyendo así a la interacción con el antígeno y a la rotación de los brazos de anticuerpo. Las regiones constantes de anticuerpos pueden cumplir funciones efectoras, tales como, pero no limitadas a, el aclaramiento de antígenos, patógenos y toxinas a los que se une específicamente el anticuerpo, p. ej., a través de interacciones con diversas células, biomoléculas y tejidos.
Como se emplea en la presente memoria, la frase "derivado de" o "derivado" cuando se refiere a fragmentos de anticuerpos derivados de otro anticuerpo, tales como un anticuerpo monoclonal, se refiere a la modificación genética de fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd') que conservan la especificidad de unión del anticuerpo original o parental. Tales fragmentos se pueden obtener mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, escisión enzimática, entrecruzamiento químico, medios recombinantes o combinaciones de los mismos. En general, el fragmento de anticuerpo obtenido comparte la región variable de la cadena pesada (Vh) idéntica o sustancialmente idéntica y la región variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo parental, de manera que el fragmento de anticuerpo y el anticuerpo parental se unen al mismo epítopo.
Como se emplea en la presente memoria, un "anticuerpo parental" o "anticuerpo de origen" se refiere a un anticuerpo del cual se obtiene un fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmentos Fab, F(ab'), F(ab)2 , Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd').
Como se emplea en la presente memoria, un anticuerpo de proteína de puntos de control inmunitario, se refiere a cualquier anticuerpo que se une específicamente a una proteína de puntos de control inmunitario o fragmento soluble de la misma y bloquea su actividad o inhibe o reduce su actividad. Un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario generalmente se une a una proteína ligando de puntos de control inmunitario o a una proteína receptora de puntos de control inmunitario y bloquea la unión de un receptor a la proteína ligando de puntos de control inmunitario diana o a un ligando para la proteína receptora de puntos de control inmunitario diana, evitando de ese modo la transducción de la señal inhibidora que suprime una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, los anticuerpos anti-proteínas de puntos de control inmunitario son inhibidores de puntos de control inmunitario. La referencia a anticuerpos de proteínas de puntos de control inmunitario en la presente memoria incluyen anticuerpos completos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a una proteína ligando o receptora de puntos de control inmunitario. Los anticuerpos anti-proteínas de puntos de control inmunitario ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) y anticuerpos anti-proteína 1 de muerte celular programada (PD-1).
Como se emplea en la presente memoria, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario se refiere a un anticuerpo derivado de un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario pero que es menor que la secuencia completa del anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario pero que contiene al menos una porción de las regiones variables (pesada y ligera) del anticuerpo suficiente para formar un sitio de unión a antígeno (p. ej., una o más CDR y, en general, todas las CDR) y, por lo tanto, conserva la especificidad de unión y/o la actividad del anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario.
Como se emplea en la presente memoria, el anticuerpo anti-CTLA4 se refiere a cualquier anticuerpo que se una específicamente a la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) o un fragmento soluble de la misma y bloquea la unión de los ligandos a CTLA4, lo que da como resultado una inhibición competitiva de CTLA4 y una inhibición de la inhibición mediada por CTLA4 de la activación de células T. Por lo tanto, los anticuerpos anti-CTLA4 son inhibidores de CTLA4. La referencia a anticuerpos anti-CTLA4 en la presente memoria incluye un anticuerpo completo y derivados del mismo, tales como fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a CTLA4. Los anticuerpos anti-CTLA4 ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, Ipilimumab o Tremelimumab, o un derivado o fragmento de unión a antígeno de los mismos.
Como se emplea en la presente memoria, una proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también conocida como CD152) se refiere a un receptor inhibidor de la superfamilia de inmunoglobulinas, que está unido por ligandos tales como CD80 (también denominado B7-1) y CD86 (también denominado B7-2). CTLA4 incluye proteínas humanas y no humanas. En particular, el antígeno CTLA4 incluye CTLA4 humano, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10 (véase p. ej., Número de Acceso de GenBank AAL07473.1).
Como se emplea en la presente memoria, el anticuerpo anti-PD-1 se refiere a cualquier anticuerpo que se une específicamente a la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) o a un fragmento soluble de la misma y bloquea la unión de los ligandos a PD-1, lo que da como resultado una inhibición competitiva de PD-1 y una inhibición de la inhibición mediada por PD-1 de la activación de células T. Por lo tanto, los anticuerpos anti-PD-1 son inhibidores de PD-1. La referencia a anticuerpos anti-PD-1 en la presente memoria incluye un anticuerpo completo y derivados del mismo, tales como fragmentos de unión a antígeno del mismo que se unen específicamente a PD-1. Los anticuerpos anti-PD-1 ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, Nivolumab, MK-3475, Pidilizumab, o un derivado o fragmento de unión a antígeno de los mismos.
Como se emplea en la presente memoria, un antígeno de proteína 1 de muerte celular programada (PD-1) se refiere a un receptor inhibidor, que es una proteína de membrana de tipo 1 y está unida por ligandos tales como PD-L1 y PD-L2, que son miembros de familia B7. PD-1 incluye proteínas humanas y no humanas. En particular, el antígeno PD-1 incluye PD-1 humano, que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 299 (véase p. ej., Número de Acceso UniProt Q15116.3).
Como se emplea en la presente memoria, el anticuerpo anti-PD-L1 se refiere a un anticuerpo que se une específicamente al ligando 1 de muerte programada (PD-L1) o un fragmento soluble del mismo y bloquea la unión del ligando a PD-1, lo que da como resultado una inhibición competitiva de PD-1 y una inhibición de la inhibición mediada por PD-1 de la actividad de las células T. Por lo tanto, los anticuerpos anti-PD-L1 son inhibidores de PD-1. La referencia a los anticuerpos anti-PD-L1 en la presente memoria incluye un anticuerpo completo y derivados del mismo, tales como sus fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a PD-L1. Los anticuerpos anti-PD-L1 ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, BMS-936559, MPDL3280A, MEDI4736 o un derivado o fragmento de unión a antígeno de los mismos.
Como se emplea en la presente memoria, "unir", "unido" o sus variaciones gramaticales se refieren a la participación de una molécula en cualquier interacción atrayente con otra molécula, lo que da como resultado una asociación estable en la que las dos moléculas están muy cerca una de otra. La unión incluye, pero no se limita a, enlaces no covalentes, enlaces covalentes (tales como los enlaces covalentes reversibles e irreversibles), e incluye interacciones entre moléculas tales como, pero no limitadas a, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y pequeñas moléculas, tales como compuestos químicos incluyendo fármacos.
Los enlaces ilustrativos son interacciones anticuerpo-antígeno e interacciones receptor-ligando. Cuando un anticuerpo "se une" a un antígeno particular, se refiere al reconocimiento específico del antígeno por el anticuerpo, a través de la interacción anticuerpo-antígeno cognado, en los sitios de combinación de anticuerpos. La unión también puede incluir la asociación de múltiples cadenas de un polipéptido, tales como cadenas de anticuerpos que interaccionan a través de enlaces disulfuro.
Como se emplea en la presente memoria, la actividad de unión se refiere a las características de una molécula, p. ej., un polipéptido, relacionado con si se une o no, y con cómo se une a uno o más compañeros de unión. Las actividades de unión incluyen la capacidad de unirse al compañero o los compañeros de unión, la afinidad con la que se une al compañero de unión (p. ej., alta afinidad), la avidez con la que se une al compañero de unión, la fuerza del enlace con el compañero de unión y/o la especificidad por la unión con el compañero de unión.
Como se emplea en la presente memoria, "afinidad" o "afinidad de unión" describe la fuerza de la interacción entre dos o más moléculas, tales como compañeros de unión, típicamente la fuerza de las interacciones no covalentes entre dos compañeros de unión. La afinidad de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo por un epítopo antigénico es la medida de la fuerza de las interacciones no covalentes totales entre un sitio de combinación de anticuerpo único y el epítopo. La interacción anticuerpo-antígeno de baja afinidad es débil, y las moléculas tienden a disociarse rápidamente, mientras que la unión del antígeno-anticuerpo de alta afinidad es fuerte y las moléculas permanecen unidas por un período de tiempo más largo. Los métodos para calcular la afinidad son bien conocidos, tales como los métodos para determinar las constantes de asociación/disociación. Por ejemplo, una elevada afinidad de anticuerpos significa que el anticuerpo se une específicamente a una proteína diana con una constante de asociación en equilibrio (Ka ) de más de o igual a aproximadamente 106 M , de más de o igual a aproximadamente 107 M-1, de más de o igual a aproximadamente 108 M-1, o de más de o igual a aproximadamente 10 * 9 M 1 , 110 0 M 1' , 1 12101 1 M o 10 M' 1. Los ant 1icuerpos también se pueden caracterizâr por un 1a constante de disociación en equilibrio (Kd) 10-4M, de 10-6 M a 10-7 M, o 10-8 M, 10' 10 M, 10-11 M o 10-12 M o inferior. La afinidad se puede estimar empíricamente o las afinidades se pueden determinar comparativamente, p. ej., comparando la afinidad de un anticuerpo y otro anticuerpo para un antígeno particular. Por ejemplo, tales afinidades se pueden determinar fácilmente utilizando técnicas convencionales, tales como diálisis en equilibrio; utilizando el aparato BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales descritos por el fabricante; por radioinmunoensayo utilizando antígeno diana radiomarcado; o por otro método conocido por el experto en la técnica. Los datos de afinidad se pueden analizar, por ejemplo, por el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949).
Como se emplea en la presente memoria, la avidez del anticuerpo se refiere a la fuerza de las interacciones múltiples entre un anticuerpo multivalente y su antígeno cognado, tal como con anticuerpos que contienen múltiples sitios de unión asociados con un antígeno con epítopos repetitivos o una matriz de epítopos. Un anticuerpo de alta avidez tiene una mayor fuerza de tales interacciones en comparación con un anticuerpo de baja avidez.
Como se emplea en la presente memoria, "constante de afinidad" se refiere a una constante de asociación (Ka) utilizada para medir la afinidad de un anticuerpo por un antígeno. Cuanto mayor sea la constante de afinidad, mayor será la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Las constantes de afinidad se expresan en unidades de molaridad recíproca (es decir, M-1) y se pueden calcular a partir de la constante de velocidad para la reacción de asociacióndisociación medida por la metodología cinética convencional para reacciones de anticuerpos (p. ej., inmunoensayos, resonancia de plasmón superficial u otros ensayos de interacción cinética conocidos en la técnica). La afinidad de unión de un anticuerpo también se puede expresar como una constante de disociación, o Kd. La constante de disociación es la inversa de la constante de asociación, Kd = 1/Ka. Por lo tanto, una constante de afinidad también puede ser representada por la Kd.
Como se emplea en la presente memoria, el término "el mismo", cuando se utiliza en referencia a la afinidad de unión al anticuerpo, significa que la constante de asociación (Ka) o la constante de disociación (Kd) están dentro de aproximadamente 1 a 100 veces o 1 a 10 veces la del anticuerpo de referencia (1-100 veces mayor afinidad o 1-100 veces menor afinidad, o cualquier valor numérico o intervalo o valor dentro de tales intervalos, que la del anticuerpo de referencia).
Como se emplea en la presente memoria, "sustancialmente lo mismo" cuando se utiliza en referencia a la constante de asociación (Ka) o constante de disociación (Kd), significa que la constante de asociación está dentro de aproximadamente 5 a 5.000 veces mayor o menor que la constante de asociación, Ka, del anticuerpo de referencia (5-5.000 veces mayor o 5-5.000 veces menor que la el anticuerpo de referencia).
Como se emplea en la presente memoria, "unión específica" o "unión inmunoespecífica" con respecto a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se utilizan de manera indistinta en la presente memoria y se refieren a la capacidad del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para formar uno o más enlaces no covalentes con un antígeno cognado, por interacciones no covalentes entre los sitios de combinación de anticuerpos del anticuerpo y el antígeno. Típicamente, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente (o que se une específicamente) es uno que se une a una diana con una constante de afinidad Ka de aproximadamente o 1 x 107 M-1 o 1 x 108 M-1 o mayor (o una constante de disociación (Kd) de 1 x 10-7 M o 1 x 10'8 M o menos). Las constantes de afinidad se pueden determinar mediante una metodología cinética convencional para reacciones de anticuerpos, por ejemplo, inmunoensayos, resonancia de plasmón superficial (SPR) (Rich y Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123:1599), calorimetría de titulación isotérmica (ITC) u otros ensayos de interacción cinética conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Paul, ed., Fundamental Immunology, 2a ed., Raven Press, Nueva York, páginas 332-336 (1989); véase también la Patente de Estados Unidos Núm. 7.229.619 para una descripción de los métodos de SPR e ITC ilustrativos para calcular la afinidad de unión de los anticuerpos). El instrumental y los métodos para la detección y seguimiento en tiempo real de las tasas de unión son conocidos y están disponibles comercialmente (p. ej., BIAcore 2000, BIAcore AB, Upsala, Suecia y GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (1999) Biochem. Soc. Trans. 27:335). Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen de forma inmunoespecífica a un antígeno particular (p. ej., EGFR) se pueden identificar, por ejemplo, mediante inmunoensayos, tales como radioinmunoensayos (RIA), ensayos de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), resonancia de plasmón superficial u otros mecanismos conocidas por los expertos en la técnica.
Como se emplea en la presente memoria, una respuesta inmunitaria es una respuesta generada por un sujeto animal cuando los linfocitos identifican una molécula antigénica como foránea e inducen la formación de anticuerpos y linfocitos capaces de reaccionar con el antígeno foráneo y actuar para eliminar el antígeno. En particular, la molécula antigénica es un antígeno asociado con una célula tumoral y la respuesta inmunitaria se dirige contra la célula tumoral.
Como se emplea en la presente memoria, una respuesta inmunitaria potenciada es un aumento en la actividad asociada con una respuesta inmunitaria. La actividad inmunitaria potenciada o aumentada se puede medir mediante una variedad de métodos, que incluyen, pero no se limitan a, un aumento de las células inmunitarias circulantes (p. ej., linfocitos) y un aumento de los linfocitos que reconocen específicamente los antígenos tumorales.
Como se emplea en la presente memoria, una respuesta inmunitaria antitumoral es una respuesta inmunitaria específicamente dirigida contra una célula tumoral o un antígeno tumoral.
Como se emplea en la presente memoria, un agente anti-hialuronano se refiere a cualquier agente que modula la síntesis o degradación de hialuronano (HA), alterando de ese modo los niveles de hialuronano en un tejido o célula. Para los fines de la presente memoria, los agentes anti-hialuronano reducen los niveles de hialuronano en un tejido o célula en comparación con la ausencia del agente. Tales agentes incluyen compuestos que modulan la expresión del material genético que codifica la HA sintasa (HAS) y otras enzimas o receptores involucrados en el metabolismo del hialuronano, o que modulan las proteínas que sintetizan o degradan el hialuronano, incluida la función o actividad de HAS. Los agentes incluyen moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas u otros compuestos. Por ejemplo, los agentes anti-hialuronano incluyen, pero no se limitan a, moléculas antisentido o efectoras, anticuerpos, enzimas, inhibidores de moléculas pequeñas y análogos de sustrato de HAS.
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e re f ie re a u n a e n z im a q u e cataliza la escisión de un polímero de hialuronano (también denominado ácido hialurónico o HA) en fragmentos de menor peso molecular. Las enzimas de degradación de hialuronano ilustrativas son hialuronidasas, y condroitinasas y liasas particulares que tienen la capacidad de despolimerizar el hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas que son enzimas que degradan el hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitina sulfato liasa o condroitina sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. La condroitina ABC liasa incluye dos enzimas, la condroitina-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y la condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21). Las condroitina-sulfato-ABC endoliasas y las condroitina-sulfato-ABC exoliasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de P ro te u s vu lga ris y F la vo b a c te riu m h e p a rin u m (la condroitina-sulfato-ABC endoliasa de P ro te u s vu lga ris se expone en SEQ ID NO: 253; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1): 39-46). Las enzimas de condroitinasa AC ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de F la vo b a c te riu m he p a rin u m , expuesta en SEQ ID NO: 254, de V ic tiva llis vadens is , expuesta en SEQ ID NO: 255, y de A rth ro b a c te r a u re sce n s (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5): 387-444). Las enzimas condroitinasa C ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de S tre p to co ccu s y F la vo b a c te riu m (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48 (2): 121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251: 1154-8; Tsudaetal. (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133).
Como se emplea en la presente memoria, hialuronidasa se refiere a una clase de enzimas que degradan el hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) y hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, origen murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino, ovino, porcino, de peces, de ranas, bacteriano y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Las hialuronidasas no humanas ilustrativas incluyen, hialuronidasas de vacas (SEQ ID NO: 176-178 y BH55 (Patentes de Estados Unidos Núm. 5.747.027 y 5.827.721)), avispa chaqueta amarilla (SEQ ID NO: 171 y 172), abeja (SEQ ID NO: 173), avispa cara blanca (SEQ ID NO: 174), avispa de papel (SEQ ID NO: 175), ratón ( SEQ ID NO: 193-196), cerdo (SEQ ID NO: 191, 192), rata (SEQ ID NO: 198-201), conejo (SEQ ID NO: 203), oveja (SEQ ID NO: 184-187), chimpancé (SEQ ID NO: 204), mono Rhesus (SEQ ID n O: 202), orangután (SEQ i D NO: 205), mono cinomolgo ( S e Q ID NO: 206), cobaya (SEQ ID NO: 197), A rth ro b a c te r sp. (cepa FB24) ( S e Q ID NO: 222), B de llo v ib rio b a c te r io v o ru s (SEQ ID NO: 223), P ro p io n ib a c te riu m a cn e s (SEQ ID NO: 224), S tre p to co ccu s ag a la c tia e ((SEQ ID NO: 225); 18RS21 (SEQ ID NO: 226); serotipo la (SEQ ID NO: 227); y serotipo III (SEQ ID NO: 228)), S ta p h y lo co ccu s a u re u s (cepa COL (SEQ ID n O : 229); cepa MRSA252 ( S e Q ID NO: 230, 231); cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 232); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 233); cepa bovina RF122 (SEQ ID NOS: 234, 235) y cepa USA300 (SEQ ID NO: 236)), S tre p to co ccu s p n e u m o n ia e ((SEQ ID NO: 237); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ iD n O : 238) y serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 ( S e Q ID NO: 239)), S tre p to co ccu s p y o g e n e s (serotipo M1 (SEQ ID NO: 240); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 241); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 242); serotipo M6 (SEQ ID NO: 243); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NO: 244, 245); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 246) y serotipo M28 (SEQ ID NO: 247)); S tre p to co ccu s su is (SEQ ID NO: 248-250); Vibrio fis c h e ri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 251)), y la enzima hialuronidasa de S tre p to m yce s hya lu ro n o ly ticu s , que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina ni el sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen aquellas de origen humano. Las hialuronidasas humanas ilustrativas incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 218), HYAL2 (SEQ ID NO: 219), HYAL3 (SEQ ID NO: 220), HYAL4 (SEQ ID NO: 221) y PH20 (SEQ ID NO: 217). También se incluyen entre las hialuronidasas las hialuronidasas solubles, que incluyen la PH20 ovina y bovina, la PH20 humana soluble y la rHuPH20 soluble. Los ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas disponibles comercialmente incluyen Vitrase® (hialuronidasa ovina), Amphadase® (hialuronidasa bovina) e Hydase™ (hialuronidasa bovina).
Como se emplea en la presente memoria, "hialuronidasa testicular bovina purificada" se refiere a una hialuronidasa bovina purificada a partir de extractos testiculares bovinos (véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565, 2.806.815, 2.808.362, 2.676.139, 2.795.529, 5.747.027 y 5.827.721). Los ejemplos de hialuronidasas testiculares bovinas purificadas disponibles comercialmente incluyen Amphadase® e Hydase™, y hialuronidasas bovinas, incluyendo, pero no limitadas a, aquellas disponibles de Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Raybiotech, Inc. y Calzyme. También se incluyen hialuronidasas bovinas producidas de forma recombinante, tales como, pero no limitadas a, las generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de S e Q ID NO: 181-183.
Como se emplea en la presente memoria, "hialuronidasa testicular ovina purificada" se refiere a una hialuronidasa ovina purificada a partir de extractos testiculares ovinos (véanse las Patentes de Estados Unidos Núm. 2.488.564, 2.488.565 y 2.806.815 y la publicación internacional P c T Núm. WO2005/118799). Los ejemplos de extracto testicular ovino purificado disponible comercialmente incluyen Vitrase® y hialuronidasas ovinas, incluyendo, pero no limitadas a, las disponibles de Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com y Raybiotech, Inc. También se incluyen hialuronidasas ovinas producidas de forma recombinante, tales como, pero no limitadas a, las generadas por la expresión de una molécula de ácido nucleico expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 188-190.
Como se emplea en la presente memoria, "PH20" se refiere a un tipo de hialuronidasa que se produce en el esperma y es neutro-activo. La PH-20 se produce en la superficie del esperma y en el acrosoma derivado de lisosomas, donde se une a la membrana acrosómica interna. La PH20 incluye aquellas de cualquier origen incluyendo, pero no limitado a, humano, de chimpancé, de monos Cynomolgus, de monos Rhesus, murino, bovino, ovino, de cobaya, de conejo y de rata. Los polipéptidos de PH20 ilustrativos incluyen los de ser humano (SEQ ID NO: 217), chimpancé (SeQ iD NO: 204), mono Rhesus (SEQ ID NO: 202), mono Cynomolgus (SEQ ID NO: 206), vaca (p. ej., SEQ ID NO: 177, 178), ratón (SEQ ID NO: 196), rata (SEQ ID NO: 201), conejo (SEQ ID NO: 203), oveja (SEQ ID NO: 185-187) y cobaya (SEQ ID NO: 197).
La referencia a enzimas de degradación de hialuronano incluye los polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano precursores y los polipéptidos de enzimas de degradación de hialuronano maduros (tales como aquellos en los que se ha eliminado una secuencia señal), sus formas truncadas que tienen actividad e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 217 y 129, 130, 171-178, 184-187, 191-206 218-255, 258, 268-272, 274, 300, y 301, o sus formas maduras. Por ejemplo, la referencia a la enzima de degradación de hialuronano también incluye las variantes del polipéptido precursor de PH20 humano expuestas en SEQ ID NO: 179, 180. Las enzimas de degradación de hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y las que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilación, albuminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica. Una hialuronidasa PH20 truncada es cualquier forma acortada C-terminal de la misma, en particular las formas que se truncan y se activan de forma neutra cuando están N-glicosiladas.
Como se emplea en la presente memoria, una "PH20 soluble" se refiere a cualquier forma de PH20 que sea soluble en condiciones fisiológicas. Una PH20 soluble se puede identificar, por ejemplo, mediante su reparto en la fase acuosa de una solución de Triton® X-114 a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256: 1604-7). La PH20 anclada a membrana, tal como la PH20 anclada en lípidos, incluyendo la PH20 anclada a GPI, se repartirá en la fase rica en detergente, pero se repartirá en la fase acuosa o pobre en detergente después del tratamiento con Fosfolipasa-C. Entre las PH20 solubles se incluyen las PH20 ancladas a la membrana en las que una o más regiones asociadas con el anclaje de la PH20 a la membrana se ha eliminado o modificado, donde la forma soluble conserva la actividad de la hialuronidasa. La PH20 soluble también incluye la PH20 soluble recombinante y aquellas contenidas en o purificadas de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Un ejemplo de tal PH20 soluble es la PH20 humana soluble.
Como se emplea en la presente memoria, la PH20 humano soluble o sHuPH20 incluye polipéptidos de PH20 que carecen de la totalidad o de una parte de la secuencia de anclaje del glicosilfosfatidilinositol (GPI) en el extremo C de manera que, tras la expresión, los polipéptidos son solubles en condiciones fisiológicas. La solubilidad se puede evaluar mediante cualquier método adecuado que demuestre solubilidad en condiciones fisiológicas. Un ejemplo de tales métodos es el ensayo de Triton® X-114, que evalúa el reparto en la fase acuosa y que se ha descrito anteriormente y en los ejemplos. Además, un polipéptido de PH20 humano soluble, si se produce en células CHO, tales como las células CHO-S, es un polipéptido que se expresa y se secreta en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos de PH20 humanos solubles, sin embargo, no se limitan a los producidos en células CHO, sino que se pueden producir en cualquier célula o por cualquier método, incluyendo la expresión recombinante y la síntesis de polipéptidos. La referencia a la secreción por células CHO es definitoria. Por lo tanto, si un polipéptido podría ser expresado y secretado por las células CHO y es soluble, es decir, se reparte en la fase acuosa cuando se extrae con Triton® X-114, es un polipéptido de PH20 soluble, se produzca o no de esta manera. Los polipéptidos precursores para los polipéptidos sHuPH20 pueden incluir una secuencia señal, tal como una secuencia señal heteróloga o no heteróloga (es decir, nativa). Los precursores ilustrativos son aquellos que incluyen una secuencia de señal, tal como la secuencia señal de 35 aminoácidos nativa en las posiciones de aminoácidos 1-35 (véanse, p. ej., aminoácidos 1-35 de SEQ ID NO: 217). Los polipéptidos de PH20 humanos solubles ilustrativos incluyen un polipéptido de PH20 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158 y conserva la actividad hialuronidasa.
Como se emplea en la presente memoria, "PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20)" se refiere a una composición que contiene formas solubles de PH20 humana expresada de forma recombinante y secretada en células de ovario de hámster chino (CHO). La rHuPH20 soluble está codificada por una molécula de ácido nucleico que incluye la secuencia señal y se expone en SEQ ID NO: 111. El ácido nucleico que codifica la rHuPH20 soluble se expresa en células CHO que secretan el polipéptido maduro. Tal como se produce en el medio de cultivo, hay heterogeneidad en el extremo C de modo que el producto incluye una mezcla de especies que puede incluir uno o más de SEQ ID NO: 123-128 en diferente abundancia.
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , un " p ro d u c to c o n ju g a d o " s e re f ie re a un p o lip é p tid o u n id o d ire c ta o indirectamente a uno o más de otros polipéptidos o radicales químicos. Tales productos conjugados incluyen proteínas de fusión, aquellas producidas por productos conjugados químicos y aquellas producidas por cualquier otro método. Por ejemplo, un producto conjugado se refiere a una enzima de degradación de hialuronano, tal como un hialuronidasa o polipéptido de PH20 soluble, unido directa o indirectamente a uno o más polipéptidos o radicales químicos diferentes, por lo que al menos un polipéptido de PH20 soluble está conectado, directa o indirectamente, a otro polipéptido o radical químico siempre que el producto conjugado conserve la actividad hialuronidasa.
Como se emplea en la presente memoria, una "enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero" se refiere a una enzima de degradación de hialuronano que está ligada directa o indirectamente a un polímero. La conexión puede ser cualquier tipo de conexión, incluyendo, pero no limitada a, enlaces iónicos y covalentes, y cualquier otra interacción asociada suficientemente estable. Por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, incluye una hialuronidasa o un polipéptido de PH20 soluble conjugado con un polímero. La referencia a una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero significa que el producto conjugado muestra actividad hialuronidasa. Típicamente, el producto conjugado con polímero muestra al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de la actividad hialuronidasa en comparación con la enzima de degradación de hialuronano que no está conjugada con un polímero
Como se emplea en la presente memoria, un "radical unido a N" se refiere a un residuo de aminoácido asparragina (N) de un polipéptido que es susceptible de ser glicosilado por modificación postraduccional de un polipéptido. Los radicales ligados a N ilustrativos de PH20 humana incluyen los aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 y N393 de PH20 humano expuestos en SEQ ID NO: 217.
Como se emplea en la presente memoria, un "polímero" se refiere a cualquier radical natural o sintético de alto peso molecular que se compone de unidades repetitivas. Los polímeros incluyen, pero no se limitan a, radicales de polietilenglicol, dextrano, celulosa y ácido siálico. Estos y otros polímeros ilustrativos se describen en la presente memoria, y muchos son conocidos en la técnica. Para los fines de la presente memoria, el polímero puede estar conjugado con, es decir, ligado de manera estable directa o indirectamente a través de un conector, a un polipéptido. Tales productos conjugados poliméricos, típicamente aumentan la semi-vida en suero, e incluyen, pero no se limitan a, radicales siálicos, radicales de PEGilación, dextrano y azúcar y otros radicales, tales como glicosilación. Por ejemplo, las hialuronidasas, tales como una PH20 soluble o rHuPH20, se pueden conjugar con un polímero.
Como se emplea en la presente memoria, "PEGilado" se refiere al anclaje covalente u otro anclaje estable de moléculas poliméricas, tales como polietilenglicol (radical de PEGilación PEG) a las proteínas, incluyendo las enzimas de degradación de hialuronano, tales como las hialuronidasas, típicamente para aumentar la semi-vida de la enzima de degradación de hialuronano.
Como se emplea en la presente memoria, un agente anti-canceroso o un agente quimioterapéutico se refiere a un agente que es capaz de destruir las células que se dividen rápidamente, tales como las células cancerosas. Un experto en la técnica está familiarizado con los agentes anti-cancerosos, incluyendo los agentes quimioterapéuticos. Los agentes ilustrativos se describen en la presente memoria.
Como se emplea en la presente memoria, un profármaco es un compuesto que muestra actividad farmacológica después de la biotransformación. Por ejemplo, los análogos de nucleósidos tales como la gemcitabina son profármacos, por lo que su actividad se produce como resultado de la conversión intracelular en dos metabolitos activos, el difosfato de gemcitabina y el trifosfato de gemcitabina por la desoxicitidina quinasa. El trifosfato (trifosfato de difluorodesoxicitidina) compite con los desoxinucleósidos trifosfato endógenos por su incorporación en el ADN. Como se emplea en la presente memoria, un derivado con referencia a un fármaco se refiere a una forma de un fármaco que ha sufrido cambios o modificaciones con respecto a un fármaco o agente de referencia, pero que aún conserva la actividad (p. ej., muestra un aumento o disminución de actividad) en comparación con el fármaco o agente de referencia. Normalmente, una forma derivada de un compuesto significa que una cadena lateral del compuesto se ha modificado o cambiado.
Como se emplea en la presente memoria, un análogo o análogo de un fármaco o agente es un fármaco o agente que está relacionado con un fármaco de referencia, pero cuyas actividades químicas y biológicas pueden ser diferentes. Típicamente, los análogos muestran actividades similares a un fármaco o agente de referencia, pero la actividad se puede aumentar o disminuir o mejorar de otro modo. Típicamente, una forma análoga de un compuesto o medicamento significa que el núcleo de la cadena principal de la estructura se modifica o cambia en comparación con un fármaco de referencia.
Como se emplea en la presente memoria, "actividad" se refiere a una actividad o actividades funcionales de un polipéptido o porción del mismo asociadas con una proteína con toda su longitud (completa). Por ejemplo, los fragmentos activos de un polipéptido pueden mostrar una actividad de una proteína con toda su longitud. Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad biológica, actividad catalítica o enzimática, a n t ig e n ic id a d (c a p a c id a d p a ra u n irs e o c o m p e t ir co n un p o lip é p tid o p o r la u n ió n a un a n t ic u e rp o a n ti-p o lip é p t id o ) , in m u n o g e n ic id a d , c a p a c id a d p a ra fo rm a r m u ltím e ro s y c a p a c id a d p a ra u n irs e e s p e c íf ic a m e n te a un re c e p to r , lig a n d o o a n tíg e n o .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a " s e re f ie re a la c a p a c id a d p a ra c a ta liz a r e n z im á t ic a m e n te la e s c is ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o . El e n s a y o X X II d e la F a rm a c o p e a d e lo s E s ta d o s U n id o s (U S P ) p a ra la h ia lu ro n id a s a d e te rm in a la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a in d ire c ta m e n te m id ie n d o la c a n t id a d d e á c id o h ia lu ró n ic o d e m a y o r p e s o m o le c u la r o h ia lu ro n a n o (H A ) q u e q u e d a d e s p u é s d e d e ja r q u e la e n z im a re a c c io n e co n H A d u ra n te 30 m in a 37 °C (U S P X X II -N F X V II (1990 ) 644 -645 U n ite d S ta te s P h a rm a c o p e ia C o n v e n tio n , Inc ., R o c k v ille , M D ). S e p u e d e u t i l iz a r u n a s o lu c ió n p a tró n en un e n s a y o p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d re la t iv a , en u n id a d e s , d e c u a lq u ie r h ia lu ro n id a s a . L o s e n s a y o s in v itro p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a d e la s h ia lu ro n id a s a s , ta le s c o m o P H 20 , in c lu y e n d o P H 20 s o lu b le y e s P H 20 , s o n c o n o c id o s en la té c n ic a y s e d e s c r ib e n en la p re s e n te m e m o r ia . L o s e n s a y o s i lu s tra t iv o s in c lu y e n e l e n s a y o d e m ic ro tu rb id e z q u e m id e la e s c is ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o p o r h ia lu ro n id a s a in d ire c ta m e n te d e te c ta n d o e l p ro d u c to p re c ip ita d o in s o lu b le q u e s e fo rm a c u a n d o el á c id o h ia lu ró n ic o n o e s c in d id o s e u n e c o n la a lb ú m in a s é r ic a y e l e n s a y o d e á c id o h ia lu ró n ic o b io t in ila d o q u e m id e la e s c is ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o in d ire c ta m e n te a l d e te c ta r e l á c id o h ia lu ró n ic o b io t in ila d o u n id o d e m a n e ra no c o v a le n te a lo s p o c il lo s d e la p la c a d e m ic ro t itu la c ió n c o n un p ro d u c to c o n ju g a d o d e e s tre p ta v id in a -p e ro x id a s a d e rá b a n o p ic a n te y un s u s tra to c ro m o g é n ic o . S e p u e d e n u t i l iz a r P a tro n e s d e re fe re n c ia , p o r e je m p lo , p a ra g e n e ra r u n a c u rv a e s tá n d a r p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d en U n id a d e s d e la h ia lu ro n id a s a q u e s e e s tá s o m e tie n d o a p ru e b a .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , la a c t iv id a d e s p e c íf ic a s e re f ie re a U n id a d e s d e a c t iv id a d p o r m g d e p ro te ín a . L o s m ilig ra m o s d e h ia lu ro n id a s a s e d e f in e n p o r la a b s o rc ió n d e u n a s o lu c ió n d e 280 n m , s u p o n ie n d o un c o e f ic ie n te d e e x t in c ió n m o la r d e a p ro x im a d a m e n te 1 ,7 , en u n id a d e s d e M -1 c m -1.
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "a c t iv o n e u tro " s e re f ie re a la c a p a c id a d d e un p o lip é p tid o d e P H 20 p a ra c a ta l iz a r e n z im á t ic a m e n te la e s c is ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o a pH n e u tro (p. e j., a o a p ro x im a d a m e n te a pH 7 ,0 ).
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a " s e c u e n c ia s e ñ a l d e a n c la je a l a n c la d e G P I" e s u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s C - te rm in a l q u e d ir ig e la a d ic ió n d e un a n c la d e G P I p re fo rm a d a a l p o lip é p tid o a l in te r io r d e l lu m e n de l R E . L a s s e c u e n c ia s s e ñ a l d e a n c la je a l a n c la d e G P I e s tá n p re s e n te s en lo s p o lip é p tid o s p re c u rs o re s d e p o lip é p tid o s a n c la d o s a G P I, ta le s c o m o lo s p o lip é p tid o s d e P H 20 a n c la d o s a G P I. L a s e c u e n c ia d e s e ñ a l d e a n c la je a l a n c la d e G P I C - te rm in a l t íp ic a m e n te c o n t ie n e u n a re g ió n p re d o m in a n te m e n te h id ró fo b a d e 8 -20 a m in o á c id o s , p re c e d id a p o r u n a re g ió n e s p a c ia d o ra h id ró f ila d e 8 -12 a m in o á c id o s , in m e d ia ta m e n te a g u a s a b a jo d e l s it io u>, o el s it io d e l a n c la d e G P I a d ju n to . L a s s e c u e n c ia s s e ñ a l d e a n c la je a l a n c la d e G P I s e p u e d e n id e n t if ic a r u t i l iz a n d o m é to d o s b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . E s to s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, m é to d o s in s ilico y a lg o r itm o s (v é a s e , p. e j., U d e n fr ie n d e t a l. (1995 ) M e th o d s E n z y m o l. 250 : 571 -582 , E is e n h a b e r e t a l., (1999 ) J. B io l. C h e m . 292 :741 -758 , F a n k h a u s e r e t a l., (2005 ) B io in fo rm a t ic s 21 :1846 -1852 , O m a e tx e b a r r ia e t a l., (2007 ) P ro te o m ic s 7 :1951 -1960 , P ie r le o n i e t a l., (2008 ) B M C B io in fo rm a t ic s 9 :392 ), in c lu y e n d o a q u e llo s q u e e s tá n d is p o n ib le s en s it io s w e b d e b io in fo rm á t ic a , ta le s c o m o el s it io d e h e rra m ie n ta s E x P A S y P ro te o m ic s (p. e j., e l s it io d e la R e d In fo rm á t ic a M u n d ia l e x p a s y .c h /to o ls /) .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "á c id o s n u c le ic o s " in c lu y e A D N , A R N y a n á lo g o s d e lo s m is m o s , in c lu y e n d o á c id o s p e p tid o n u c le ic o s (P N A ) y m e z c la s d e lo s m is m o s . L o s á c id o s n u c le ic o s p u e d e n s e r d e h e b ra s e n c il la o d o b le . C u a n d o s e h a c e re fe re n c ia a s o n d a s o c e b a d o re s , q u e e s tá n m a rc a d o s o p c io n a lm e n te , ta le s c o m o c o n u n a m a rc a d e te c ta b le , ta l c o m o u n a m a rc a f lu o re s c e n te o ra d io m a rc a , s e c o n te m p la n m o lé c u la s d e h e b ra s e n c illa . T a le s m o lé c u la s t ie n e n t íp ic a m e n te u n a lo n g itu d ta l q u e su d ia n a e s e s ta d ís t ic a m e n te ú n ic o o d e b a jo n ú m e ro d e c o p ia s ( t íp ic a m e n te m e n o s d e 5, g e n e ra lm e n te m e n o s d e 3 ) p a ra s o n d e a r o c e b a r u n a b ib lio te c a . En g e n e ra l, u n a s o n d a o c e b a d o r c o n t ie n e a l m e n o s 14, 16 o 30 n u c le ó tid o s c o n t ig u o s d e s e c u e n c ia c o m p le m e n ta r ia o id é n t ic a a un g e n d e in te ré s . L a s s o n d a s y lo s c e b a d o re s p u e d e n te n e r u n a lo n g itu d d e 10, 20 , 30 , 50 , 100 o m á s n u c le ó tid o s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , un p é p tid o s e re f ie re a un p o lip é p tid o q u e t ie n e u n a lo n g itu d m a y o r o ig u a l a 2 a m in o á c id o s , y u n a lo n g itu d m e n o r o ig u a l a 40 a m in o á c id o s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , lo s a m in o á c id o s q u e a p a re c e n en la s d iv e rs a s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia s e id e n t if ic a n d e a c u e rd o co n s u s a b re v ia tu ra s c o n o c id a s d e t re s le tra s o d e u n a le tra (T a b la 1). L o s n u c le ó tid o s q u e a p a re c e n en lo s d iv e rs o s fra g m e n to s d e á c id o n u c le ic o se d e s ig n a n c o n la s d e s ig n a c io n e s c o n v e n c io n a le s d e u n a s o la le tra u t i l iz a d a s h a b itu a lm e n te en la té c n ic a .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , un " a m in o á c id o " e s un c o m p u e s to o rg á n ic o q u e c o n t ie n e un g ru p o a m in o y un g ru p o á c id o c a rb o x í lic o . U n p o lip é p tid o c o n t ie n e d o s o m á s a m in o á c id o s . P a ra lo s f in e s d e la p re s e n te m e m o r ia , lo s a m in o á c id o s in c lu y e n lo s v e in te a m in o á c id o s n a tu ra le s , a m in o á c id o s n o n a tu ra le s y a n á lo g o s d e a m in o á c id o s (e s d e c ir , a m in o á c id o s en lo s q u e e l c a rb o n o a t ie n e u n a c a d e n a la te ra l) .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , " re s id u o d e a m in o á c id o " s e re f ie re a un a m in o á c id o fo rm a d o t ra s la d ig e s t ió n q u ím ic a (h id ró lis is ) d e un p o lip é p tid o en s u s e n la c e s p e p tíd ic o s . S e s u p o n e q u e lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia e s tá n en la fo rm a is ó m e ra "L ". L o s re s id u o s en la fo rm a is o m é r ic a "D ", q u e s e d e s ig n a n as í, s e p u e d e n s u s t itu ir p o r c u a lq u ie r re s id u o d e L -a m in o á c id o s ie m p re q u e la p ro p ie d a d fu n c io n a l d e s e a d a s e a c o n s e rv a d a p o r e l p o lip é p tid o . N H 2 s e re f ie re a l g ru p o a m in o lib re p re s e n te en e l e x tre m o a m in o d e un p o lip é p tid o . C O O H s e re f ie re a l g ru p o c a rb o x i lib re p re s e n te en e l e x t re m o c a rb o x ilo d e un p o lip é p tid o . D e a c u e rd o c o n la n o m e n c la tu ra d e p o lip é p tid o s c o n v e n c io n a l d e s c r ita en J. B io l. C h e m ., 243 :3557 -3559 (1968 ), y a d o p ta d a 37 C .F .R . § § 1.821 -1.822 , la s a b re v ia tu ra s p a ra lo s re s id u o s d e a m in o á c id o s e m u e s tra n en la T a b la 1:
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T o d a s la s s e c u e n c ia s d e re s id u o s d e a m in o á c id o s re p re s e n ta d a s en la p re s e n te m e m o r ia m e d ia n te fó rm u la s t ie n e n u n a o r ie n ta c ió n d e iz q u ie rd a a d e re c h a en la d ire c c ió n c o n v e n c io n a l d e l e x tre m o a m in o a l e x tre m o c a rb o x ilo . A d e m á s , la e x p re s ió n " re s id u o d e a m in o á c id o " s e d e f in e p a ra in c lu ir lo s a m in o á c id o s e n u m e ra d o s en la T a b la d e C o r re s p o n d e n c ia (T a b la 1) y lo s a m in o á c id o s m o d if ic a d o s e in u s u a le s , ta le s c o m o lo s m e n c io n a d o s en 37 C .F .R . § § 1.821 -1.822. A d e m á s , s e d e b e te n e r en c u e n ta q u e un g u ió n a l p r in c ip io o a l f in a l d e u n a s e c u e n c ia d e re s id u o s d e a m in o á c id o in d ic a un e n la c e p e p tíd ic o a u n a s e c u e n c ia a d ic io n a l d e u n o o m á s re s id u o s d e a m in o á c id o , a un g ru p o a m in o - te rm in a l ta l c o m o N H 2 o a un g ru p o c a rb o x ilo te rm in a l ta l c o m o C O O H .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , lo s " a -a m in o á c id o s d e o r ig e n n a tu ra l" so n lo s re s id u o s d e e s o s 20 a -a m in o á c id o s q u e s e e n c u e n tra n en la n a tu ra le z a q u e s e in c o rp o ra n a la p ro te ín a m e d ia n te e l re c o n o c im ie n to e s p e c íf ic o d e la m o lé c u la d e A R N t c a rg a d a c o n su c o d ó n d e A R N m c o g n a d o en lo s s e re s h u m a n o s . L o s a m in o á c id o s d e o r ig e n n o n a tu ra l in c lu y e n , p o r e je m p lo , a m in o á c id o s o a n á lo g o s d e a m in o á c id o s d is t in to s d e lo s 20 a m in o á c id o s d e o r ig e n n a tu ra l e in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, lo s e s te re o is ó m e ro s D d e lo s a m in o á c id o s . L o s a m in o á c id o s n o n a tu ra le s i lu s tra t iv o s s e d e s c r ib e n en la p re s e n te m e m o r ia y so n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a c o n s tru c c ió n d e A D N e s u n a m o lé c u la d e A D N lin e a l o c ir c u la r d e h e b ra s e n c il la o d o b le q u e c o n t ie n e s e g m e n to s d e A D N c o m b in a d o s y y u x ta p u e s to s d e u n a m a n e ra q u e n o se e n c u e n tra en la n a tu ra le z a . L a s c o n s tru c c io n e s d e A D N e x is te n c o m o re s u lta d o d e la m a n ip u la c ió n h u m a n a e in c lu y e n c lo n e s y o tra s c o p ia s d e m o lé c u la s m a n ip u la d a s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , un s e g m e n to d e A D N e s u n a p o rc ió n d e u n a m o lé c u la d e A D N m á s g ra n d e q u e t ie n e a tr ib u to s e s p e c íf ic o s . P o r e je m p lo , un s e g m e n to d e A D N q u e c o d if ic a un p o lip é p tid o e s p e c if ic a d o e s u n a p o rc ió n d e u n a m o lé c u la d e A D N m á s la rg a , ta l c o m o un p lá s m id o o f ra g m e n to d e p lá s m id o , q u e , c u a n d o se le e d e s d e la d ire c c ió n 5 ' a 3', c o d if ic a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l p o lip é p tid o e s p e c if ic a d o .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , e l té rm in o p o lin u c le ó t id o s ig n if ic a un p o lím e ro d e h e b ra s e n c il la o d o b le d e b a s e s d e s o x ir r ib o n u c le o t íd ic a s o r ib o n u c le o t íd ic a s le íd o d e s d e e l e x tre m o 5 ' a l e x tre m o 3'. L o s p o lin u c le ó t id o s in c lu y e n A R N y A D N , y s e p u e d e n a is la r d e fu e n te s n a tu ra le s , s in te t iz a r in v itro o p re p a ra r a p a r t ir d e u n a c o m b in a c ió n d e m o lé c u la s n a tu ra le s y s in té t ic a s . L a lo n g itu d d e u n a m o lé c u la p o lin u c le o tíd ic a s e p ro p o rc io n a en la p re s e n te m e m o r ia en té rm in o s d e n u c le ó tid o s (a b re v ia d o c o m o "n t" ) o p a re s d e b a s e s (a b re v ia d o c o m o "p b ") . El té rm in o n u c le ó tid o s s e u t iliz a p a ra m o lé c u la s d e h e b ra s e n c il la y d o b le d o n d e el c o n te x to lo p e rm ite . C u a n d o el té rm in o s e a p lic a a m o lé c u la s d e d o b le h e b ra , s e u t iliz a p a ra in d ic a r la lo n g itu d to ta l y s e e n te n d e rá q u e es e q u iv a le n te a l té rm in o p a re s d e b a s e s . L o s e x p e r to s en la té c n ic a re c o n o c e rá n q u e la s d o s h e b ra s d e un p o lin u c le ó t id o d e d o b le h e b ra p u e d e n d ife r ir l ig e ra m e n te en lo n g itu d y q u e s u s e x tre m o s p u e d e n s e r e s c a lo n a d o s ; p o r lo ta n to , e s p o s ib le q u e n o to d o s lo s n u c le ó tid o s d e n tro d e u n a m o lé c u la d e p o lin u c le ó t id o d e d o b le h e b ra e s té n e m p a re ja d o s . T a le s e x tre m o s n o p a re a d o s , en g e n e ra l, n o s u p e ra rá n lo s 20 n u c le ó tid o s d e lo n g itu d .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , " s im ilitu d " e n tre d o s p ro te ín a s o á c id o s n u c le ic o s s e re f ie re a la re la c ió n e n tre la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la s p ro te ín a s o la s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s d e lo s á c id o s n u c le ic o s . La s im ilitu d s e p u e d e b a s a r en e l g ra d o d e id e n t id a d y /u h o m o lo g ía d e la s s e c u e n c ia s d e re s id u o s y en lo s re s id u o s q u e c o n tie n e . L o s e x p e r to s en la té c n ic a c o n o c e n m é to d o s p a ra e v a lu a r e l g ra d o d e s im ilitu d e n tre p ro te ín a s o á c id o s n u c le ic o s . P o r e je m p lo , en un m é to d o p a ra e v a lu a r la s im ilitu d d e s e c u e n c ia s , d o s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s o n u c le ó tid o s s e a lin e a n d e u n a m a n e ra q u e p ro d u c e un n iv e l m á x im o d e id e n t id a d e n tre la s s e c u e n c ia s . " Id e n t id a d " s e re f ie re a la m e d id a en q u e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s o n u c le ó tid o s s o n in v a r ia b le s . E l a lin e a m ie n to d e la s s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s y, en c ie r ta m e d id a , la s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s , ta m b ié n p u e d e n te n e r en c u e n ta la s d ife re n c ia s c o n s e rv a t iv a s y /o la s s u s t itu c io n e s fre c u e n te s en lo s a m in o á c id o s (o n u c le ó tid o s ) . L a s d ife re n c ia s c o n s e rv a t iv a s so n a q u e lla s q u e p re s e rv a n la s p ro p ie d a d e s f ís ic o -q u ím ic a s d e lo s re s id u o s im p lic a d o s . L o s a l in e a m ie n to s p u e d e n s e r g lo b a le s (a l in e a m ie n to d e la s s e c u e n c ia s c o m p a ra d a s en to d a la lo n g itu d d e la s s e c u e n c ia s e in c lu y e n d o to d o s lo s re s id u o s ) o lo c a le s (e l a lin e a m ie n to d e u n a p a rte d e la s s e c u e n c ia s q u e in c lu y e s o lo la re g ió n o re g io n e s m á s s im ila re s ) .
L a " id e n t id a d " p e r s e t ie n e un s ig n if ic a d o re c o n o c id o en la té c n ic a y s e p u e d e c a lc u la r u t i l iz a n d o m e c a n is m o s p u b lic a d o s . (V é a s e , p. e j., C o m p u ta t io n a l M o le c u la r B io lo g y , L e sk , A .M ., ed ., O x fo rd U n iv e rs ity P re s s , N u e v a Y o rk , 1988 ; B io c o m p u tin g : In fo rm a t ic s a n d G e n o m e P ro je c ts , S m ith , D .W ., ed ., A c a d e m ic P re s s , N u e v a Y o rk , 1993 ; C o m p u te r A n a ly s is o f S e q u e n c e D a ta , P a r te I, G r if fin , A .M ., y G r if f in , H .G ., e d s ., H u m a n a P re s s , N u e v a J e rs e y , 1994 ; S e q u e n c e A n a ly s is in M o le c u la r B io lo g y , v o n H e in je , G ., A c a d e m ic P re s s , 1987 ; y S e q u e n c e A n a ly s is P r im e r, G r ib s k o v , M . y D e v e re u x , J ., e d s ., M S to c k to n P re s s , N u e v a Y o rk , 1991 ). S i b ie n e x is te n n u m e ro s o s m é to d o s p a ra m e d ir la id e n t id a d e n tre d o s p o lin u c le ó t id o s o p o lip é p tid o s , e l té rm in o " id e n t id a d " e s b ie n c o n o c id o p o r lo s e x p e rto s en la té c n ic a (C a rr il lo , H. & L ip m a n , D ., S IA M J A p p lie d M a th 48 : 1073 (1988 )).
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , h o m ó lo g o (c o n re s p e c to a la s s e c u e n c ia s d e á c id o n u c le ic o y /o a m in o á c id o ) s ig n if ic a u n a h o m o lo g ía d e s e c u e n c ia m a y o r o ig u a l a 25 % , t íp ic a m e n te m a y o r o ig u a l a 25 % , 40 % , 50 % , 60 % , 70 % , 80 % , 85 % , 90 % o 95 % d e h o m o lo g ía d e s e c u e n c ia ; e l p o rc e n ta je p re c is o s e p u e d e e s p e c if ic a r si e s n e c e s a r io . P a ra lo s f in e s d e la p re s e n te m e m o r ia , lo s té rm in o s "h o m o lo g ía " e " id e n t id a d " a m e n u d o s e u t iliz a n d e m a n e ra in d is t in ta , a m e n o s q u e s e in d iq u e lo c o n tra r io . E n g e n e ra l, p a ra la d e te rm in a c ió n d e l p o rc e n ta je d e h o m o lo g ía o id e n tid a d , la s s e c u e n c ia s s e a lin e a n d e m o d o q u e s e o b te n g a la m a y o r c o in c id e n c ia d e o rd e n (v é a s e , p .e j.: C o m p u ta t io n a l M o le c u la r B io lo g y , L e sk , A .M ., ed ., O x fo rd U n iv e rs ity P re s s , N u e v a Y o rk , 1988 ; B io c o m p u tin g : In fo rm a t ic s a n d G e n o m e P ro je c ts , S m ith , D .W ., e d ., A c a d e m ic P re s s , N u e v a Y o rk , 1993 ; C o m p u te r A n a ly s is o f S e q u e n c e D a ta , P a re t I, G r if fin , A .M ., y G r if fin , H .G ., e d s ., H u m a n a P re s s , N u e v a J e rs e y , 1994 ; S e q u e n c e A n a ly s is in M o le c u la r B io lo g y , v o n H e in je , G ., A c a d e m ic P re s s , 1987 ; y S e q u e n c e A n a ly s is P r im e r, G r ib s k o v , M . y D e v e re u x , J ., e d s ., M S to c k to n P re s s , N u e v a Y o rk , 1991 ; C a r r il lo e t a l. (1988 ) S IA M J A p p lie d M a th 48 :1073 ) . P o r h o m o lo g ía d e s e c u e n c ia , e l n ú m e ro d e a m in o á c id o s c o n s e rv a d o s s e d e te rm in a m e d ia n te p ro g ra m a s d e a lg o r itm o s d e a lin e a m ie n to c o n v e n c io n a le s , y s e p u e d e u t i l iz a r c o n la s p e n a liz a c io n e s p o r h u e c o p re d e te rm in a d a s e s ta b le c id a s p o r c a d a p ro v e e d o r. L a s m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o s u b s ta n c ia lm e n te h o m ó lo g a s s e h ib r id a rá n t íp ic a m e n te a u n a r ig u ro s id a d m o d e ra d a o a u n a a lta r ig u ro s id a d a lo la rg o d e la lo n g itu d d e l á c id o n u c le ic o d e in te ré s . T a m b ié n se c o n te m p la n m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o q u e c o n t ie n e n c o d o n e s d e g e n e ra d o s en lu g a r d e c o d o n e s en la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o d e h ib r id a c ió n .
S i d o s m o lé c u la s t ie n e n s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s o s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s q u e s o n a l m e n o s 60 % , 70 % , 80 % , 85 % , 90 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % " id é n t ic a s " u " h o m ó lo g a s " s e p u e d e d e te rm in a r u t i l iz a n d o a lg o r itm o s in fo rm á t ic o s c o n o c id o s , c o m o el p ro g ra m a " F A S T A ", u t iliz a n d o , p o r e je m p lo , lo s p a rá m e tro s p re d e te rm in a d o s c o m o en P e a rs o n e t a l. (1988 ) P ro c . N a tl A c a d S c i. U S A 85 :2444 (o tro s p ro g ra m a s in c lu y e n e l p a q u e te d e p ro g ra m a s G C G (D e v e re u x , J ., e t a l., N u c le ic A c id s R e s e a rc h 12 (I) :387 (1984 )), B L A S T P , B L A S T N , F A S T A (A lts c h u l, S .F ., e t a l., J M o l B io l 215 :403 (1990 )) ; G u id e to H u g e C o m p u te rs , M a r t in J. B is h o p , e d ito r, A c a d e m ic P re s s , S a n D ie g o , 1994 y C a r r il lo e t al. (1988 ) S iA m J A p p lie d M a th 48 :1073 ) . P o r e je m p lo , s e p u e d e u t i l iz a r la fu n c ió n B L A S T d e la b a s e d e d a to s d e in fo rm a c ió n d e l C e n tro N a c io n a l d e B io te c n o lo g ía p a ra d e te rm in a r la id e n tid a d . O tro s p ro g ra m a s d is p o n ib le s c o m e rc ia l o p ú b lic a m e n te in c lu y e n e l p ro g ra m a "M e g A lig n " d e D N A S ta r (M a d is o n , W I) y e l p ro g ra m a "G a p " d e l U n iv e rs ity o f W is c o n s in G e n e t ic s C o m p u te r G ro u p (U W G ) (M a d is o n W I) . E l p o rc e n ta je d e h o m o lo g ía o id e n t id a d d e p ro te ín a s y /o m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o s e p u e d e d e te rm in a r , p o r e je m p lo , c o m p a ra n d o la in fo rm a c ió n d e s e c u e n c ia u t i l iz a n d o un p ro g ra m a d e in fo rm á t ic o G A P (p . e j., N e e d le m a n e t a l. (1970 ) J. M o l. B io l.
48 :443 , re v is a d o p o r S m ith y W a te rm a n ( (1981 ) A d v . A p p l. M a th . 2 : 482 ). B re v e m e n te , e l p ro g ra m a G a p d e f in e la s im ilitu d c o m o el n ú m e ro d e s ím b o lo s a lin e a d o s (e s d e c ir , n u c le ó tid o s o a m in o á c id o s ) , q u e s o n s im ila re s , d iv id id o p o r e l n ú m e ro to ta l d e s ím b o lo s en la m á s c o r ta d e la s d o s s e c u e n c ia s . L o s p a rá m e tro s p re d e te rm in a d o s p a ra el p ro g ra m a G A P p u e d e n in c lu ir : (1 ) u n a m a tr iz d e c o m p a ra c ió n u n a r ia (q u e c o n t ie n e un v a lo r d e 1 p a ra las id e n t id a d e s y d e 0 p a ra la s n o id e n t id a d e s ) y la m a tr iz d e c o m p a ra c ió n p o n d e ra d a d e G r ib s k o v e t a l. (1986 ) N u c l. A c id o s R e s . 14 :6745 , s e g ú n lo d e s c r ito p o r S c h w a r tz y D a y h o ff, e d s ., A T L A S O F P R O T E IN S E Q U E N c E A N D S T R U C T U R E , N a tio n a l B io m e d ic a l R e s e a rc h F o u n d a t io n , pá g . 353 -358 (1979 ); (2 ) u n a p e n a liz a c ió n d e 3 ,0 p o r c a d a h u e c o y u n a p e n a liz a c ió n a d ic io n a l d e 0 ,10 p o r c a d a s ím b o lo en c a d a h u e c o ; y (3 ) n o h a y p e n a liz a c ió n p a ra los h u e c o s f in a le s .
P o r lo ta n to , c o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , e l té rm in o " id e n t id a d " u " h o m o lo g ía " re p re s e n ta u n a c o m p a ra c ió n e n tre un p o lip é p tid o o p o lin u c le ó t id o d e p ru e b a y u n o d e re fe re n c ia . C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , e l té rm in o a l m e n o s "90 % id é n t ic o a " s e re f ie re a id e n t id a d e s p o rc e n tu a le s d e 90 a 99 ,99 c o n re s p e c to a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s o á c id o n u c le ic o d e re fe re n c ia d e l p o lip é p tid o . L a id e n t id a d a un n iv e l d e 90 % o m á s es in d ic a t iv a d e l h e c h o d e q u e , a s u m ie n d o c o n f in e s d e ilu s tra t iv o s , s e c o m p a ra n u n a lo n g itu d d e p o lip é p tid o d e p ru e b a y u n o d e re fe re n c ia d e 100 a m in o á c id o s . N o m á s d e 10 % (e s d e c ir , 10 d e 100 ) d e lo s a m in o á c id o s en e l p o lip é p tid o d e p ru e b a d if ie re d e l p o lip é p tid o d e re fe re n c ia . S e p u e d e n h a c e r c o m p a ra c io n e s s im ila re s e n tre lo s p o lin u c le ó t id o s d e p ru e b a y d e re fe re n c ia . T a le s d ife re n c ia s s e p u e d e n re p re s e n ta r c o m o m u ta c io n e s p u n tu a le s d is tr ib u id a s a l a z a r en to d a la lo n g itu d d e un p o lip é p tid o o s e p u e d e n a g ru p a r en u n a o m á s u b ic a c io n e s d e lo n g itu d v a r ia b le h a s ta el m á x im o p e rm it id o . p. e j., u n a d ife re n c ia d e a m in o á c id o s d e 10 /100 (a p ro x im a d a m e n te 90 % d e id e n t id a d ) . L a s d ife re n c ia s s e d e fin e n c o m o s u s titu c io n e s , in s e rc io n e s o d e le c io n e s d e á c id o s n u c le ic o s o a m in o á c id o s . A n iv e l d e h o m o lo g ía s o id e n t id a d e s p o r e n c im a d e a p ro x im a d a m e n te 85 -90 % , e l re s u lta d o d e b e s e r in d e p e n d ie n te de l p ro g ra m a y lo s p a rá m e tro s d e h u e c o e s ta b le c id o s ; e s to s a lto s n iv e le s d e id e n t id a d s e p u e d e n e v a lu a r fá c ilm e n te , a m e n u d o m e d ia n te a lin e a c ió n m a n u a l s in d e p e n d e r d e l s o p o rte ló g ic o .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a s e c u e n c ia a lin e a d a s e re f ie re a l u s o d e h o m o lo g ía (s im il itu d y /o id e n t id a d ) p a ra a lin e a r la s p o s ic io n e s c o r re s p o n d ie n te s en u n a s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s o a m in o á c id o s . T íp ic a m e n te , d o s o m á s s e c u e n c ia s q u e e s tá n re la c io n a d a s p o r u n a id e n t id a d d e 50 % o m á s e s tá n a lin e a d a s . U n c o n ju n to a lin e a d o d e s e c u e n c ia s s e re f ie re a 2 o m á s s e c u e n c ia s q u e e s tá n a lin e a d a s en la s p o s ic io n e s c o r re s p o n d ie n te s y p u e d e n in c lu ir s e c u e n c ia s d e a lin e a m ie n to d e r iv a d a s d e A R N , ta le s c o m o la s E S T y o tro s A D N c , a lin e a d a s co n la s e c u e n c ia d e A D N g e n ó m ic o .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "c e b a d o r " s e re f ie re a u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o q u e p u e d e a c tu a r c o m o un p u n to d e in ic io d e la s ín te s is d e A D N d ir ig id a p o r un m o ld e en c o n d ic io n e s a p ro p ia d a s (p. e j., en p re s e n c ia d e c u a tro n u c le ó s id o s t r i fo s fa to d ife re n te s y un a g e n te d e p o lim e r iz a c ió n , ta l c o m o la A D N p o lim e ra s a , la A R N p o lim e ra s a o la t r a n s c r ip ta s a in v e rs a ) en un ta m p ó n a p ro p ia d o y a u n a te m p e ra tu ra a d e c u a d a . S e a p re c ia rá q u e c ie r ta s m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o p u e d e n s e rv ir c o m o u n a "s o n d a " y c o m o un "c e b a d o r " . U n c e b a d o r , s in e m b a rg o , t ie n e un g ru p o h id ro x ilo 3 ' p a ra su e x te n s ió n . S e p u e d e u t i l iz a r un c e b a d o r en u n a v a r ie d a d d e m é to d o s , q u e in c lu y e n , p o r e je m p lo , re a c c ió n en c a d e n a d e la p o lim e ra s a (P C R ), t ra n s c r ip ta s a in v e rs a (R T )-P C R , A R N P C R , L C R , P C R m u ltip le x , P C R a n g o s ta , P C R d e c a p tu ra , P C R d e e x p re s ió n , R A C E 3 ' y 5 ', P C R in situ , P C R m e d ia d a p o r lig a c ió n y o tro s p ro to c o lo s d e a m p lif ic a c ió n .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , " p a r d e c e b a d o re s " s e re f ie re a un c o n ju n to d e c e b a d o re s q u e in c lu y e un c e b a d o r 5 ' (a g u a s a rr ib a ) q u e h ib r id a c o n e l e x tre m o 5 ' d e u n a s e c u e n c ia a a m p li f ic a r (p. e j., p o r P C R ) y un c e b a d o r 3 ' (a g u a s a b a jo ) q u e h ib r id a c o n e l c o m p le m e n to d e l e x tre m o 3 ' d e la s e c u e n c ia a a m p lif ic a r .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , " h ib r id a e s p e c íf ic a m e n te " s e re f ie re a la re a s o c ia c ió n , m e d ia n te el e m p a re ja m ie n to d e b a s e s c o m p le m e n ta r ia s , d e u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o (p. e j., un o l ig o n u c le ó t id o ) a u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o d ia n a . L o s e x p e r to s en la té c n ic a e s tá n fa m il ia r iz a d o s c o n lo s p a rá m e tro s in v itro e in v ivo q u e a fe c ta n la h ib r id a c ió n e s p e c íf ic a , ta le s c o m o la lo n g itu d y la c o m p o s ic ió n d e la m o lé c u la en p a rt ic u la r . L o s p a rá m e tro s p a r t ic u la rm e n te re le v a n te s p a ra la h ib r id a c ió n in v itro in c lu y e n a d e m á s la te m p e ra tu ra d e re a s o c ia c ió n y la v a d o , la c o m p o s ic ió n d e l ta m p ó n y la c o n c e n tra c ió n d e sa l. L a s c o n d ic io n e s d e la v a d o i lu s tra t iv a s p a ra e l im in a r las m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o u n id a s no e s p e c íf ic a m e n te a u n a a lta r ig u ro s id a d s o n 0.1 x S S P E , S D S al 0 ,1 % , 65 °C , y a u n a r ig u ro s id a d m e d ia s o n 0 ,2 x S S P E , S D S a l 0 ,1 % , 50 °C . L a s c o n d ic io n e s d e r ig u ro s id a d e q u iv a le n te s so n c o n o c id a s en la té c n ic a . El e x p e rto en la té c n ic a p u e d e a ju s ta r fá c ilm e n te e s to s p a rá m e tro s p a ra lo g ra r la h ib r id a c ió n e s p e c íf ic a d e u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o c o n a u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o d ia n a a p ro p ia d a p a ra u n a a p lic a c ió n p a rt ic u la r . C o m p le m e n ta r io , c u a n d o s e re f ie re a d o s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s , s ig n if ic a q u e la s d o s s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s s o n c a p a c e s d e h ib r id a r , t íp ic a m e n te c o n m e n o s d e 25 % , 15 % o 5 % d e e m p a re ja m ie n to s e r ró n e o s e n tre n u c le ó tid o s o p u e s to s . S i e s n e c e s a r io , s e e s p e c if ic a rá e l p o rc e n ta je d e c o m p le m e n ta r ie d a d . N o rm a lm e n te , la s d o s m o lé c u la s s e s e le c c io n a n d e m o d o q u e h ib r id e n en c o n d ic io n e s d e a lta r ig u ro s id a d .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , s u s ta n c ia lm e n te id é n t ic o a un p ro d u c to s ig n if ic a s u f ic ie n te m e n te s im ila r , d e m o d o q u e la p ro p ie d a d d e in te ré s p e rm a n e z c a s u f ic ie n te m e n te in a lte ra d a c o m o p a ra q u e s e p u e d a u t i l iz a r el p ro d u c to s u s ta n c ia lm e n te id é n t ic o en lu g a r d e l p ro d u c to .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , ta m b ié n s e e n t ie n d e q u e lo s té rm in o s "s u s ta n c ia lm e n te id é n t ic o s " o " s im ila re s " v a r ía n c o n e l c o n te x to s e g ú n lo e n t ie n d e n lo s e x p e r to s en la té c n ic a re le v a n te .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a v a r ia n te a lé lic a o v a r ia c ió n a lé lic a h a c e re fe re n c ia a c u a lq u ie ra d e d o s o m á s fo rm a s a lte rn a t iv a s d e un g e n q u e o c u p a n el m is m o lo c u s c ro m o s ó m ic o . L a v a r ia c ió n a lé lic a s u rg e n a tu ra lm e n te a t ra v é s d e la m u ta c ió n , y p u e d e d a r c o m o re s u lta d o un p o lim o r f is m o fe n o t íp ic o d e n tro d e la s p o b la c io n e s . L a s m u ta c io n e s g e n é t ic a s p u e d e n s e r s i le n c io s a s (s in c a m b io s en e l p o lip é p tid o c o d if ic a d o ) o p u e d e n c o d if ic a r p o lip é p tid o s q u e t ie n e n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s a lte ra d a . E l té rm in o " v a r ia n te a lé lic a " ta m b ié n se u t iliz a en la p re s e n te m e m o r ia p a ra d e n o ta r u n a p ro te ín a c o d if ic a d a p o r u n a v a r ia n te a lé lic a d e un g en . N o rm a lm e n te , la fo rm a d e re fe re n c ia d e l g e n c o d if ic a u n a fo rm a d e t ip o s a lv a je y /o u n a fo rm a p re d o m in a n te d e un p o lip é p tid o d e u n a p o b la c ió n o un m ie m b ro d e re fe re n c ia ú n ic o d e u n a e s p e c ie . T íp ic a m e n te , la s v a r ia n te s a lé lic a s , q u e in c lu y e n v a r ia n te s e n tre la s e s p e c ie s , t ie n e n t íp ic a m e n te u n a id e n t id a d d e a m in o á c id o s d e a l m e n o s 80 % , 90 % o m á s co n u n a fo rm a d e t ip o s a lv a je y /o p re d o m in a n te d e la m is m a e s p e c ie ; e l g ra d o d e id e n t id a d d e p e n d e d e l g e n y d e s i la c o m p a ra c ió n e s in te re s p e c ie o in tra e s p e c ie . E n g e n e ra l, la s v a r ia n te s a lé lic a s in tra e s p e c ie t ie n e n a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te 80 % , 85 % , 90 % , 95 % o m á s d e id e n t id a d c o n u n a fo rm a d e t ip o s a lv a je y /o p re d o m in a n te , in c lu y e n d o 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o m á s d e id e n t id a d co n u n a fo rm a d e e s p e c ie d e t ip o s a lv a je y /o p re d o m in a n te d e un p o lip é p tid o . L a re fe re n c ia a u n a v a r ia n te a lé lic a en la p re s e n te m e m o r ia g e n e ra lm e n te s e re f ie re a v a r ia c io n e s en p ro te ín a s e n tre m ie m b ro s d e la m is m a e s p e c ie .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "a le lo " , q u e s e u t il iz a d e m a n e ra in d is t in ta en la p re s e n te m e m o r ia co n "v a r ia n te a lé lic a " , s e re f ie re a fo rm a s a lte rn a t iv a s d e un g e n o p o rc io n e s d e l m is m o . L o s a le lo s o c u p a n el m is m o lo c u s o p o s ic ió n en lo s c ro m o s o m a s h o m ó lo g o s . C u a n d o un s u je to t ie n e d o s a le lo s id é n t ic o s d e un g e n , s e d ic e q u e e l s u je to e s h o m o c ig o to p a ra e s e g e n o a le lo . C u a n d o un s u je to t ie n e d o s a le lo s d ife re n te s d e un g e n , s e d ic e q u e el s u je to e s h e te ro c ig o to p a ra e l g e n . L o s a le lo s d e un g e n e s p e c íf ic o p u e d e n d ife r ir e n tre s í en un s o lo n u c le ó tid o o en v a r io s n u c le ó tid o s , y p u e d e n in c lu ir m o d if ic a c io n e s ta le s c o m o s u s titu c io n e s , d e le c io n e s e in s e rc io n e s d e n u c le ó tid o s . U n a le lo d e un g e n ta m b ié n p u e d e s e r u n a fo rm a d e un g e n q u e c o n t ie n e u n a m u ta c ió n .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , la s v a r ia n te s d e e s p e c ie s e re f ie re n a v a r ia n te s en p o lip é p tid o s e n tre d ife re n te s e s p e c ie s , in c lu y e n d o d ife re n te s e s p e c ie s d e m a m ífe ro s , ta le s c o m o ra tó n y s e r h u m a n o . P o r e je m p lo , p a ra P H 20 , la s v a r ia n te s d e e s p e c ie i lu s t ra t iv a s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia so n P H 20 d e p r im a te , ta le s c o m o , p e ro no lim ita d o s a, s e r h u m a n o , c h im p a n c é , m a c a c o y m o n o c in o m o lg o . E n g e n e ra l, la s v a r ia n te s d e e s p e c ie t ie n e n 70 % , 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o m á s d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia . L o s re s id u o s c o r re s p o n d ie n te s e n tre la s v a r ia n te s d e e s p e c ie s e p u e d e n d e te rm in a r c o m p a ra n d o y a lin e a n d o s e c u e n c ia s p a ra m a x im iz a r e l n ú m e ro d e n u c le ó tid o s o re s id u o s c o in c id e n te s , p o r e je m p lo , d e m o d o q u e la id e n tid a d e n tre la s s e c u e n c ia s s e a ig u a l o s u p e r io r a 95 % , ig u a l o s u p e r io r a 96 % , ig u a l o s u p e r io r a 97 % , ig u a l o s u p e r io r a 98 % , o ig u a l o s u p e r io r a 99 % . A la p o s ic ió n d e in te ré s s e le p ro p o rc io n a e l n ú m e ro a s ig n a d o en la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o d e re fe re n c ia . E l a lin e a m ie n to s e p u e d e e fe c tu a r d e fo rm a m a n u a l o a s im p le v is ta , en p a rt ic u la r , d o n d e la id e n tid a d d e s e c u e n c ia e s m a y o r d e 80 % .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a p ro te ín a h u m a n a e s u n a c o d if ic a d a p o r u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o , c o m o A D N , p re s e n te en e l g e n o m a d e un s e r h u m a n o , in c lu y e n d o to d a s la s v a r ia n te s a lé lic a s y s u s v a r ia c io n e s c o n s e rv a t iv a s . U n a v a r ia n te o m o d if ic a c ió n d e u n a p ro te ín a e s u n a p ro te ín a h u m a n a si la m o d if ic a c ió n s e b a s a en la s e c u e n c ia d e t ip o s a lv a je o p ro m in e n te d e u n a p ro te ín a h u m a n a .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a v a r ia n te d e c o r te y e m p a lm e s e re f ie re a u n a v a r ia n te p ro d u c id a p o r e l p ro c e s a m ie n to d ife re n c ia l d e un t ra n s c r ito p r im a r io d e A D N g e n ó m ic o q u e d a c o m o re s u lta d o m á s d e un t ip o d e A R N m .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , la m o d if ic a c ió n s e re f ie re a la m o d if ic a c ió n d e u n a s e c u e n c ia d e aminoácidos de un polipéptido o una secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico e incluye deleciones, inserciones y reemplazos (p. ej., sustituciones) de aminoácidos y nucleótidos, respectivamente. Las modificaciones ilustrativas son sustituciones de aminoácidos. Un polipéptido sustituido con un aminoácido puede mostrar 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más de identidad de secuencia con un polipéptido que no contiene las sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservativas o no conservativas. En general, cualquier modificación de un polipéptido conserva una actividad del polipéptido. Los métodos para modificar un polipéptido son rutinarios para los expertos en la técnica, tales como el uso de metodologías de ADN recombinante.
Como se emplea en la presente memoria, las sustituciones conservativas adecuadas de aminoácidos son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden realizar generalmente sin alterar la actividad biológica de la molécula resultante. Los expertos en la técnica reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, p. ej., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., pág. 224). Tales sustituciones se pueden realizar de acuerdo con las establecidas en la Tabla 2 de la siguiente manera:
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Otras sustituciones también son permisibles y se pueden determinar empíricamente o de acuerdo con sustituciones conservativas conocidas.
Como se emplea en la presente memoria, el término promotor significa una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras se encuentran comúnmente, pero no siempre, en la región 5' no codificante de los genes.
Como se emplea en la presente memoria, el polipéptido o proteína aislados o purificados o su porción biológicamente activa están sustancialmente libres de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o tejido del cual se obtiene la proteína, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. Se puede determinar que las preparaciones están sustancialmente libres si parecen libres de impurezas fácilmente detectables según lo determinado por los métodos convencionales de análisis, tales como la cromatografía en capa fina (TLC), la electroforesis en gel y la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), utilizadas por los expertos en La técnica para evaluar dicha pureza, o suficientemente pura para que una purificación adicional no altere de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como las actividades enzimáticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la técnica conocen métodos para la purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente químicamente puros. Sin embargo, un compuesto sustancialmente químicamente puro puede ser una mezcla de estereoisómeros. En tales casos, una purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.
Por lo tanto, la referencia a un polipéptido sustancialmente purificado, tal como una PH20 soluble sustancialmente purificada, se refiere a preparaciones de proteínas que están sustancialmente libres de material celular e incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las que se aísla o produce de forma recombinante. En una realización, el término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteínas no enzimáticas (también denominadas en la presente memoria proteína contaminante), generalmente menos de aproximadamente 20% de proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menos de aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce de forma recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de, o aproximadamente menos de 20%, 10% o 5% del volumen de la preparación de proteína enzimática. Como se emplea en la presente memoria, el término sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las que la proteína se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis de la proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco), 20%, 10%, 5% o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no enzimáticos.
Como se emplea en la presente memoria, sintético, con referencia, por ejemplo, a una molécula de ácido nucleico sintética o un gen sintético o un péptido sintético se refiere a una molécula de ácido nucleico o molécula polipeptídica que se producen por métodos recombinantes y/o por métodos de síntesis química.
Como se emplea en la presente memoria, la producción por medios recombinantes o utilizando métodos de ADN recombinante significa el uso de métodos bien conocidos de la biología molecular para expresar proteínas codificadas por ADN clonado.
Como se emplea en la presente memoria, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para la expresión o la replicación de los mismos. Los vectores típicamente siguen siendo episómicos, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o una porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan los vectores que son cromosomas artificiales, tales como los cromosomas artificiales de levadura y los cromosomas artificiales de mamífero. La selección y el uso de tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Como se emplea en la presente memoria, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente a secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de tales fragmentos de ADN. Tales segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador y una señal de poliadenilación. Los vectores de expresión generalmente derivan de plásmidos o ADN viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, un virus recombinante u otro vector que, al introducirse en una célula anfitriona apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que son replicables en células eucariotas y/o células procariotas y aquellos que siguen siendo episómicos o aquellos que se integran en el genoma de la célula anfitriona.
Como se emplea en la presente memoria, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales". Los vectores virales son virus diseñados que están ligados operativamente a genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a las células.
Como se emplea en la presente memoria, "operablemente" o "ligado operativamente" cuando se refiere a segmentos de ADN significa que los segmentos están dispuestos de modo que funcionen en concierto para sus fines previstos, p. ej., la transcripción se inicia aguas abajo del promotor y aguas arriba de cualquier secuencia transcrita. El promotor suele ser el dominio al que se une la maquinaria transcripcional para iniciar la transcripción y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "evaluar" incluya la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de una proteína, tal como una enzima, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, valor visual u otro valor indicativos del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la especie química realmente detectada no necesita, por supuesto, ser el propio producto escindido enzimáticamente, sino que p u e d e se r, p o r e je m p lo , un d e r iv a d o d e l m is m o o a lg u n a o tra s u s ta n c ia . P o r e je m p lo , la d e te c c ió n d e un p ro d u c to d e e s c is ió n p u e d e s e r un ra d ic a l d e te c ta b le ta l c o m o un ra d ic a l f lu o re s c e n te .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , la a c t iv id a d b io ló g ic a s e re f ie re a la s a c t iv id a d e s in v ivo d e un c o m p u e s to o re s p u e s ta s f is io ló g ic a s q u e s e p ro d u c e n t ra s la a d m in is tra c ió n in v ivo d e un c o m p u e s to , c o m p o s ic ió n u o tra m e z c la . L a a c t iv id a d b io ló g ic a , p o r lo ta n to , a b a rc a lo s e fe c to s te ra p é u t ic o s y la a c t iv id a d fa rm a c é u tic a d e ta le s c o m p u e s to s , c o m p o s ic io n e s y m e z c la s . L a s a c t iv id a d e s b io ló g ic a s s e p u e d e n o b s e rv a r en s is te m a s in v itro d is e ñ a d o s p a ra s o m e te r a p ru e b a o u t i l iz a r ta le s a c t iv id a d e s . P o r lo ta n to , p a ra lo s p ro p ó s ito s en la p re s e n te m e m o r ia , la a c t iv id a d b io ló g ic a d e u n a e n z im a h ia lu ro n id a s a e s su d e g ra d a c ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o . L a a c t iv id a d b io ló g ic a d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p u e d e in c lu ir , p e ro n o s e lim ita a, la u n ió n d e u n a p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , la a c t iv id a d in h ib id o ra o e s t im u la d o ra d e la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , la in d u c c ió n d e u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia a u m e n ta d a y /o la in d u c c ió n d e u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e s p e c íf ic a d e un tu m o r .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia e q u iv a le n te , c u a n d o s e h a c e re fe re n c ia a d o s s e c u e n c ia s d e á c id o s n u c le ic o s , s ig n if ic a q u e la s d o s s e c u e n c ia s en c u e s t ió n c o d if ic a n la m is m a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s o p ro te ín a s e q u iv a le n te s . C u a n d o s e u t iliz a e q u iv a le n te p a ra re fe r irs e a d o s p ro te ín a s o p é p tid o s , s ig n if ic a q u e la s d o s p ro te ín a s o p é p tid o s t ie n e n s u s ta n c ia lm e n te la m is m a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s c o n s o lo s u s t itu c io n e s d e a m in o á c id o s q u e n o a lte ra n s u s ta n c ia lm e n te la a c t iv id a d o fu n c ió n d e la p ro te ín a o e l p é p tid o . C u a n d o el e q u iv a le n te s e re f ie re a u n a p ro p ie d a d , n o e s n e c e s a r io q u e la p ro p ie d a d e s té p re s e n te e n la m is m a m e d id a (p . e j., d o s p é p tid o s p u e d e n m o s tra r d ife re n te s ta s a s d e l m is m o t ip o d e a c t iv id a d e n z im á t ic a ) , p e ro la s a c t iv id a d e s s o n g e n e ra lm e n te s u s ta n c ia lm e n te la s m is m a s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "m o d u la r" y "m o d u la c ió n " o "a lte ra r " s e re f ie re n a un c a m b io d e u n a a c t iv id a d d e u n a m o lé c u la , ta l c o m o u n a p ro te ín a . L a s a c t iv id a d e s i lu s tra t iv a s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, a c t iv id a d e s b io ló g ic a s , ta le s c o m o la t ra n s d u c c ió n d e s e ñ a le s . L a m o d u la c ió n p u e d e in c lu ir un a u m e n to d e la a c t iv id a d (e s d e c ir , re g u la c ió n p o r a u m e n to o a c t iv id a d a g o n is ta ) , u n a d is m in u c ió n d e la a c t iv id a d (e s d e c ir, re g u la c ió n p o r d is m in u c ió n o in h ib ic ió n ) o c u a lq u ie r o tra a lte ra c ió n en u n a a c t iv id a d ( ta l c o m o un c a m b io en la p e r io d ic id a d , fre c u e n c ia , d u ra c ió n , c in é t ic a u o tro p a rá m e tro ) . L a m o d u la c ió n p u e d e d e p e n d e r d e l c o n te x to y, p o r lo g e n e ra l, la m o d u la c ió n s e c o m p a ra c o n un e s ta d o d e s ig n a d o , p o r e je m p lo , la p ro te ín a d e t ip o s a lv a je , la p ro te ín a en un e s ta d o c o n s t itu t iv o o la p ro te ín a e x p re s a d a en un t ip o o c o n d ic ió n c e lu la re s d e s ig n a d o s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , la a d m in is tra c ió n d ire c ta s e re f ie re a u n a c o m p o s ic ió n q u e s e a d m in is tra s in d ilu c ió n .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a fo rm u la c ió n d e d o s is ú n ic a s e re f ie re a u n a fo rm u la c ió n p a ra u s o d e u n a s o la v e z . T íp ic a m e n te , u n a fo rm u la c ió n d e d o s is ú n ic a e s p a ra a d m in is tra c ió n d ire c ta .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a fo rm u la c ió n d e d o s if ic a c ió n m ú lt ip le s e re f ie re a u n a fo rm u la c ió n p a ra su u so en a d m in is t ra c io n e s re p e tid a s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a c o m p o s ic ió n s e re f ie re a c u a lq u ie r m e z c la . P u e d e s e r u n a s o lu c ió n , s u s p e n s ió n , líq u id o , p o lvo , p a s ta , a c u o s a , n o a c u o s a o c u a lq u ie r c o m b in a c ió n d e lo s m is m o s .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , u n a c o m b in a c ió n s e re f ie re a c u a lq u ie r a s o c ia c ió n e n tre d o s o m á s e le m e n to s . L a c o m b in a c ió n p u e d e s e r d o s o m á s e le m e n to s s e p a ra d o s , ta le s c o m o d o s c o m p o s ic io n e s o d o s c o le c c io n e s , p u e d e s e r u n a m e z c la d e lo s m is m o s , ta l c o m o u n a m e z c la ú n ic a d e lo s d o s o m á s e le m e n to s , o c u a lq u ie r v a r ia c ió n d e lo s m is m o s . L o s e le m e n to s d e u n a c o m b in a c ió n e s tá n g e n e ra lm e n te a s o c ia d o s o re la c io n a d o s fu n c io n a lm e n te .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "e n fe rm e d a d o t ra s to rn o " s e re f ie re a u n a c o n d ic ió n p a to ló g ic a en un o rg a n is m o re s u lta n te d e u n a c a u s a o a fe c c ió n q u e in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, in fe c c io n e s , a fe c c io n e s a d q u ir id a s , a fe c c io n e s g e n é t ic a s y c a ra c te r iz a d a s p o r s ín to m a s id e n t if ic a b le s . L a s e n fe rm e d a d e s y t r a s to rn o s d e in te ré s en la p re s e n te m e m o r ia s o n e n fe rm e d a d e s y t ra s to rn o s a s o c ia d o s c o n e l h ia lu ro n a n o .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , "a d m in is t ra c ió n in tra v e n o s a " s e re f ie re a l s u m in is tro d e un a g e n te te ra p é u t ic o d ire c ta m e n te en u n a v e n a .
C o m o s e e m p le a en la p re s e n te m e m o r ia , un " c á n c e r a s o c ia d o c o n h ia lu ro n a n o " o "c á n c e re s r ic o s en h ia lu ro n a n o " in c lu y e c á n c e re s en lo s q u e lo s n iv e le s d e h ia lu ro n a n o s e e le v a n c o m o c a u s a , c o n s e c u e n c ia o s e o b s e rv a n d e o tro m o d o en la e n fe rm e d a d o a fe c c ió n . L o s c á n c e re s o tu m o re s a s o c ia d o s c o n h ia lu ro n a n o s e a s o c ia n c o n n iv e le s e le v a d o s d e h ia lu ro n a n o en un te j id o o c é lu la , a u m e n to d e la p re s ió n d e l líq u id o in te rs t ic ia l, d is m in u c ió n d e l v o lu m e n v a s c u la r y /o a u m e n to d e l c o n te n id o d e a g u a en un te jid o . T a le s c á n c e re s in c lu y e n , p o r e je m p lo , tu m o re s , q u e in c lu y e n tu m o re s s ó lid o s ta le s c o m o c á n c e re s d e e s ta d io ta rd ío , c á n c e re s m e ta s tá s ic o s , c á n c e re s in d ife re n c ia d o s , cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon y otros tipos de cáncer. Como se emplea en la presente memoria, hialuronano (HA; también conocido como ácido hialurónico o hialuronato) se refiere a un polímero natural de unidades de disacáridos repetidas de N-acetilglucosamina y ácido D-glucurónico. El hialuronano es producido por ciertos tumores.
Como se emplea en la presente memoria, los niveles elevados de hialuronano se refieren a cantidades de hialuronano en un tejido, líquido corporal o célula particulares, dependiendo de la enfermedad o afección, consecuencia u observadas de otra manera en la enfermedad. Por ejemplo, como consecuencia de la presencia de un tumor rico en hialuronano, los niveles de hialuronano (HA) se pueden elevar en los fluidos corporales, tales como la sangre, la orina, la saliva y el suero, y/o en el tejido o la célula tumoral. El nivel se puede comparar con un patrón u control adecuado, tal como una muestra comparable de un sujeto que no tiene la enfermedad asociada con Ha . Como se emplea en la presente memoria, una puntuación de HA se refiere a una puntuación semicuantitativa de los niveles de positividad de HA en miembros celulares y estroma de tumores. La puntuación se puede determinar mediante la detección de HA en tejido tumoral, tal como tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina, mediante métodos de histoquímica, tales como inmunohistoquímica o pseudoinmunohistoquímica, para HA utilizando una proteína de unión a hialuronano (HABP), (también referida a como hialadherinas). El grado de tinción en las células y el estroma se puede determinar visualmente con un microscopio o mediante programas y soportes lógicos de algoritmos informáticos disponibles. Por ejemplo, las imágenes se pueden analizar cuantitativamente utilizando un algoritmo de recuento de píxeles para la tinción de HA (p. ej., Aperio Spectrum Software y otros métodos convencionales que miden o cuantifican o semi-cuantifican el grado de tinción). En tal ejemplo, se puede calcular y puntuar una razón de tinción positiva fuerte (tal como la tinción de color marrón) con respecto a la suma del área total teñida, donde si la razón es más de 25% de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total, se puntúa el tejido tumoral como HA+3, si la razón es de 10-25% de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total, el tejido del tumor se califica como HA+2, si la razón es inferior a 10% de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total, el tejido del tumor se califica como HA+1, y si la 'razón de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total es 0, el tejido tumoral se califica como 0. El método de Aperio, así como el soporte lógico correspondiente, son conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 8.023.714; la Patente de Estados Unidos Núm. 7.257.268). Un tumor se clasifica o puntúa como HAAlto (HA+3) a una fuerte tinción de HA por encima de 25% de la sección del tumor; como HAM°derad° (Ha 2) a fuerte tinción de HA entre 10 y 25% de la sección del tumor; y como HABaj°(HA+1) a una fuerte tinción de HA en 10% de la sección del tumor.
Como se emplea en la presente memoria, "HA moderado" con referencia a la cantidad o nivel de HA en una muestra de tejido o fluido corporal se refiere al grado o la extensión de HA en la muestra de tejido o fluido corporal en comparación con una muestra de tejido o fluido corporal normal o sano muestra. La cantidad de HA es moderada si la cantidad es aproximadamente 1,3 a 2 veces o mayor que la cantidad o nivel de HA en un tejido normal, de control o sano correspondiente. Se entiende que la cantidad de HA se puede determinar y cuantificar o semicuantificar utilizando métodos tales como ensayos de unión en fase sólida o histoquímica. Por ejemplo, la cantidad se puede basar en la comparación de los niveles plasmáticos o en la comparación de la intensidad de la tinción (p. ej., porcentaje de píxeles positivos) según lo determinado por la histoquímica. Por ejemplo, existe un HA moderado si la puntuación de HA por histoquímica u otro método es HA+2 y/o si hay tinción de HA por encima de 10-25% de la sección del tumor. Por ejemplo, existe un HA moderado si existe una razón de tinción positiva fuerte (tal como tinción de color marrón) con respecto a la suma del área total teñida que es más de 25% de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total del tejido tumoral.
Como se emplea en la presente memoria, "HA alto" con referencia a la cantidad o nivel de HA en una muestra de tejido o fluido corporal se refiere al grado o extensión de HA en la muestra de tejido o fluido corporal en comparación con una muestra de tejido o fluido corporal normal o sano. La cantidad de HA es alta si la cantidad es al menos o al menos aproximadamente 2,5 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 pliegue, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces o más la cantidad o el nivel de HA en un tejido normal, de control o sano correspondiente. Se entiende que la cantidad de HA se puede determinar y cuantificar o semicuantificar utilizando métodos tales como ensayos de unión en fase sólida o histoquímica. Por ejemplo, la cantidad se puede basar en la comparación de los niveles plasmáticos o la comparación de la intensidad de la tinción (p. ej., porcentaje de píxeles positivos) según lo determinado por la histoquímica. Por ejemplo, existe un HA alto si la puntuación de HA por histoquímica u otro método es HA+3 y/o si hay tinción de HA de más de 25% de la sección del tumor. Por ejemplo, existe un HA alto si hay una razón de tinción fuerte (tal como tinción de color marrón) con respecto a la suma del área total teñida que es más de 25% de tinción positiva fuerte con respecto a la tinción total del tejido tumoral.
Como se emplea en la presente memoria, una "proteína de unión a hialuronano" (proteína de unión a HA, HABP o hialadherina) se refiere a cualquier proteína que se une específicamente a HA para permitir la detección de1HA. La afinidad de unión es aquella que tiene como constante de asociación una Ka que es al menos aproximadamente o es al menos 107 M-1. La proteína de unión a HA puede ser una proteína producida de forma recombinante o sintética, o puede ser una proteína derivada de una fuente biológica o fuente fisiológica, tal como el cartílago. Las proteínas de unión a HA incluyen dominios de unión a HA, que incluyen módulos de enlace que se unen a HA y porciones suficientes de los mismos que se unen específicamente a HA para permitir su detección. Por lo tanto, las HABP incluyen cualquier proteína que contenga una región o dominio de unión a hialuronano o una porción suficiente de los mismos para unirse específicamente a HA. Las regiones de unión a hialuronano ilustrativas son módulos de enlace (dominios de enlace) o dominios G1. Una porción suficiente incluye al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o más aminoácidos contiguos de un dominio de unión o módulo de enlace adicional. Las proteínas de unión a HA también incluyen proteínas de fusión que contienen una proteína de unión a HA y uno o más polipéptidos adicionales, incluidos los dominios de multimerización. Las proteínas de unión a HA ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, agrecano, versicano, neurocano, brevicano, fosfacano, TSG-6, mutantes de TSG-6, tales como los proporcionados en la presente memoria, incluyendo polipéptidos que contienen dominios de unión a HA y módulos de enlace de los mismos que se unen a HA.
Como se emplea en la presente memoria, "dominio de unión a hialuronano" o "dominio de unión a HA" se refiere a una región o dominio de un polipéptido HABP que se une específicamente a hialuronano con una afinidad de unión que tiene una constante de asociación Ka que es al menos aproximadamente o es al menos 106 M-1 o 107 M-1 o mayor o una constante de disociación Kd que es menos que 10"6 M o 10"7 M o menos. Los dominios de unión a hialuronano ilustrativos incluyen, por ejemplo, módulos de enlace (también llamados dominios de enlace en la presente memoria) o dominios g 1, o porciones suficientes de un módulo de enlace o dominio G1 que se unen específicamente a HA.
Como se emplea en la presente memoria, "multímero" en referencia a una proteína de unión a hialuronano se refiere a una HABP que contiene múltiples sitios de unión a HA, por ejemplo, al menos 2, 3 o 4 sitios de unión a HA. Por ejemplo, un multímero de HABP se refiere a una HABP que contiene al menos 2 módulos de enlace que son capaces de unirse cada uno a HA. Por ejemplo, se puede generar un multímero ligando, directa o indirectamente, dos o más módulos de enlace (p. ej., módulo de enlace TSG-6). El enlace se puede facilitar utilizando un dominio de multimerización, como una proteína Fc.
Como se emplea en la presente memoria, un "dominio de multimerización" se refiere a una secuencia de aminoácidos que promueve una interacción estable de una molécula polipeptídica con otra molécula polipeptídica que contiene un dominio de multimerización complementario, que puede ser el mismo dominio de multimerización o uno diferente para formar un multímero estable con el primer dominio. En general, un polipéptido se une directa o indirectamente al dominio de multimerización. Los dominios de multimerización ilustrativos incluyen las secuencias de inmunoglobulina o porciones de las mismas, cremalleras de leucina, regiones hidrófobas, regiones hidrófilas, dominios de interacción proteína-proteína compatibles, tales como, pero no limitados a, una subunidad R de PKA y un dominio de anclaje (Ad ), un tiol libre que forma un enlace disulfuro intermolecular entre dos moléculas y una protuberancia en cavidad (es decir, botón en ojal) y una cavidad compensatoria de tamaño idéntico o similar que forma multímeros estables. El dominio de multimerización, por ejemplo, puede ser una región constante de inmunoglobulina. La secuencia de inmunoglobulina puede ser un dominio constante de inmunoglobulina, tal como el dominio Fc o porciones del mismo de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM.
Como se emplea en la presente memoria, "Fc" o "región Fc" o "dominio Fc" se refiere a un polipéptido que contiene la región constante de una cadena pesada de anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Por lo tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgE, o los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM. Opcionalmente, un dominio Fc puede incluir toda o parte de la bisagra flexible N-terminal con respecto a estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Un dominio Fc de IgG ilustrativo contiene los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3, y opcionalmente toda o parte de la bisagra entre Cy1 y Cy2. Los límites de la región Fc pueden variar, pero típicamente incluyen al menos parte de la región bisagra. Además, Fc también incluye cualquier variante alélica o de especie o cualquier variante o forma modificada, tal como cualquier variante o forma modificada que altera la unión a un FcR o altera una función efectora mediada por Fc. Se conocen secuencias ilustrativas de otros dominios Fc, incluyendo los dominios Fc modificados.
Como se emplea en la presente memoria, los niveles o valores normales se pueden definir de diversas maneras conocidas por los expertos en la técnica. Normalmente, los niveles normales se refieren a los niveles de expresión de un HA en una población sana. Los niveles normales (o niveles de referencia) se basan en mediciones de sujetos sanos, tal como a partir de una fuente específica (es decir, sangre, suero, tejido u otra fuente). A menudo, un nivel normal se especificará como un "intervalo normal", que generalmente se refiere al intervalo de valores de la mediana del 95% de la población sana. El valor de referencia se utiliza indistintamente en la presente memoria con el nivel normal, pero puede ser diferente de los niveles normales según los sujetos o la fuente. Los niveles de referencia suelen depender de los niveles normales de un segmento particular de la población. Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, un nivel normal o de referencia es un patrón o control predeterminado por medio del cual se puede comparar un paciente de prueba.
Como se emplea en la presente memoria, "nivel elevado" se refiere a cualquier nivel de cantidad o expresión de HA por encima de un umbral normal o citado.
Como se emplea en la presente memoria, "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra obtenida de una fuente viva o viral u otra fuente de macromoléculas y biomoléculas, e incluye cualquier tipo de célula o tejido de un sujeto del cual se puede obtener ácido nucleico o proteína u otra macromolécula. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra que se procesa. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados que se amplifican constituyen una muestra biológica. Las muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales, como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos de animales, incluidas muestras de biopsias de tumores.
Como se emplea en la presente memoria, "detección" incluye métodos que permiten la visualización (a simple vista o con un aparato) de una proteína. Una proteína se puede visualizar utilizando un anticuerpo específico de la proteína. La detección de una proteína también se puede facilitar mediante la fusión de una proteína con una etiqueta que incluye una etiqueta o marca epitópica.
Como se emplea en la presente memoria, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o afección significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o totalmente, o permanecen estáticos después del tratamiento. Por lo tanto, el tratamiento incluye profilaxis, terapia y/o cura. La profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o a la prevención del empeoramiento de los síntomas o la progresión de una enfermedad.
Como se emplea en la presente memoria, un "agente farmacéuticamente eficaz" incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, incluyendo, pero no limitados a, agentes quimioterapéuticos, anestésicos, vasoconstrictores, agentes dispersantes, fármacos terapéuticos convencionales, incluyendo fármacos de molécula pequeña y proteínas terapéuticas.
Como se emplea en la presente memoria, "tratamiento" significa cualquier manera en que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad u otra indicación, mejoran o se modifican de manera beneficiosa.
Como se emplea en la presente memoria, "efecto terapéutico" significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera, típicamente mejora o alivia los síntomas de una enfermedad o afección o que cura una enfermedad o afección. Una cantidad terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que da como resultado un efecto terapéutico tras la administración a un sujeto.
Como se emplea en la presente memoria, el término "sujeto" se refiere a un animal, incluyendo un mamífero, tal como un ser humano.
Como se emplea en la presente memoria, un "paciente" se refiere a un sujeto humano que presenta síntomas de una enfermedad o trastorno.
Como se emplea en la presente memoria, "aproximadamente lo mismo" significa dentro de una cantidad que un experto en la técnica consideraría que es la misma o está dentro de un intervalo aceptable de error. Por ejemplo, típicamente, para composiciones farmacéuticas, dentro de al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5% o 10% se considera aproximadamente lo mismo. Tal cantidad puede variar dependiendo de la tolerancia a la variación en la composición particular de los sujetos.
Como se emplea en la presente memoria, "régimen de dosificación" se refiere a la cantidad de agente, por ejemplo, la composición que contiene un agente anti-hialuronano, por ejemplo una hialuronidasa soluble u otro agente, administrado, y la frecuencia de administración. El régimen de dosificación es una función de la enfermedad o afección que se vaya a tratar, y por lo tanto puede variar.
Como se emplea en la presente memoria, la "frecuencia" de administración se refiere al tiempo entre administraciones sucesivas de tratamiento. Por ejemplo, la frecuencia puede ser de días, semanas o meses. Por ejemplo, la frecuencia puede ser más de una vez por semana, por ejemplo, dos veces por semana, tres veces por semana, cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana o diariamente. La frecuencia también puede ser de una, dos, tres o cuatro semanas. La frecuencia particular es una función de la enfermedad o afección particular tratada. Generalmente, la frecuencia es más de una vez por semana, y generalmente es dos veces por semana.
Como se emplea en la presente memoria, un "ciclo de administración" se refiere al programa repetido del régimen de dosificación de administración de la enzima y/o un segundo agente que se repite en administraciones sucesivas. Por ejemplo, un ciclo de administración ilustrativo es un ciclo de 28 días con administración dos veces por semana durante tres semanas, seguido de una semana de interrupción de la dosificación.
Como se emplea en la presente memoria, cuando se hace referencia a la dosificación basada en mg/kg del sujeto, se considera que un sujeto humano promedio tiene una masa de aproximadamente 70 kg a 75 kg, tal como 70 kg y un área de superficie corporal (ASC) de 1,73 m2
Como se emplea en la presente memoria, el alivio de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular mediante un tratamiento, tal como la administración de una composición farmacéutica u otro agente terapéutico, se refiere a cualquier disminución, ya sea permanente o temporal, duradera o transitoria, de los síntomas o, los efectos adversos de una afección, tal como, por ejemplo, la reducción de los efectos adversos asociados con, o que se producen tras, la administración de un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa PEGilada.
Como se emplea en la presente memoria, "prevención" o "profilaxis" se refiere a la reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad o afección.
Como se emplea en la presente memoria, una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "dosis terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Por lo tanto, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, aliviar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.
Como se emplea en la presente memoria, "forma de dosis unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empaquetadas individualmente como se conoce en la técnica.
Como se emplea en la presente memoria, una formulación de dosificación única se refiere a una formulación como una dosis única.
Como se emplea en la presente memoria, la formulación para administración directa significa que la composición no requiere dilución adicional para la administración.
Como se emplea en la presente memoria, un "artículo de manufactura" es un producto que se fabrica y se vende. Como se emplea a lo largo de esta solicitud, se pretende que el término abarque agentes anti-hialuronano, por ejemplo, enzima de degradación de hialuronano, tal como la hialuronidasa, y composiciones inhibidoras de puntos de control inmunitario contenidas en artículos empaquetados.
Como se emplea en la presente memoria, "fluido" se refiere a cualquier composición que pueda fluir. De este modo, los fluidos abarcan composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones similares.
Como se emplea en la presente memoria, un "kit" se refiere a una combinación de componentes, como una combinación de las composiciones de la presente memoria y otro elemento para un propósito que incluye, pero no se limita a, la reconstitución, activación y aparatos/dispositivos para el suministro, administración, diagnóstico, y valoración de una actividad o propiedad biológicas. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones de uso.
Como se emplea en la presente memoria, un extracto o producto lisado celular se refiere a una preparación o fracción que se elabora a partir de una célula lisada o alterada.
Como se emplea en la presente memoria, la sangre periférica es la sangre que se puede extraer de una vena y/o arteria. La recogida de sangre periférica puede ser distal o proximal a una región de interés, tal como un tumor. Como se emplea en la presente memoria, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no limitado a, primates, incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los humanos como animal contemplado. Las hialuronidasas proporcionadas en la presente memoria provienen de cualquier fuente, animal, vegetal, procariótica y fúngica. La mayoría de las hialuronidasas son de origen animal, incluyendo el origen de mamífero. Generalmente las hialuronidasas son de origen humano.
Como se emplea en la presente memoria, los tratamientos anti-cancerosos incluyen la administración de fármacos y otros agentes para tratar el cáncer, y también los protocolos de tratamiento, tales como la cirugía y la radiación. Los tratamientos anti-cancerosos incluyen la administración de agentes contra el cáncer.
Como se emplea en la presente memoria, un agente anti-canceroso se refiere a cualquier agente o compuesto utilizado en el tratamiento contra el cáncer. Estos incluyen cualquier agente, cuando se utilizan solos o combinados con otros compuestos, que pueden aliviar, reducir, mejorar, prevenir o colocar o mantener en un estado de remisión de síntomas clínicos o marcadores de diagnóstico asociados con tumores y cáncer, y se pueden utilizar en combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Los agentes anticancerosos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, enzimas de degradación de hialuronano, tales como las enzimas de degradación de hialuronano PEGiladas proporcionadas en la presente memoria utilizadas individualmente o combinadas con otros agentes anticancerosos, tales como agentes quimioterapéuticos, polipéptidos, anticuerpos, péptidos, pequeñas moléculas o vectores de terapia génica, virus o ADN.
Como se emplea en la presente memoria, un control se refiere a una muestra que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba o, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal que no esté afectado con la afección de interés. Un control también puede ser un control interno.
Como se emplea en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", "uno" y "el" y "la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a un compuesto que comprende o contiene "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.
Como se emplea en la presente memoria, los intervalos y las cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto, "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases".
Como se emplea en la presente memoria, "opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia que se describe posteriormente ocurre o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o circunstancia ocurre y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo no está sustituido o está sustituido.
Como se emplea en la presente memoria, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos, están, a menos que se indique lo contrario, de acuerdo con su uso común, abreviaturas reconocidas, o la Comisión IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochem. 11:1726).
B. Terapia combinada de inhibidor de puntos de control inmunitario y enzimas de degradación de hialuronano
En la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en el tratamiento de cánceres que incluyen un agente anti-hialuronano, una enzima de degradación de hialuronano (p. ej., una hialuronidasa soluble, tal como una PH20), y un agente que aumenta la respuesta inmunitaria mediante el bloqueo de una proteína de puntos de control inmunitario (es decir, inhibidor de puntos de control inmunitario). El agente anti-hialuronano, una enzima de degradación de hialuronano (p. ej., una hialuronidasa soluble, tal como PH20), se modifica o se formula o se proporciona para mostrar una mayor semi-vida en el plasma. Generalmente, la enzima de degradación de hialuronano se modifica por conjugación con un polímero. Como se describe en la presente memoria, la enzima de degradación de hialuronano se puede formular para la liberación sostenida o la liberación o el suministro locales, tal como en un vector que lo codifica.
Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan terapias combinadas para su uso en el tratamiento de cánceres. Las combinaciones incluyen una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, es decir, una hialuronidasa, tal como PEGPH20, y un agente que aumenta la respuesta inmunitaria al bloquear una proteína de puntos de control inmunitario (es decir, inhibidor de puntos de control inmunitario). En las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria, el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo dirigido contra una proteína de puntos de control inmunitario, es decir, un anticuerpo dirigido contra el antígeno 4 de linfocitos T citotóxicos (CTLA-4 o CD152) o el ligando 1 de muerte celular programada (PDL-1) o la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1).
En particular, la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se utiliza en el tratamiento de cualquier cáncer caracterizado por tumores sólidos que tienen un fenotipo de hialuronano (HA) al menos moderado a alto, y también de tumores sólidos estromales. Los cánceres ilustrativos incluyen cánceres de tumores sólidos, tales como, pero no limitados a, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, tal como cáncer de pulmón de células no escamosas (CPCNE), cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello y otros. La terapia combinada puede incluir adicionalmente un fármaco quimioterapéutico citotóxico adicional o una terapia con radionúclidos o cirugía, tal como resección quirúrgica.
1. Tumores sólidos y respuesta inmunitaria
Muchos cánceres desarrollan mecanismos para evadir las respuestas inmunitarias antitumorales. Estos mecanismos pueden ser intrínsecos a las células tumorales o estar mediados por otras células. Los mecanismos intrínsecos a las células tumorales incluyen la pérdida de expresión de antígenos que provocan respuestas inmunitarias. Por ejemplo, la alta tasa mitótica y la inestabilidad genética de las células tumorales, en presencia de un sistema inmunológico del anfitrión que funciona, pueden conducir a la selección de mutaciones o deleciones de genes que codifican antígenos tumorales que no son necesarios para el crecimiento de los tumores o el mantenimiento del fenotipo transformado.
Por ejemplo, algunas células tumorales no expresan co-estimuladores, tales como CD80 y CD86, necesarios para las respuestas de las células T o las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II, que son necesarias para la activación de las células T auxiliares. Al eliminar los antígenos o prevenir la expresión de los ligandos que se requieren para la activación inmunitaria, las células tumorales pueden evadir las respuestas inmunitarias mediadas por células T.
Las células tumorales también pueden suprimir las respuestas anti-tumorales mediante la secreción de citoquinas inmunosupresoras, tales como el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), que puede inhibir la proliferación y las funciones efectoras de los linfocitos y macrófagos.
Los tumores también pueden evadir la respuesta inmunitaria al inhibir el acceso de las células inmunitarias a los antígenos tumorales. Por ejemplo, los antígenos tumorales pueden ser enmascarados frente al sistema inmunológico mediante la expresión de moléculas de glicocálix, tales como los mucopolisacáridos que contienen ácido siálico, sobre la superficie de la célula tumoral. Además, los tumores, tales como los tumores sólidos, están formados por células cancerosas y células del estroma (p. ej., fibroblastos y células inflamatorias) que están rodeadas por una matriz extracelular y una red vascular. Las células estromales, los componentes de la matriz extracelular y/o la vasculatura generalmente son anormales en comparación con los presentes en los tejidos normales. Por ejemplo, muchos tumores sólidos tienen un mayor número de fibroblastos en comparación con los tejidos normales. Además, la vasculatura en los tumores sólidos puede mostrar una estructura ramificada o enroscada en comparación con la vasculatura normal, y mostrar aberraciones estructurales caracterizadas por vasos dilatados, reducción del revestimiento endotelial y/o vasos comprimidos. Finalmente, las células tumorales y estromales producen y ensamblan una red compleja de componentes de la matriz extracelular, tales como colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos (p. ej., hialuronano) y otras moléculas que forman una masa densa y pueden contribuir a la alta presión intersticial del tumor. La alta presión del fluido intersticial por encima de la presión intravascular en las arteriolas y capilares terminales puede afectar la perfusión de los fluidos y solutos al intersticio y evitar el acceso de las células de la respuesta inmunitaria, tales como los linfocitos infiltrantes de tumores, a la superficie del tumor.
2. Modulación de puntos de control inmunitario de la actividad de las células T en tumores
En condiciones fisiológicas normales, la respuesta inmunitaria mediada por células T se inicia mediante el reconocimiento de antígenos por el receptor de células T (TCR) y se regula mediante un equilibrio de señales co­ estimuladoras e inhibidoras (es decir, proteínas de puntos de control inmunitario). El sistema inmunológico se basa en puntos de control inmunitario para prevenir la autoinmunidad (es decir, la auto-tolerancia) y para proteger los tejidos del daño excesivo durante una respuesta inmunitaria, por ejemplo, durante un ataque contra una infección por patógenos. En algunos casos, sin embargo, las proteínas de puntos de control inmunitario pueden estar desreguladas en los tumores como un mecanismo para evadir el sistema inmunológico.
Las terapias para tratar el cáncer incluyen inmunoterapias (p. ej., antagonistas o agonistas de proteínas de puntos de control inhibidoras) que inhiben la señalización inmunosupresora o aumentan la señalización inmunoestimuladora. En lugar de dirigirse directamente al tumor en sí, tales terapias utilizan las defensas endógenas del anfitrión para combatir el tumor. Por ejemplo, los antagonistas y/o agonistas de proteínas de puntos de control inhibidoras de los receptores co-estimuladores pueden estimular la respuesta inmunitaria antitumoral endógena de un anfitrión al amplificar las respuestas de las células T específicas del antígeno. La potenciación de la respuesta inmunitaria del anfitrión ofrece ventajas sobre las terapias citotóxicas, ya que los efectos pueden durar mucho tiempo, de modo que el sujeto puede desarrollar una respuesta anti-tumoral duradera que puede persistir durante meses o años después de la interrupción del tratamiento.
En ejemplos particulares, las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria emplean un agente (es decir anticuerpo) que se dirige a una proteína de puntos de control inhibidora. Las proteínas diana de puntos de control inmunitario inhibidoras y los anticuerpos terapéuticos para las dianas se proporcionan en la Tabla 3.
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En particular, se contemplan inhibidores de las moléculas inhibidoras inmunológicas CTLA4 y PD-1 para las combinaciones y métodos proporcionados en la presente memoria. Mientras CTLA4 y PD-1 funcionan como reguladores negativos, cada uno desempeña un papel no redundante en la modulación de las respuestas inmunitarias: CTLA-4 participa en la atenuación de la activación temprana de células T no activadas "no sometidas a tratamiento previo" y de memoria (en reposo); mientras que PD-1 desempeña un papel en la modulación de la actividad de las células T en los tejidos periféricos (véase, p. ej., Keir et al. (2008) Annu Rev Immunol. 26:677-704; Pardoll, (2012) Nat Rev Cancer. 12 (4):252-264; Quezada et al., (2013) Br J Cancer. 108 (8): 1560-1565; Callahan et al., (2010) Semin Oncol. 37 (5):473-84). Estas actividades, y la inhibición de estas dianas en la inmunoterapia de tumores, se describen con más detalle a continuación.
a. CTLA-4 y cebado de células T
La inmunidad mediada por células T implica las etapas de cebado, que se inician mediante la selección clonal de células T específicas de antígeno seguida de la activación y proliferación de células T seleccionadas en tejidos linfoides, el tráfico de células T activadas a sitios de antígeno e inflamación, y la ejecución de funciones efectoras directas en células diana. Cada una de estas etapas está regulada por las señales estimuladoras e inhibidoras compensatorias que afinan la amplitud de la respuesta inmunitaria.
El cebado de células T, que incluye las etapas consecutivas de selección de células T específicas de antígeno y activación y proliferación de las células T seleccionadas, se produce en los ganglios linfáticos. Las células T no activadas y en reposo expresan el receptor de células T (TCR) y altos niveles del receptor coestimulador, CD28 sobre la superficie celular. Los TCR se unen a péptidos antigénicos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC), tal como una célula dendrítica o macrófago. Las APC también expresan CD80 (también llamado B7.1) o CD86 (también llamado B7.2), los ligandos para CD28. Tras la unión de TCR a su péptido: el antígeno MHC y el reconocimiento de CD80 o CD86 por el receptor de células T coestimulador, CD28, expresado sobre las células T, se produce una transducción de señales dentro de las células T para iniciar la activación de las células T.
El antígeno 4 asociado a los linfocitos T citotóxicos (CTLA4; también llamado CD152) es un receptor co-inhibidor que se empaqueta en vesículas que se mantienen en el citoplasma de las células T no activadas o en reposo. Cuando la transducción de señales iniciada por CD28 inicia la activación de las células T, también desencadena el transporte de las vesículas que contienen CTLA4 a la superficie de la célula T. CTLA4 compite con CD28 para unirse a CD80 y CD86 sobre las APC, y CTLA4 tiene una afinidad de unión más alta para los antígenos que CD28. La actividad inhibidora de CTLA4 actúa amortiguando la amplitud de la señal estimuladora de CD28. Por lo tanto, la activación y proliferación de células T depende de la razón de las señales de CD28 (estimulador) con respecto a CTLA4 (inhibidor). En este papel, CTLA4 funciona reduciendo la actividad de las células T y, por lo tanto, limitando la autoinmunidad. CTLA4 también desempeña un papel en la modulación descendente de la actividad de las células T auxiliares y en la mejora de la actividad de las células T reguladoras (Treg).
La erradicación de tumores puede ocurrir al destruir las células tumorales por medio de los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos para antígenos tumorales. Las células T auxiliares CD4+ también pueden desempeñar un papel en la respuesta inmunitaria a los tumores activando células efectoras específicas de antígeno y reclutando células del sistema inmunitario innato hacia el tumor, tales como los macrófagos. La mayoría de los tumores, sin embargo, pueden evadir el sistema inmunológico. Esto puede ocurrir por el fallo de los tumores para expresar antígenos que puedan ser reconocidos por el sistema inmunológico. Además, muchos tumores pueden expresar aberrantemente moléculas co-estimuladoras e inhibidoras de modo que, en general, hay una activación reducida de CTL y células T auxiliares. Por ejemplo, los tumores pueden expresar niveles bajos de la molécula coestimuladora CD80 o CD86, lo que da como resultado un compromiso preferencial del receptor inhibidor CTLA-4 en lugar del receptor estimulador CD28. Además, algunos tumores pueden inducir células T reguladoras, que también suprimen las respuestas inmunitarias antitumorales.
La inhibición de CTLA4, por ejemplo administrando anticuerpos anti-CTLA4, puede mejorar la respuesta inmunitaria al aumentar la actividad de los cTl , aumentando la presencia de células T efectoras y auxiliares y/o inhibiendo las funciones supresoras de las células Treg. La inhibición de CTLA4 permite la activación completa de las células T durante la fase de cebado de la respuesta inmunitaria.
Como se indica en la Tabla 3 anterior, dos anticuerpos que bloquean CTLA4, Ipilimumab y Tremelimumab, se han utilizado para el tratamiento eficaz de algunos cánceres, tales como el melanoma, el cáncer de páncreas, el cáncer de ovario, el cáncer de próstata, el cáncer de células renales (CCR), el cáncer colorrectal (CCR), el cáncer gástrico y CPCNP (véase Kyi et al., (2014) FEBS Letters 588: 368-376 para una revisión). El bloqueo terapéutico de CTLa 4 puede efectuar una regresión del tumor de meses a años después de completar la terapia (Prieto et al., (2012) Clin Cancer Res. 18(7):2039-2047; Kirkwood et al., (2010) Clin Cancer Res. 16(3):1042-1048), pero también puede reducir la tolerancia a otros tejidos del anfitrión, lo que lleva a eventos adversos, tales como los eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico (irAE).
b. PD-1 y fase efectora de células T
Después de la activación en el ganglio linfático, las células T activadas ingresan al torrente sanguíneo y viajan a los tejidos periféricos para llevar a cabo las funciones efectoras de las células T. La expresión de la proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), un receptor que inhibe la activación de las células T, se induce con la activación de las células T. PD-1 también está presente en las células T reguladoras (Treg), células T agotadas, células B activadas, células asesinas naturales (Nk ), células dendríticas (DC) y monocitos activados.
PD-1 tiene dos ligandos principales, el ligando 1 de PD-1 (PD-L1; también llamado B7-H1 o CD274) y PD-L2 (también llamado B7-DC o CD273). Las señales inflamatorias en los tejidos inducen la expresión de PD-L1 y PD-L2. Al unirse a uno de sus ligandos, PD-1 actúa atenuando la actividad de las células T, al inhibir la señalización del receptor de células T (TCR), regulando por disminución la secreción de citoquinas inmunoestimuladoras y la expresión de proteínas de supervivencia, y aumentando la producción de células T de la citoquina inmunosupresora IL-10. Estas actividades sirven para limitar el daño colateral al tejido y limitar la autoinmunidad durante una respuesta inmunitaria en condiciones normales.
Múltiples tumores y células en el microentorno del tumor de cánceres tales como cánceres de ovario, urotelial, de mama, cervical, de colon, pancreático, gástrico, melanoma, glioblastoma y CPCNP, expresan PD-L1 y/o PD-L2 (Zou y Chen, (2008) Nat. Rev. Immunol. 8(6):467-477; Rozali et al., (2012) Clin Dev Immunol. 2012: 656340). Cuando PD-1 se une a su ligando sobre las células tumorales, la actividad de las células T se atenúa, lo que evita el rechazo del tumor y, por lo tanto, contribuye a la evasión inmunitaria del tumor. La expresión de PD-L1 por tumores se ha relacionado con un mal pronóstico en varios cánceres (Hamid y Carvajal, (2013) Expert Opin Biol Ther. 13(6):847-861).
El bloqueo de la ruta de señalización de PD-1 da como resultado la restauración de las funciones efectoras de las células T, tales como las funciones efectoras de las células T específicas del tumor, tal como la destrucción de células tumorales y la secreción de citoquinas inmunoestimuladoras, tales como el interferón gamma (IFNy), la interleuquina-2 (IL -2) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Se pueden utilizar terapias, incluyendo terapias que emplean anticuerpos monoclonales, tales como las que se muestran anteriormente en la Tabla 3, para bloquear la interacción entre PD-1 y PD-L1 o PD-L2 como una estrategia para aumentar la respuesta inmunitaria antitumoral. Los anticuerpos anti-PD-1 que interrumpen la señalización de PD-1 incluyen Nivolumab, MK-3745 y Pidilizumab. c. Otros agentes inmunomoduladores
Otros ligandos y receptores de puntos de control inmunitario participan en la modulación de la respuesta inmunitaria y pueden ser dianas de terapias dirigidas a mejorar la inmunidad antitumoral. Adicionalmente, el bloqueo de dos o más de los receptores o ligandos expresados de manera coordinada puede producir actividades antitumorales aditivas o sinérgicas.
Las dianas incluyen ligandos inhibidores de B7, distintos de PD-L1 y PD-L2, tales como B7-H3 y B7-H4, que están regulados por aumento en células tumorales o células infiltrantes de tumores. Otras dianas, que están asociadas con la inhibición de la actividad de los linfocitos, incluyen el gen 3 de activación de los linfocitos (LAG3; también llamado CD223), 2B4 (también llamado CD244), atenuador de linfocitos B y T (BTLA; o CD272), proteína 3 de la membrana de la célula T (TIM3; o HAVcr2), receptor de adenosina A2a (A2aR) y la familia de los receptores inhibidores de las células asesinas. Muchos de estos receptores de puntos de control inmunitario regulan la actividad de las células T efectoras y las células Treg. Por ejemplo, LAG3 es altamente expresado en células Treg (que ayudan a prevenir la autoinmunidad), donde se cree que es importante para amplificar la actividad inmunosupresora. LAG3 también se asocia con la inhibición de la actividad de las células T efectoras y puede inducir anergia de las células T (Pardoll, (2012) Nat Rev Cancer. 12(4):252-264. El direccionamiento de anticuerpos contra estas proteínas solas o combinadas puede mejorar la inmunidad antitumoral en modelos de cáncer en animales. Debido a que muchas células tumorales expresan múltiples ligandos inhibidores, y a que los linfocitos que se infiltran en el tumor expresan múltiples receptores inhibidores, un enfoque combinatorio para inhibir estas proteínas puede ser eficaz para mejorar la inmunidad antitumoral (véase Pardoll, (2012) Nat Rev Cancer. 12(4):252-264 para una revisión).
Además de los ligandos inhibidores secretados o unidos a la membrana, las enzimas metabólicas tales como la indolamina 2,3 dioxigenasa (IDO) y la arginasa, que son expresadas por células supresoras derivadas de mieloides inhibidores que normalmente infiltran tumores, pueden inhibir localmente las respuestas inmunitarias mediante el agotamiento de los aminoácidos esencial para el metabolismo anabólico de las células T. Estas enzimas pueden ser inhibidas por fármacos de molécula pequeña.
3. Enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero en terapia combinada con un inhibidor de puntos de control inmunitario
El hialuronano (HA) es un componente importante de la matriz extracelular de los tumores sólidos. E1HA es un glicosaminoglicano lineal de alto peso molecular que contiene unidades de disacáridos que se repiten, (3-1,3-acetil-D-glucosamina unida p-1,4 a ácido D-glucurónico. El HA se produce naturalmente en el organismo y se secreta a niveles extremadamente altos en algunas células cancerosas, incluyendo células de cáncer de páncreas, pulmón (p. ej., PCNP), y mama. Se ha informado sobre aberraciones locales del metabolismo de HA en muchas neoplasias malignas de tumores sólidos, donde los niveles elevados de HA a menudo se correlacionan con un mal pronóstico en tumores tales como el carcinoma de mama, gástrico, colorrectal, ovárico, de próstata y de pulmón. En particular, el HA participa en el aumento de absorción de agua y la presión del fluido intersticial (IFP) en los tejidos enfermos, tales como tumores, lo que da como resultado una vasculatura tumoral comprimida. Por ejemplo, en los sitios de inflamación o en un foco tumoral, hay una rápida acumulación de hialuronano, otros componentes de la matriz y agua. Debido a esta rápida acumulación, el sitio enfermo no puede alcanzar el equilibrio con su entorno y, por lo tanto, tiene una IFP más alta que los tejidos normales.
Como se comentó anteriormente, la IFP de la mayoría de los tumores sólidos y otros tejidos enfermos asociados con HA acumulado es elevada, actuando como una barrera para la administración eficaz de fármacos (Heldin et al. (2004) Nat Rev Cancer 4(10):806-813). La acumulación de HA también reduce la inhibición por contacto entre las células tumorales (véase, p. ej., Itano et al. (2002) Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 99:3609-3614). Además de crear una barrera física, el hialuronano derivado del tumor también puede inducir macrófagos inmunosupresores a través de la activación temprana transitoria de los monocitos (Kuang et al., (2007) Blood 110 (2):587-595) permitiendo de ese modo que las células tumorales eviten la respuesta inmunitaria y creen condiciones para la progresión del tumor.
Las enzimas que degradan el hialuronano, tales como las enzimas hialuronidasas, son enzimas que interfieren en el ácido hialurónico y lo degradan. Las enzimas que degradan el hialuronano, p. ej., las hialuronidasas (p. ej., PH20), pueden reducir el hialuronano de manera que el tejido se desinfle, los vasos sanguíneos se expandan y más sangre pueda fluir a través del sitio. Esto produce como resultado una disminución de la presión del líquido intersticial en el sitio del tejido y un aumento asociado en la perfusión vascular. Además, las enzimas que degradan el hialuronano (p. ej., la hialuronidasa soluble, por ejemplo, PH20) puede agotar el estroma que rodea las células cancerosas al degradar el HA. En virtud de los efectos para degradar el hialuronano, las enzimas que degradan el hialuronano (p. ej., la hialuronidasa soluble, por ejemplo, PH20) se han utilizado para el tratamiento de tumores y cánceres en la terapia de tratamiento único o en terapia combinada con otros agentes (véase p. ej., las Solicitudes publicadas de Estados Unidos Núm. US2006/0104968 y US20100003238; y la Solicitud de Publicación Internacional PCT Núm. WO 2009/128917).
El tratamiento de los tumores generalmente requiere administración sistémica. El uso de hialuronidasa, tal como una enzima PH20, como tratamiento sistémico adolece de problemas asociados con la corta semi-vida de la enzima. Por ejemplo, la hialuronidasa no modificada típicamente tiene una semi-vida corta de actividad enzimática en la sangre de minutos, generalmente menos de 5 minutos. Esto significa que tales enzimas son generalmente inadecuadas para su uso en administraciones intravenosas y otras administraciones, donde su duración de acción es de corta duración. Esto se debe a que, después de la degradación, el sustrato de HA se reemplaza con una semi-vida de aproximadamente 5 h. En contraste, los métodos que aumentan la administración y/o prolongan la asociación de una hialuronidasa con hialuronano asociado a células (p. ej., hialuronano pericelular asociado al tumor) permite el tratamiento de tumores ricos en HA (p. ej., tumores con HAalto). Tales métodos pueden incluir, pero no se limitan a, la conjugación de la enzima con un polímero, el uso de una enzima que está aglicosilada o que esté modificada para presentar una reducción de la glicosilación, la infusión continua de la enzima y/o un suministro localizado de la enzima. Por ejemplo, la modificación con polímero de la hialuronidasa, tal como la PEGilación, aumenta la semi-vida de la enzima aproximadamente 48 a 72 horas y permite el tratamiento sistémico de tumores ricos en HA (véase p. ej., la Solicitud Publicada de Estados Unidos Núm. 20100003238 y la Solicitud Publicada Internacional PCT Núm. Wo 2009/128917). El aumento de la semi-vida en relación con la hialuronidasa no modificada permite la eliminación continua de HA, y por lo tanto reduce o disminuye el grado de regeneración de HA en tejidos enfermos, tales como el tumor. Por lo tanto, el mantenimiento de los niveles de enzimas en plasma mediante la conjugación con polímeros puede eliminar el HA, tal como el HA del tumor, y también contrarrestar la resíntesis de HA.
En la presente memoria se encuentra que la terapia combinada de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, por ejemplo una hialuronidasa soluble PEGilada (p. ej., PEGPH20) y un inhibidor de puntos de control inmunitario muestra un aumento sustancial en la eficacia para el tratamiento de tumores (particularmente tumores HAalto) que cualquiera de los agentes solo. En particular, tales resultados son evidentes cuando la enzima se administra previamente al sujeto antes de administrar el inhibidor de puntos de control inmunitario.
Dado que los inhibidores de puntos de control inmunitario actúan sobre las células inmunitarias para mejorar las respuestas inmunitarias, el incremento de la respuesta cuando se proporcionan combinados con una enzima de degradación de hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, puede deberse a efectos sobre el aumento de acceso de las células inmunitarias (p. ej., CTL) al tumor. Por ejemplo, como se describió anteriormente, las células tumorales y estromales producen y ensamblan una red compleja de componentes de la matriz extracelular, tales como colágenos, proteoglicanos, glicosaminoglicanos (p. ej., hialuronano) y otras moléculas que forman una masa densa que puede inhibir la infiltración de linfocitos y otras células inmunitarias. Al degradar el hialuronano, puede haber un mayor acceso de las células inmunitarias circulantes a los tumores, lo que aumenta el número de células citotóxicas y otras inmunitarias disponibles para destruir las células tumorales. La penetración de agentes o fármacos antitumorales, tales como los inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpo anti-CTLA4), también se puede aumentar. También es posible que la degradación del hialuronano mejore el contacto superficial entre las células inmunitarias, tales como las células T citotóxicas y las células tumorales, lo que también produce como resultado una mayor destrucción de las células tumorales cuando se combina con un inhibidor de puntos de control inmunitario.
Por lo tanto, el uso de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, por ejemplo una hialuronidasa soluble PEGilada (p. ej., PEGPH20), tal como mediante la administración previa, puede sensibilizar un tumor a las respuestas mediadas por el sistema inmunológico, que pueden aumentar aún más en presencia de un inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpo anti-CTLA4). La mejora de la accesibilidad de las células inmunitarias al tumor mediante una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, por ejemplo, como se logra mediante la administración previa de la enzima, puede permitir una dosificación reducida del inhibidor de puntos de control inmunitario, mientras se mantiene la eficacia terapéutica. La capacidad de ajustar con mayor eficacia la dosificación de anticuerpos puede producir una reducción de los eventos adversos que pueden estar asociados con la terapia con anticuerpos. Por lo tanto, la terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede facilitar una respuesta inmunitaria antitumoral mejorada para la erradicación de tumores y el tratamiento de tumores.
C. Agentes de terapia combinada
En la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de acuerdo con las presentes reivindicaciones que comprenden agentes anti-hialuronano, tales como enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímeros y otras formas de los mismos, tales como vesículas que contienen una enzima de degradación de hialuronano y un vector que lo codifica, y un inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como los inhibidores de las proteínas de puntos de control inmunitario, tales como los anticuerpos anti-CTLA4 y anti-PD-1, para su uso en el tratamiento de cánceres. En particular, en la presente memoria se proporcionan terapias combinadas de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, es decir, una hialuronidasa, tal como PEGPH20, e inhibidores de puntos de control inmunitario, tales como anticuerpos anti-CTLA4 y anti-PD-1, para su uso en el tratamiento de cánceres Para los fines de las realizaciones en la presente memoria, la referencia a una enzima de degradación de hialuronano (p. ej., una hialuronidasa soluble, tal como PH20), incluye enzimas de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p. ej., polipéptidos de hialuronidasa solubles conjugados con polímeros, tales como PEGPH20). En particular, la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se utiliza en el tratamiento de cualquier cáncer caracterizado por tumores sólidos que se caracterizan por tener niveles de HA de moderados a altos en la matriz extracelular (es decir, tumores HAmoderado a HAalto). Los ejemplos de tales cánceres incluyen cánceres de tumores sólidos, tales como, pero no limitados a, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón y otros. La terapia combinada puede incluir adicionalmente un agente de direccionamiento inmunitario adicional, un fármaco quimioterapéutico citotóxico, radioterapia o tratamiento quirúrgico.
En las siguientes subsecciones se proporcionan ejemplos no limitantes de inhibidores de puntos de control inmunitario y agentes antihialuronano, incluidas las enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímeros, para su uso en la terapia combinada.
1. Inhibidores de puntos de control inmunitario y sus formulaciones
La terapia combinada, que incluye composiciones, combinaciones y métodos y uso de los mismos, proporcionada en la presente memoria contiene inhibidores de las proteínas de puntos de control inmunitario que bloquean una proteína de puntos de control inmunitario para estimular una respuesta inmunitaria antitumoral. Tales inhibidores de a. Terapias anti-CTLA4
Las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria, incluyendo las composiciones y combinaciones para su uso, incluyen anticuerpos terapéuticos que inhiben CTLA4. Los inhibidores incluyen anticuerpos y aptámeros. Se conocen inhibidores de anticuerpos y aptámeros que se unen a CTLA4 e inhiben la señalización de CTLA4. Se han descrito aptámeros ilustrativos (fuera del alcance de la invención) que se unen a CTLA4, inhiben la función de CTLA4 y potencian la inmunidad tumoral y se exponen en SEQ ID NO: 11-18 (Santulli-Marotto (2003) Cancer Res. 63(21):7483-7489; Gilboa et al., (2013) Clin Cancer Res 19(5):1054-1062).
Se han descrito varios anticuerpos, que se unen a, e inhiben la actividad de CTLA4, que se han utilizado en la inmunoterapia antitumoral. Los anticuerpos anti-CTLA4 incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm. 6.682.736, 6.984.720; las Publicaciones de EE.UU. Núm. 2002/0086014; 2009/0074787; la Patente Europea Núm. EP 1262193; y la Publicación de Patente Internacional Núm. WO 2000/037504. En particular, los anticuerpos anti-CTLA4 incluyen Ipilimumab (también llamado MDS-010 o 10D1) y Tremelimumab (también llamado Ticilimumab o CP-675,206). Estos anticuerpos anti-CTLA4 han participado en numerosos ensayos clínicos para el tratamiento de cánceres. Ipilimumab está aprobado por la FDA para el tratamiento del melanoma y ha estado en ensayos clínicos para otros cánceres, tales como el cáncer de próstata, cáncer de pulmón y CCR. Tremelimumab se ha investigado en ensayos clínicos para el tratamiento de CCR, cáncer gástrico, melanoma y CPCNP.
(i) Ipilimumab y derivados del mismo
Un anticuerpo anti-CTLA4 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede incluir Ipilimumab (también llamado MDX-010, MDX-101, 10D1; Núm. de Acceso del Banco de Fármacos DB06186) o derivados del mismo, tales como variantes o fragmentos de unión a antígeno de Ipilimumab. Ipilimumab es un anticuerpo monoclonal IgG1K completamente humano que se une específicamente a CTLA4 humano (véanse, p. ej., anticuerpo designado 10D1 en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2002/0086014 y la Patente de Estados Unidos Núm. 6.984.720). La cadena pesada de Ipilimumab tiene un dominio variable (Vh) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 21. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada incluyen Vh CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 25); Vh CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 26); y Vh CDR 3 (expuesta en SEQ ID NO: 27). La cadena ligera de Ipilimumab tiene un dominio variable (Vl) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 23. Las CDR de la cadena ligera incluyen, Vl CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 28); Vl CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 29); y Vl CDR 3 (expuesta en SeQ ID NO: 30). Cuando se produce de forma recombinante, Ipilimumab se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas de 447 aminoácidos cada una y dos cadenas ligeras kappa idénticas de 215 aminoácidos cada una. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
El anticuerpo anti-CTLA4 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también incluye fragmentos de unión a antígeno de Ipilimumab completo o variantes del mismo. Un fragmento de unión a antígeno contiene mínimamente una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de ipilimumab, o una porción de la misma suficiente para formar un sitio de unión a antígeno suficiente para unirse a CTLA4. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier forma de un anticuerpo siempre que, cuando se produzca o se ensamble en un anticuerpo, contenga mínimamente una porción suficiente de la cadena pesada variable y una porción suficiente de la cadena ligera variable para unirse inmunoespecíficamente a CTLA4. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CTLA4 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria incluyen fragmentos de unión a antígeno de Ipilimumab que contienen mínimamente una cadena pesada variable (Vh) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24, o una porción de SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24 suficiente para formar un sitio de unión a antígeno para unirse inmunoespecíficamente a CTLA4. Por ejemplo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd'.
El anticuerpo anti-CTLA4 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de Ipilimumab, o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen las variaciones. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4 puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de amino ácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24, donde el anticuerpo variante se une de forma inmunoespecífica a CTLA-4. La variación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción o deleción de aminoácidos. En algunos casos, solamente varía la cadena pesada. En otros casos, solo varía la cadena ligera. En otros casos, tanto la cadena pesada como la ligera varían en comparación con el anticuerpo parental Ipilimumab.
(ii) Tremelimumab y derivados del mismo.
Un anticuerpo anti-CTLA4 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede incluir Tremelimumab (también llamado Ticilimumab, CP-675,206 u 11.2.1) o derivados del mismo, tales como variantes o fragmentos de unión a antígeno de Tremelimumab. Tremelimumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 completamente humano que se une específicamente a CTLA4 humana (véase p. ej., el anticuerpo designado 11.2.1 de la Pub. de Patente Internacional Núm. WO 00/37504). La cadena pesada de Tremelimumab tiene un dominio variable (Vh) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 33. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada incluyen Vh CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 282); Vh CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 283); y Vh CDR 3 (expuesta en SEQ ID NO: 284). La cadena ligera de Tremelimumab tiene un dominio variable (Vl) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 35. Las CDR de la cadena ligera incluyen, Vl CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 285); Vl CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 286); y Vl CDR 3 (expuesta en SEQ ID NO: 287). Cuando se produce de forma recombinante, Tremelimumab se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras kappa idénticas. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
El anticuerpo anti-CTLA4 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también incluye fragmentos de unión a antígeno de Tremelimumab completo o variantes del mismo. Un fragmento de unión a antígeno contiene mínimamente una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de Tremelimumab, o una porción del mismo suficiente para formar un sitio de unión a antígeno suficiente para unirse a CTLA4. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier forma de un anticuerpo siempre que, cuando se produzca o se ensamble en un anticuerpo, contenga mínimamente una porción suficiente de la cadena pesada variable y una porción suficiente de la cadena ligera variable para unirse inmunoespecíficamente a CTLA4. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CTLA4 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria incluyen fragmentos de unión a antígeno de Tremelimumab que contienen mínimamente una cadena pesada variable (Vh) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36, o una porción suficiente de SEQ ID NO: 34 y SEQ ID NO: 36 para formar un sitio de unión a antígeno para unirse inmunoespecíficamente a CTLA4. Por ejemplo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd'.
El anticuerpo anti-CTLA4 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de Tremelimumab, o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen las variaciones. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA4 puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de amino ácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 36, donde el anticuerpo variante se une de forma inmunoespecífica a CTLA-4. La variación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción o deleción de aminoácidos. En algunos casos, solamente varía la cadena pesada es variada. En otros casos, solamente varía la cadena ligera. En otros casos, tanto la cadena pesada como la ligera varían en comparación con el anticuerpo Tremelimumab parental.
Las variantes de Tremelimumab son conocidas en la técnica (véase p. ej., N294 en la Publicación de Patente Internacional Núm. WO 00/37504). En algunos ejemplos, el anticuerpo, purificado de fuentes no humanas, se modifica para eliminar un sitio de glicosilación, por ejemplo, para prevenir cambios en la inmunogenicidad, farmacocinética y/o las funciones efectoras resultantes de la glicosilación no humana. Por ejemplo, en algunas variantes, una asparragina puede ser reemplazada por glutamina (Q) (p. ej., N294Q) para prevenir la glicosilación. b. Terapias anti-PD-1 y anti-PD-Ll
Las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria, incluyendo composiciones y métodos y usos de los mismos, incluyen anticuerpos terapéuticos que inhiben PD-1 o PD-L1. Los inhibidores incluyen anticuerpos y proteínas de fusión, aptámeros. Se conocen inhibidores de anticuerpos, aptámeros y proteínas de fusión que se unen a PD-1 o PD-L1 e inhiben la señalización inhibidora de PD-1. Las proteínas de fusión ilustrativas (fuera del alcance de la invención) incluyen AMP-224 (también conocida como B7-DCIg), que es un receptor soluble de fusión PD-L2-Fc descrito en las Publicaciones de Patente Internacional. Núm. WO2010/027827 y WO201 1/066342.
Se han descrito varios anticuerpos, que se unen a PD-1 o PD-L1 e inhiben la actividad inhibidora de PD-1, que se han utilizado en inmunoterapia antitumoral. Los anticuerpos anti-PD-1 incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los descritos en las Patentes de Estados Unidos Núm. 7.943.743, 8.008.449, 8.779.105, 8.735.553; Publicaciones de Estados Unidos Núm. 2005/0180969; 2007/0166281; Publicación de Patente Internacional. Núm. WO 2008/156712. Los anticuerpos anti-PD-L1 incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los descritos en las Publicaciones de Estados Unidos Núm. 2013/0034559 y 2013/0045202; Patentes de Estados Unidos Núm. 7.943.743, 8.217.149, 8.679.767 y 8.779.108; y en las Publicaciones Internacionales Núm. WO 2010/077634 y WO 2013/019906.
(i) Anticuerpos anti-PD-1
En particular, los anticuerpos anti-PD-1 incluyen Nivolumab (también llamado BMS-936558; MDX-1106; o ONO-4538), MK-3475 (también conocido como Pembrolizumab o Lambrolizumab), Pidilizumab (o CT-011) y AMP-224. Estos anticuerpos anti-PD-1 han participado en numerosos ensayos clínicos para el tratamiento de cánceres, tales como el melanoma, CPCNP, rCc , tumores malignos hematológicos, linfomas, leucemias, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de pulmón y mieloma múltiple.
(a) Nivolumab y derivados del mismo.
Un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en la terapia combinada que se proporciona en la presente memoria puede incluir Nivolumab (también conocido como BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538 o 5C4) o derivados del mismo, tales como variantes o fragmentos de unión al antígeno de Nivolumab. Nivolumab es un anticuerpo monoclonal IgG4 completamente humano que se une específicamente a PD-1 humano (véase, p. ej., el anticuerpo designado 5C4 en la Patente de Estados Unidos Núm. 8.008.449). La cadena pesada de Nivolumab tiene un dominio variable (Vh) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 53. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la cadena pesada incluyen Vh CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 57); Vh CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 58); y Vh CDR 3 (expuesta en SeQ ID NO: 59). La cadena ligera de Nivolumab tiene un dominio variable (Vl) con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 56, codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 55. Las CDR de la cadena ligera incluyen, Vl CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 60); Vl Cd R 2 (expuesta en SEQ ID NO: 61); y Vl CDR 3 (expuesta en SEQ ID NO: 62). Cuando se produce de forma recombinante, Nivolumab se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras kappa idénticas. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
El anticuerpo anti-PD-1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también incluye fragmentos de unión a antígeno de Nivolumab completo o variantes del mismo. Un fragmento de unión a antígeno contiene mínimamente una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de Nivolumab, o una porción suficiente del mismo para formar un sitio de unión a antígeno suficiente para unirse a PD-1. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier forma de un anticuerpo siempre que, cuando se produzca o se ensamble en un anticuerpo, contenga mínimamente una porción suficiente de la cadena pesada variable y una porción suficiente de la cadena ligera variable para unirse inmunoespecíficamente a PD 1. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria incluyen fragmentos de unión a antígeno de Nivolumab que contienen mínimamente una cadena pesada variable (Vh) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 56, o una porción suficiente de SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56 para formar un sitio de unión a antígeno para unirse inmunoespecíficamente a PD-1. Por ejemplo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fvde cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd'.
El anticuerpo anti-PD-1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de Nivolumab, o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen las variaciones. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable que tiene un secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, o 99% con la cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 56, donde el anticuerpo variante se une de forma inmunoespecífica a PD-1. La variación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción o deleción de aminoácidos. En algunos casos, solamente la cadena pesada varía. En otros casos, solamente varía la cadena ligera. En otros casos, tanto la cadena pesada como la ligera varían en comparación con el anticuerpo parental de Nivolumab.
(b) MK-3475 y derivados del mismo
Un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede incluir MK-3475 (también llamado Pembrolizumab, Lambrolizumab o h409A11) o derivados del mismo, tales como variantes o fragmentos de unión a antígeno de MK-3475. MK-3475 es un anticuerpo monoclonal IgG4K humanizado que se une específicamente a PD-1 humano (véase, p. ej., el anticuerpo designado h409A11 en la Publicación de Patente Internacional. Núm. WO 2008/156712). La cadena pesada completa de MK-3475 tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 64, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 63, y la cadena ligera completa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 66, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 65. La cadena pesada se compone de un dominio variable (Vh), con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 67). La cadena ligera está compuesta por un dominio variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 69 y una región constante ligera kappa humanizada. Cuando se produce de forma recombinante, MK-3475 se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas de 447 aminoácidos cada una y dos cadenas ligeras kappa idénticas de 218 aminoácidos cada una. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
Las CDR de MK-3475 incluyen, Vh CDR 1 (SEQ ID NO: 71); Vh CDR 2 (SEQ ID NO: 72); Vh CDR 3 (SEQ ID NO: 73); Vl CDR 1 (SEQ ID NO: 74); Vl CDR 2 (SEQ ID NO: 75); y Vl CDR 3 (SEQ ID NO: 76).
El anticuerpo anti-PD-1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de MK-3475. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 64 y una cadena ligera que tiene una secuencia de amino ácidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 66. La variación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción o deleción de aminoácidos. En algunos casos, solamente la cadena pesada varía. En otros casos, solamente varía la cadena ligera. En otros casos, tanto la cadena pesada como la ligera varían en comparación con el anticuerpo MK-3475 parental.
El anticuerpo anti-PD-1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también incluye fragmentos de unión a antígeno de MK-3475 completo o variantes del mismo. Un fragmento de unión a antígeno contiene mínimamente una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de MK-3475, o una porción suficiente de la misma para formar un sitio de unión a antígeno suficiente para unirse a PD-1. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier forma de un anticuerpo siempre que, cuando se produzca o se ensamble en un anticuerpo, contenga mínimamente una porción suficiente de la cadena pesada variable y una porción suficiente de la cadena ligera variable para unirse inmunoespecíficamente a PD 1. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria contienen mínimamente una cadena pesada variable (Vh) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70, o una porción suficiente de SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 70 para formar un sitio de unión a antígeno para unirse de forma inmunoespecífica a PD-1. Por ejemplo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd'.
(c) Pidilizumab y derivados del mismo
Un anticuerpo anti-PD-1 para su uso en la terapia combinada provista en la presente memoria puede incluir Pidilizumab (también llamado hBAT-1 o CT-011) o derivados del mismo, tales como variantes o fragmentos de unión a antígeno de Pidilizumab. Pidilizumab es un anticuerpo monoclonal IgG1K humanizado que se generó a partir de un anticuerpo murino (BAT), que se originó contra las membranas de las células B linfoides, y se ha demostrado que provoca actividades basadas en las células T y en las células NK. Pidilizumab se une al PD-1 humano (véase, p. ej., el anticuerpo designado BAT-1 Rkd/RHc en el Documento US 2005/0180969). La cadena pesada completa de Pidilizumab tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 78, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 77, y la cadena ligera completa tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 80, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 79. La cadena pesada está compuesta por un dominio variable (Vh), con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 82, codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 81. La cadena ligera se compone de un dominio variable (Vl,) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84, codificada por una secuencia de ácidos nucleicos expuesta en SEQ ID NO: 83, y una región constante ligera kappa humanizada. Cuando se produce de forma recombinante, Pidilizumab se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras kappa idénticas. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
Las CDR de Pidilizumab incluyen, Vh CDR 1 (secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 85); Vh CDR 2 (secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 86); Vh CDR 3 (secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 87); Vl CDR 1 (secuencia de aminoácidos expuesta en SeQ ID NO: 88); Vl CDR 2 (secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 89); y Vl CDR 3 (secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 90). El anticuerpo anti-PD-1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de Pidilizumab. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % c o n la c a d e n a p e s a d a e x p u e s ta en S E Q ID N O : 78 y u n a c a d e n a lig e ra q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e n u n a id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e a l m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , o 99 % c o n la c a d e n a lig e ra e x p u e s ta en S E Q ID N O : 80. L a v a r ia c ió n p u e d e s e r un re e m p la z o d e a m in o á c id o s , in s e rc ió n o d e le c ió n d e a m in o á c id o s . E n a lg u n o s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a p e s a d a . E n o tro s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a lig e ra . E n o tro s c a s o s , ta n to la c a d e n a p e s a d a c o m o la l ig e ra v a r ía n en c o m p a ra c ió n c o n e l a n t ic u e rp o p a re n ta l d e P id il iz u m a b .
E l a n t ic u e rp o a n ti-P D -1 en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia ta m b ié n in c lu y e fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e P id il iz u m a b c o m p le to o v a r ia n te s de l m is m o . U n fra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o c o n t ie n e m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y /o u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e P id il iz u m a b , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e l m is m o p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o s u f ic ie n te p a ra u n irs e a P D -1. P o r lo ta n to , e l a n t ic u e rp o p u e d e s e r c u a lq u ie r fo rm a d e un a n t ic u e rp o s ie m p re q u e , c u a n d o se p ro d u z c a o s e e n s a m b le en un a n t ic u e rp o , c o n te n g a m ín im a m e n te u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a lig e ra v a r ia b le p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D 1. P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n ti-P D -1 p a ra su u so en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia c o n t ie n e n m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le (Vh) co n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 82 y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le (Vl) c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 84 , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e S E Q ID N O : 82 y S E Q ID N O : 84 p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D -1. P o r e je m p lo , lo s e je m p lo s d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, f ra g m e n to s F a b , F a b ', F (a b ')2, F v d e c a d e n a s e n c il la (s c F v ) , Fv, d s F v , d ia c u e rp o , F d y Fd'.
(ii). Anticuerpos anti-PD-LI
E n p a rt ic u la r , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-P D -L l (o a n t i-B 7 H 1 ) in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, lo s a n t ic u e rp o s l la m a d o s B M S -936559 (o M D X -1105 ) , M P D L 3280 A (o R G 7446 ) y M E D 14736. E s to s a n t ic u e rp o s a n t i-P D -L l h a n p a r t ic ip a d o en n u m e ro s o s e n s a y o s c lín ic o s p a ra e l t ra ta m ie n to d e c á n c e re s , ta le s c o m o el m e la n o m a , C P C N P , c á n c e r d e o v a r io , R C C y c á n c e r d e p u lm ó n .
(a) BMS-936559 y derivados del mismo
U n a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l p a ra u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e in c lu ir B M S -936559 ( ta m b ié n c o n o c id o c o m o M D X -1105 o 12 A 4 ) o d e r iv a d o s d e l m is m o , ta le s c o m o v a r ia n te s o f r a g m e n to s d e u n ió n a a n t íg e n o d e B M S -936559. B M S -936559 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l Ig G 4 c o m p le ta m e n te h u m a n o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a P D -L 1 h u m a n o (v é a s e , p. ej., e l a n t ic u e rp o d e s ig n a d o 12 A 4 en la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 7.943.743 ). L a c a d e n a p e s a d a d e b MS-936559 t ie n e un d o m in io v a r ia b le (Vh) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 92 , c o d if ic a d a p o r la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 91. L a s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d (C D R ) d e la c a d e n a p e s a d a in c lu y e n Vh C D R 1 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 95 ); Vh C D R 2 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 96 ); y Vh C D R 3 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 97 ). L a c a d e n a lig e ra d e B M S -936559 t ie n e un d o m in io v a r ia b le (Vl) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 94 , c o d if ic a d a p o r la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 93. L a s C D R d e la c a d e n a lig e ra in c lu y e n , Vl C D R 1 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 98 ); Vl C D R 2 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 99 ); y Vl C D R 3 (e x p u e s ta en SeQ ID N O : 100 ). C u a n d o s e p ro d u c e d e fo rm a re c o m b in a n te , B M S -936559 s e c o m p o n e d e c u a tro c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s ; d o s c a d e n a s p e s a d a s id é n t ic a s y d o s c a d e n a s lig e ra s k a p p a id é n tic a s . C a d a p a r d e c a d e n a s p e s a d a y lig e ra e s tá u n id o a t ra v é s d e un e n la c e d is u lfu ro e n tre c a d e n a s .
E l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia ta m b ié n in c lu y e fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e B M S -936559 c o m p le to o v a r ia n te s d e l m is m o . U n fra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o c o n t ie n e m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y /o c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e B M S -936559 , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la m is m a p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o s u f ic ie n te p a ra u n irs e a P D -L 1. P o r lo ta n to , e l a n t ic u e rp o p u e d e s e r c u a lq u ie r fo rm a d e un a n t ic u e rp o s ie m p re q u e , c u a n d o s e p ro d u z c a o s e e n s a m b le en un a n t ic u e rp o , c o n te n g a m ín im a m e n te u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a lig e ra v a r ia b le p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D L1. P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-P D -L l p a ra su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia in c lu y e n fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e B M S -936559 q u e c o n t ie n e n m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le (Vh) c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 92 y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le (Vl) c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 94 , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e S E Q ID N O : 92 y S E Q ID N O : 94 p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D -L 1. P o r e je m p lo , lo s e je m p lo s d e fra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s in c lu y e n , p e ro n o se lim ita n a, f r a g m e n to s F ab , F ab ', F (a b ')2 , F v d e c a d e n a s e n c il la (s c F v ), Fv, d s F v , d ia c u e rp o , F d y Fd'.
E l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia ta m b ié n p u e d e in c lu ir v a r ia n te s d e B M S -936559 , o f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o q u e in c lu y e n la s v a r ia c io n e s . P o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l p u e d e in c lu ir un a n t ic u e rp o q u e c o n t ie n e u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e u n a id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e a l m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 9 ,8 % o 99 % c o n la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le e x p u e s ta en S E Q ID N O : 92 y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le q u e t ie n e un s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e u n a id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e a l m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , o 99 % c o n la c a d e n a lig e ra v a r ia b le e x p u e s ta en S E Q ID N O : 94 , d o n d e el a n t ic u e rp o v a r ia n te s e u n e d e fo rm a in m u n o e s p e c í f ic a a P D -L 1. La v a r ia c ió n p u e d e s e r un re e m p la z o d e a m in o á c id o s , in s e rc ió n o d e le c ió n d e a m in o á c id o s . En a lg u n o s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a p e s a d a . E n o tro s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a lig e ra . E n o tro s c a s o s , ta n to la c a d e n a p e s a d a c o m o la lig e ra v a r ía n en c o m p a ra c ió n c o n e l a n t ic u e rp o B M S -936559 p a re n ta l.
(b) MPDL3280A y derivados del mismo.
U n a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l p a ra su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e in c lu ir M P D L 3280 A ( ta m b ié n c o n o c id o c o m o R G 7446 ) o d e r iv a d o s d e l m is m o , ta le s c o m o v a r ia n te s o f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e M P D L 3280 A . M P D L 3280 A e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l Ig G 4 c o m p le ta m e n te h u m a n o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a P D -L 1 h u m a n o (v é a s e , p. ej., la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 8.217.149 y la P u b lic a c ió n d e P a te n te In te rn a c io n a l N ú m . W O 2013 /019906 ) . M P D L 3280 A c o n t ie n e un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a (Vh) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 114 y un d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra (Vl) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 115. El a n t ic u e rp o c o m p le to c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia d e c a d e n a p e s a d a d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 318 o 320 y u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e c a d e n a lig e ra e x p u e s ta en S E Q ID N O : 319. T a m b ié n s e in fo rm a d e q u e e l a n t ic u e rp o c o m p le to c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e c a d e n a p e s a d a e x p u e s ta en S E Q ID N O : 112 y u n a s e c u e n c ia d e c a d e n a lig e ra e x p u e s ta en S E Q ID N O : 113 (v é a s e la P u b lic a c ió n d e P a te n te In te rn a c io n a l N ú m . W O 2013019906 ) . L a s re g io n e s d e te rm in a n te s d e c o m p le m e n ta r ie d a d (C D R ) d e la c a d e n a p e s a d a in c lu y e n Vh C D R 1 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 116 ); Vh C D R 2 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 117 ); y VhCDR 3 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 1 1 8 ). L o s C D R d e la c a d e n a lig e ra in c lu y e n , Vl C D R 1 (e x p u e s ta en S E Q iD No : 119 ); Vl c Dr 2 (e x p u e s ta en S E Q ID No : 1 2 0 ); y Vl C D R 3 (e x p u e s ta en SeQ ID N O : 121 ). C u a n d o s e p ro d u c e d e fo rm a re c o m b in a n te , M P D L 3280 A e s tá fo rm a d o p o r c u a tro c a d e n a s p o lip e p tíd ic a s ; d o s c a d e n a s p e s a d a s id é n t ic a s y d o s c a d e n a s lig e ra s k a p p a id é n tic a s . C a d a p a r d e c a d e n a s p e s a d a y lig e ra e s tá u n id o a t ra v é s d e un e n la c e d is u lfu ro e n tre c a d e n a s .
E l a n t ic u e rp o a n ti-P D -L 1 en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia ta m b ié n p u e d e in c lu ir v a r ia n te s d e M P D L 3280 A , o f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e l m is m o q u e in c lu y e n la s v a r ia c io n e s . P o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l p u e d e in c lu ir un a n t ic u e rp o q u e c o n t ie n e u n a c a d e n a p e s a d a q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e u n a id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e a l m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % c o n la c a d e n a p e s a d a e x p u e s ta en S E Q ID N O : 112 , 318 o 320 y u n a c a d e n a lig e ra q u e t ie n e u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e t ie n e u n a id e n t id a d d e s e c u e n c ia d e a l m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % c o n la c a d e n a lig e ra e x p u e s ta en S E Q ID N O : 113 o 319 , d o n d e el a n t ic u e rp o v a r ia n te s e u n e d e fo rm a in m u n o e s p e c í f ic a a P D -L 1. L a v a r ia c ió n p u e d e s e r un re e m p la z o d e a m in o á c id o s , in s e rc ió n o d e le c ió n d e a m in o á c id o s . E n a lg u n o s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a p e s a d a . E n o tro s c a s o s , s o la m e n te v a r ía la c a d e n a lig e ra . E n o tro s c a s o s , ta n to la c a d e n a p e s a d a c o m o la lig e ra v a r ía n en c o m p a ra c ió n co n e l a n t ic u e rp o p a re n ta l M P D L 3280 A .
E l a n t ic u e rp o a n t i-P D -L l en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia ta m b ié n in c lu y e fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e M P D L 3280 A c o m p le to o v a r ia n te s d e l m is m o . U n fra g m e n to d e u n ió n a a n tíg e n o c o n t ie n e m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y /o u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e M P D L 3280 A , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la m is m a p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o s u f ic ie n te p a ra u n irs e a P D -L 1. P o r lo ta n to , e l a n t ic u e rp o p u e d e s e r c u a lq u ie r fo rm a d e un a n t ic u e rp o s ie m p re q u e , c u a n d o s e p ro d u z c a o s e e n s a m b le en un a n tic u e rp o , c o n te n g a m ín im a m e n te u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e la c a d e n a lig e ra v a r ia b le p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D L1. P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n ti-P D -L 1 p a ra su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia in c lu y e n fra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e M P D L 3280 A q u e c o n t ie n e n m ín im a m e n te u n a c a d e n a p e s a d a v a r ia b le (Vh) c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 114 y u n a c a d e n a lig e ra v a r ia b le (Vl) co n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 115 , o u n a p o rc ió n s u f ic ie n te d e S E Q ID N O : 114 y S E Q ID N O : 115 p a ra fo rm a r un s it io d e u n ió n a a n tíg e n o p a ra u n irs e in m u n o e s p e c í f ic a m e n te a P D -L 1. P o r e je m p lo , lo s e je m p lo s d e f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, F a b , F ab ', F (a b ')2, F v d e c a d e n a s e n c il la (s c F v ) , Fv, d s F v , d ia c u e rp o , F d y Fd '.
(c) MEDI4736 y derivados del mismo
U n a n t ic u e rp o a n ti-P D -L 1 p a ra su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e in c lu ir M E D I4736 o d e r iv a d o s d e l m is m o , ta le s c o m o v a r ia n te s o f ra g m e n to s d e u n ió n a a n tíg e n o d e M E D I4736. M E D I4736 e s un a n t ic u e rp o m o n o c lo n a l IgG 1 c o m p le ta m e n te h u m a n o q u e s e u n e e s p e c íf ic a m e n te a P D -L 1 h u m a n o (v é a s e , p. e j., e l a n t ic u e rp o d e s ig n a d o 2.7 A 4 O P T en la P u b lic a c ió n d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2013 /0034559 ) . La c a d e n a p e s a d a d e M E D I4736 t ie n e un d o m in io v a r ia b le (Vh) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 102 , c o d if ic a d a p o r la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 101. L a s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d (C D R ) d e la c a d e n a p e s a d a in c lu y e n Vh C D R 1 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 105 ); Vh C D R 2 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 106 ); y Vh C D R 3 (e x p u e s ta en S E Q ID N O : 107 ). La c a d e n a lig e ra d e M E D I4736 t ie n e un d o m in io v a r ia b le (Vl) c o n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en S E Q ID N O : 104 , c o d if ic a d a p o r la s e c u e n c ia d e nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 103. Las CDR de la cadena ligera incluyen, Vl CDR 1 (expuesta en SEQ ID NO: 108); Vl CDR 2 (expuesta en SEQ ID NO: 109); y Vl CDR 3 (expuesta en SEQ ID No : 110). Cuando se produce de forma recombinante, MEDI4736 se compone de cuatro cadenas polipeptídicas; dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras kappa idénticas. Cada par de cadenas pesada y ligera está unido a través de un enlace disulfuro entre cadenas.
El anticuerpo anti-PD-L1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también incluye fragmentos de unión a antígeno de MEDI4736 completo o variantes de los mismos. Un fragmento de unión a antígeno contiene mínimamente una cadena pesada variable y/o una cadena ligera variable de MEDI4736, o una porción suficiente de la misma para formar un sitio de unión a antígeno suficiente para unirse a PD-L1. Por lo tanto, el anticuerpo puede ser cualquier forma de un anticuerpo siempre que, cuando se produzca o se ensamble en un anticuerpo, contenga mínimamente una porción suficiente de la cadena pesada variable y una porción suficiente de la cadena ligera variable para unirse inmunoespecíficamente a PD L1. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-Ll para su uso en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria incluyen fragmentos de unión a antígeno de MEDI4736 que contienen mínimamente una cadena pesada variable (Vh) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable (Vl) con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104, o una porción suficiente de SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 104 para formar un sitio de unión a antígeno para unirse inmunoespecíficamente a PD-L1. Por ejemplo, los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fvde cadena sencilla (scFv), Fv, dsFv, diacuerpo, Fd y Fd'.
El anticuerpo anti-PD-L1 en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria también puede incluir variantes de MEDI4736, o fragmentos de unión a antígeno del mismo que incluyen las variaciones. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-Ll puede incluir un anticuerpo que contiene una cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 104, donde el anticuerpo variante se une de forma inmunoespecífica a PD-L1. La variación puede ser un reemplazo de aminoácidos, inserción o deleción de aminoácidos. En algunos casos, solamente varía la cadena pesada. En otros casos, solamente varía la cadena ligera. En otros casos, tanto la cadena pesada como la ligera varían en comparación con el anticuerpo parental MEDI4736.
c. Otras terapias inmunomoduladoras
Otros agentes inmunomoduladores que se contemplan para su uso en las combinaciones, métodos y usos proporcionados en la presente memoria incluyen agentes inhibidores dirigidos contra los receptores inhibidores, el gen 3 de activación de linfocitos (LAG3) y la proteína 3 de membrana de células T (TIM3), ligandos inhibidores tales como PD-L2 (o B7-H2), B7-H3, B7-H4 y CD25, y la enzima inmunosupresora Indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO). Los agentes dirigidos contra LAG3 (p. ej., la proteína de fusión IMP321 y múltiples mAb) y anticuerpos anti B7-H3 (p. ej., MGA271) se han caracterizado y están en uso en ensayos clínicos. Los anticuerpos o agentes inhibidores de B7-H4 y TIM3 están en desarrollo preclínico (Pardoll, Nat Rev Cáncer. 22 de Marzo de 2012; 12(4):252-264). Se pueden incluir uno o más cualesquiera de estos agentes en cualquiera de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria.
Además de los anticuerpos inhibidores que se dirigen a, e inhiben las proteínas de puntos de control inmunitario, se contemplan los anticuerpos agonistas, que son capaces de estimular una respuesta inmunitaria uniéndose a su proteína/receptor diana, para su uso en las combinaciones, métodos y usos proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, Urelumab (también conocido como BMS-663513 y anti-4-1BB) es un anticuerpo monoclonal humanizado agonista que se dirige al co-receptor CD137, que es un miembro de la familia de receptores factor de necrosis tumoral (TNF)/factor de crecimiento nervioso (NGF) y se expresa sobre células dendríticas, células dendríticas foliculares, células asesinas naturales, granulocitos y células de las paredes de los vasos sanguíneos en sitios de inflamación, con propiedades inmunoestimuladoras. Urelumab se une a, y activa específicamente las células inmunitarias que expresan CD137, estimulando una respuesta inmunitaria, en particular una respuesta de células T citotóxicas, que puede montarse contra las células tumorales cuando se administra como parte de una terapia combinada proporcionada en la presente memoria (véase, p. ej., Vinay et al., (2012) Mol Cancer Ther.
11(5): 1062-1070). También se pueden incluir otros agonistas de 4-1BB en las combinaciones proporcionadas en la presente memoria, tales como las descritas por Snell et al. En Immunol Rev. 244:197-217 (2011). OX40 (también conocido como CD134) es otro receptor inmunoestimulador, de la familia de TNF, que puede ser elegido como diana incorporando agonistas de OX40, tales como los descritos por Weinberg et al. En Immunol Rev. 244 (1): 218-231 (2011), en las combinaciones proporcionadas en la presente memoria. También se han descrito los ligandos de aptámeros que se unen a, y estimulan la señalización de 4-1BB o OX40 (Gilboa et al., Clin Cancer Res. 19(5):1054-1062) y se contemplan para su inclusión en las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria.
2. Enzimas de degradación de hialuronano y Enzimas de degradación de hialuronano conjugadas con polímero
L a te ra p ia c o m b in a d a , q u e in c lu y e c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u so , p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia c o n t ie n e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n un p o lím e ro . L a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o e s u n a q u e s e p u e d e a d m in is t r a r d e m a n e ra q u e a lc a n c e su d ia n a y, en p a rt ic u la r , a lc a n c e u n a c é lu la tu m o ra l q u e c o n te n g a H A p e r ic e lu la r e le v a d o . P o r e je m p lo , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e p u e d e a d m in is t ra r p o r in fu s ió n c o n t in u a o s e p u e d e in y e c ta r lo c a lm e n te , s e p u e d e m o d if ic a r c o n un p o lím e ro , o e s u n a q u e e s tá a g lic o s ila d a o e s tá m o d if ic a d a d e ta l m a n e ra q u e e s tá a g lic o s ila d a o te n g a u n a g lic o s ila c ió n re d u c id a . E n un e je m p lo , la s c o m p o s ic io n e s y c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s c o n t ie n e n u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , en p a r t ic u la r u n a h ia lu ro n id a s a , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le (p. e j., u n a P H 20 o P H 20 tru n c a d a ) , q u e s e h a m o d if ic a d o p o r c o n ju g a c ió n c o n u n a o m á s m o lé c u la s p o lim é r ic a s (p o lím e ro ) , p o r lo g e n e ra l p a ra a u m e n ta r la s e m i-v id a d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , p a ra p ro m o v e r e fe c to s d e t ra ta m ie n to p ro lo n g a d o /s o s te n id o en un s u je to .
E l h ia lu ro n a n o e s un c o m p o n e n te d e la m a tr iz e x t ra c e lu la r y un c o n s t itu y e n te im p o r ta n te d e la b a rre ra in te rs t ic ia l. A l c a ta l iz a r la h id ró lis is d e l h ia lu ro n a n o , la s e n z im a s q u e d e g ra d a n e l h ia lu ro n a n o d is m in u y e n la v is c o s id a d de l h ia lu ro n a n o , lo q u e a u m e n ta la p e rm e a b ilid a d d e l te j id o y a u m e n ta la v e lo c id a d d e a b s o rc ió n d e lo s líq u id o s a d m in is t ra d o s p o r v ía p a re n te ra l. L a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o la h ia lu ro n id a s a , in te r f ie re n en , y d e g ra d a n e l á c id o h ia lu ró n ic o (H A ). E l t ra ta m ie n to co n e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o re d u c e e l h ia lu ro n a n o d e m o d o q u e e l te j id o s e d e s in f la , lo s v a s o s s a n g u ín e o s s e e x p a n d e n y m á s s a n g re p u e d e f lu ir a t ra v é s d e l s it io . C o m o ta le s , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o la s h ia lu ro n id a s a s , s e h a n u t iliz a d o , p o r e je m p lo , c o m o a g e n te s d e p ro p a g a c ió n o d is p e rs ió n ju n to c o n o tro s a g e n te s , fá rm a c o s y p ro te ín a s p a ra m e jo ra r su d is p e rs ió n y a d m in is tra c ió n .
L a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o a c tú a n p a ra d e g ra d a r e l h ia lu ro n a n o al d iv id ir lo s p o lím e ro s d e h ia lu ro n a n o , q u e s e c o m p o n e n d e u n id a d e s d e d is a c á r id o s q u e s e re p ite n , á c id o D -g lu c u ró n ic o (G lc A ) y N -a c e t il-D -g lu c o s a m in a (G lc N A c ) , u n id o s e n tre s í p o r m e d io d e e n la c e s g lic o s íd ic o s p-1 ^ 4 y p -1 ^ 3 . L a s c a d e n a s d e h ia lu ro n a n o p u e d e n a lc a n z a r a p ro x im a d a m e n te 25 ,000 re p e t ic io n e s d e d is a c á r id o s o m á s d e lo n g itu d y lo s p o lím e ro s d e h ia lu ro n a n o p u e d e n a lc a n z a r un ta m a ñ o q u e v a r ía d e s d e a p ro x im a d a m e n te 5.000 h a s ta 20.000 ,000 D a in vivo. A l c a ta l iz a r la h id ró lis is d e l h ia lu ro n a n o , un c o n s t itu y e n te p r in c ip a l d e la b a rre ra in te rs t ic ia l, la s e n z im a s q u e d e g ra d a n e l h ia lu ro n a n o re d u c e n la v is c o s id a d d e l h ia lu ro n a n o , lo q u e a u m e n ta la p e rm e a b ilid a d d e l te jid o .
P o r c o n s ig u ie n te , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o in c lu y e n c u a lq u ie r e n z im a q u e te n g a la c a p a c id a d d e c a ta l iz a r la e s c is ió n d e u n a c a d e n a o p o lím e ro d e d is a c á r id o s d e h ia lu ro n a n o . E n a lg u n o s e je m p lo s , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ro m p e el e n la c e g lic o s íd ic o p-1 ^ 4 en la c a d e n a o p o lím e ro d e h ia lu ro n a n o . E n o tro s e je m p lo s , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c a ta liz a la e s c is ió n d e l e n la c e g lic o s íd ic o p -1 ^ 3 en la c a d e n a o p o lím e ro d e h ia lu ro n a n o .
L a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o in c lu y e n la s h ia lu ro n id a s a s , a s í c o m o o tra s e n z im a s ta le s c o m o la s c o n d ro it in a s a s y la s l ia s a s q u e t ie n e n la c a p a c id a d d e e s c in d ir e l h ia lu ro n a n o . A d ic io n a lm e n te , la s e n z im a s q u e d e g ra d a n e l h ia lu ro n a n o ta m b ié n in c lu y e n fo rm a s s o lu b le s d e la s m is m a s q u e s e p u e d e n e x p re s a r y s e c re ta r d e la s c é lu la s . C o m o s e d e s c r ib e a c o n t in u a c ió n , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o e x is te n en fo rm a s u n id a s a la m e m b ra n a o s o lu b le s q u e s e s e c re ta n d e la s c é lu la s . P a ra lo s f in e s d e la p re s e n te m e m o r ia , s e p ro p o rc io n a n e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s o lu b le s p a ra su u so en la s c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u s o en la p re s e n te m e m o r ia . P o r lo ta n to , c u a n d o la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o in c lu y e n un a n c la d e g lic o s il fo s fa t id i l in o s ito l (G P I) y /o e s tá n a n c la d o s a la m e m b ra n a d e o tra m a n e ra o s o n in s o lu b le s , ta le s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e p u e d e n p ro p o rc io n a r en fo rm a s o lu b le p o r t ru n c a m ie n to o d e le c ió n d e to d a o u n a p a r te d e l a n c la d e G P I p a ra c o n v e r t ir la e n z im a en s e c re ta d a y s o lu b le . P o r lo ta n to , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o in c lu y e n v a r ia n te s tru n c a d a s , p. e j., t ru n c a d a s p a ra e l im in a r to d a o u n a p a rte d e l a n c la d e G P I. L o s e je m p lo s d e ta le s h ia lu ro n id a s a s s o lu b le s in c lu y e n h ia lu ro n id a s a s P H 20 s o lu b le s , ta le s c o m o la s q u e s e e x p o n e n en la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 7.767.429 ; la s P u b lic a c io n e s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 20040268425 o U S 20100143457. V é a n s e ta m b ié n la s h ia lu ro n id a s a s P H 20 h u m a n a s s o lu b le s i lu s tra t iv a s e x p u e s ta s en c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O : 123 -158 ).
L a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ta m b ié n in c lu y e n v a r ia n te s d e c u a lq u ie r e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o c u a lq u ie r h ia lu ro n id a s a o h ia lu ro n id a s a s o lu b le , p o r e je m p lo u n a P H 20 , q u e s e a c o n o c id a p o r un e x p e rto en la té c n ic a o s e d e s c r ib a en la p re s e n te m e m o r ia . P o r e je m p lo , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p u e d e n c o n te n e r u n a o m á s v a r ia c io n e s en su s e c u e n c ia p r im a r ia , ta le s c o m o s u s t itu c io n e s , a d ic io n e s y /o d e le c io n e s d e a m in o á c id o s . U n a v a r ia n te d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o g e n e ra lm e n te m u e s tra a l m e n o s 60 % , 70 % , 80 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o m á s d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia en c o m p a ra c ió n c o n la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o q u e n o c o n t ie n e la v a r ia c ió n . S e p u e d e in c lu ir c u a lq u ie r v a r ia c ió n en la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p a ra lo s f in e s d e la p re s e n te m e m o r ia s ie m p re q u e la e n z im a c o n s e rv e la a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a , ta l c o m o a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 5 % , 10 % , 15 % , 20 % , 25 % , 30 % , 35 % , 40 % , 45 % , 50 % , 55 % , 60 % , 65 % , 70 % , 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 95 % o m á s d e la a c t iv id a d d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o q u e n o c o n t ie n e la v a r ia c ió n (s e g ú n lo m e d id o m e d ia n te e n s a y o s in v it ro y /o in v iv o b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a y d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia ) . P o r e je m p lo , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ilu s tra t iv a s , in c lu y e n d o la s q u e s e p u e d e n c o n ju g a r c o n un p o lím e ro , s o n a q u e lla s q u e m u e s tra n a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te 60 % , 70 % , 80 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o m á s d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia c o n c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O : 122 -170. C o m o s e e x p lic a a c o n tin u a c ió n , s e c o n o c e n e je m p lo s d e ta le s v a r ia n te s d e P H 20 y s e d e s c r ib e n en la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 2013 -0302275.
S e h a n p re p a ra d o y a p ro b a d o v a r ia s fo rm a s d e e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , in c lu id a s la s h ia lu ro n id a s a s , p a ra su u so te ra p é u t ic o en s u je to s , in c lu y e n d o lo s s e re s h u m a n o s . P o r e je m p lo , la s p re p a ra c io n e s d e h ia lu ro n id a s a d e r iv a d a s d e a n im a le s in c lu y e n V it ra s e ® ( IS T A P h a rm a c e u t ic a ls ) , u n a h ia lu ro n id a s a te s t ic u la r o v in a p u r if ic a d a , A m p h a d a s e ® (A m p h a s ta r P h a rm a c e u t ic a ls ) , u n a h ia lu ro n id a s a te s t ic u la r b o v in a e H y d a s e ™ (P r im a P h a rm In c .), u n a h ia lu ro n id a s a te s t ic u la r b o v in a . H y le n e x ® (H a lo z y m e T h e ra p e u t ic s ) e s u n a h ia lu ro n id a s a re c o m b in a n te h u m a n a p ro d u c id a p o r c é lu la s d e o v a r io d e h á m s te r c h in o (C H O ) m o d if ic a d a s p o r in g e n ie r ía g e n é t ic a q u e c o n t ie n e n á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a fo rm a s s o lu b le s d e P H 20 , d e s ig n a d a rH u P H 20 (v é a s e p. e j., la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 20040268425 ; la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 7.767.429 ). S e e n t ie n d e q u e c u a lq u ie r p re p a ra c ió n d e h ia lu ro n id a s a s e p u e d e u t il iz a r en la s c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u so p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia (v é a n s e , p. e j., la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2.488.564 , 2.488.565 , 2.676.139 , 2.795.529 , 2.806.815 , 2.808.362 , 5.747.027 y 5.827.721 y la P u b lic a c ió n In te rn a c io n a l P C T N ú m . W O 2005 /118799 ; la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 20040268425 ; la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m .
7.767.429 ; o c u a lq u ie ra d e la s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia ) .
A c o n t in u a c ió n s e p re s e n ta u n a d e s c r ip c ió n n o lim ita n te d e la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ilu s tra t iv a s , ta le s c o m o e n z im a s h ia lu ro n id a s a s o e n z im a s h ia lu ro n id a s a s s o lu b le s , p o r e je m p lo , P H 20 , p a ra su u s o en la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia . E n g e n e ra l, ta le s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o in c lu y e n a q u e lla s q u e e s tá n c o n ju g a d a s c o n un p o lím e ro .
a. Hialuronidasas
L a s h ia lu ro n id a s a s so n m ie m b ro s d e u n a g ra n fa m il ia d e e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . H a y tre s c la s e s g e n e ra le s d e h ia lu ro n id a s a s : h ia lu ro n id a s a s d e t ip o m a m ífe ro , h ia lu ro n id a s a s b a c te r ia n a s y h ia lu ro n id a s a s d e s a n g u iju e la s , o tro s p a rá s ito s y c ru s tá c e o s . S e c o n o c e n o tra s h ia lu ro n id a s a s , ta le s c o m o la d e a v is p a c h a q u e ta a m a r il la (S E Q ID N O : 171 y 172 ), la d e a b e ja (S E Q ID N O : 173 ), la d e a v is p a d e c a ra b la n c a (S E Q ID N O : 174 ) y la d e a v is p a p a p e le ra (S E Q ID N O : 175 ). C u a lq u ie ra d e ta le s e n z im a s s e p u e d e u t i l iz a r en la s c o m p o s ic io n e s , c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u so p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia .
i. Hialuronidasas de tipo mamífero
L a s h ia lu ro n id a s a s d e t ip o m a m ífe ro (E C 3.2.1.35 ) so n e n d o -p -N -a c e til-h e x o s a m in id a s a s q u e h id ro liz a n e l e n la c e g lic o s íd ic o (3-1 —^4 d e l h ia lu ro n a n o en d iv e rs a s lo n g itu d e s d e o lig o s a c á r id o s , c o m o te t ra s a c á r id o s y h e x a s a c á r id o s . E s ta s e n z im a s t ie n e n a c t iv id a d e s ta n to h id ro lí t ic a s c o m o d e tra n s g lic o s id a s a , y p u e d e n d e g ra d a r e l h ia lu ro n a n o y los s u lfa to s d e c o n d ro it in a (C S ), g e n e ra lm e n te C 4 -S y C 6 -S . L a s h ia lu ro n id a s a s d e e s te t ip o in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, d e la s d e v a c a (b o v in a s ) (S E Q ID N O : 163 , 164 y 176 -178 , y m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o e x p u e s ta s en S E Q ID N O : 181 -183 ), d e o v e ja (O v is A rie s ) (S E Q ID N O : 184 -187 , m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o e x p u e s ta s en S E Q ID N O : 188 -190 ), d e c e rd o (S E Q ID N O : 191 -192 ), d e ra tó n (S E Q ID N O : 165 , 193 -196 ), d e ra ta (S E Q ID N O : 166 , 198 ­ 201 ), d e c o n e jo (S E Q ID N O : 167 , 203 ), d e o ra n g u tá n (S E Q ID N O : 205 ), d e m o n o c in o m o lg o (S E Q ID N O : 162 , 206 ), d e c o b a y a (S E Q ID N O : 168 , 197 ), d e c h im p a n c é (S E Q ID N O : 159 , 160 y 204 ), d e m o n o R h e s u s (S E Q ID N O : 161 , 202 ), d e z o r ro (S E Q ID N O : 169 , 170 ) y la s h ia lu ro n id a s a s h u m a n a s (S E Q ID N O S : 122 , 217 -221 ) . L a s h ia lu ro n id a s a s a n te r io re s in c lu y e n h ia lu ro n id a s a s P H 20. A d e m á s , la h ia lu ro n id a s a B H 55 e s d e e s te t ip o c o m o se d e s c r ib e en la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 5.747.027 y 5.827.721. L a s h ia lu ro n id a s a s i lu s tra t iv a s en las c o m p o s ic io n e s , c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u s o p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia so n h ia lu ro n id a s a s s o lu b le s .
L a s h ia lu ro n id a s a s d e m a m ífe ro s e p u e d e n s u b d iv id ir en a q u e l la s q u e s o n a c t iv a s en c o n d ic io n e s n e u tra s , p re d o m in a n te m e n te e n c o n tra d a s en e x tra c to s d e te s t íc u lo s , y a c t iv a s en c o n d ic io n e s á c id a s , p re d o m in a n te m e n te en ó rg a n o s ta le s c o m o el h íg a d o . L a s h ia lu ro n id a s a s a c t iv a s en c o n d ic io n e s n e u tra s ilu s tra t iv a s in c lu y e n P H 20 , q u e in c lu y e , p e ro n o s e lim ita a, P H 20 d e r iv a d a d e d ife re n te s e s p e c ie s , ta le s c o m o o v in a (S E Q ID N O : 185 -187 ), b o v in a (SeQ ID N O : 177 , 178 ) y h u m a n a (S E Q ID N O : 217 ). ). L a P H 20 h u m a n a ( ta m b ié n c o n o c id a c o m o S P A M 1 o p ro te ín a d e la s u p e r f ic ie d e l e s p e rm a to z o id e P H 20 ), g e n e ra lm e n te s e a n c la a la m e m b ra n a p la s m á tic a a t ra v é s d e un a n c la d e g lic o s ilfo s fa t id il in o s ito l (G P I). É s te e s tá n a tu ra lm e n te in v o lu c ra d o en la a d h e s ió n d e e s p e rm a to z o id e -ó v u lo y a y u d a a la p e n e tra c ió n p o r e l e s p e rm a to z o id e d e la c a p a d e c é lu la s d e l c ú m u lo m e d ia n te la d ig e s t ió n de l á c id o h ia lu ró n ic o .
A d e m á s d e la P H 20 h u m a n a (o S P A M 1 ), s e h a n id e n t if ic a d o c in c o g e n e s s im ila re s a la h ia lu ro n id a s a en e l g e n o m a h u m a n o , H Y A L 1 , H Y A L 2 , HyAl3, H Y A L 4 y H Y A L P 1. H Y A L P 1 e s un p s e u d o g é n , y n o s e h a d e m o s tra d o q u e H Y A L 3 (S E Q ID N O : 220 ) p o s e a a c t iv id a d e n z im á t ic a h a c ia n in g ú n s u s tra to c o n o c id o . H Y A L 4 (p o lip é p t id o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 221 ) e s u n a c o n d ro it in a s a y p re s e n ta p o c a a c t iv id a d h a c ia e l h ia lu ro n a n o . H Y A L 1 ( p o lip é p t id o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 218 ) e s e l e n z im a a c t iv o en c o n d ic io n e s á c id a s p ro to t íp ic a y P H 20 (p o lip é p t id o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 217 ) e s la e n z im a a c t iv a en c o n d ic io n e s n e u tra s p ro to típ ic a . L a s h ia lu ro n id a s a s a c t iv a s en c o n d ic io n e s á c id a s , ta le s c o m o H Y A L 1 y H Y A L 2 (p o lip é p t id o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 219 ) g e n e ra lm e n te c a re c e n d e a c t iv id a d c a ta lí t ic a a pH n e u tro (e s d e c ir , pH 7 ). P o r e je m p lo , H Y A L 1 t ie n e p o c a a c t iv id a d c a ta lí t ic a in v itro p o r e n c im a d e pH 4 ,5 (F ro s t e t a l. (1997 ) A n a l. B io c h e m . 251 : 263 -269 ). H Y A L 2 es u n a e n z im a a c t iv a en c o n d ic io n e s á c id a c o n u n a a c t iv id a d e s p e c íf ic a m u y b a ja in vitro. L a s e n z im a s s im ila re s a la h ia lu ro n id a s a ta m b ié n s e p u e d e n c a ra c te r iz a r p o r a q u e lla s q u e g e n e ra lm e n te s e a n c la n a la m e m b ra n a p la s m á tic a a t ra v é s d e un a n c la d e g l ic o s ilfo s fa t id il in o s ito l (G P I) c o m o la H Y A L 2 h u m a n a y la P H 20 h u m a n a (D a n i lk o v itc h -M ia g k o v a e t a l. (2003 ) P ro c N a tl A c a d S c i U S A 100 (8 ) :4580 -4585 ) , y a q u e lla s q u e s o n g e n e ra lm e n te s o lu b le s ta le s c o m o H Y A L 1 h u m a n a (F ro s t e t a l. (1997 ) B io c h e m B io p h y s R e s C o m m u n . 236 (1 ) :10 -15 ) .
PH20
P H 20 , a l ig u a l q u e o tra s h ia lu ro n id a s a s d e m a m ífe ro , e s u n a e n d o -p -N -a c e t i l- h e x o s a m in id a s a q u e h id ro liz a e l e n la c e g lic o s íd ic o p 1 —^4 d e l á c id o h ia lu ró n ic o en v a r ia s lo n g itu d e s d e o lig o s a c á r id o s , ta le s c o m o te t ra s a c á r id o s y h e x a s a c á r id o s . T ie n e a c t iv id a d e s ta n to h id ro lí t ic a s c o m o d e t r a n s g lic o s id a s a y p u e d e d e g ra d a r e l á c id o h ia lu ró n ic o y lo s s u lfa to s d e c o n d ro it in a , ta le s c o m o el C 4 -S y e l C 6 -S . P H 20 p a rt ic ip a n a tu ra lm e n te en la a d h e re n c ia e s p e rm a to z o id e -ó v u lo y a y u d a a la p e n e tra c ió n p o r e l e s p e rm a to z o id e d e la c a p a d e c é lu la s d e l c ú m u lo m e d ia n te la d ig e s t ió n d e l á c id o h ia lu ró n ic o . La P H 20 s e e n c u e n tra lo c a liz a d a s o b re la s u p e r f ic ie d e l e s p e rm a to z o id e y en el a c ro s o m a d e r iv a d o d e l l is o s o m a , d o n d e s e u n e a la m e m b ra n a a c ro s ó m ic a in te rn a . L a p H 20 d e la m e m b ra n a p la s m á tic a t ie n e a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a s o la m e n te a pH n e u tro , m ie n tra s q u e la P H 20 d e la m e m b ra n a a c ro s ó m ic a in te rn a t ie n e a c t iv id a d ta n to a pH n e u tro c o m o á c id o . A d e m á s d e s e r u n a h ia lu ro n id a s a , la P H 20 ta m b ié n p a re c e s e r un re c e p to r p a ra la s e ñ a liz a c ió n c e lu la r in d u c id a p o r H A , y un re c e p to r p a ra la z o n a p e lú c id a q u e ro d e a a l o v o c ito .
L a s p ro te ín a s P H 20 ilu s tra t iv a s , in c lu id a s la s fo rm a s p re c u rs o ra s y m a d u ra s , in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, p o lip é p tid o h u m a n o (p o lip é p t id o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 217 , p o lip é p tid o m a d u ro e x p u e s to en S E Q ID N O : 122 ), p o lip é p tid o s P H 20 d e c h im p a n c é (S E Q ID N O : 159, 160 y 204 ), d e m o n o R h e s u s (S E Q ID N O : 161 , 202 ) b o v in o (S E Q ID N O : 164 ,163 , 177 , 178 ), d e c o n e jo (S E Q ID N O : 167 , 203 ), P H 20 o v in o (S E Q ID N O : 185 -187 ), d e m o n o C y n o m o lg u s (S E Q ID N O : 162 , 206 ), d e c o b a y a (S E Q ID N O : 168 , 197 ), d e ra ta (S E Q ID N O : 166 , 201 ), d e ra tó n (S E Q ID N O : 165 , 196 ) y d e z o r ro (S E Q ID N O : 169 , 170 ).
L a P H 20 b o v in o e s un p o lip é p tid o p re c u rs o r d e 553 a m in o á c id o s (S E Q ID N O : 177 ). El a lin e a m ie n to d e la P H 20 b o v in a c o n la P H 20 h u m a n a s o la m e n te m u e s tra u n a h o m o lo g ía d é b il, c o n m ú lt ip le s h u e c o s e x is te n te s d e s d e el a m in o á c id o 470 h a s ta lo s re s p e c t iv o s e x tre m o s c a rb o x i d e b id o a la a u s e n c ia d e un a n c la d e G P I en e l p o lip é p tid o b o v in o (v é a s e p. ej., F ro s t (2007 ) E x p e r t O p in . D ru g . D e liv . 4 :427 -440 ) . D e h e c h o , la s a n c la s d e G P I c la ra s n o se p ro n o s t ic a n en m u c h a s o tra s e s p e c ie s d e P H 20 a d e m á s d e lo s s e re s h u m a n o s . P o r lo ta n to , lo s p o lip é p tid o s P H 20 p ro d u c id o s a p a r t ir d e ó v id o s y b ó v id o s e x is te n n a tu ra lm e n te c o m o fo rm a s s o lu b le s . A u n q u e la P H 20 b o v in a se e n c u e n tra m u y p o c o a d h e r id a a la m e m b ra n a p la s m á tic a , n o e s tá a n c la d a a t ra v é s d e un a n c la s e n s ib le a la fo s fo l ip a s a (L a la n c e tte e t a l. (2001 ) B io l R e p ro d . 65 (2 ) :628 -636 ) . E s ta c a ra c te r ís t ic a ú n ic a d e la h ia lu ro n id a s a b o v in a h a p e rm it id o e l u s o d e la e n z im a h ia lu ro n id a s a d e te s t íc u lo b o v in o c o m o un e x tra c to p a ra u s o c lín ic o (W y d a s e ® , H y a la s e ® ).
E l t ra n s c r ito d e l A R N m d e P H 20 h u m a n a s e t ra d u c e n o rm a lm e n te p a ra g e n e ra r un p o lip é p tid o p re c u rs o r d e 509 a m in o á c id o s (S E Q ID N O : 217 ) q u e c o n t ie n e u n a s e c u e n c ia s e ñ a l d e 35 a m in o á c id o s en e l e x t re m o N (p o s ic io n e s d e re s id u o s d e a m in o á c id o s 1 -35 ) y u n a s e c u e n c ia s e ñ a l d e a n c la je a l a n c la d e g lic o s il fo s fa t id i l in o s ito l d e 19 a m in o á c id o s (G P I) en e l e x tre m o C (p o s ic io n e s d e re s id u o s d e a m in o á c id o s 491 -509 ) . L a P H 20 m a d u ra , p o r lo ta n to , e s un p o lip é p tid o d e 474 a m in o á c id o s e x p u e s to en S E Q ID N O : 122. D e s p u é s d e l t ra n s p o r te d e l p o lip é p tid o p re c u rs o r a l R E y la e lim in a c ió n d e l p é p tid o s e ñ a l, e l p é p tid o s e ñ a l d e a n c la je a G P I C - te rm in a l s e e s c in d e p a ra fa c i l i ta r e l a n c la je c o v a le n te d e un a n c la d e G P I a l a m in o á c id o C - te rm in a l re c ié n fo rm a d o en la p o s ic ió n de l a m in o á c id o c o r re s p o n d ie n te a la p o s ic ió n 490 d e l p o lip é p tid o p re c u rs o r e x p u e s to en S E Q ID N O : 217. A s í, se p ro d u c e un p o lip é p tid o m a d u ro a n c la d o a G P I d e 474 a m in o á c id o s c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s , e x p u e s ta en S E Q ID N O : 122.
L a P H 20 h u m a n o m u e s tra a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a a pH n e u tro y á c id o . E n un a s p e c to , la P H 20 h u m a n a e s la h ia lu ro n id a s a a c t iv a en c o n d ic io n e s n e u tra s p ro to t íp ic a q u e g e n e ra lm e n te s e f i ja a la m e m b ra n a p la s m á tic a a t ra v é s d e un a n c la d e G P I. E n o tro a s p e c to , la P H 20 s e e x p re s a s o b re la m e m b ra n a a c ro s ó m ic a in te rn a d o n d e t ie n e a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a a pH n e u tro y á c id o . P a re c e q u e P H 20 c o n t ie n e d o s s it io s c a ta lí t ic o s en d is t in ta s re g io n e s de l p o lip é p tid o : la s re g io n e s P é p tid o 1 y P é p t id o 3 (C h e r r e t a l., (2001 ) M a tr ix B io lo g y 20 :515 -525 ) . L a e v id e n c ia in d ic a q u e la re g ió n d e l P é p t id o 1 d e P H 20 , q u e c o r re s p o n d e a la s p o s ic io n e s d e a m in o á c id o s 107 -137 d e l p o lip é p tid o m a d u ro e x p u e s to en S E Q ID N O : 122 y la s p o s ic io n e s 142 -172 d e l p o lip é p tid o p re c u rs o r e x p u e s to en s E q ID N O : 217 , e s n e c e s a r ia p a ra la a c t iv id a d e n z im á t ic a a pH n e u tro . L o s a m in o á c id o s en la s p o s ic io n e s 111 y 113 (c o r re s p o n d ie n te s a l p o lip é p tid o P H 20 m a d u ro e x p u e s to en S E Q ID N O : 122 ) d e n tro d e e s ta re g ió n p a re c e n s e r im p o r ta n te s p a ra la a c t iv id a d , y a q u e la m u ta g é n e s is p o r re e m p la z o d e a m in o á c id o s p ro d u c e c o m o re s u lta d o p o lip é p tid o s d e P H 20 c o n un 3 % d e a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a o c o n a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a no d e te c ta b le , respectivamente, en comparación con la PH20 de tipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814). La región del Péptido 3, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 242-262 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 122, y las posiciones 277-297 del polipéptido precursor expuesto en SEQ iD NO: 217, parece ser importante para la actividad enzimática a pH ácido. Dentro de esta región, los aminoácidos en las posiciones 249 y 252 del polipéptido de PH20 maduro parecen ser esenciales para la actividad, y la mutagénesis de uno de los dos produce como resultado un polipéptido esencialmente desprovisto de actividad (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
Además de los sitios catalíticos, la PH20 también contiene un sitio de unión a hialuronano. La evidencia experimental indica que este sitio está ubicado en la región del Péptido 2, que corresponde a las posiciones de aminoácidos 205-235 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 217 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 122. Esta región está altamente conservada entre las hialuronidasas y es similar al motivo de unión a la heparina. La mutación del residuo de arginina en la posición 176 (correspondiente al polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 122) a un a glicina da como resultado un polipéptido con solo aproximadamente 1% de la actividad hialuronidasa del polipéptido de tipo salvaje (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
Hay siete sitios potenciales de glicosilación, incluidos los sitios de glicosilación unidos a N y O, en PH20 humana en N82, N166, N235, N254, N368, N393 y S490 del polipéptido ilustrado en SEQ ID NO: 217. Debido a que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 217 parecen contener el dominio de hialuronidasa PH20 humano mínimamente activo, el sitio de glicosilación en S490 no es necesario para la actividad una hialuronidasa adecuada. Hay seis enlaces disulfuro en la PH20 humana. Dos enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipéptido ilustrado en SEQ ID NO: 217 (correspondiente a los residuos C25 y C316, y C189 y C203 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 122 respectivamente). Se forman cuatro enlaces disulfuro adicionales entre los residuos de cisteína C376 y C387; entre C381 y C435; entre C437 y C443; y entre C458 y C464 del polipéptido ilustrado en SEQ ID NO: 217 (correspondiente a los residuos C341 y c 352; entre C346 y C400; entre C402 y c408; y entre C423 y C429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 122, respectivamente). ii. Hialuronidasa bacteriana
Las hialuronidasas bacterianas (EC 4.2.2.1 o EC 4.2.99.1) degradan el hialuronano y, en diversos grados, los sulfatos de condroitina y los sulfatos de dermatán. Las hialuronano liasas aisladas de bacterias difieren de las hialuronidasas (de otras fuentes, p. ej., hialuronoglucosaminidasas, EC 3.2.1.35) por su modo de acción. Son endop-N-acetilhexosaminidasas que catalizan una reacción de eliminación, en lugar de la hidrólisis, del enlace p1 ^ 4-glicosídico entre la N-acetil-beta-D-glucosamina y los residuos de ácido D-glucurónico en el hialuronano, produciendo tetra- y hexasacáridos de 3-(4-deoxi-p-D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina, y productos finales disacáridos. La reacción da como resultado la formación de oligosacáridos con residuos de ácido hexurónico insaturados en sus extremos no reductores.
Las hialuronidasas ilustrativas de bacterias para su uso en las composiciones, combinaciones y combinaciones para su uso proporcionadas incluyen, pero no se limitan a, enzimas de degradación de hialuronano en microorganismos, incluyendo cepas de A rth ro b a c te r, B de llov ib rio , C los trid ium , M ic ro coccus , S trep to coccus , P ep tococcu s , P ro p io n ib a c te riu m , B ac te ro id es , y S trep to m yces . Los ejemplos particulares de tales cepas y enzimas incluyen, pero no se limitan a A rth ro b a c te r sp. (cepa FB24) (SEQ ID No : 222), B de llo v ib rio b a c te r io v o ru s (SEQ ID No : 223), P ro p io n ib a c te r iu m a cn e s (SEQ ID nO: 224), S tre p to co ccu s a g a la c tia e ((SEQ ID NO: 225); 18RS21 (SEQ ID NO: 226); serotipo la (SEQ ID NO: 227); y serotipo III (SEQ ID NO: 228)), S ta p h y lo co ccu s a u reu s (cepa Co l (SEQ ID NO: 229); cepa MRSA252 (SEQ ID NO: 230, 231); cepa MSSA476 (SEQ ID NO: 232); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO: 233); cepa bovina RF122 (SEQ ID NO: 234, 235) y cepa USA300 (SEQ ID NO: 236)), S tre p to co ccu s n e u m o n ia e ((SEQ ID NO: 237); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO: 238) y serotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO: 239)), S tre p to co ccu s p y o g e n e s (serotipo M1 (SEQ ID NO: 240); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO: 241); serotipo M4, cepa MGAS10750 (SEQ ID NO: 242); serotipo M6 (SEQ ID NO: 243); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NO: 244, 245); serotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO: 246) y serotipo M28 (SEQ ID NO: 247)); S tre p to co ccu s su is (SEQ ID NO: 248-250); Vibrio fis c h e ri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 251)), y la enzima hialuronidasa de S tre p to m yce s h y a lu ro n o ly tic u s , que es específica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina ni el sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607).
iii. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos.
Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) son endo-p-glucuronidasas que generan productos finales de tetra- y hexasacáridos. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de los enlaces 1 ^ 3 entre los residuos de p-D-glucuronato y N-acetil-D-glucosamina en hialuronato. Las hialuronidasas ilustrativas de sanguijuelas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de Hirudinidae (p. ej., H iru d o m ed ic in a lis ), Erpobdellidae (p. ej., N e p h e lo p s is o b s c u ra y E rpo bd e lla p u n c ta ta ,), Glossiphoniidae (p. ej., D e sse ro b d e lla p ic ta , H e lob de lla s tagna lis , G lo ss ip h o n ia com p la n a ta , P la co b d e lla o rn a ta y T he ro m yzon sp .) y Haemopidae (H a em op is m a rm o ra ta ) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 124 (3):319-26). Una hialuronidasa ilustrativa de una bacteria que tiene el mismo mecanismo de acción que la hialuronidasa de la sanguijuela es la de la cianobacteria, S yn e ch o co ccu s sp.; cepa RCC307 (SEQ ID NO: 252).
b. Otras enzimas de degradación de hialuronano
Además de la familia de las hialuronidasas, en la presente memoria se describen otras enzimas de degradación de hialuronano. Por ejemplo, se pueden emplear enzimas, incluidas condroitinasas y liasas particulares, que tienen la capacidad de escindir hialuronano. Las condroitinasas ilustrativas que pueden degradar el hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa (también conocida como condroitina sulfato liasa o condroitina sulfato eliminasa) y condroitina C liasa. Los métodos para la producción y purificación de tales enzimas para su uso en las composiciones, combinaciones y métodos proporcionados son conocidos en la técnica (p. ej., Patente de Estados Unidos Núm. 6.054.569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243 (7): 1523-1535; Yang et al. (1985) J. Biol. Chem. 160 (30): 1849-1857).
La condroitina ABC liasa contiene dos enzimas, condroitin-sulfato-ABC endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitin-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol Chem. 272 (14):9123-30), que degradan una variedad de glicosaminoglicanos de tipo sulfato de condroitina y sulfato de dermatán. El sulfato de condroitina, el proteoglicano sulfato de condroitina y el sulfato de dermatán son los sustratos preferidos para la sulfato de condroitina-ABC endoliasa, pero la enzima también puede actuar sobre el hialuronano a una tasa menor. La sulfato de condroitina-ABC endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicanos de tipo sulfato de condroitina y sulfato de dermatán, produciendo una mezcla de oligosacáridos A4-insaturados de diferentes tamaños que finalmente se degradan a tetra- y disacáridos A4 insaturados. El sulfato de condroitina-ABC exoliasa tiene la misma especificidad de sustrato, pero elimina los residuos de disacáridos de los extremos no reductores de ambos sulfatos de condroitina poliméricos y sus fragmentos oligosacáridos producidos por la sulfato de condroitina-ABC endoliasa (Hamai, A. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130). Las sulfato de condroitina-ABC endoliasas de y las sulfato de condroitina-ABC exoliasas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, las de P ro te u s vu lga ris y F la v o b a c te r iu m h e p a rin u m (la sulfato de condroitina-ABC endoliasa de P ro te u s vu lga ris se expone en SEQ ID NO: 253 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotecnol. 41(1):39-46).
La condroitina AC liasa (EC 4.2.2.5) es activa sobre los sulfatos de condroitina A y C, la condroitina y el ácido hialurónico, pero no es activa sobre el sulfato de dermatán (sulfato de condroitina B). Las enzimas condroitinasa AC ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de F la vo b a c te riu m h e p a rin u m y V ic tiva llis vadens is , expuestas en SEQ ID NOS: 254 y 255, respectivamente, y A rth ro b a c te r a u re sce n s (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviewal in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
La condroitinasa C escinde el sulfato de condroitina C, que produce tetrasacáridos más un disacárido 6-sulfatado insaturado (delta Di-6S). También escinde el ácido hialurónico produciendo disacáridos no sulfatados insaturados (delta Di-OS). Las enzimas condroitinasa C ilustrativas de bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de S tre p to co ccu s y F la vo b a c te riu m (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48 (2): 121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251: 1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262: 127-133).
c. Enzimas solubles de degradación de hialuronano (p. ej., PH20 soluble)
En las composiciones, combinaciones y combinaciones para su uso en la presente memoria se proporcionan enzimas solubles de degradación de hialuronano, incluidas las hialuronidasas solubles. Las enzimas de degradación de hialuronano solubles incluyen cualquier enzima de degradación de hialuronano que sea secretada de las células (p. ej., célula CHO) tras la expresión y exista en forma soluble. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas solubles, incluyendo hialuronidasas solubles animales no humanas, y hialuronidasas humanas, tales como Hyal1, PH20 bovina, p H20 ovina, y cualquier enzima de degradación de hialuronano que se haya modificado para que sea soluble, y variantes alélicas de las mismos y otras variantes de las mismas. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano que contienen un ancla de GPI se pueden hacer solubles mediante el truncamiento C-terminal y la eliminación de toda o una parte del ancla de GPI. En un ejemplo, una hialuronidasa soluble es una PH20 humana truncada en el extremo C en la que la hialuronidasa PH20 humana, que normalmente está anclada a la membrana a través de un ancla de GPI, está truncada y carece de toda o una parte del ancla de GPI en el extremo C-terminal.
Las enzimas de degradación de hialuronano solubles también incluyen hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. Dependiendo de factores, tales como, pero no limitados a, el nivel deseado de actividad de la enzima después de la administración y/o el sitio de administración, se pueden seleccionar hialuronidasas activas en condiciones neutras y activas en condiciones ácidas. En un ejemplo particular, la enzima de degradación de hialuronano para su uso en las composiciones, combinaciones y combinaciones para su uso en la presente memoria es una hialuronidasa activa en condiciones neutras, soluble.
Tales formas solubles incluyen formas truncadas de las mismas que carecen de toda o una parte del ancla de GPI C-terminal, siempre que la hialuronidasa sea soluble (secretada tras la expresión) y conserve la actividad de la hialuronidasa (véanse, p. ej., también las Patentes de Estados Unidos Núm. 8.431.380 y 7.767.429). Tales formas también suelen ser formas maduras que, cuando se expresan en una célula, carecen del péptido señal. Las hialuronidasas ilustrativas incluyen formas solubles de una PH20 de cualquier especie, tal como una forma soluble de una PH20 de cualquiera de SEQ ID NO: 122, 159, 160, 161-170, 177, 178, 185-187, 196, 197, 203, 206, 201, 202, 204 y 217. También se incluyen entre las hialuronidasas solubles las formas solubles de variantes de cualquiera de las PH20 de cualquier especie expuesta en SEQ ID NO: 122, 159, 160, 161-170, 177, 178, 185-187, 196, 197, 203, 206, 201, 202, 204, 217, o formas truncadas de las mismas, que muestran actividad hialuronidasa. Las variantes incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 122, 159, 160, 161-170, 177, 178, 185-187, 196, 197, 203, 206, 201, 202, 204 o 217, y las formas maduras (p. ej., que carecen de la secuencia señal) o solubles truncadas de la misma. Las variantes de aminoácidos incluyen mutaciones conservativas y no conservativas. Se entiende que los residuos que son importantes o que se requieren de otro modo para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera de los descritos anteriormente o conocidos por los expertos en la técnica, son generalmente invariables y no se pueden cambiar. Estos incluyen, por ejemplo, residuos de sitios activos. Así, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 111, 113 y 176 (correspondientes a los residuos del polipéptido de PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO: 122) de un polipéptido de PH20 humano, o una forma soluble del mismo, son generalmente invariables y no están alterados. Otros residuos que confieren glicosilación y formación de enlaces disulfuro requeridos para un plegamiento adecuado también pueden ser invariables. Las formas modificadas de las enzimas PH20 solubles también son conocidas (véase, la Publicación de Estados Unidos Núm.US-2013-0302275), que incluyen enzimas PH20 que tienen una estabilidad mejorada en condiciones de desnaturalización, tales como aquellas que incluyen el reemplazo del residuo correspondiente a 204 (de la PH20 humana completa) por prolina (P).
En algunos casos, la enzima de degradación de hialuronano soluble está normalmente anclada a GPI (tal como, por ejemplo, la PH20 humana) y se vuelve soluble por truncamiento en el extremo C-terminal. Tal truncamiento puede eliminar toda la secuencia señal de anclaje al ancla de GPI, o puede eliminar solamente parte de la secuencia de señal de anclaje al ancla de GPI. El polipéptido resultante, sin embargo, es soluble. En los casos en que la enzima de degradación de hialuronano soluble conserva una parte de la secuencia señal de anclaje al ancla GPI, se pueden conservar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más residuos de aminoácidos en la secuencia de señal de anclaje al ancla GPI, siempre que el polipéptido sea soluble. Los polipéptidos que contienen uno o más aminoácidos del ancla de GPI se denominan enzimas de degradación de hialuronano solubles extendidas. Un experto en la técnica puede determinar si un polipéptido está anclado a GPI usando métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso de algoritmos conocidos para predecir la presencia y ubicación de la secuencia señal de anclaje al ancla de GPI y el sitio w, y la realización de análisis de solubilidad antes y después de la digestión con fosfolipasa C específica de fosfatdilinositol (PI-PLC)) o D (PI-PLD).
Las enzimas de degradación de hialuronano solubles extendidas se pueden producir realizando truncamientos C-terminales en cualquier enzima de degradación de hialuronano naturalmente anclada a GPI de modo que el polipéptido resultante sea soluble y contenga uno o más residuos de aminoácido de la secuencia señal de anclaje al ancla de GPI (véase p. ej., la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada Núm. US20100143457). Las enzimas de degradación de hialuronano solubles extendidas ilustrativas que están truncadas en el extremo C pero que conservan una parte de la secuencia señal de anclaje el ancla GPI incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos de PH20 solubles extendidos (esPH20) de primate, tales como, por ejemplo, polipéptidos de esPH20 de ser humano y de chimpancé. Por ejemplo, los polipéptidos de esPH20 se pueden elaborar mediante el truncamiento C-terminal de cualquiera de los polipéptidos maduros o precursores expuestos en SEQ ID NO: 122, 179, 180 o 204, o 217, u otras variantes de los mismos, incluyendo su fragmento activo, en donde el polipéptido resultante es soluble y conserva uno o más residuos de aminoácidos de la secuencia de señal de anclaje al ancla de GPI. Las variantes incluyen polipéptidos que tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 122, 179, 180 o 204, o 217 que conservan la actividad hialuronidasa. Los polipéptidos de esPH20 proporcionados en la presente memoria se pueden truncar en el extremo C en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos en comparación con el polipéptido de tipo salvaje, tal como un polipéptido con un conjunto de secuencias expuesto en SEQ ID NO: 122, 179, 180 o 204, o 217, siempre que el polipéptido de esPH20 resultante sea soluble y conserve 1 o más residuos de aminoácido de la secuencia de señal de anclaje unión al ancla de GPI.
Típicamente, para uso en las composiciones, combinaciones y combinaciones para su uso en la presente memoria, se utiliza una enzima de degradación de hialuronano humana soluble, tal como una PH20 humana soluble. Aunque se pueden utilizar enzimas de degradación de hialuronano, tales como el PH20, de otros animales, tales preparaciones son potencialmente inmunogénicas, ya que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes demuestra una sensibilización previa secundaria a los alimentos ingeridos, y puesto que se trata de proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización posterior. Por lo tanto, las preparaciones no humanas pueden no ser adecuadas para uso crónico. Si se desean preparaciones no humanas, se contempla en la presente memoria que tales polipéptidos se puedan preparar para que tengan una inmunogenicidad reducida. Tales modificaciones están dentro del nivel de un experto en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, la eliminación y/o sustitución de uno o más epítopos antigénicos en la molécula.
Las enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo las hialuronidasas (p. ej., PH20), utilizadas en las combinaciones para su uso en la presente memoria se pueden producir de forma recombinante o se pueden purificar o purificar parcialmente a partir de fuentes naturales, tales como, por ejemplo, a partir de extractos de testículo. Los métodos para la producción de proteínas recombinantes, incluidas las enzimas de degradación de hialuronano recombinantes, se proporcionan en otras partes de la presente memoria y son bien conocidos en la técnica.
i. PH20 humana soluble
La PH20 humana soluble es un ejemplo de una hialuronidasa soluble. Se han producido formas solubles de PH20 humana recombinante y se pueden utilizar en las composiciones, combinaciones y combinaciones para su uso descrito en la presente memoria. La producción de tales formas solubles de PH20 se describe en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos Publicadas US20040268425; US20050260186, US20060104968, US20100143457 y en la Publicación internacional PCT Núm. WO2009111066. Por ejemplo, los polipéptidos de PH20 solubles incluyen polipéptidos variantes truncados en el extremo C que incluyen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 217 o 122, o tienen al menos 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97% o 98% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos incluida en SEQ ID NO: 217 o 122, conservan la actividad de hialuronidasa y son solubles. Entre estos polipéptidos se incluyen los polipéptidos de PH20 solubles que carecen completamente de toda o una parte de la secuencia señal de anclaje al ancla de GPI.
También se incluyen los polipéptidos de PH20 solubles extendidos (esPH20) que contienen al menos un aminoácido del ancla de GPI. Por lo tanto, en lugar de tener un ancla de GPI covalentemente anclada al extremo C de la proteína en el RE y estar anclados a la lámina extracelular de la membrana plasmática, estos polipéptidos se secretan y son solubles. Los polipéptidos de PH20 truncados en el extremo C pueden estar truncados en el extremo C en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más aminoácidos en comparación con el polipéptido de tipo salvaje completo, tal como un polipéptido de tipo salvaje completo con una secuencia expuesta en SEQ ID NO: 217 o 122, o variantes alélicas o de especies u otras variantes de los mismos.
Las formas solubles de la PH20 humana generalmente incluyen aquellas que contienen los aminoácidos 36-464 expuestos en SEQ ID NO: 217. Por ejemplo, las formas solubles incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos truncados C-terminalmente de la PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 217 que tiene un residuo de aminoácido C-terminal 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 477, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486,487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 217, las formas maduras de los mismos o los polipéptidos que muestran al menos 85% de identidad con los mismos. Por ejemplo, cuando se expresa en células de mamíferos, la secuencia señal N-terminal de 35 aminoácidos se escinde durante el procesamiento, y la forma madura de la proteína se produce y se puede secretar. De este modo, los polipéptidos solubles maduros contienen los aminoácidos 36 a 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 477, 477, 478, 479, 480, 481, 482 y 483 de SEQ ID NO: 217. La Tabla 4 proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos de PH20 solubles truncados en el extremo C, que incluyen precursores y formas maduras de los mismos. En la Tabla 4 a continuación, se proporcionan la longitud (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y el identificador de secuencia (SEQ ID NO) en la que se exponen las secuencias de aminoácidos ilustrativas de los polipéptidos precursores y maduros de las proteínas PH20 truncadas en el extremo C. El polipéptido de PH20 de tipo salvaje también se incluye en la Tabla 4 para su comparación. En particular, las hialuronidasas solubles ilustrativas son polipéptidos de PH20 humanos solubles que tienen una longitud de 442, 443, 444, 445, 446 o 447 aminoácidos, tales como los que se exponen en SEQ ID NO: 123-128, o variantes alélicas o de especies u otras variantes de los mismos.
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P o r e je m p lo , la s fo rm a s s o lu b le s d e P H 20 in c lu y e n , p o r e je m p lo , p o lip é p tid o s q u e t ie n e n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O : 123 -158 , o u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e m u e s tra al m e n o s 85 % , 86 % , 87 % , 88 % , 89 % , 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia c o n u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O S : 123 -158 y s o n s o lu b le s y c o n s e rv a n la a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a .
L a s v a r ia n te s d e P H 20 , ta le s c o m o u n a P H 20 h u m a n a (p. e j., u n a P H 20 h u m a n a s o lu b le ) s o n c o n o c id a s y se d e s c r ib e n en la S o lic itu d P u b lic a d a d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 2013 /0302275. C u a lq u ie r v a r ia n te d e P H 20 d e s c r ita en la S o lic itu d P u b lic a d a d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S 2013 /0302275 s e p u e d e in c o rp o ra r a un p o lip é p tid o d e P H 20 s o lu b le p a ra su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia . T a le s v a r ia n te s in c lu y e n a q u e l la s q u e m u e s tra n u n a m a y o r re s is te n c ia a la s c o n d ic io n e s d e d e s n a tu ra liz a c ió n (p. e j., un c o n s e rv a n te fe n ó lic o ) o u n a m a y o r a c t iv id a d . U n e je m p lo d e ta l p o lip é p tid o e s u n a P H 20 h u m a n a s o lu b le q u e c o n t ie n e e l re e m p la z o d e a m in o á c id o F 204 P , V 58 K o V58r c o n re fe re n c ia a la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s e x p u e s ta en la P H 20 h u m a n a c o m p le ta e x p u e s ta en S E Q ID N O : 122 o en u n a P H 20 h u m a n a s o lu b le e x p u e s ta en c u a lq u ie ra d e S E Q ID N O : 123 ­ 158.
G e n e ra lm e n te , la s fo rm a s s o lu b le s d e P H 20 s e p ro d u c e n u t il iz a n d o s is te m a s d e e x p re s ió n d e p ro te ín a s q u e fa c il ita n la c o r re c ta g lic o s ila c ió n en N p a ra a s e g u ra r q u e e l p o lip é p tid o c o n s e rv e la a c t iv id a d , y a q u e la g lic o s ila c ió n es im p o r ta n te p a ra la a c t iv id a d c a ta lí t ic a y la e s ta b il id a d d e la s h ia lu ro n id a s a s . T a le s c é lu la s in c lu y e n , p o r e je m p lo , c é lu la s d e o v a r io d e h á m s te r c h in o (C H O ) (p. e j., c é lu la s C H O D G 44 ).
ii. rHuPH20
S e h a n g e n e ra d o fo rm a s s o lu b le s re c o m b in a n te s d e P H 20 h u m a n a y s e p u e d e n u t i l iz a r en la s c o m p o s ic io n e s , c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u so p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia . L a g e n e ra c ió n d e ta le s fo rm a s s o lu b le s d e P H 20 h u m a n a re c o m b in a n te s e d e s c r ib e n , p o r e je m p lo , en la s S o lic itu d e s d e P a te n te P u b lic a d a s d e E s ta d o s U n id o s U S 20040268425 ; U S 20050260186 ; U S 20060104968 ; U S 20100143457 ; y la S o lic itu d In te rn a c io n a l P C T . N ú m . W O 2009111066. L o s e je m p lo s d e ta le s p o lip é p tid o s s o n lo s g e n e ra d o s p o r la e x p re s ió n d e u n a m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a lo s a m in o á c id o s 1 -482 (e x p u e s to s en S E Q ID N O : 273 ). T a l m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o i lu s tra t iv a s e e x p o n e en S E Q ID N O : 5. E l p ro c e s a m ie n to p o s te r io r a la t ra d u c c ió n e lim in a la s e c u e n c ia s e ñ a l d e 35 a m in o á c id o s , d e ja n d o u n a P H 20 h u m a n a re c o m b in a n te s o lu b le d e 447 a m in o á c id o s (S E Q ID N O : 123 ). T a l c o m o s e p ro d u c e en e l m e d io d e c u lt iv o , e x is te h e te ro g e n e id a d en e l e x tre m o C, d e m a n e ra q u e e l p ro d u c to , d e s ig n a d o rH u P H 20 , in c lu y e u n a m e z c la d e e s p e c ie s q u e p u e d e in c lu ir u n o o m á s d e S E Q ID No . 123 -128 en d iv e rs a a b u n d a n c ia . N o rm a lm e n te , la rH u P H 20 s e p ro d u c e e n c é lu la s q u e fa c il ita n la c o r re c ta g l ic o s ila c ió n en N p a ra c o n s e rv a r la a c t iv id a d , ta le s c o m o la s c é lu la s C H O (p. ej., c é lu la s C H O D G 44 ).
D. Glicosilación de enzimas de degradación de hialuronano
L a g lic o s ila c ió n , in c lu y e n d o la g l ic o s ila c ió n lig a d a a N y O , d e a lg u n a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , in c lu id a s la s h ia lu ro n id a s a s , p u e d e s e r im p o r ta n te p o r su a c t iv id a d c a ta lí t ic a y e s ta b il id a d . S i b ie n la a lte ra c ió n de l t ip o d e g l ic a n o q u e m o d if ic a u n a g lic o p ro te ín a p u e d e te n e r e fe c to s d rá s t ic o s s o b re la a n t ig e n ic id a d , e l p le g a m ie n to e s tru c tu ra l, la s o lu b il id a d y la e s ta b il id a d d e u n a p ro te ín a , n o s e c re e q u e la m a y o r ía d e la s e n z im a s re q u ie ra n g lic o s ila c ió n p a ra u n a a c t iv id a d e n z im á t ic a ó p tim a . P a ra a lg u n a s h ia lu ro n id a s a s , la e lim in a c ió n d e la g lic o s ila c ió n lig a d a a N p u e d e d a r c o m o re s u lta d o u n a in a c t iv a c ió n c a s i c o m p le ta d e la a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a . P o r lo ta n to , p a ra ta le s h ia lu ro n id a s a s , la p re s e n c ia d e g l ic a n o s u n id o s a N e s c r ít ic a p a ra g e n e ra r u n a e n z im a a c tiv a .
L o s o l ig o s a c á r id o s u n id o s a N s e c la s if ic a n en v a r io s t ip o s p r in c ip a le s (o l ig o m a n o s a , c o m p le jo , h íb r id o , s u lfa ta d o ) , to d o s lo s c u a le s t ie n e n n ú c le o s (M a n ) 3 -G lc N A c -G lc N A c a n c la d o s a t ra v é s d e l n itró g e n o a m íd ic o d e lo s re s id u o s d e A s n q u e c a e n d e n tro d e la s s e c u e n c ia s -A s n -X a a -T h r /S e r - (d o n d e X a a n o e s P ro ). S e h a in fo rm a d o s o b re la g lic o s ila c ió n en un s it io -A s n -X a a -C y s p a ra la p ro te ín a d e c o a g u la c ió n C . En a lg u n o s c a s o s , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o la h ia lu ro n id a s a , p u e d e c o n te n e r e n la c e s ta n to N -g lic o s íd ic o s y O -g lic o s íd ic o s . P o r e je m p lo , la P H 20 t ie n e o lig o s a c á r id o s u n id o s a O a s í c o m o o lig o s a c á r id o s u n id o s a N. E x is te n s e is s it io s p o te n c ia le s d e g lic o s ila c ió n u n id a a N en N 82 , N 166 , N 235 , N 254 , N 368 , N 393 d e la P H 20 h u m a n a ilu s tra d a en S E Q ID N O : 217. L o s re s id u o s d e a m in o á c id o N 82 , N 166 y N 254 e s tá n o c u p a d o s p o r g l ic a n o s d e t ip o c o m p le jo m ie n tra s q u e lo s re s id u o s d e a m in o á c id o N 368 y N 393 e s tá n o c u p a d o s p o r g l ic a n o s d e t ip o a lto c o n te n id o d e m a n o s a . E l re s id u o d e a m in o á c id o N 235 e s tá o c u p a d o p o r a p ro x im a d a m e n te 80 % d e g lic a n o s d e t ip o a lto c o n te n id o d e m a n o s a y 20 % d e g lic a n o s d e t ip o c o m p le jo . C o m o s e s e ñ a ló a n te r io rm e n te , la g l ic o s ila c ió n u n id a a O en S 490 n o es n e c e s a r ia p a ra la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a .
E n a lg u n o s e je m p lo s , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p a ra su u so en la s c o m p o s ic io n e s , c o m b in a c io n e s y /o c o m b in a c io n e s p a ra su u s o p ro p o rc io n a d a s e s tá n g lic o s ila d a s en u n o o en to d o s lo s s it io s d e g lic o s ila c ió n . P o r e je m p lo , p a ra la p H 20 h u m a n a , o u n a fo rm a s o lu b le d e la m is m a , 2 , 3, 4 , 5 o 6 d e lo s s it io s d e N -g lic o s ila c ió n c o r re s p o n d ie n te s a lo s a m in o á c id o s N 82 , N 166 , N 235 , N 254 , N 368 y N 393 d e S E Q ID N O : 217 e s tá n g lic o s ila d o s . E n o tro s e je m p lo s , 3, 4, 5 o 6 d e lo s s it io s d e N -g lic o s ila c ió n c o r re s p o n d ie n te s a lo s a m in o á c id o s N 82 , N 166 , N 235 , N 254 , N 368 y N 393 d e S E Q ID N O : 217 e s tá n g lic o s ila d o s . T íp ic a m e n te , a l m e n o s lo s re s id u o s 235 , 368 y 393 e s tá n g lic o s ila d o s . L o s re s id u o s d e a m in o á c id o s g lic o s ila d o s c o n tie n e n m ín im a m e n te un ra d ic a l N -a c e t ilg lu c o s a m in a .
E n a lg u n o s e je m p lo s , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o e s tá n g lic o s ila d a s en u n o o m á s s it io s d e g lic o s ila c ió n n a tiv o s . E n o tro s e je m p lo s , la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e m o d if ic a n en u n o o m á s s it io s d e g lic o s ila c ió n n o n a tiv o s p a ra c o n fe r ir g l ic o s ila c ió n de l p o lip é p tid o en u n o o m á s s it io s a d ic io n a le s . E n ta le s e je m p lo s , e l a n c la je d e ra d ic a le s a z ú c a r a d ic io n a le s p u e d e m e jo ra r la s p ro p ie d a d e s fa rm a c o c in é t ic a s d e la m o lé c u la , ta l c o m o u n a m e jo ra d e la s e m i-v id a y /o u n a m e jo ra d e la a c tiv id a d .
e. Formulaciones de liberación sostenida o controlada y vectores que codifican hialuronidasas solubles
L o s e x p e r to s en la té c n ic a c o n o c e n d iv e rs a s e s tra te g ia s p a ra a u m e n ta r la s e m iv id a en s u e ro d e e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o la s h ia lu ro n id a s a s , q u e s o n v e n ta jo s a s p a ra la a d m in is tra c ió n s is té m ic a d e la s h ia lu ro n id a s a s . E n g e n e ra l, la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e m o d if ic a , ta l c o m o p o r p e g ila c ió n o s ia la c ió n . T a m b ié n s e p u e d e n e m p le a r o tra s e s tra te g ia s . E s ta s in c lu y e n la fo rm u la c ió n d e e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p a ra la l ib e ra c ió n s o s te n id a , ta l c o m o en v e s íc u la s , in c lu y e n d o lip o s o m a s , q u e p u e d e n p ro p o rc io n a r u n a lib e ra c ió n c o n tro la d a o u n a l ib e ra c ió n re ta rd a d a d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , y /o p u e d e n s e r d ir ig id a s a l tu m o r p a ra su l ib e ra c ió n en e l tu m o r . L o s e je m p lo s d e ta le s fo rm u la c io n e s d e e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o la s h ia lu ro n id a s a s s o lu b le s , s o n la s d e s c r ita s en la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s U S -2013 -0251786 -A 1 y la P u b lic a c ió n d e la S o lic itu d In te rn a c io n a l P C T N ú m . W O 2012 /109387. L a s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ta m b ié n p u e d e n e s ta r c o d if ic a d a s en v e c to re s d e e x p re s ió n p a ra su e x p re s ió n in vivo, en p a r t ic u la r v e c to re s d ir ig id o s a tu m o re s u o n c o lí t ic o s p a ra su e x p re s ió n en c é lu la s tu m o ra le s (v é a s e , p. e j., la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 8.450.470 , y la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2011 -0152359 -A 1 ; v é a s e ta m b ié n la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . U S - 2012 -0148535 ) . L a s c o m b in a c io n e s p a ra su u s o en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e n p ra c t ic a r c o n la s fo rm u la c io n e s v e s ic u la re s y /o v e c to re s d e e x p re s ió n q u e c o d if ic a n h ia lu ro n id a s a s s o lu b le s , q u e s e p u e d e n a d m in is t r a r a un s u je to p a ra te ra p ia c o m b in a d a c o n un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l. L a s fo rm u la c io n e s d e lib e ra c ió n s o s te n id a ta m b ié n s e p u e d e n fo rm u la r p a ra q u e c o n te n g a n el in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l, in c lu y e n d o c u a lq u ie ra d e lo s d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia , en p a r t ic u la r lo s a n t ic u e rp o s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l, ta le s c o m o a n ti-P D -L 1 y a n ti-C T L A 4.
i. Enzimas de degradación de hialuronano modificadas (conjugadas con polímero)
E l a n c la je c o v a le n te u o tro a n c la je e s ta b le (c o n ju g a c ió n ) d e m o lé c u la s p o lim é r ic a s , ta le s c o m o el p o lie t i le n g lic o l ( ra d ic a l d e P E G ila c ió n (P E G )) , a la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta le s c o m o la s h ia lu ro n id a s a s , c o n fie re n p ro p ie d a d e s b e n e f ic io s a s a la c o m p o s ic ió n d e e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p o lím e ro re s u lta n te . T a le s p ro p ie d a d e s in c lu y e n u n a m e jo ra d e la b io c o m p a t ib il id a d , u n a p ro lo n g a c ió n d e la s e m iv id a d e la p ro te ín a (y la a c t iv id a d e n z im á t ic a ) en la s a n g re , la s c é lu la s y /o en o tro s te j id o s d e n tro d e un s u je to , la p ro te c c ió n e f ic a z d e la p ro te ín a f re n te a la s p ro te a s a s y la h id ró lis is , u n a m e jo r b io d is tr ib u c ió n , un m e jo ra d e la fa rm a c o c in é tic a y /o fa rm a c o d in a m ia , y a u m e n to d e la s o lu b il id a d en a g u a .
L o s p o lím e ro s i lu s tra t iv o s q u e s e p u e d e n c o n ju g a r c o n la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o la h ia lu ro n id a s a , in c lu y e n h o m o p o lím e ro s n a tu ra le s y s in té t ic o s , ta le s c o m o p o lio le s (e s d e c ir, p o li-O H ), p o lia m in a s (e s d e c ir , p o li-N H 2) y p o li(á c id o s c a rb o x í lic o s ) (e s d e c ir , p o li-C O O H ), y o tro s h e te ro p o lím e ro s e s d e c ir , p o lím e ro s q u e c o m p re n d e n u n o o m á s g ru p o s d e a c o p la m ie n to d ife re n te s p. e j., un g ru p o h id ro x ilo y g ru p o s a m in a . L o s e je m p lo s d e m o lé c u la s p o lim é r ic a s a d e c u a d a s in c lu y e n m o lé c u la s p o lim é r ic a s s e le c c io n a d a s e n tre lo s p o li(ó x id o s d e a lq u ile n o ) (P A O ), ta le s c o m o p o lia lq u ile n g l ic o le s (P A G ), q u e in c lu y e n p o lie t i le n g l ic o le s (P E G ), m e to x ip o lie t i le n g lic o le s (m P E G ) y p o lip ro p ile n g lic o le s , P E G -g lic id il é te re s (E p o x -P E G ) , P E G -o x ic a rb o n il im id a z o l (C D I-P E G ) , p o lie t i le n g lic o le s ra m if ic a d o s (P E G ), p o li(a lc o h o l v in í l ic o ) (P V A ), p o li(e t i le n im in a ) (P E I) , p o lia m id o a m in a s lin e a le s , p o lia c r i la m id a (P A A m ), p o lid im e t ila c r ila m id a (P D A A m ), p o li(a lc o h o l v in í l ic o ) (P V A ), p o lic a rb o x ila to s , p o liv in ilp ir ro lid o n a (P V P ), p o li-D ,L -a m in o á c id o s , p o lie t i le n o -c o -a n h íd r id o d e á c id o m a le ic o , p o lie s t ire n o -c o -a n h íd r id o d e á c id o m a le ic o , d e x tra n o s , in c lu y e n d o c a rb o x im e t il- q u ito s a n o , d e x tr in a , d e x tra n o s , h e p a r in a , a lb ú m in a h o m ó lo g a , c e lu lo s a s , in c lu y e n d o m e t ilc e lu lo s a , c a rb o x im e t ilc e lu lo s a , e t ilc e lu lo s a , h id ro x ie t i lc e lu lo s a , c a rb o x ie t i lc e lu lo s a e h id ro x ip ro p ilc e lu lo s a , p ro d u c to s h id ro liz a d o s d e q u ito s a n o , a lm id o n e s ta le s c o m o h id ro x ie t i la lm id o n e s y h id ro x ip ro p ila lm id o n e s , g lu c ó g e n o , a g a ro s a s y d e r iv a d o s d e la s m is m a s , g o m a g u a r, p u lu la n o , in u lin a , g o m a x a n ta n a , c a rra g e n in a , p e c tin a , p ro d u c to s h id ro liz a d o s d e á c id o a lg ín ic o y b io p o lím e ro s .
T íp ic a m e n te , lo s p o lím e ro s s o n p o li(ó x id o s d e a lq u ile n o ) (P A O ), ta le s c o m o p o li(ó x id o s d e e t ile n o ), ta le s c o m o P E G , t íp ic a m e n te m P E G , q u e , en c o m p a ra c ió n c o n p o lis a c á r id o s ta le s c o m o el d e x tra n o y e l p u lu la n o , t ie n e n p o c o s g ru p o s re a c t iv o s s u s c e p tib le s d e e n tre c ru z a m ie n to . T íp ic a m e n te , lo s p o lím e ro s s o n m o lé c u la s p o lim é r ic a s no tó x ic a s , ta le s c o m o (m )p o lie t i le n g lic o l (m P E G ) q u e s e p u e d e n c o n ju g a r c o v a le n te m e n te a la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o la h ia lu ro n id a s a (p . e j., a lo s g ru p o s d e a n c la je s o b re la s u p e r f ic ie d e la p ro te ín a ) u t i l iz a n d o u n a q u ím ic a re la t iv a m e n te s im p le .
S e h a in fo rm a d o q u e la P E G ila c ió n d e lo s a g e n te s te ra p é u t ic o s a u m e n ta la re s is te n c ia a la p ro te ó lis is , a u m e n ta la s e m i-v id a en p la s m a y d is m in u y e la a n t ig e n ic id a d y la in m u n o g e n ic id a d . E n la té c n ic a s e c o n o c e n e je m p lo s d e m e to d o lo g ía s d e P E G ila c ió n (v é a n s e , p o r e je m p lo , Lu y F e lix , In t. J. P e p tid e P ro te in R e s ., 43 :127 -138 , 1994 ; Lu y F e lix , P e p tid e R e s ., 6 :140 -6 , 1993 ; F e lix e t a l., In t. J. P e p tid e R e s ., 46 :253 -64 , 1995 ; B e n h a r e t a l., J. B io l. C h e m ., 269 :13398 -404 , 1994 ; B ru m e a n u e t a l., J Im m u n o l., 154 :3088 -95 , 1995 ; v é a s e ta m b ié n , C a lic e t i e t a l. (2003 ) A d v . D ru g D e liv . R e v . 55 (10 ) :1261 -77 y M o lin e u x (2003 ) P h a rm a c o th e ra p y 23 (8 P t 2 ) :3 S -8 S ) . L a P E G ila c ió n ta m b ié n se p u e d e u t i l iz a r en la a d m in is tra c ió n d e m o lé c u la s d e á c id o n u c le ic o in vivo. L a P E G ila c ió n d e a d e n o v iru s p u e d e a u m e n ta r la e s ta b il id a d y la t r a n s fe re n c ia d e g e n e s (v é a s e , p. e j., C h e n g e t a l. (2003 ) P h a rm . R e s . 20 (9 ) :1444 -51 ) .
L a s m o lé c u la s p o lim é r ic a s a d e c u a d a s p a ra e l a n c la je a la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , in c lu y e n d o la s h ia lu ro n id a s a s , in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, p o lie t i le n g lic o l (P E G ) y d e r iv a d o s d e P E G ta le s c o m o m e to x ip o lie t i le n g l ic o le s (m P E G ), P E G -g lic id ilé te re s (E p o x -P E G ) P E G -o x ic a rb o n il im id a z o l (C D I-P E G ) , P E G ra m if ic a d o s y p o li(ó x id o d e e t ile n o ) (P E O ) ( v é a n s e p. e j., R o b e rts e t a l., A d v a n c e d D ru g D e liv e ry R e v ie w (2002 ) 54 : 459 -476 ; H a rr is y Z a lip s k y , S (e d s .) " P o ly (e th y le n e g lic o l) , C h e m is tr y a n d B io lo g ic a l A p p lic a t io n s " A C S S y m p o s iu m S e r ie s 680 , 1997 ; M e h v a r e t a l., J. P h a rm . P h a rm a c e u t. S c i., 3 (1 ) :125 -136 , 2000 ; H a rr is , (2003 ) N a tu re R e v ie w s D ru g D is c o v e ry 2 :214 -221 ; y T s u b e ry , (2004 ) J B io l. C h e m 279 (37 ) :38118 -24 ) . L a m o lé c u la p o lim é r ic a p u e d e te n e r c u a lq u ie r p e s o m o le c u la r q u e o s c ile t íp ic a m e n te e n tre a p ro x im a d a m e n te 3 k D a y a p ro x im a d a m e n te 60 kD a . E n a lg u n a s re a liz a c io n e s la m o lé c u la p o lim é r ic a q u e e s tá c o n ju g a d a co n u n a p ro te ín a , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a , p o r e je m p lo u n a P H 20 , t ie n e un p e s o m o le c u la r e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 5 y 60 kD a , ta l c o m o a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te a l m e n o s o 5, 10, 15, 20 , 25 , 30 , 35 , 40 , 45 , 50 , 55 , 60 o m á s d e 60 kD a .
Enzimas de degradación de hialuronano solubles PEGiladas
L a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o u t il iz a d a en la s c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u so en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e s e r u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s o lu b le P E G ila d a . E n un e je m p lo , e s u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le P E G ila d a , p. e j., u n a P H 20 P E G ila d a . S e c o n o c e n en la té c n ic a v a r io s m é to d o s p a ra m o d if ic a r p o lip é p tid o s a n c la n d o c o v a le n te m e n te ( c o n ju g a n d o ) un P E G o un d e r iv a d o d e P E G (e s d e c ir , "P E G ila c ió n " ) (v é a n s e p. e j., lo s d o c u m e n to s U .S .
2006 /0104968 ; U .S . 5.672.662 ; U .S . 6.737.505 ; y U .S . 2004 /0235734 ) . L a s té c n ic a s p a ra la P E G ila c ió n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, c o n e c to re s y q u ím ic a s d e a c o p la m ie n to e s p e c ia liz a d o s (v é a s e p. e j., R o b e rts e t a l., A d v . D ru g D e liv . R e v . 54 :459 -476 , 2002 ), e l a n c la je d e m ú lt ip le s ra d ic a le s d e P E G a un s o lo s it io d e c o n ju g a c ió n ( ta l c o m o a t ra v é s d e l u so d e P E G ra m if ic a d o s ; v é a s e p. e j., G u io t to e t a l., B io o rg . M ed . C h e m . L e tt. 12 :177 -180 , 2002 ), P E G ila c ió n e s p e c íf ic a d e l s it io y /o m o n o -P E G ila c ió n (v é a s e p. e j., C h a p m a n e t a l., N a tu re B io te c h . 17: 780 -783 , 1999 ), y P E G ila c ió n e n z im á t ic a d ir ig id a a l s it io (v é a s e p. e j., S a to , A d v . D ru g D e liv . R e v ., 54 :487 -504 , 2002 ) . L o s m é to d o s y m e c a n is m o s d e s c r ito s en la té c n ic a p u e d e n p ro d u c ir p ro te ín a s q u e te n g a n 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10 o m á s d e 10 P E G o d e r iv a d o s d e P E G u n id o s a u n a ú n ic a m o lé c u la d e p ro te ín a (v é a s e p. e j., e l d o c u m e n to U .S .
2006 /0104968 ) .
S e h a n d e s c r ito en la té c n ic a n u m e ro s o s re a c t iv o s p a ra la P E G ila c ió n . T a le s re a c t iv o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, P E G a c t iv a d o c o n N -h id ro x is u c c in im id ilo (N H S ), s u c c in im id il-m P E G , m P E G 2-N -h id ro x is u c c in im id a , m P E G -a lfa -m e t ilb u ta n o a to d e s u c c in im id ilo , m P E G -p ro p io n a to d e s u c c in im id ilo , m P E G -b u ta n o a to d e s u c c in im id ilo , m P E G - é s te r d e s u c c in im id i lo d e á c id o c a rb o x im e t ilo , P E G -p ro p io n a to d e s u c c in im id i lo h o m o b ifu n c io n a l, P E G - p ro p io n a ld e h íd o h o m o b ifu n c io n a l, P E G -b u t ira ld e h íd o h o m o b ifu n c io n a l, P E G -m a le im id a , P E G -h id ra z id a , c a rb o n a to d e p -n it ro fe n i lo -P E G , m P E G -c a rb o n a to d e b e n z o tr ia z o l, p ro p io n a ld e h íd o -P E G , m P E G -b u t ira ld e h íd o , m P E G 2- b u t ira ld e h íd o ra m if ic a d o , m P E G -a c e t ilo , m P E G -p ip e r id o n a , m P E G -m e tilc e to n a , m P E G -m a le im id a "s in c o n e c to r" , m P E G -v in il s u lfo n a , m P E G - t io l, m P E G -o r to p ir id ilé s te r , m P E G -d is u lfu ro d e o r to p ir id ilo , F m o c -P E G -N H S , B o c -P E G -N H S , v in i ls u lfo n a -P E G -N H S , a c r i la to -P E G -N H S , f lu o re s c e ín a -P E G -N H S , y b io t in a -P E G -N H S (v é a s e p. e j., M o n fa rd in i e t a l., B io c o n ju g a te C h e m . 6 :62 -69 , 1995 ; V e ro n e s e e t a l., J. B io a c t iv e C o m p a t ib le P o ly m e rs 12 :197 -207 , 1997 ; D o c u m e n to s U .S . 5.672.662 ; U .S . 5.932.462 ; U .S . 6.495.659 ; U .S . 6.737.505 ; U .S . 4.002.531 ; U .S . 4.179.337 ; U .S .
5.122.614 ; U .S . 5.324. 844 ; U .S . 5.446.090 ; U .S . 5.612.460 ; U .S . 5.643.575 ; U .S . 5.766.581 ; U .S .5.795. 569 ; U .S .
5.808.096 ; U .S . 5.900.461 ; U .S . 5.919.455 ; U .S . 5.985.263 ; U .S . 5.990. 237 ; U .S . 6.113.906 ; U .S . 6.214.966 ; U .S .
6.258.351 ; U .S . 6.340.742 ; U .S . 6.413.507 ; U .S . 6.420.339 ; U .S . 6.437.025 ; U .S . 6.448.369 ; U .S . 6.461.802 ; U .S .
6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S.
2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S.
2003/0220447; U.S. 2004/0013637; U.S. 2004/0235734; WO0500360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S.
2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; y WO 0187925).
ii. Formulaciones de liberación sostenida o controlada y vectores que codifican hialuronidasas solubles ii. Formulaciones de liberación sostenida
Las composiciones de enzimas de degradación de hialuronano se pueden proporcionar en formulaciones de liberación sostenida o controlada. Se pueden coformular con el inhibidor de puntos de control y/u otro agente antitumoral. En algunos ejemplos, las formulaciones de liberación sostenida o controlada también contienen otro u otros agentes terapéuticos, por ejemplo, el inhibidor de puntos de control y/o un agente antitumoral adicional. La enzima de degradación de hialuronano, tal como las hialuronidasas solubles, se puede proporcionar en vectores para su administración. Los vectores incluyen vectores virales oncolíticos, tales como vectores oncolíticos de adenovirus y virus vaccinia que codifican y expresan la enzima de degradación de hialuronano. También pueden codificar otros agentes terapéuticos de proteínas contra el cáncer, tales como el inhibidor de puntos de control, incluyendo los descritos en la presente memoria.
Las formulaciones se pueden formular para inyección local o sistémica. Las formulaciones de liberación sostenida ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, vesículas lipídicas incluyendo vesículas unilamelares (LUV) y vesículas multilamelares (MVL), complejos de fármaco-resina (resinatos) y formulaciones de depósito. Tales formulaciones de liberación sostenida o controlada son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una enzima de degradación de hialuronano se puede encapsular en un sistema de dispersión coloidal o en cristales estabilizados con polímeros. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen nanocápsulas, microesferas, cuentas y sistemas basados en lípidos, incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 5.631.018). En la técnica se conocen ejemplos de procedimientos para elaborar liposomas multilamelares y unilamelares (véase p.ej. las Patente de Estados Unidos Núm. 4.522.803, 4.310.506, 4.235.871, 4.224.179, 4.078.052, 4.394.372, 4.308.166, 4.485.054 y 4.508.703). Otros ejemplos de vehículos de suministro de liberación lenta son las matrices de hidrogel biodegradables (Patente de Estados Unidos Núm.
5.041.292), los productos conjugados de polímeros dendríticos (Patente de Estados Unidos Núm. 5.714.166), y los liposomas multivesiculares (DepoFoam®, DepoTech, San Diego, California) (Patentes de Estados Unidos Núm.
5.723.147 y 5.766.627). Un tipo de microesferas adecuadas para encapsular las composiciones para inyección local, son las microesferas de poli(D,L-lactida), como describen Fletcher, D. Anesth. Analg 84: 90-94 (1997).
En particular, las formulaciones de liberación sostenida proporcionadas se pueden diseñar de manera tal que la enzima (u otro agente o agentes) se libere a una velocidad predeterminada o de manera tal que se mantenga un nivel constante de fármaco durante un período específico de tiempo. En particular, las formulaciones permiten una liberación controlada de la enzima de degradación de hialuronano (u otro agente o agentes) al tejido local, tal como el tejido tumoral. La velocidad de liberación es lo suficientemente lenta como para que el efecto resultante de la enzima sobre la degradación de HA en el tejido (p. ej., el estroma) se prolongue durante muchas horas, días, semanas o meses. Los expertos en la técnica pueden determinar la velocidad de liberación y la duración óptimas para las formulaciones de liberación sostenida de una enzima de degradación de hialuronano basándose en las propiedades farmacológicas de los agentes específicos.
Si es necesario, se puede medir la actividad de la enzima de degradación de hialuronano liberada en la sangre o el suero. Se puede realizar cualquier ensayo conocido por un experto en la técnica para medir la hialuronidasa en el plasma. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de microturbidez o un ensayo enzimático en las proteínas en plasma. Se entiende que el plasma normalmente contiene enzimas hialuronidasas. Tales enzimas hialuronidasas plasmáticas tienen típicamente actividad a un pH ácido (Patente de Estados Unidos Núm. 7.105.330). Por lo tanto, antes del tratamiento con una formulación de liberación sostenida como se describe en la presente memoria, se deben determinar los niveles plasmáticos de hialuronidasa y utilizarlos como una referencia. Las mediciones posteriores de los niveles de hialuronidasa en plasma después del tratamiento se pueden comparar con los niveles antes de los tratamientos. Alternativamente, el ensayo se puede realizar en condiciones de pH que suprimen la actividad hialuronidasa lisosomal endógena en plasma, que normalmente muestra actividad a pH ácido. Por lo tanto, cuando la enzima de degradación de hialuronano es activa a pH neutro (p. ej., la PH20 humana), solamente se mide el nivel de la enzima activa en condiciones neutras.
Adicionalmente, las formulaciones de liberación sostenida proporcionadas en la presente memoria pueden diseñarse de manera tal que la enzima de degradación de hialuronano sea relativamente estable y activa. Por ejemplo, las formulaciones de liberación sostenida se proporcionan de tal manera que la actividad de la enzima de degradación de hialuronano total de la formulación sea de o entre 25.000 U/mg a 200.000 U/mg, por ejemplo de 40.000 U/mg a 150.000 U/mg, tal como de 75.000 U/mg mg a 120.000 U/mg y en particular al menos o 40.000 U/mg, 50.000 U/mg, 60.000 U/mg, 70.000 U/mg, 80.000 U/mg, 90.000 U/mg, 100.000 U/mg, 110.000 U/mg, 120.000 U/mg, 130.000 U/mg, 140.000 U/mg, 150.000 U/mg o más.
Los ejemplos no limitantes de formulaciones de liberación sostenida y formulaciones ilustrativas se proporcionan en los ejemplos a continuación. Véase, también la Solicitud PCT publicada WO 2012/109387.
a) Liposomas multivesiculares (MVL)
En la presente memoria se proporcionan vesículas de membrana sintética, tales como formulaciones de liposomas multivesiculares (MVL), que incluyen la enzima de degradación de hialuronano, y en particular una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 soluble o recombinante. En algunos ejemplos, se proporcionan co-formulaciones de MVL que además contienen otro fármaco terapéutico, tal como el inhibidor de puntos de control y/u otro agente antitumoral o anticancerígeno. Las formulaciones de liposomas multivesiculares contienen partículas microscópicas esféricas compuestas por numerosas cámaras acuosas no concéntricas que encapsulan un fármaco o agente que se va a suministrar. Las cámaras individuales están separadas por membranas de bicapa lipídica compuestas por duplicados sintéticos o lípidos naturales, lo que da como resultado un vehículo de suministro que es biocompatible y biodegradable. En los ejemplos de la presente memoria, las enzimas de degradación de hialuronano u otros agentes terapéuticos que son hidrófilos se pueden encapsular en la fase acuosa. En otros ejemplos en la presente memoria, se proporciona una co-formulación de MVL mediante co-encapsulación de un fármaco hidrófilo y un fármaco hidrófobo en la misma formulación. Por ejemplo, en tales co-formulaciones de MVL, la enzima de degradación de hialuronano se encapsula en la fase acuosa y un fármaco hidrófobo, por ejemplo, finasterida o dutasterida, se intercala en la fase lipídica.
Las vesículas de membrana se pueden utilizar en métodos para administrar una enzima de degradación de hialuronano y, si se desea, también otro agente, a un sujeto para ser utilizado como coadyuvante, agente de propagación o terapéutico. En particular, las vesículas de membrana se proporcionan en composiciones farmacéuticas para su uso como agente terapéutico.
Los liposomas multivesiculares (MVL) se elaboran basándose en procedimientos conocidos por los expertos en la técnica (véanse p. ej. las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.723.147; 5.766.627; 6.106.858; 6.306.432; 5.962.016; 6.241.999; Solicitudes de Patente de Estados Unidos Publicadas Núm. US2007/0235889 y US2010/030550; y Solicitud Internacional Publicado Núm. WO02/096368). Al generar tales liposomas, cualquiera de las composiciones de enzimas de degradación de hialuronano descritas en la presente memoria, o conocidas por los expertos en la técnica, se puede preparar como parte de los liposomas multivesiculares. Brevemente, primero se prepara una emulsión de "agua en aceite" que contiene una enzima de degradación de hialuronano disolviendo los lípidos anfipáticos y los lípidos neutros en un solvente orgánico volátil para el componente lipídico, agregando al componente lipídico un primer componente acuoso inmiscible que contiene la enzima. y/u otro agente que se vaya a incluir, y una o más moléculas auxiliares, es decir excipientes osmóticos, que proporcionan propiedades útiles y beneficiosas a las MVL. La mezcla se emulsiona mezclando, por ejemplo, mecánicamente mediante mezclado, agitación, sonicación, por energía ultrasónica, atomización de boquillas o combinaciones de los mismos. La enzima de degradación de hialuronano puede estar contenida en el primer componente acuoso o en el componente lipídico o en ambos. La emulsión completa de agua en aceite se mezcla a continuación con el segundo componente acuoso y a continuación se agita mecánicamente, como anteriormente, para formar esférulas de disolvente suspendidas en el segundo componente acuoso. Las esferas de disolvente contienen múltiples gotitas acuosas con la sustancia que se va a encapsular disuelta en ellas. El solvente orgánico volátil se elimina, por ejemplo, por evaporación, de las esférulas. Cuando el disolvente se ha evaporado por completo, se forman liposomas multivesiculares. Las MVL se resuspenden, se lavan y se almacenan en una tercera solución acuosa, tal como solución salina o un tampón adecuado que permita la estabilidad de las partículas a las temperaturas de almacenamiento. Los gases representativos satisfactorios para su utilización en la evaporación del disolvente incluyen nitrógeno, helio, argón, oxígeno, hidrógeno y dióxido de carbono. Alternativamente, el solvente orgánico se puede eliminar mediante evaporación, evaporación rotatoria o membranas selectivas para disolventes.
Como se describe en la Solicitud PCT Publicada WO 2012/109387, las moléculas hidrófobas se pueden incorporar a la bicapa lipídica disolviendo los lípidos y el fármaco hidrófobo en un disolvente orgánico antes de mezclar con un primer componente acuoso que contenga el fármaco hidrófilo (p. ej. una enzima de degradación de hialuronano). Por lo tanto, los métodos se pueden utilizar para generar también co-formulaciones de MVL de un fármaco hidrófobo e hidrófilo.
Se pueden utilizar muchos tipos diferentes de disolventes hidrófobos volátiles, tales como éteres, éteres halogenados, hidrocarburos, ésteres, hidrocarburos halogenados o freones como disolvente de la fase lipídica. Por ejemplo, se pueden utilizar dietil éter, isopropilo y otros éteres, cloroformo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, acetato de etilo, Forano y combinaciones de los mismos para preparar liposomas multivesiculares.
Se pueden utilizar varios tipos de lípidos para preparar liposomas multivesiculares, siempre que el componente lipídico contenga un lípido neutro y un lípido anfipático. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen diglicéridos, tales como diolefina, dipalmitoleína; ésteres de propilenglicol tales como diésteres mixtos de ácidos caprílico/cáprico en propilenglicol; triglicéridos tales como trioleína, tripalmitoleína, trilinoleína, tricaprilina y trilaurina; aceites vegetales, tales como aceite de soja; manteca de cerdo o grasa de res; escualeno; tocoferol; y combinaciones de los mismos. En ejemplos particulares, los lípidos neutros de liberación lenta incluyen, por ejemplo, trioleína, tripalmitoleína, trimiristoleína, trilaurina y tricaprina. Los lípidos neutros de liberación rápida incluyen, por ejemplo, tricaprilina y tricaproína y mezclas de los mismos. Los ejemplos de lípidos anfipáticos incluyen aquellos con carga neta negativa, carga neta cero y carga neta positiva a pH 7,4. Estos incluyen lípidos zwitteriónicos, ácidos o catiónicos. Tales lípidos anfipáticos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilserina (PS), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), esfingomielina, diacil trimetilamonio propano (DITAP) y combinaciones de los mismos. Además, se pueden utilizar el colesterol o los esteroles vegetales para preparar liposomas multivesiculares. El componente lipídico elegido también puede ser uno que tenga un punto de fusión por debajo de la temperatura a la que se almacena y/o utiliza el MVL (véase p.ej. la Patente de Estados Unidos Núm. 5.962.016).
En ejemplos de las vesículas de membrana sintética, se puede preparar la enzima de degradación de hialuronano, y en particular una hialuronidasa tal como PH20 o PH20 recombinante, en presencia de uno o más excipientes que preservan o mejoran la estabilidad de la enzima y/o aumentan la velocidad de formación de las vesículas. En ejemplos particulares, el excipiente es ácido hialurónico (también llamado hialuronano; HA).
El tamaño de partícula del MVL resultante puede variar. Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar el tamaño de una vesícula de membrana y seleccionar una vesícula basándose en una aplicación deseada. Por ejemplo, se puede realizar un análisis del tamaño de partículas, por ejemplo, utilizando un analizador de tamaño de partículas por difracción láser. En algunos ejemplos, las vesículas de membrana proporcionadas en la presente memoria tienen un diámetro promedio de aproximadamente o entre 0,5 pm y 100 pm, por ejemplo al menos o aproximadamente o 0,5 pm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 15 pm, 20 pM, 50 pm o 100 pm.
Las formulaciones o las coformulaciones de MVL resultantes se pueden diluir o suspender adicionalmente mediante la adición de medio de suspensión u otro portador biológicamente aceptable para obtener formulaciones de depósito de liberación lenta inyectables o implantables. Los portadores adecuados comunes incluyen soluciones suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas. Los ejemplos de soluciones no acuosas son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones acuosas alcohólicas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen soluciones de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y solución de Ringer con lactato añadido. Los vehículos intravenosos incluyen reforzadores de líquidos y nutrientes, reforzadores de electrolitos (tales como los que se basan en la dextrosa de Ringer). También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes (véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, A. Oslo, ed., Mack, Easton, Pa. 1980). Los detalles adicionales para la preparación de las vesículas se describen, por ejemplo, en la Solicitud PCT publicada WO 2012/109387 y, por lo tanto, son conocidos por los expertos en la técnica.
b) Co-Formulaciones de MVL
En la presente memoria se proporcionan vesículas que contienen otro agente terapéutico o agente con la enzima de degradación de hialuronano. El otro agente terapéutico puede ser cualquier fármaco o agente conocido por un experto en la técnica, y particularmente incluye un inhibidor de puntos de control y/u otro agente anticanceroso. El otro agente puede ser hidrófilo o hidrófobo. En algunos ejemplos, las co-formulaciones de MVL se preparan mezclando un primer componente acuoso que contiene la enzima de degradación de hialuronano y otro agente con el componente lipídico en un disolvente orgánico. En otros ejemplos, el otro agente es un fármaco hidrófobo y las coformulaciones de MVL se preparan mezclando un primer componente acuoso que contiene la enzima de degradación de hialuronano y con el componente lipídico en un disolvente orgánico que también contiene el fármaco hidrófobo. Se encuentra en la presente memoria que la inclusión del fármaco hidrófobo con el componente lipídico en un disolvente orgánico da como resultado la encapsulación o intercalación del fármaco hidrófobo en la fase lipídica de MVL. Por lo tanto, cuando se generan combinadas con una enzima de degradación de hialuronano, las formulaciones de MVL contienen un fármaco hidrófilo e hidrófobo coencapsulados en la misma formulación, por lo que la enzima de degradación de hialuronano está en la fase acuosa y el fármaco hidrófobo está en la fase lipídica. Los fármacos hidrófobos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, docetaxel, gemcitabina, glucocorticoides. Con respecto a la generación de co-formulaciones de MVL que contienen un fármaco hidrófobo, se encuentra en la presente memoria que la morfología de las partículas de co-formulación lipídicas puede verse afectada por la concentración del fármaco y la concentración de lípidos. Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar las concentraciones óptimas de fármaco y lípidos para obtener una partícula de morfología suficiente para aplicaciones terapéuticas a la vez que conserva la actividad de los fármacos encapsulados activos. Los Ejemplos ilustran procedimientos para evaluar y hacer un seguimiento de la morfología y las actividades
D. Métodos para producir ácidos nucleicos y polipéptidos codificados de enzimas de degradación de hialuronano e inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., Anticuerpos)
Los polipéptidos que se utilizan en las combinaciones para su uso proporcionadas en la presente memoria, incluidos los polipéptidos de una enzima de degradación de hialuronano (p. ej., hialuronidasa soluble, tal como una PH20) o un inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpo), se pueden obtener mediante métodos bien conocidos en la técnica para la purificación de proteínas y la expresión de proteínas recombinantes. Los métodos de ADN recombinante están dentro del alcance de los expertos en la técnica. El ADN que codifica un polipéptido de interés, tal como cualquiera de los descritos en la presente memoria, se puede producir sintéticamente o se puede aislar y secuenciar fácilmente utilizando procedimientos convencionales (p. ej., utilizando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes). Por ejemplo, cualquier fuente de células o tejido que se sabe que produce o expresa un polipéptido de interés, puede servir como fuente de dicho ADN. Los polipéptidos se pueden clonar o aislar utilizando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Tales métodos incluyen la amplificación por PCR de ácidos nucleicos y el escrutinio de bibliotecas, incluyendo el escrutinio por hibridación de ácidos nucleicos, el escrutinio basado en anticuerpos y el escrutinio basado en la actividad. En otro ejemplo, si la secuencia del ADN es conocida o determinada, se pueden construir las secuencias de ácido nucleico utilizando técnicas de síntesis de genes.
Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos se pueden utilizar para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, incluyendo, por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se puede utilizar un material que contiene ácido nucleico como material de partida a partir del cual se puede aislar una molécula de ácido nucleico codificante de un polipéptido deseado. Por ejemplo, las preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos de tejidos, muestras de fluidos (p. ej., sangre, suero, saliva) u otras muestras de sujetos sanos y/o enfermos se pueden utilizar en métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácidos nucleicos también se pueden utilizar como fuente de material de partida. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar basándose en secuencias expresadas a partir de las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores se pueden diseñar basándose en la traducción inversa de una secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación se pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipéptido deseado.
Además, las técnicas de mutagénesis también se pueden emplear para generar formas modificadas de una proteína de interés. El ADN también puede ser modificado. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de síntesis génica o biología molecular de rutina para efectuar la inserción, deleción, adición o reemplazo de nucleótidos, por ejemplo, para alterar las propiedades de la proteína, tales como las propiedades de unión o la estabilidad del anticuerpo o la actividad enzimática de la enzima de degradación de hialuronano.
Se pueden unir secuencias de nucleótidos adicionales a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido. En un ejemplo, se pueden añadir secuencias conectoras, tales como secuencias que contienen sitios de endonucleasas de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN codificantes de proteínas centrales. Además, se pueden unir operativamente secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales a una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido. Los ejemplos de tales secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares, y secuencias de secreción, por ejemplo secuencias señal heterólogas, diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Tales secuencias son conocidas por los expertos en la técnica. Los residuos de nucleótidos adicionales, tales como secuencias de bases que especifican regiones de unión a proteínas, también se pueden unir a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos. Tales regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias de residuos que facilitan o codifican proteínas que facilitan la captación del polipéptido en células diana específicas, o alteran de otro modo la farmacocinética del producto del gen sintético.
Además, se pueden añadir etiquetas u otros radicales, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, también se pueden ligar secuencias de residuos de nucleótidos adicionales, tales como secuencias de bases que especifican una etiqueta epitópica u otro marcador detectable a moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Los ejemplos de tales secuencias incluyen secuencias de ácido nucleico que codifican una etiqueta His (p. ej., 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 31) o una etiqueta Flag (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 20).
Los ácidos nucleicos identificados y aislados se pueden insertar a continuación en un vector de clonación apropiado. Se puede utilizar un gran número de sistemas de vector-anfitrión conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vectores debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada. La elección del vector puede depender de la aplicación deseada. La inserción en un vector de clonación se puede lograr, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tenga extremos cohesivos complementarios. La inserción se puede efectuar utilizando vectores de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios utilizados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN se pueden modificar enzimáticamente. Alternativamente, se puede producir cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (conectores) en los extremos del ADN; estos conectores ligados pueden contener oligonucleótidos específicos sintetizados químicamente que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un método alternativo, el vector escindido y el gen de la proteína se pueden modificar mediante colas homopoliméricas.
Después de la inserción del ácido nucleico, los vectores típicamente se introducen en las células anfitrionas, por ejemplo, para amplificar los genes de proteínas para la replicación y/o expresión de los mismos. Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células anfitrionas, por ejemplo, mediante transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia del gen. En realizaciones específicas, la transformación de células anfitrionas con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de la proteína aislada, el ADNc o la secuencia de ADN sintetizada permite la generación de copias múltiples del gen. De este modo, se puede obtener el gen en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado. En tales ejemplos, se utiliza un vector adecuado para la expresión de alto nivel. Los vectores ilustrativos se describen a continuación. Los polipéptidos se pueden expresar utilizando cultivos celulares convencionales y otros sistemas de expresión conocidos en la técnica. Las proteínas pueden ser purificadas.
1. Aislamiento o preparación de polipéptidos que codifican ácido nucleico
a. Enzima de degradación de hialuronano
En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las enzimas de degradación de hialuronano descritas en la presente memoria, tales como las descritas en la Sección C anterior. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de PH20 solubles que tienen la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85%, 86% , 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158. Como se describió anteriormente, el ADN que codifica una enzima de degradación de hialuronano se puede producir sintéticamente o se puede aislar fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Se puede utilizar cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc completo (es decir, que abarca toda la región codificante), o clon de ADN genómico, que codifica una hialuronidasa, tal como a partir de una célula o fuente de tejido. Las hialuronidasas modificadas, tales como las truncadas o las variantes solubles, se pueden modificar a partir de un polipéptido de tipo salvaje utilizando técnicas de ADN recombinante, incluyendo la mutagénesis dirigida al sitio.
La molécula de ácido nucleico se puede insertar en un vector para su expresión. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos tales como derivados de los plásmidos pCMV4, pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión HZ24 ilustrado en la presente memoria. Otros vectores ilustrativos se describen a continuación. b. Inhibidores de puntos de control inmunitario (p. ej., Anticuerpos)
En la presente memoria se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de los inhibidores de puntos de control inmunitario descritos en la presente memoria, tales como los descritos en la Sección C anterior. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan las moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1, tal como cualquiera de los descritos en la Sección C anterior. Como se describió anteriormente, las moléculas de ácido nucleico y las proteínas proporcionadas en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. Tales procedimientos son rutinarios y son bien conocidos por el experto en la técnica. Incluyen técnicas de biología molecular de rutina que incluyen técnicas de síntesis de genes, PCR, ligación, clonación, transfección y purificación.
Los anticuerpos anti-proteínas de puntos de control inmunitario, tales como los anticuerpos anti-CTLA4 o anti-PD-1, se pueden generar o expresar como anticuerpos completos o como anticuerpos de longitud inferior, incluyendo, pero no limitados a, fragmentos de unión a antígeno de los mismos, tales como, por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', bisagra de Fab, F(ab')2, Fv de cadena sencilla (scFv), tándem de scFv, Fv, dsFv, bisagra de scFv, diacuerpo de bisagra de scFv (AE), Fd y Fd'. En general, un fragmento de anticuerpo contiene una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de un anticuerpo, tal como cualquiera de los descritos en la presente memoria.
Se han desarrollado varias técnicas para la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (véase, por ejemplo, Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar por hidrólisis proteolítica de anticuerpos intactos (véanse p. e j., M o r im o to e t a l. (1992 ) J o u rn a l o f B io c h e m ic a l a n d B io p h y s ic a l M e th o d s , 24 :107 -117 ; B re n n a n e t a l. (1985 ) S c ie n c e , 229 :81 ) . P o r e je m p lo , s e p u e d e n g e n e ra r f ra g m e n to s d e m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o p o r e s c is ió n e n z im á tic a , ta l c o m o p o r e s c is ió n co n p e p s in a o p a p a ín a u t il iz a n d o m é to d o s c o n v e n c io n a le s . P o r e je m p lo , t ra s la e s c is ió n c o n la p ro te a s a p a p a ín a , un d ím e ro d e la s re g io n e s c o n s ta n te s d e la c a d e n a p e s a d a , e l d o m in io Fc, s e e s c in d e d e la s d o s re g io n e s F a b (e s d e c ir, la s p o rc io n e s q u e c o n tie n e n la s re g io n e s v a r ia b le s ) .
L o s fra g m e n to s ta m b ié n p u e d e n s e r p ro d u c id o s d ire c ta m e n te p o r c é lu la s a n f it r io n a s re c o m b in a n te s . P o r e je m p lo , los f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s F ab , F v y s c F v s e p u e d e n e x p re s a r y s e c re ta r to d o s a p a r t ir d e la s c é lu la s a n fitr io n a s , ta le s c o m o E. coli, fa c i l i ta n d o a s í la p ro d u c c ió n d e g ra n d e s c a n t id a d e s d e e s to s fra g m e n to s . A d e m á s , lo s f ra g m e n to s F a b '-S H s e p u e d e n a c o p la r q u ím ic a m e n te p a ra fo rm a r f ra g m e n to s F (a b ' )2 (C a r te r e t a l. (1992 ) B io /T e c h n o lo g y , 10: 163 -167 ). S e g ú n o tro e n fo q u e , lo s f ra g m e n to s F (a b ' )2 s e p u e d e n a is la r d ire c ta m e n te d e l c u lt iv o d e c é lu la s a n f it r io n a s re c o m b in a n te s . E n a lg u n o s e je m p lo s , e l a n t ic u e rp o e s un fra g m e n to F v d e c a d e n a s e n c il la (s c F v ) (v é a n s e , p. e j., la P u b lic a c ió n d e P a te n te In te rn a c io n a l N ú m . W O 93 /16185 ; y la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 5.571.894 y 5.587.458 ) . F v y s c F v s o n la s ú n ic a s e s p e c ie s c o n s it io s d e c o m b in a c ió n in ta c to s q u e c a re c e n d e re g io n e s c o n s ta n te s ; p o r lo ta n to , so n a d e c u a d o s p a ra la u n ió n n o e s p e c íf ic a re d u c id a d u ra n te e l u s o in vivo. L a s p ro te ín a s d e fu s ió n d e s c F v s e p u e d e n c o n s tru ir p a ra p ro d u c ir la fu s ió n d e u n a p ro te ín a e fe c to ra en e l e x tre m o a m in o o c a rb o x i d e un s c F v . El f ra g m e n to d e a n t ic u e rp o ta m b ié n p u e d e s e r un a n t ic u e rp o lin e a l (v é a s e , p. e j., la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 5.641.870 ). T a le s f r a g m e n to s d e a n t ic u e rp o s lin e a le s p u e d e n s e r m o n o e s p e c í f ic o s o b ie s p e c íf ic o s . U n e x p e r to en la té c n ic a c o n o c e o tro s m e c a n is m o s p a ra la p ro d u c c ió n d e f ra g m e n to s d e a n tic u e rp o s .
E n a lg u n o s e je m p lo s , e l a n t ic u e rp o en la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s , y la s c o m b in a c io n e s p a ra su u so , e s un a n t ic u e rp o d e c a d e n a s e n c illa . S e p u e d e g e n e ra r un a n t ic u e rp o d e c a d e n a s e n c il la a p a r t ir d e l d o m in io d e u n ió n a a n tíg e n o d e un a n t ic u e rp o . L o s m é to d o s p a ra g e n e ra r a n t ic u e rp o s d e c a d e n a s e n c il la u t iliz a n d o m e c a n is m o s re c o m b in a n te s s o n c o n o c id o s en la té c n ic a , ta le s c o m o lo s d e s c r ito s , p o r e je m p lo , p o r M a ra s c o e t a l. (1993 ) P ro c . N a tl A c a d S c i. U S A 90: 7889 -7893 ; W h it lo w y F ilp u la (1991 ) M e th o d s , 2: 97 -105 ; B ird e t al. (1988 ) S c ie n c e 242 : 423 ­ 426 ; P a c k e t a l. (1993 ) B io /T e c h n o lo g y 11: 1271 -77 ; y la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 4.946.778 , 5.840.300 , 5.667.988 y 5.658.727.
L o s a n t ic u e rp o s d e c a d e n a s e n c il la s e p u e d e n d is e ñ a r d e fo rm a re c o m b in a n te u n ie n d o u n a re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a p e s a d a (V h) y u n a re g ió n v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra (V l) d e un a n t ic u e rp o e s p e c íf ic o . L a s s e c u e n c ia s p a r t ic u la re s d e á c id o n u c le ic o p a ra la s re g io n e s v a r ia b le s s e p u e d e n c lo n a r m e d ia n te m é to d o s c o n v e n c io n a le s d e la b io lo g ía m o le c u la r , ta le s c o m o , p o r e je m p lo , m e d ia n te la re a c c ió n en c a d e n a d e la p o lim e ra s a (P C R ) y o tra s te c n o lo g ía s d e re c o m b in a c ió n d e á c id o s n u c le ic o s . L o s m é to d o s p a ra p ro d u c ir s c F v s o n d e s c r ito s , p o r e je m p lo , p o r W h it lo w y F ilp u la (1991 ) M e th o d s ; 2 :97 -105 ; B ird e t a l. (1988 ) S c ie n c e 242 :423 -426 ; P a c k e t al. (1993 ) B io /T e c h n o lo g y 11 :1271 -77 ; y P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 4.946.778 , 5.840.300 , 5.667.988 , 5.658.727 y 5.258.498.
L o s a n t ic u e rp o s in c lu id o s en la s c o m b in a c io n e s y c o m b in a c io n e s p a ra su u s o en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e n s e r h u m a n iz a d o s . L a s fo rm a s h u m a n iz a d a s d e a n t ic u e rp o s n o h u m a n o s (p. e j., m u r in o s ) s o n a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s d is e ñ a d o s g e n é t ic a m e n te o f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s q u e t ie n e n p o rc io n e s m ín im a s d e r iv a d a s d e a n t ic u e rp o s no h u m a n o s . L o s a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s in c lu y e n a n t ic u e rp o s en lo s q u e la s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d d e un a n t ic u e rp o h u m a n o (a n t ic u e rp o re c e p to r ) s e re e m p la z a n p o r re s id u o s d e u n a re g ió n d e te rm in a n te d e la c o m p le m e n ta r ie d a d d e u n a e s p e c ie n o h u m a n a (a n t ic u e rp o d o n a n te ) ta l c o m o ra tó n , ra ta o c o n e jo , q u e t ie n e n la fu n c io n a lid a d d e s e a d a . E n a lg u n o s c a s o s , lo s re s id u o s d e l m a rc o F v d e l a n t ic u e rp o h u m a n o se re e m p la z a n p o r lo s re s id u o s n o h u m a n o s c o r re s p o n d ie n te s . L o s a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s ta m b ié n p u e d e n c o n te n e r re s id u o s q u e n o s e e n c u e n tra n en e l a n t ic u e rp o re c e p to r n i en la re g ió n d e te rm in a n te d e la c o m p le m e n ta r ie d a d im p o r ta d a n i en la s s e c u e n c ia s m a rc o . En g e n e ra l, e l a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o c o n t ie n e s u s ta n c ia lm e n te to d o s lo s a l m e n o s un o , y t íp ic a m e n te d o s , d o m in io s v a r ia b le s , en lo s c u a le s to d a s , o s u s ta n c ia lm e n te to d a s , la s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d c o r re s p o n d e n a la s d e un a n t ic u e rp o n o h u m a n o y to d a s , o s u s ta n c ia lm e n te to d a s , la s re g io n e s m a rc o c o r re s p o n d e n a la s d e u n a s e c u e n c ia c o n s e n s o h u m a n a re le v a n te . L o s a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s ta m b ié n p u e d e n in c lu ir a l m e n o s u n a p o rc ió n d e u n a re g ió n c o n s ta n te d e l a n t ic u e rp o , ta l c o m o u n a re g ió n Fc, t íp ic a m e n te d e r iv a d a d e un a n t ic u e rp o h u m a n o (v é a n s e , p o r e je m p lo , J o n e s e t a l., 1986 , N a tu re 321 :522 -525 ; R ie c h m a n n e t a l., 1988 , N a tu re 332 :323 -329.; P re s ta , 1992 , C u rr. O p . S tru c t B io l. 2 :593 -596 ).
L o s m é to d o s p a ra h u m a n iz a r a n t ic u e rp o s n o h u m a n o s so n b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . E n g e n e ra l, e l a n t ic u e rp o h u m a n iz a d o t ie n e u n o o m á s re s id u o s d e a m in o á c id o in tro d u c id o s en é l d e s d e u n a fu e n te q u e n o e s h u m a n a . E s to s re s id u o s d e a m in o á c id o n o h u m a n o s , a m e n u d o d e n o m in a d o s re s id u o s im p o r ta d o s , s e to m a n t íp ic a m e n te d e un d o m in io v a r ia b le im p o r ta d o . L a h u m a n iz a c ió n s e p u e d e re a liz a r s u s t itu y e n d o la s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d h u m a n a s , p o r e je m p lo , p o r la s c o r re s p o n d ie n te s re g io n e s d e te rm in a n te s d e la c o m p le m e n ta r ie d a d d e ro e d o re s (v é a n s e , p o r e je m p lo , J o n e s e t a l., 1986 , N a tu re 321 :522 -525 ; R e ic h m a n n e t a l., 1988. N a tu re 332 :323 -327 ; V e rh o e y e n e t a l., 1988 , S c ie n c e 239 :1534 -15361 ; P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m .
4.816.567 ) . P o r c o n s ig u ie n te , ta le s a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s s o n a n t ic u e rp o s q u im é r ic o s , en d o n d e s u s ta n c ia lm e n te m e n o s d e un d o m in io v a r ia b le h u m a n o in ta c to h a s id o s u s t itu id o p o r la s e c u e n c ia c o r re s p o n d ie n te d e u n a e s p e c ie no h u m a n a . E n la p rá c t ic a , lo s a n t ic u e rp o s h u m a n iz a d o s p u e d e n s e r t íp ic a m e n te a n t ic u e rp o s h u m a n o s en lo s q u e a lg u n o s re s id u o s d e la re g ió n d e te rm in a n te d e la c o m p le m e n ta r ie d a d y p o s ib le m e n te a lg u n o s re s id u o s d e l m a rc o e s tá n s u s t itu id o s p o r re s id u o s d e s it io s a n á lo g o s en a n t ic u e rp o s d e ro e d o re s .
T a m b ié n s e c o n o c e n m é to d o s p a ra id e n t if ic a r a n t ic u e rp o s f re n te a u n a d ia n a , ta l c o m o u n a p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io . P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s s e p u e d e n id e n t if ic a r u t i l iz a n d o d iv e rs o s m e c a n is m o s c o n o c id o s en la té c n ic a , in c lu y e n d o la s b ib lio te c a s d e p re s e n ta c ió n en fa g o s (v é a n s e , p o r e je m p lo , H o o g e n b o o m & W in te r , 1991 , J. M o l. B io l. 227 :381 ; M a rk s e t a l., 1991 , J. M o l. B io l. 222 :581 ; C o le e t a l., 1985 , en : M o n o c lo n a l A n t ib o d ie s a n d C a n c e r T h e ra p y , A la n R. L iss , p á g . 77 ; B o e rn e r e t a l., 1991. J. Im m u n o l. 147 :86 -95 ). A d e m á s , lo s a n t ic u e rp o s se p u e d e n g e n e ra r a t ra v é s d e u n o d e v a r io s m é to d o s q u e e m p le a n la in d u c c ió n d e la p ro d u c c ió n in v ivo d e m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o s , e s c ru t in io d e b ib lio te c a s d e in m u n o g lo b u lin a s (O r la n d i. e t a l., 1989. P ro c . N a tl A c a d S c i. 86 :3833 -3837 ; W in te r e t a l., 1991 , N a tu re 349 :293 -299 ) o g e n e ra c ió n d e m o lé c u la s d e a n t ic u e rp o s m o n o c lo n a le s p o r lín e a s c e lu la re s en c u lt iv o . E s to s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, la té c n ic a d e h ib r id o m a , la té c n ic a d e h ib r id o m a d e c é lu la s B h u m a n a s y la té c n ic a d e h ib r id o m a d e l v iru s d e E p s te in -B a r r (E B V ) (K o h le r e t a l., 1975. N a tu re 256 :4950497 ; K o z b o r e t a l., 1985. J. Im m u n o l. M é to d o s 81 :31 -42 ; C o te e t a l., 1983. P ro c . N a tl A c a d S c i. U S A 80 :2026 -2030 ; C o le e t a l., 1984. M o l. C e ll. B io l. 62 :109 -120 ) .
L a s s e c u e n c ia s d e á c id o n u c le ic o d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y la c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e un a n t ic u e rp o o fra g m e n to d e l m is m o , ta le s c o m o c u a lq u ie ra d e la s d e s c r ita s en la p re s e n te m e m o r ia , s e p u e d e n in s e r ta r en v e c to re s p a ra la e x p re s ió n d e a n t ic u e rp o s c o m p le to s y f ra g m e n to s d e a n t ic u e rp o s d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia . P o r e je m p lo , e l á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la s s e c u e n c ia s d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y la c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e Ip il im u m a b (S E Q ID N O : 22 y 24 , re s p e c t iv a m e n te ) o la s s e c u e n c ia s d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y la c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e c u a lq u ie r a n t ic u e rp o d e s c r ito en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e n in s e r ta r en u n a v e c to r d e e x p re s ió n d e s c r ito en la p re s e n te m e m o r ia o c o n o c id o p o r un e x p e rto en la té c n ic a . La to ta lid a d o u n a p o rc ió n d e la re g ió n c o n s ta n te d e la c a d e n a p e s a d a o lig e ra ta m b ié n s e p u e d e n in s e r ta r o p u e d e n e s ta r c o n te n id a s en e l v e c to r p a ra la e x p re s ió n d e a n t ic u e rp o s Ig G o fra g m e n to s d e lo s m is m o s . A d e m á s , la s s e c u e n c ia s V h- C h 1 y V l- C l s e p u e d e n in s e r ta r en un v e c to r d e e x p re s ió n a d e c u a d o p a ra la e x p re s ió n d e m o lé c u la s F ab . L o s d o m in io s d e la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y la c a d e n a lig e ra v a r ia b le d e un a n t ic u e rp o s e p u e d e n e x p re s a r en un v e c to r d e e x p re s ió n a d e c u a d o , ta l c o m o un v e c to r q u e c o d if ic a un c o n e c to r e n tre la c a d e n a p e s a d a v a r ia b le y la c a d e n a lig e ra v a r ia b le p a ra p ro d u c ir a n t ic u e rp o s d e c a d e n a s e n c il la . L o s c o n e c to re s i lu s tra t iv o s in c lu y e n lo s c o n e c to re s f le x ib le s r ic o s en g lic in a ( -G 4S-)n, d o n d e n e s un n ú m e ro e n te ro p o s it iv o , ta l c o m o 1 (S E Q ID N O : 37 ), 2 (S E Q ID N O : 38 ), 3 (S E Q ID N O : 39 ), 4 (S E Q ID N O : 40 ), 5 (S E Q ID N O : 41 ), o m ás .
2. Vectores
P a ra la e x p re s ió n re c o m b in a n te d e u n a o m á s d e la s p ro te ín a s d e s e a d a s , ta le s c o m o c u a lq u ie r p o lip é p tid o d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o o in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p . e j., a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io ) d e s c r ito en la p re s e n te m e m o r ia , e l á c id o n u c le ic o q u e c o n t ie n e to d a o u n a p a rte d e la s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a la p ro te ín a s e p u e d e in s e r ta r en un v e c to r d e e x p re s ió n a p ro p ia d o . La s e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a la p ro te ín a ta m b ié n e s tá g e n e ra lm e n te a c o p la d a a u n a s e c u e n c ia s e ñ a l n a tiv a o h e te ró lo g a . L o s v e c to re s s e p u e d e n s e le c c io n a r p a ra la e x p re s ió n d e la p ro te ín a e n z im á t ic a en la c é lu la o d e ta l m a n e ra q u e la p ro te ín a s e e x p re s e c o m o u n a p ro te ín a s e c re ta d a .
L a s e le c c ió n d e v e c to re s p u e d e d e p e n d e r d e la a p lic a c ió n d e s e a d a . M u c h o s v e c to re s d e e x p re s ió n s e e n c u e n tra n d is p o n ib le s y s o n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . L a e le c c ió n d e un v e c to r d e e x p re s ió n e s tá in f lu e n c ia d a p o r la e le c c ió n d e l s is te m a d e e x p re s ió n d e l a n f it r ió n . T a l s e le c c ió n e s tá d e n tro d e l n iv e l d e h a b ilid a d d e l e x p e rto en la té c n ic a . E l v e c to r c o n t ie n e lo s e le m e n to s n e c e s a r io s p a ra la t ra n s c r ip c ió n y t ra d u c c ió n d e la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e la p ro te ín a in s e rta d a . E n g e n e ra l, lo s v e c to re s d e e x p re s ió n p u e d e n in c lu ir p ro m o to re s t ra n s c r ip c io n a le s y, o p c io n a lm e n te , p o te n c ia d o re s , s e ñ a le s d e tra d u c c ió n y s e ñ a le s d e te rm in a c ió n d e la t ra n s c r ip c ió n y d e la tra d u c c ió n . L a s s e ñ a le s d e tra n s c r ip c ió n y t ra d u c c ió n n e c e s a r ia s ta m b ié n p u e d e n s e r s u m in is tra d a s p o r e l p ro m o to r n a tiv o p a ra lo s g e n e s d e la s e n z im a s y /o s u s re g io n e s f la n q u e a n te s .
L o s v e c to re s d e e x p re s ió n q u e s e u t il iz a n p a ra la t ra n s fo rm a c ió n e s ta b le s u e le n te n e r un m a rc a d o r s e le c c io n a b le q u e p e rm ite la s e le c c ió n y e l m a n te n im ie n to d e la s c é lu la s tra n s fo rm a d a s . E n a lg u n o s c a s o s , s e p u e d e u t i l iz a r un o r ig e n d e re p lic a c ió n p a ra a m p li f ic a r e l n ú m e ro d e c o p ia s d e lo s v e c to re s en la s c é lu la s . L o s v e c to re s ta m b ié n p u e d e n c o n te n e r s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s a d ic io n a le s o p e ra b le m e n te u n id a s a la m o lé c u la d e á c id o n u c le ic o lig a d a (p . e j., e t iq u e ta H is , e t iq u e ta F la g ). P a ra a p lic a c io n e s c o n a n t ic u e rp o s , lo s v e c to re s g e n e ra lm e n te in c lu y e n s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n la re g ió n c o n s ta n te . P o r lo ta n to , lo s a n t ic u e rp o s o p o rc io n e s d e lo s m is m o s ta m b ié n se p u e d e n e x p re s a r c o m o fu s io n e s d e p ro te ín a s . S e p u e d e g e n e ra r u n a p ro te ín a d e fu s ió n p a ra a ñ a d ir fu n c io n a lid a d a d ic io n a l a un p o lip é p tid o . L o s e je m p lo s d e p ro te ín a s d e fu s ió n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, fu s io n e s d e u n a s e c u e n c ia s e ñ a l, u n a e t iq u e ta e p itó p ic a u t il iz a d a p a ra la d e te c c ió n o v is u a liz a c ió n (p. e j., u n a e t iq u e ta H is 6 o u n a e t iq u e ta m y c ), o u n a e t iq u e ta p a ra la p u r if ic a c ió n (p. e j., u n a fu s ió n d e G S T ), y u n a s e c u e n c ia p a ra d ir ig ir la s e c re c ió n d e la p ro te ín a y /o la a s o c ia c ió n c o n la m e m b ra n a .
S e p u e d e u t i l iz a r u n a v a r ie d a d d e s is te m a s d e a n f it r ió n -v e c to r p a ra e x p re s a r la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e la p ro te ín a .
E s to s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, s is te m a s c e lu la re s d e m a m ífe ro in fe c ta d o s c o n v iru s (p. e j., v iru s v a c c in ia , a d e n o v iru s y o tro s v iru s ) ; s is te m a s c e lu la re s d e in s e c to s in fe c ta d o s c o n v iru s (p . e j., b a c u lo v iru s ) ; m ic ro o rg a n is m o s ta le s c o m o le v a d u ra s q u e c o n tie n e n v e c to re s d e le v a d u ra ; o b a c te r ia s t ra n s fo rm a d a s c o n b a c te r ió fa g o s , A D N , A D N p la s m íd ic o o A D N c o s m íd ic o . L o s e le m e n to s d e e x p re s ió n d e lo s v e c to re s v a r ía n en s u s fo r ta le z a s y e s p e c if ic id a d e s . D e p e n d ie n d o d e l s is te m a d e a n f it r ió n -v e c to r u t iliz a d o , s e p u e d e u t i l iz a r c u a lq u ie ra d e lo s n u m e ro s o s e le m e n to s d e tra n s c r ip c ió n y t ra d u c c ió n a d e c u a d o s .
S e p u e d e u t i l iz a r c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a p a ra la in s e rc ió n d e fra g m e n to s d e A D N en un v e c to r p a ra c o n s tru ir v e c to re s d e e x p re s ió n q u e c o n te n g a n un g e n q u im é r ic o q u e c o n te n g a s e ñ a le s d e c o n tro l d e la t ra n s c r ip c ió n / tra d u c c ió n y s e c u e n c ia s c o d if ic a n te s d e p ro te ín a s a p ro p ia d a s . E s to s m é to d o s p u e d e n in c lu ir té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te y s in té t ic a s in v itro y té c n ic a s re c o m b in a n te s in v ivo ( re c o m b in a c ió n g e n é tic a ) . La e x p re s ió n d e s e c u e n c ia s d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a n p ro te ín a s , o d o m in io s , d e r iv a d o s , f ra g m e n to s u h o m ó lo g o s d e la s m is m a s , s e p u e d e re g u la r m e d ia n te u n a s e g u n d a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e m o d o q u e lo s g e n e s o fra g m e n to s d e la m is m a s e e x p re s e n en un a n f it r ió n tra n s fo rm a d o c o n la m o lé c u la o m o lé c u la s d e A D N re c o m b in a n te .
P o r e je m p lo , la e x p re s ió n d e la s p ro te ín a s s e p u e d e c o n t ro la r p o r c u a lq u ie r p ro m o to r /p o te n c ia d o r c o n o c id o en la té c n ic a . L o s p ro m o to re s b a c te r ia n o s a d e c u a d o s s o n b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a , e in c lu y e n p ro m o to re s p a ra c é lu la s d e m a m ífe ro , c é lu la s d e le v a d u ra y c é lu la s d e in s e c to , ta le s c o m o lo s p ro m o to re s i lu s tra d o s a c o n t in u a c ió n . L a s e le c c ió n d e l p ro m o to r u t iliz a d o p a ra d ir ig ir la e x p re s ió n d e un á c id o n u c le ic o h e te ró lo g o d e p e n d e d e la a p lic a c ió n p a rt ic u la r . En u n a re a liz a c ió n e s p e c íf ic a , e l p ro m o to r n o es n a tiv o co n re s p e c to a lo s g e n e s p a ra u n a p ro te ín a d e s e a d a . L o s p ro m o to re s q u e s e p u e d e n u t i l iz a r in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, a q u e llo s p a ra su u s o en v e c to re s d e e x p re s ió n e u c a r ió t ic o s , ta le s c o m o el p ro m o to r te m p ra n o d e S V 40 (B e rn o is t y C h a m b o n , N a tu re 290 :304 -310 (1981 ) ), e l p ro m o to r c o n te n id o en la re p e t ic ió n te rm in a l la rg a 3 ' d e l v iru s d e s a rc o m a d e R o u s (Y a m a m o to e t a l. C e ll 22 :787 -797 (1980 )) , e l p ro m o to r d e la t im id in a q u in a s a de l h e rp e s (W a g n e r y o tro s , P ro c . N a tl A c a d S c i. U S A 78 :1441 -1445 (1981 )), la s s e c u e n c ia s re g u la d o ra s d e l g e n d e la m e ta lo t io n e ín a (B r in s te r e t a l., N a tu re 296 :39 -42 (1982 ) ); en v e c to re s d e e x p re s ió n p ro c a r ió t ic o s , ta le s c o m o el p ro m o to r d e la p - la c ta m a s a (J a y e t a l., (1981 ) P roc . N a tl A c a d S c i. U S A 78 :5543 ) o e l p ro m o to r ta c (D e B o e r e t a l., P ro c . N a tl A c a d S c i. U S A 80 :21 -25 (1983 ); v é a s e ta m b ié n "U s e fu l P ro te in s fro m R e c o m b in a n t B a c te r ia " : en S c ie n t if ic A m e r ic a n 242 :74 -94 (1980 ); v e c to re s d e e x p re s ió n d e p la n ta s , ta le s c o m o el p ro m o to r d e la n o p a lin a s in te ta s a (H e rre ra -E s tre lla e t a l., N a tu re 303 :209 -213 (1984 ) ) o e l p ro m o to r d e A R N 35 S d e l v iru s d e l m o s a ic o d e la c o li f lo r (G a rd n e r e t a l., N u c le ic A c id s R e s . 9 :2871 (1981 )) , y e l p ro m o to r d e la e n z im a fo to s in té t ic a r ib u lo s a b ifo s fa to c a rb o x ila s a (H e rre ra -E s tre lla e t a l., N a tu re 310 :115 -120 (1984 )); e le m e n to s p ro m o to re s d e le v a d u ra y o tro s h o n g o s , ta le s c o m o el p ro m o to r G a l4 , e l p ro m o to r d e la a lc o h o l d e s h id ro g e n a s a , e l p ro m o to r d e la fo s fo g lic e ro l q u in a s a , e l p ro m o to r d e la fo s fa ta s a a lc a lin a y la s s ig u ie n te s re g io n e s d e c o n tro l d e la t ra n s c r ip c ió n a n im a l q u e m u e s tra n e s p e c if ic id a d d e te j id o y s e h a n u t iliz a d o en a n im a le s tra n s g é n ic o s : re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la e la s ta s a I q u e e s a c t iv a en c é lu la s a c in a re s p a n c re á t ic a s (S w if t e t a l., C e ll 38 :639 -646 (1984 ); O rn itz e t a l., C o ld S p r in g H a rb o r S y m p . C u a n t. B io l. 50 :399 -409 (1986 ); M a c D o n a ld , H e p a to lo g y 7 :425 -515 (1987 )) ; la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la in s u lin a q u e e s a c t iv a en la s c é lu la s b e ta p a n c re á t ic a s (H a n a h a n e t a l., N a tu re 315 :115 -122 (1985 )) , la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e in m u n o g lo b u lin a q u e e s a c t iv a en la s c é lu la s lin fo id e s (G ro s s c h e d l e t a l., C e ll 38 :647 -658 (1984 ) ; A d a m s e t a l., N a tu re 318 :533 -538 (1985 ) ; A le x a n d e r e t a l., M o l. C e ll B io l. 7 :1436 -1444 (1987 )) , la re g ió n d e c o n tro l d e l v iru s d e l tu m o r m a m a r io d e ra tó n q u e e s a c t iv a en c é lu la s te s t ic u la re s , m a m a r ia s , l in fo id e s y m a s to c ito s (L e d e r e t a l., C e ll 45 :485 -495 (1986 )) , la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la a lb ú m in a q u e e s a c t iv a en e l h íg a d o (P in k e r t e t a l., G e n e s y D e v e l. 1 :268 -276 (1987 )), la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la a lfa - fe to p ro te ín a q u e e s a c t iv a en e l h íg a d o (K ru m la u f e t a l., M o l. C é lu la . B io l.
5 :1639 -1648 (1985 ); H a m m e r e t a l., S c ie n c e 235 :53 -58 1987 )), la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n a lfa 1 - a n t it r ip s in a q u e es a c t iv a en e l h íg a d o (K e ls e y e t a l., G e n e s y D e v e l. 1 :161 -171 (1987 )) , la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la b e ta -g lo b in a q u e e s a c t iv a en la s c é lu la s m ie lo id e s (M a g ra m e t a l., N a tu re 315 :338 -340 (1985 ); K o llia s e t a l., C e ll 46 :89 -94 (1986 ) ), la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la p ro te ín a b á s ic a d e la m ie lin a q u e e s a c t iv a en lo s o l ig o d e n d ro c ito s de l c e re b ro (R e a d h e a d e t a l., C e ll 48 :703 -712 (1987 )), la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la c a d e n a lig e ra -2 d e la m io s in a q u e e s a c t iv a en e l m ú s c u lo e s q u e lé t ic o (S h a n i, N a tu re 314 :283 -286 (1985 )) , y la re g ió n d e c o n tro l d e l g e n d e la h o rm o n a lib e ra d o ra g o n a d o tró f ic a q u e e s a c t iv a en lo s g o n a d o tro fo s d e l h ip o tá la m o (M a s o n e t a l., S c ie n c e 234 :1372 -1378 (1986 )).
A d e m á s d e l p ro m o to r , e l v e c to r d e e x p re s ió n t íp ic a m e n te c o n t ie n e u n a u n id a d d e tra n s c r ip c ió n o c a s e te d e e x p re s ió n q u e c o n t ie n e to d o s lo s e le m e n to s a d ic io n a le s re q u e r id o s p a ra la e x p re s ió n d e la p ro te ín a en la s c é lu la s a n f it r io n a s . U n c a s e te d e e x p re s ió n t íp ic o c o n t ie n e un p ro m o to r u n id o o p e ra b le m e n te a la s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la p ro te ín a y la s s e ñ a le s re q u e r id a s p a ra u n a p o lia d e n ila c ió n e f ic a z d e l t ra n s c r ito , lo s s it io s d e u n ió n a l r ib o s o m a y la te rm in a c ió n d e la t ra d u c c ió n . L o s e le m e n to s a d ic io n a le s d e l c a s e te p u e d e n in c lu ir p o te n c ia d o re s . A d e m á s , e l c a s e te c o n t ie n e t íp ic a m e n te u n a re g ió n d e te rm in a c ió n d e la t ra n s c r ip c ió n a g u a s a b a jo d e l g e n e s tru c tu ra l p a ra p ro p o rc io n a r u n a te rm in a c ió n e fic a z . L a re g ió n d e te rm in a c ió n s e p u e d e o b te n e r d e l m is m o g e n q u e la s e c u e n c ia p ro m o to ra o s e p u e d e o b te n e r d e d ife re n te s g e n e s .
A lg u n o s s is te m a s d e e x p re s ió n t ie n e n m a rc a d o re s q u e p ro p o rc io n a n a m p lif ic a c ió n d e g e n e s , ta le s c o m o la t im id in a q u in a s a y la d ih id ro fo la to re d u c ta s a . A lte rn a tiv a m e n te , ta m b ié n s o n a d e c u a d o s s is te m a s d e e x p re s ió n d e a lto re n d im ie n to q u e n o im p lic a n a m p lif ic a c ió n g é n ic a , ta l c o m o el u s o d e un v e c to r d e b a c u lo v iru s en c é lu la s d e in s e c to , c o n u n a s e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a p ro te ín a b a jo la d ire c c ió n d e l p ro m o to r d e l p o lie d ro u o tro p ro m o to r d e b a c u lo v iru s fu e r te . E n u n a re a liz a c ió n e s p e c íf ic a , s e u t i l iz a un v e c to r q u e c o n t ie n e un p ro m o to r u n id o o p e ra b le m e n te a lo s á c id o s n u c le ic o s q u e c o d if ic a n u n a p ro te ín a d e s e a d a , o un d o m in io , f ra g m e n to , d e r iv a d o u h o m ó lo g o d e l m is m o , u n o o m á s o r íg e n e s d e re p lic a c ió n y, o p c io n a lm e n te , u n o o m á s m a rc a d o re s s e le c c io n a b le s (p. e j., un g e n d e re s is te n c ia a a n tib ió tic o ) .
S e e n c u e n tra n d is p o n ib le s m u c h o s v e c to re s d e e x p re s ió n y s o n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a y se p u e d e n u t i l iz a r p a ra la e x p re s ió n d e p ro te ín a s . L a e le c c ió n de l v e c to r d e e x p re s ió n e s ta rá in f lu e n c ia d a p o r la e le c c ió n d e l s is te m a d e e x p re s ió n d e l a n fitr ió n . E n g e n e ra l, lo s v e c to re s d e e x p re s ió n p u e d e n in c lu ir p ro m o to re s t ra n s c r ip c io n a le s y, o p c io n a lm e n te , p o te n c ia d o re s , s e ñ a le s d e t ra d u c c ió n y s e ñ a le s d e te rm in a c ió n d e la t ra n s c r ip c ió n y d e la t ra d u c c ió n . L o s v e c to re s d e e x p re s ió n q u e s e u t il iz a n p a ra la t r a n s fo rm a c ió n e s ta b le s u e le n te n e r un m a rc a d o r s e le c c io n a b le q u e p e rm ite la s e le c c ió n y e l m a n te n im ie n to d e la s c é lu la s tra n s fo rm a d a s . En a lg u n o s c a s o s , s e p u e d e u t il iz a r un o r ig e n d e re p lic a c ió n p a ra a m p li f ic a r e l n ú m e ro d e c o p ia s d e l v e c to r .
L o s v e c to re s d e e x p re s ió n i lu s tra t iv o s in c lu y e n c u a lq u ie r v e c to r d e e x p re s ió n d e m a m ífe ro ta l c o m o , p o r e je m p lo , p C M V . P a ra la e x p re s ió n b a c te r ia n a , ta le s v e c to re s in c lu y e n p B R 322 , p U C , p S K F , p E T 23 D y v e c to re s d e fu s ió n ta le s c o m o M B P , G S T y L a c Z . S e p u e d e n u t i l iz a r o tro s v e c to re s e u c a r ió t ic o s , p o r e je m p lo , c u a lq u ie ra q u e c o n te n g a e le m e n to s re g u la d o re s d e v ir u s e u c a r ió t ic o s , c o m o v e c to re s d e e x p re s ió n e u c a r ió t ic o s . E s to s in c lu y e n , p o r e je m p lo , v e c to re s S V 40 , v e c to re s d e v ir u s d e p a p ilo m a y v e c to re s d e r iv a d o s d e l v iru s d e E p s te in -B a r . L o s v e c to re s e u c a r ió t ic o s i lu s tra t iv o s in c lu y e n p M S G , p A V 009 /A , p M T 010 /A , p M A M n e o -5 , b a c u lo v iru s p D S C E , y c u a lq u ie r o tro v e c to r q u e p e rm ita la e x p re s ió n d e p ro te ín a s b a jo la d ire c c ió n d e l p ro m o to r d e C M V , e l p ro m o to r te m p ra n o d e S V 40 , e l p ro m o to r ta rd ío d e S V 40 , e l p ro m o to r d e m e ta lo t io n e ín a , e l p ro m o to r d e l v iru s tu m o ra l m a m a r io m u r in o , el p ro m o to r d e l v iru s d e l s a rc o m a d e R o u s , e l p ro m o to r d e l p o lie d ro u o tro s p ro m o to re s q u e s e h a d e m o s tra d o q u e so n e f ic a c e s p a ra la e x p re s ió n en e u c a r io ta s .
U n v e c to r i lu s tra t iv o p a ra la e x p re s ió n d e c é lu la s d e m a m ífe ro , ta l c o m o p a ra u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , e s e l v e c to r d e e x p re s ió n H Z 24. E l v e c to r d e e x p re s ió n H Z 24 s e o b tu v o d e la c a d e n a p r in c ip a l de l v e c to r pC I (P ro m e g a ). C o n t ie n e A D N q u e c o d if ic a e l g e n d e re s is te n c ia d e la b e ta - la c ta m a s a (A m p R ), un o r ig e n d e re p lic a c ió n F 1, u n a re g ió n d e p o te n c ia d o r /p ro m o to r in m e d ia to te m p ra n o d e C ito m e g a lo v iru s (C M V ) y u n a s e ñ a l d e p o lia d e n ila c ió n ta rd ía d e S V 40 (S V 40 ) . El v e c to r d e e x p re s ió n ta m b ié n t ie n e un s it io in te rn o d e e n tra d a a l r ib o s o m a ( IR E S ) d e l v iru s E C M V (C lo n te c h ) y e l g e n d e la d ih id ro fo la to re d u c ta s a (D H F R ) d e l ra tó n .
L o s v e c to re s d e p lá s m id o s ilu s tra t iv o s p a ra la t ra n s fo rm a c ió n d e c é lu la s d e E. co li in c lu y e n , p o r e je m p lo , lo s v e c to re s d e e x p re s ió n p Q E (d is p o n ib le s en Q ia g e n , V a le n c ia , C A ; c o n s ú lte s e ta m b ié n la b ib lio g ra f ía p u b lic a d a p o r Q ia g e n q u e d e s c r ib e e l s is te m a ) . L o s v e c to re s p Q E t ie n e n un p ro m o to r d e l fa g o T 5 ( re c o n o c id o p o r la A R N p o lim e ra s a d e E. co li) y un m ó d u lo d e re p re s ió n d e l o p e ra d o r la c d o b le p a ra p ro p o rc io n a r u n a e x p re s ió n e s t re c h a m e n te re g u la d a d e a lto n iv e l d e p ro te ín a s re c o m b in a n te s en E. coli, un s it io d e u n ió n r ib o s o m a l s in té t ic o (R B S II) p a ra u n a tra d u c c ió n e f ic a z , u n a s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e la e t iq u e ta 6 X H is , te rm in a d o re s d e la t ra n s c r ip c ió n fe y T 1 , un o r ig e n d e re p lic a c ió n d e C o lE 1 y un g e n d e b e ta - la c ta m a s a p a ra c o n fe r ir re s is te n c ia a la a m p ic i lin a . L o s v e c to re s p Q E p e rm ite n la c o lo c a c ió n d e u n a e t iq u e ta 6 x H is en e l e x tre m o N o C d e la p ro te ín a re c o m b in a n te . T a le s p lá s m id o s in c lu y e n p Q E 32, p Q E 30 y p Q E 31 q u e p ro p o rc io n a n m ú lt ip le s s it io s d e c lo n a c ió n p a ra lo s t re s m a rc o s d e le c tu ra y p ro p o rc io n a n la e x p re s ió n d e p ro te ín a s e t iq u e ta d a s en 6 x H is en e l e x t re m o N te rm in a l. O tro s v e c to re s p la s m íd ic o s ilu s tra t iv o s p a ra la t ra n s fo rm a c ió n d e c é lu la s d e E. co li in c lu y e n , p o r e je m p lo , lo s v e c to re s d e e x p re s ió n p E T (v é a s e , la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s 4.952.496 ; d is p o n ib le en N o v a g e n , M a d is o n , W I; v é a s e , ta m b ié n la b ib lio g ra f ía p u b lic a d a p o r N o v a g e n d e s c r ib ie n d o e l s is te m a ) . T a le s p lá s m id o s in c lu y e n p E T 11a , q u e c o n t ie n e e l p ro m o to r T 7 la c , e l te rm in a d o r T 7 , e l o p e ra d o r la c d e E. c o li in d u c ib le , y e l g e n re p re s o r lac ; p E T 12 a -c , q u e c o n t ie n e e l p ro m o to r T 7 , e l te rm in a d o r T 7 y la s e ñ a l d e s e c re c ió n o m p T d e E. coli; y p E T 15 b y p E T 19 b (N o v a g e n , M a d is o n , W I) , q u e c o n t ie n e n u n a s e c u e n c ia líd e r H is -T a g ™ p a ra su u so en la p u r if ic a c ió n c o n u n a c o lu m n a H is y un s it io d e e s c is ió n d e t r o m b in a q u e p e rm ite la e s c is ió n d e s p u é s d e la p u r if ic a c ió n s o b re la c o lu m n a , la re g ió n p ro m o to ra T 7 - la c y el te rm in a d o r T 7.
S e p u e d e u t i l iz a r c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a p a ra la in s e rc ió n d e fra g m e n to s d e A D N en un v e c to r p a ra c o n s tru ir v e c to re s d e e x p re s ió n q u e c o n t ie n e n un á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a u n a p ro te ín a o u n a c a d e n a d e a n t ic u e rp o . E s to s m é to d o s p u e d e n in c lu ir té c n ic a s d e A D N re c o m b in a n te y s in té t ic a s in v itro y re c o m b in a n te s in v ivo ( re c o m b in a c ió n g e n é tic a ) . L a in s e rc ió n en un v e c to r d e c lo n a c ió n s e p u e d e lo g ra r , p o r e je m p lo , lig a n d o e l f ra g m e n to d e A D N en un v e c to r d e c lo n a c ió n q u e t ie n e e x tre m o s c o h e s iv o s c o m p le m e n ta r io s . S i lo s s it io s d e re s tr ic c ió n c o m p le m e n ta r io s u t iliz a d o s p a ra fr a g m e n ta r e l A D N n o e s tá n p re s e n te s en e l v e c to r d e c lo n a c ió n , lo s e x tre m o s d e la s m o lé c u la s d e A D N s e p u e d e n m o d if ic a r e n z im á t ic a m e n te . A lte rn a tiv a m e n te , s e p u e d e p ro d u c ir c u a lq u ie r s it io d e s e a d o lig a n d o s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s (c o n e c to re s ) en lo s e x tre m o s d e l A D N ; e s to s c o n e c to re s lig a d o s p u e d e n c o n te n e r á c id o s n u c le ic o s s in te t iz a d o s q u ím ic a m e n te e s p e c íf ic o s q u e c o d if ic a n s e c u e n c ia s d e re c o n o c im ie n to d e e n d o n u c le a s a s d e re s tr ic c ió n .
P a ra la e x p re s ió n d e a n t ic u e rp o s , g e n e ra lm e n te , e l á c id o n u c le ic o q u e c o d if ic a la c a d e n a p e s a d a d e un a n t ic u e rp o se clona en un vector y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo se clona en un vector. Los genes se pueden clonar en un solo vector para la expresión dual de los mismos, o en vectores separados. En un ejemplo, el ácido nucleico que codifica la cadena pesada de un anticuerpo se liga en un primer vector de expresión y el ácido nucleico que codifica la cadena ligera de un anticuerpo se liga en un segundo vector de expresión. Los vectores de expresión pueden ser iguales o diferentes, aunque en general son suficientemente compatibles para permitir la expresión comparable de proteínas (cadena pesada y ligera) de los mismos. Si se desea, los vectores también pueden contener secuencias adicionales que codifican regiones constantes o regiones bisagra adicionales para generar otras formas de anticuerpos. Los vectores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, pyIHC y pKLC (Tiller et al. (2008) J Immunol. Methods, 329:112-24). Otros vectores de expresión incluyen el vector de expresión de cadena ligera pAG4622 y el vector de expresión de cadena pesada pAH4604 (Coloma et al. (1992) J Immunol. Methods, 152: 89-104). El vector pAG4622 contiene la secuencia genómica que codifica el dominio de la región C de la cadena k L humana y el marcador seleccionable gpt. Los vectores pAH4604 contienen el marcador seleccionable hisD y las secuencias que codifican el dominio de la región C y1 de la cadena H humana. En otro ejemplo, las cadenas pesada y ligera se pueden clonar en un solo vector que tiene casetes de expresión tanto para la cadena pesada como para la ligera.
3. Células y expresión
En general, cualquier tipo de célula que se pueda diseñar para expresar ADN heterólogo y tenga una vía secretora es adecuada para la expresión de proteínas. Tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo métodos in v ivo e in v itro . Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de las proteínas, tales como, por ejemplo, las cantidades y/o formas necesarias para la administración y el tratamiento.
Los anfitriones de expresión incluyen organismos procarióticos y eucarióticos tales como células bacterianas (p. ej., E. c o li ), levadura, células fúngicas, Archaea, células vegetales, células de insectos, células de mamíferos, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los anfitriones de expresión pueden diferir en sus niveles de producción de proteínas, así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. Adicionalmente, la elección del anfitrión de expresión a menudo está relacionada con la elección del vector y los elementos de transcripción y traducción utilizados. Por ejemplo, la elección del anfitrión de expresión depende a menudo, pero no siempre, de la elección de la secuencia precursora utilizada. Por ejemplo, muchas secuencias de señal heterólogas solo se pueden expresar en una célula anfitriona de la misma especie (es decir, una secuencia de señal de célula de insecto se expresa de manera óptima en una célula de insecto). Por el contrario, otras secuencias señal se pueden utilizar en anfitriones heterólogos tales como, por ejemplo, la secuencia señal de albúmina de suero humana (hHSA) que funciona bien en células anfitrionas de levaduras, insectos o mamíferos y la secuencia pre/pro del activador de plasminógeno tisular que se ha demostrado que es funcional en células de insectos y mamíferos (Tan et al., (2002) Protein Eng. 15:337). La elección del anfitrión de expresión se puede realizar en función de estos y otros factores, tales como las consideraciones reglamentarias y de seguridad, los costes de producción y la necesidad y los métodos de purificación. Por lo tanto, el sistema vector debe ser compatible con la célula anfitriona utilizada.
Se proporcionan células procarióticas y eucarióticas que contienen los vectores. Tales células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archaea, células vegetales, células de insectos y células animales. Las células se utilizan para producir una proteína de la misma haciendo crecer las células descritas anteriormente en condiciones en las que la proteína codificada es expresada por la célula y recuperando la proteína expresada. Por ejemplo, la proteína puede ser secretada al medio.
La expresión en anfitriones eucarióticos puede incluir la expresión en levaduras tales como S a cch a ro m yce s ce re v is ia e y P ich ia p a s to ris , células de insectos tales como células de D ro so p h ila y células de le p id ó p te ro , plantas y células vegetales tales como tabaco, maíz, arroz, algas y Lemna. Las células eucarióticas para la expresión también incluyen líneas de células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñón de cría de hámster (BHK). Los anfitriones de expresión eucarióticos también incluyen la producción en animales transgénicos, por ejemplo, incluyendo la producción en suero, leche y huevos. La expresión eucariótica, tales como los sistemas de expresión de mamíferos, se emplea generalmente cuando se desea la glicosilación de una proteína, tal como para expresar o producir una enzima de degradación de hialuronano glicosilada (p. ej., hialuronidasa soluble, tal como Ph20).
Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas, tales como anticuerpos reensamblados o porciones de los mismos, y son particularmente deseados en aplicaciones de expresión y purificación de proteínas. La transformación en E. c o li es un mecanismo simple y rápido bien conocido por los expertos en la técnica. Las cepas anfitrionas de E. c o li l para la expresión de alto rendimiento incluyen, pero no se limitan a, BL21 (EMD Biosciences) y LMG194 (ATCC). Una cepa anfitrionas de E. co li ilustrativa es BL21. Los vectores para expresión de alto rendimiento incluyen, pero no se limitan a, vectores pBR322 y pUC.
L a s m o lé c u la s re c o m b in a n te s s e p u e d e n in t ro d u c ir en la s c é lu la s a n f it r io n a s m e d ia n te , p o r e je m p lo , t ra n s fo rm a c ió n , t ra n s fe c c ió n , in fe c c ió n , e le c tro p o ra c ió n y s o n o p o ra c ió n , d e m o d o q u e s e g e n e ra n m u c h a s c o p ia s d e la s e c u e n c ia de l g e n . P o r e je m p lo , lo s v e c to re s p u e d e n s e r t r a n s fe c ta d o s y e x p re s a d o s en c é lu la s a n fitr io n a s . E n g e n e ra l, lo s m é to d o s d e t ra n s fe c c ió n c o n v e n c io n a le s s e u t il iz a n p a ra p ro d u c ir lín e a s c e lu la re s d e b a c te r ia s , m a m ífe ro s , le v a d u ra s o in s e c to s q u e e x p re s a n u n a g ra n c a n t id a d d e c a d e n a s d e a n t ic u e rp o s , q u e a c o n t in u a c ió n s e p u r if ic a n u t il iz a n d o té c n ic a s c o n v e n c io n a le s (v é a s e p. e j., C o lle y e t a l. (1989 ) J. B io l. C h e m ., 264 :17619 -17622 ; G u id e to P ro te in P u r if ic a t io n , en M e th o d s in E n z y m o lo g y , v o l. 182 (D e u ts c h e r , e d .), 1990 ).
L a tra n s fo rm a c ió n d e c é lu la s e u c a r ió t ic a s y p ro c a r ió t ic a s s e re a liz a d e a c u e rd o c o n té c n ic a s c o n v e n c io n a le s (v é a n s e , p. e j., M o rr is o n (1977 ) J. B a c t. 132 :349 -351 ; C la rk -C u r t is s y C u r t is s (1983 ) M e th o d s in E n z y m o lo g y , 101 , 347 -362 ). P o r e je m p lo , s e p u e d e u t i l iz a r c u a lq u ie ra d e lo s p ro c e d im ie n to s b ie n c o n o c id o s p a ra in tro d u c ir s e c u e n c ia s d e n u c le ó tid o s fo rá n e a s en la s c é lu la s a n f it r io n a s . E s to s in c lu y e n e l u s o d e t ra n s fe c c ió n c o n fo s fa to d e c a lc io , p o lib re n o , fu s ió n d e p ro to p la s to s , e le c tro p o ra c ió n , b io lís t ic a , l ip o s o m a s , m ic ro in y e c c ió n , v e c to re s d e p la s m a , v e c to re s v ira le s y c u a lq u ie r o tro m é to d o b ie n c o n o c id o p a ra in tro d u c ir A D N g e n ó m ic o c lo n a d o , A D N c , A D N s in té t ic o u o tro m a te r ia l g e n é t ic o fo rá n e o en u n a c é lu la a n fitr io n a .
G e n e ra lm e n te , c o n e l p ro p ó s ito d e e x p re s a r un a n t ic u e rp o , la s c é lu la s a n f it r io n a s s e t ra n s fe c ta n c o n un p r im e r v e c to r q u e c o d if ic a a l m e n o s u n a c a d e n a V h y un s e g u n d o v e c to r q u e c o d if ic a a l m e n o s u n a c a d e n a V l. P o r lo ta n to , s o lo e s n e c e s a r io q u e e l p ro c e d im ie n to d e in g e n ie r ía g e n é t ic a p a r t ic u la r u t i l iz a d o s e a c a p a z d e in tro d u c ir s a t is fa c to r ia m e n te a l m e n o s a m b o s g e n e s en la c é lu la a n f it r io n a c a p a z d e e x p re s a r e l p o lip é p tid o d e l a n t ic u e rp o , o su fo rm a m o d if ic a d a . L o s p r im e ro s y s e g u n d o s v e c to re s d e e x p re s ió n g e n e ra lm e n te s e c o tra n s fe c ta n en c é lu la s a n f it r io n a s , t íp ic a m e n te en u n a p ro p o rc ió n d e 1 :1. L a e x p re s ió n p u e d e e s ta r en c u a lq u ie r s is te m a d e e x p re s ió n c e lu la r c o n o c id o p o r un e x p e rto en la té c n ic a . P o r e je m p lo , la s c é lu la s a n f it r io n a s in c lu y e n c é lu la s q u e d e o tro m o d o n o p ro d u c e n p ro te ín a d e in m u n o g lo b u lin a , p a ra o b te n e r la s ín te s is d e a n t ic u e rp o s en la s c é lu la s a n f it r io n a s re c o m b in a n te s . P o r e je m p lo , la s c é lu la s a n f it r io n a s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, c é lu la s C O S d e s im io , c é lu la s d e o v a r io d e h á m s te r c h in o (C H O ), c é lu la s 293 F S , c é lu la s H E K 293 -6 E , c é lu la s N S O u o tra s c é lu la s d e m ie lo m a . O tro s v e c to re s d e e x p re s ió n y c é lu la s a n f it r io n a s s e d e s c r ib e n en la p re s e n te m e m o r ia .
T ra s la e x p re s ió n , la s c a d e n a s p e s a d a y lig e ra d e l a n t ic u e rp o s e e m p a re ja n m e d ia n te un e n la c e d is u lfu ro p a ra fo rm a r un a n t ic u e rp o c o m p le to o f ra g m e n to s d e l m is m o . P o r e je m p lo , p a ra la e x p re s ió n d e u n a Ig c o m p le ta , se p u e d e n c lo n a r la s s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n V H- C H1 -b is a g ra -C H2 -C H3 en un p r im e r v e c to r d e e x p re s ió n y s e p u e d e n c lo n a r la s s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n lo s d o m in io s V l- C l en un s e g u n d o v e c to r d e e x p re s ió n . T ra s la c o e x p re s ió n de l p r im e r v e c to r d e e x p re s ió n , q u e c o d if ic a lo s d o m in io s V H-C H1 -b is a g ra -C H2 -C H3, y e l s e g u n d o v e c to r d e e x p re s ió n , q u e c o d if ic a lo s d o m in io s V l- C l, s e e x p re s a un a n t ic u e rp o c o m p le to . E n o tro e je m p lo , p a ra g e n e ra r un F ab , las s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n V H- C H1 s e p u e d e n c lo n a r en un p r im e r v e c to r d e e x p re s ió n y la s s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n lo s d o m in io s V l- C l s e p u e d e n c lo n a r en un s e g u n d o v e c to r d e e x p re s ió n . S e g e n e ra n lo s p a re s d e c a d e n a s p e s a d a s c o n u n a c a d e n a lig e ra y un m o n ó m e ro F ab . L a s s e c u e n c ia s d e C h1, b is a g ra , C h2 y /o C h3 d e v a r io s s u b t ip o s d e Ig G s o n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a (v é a s e , p. e j., la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 20080248028 ) . D e l m is m o m o d o , la s s e c u e n c ia s d e C l, la m b d a o ka p p a , ta m b ié n s o n c o n o c id a s (v é a s e , p. e j., la P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 20080248028 ) . E n la p re s e n te m e m o r ia s e p ro p o rc io n a n e je m p lo s d e ta le s s e c u e n c ia s .
a. Células procarióticas
L o s p ro c a r io ta s , e s p e c ia lm e n te E. coli, p ro p o rc io n a n un s is te m a p a ra p ro d u c ir g ra n d e s c a n t id a d e s d e p ro te ín a s . La tra n s fo rm a c ió n en E. co li e s un m e c a n is m o s im p le y rá p id o b ie n c o n o c id o p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . L o s v e c to re s d e e x p re s ió n p a ra E. c o li p u e d e n c o n te n e r p ro m o to re s in d u c ib le s , ta le s p ro m o to re s s o n ú t ile s p a ra in d u c ir a lto s n iv e le s d e e x p re s ió n d e p ro te ín a s y p a ra e x p re s a r p ro te ín a s q u e m u e s tra n c ie r ta to x ic id a d p a ra la s c é lu la s a n f it r io n a s . L o s e je m p lo s d e p ro m o to re s in d u c ib le s in c lu y e n e l p ro m o to r lac , e l p ro m o to r trp , e l p ro m o to r ta c h íb rid o , lo s p ro m o to re s d e A R N T 7 y S P 6 y e l p ro m o to r A P L re g u la d o p o r te m p e ra tu ra .
L a s p ro te ín a s , ta le s c o m o la s q u e s e p ro p o rc io n a n en la p re s e n te m e m o r ia , s e p u e d e n e x p re s a r en e l e n to rn o c ito p lá s m ic o d e E. coli. E l c ito p la s m a e s un e n to rn o re d u c to r y p a ra a lg u n a s m o lé c u la s , e s to p u e d e d a r c o m o re s u lta d o la fo rm a c ió n d e c u e rp o s d e in c lu s ió n in s o lu b le s . S e p u e d e n u t i l iz a r a g e n te s re d u c to re s ta le s c o m o el d it io tre ito l y e l p -m e rc a p to e ta n o l y d e s n a tu ra liz a n te s , ta le s c o m o g u a n id in a -H C l y la u re a , p a ra v o lv e r a s o lu b il iz a r la s p ro te ín a s . U n e n fo q u e a lte rn a t iv o e s la e x p re s ió n d e p ro te ín a s en e l e s p a c io p e r ip lá s m ic o d e la s b a c te r ia s , q u e p ro p o rc io n a un e n to rn o o x id a n te e is o m e ra s a s d e t ip o c h a p e ro n in a y d is u lfu ro y p u e d e c o n d u c ir a la p ro d u c c ió n d e p ro te ín a s s o lu b le s . N o rm a lm e n te , u n a s e c u e n c ia líd e r s e fu s io n a c o n la p ro te ín a q u e s e v a a e x p re s a r , la c u a l d ir ig e la p ro te ín a a l p e r ip la s m a . D e s p u é s , e l líd e r s e e lim in a m e d ia n te p e p tid a s a s s e ñ a l d e n tro d e l p e r ip la s m a .
L o s e je m p lo s d e s e c u e n c ia s líd e r d ir ig id a s a p e r ip la s m a in c lu y e n e l líd e r p e lB d e l g e n d e la p e c ta to l ia s a y e l líd e r d e r iv a d o d e l g e n d e la fo s fa ta s a a lc a lin a . E n a lg u n o s c a s o s , la e x p re s ió n p e r ip lá s m ic a p e rm ite la f i lt r a c ió n d e la p ro te ín a e x p re s a d a a l m e d io d e c u lt iv o . L a s e c re c ió n d e p ro te ín a s p e rm ite u n a p u r if ic a c ió n rá p id a y s e n c il la de l s o b re n a d a n te d e c u lt iv o . L a s p ro te ín a s q u e n o s e s e c re ta n s e p u e d e n o b te n e r d e l p e r ip la s m a p o r lis is o s m ó tic a . D e in m o d o s im ila r a la e x p re s ió n c ito p lá s m ic a , en a lg u n o s c a s o s la s p ro te ín a s p u e d e n v o lv e rs e in s o lu b le s y s e p u e d e n utilizar desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y solubilidad, típicamente se utilizan temperaturas entre 25°C y 37°C. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glicosilación para funcionar, se puede añadir glicosilación in v itro después de la purificación de las células anfitrionas.
b. Células de levadura
Las levaduras tales como S a cch a ro m yce s ce rev isae , S ch iz o s a c c h a ro m y c e s pom be , Y a rrow ia lipo ly tica , K lu y v e ro m y c e s la c tis y P ich ia p a s to r is son anfitriones de expresión de levadura bien conocidos que se pueden utilizar para la producción de proteínas, tales como cualquiera de las descritas en la presente memoria. La levadura se puede transformar con vectores de replicación episómica o mediante integración cromosómica estable por medio de recombinación homóloga. Típicamente, los promotores inducibles se utilizan para regular la expresión génica. Los ejemplos de tales promotores incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneína, tales como CUP1, AOX1 u otros promotores de P ich ia u otras levaduras. Los vectores de expresión a menudo incluyen un marcador seleccionable tal como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para la selección y el mantenimiento del ADN transformado. Las proteínas expresadas en la levadura son a menudo solubles. La coexpresión con chaperoninas tales como Bip y la proteína disulfuro isomerasa puede mejorar los niveles de expresión y la solubilidad. Además, las proteínas expresadas en la levadura se pueden dirigir para la secreción mediante el uso de fusiones peptídicas de señal de secreción, tales como la señal de secreción del factor alfa de apareamiento de la levadura de Saccharomyces cerevisae y fusiones con proteínas de la superficie celular de la levadura, tales como el receptor de adherencia de de apareamiento Aga2p o la glucoamilasa de A rx u la a d e n in iv o ra n s . Se puede diseñar un sitio de escisión para proteasa, tal como para la proteasa Kex-2, para eliminar las secuencias fusionadas de los polipéptidos expresados a medida que salen de la vía de secreción. La levadura también es susceptible de glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de insectos
Las células de insecto, particularmente utilizando la expresión en baculovirus, son útiles para expresar proteínas. Las células de insectos expresan altos niveles de proteína y son capaces de la mayoría de las modificaciones posttraduccionales utilizadas por los eucariotas superiores. Los baculovirus tienen una gama de anfitriones restrictiva que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariótica. Los vectores de expresión típicos utilizan un promotor para la expresión de alto nivel, tales como el promotor de la polihedrina y p10 de baculovirus. Los sistemas de baculovirus utilizados comúnmente incluyen los baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de A u to g ra p h a ca lifo rn ica (AcNPV), y el virus de la polihedrosis nuclear de B o m b y x m o ri (BmNPV) y una línea celular de insecto tal como Sf9 derivada de S p o d o p te ra frug ipe rda , P se u d a le tia u n ip u n c ta (A7S) y D a n a u s p le x ip p u s (DpN1). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos de la molécula que se va a expresar se fusiona inmediatamente aguas abajo del codón de inicio de la polihedrina del virus. Para generar recombinantes de baculovirus capaces de expresar anticuerpos humanos, se puede utilizar una transferencia de expresión dual, tal como pAcUW51 (PharMingen). Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insecto y se pueden utilizar para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares P se u d a le tia u n ip u n c ta (A7S) y D a n a u s p le x ip p u s (DpN1) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas celulares de mamíferos.
Un sistema de expresión alternativo en células de insecto consiste en la utilización de células transformadas de manera estable. Las líneas celulares tales como las células Schneider 2 (S2) y Kc ( D ro sop h ila m e la n o g a s te r ) y las células C7 ( A e d e s a lb o p ic tu s ) se pueden utilizar para la expresión. El promotor de metalotioneína de D ro sop h ila se puede utilizar para inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción de metales pesados con cadmio o cobre. Además, se pueden utilizar las líneas celulares tales como las células Sf9 derivadas de S p o d o p te ra fru g ip e rd a y las células derivadas TN de T richo p lu s ia n i para la expresión. El promotor del gen temprano inmediato de baculovirus IE1 se puede utilizar para inducir niveles consistentes de expresión. Los vectores de expresión típicos incluyen los vectores de transferencia pIE1-3 y pI31-4 (Novagen). Los vectores de expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores seleccionables tales como neomicina e higromicina.
d. Células de mamífero
Se pueden utilizar sistemas de expresión de mamífero para expresar proteínas. Los constructos de expresión se pueden transferir a células de mamíferos por infección viral tal como adenovirus o por transferencia directa de ADN tal como liposomas, fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamíferos incluyen típicamente una protección terminal de ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. También se pueden agregar elementos IRES para permitir la expresión bicistrónica con otro gen, tal como un marcador seleccionable. Tales vectores a menudo incluyen promotores-potenciadores de la transcripción para la expresión de alto nivel, por ejemplo, el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus h u m a n o (C M V ) y la re p e t ic ió n te rm in a l la rg a d e l v iru s d e l s a rc o m a d e R o u s (R S V ). E s to s p ro m o to re s -p o te n c ia d o re s e s tá n a c t iv o s en m u c h o s t ip o s d e c é lu la s . L o s p ro m o to re s d e t ip o t is u la r y c e lu la r y la s re g io n e s p o te n c ia d o ra s ta m b ié n s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra la e x p re s ió n . L a s re g io n e s p ro m o to ra s /p o te n c ia d o ra s ilu s tra t iv a s in c lu y e n , p e ro no s e lim ita n a, a q u e lla s d e g e n e s ta le s c o m o e la s ta s a I, in s u lin a , in m u n o g lo b u lin a , v iru s d e tu m o r m a m a r io d e ra tó n , a lb ú m in a , a lfa fe to p ro te ín a , a lfa 1 a n t it r ip s in a , b e ta g lo b in a , p ro te ín a b á s ic a d e m ie lin a , c a d e n a lig e ra 2 d e m io s in a , y e l c o n tro l d e l g e n d e la h o rm o n a lib e ra d o ra g o n a d o tró p ic a .
L o s m a rc a d o re s s e le c c io n a b le s s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra s e le c c io n a r y m a n te n e r la s c é lu la s co n la c o n s tru c c ió n d e e x p re s ió n . L o s e je m p lo s d e g e n e s m a rc a d o re s s e le c c io n a b le s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, h ig ro m ic in a B fo s fo tra n s fe ra s a , a d e n o s in a d e s a m in a s a , x a n t in a -g u a n in a fo s fo r r ib o s il tra n s fe ra s a , a m in o g lu c ó s id o fo s fo tra n s fe ra s a , d ih id ro fo la to re d u c ta s a (D H F R ) y t im id in a q u in a s a . P o r e je m p lo , la e x p re s ió n s e p u e d e re a liz a r en p re s e n c ia d e m e to tre x a to p a ra s e le c c io n a r s o lo a q u e lla s c é lu la s q u e e x p re s a n e l g e n D H F R . P a ra la e x p re s ió n d e a n t ic u e rp o s , se p u e d e u t i l iz a r un s is te m a N E O R/G 418 , un s is te m a d e d ih id ro fo la to re d u c ta s a (D H F R ) o un s is te m a d e g lu ta m in a s in te ta s a (G S ). E l s is te m a G S u s a v e c to re s d e e x p re s ió n c o n ju n ta , ta le s c o m o p E E 12 /p E E 6 , p a ra e x p re s a r ta n to la c a d e n a p e s a d a c o m o la lig e ra . L a fu s ió n c o n m o lé c u la s d e s e ñ a liz a c ió n d e la s u p e r f ic ie c e lu la r ta le s c o m o T C R -y FceRI-y p u e d e d ir ig ir la e x p re s ió n d e la s p ro te ín a s en un e s ta d o a c t iv o s o b re la s u p e r f ic ie c e lu la r.
S e e n c u e n tra n d is p o n ib le s m u c h a s lín e a s c e lu la re s p a ra la e x p re s ió n d e m a m ífe ro s , in c lu y e n d o c é lu la s d e ra tó n , ra ta , s e r h u m a n o , m o n o , p o llo y h á m s te r . L a s lín e a s c e lu la re s i lu s tra t iv a s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, c é lu la s C H O , B a lb /3 T 3 , H e L a , M T 2 , N S 0 d e ra tó n (n o s e c re to ra ) y o tra s lín e a s c e lu la re s d e m ie lo m a , lín e a s c e lu la re s d e h ib r id o m a y h e te ro h ib r id o m a , lin fo c ito s , f ib ro b la s to s , S p 2 /0 , C O S , N 1H 3 T 3 , H E K 293 , 293 S , 2 B 8 y H K B . T a m b ié n se e n c u e n tra n d is p o n ib le s lín e a s c e lu la re s a d a p ta d a s a m e d io s lib re s d e s u e ro q u e fa c il ita n la p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s s e c re ta d a s d e lo s m e d io s d e c u lt iv o c e lu la r. L o s e je m p lo s in c lu y e n c é lu la s C H O -S ( In v it ro g e n , C a r ls b a d , Ca , N ú m . d e c a tá lo g o 11619 -012 ) y la lín e a c e lu la r E B N A -1 s in s u e ro (P h a m e t a l., (2003 ) B io te c h n o l. B io e n g . 84 :332 -342 ) . T a m b ié n e s tá n d is p o n ib le s lín e a s c e lu la re s q u e e s tá n a d a p ta d a s p a ra c re c e r en m e d io s e s p e c ia le s o p t im iz a d o s p a ra la m á x im a e x p re s ió n . P o r e je m p lo , la s c é lu la s C H O D G 44 e s tá n a d a p ta d a s p a ra c re c e r en c u lt iv o en s u s p e n s ió n en un m e d io s in p ro d u c to s q u ím ic o s , d e fin id o q u ím ic a m e n te .
e. Plantas
S e p u e d e n u t i l iz a r c é lu la s d e p la n ta s tra n s g é n ic a s y p la n ta s p a ra e x p re s a r p ro te ín a s ta le s c o m o c u a lq u ie ra d e la s d e s c r ita s en la p re s e n te m e m o r ia . L a s c o n s tru c c io n e s d e e x p re s ió n s e tra n s f ie re n t íp ic a m e n te a la s p la n ta s u t i l iz a n d o la t ra n s fe re n c ia d ire c ta d e A D N , ta l c o m o el b o m b a rd e o c o n m ic ro p ro y e c t ile s y la t ra n s fe re n c ia m e d ia d a p o r P E G a p ro to p la s to s , y c o n la t r a n s fo rm a c ió n m e d ia d a p o r A g ro b a c te r iu m . L o s v e c to re s d e e x p re s ió n p u e d e n in c lu ir s e c u e n c ia s p ro m o to ra s y p o te n c ia d o ra s , e le m e n to s d e te rm in a c ió n d e la t ra n s c r ip c ió n y e le m e n to s d e c o n tro l d e la tra d u c c ió n .
L o s v e c to re s d e e x p re s ió n y la s té c n ic a s d e t r a n s fo rm a c ió n g e n e ra lm e n te s e d iv id e n e n tre a n f it r io n e s d ic o t ile d ó n e o s , ta le s c o m o A ra b id o p s is y ta b a c o , y m o n o c o t ile d ó n e o s , ta le s c o m o m a íz y a rro z . L o s e je m p lo s d e p ro m o to re s d e p la n ta s u t iliz a d o s p a ra la e x p re s ió n in c lu y e n e l p ro m o to r d e l v iru s d e l m o s a ic o d e la c o lif lo r , e l p ro m o to r d e la n o p a lin a s in te ta s a , e l p ro m o to r d e la r ib o s a b is fo s fa to c a rb o x ila s a y lo s p ro m o to re s d e la u b iq u it in a y U B Q 3.
A m e n u d o s e u t iliz a n m a rc a d o re s s e le c c io n a b le s ta le s c o m o h ig ro m ic in a , fo s fo m a n o s a is o m e ra s a y n e o m ic in a fo s fo tra n s fe ra s a p a ra fa c i l i ta r la s e le c c ió n y e l m a n te n im ie n to d e la s c é lu la s tra n s fo rm a d a s . L a s c é lu la s v e g e ta le s t r a n s fo rm a d a s s e p u e d e n m a n te n e r en c u lt iv o c o m o c é lu la s , p ro d u c to s a g re g a d o s ( te jid o d e c a llo ) o re g e n e ra d a s en p la n ta s c o m p le ta s . L a s c é lu la s d e p la n ta s t r a n s g é n ic a s ta m b ié n p u e d e n in c lu ir a lg a s d is e ñ a d a s p a ra p ro d u c ir p ro te ín a s . D e b id o a q u e la s p la n ta s t ie n e n d ife re n te s p a tro n e s d e g l ic o s ila c ió n q u e la s c é lu la s d e m a m ífe ro s , e s to p u e d e in f lu ir en la e le c c ió n d e la p ro te ín a p ro d u c id a en e s to s a n fitr io n e s .
4. Técnicas de purificación
E l m é to d o p a ra la p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s a p a r t ir d e c é lu la s a n f it r io n a s d e p e n d e rá d e la s c é lu la s a n f it r io n a s y d e lo s s is te m a s d e e x p re s ió n e le g id o s . P a ra la s m o lé c u la s s e c re ta d a s , la s p ro te ín a s g e n e ra lm e n te s e p u r if ic a n d e los m e d io s d e c u lt iv o d e s p u é s d e e lim in a r la s c é lu la s . P a ra la e x p re s ió n in tra c e lu la r , la s c é lu la s s e p u e d e n lis a r y la s p ro te ín a s s e p u e d e n p u r if ic a r a p a r t ir d e l e x tra c to . C u a n d o s e u t il iz a n p a ra la e x p re s ió n , o rg a n is m o s tra n s g é n ic o s , ta le s c o m o p la n ta s y a n im a le s t ra n s g é n ic o s , s e p u e d e n u t i l iz a r te j id o s u ó rg a n o s c o m o m a te r ia l d e p a rt id a p a ra o b te n e r un e x tra c to d e c é lu la s lis a d a s . A d e m á s , la p ro d u c c ió n a n im a l t ra n s g é n ic a p u e d e in c lu ir la p ro d u c c ió n d e p o lip é p tid o s en la le c h e o lo s h u e v o s , q u e s e p u e d e n re c o le c ta r , y si e s n e c e s a r io , la s p ro te ín a s s e p u e d e n e x tra e r y p u r if ic a r a d ic io n a lm e n te u t i l iz a n d o m é to d o s c o n v e n c io n a le s d e la té c n ic a .
C u a n d o la s p ro te ín a s s o n e x p re s a d a s p o r b a c te r ia s t r a n s fo rm a d a s en g ra n d e s c a n t id a d e s , t íp ic a m e n te d e s p u é s d e la in d u c c ió n d e l p ro m o to r , a u n q u e la e x p re s ió n p u e d e s e r c o n s t itu t iv a , lo s p o lip é p tid o s p u e d e n fo rm a r p ro d u c to s a g re g a d o s in s o lu b le s . E x is te n v a r io s p ro to c o lo s q u e s o n a d e c u a d o s p a ra la p u r if ic a c ió n d e c u e rp o s d e in c lu s ió n d e p o lip é p tid o s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . N u m e ro s a s v a r ia c io n e s s e rá n e v id e n te s p a ra lo s e x p e r to s en la té c n ic a .
P o r e je m p lo , en un m é to d o , la s u s p e n s ió n c e lu la r g e n e ra lm e n te s e c e n tr ifu g a y e l s e d im e n to q u e c o n t ie n e lo s c u e rp o s d e in c lu s ió n s e re s u s p e n d e en un ta m p ó n q u e n o s e d is u e lv e s in o q u e la v a lo s c u e rp o s d e in c lu s ió n . p. e j., T r is -H C l 20 m M (p H 7 ,2 ), E D T A 1 m M , N a C l 150 m M y T r ito n -X 100 a l 2 % , un d e te rg e n te n o ió n ic o . P u e d e s e r n e c e s a r io re p e t ir la e ta p a d e la v a d o p a ra e l im in a r la m a y o r c a n t id a d p o s ib le d e re s id u o s c e lu la re s . E l s e d im e n to re s ta n te d e c u e rp o s d e in c lu s ió n s e p u e d e re s u s p e n d e r en u n ta m p ó n a p ro p ia d o (p . e j., fo s fa to d e s o d io 20 m M , pH 6 ,8 , N a C l 150 m M ). O tro s ta m p o n e s a p ro p ia d o s s o n e v id e n te s p a ra lo s e x p e r to s en la té c n ic a .
A lte rn a tiv a m e n te , la s p ro te ín a s p u e d e n s e r p u r if ic a d a s a p a r t ir d e p e r ip la s m a d e b a c te r ia s . C u a n d o la p ro te ín a se e x p o r ta a l p e r ip la s m a d e la s b a c te r ia s , la f ra c c ió n p e r ip lá s m ic a d e la s b a c te r ia s s e p u e d e a is la r p o r c h o q u e o s m ó tic o fr ío a d e m á s d e o tro s m é to d o s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . P o r e je m p lo , en un m é to d o , p a ra a is la r p o lip é p tid o s re c o m b in a n te s d e l p e r ip la s m a , la s c é lu la s b a c te r ia n a s s e c e n tr ifu g a n p a ra fo rm a r un s e d im e n to . El s e d im e n to s e p u e d e re s u s p e n d e r en un ta m p ó n a d e c u a d o q u e c o n t ie n e s a c a ro s a a l 20 % . P a ra l is a r la s c é lu la s , las b a c te r ia s s e p u e d e n c e n tr ifu g a r y e l s e d im e n to s e p u e d e re s u s p e n d e r en M g S O 4 5 m M e n fr ia d o c o n h ie lo y m a n te n e r en un b a ñ o d e h ie lo d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 10 m in u to s . L a s u s p e n s ió n c e lu la r s e c e n tr ifu g a y el s o b re n a d a n te s e d e c a n ta y s e g u a rd a . L a s p ro te ín a s re c o m b in a n te s p re s e n te s en e l s o b re n a d a n te s e p u e d e n s e p a ra r d e la s p ro te ín a s a n f it r io n a s m e d ia n te m e c a n is m o s d e s e p a ra c ió n c o n v e n c io n a le s b ie n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a , ta le s c o m o lo s m e c a n is m o s d e s e p a ra c ió n d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia . E s to s m é to d o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, la s s ig u ie n te s e ta p a s : f ra c c io n a m ie n to d e s o lu b il id a d , f i lt ra c ió n d ife re n c ia l p o r ta m a ñ o y c ro m a to g ra fía en c o lu m n a .
L a s p ro te ín a s s e p u e d e n p u r if ic a r u t iliz a n d o m e c a n is m o s c o n v e n c io n a le s d e p u r if ic a c ió n d e p ro te ín a s c o n o c id o s en la té c n ic a . T a le s m é to d o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, S D S -P A G E , c ro m a to g ra fía d e fra c c io n a m ie n to p o r ta m a ñ o y d e e x c lu s ió n p o r ta m a ñ o , p re c ip ita c ió n c o n s u lfa to d e a m o n io y c ro m a to g ra f ía d e in te rc a m b io ió n ic o , ta l c o m o c ro m a to g ra f ía d e in te rc a m b io a n ió n ic o . P o r e je m p lo , s e p u e d e n u t i l iz a r té c n ic a s d e p u r if ic a c ió n p o r a f in id a d p a ra m e jo ra r la e f ic a c ia y la p u re z a d e la s p re p a ra c io n e s . P o r e je m p lo , lo s a n tic u e rp o s , re c e p to re s y o tra s m o lé c u la s q u e s e u n e n a la s e n z im a s h ia lu ro n id a s a s s e p u e d e n u t i l iz a r en la p u r if ic a c ió n p o r a f in id a d . L a s c o n s tru c c io n e s d e e x p re s ió n ta m b ié n s e p u e d e n d is e ñ a r p a ra a ñ a d ir u n a e t iq u e ta d e a f in id a d a u n a p ro te ín a ta l c o m o un e p íto p o m yc , u n a fu s ió n G S T o H is 6 y s e p u e d e n p u r if ic a r p o r a f in id a d co n a n t ic u e rp o c o n tra m yc , re s in a d e g lu ta t ió n y re s in a d e N i, re s p e c t iv a m e n te . T a le s e t iq u e ta s p u e d e n a y u d a r en lo s m é to d o s d e p u r if ic a c ió n p o r a fin id a d .
L a s té c n ic a s d e p u r if ic a c ió n p o r a f in id a d ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r p a ra la p u r if ic a c ió n d e a n t ic u e rp o s . P o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p ro p o rc io n a d o s en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e n p u r if ic a r m e d ia n te e l u s o d e c ro m a to g ra f ía en c o lu m n a , en d o n d e un m a te r ia l d e c o lu m n a d e s o p o r te s ó lid o e s tá l ig a d o a la P ro te ín a G , u n a p ro te ín a a s o c ia d a a la s u p e r f ic ie c e lu la r d e S trep to coccus , q u e u n e in m u n o g lo b u lin a s co n a lta a f in id a d . E n o tro s e je m p lo s , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e p u e d e n p u r if ic a r p o r c ro m a to g ra fía en c o lu m n a , en d o n d e un m a te r ia l d e c o lu m n a d e s o p o r te s ó lid o e s tá l ig a d o a la P ro te ín a A , u n a p ro te ín a a s o c ia d a a la s u p e r f ic ie c e lu la r d e S ta p h y lo co ccu s q u e s e u n e a la s in m u n o g lo b u lin a s , ta le s c o m o los a n t ic u e rp o s IgG , co n a lta a f in id a d (v é a s e , p. e j., L iu e t a l. (2010 ) M A b s 2 (5 ) :480 -499 ) . O tra s p ro te ín a s b a c te r ia n a s d e u n ió n a in m u n o g lo b u lin a q u e s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra p u r if ic a r lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io q u e s e p ro p o rc io n a n en la p re s e n te m e m o r ia in c lu y e n la P ro te ín a A /G , u n a p ro te ín a d e fu s ió n re c o m b in a n te q u e c o m b in a lo s d o m in io s d e u n ió n a Ig G d e la P ro te ín a A y la P ro te ín a G ; y la P ro te ín a L, u n a p ro te ín a d e s u p e r f ic ie d e P e p to s tre p to c o c c u s (B jo rc k (1988 ) J. Im m u n o l., 140 (4 ) :1194 -1197 ; K a s te rn , e t a l. (1992 ) J. B io l. C h e m . 267 (18 ) :12820 -12825 ; E lia s s o n e t a l. (1988 ) J. B io l. C h e m . 263 :4323 -4327 ) .
L a p u re z a s e p u e d e e v a lu a r m e d ia n te c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o en la té c n ic a , in c lu y e n d o la e le c tro fo re s is en g e l y la s té c n ic a s d e t in c ió n y e s p e c tro fo to m e tr ía . L a s p ro te ín a s s e p u e d e n p u r if ic a r a 60 % , 70 % , 80 % d e p u re z a y t íp ic a m e n te a l m e n o s 90 % , 91 % , 92 % , 93 % , 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % o 99 % d e p u re z a . L a p u re z a s e p u e d e e v a lu a r m e d ia n te m é to d o s c o n v e n c io n a le s ta le s c o m o S D S -P A G E y t in c ió n co n C o o m a s s ie . U n a v e z q u e se o b tie n e n la s p ro te ín a s a d e c u a d a s , s e p u e d e s o m e te r a p ru e b a su a c t iv id a d . P o r e je m p lo , un a n t ic u e rp o s e p u e d e s o m e te r a p ru e b a p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d d e u n ió n m e d ia n te c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o en la té c n ic a , ta l c o m o , p e ro n o lim ita d o a, E L IS A , t ra n s fe re n c ia W e s te rn o re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e rf ic ia l. U n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le o P H 20 s e p u e d e a n a liz a r p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a . U n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o p u r if ic a d a t ie n e t íp ic a m e n te u n a a c t iv id a d e s p e c íf ic a d e a l m e n o s 70 ,000 a 100.000 U n id a d e s /m g , p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 120.000 U n id a d e s /m g . L a a c t iv id a d e s p e c íf ic a p u e d e v a r ia r t ra s la m o d if ic a c ió n , ta l c o m o c o n un p o lím e ro . P o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n un p o lím e ro , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le c o n ju g a d a co n un p o lím e ro (p. e j., P E G P H 20 ) p u e d e te n e r u n a a c t iv id a d e s p e c íf ic a d e 25.000 a 60.000 U n id a d e s /m g , p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 35.000 U n id a d e s /m g .
5. PEGilación de polipéptidos de enzima de degradación de hialuronano
E l p o lie t i le n g lic o l (P E G ) s e h a u t il iz a d o a m p lia m e n te en b io m a te r ia le s , b io te c n o lo g ía y m e d ic in a p r in c ip a lm e n te p o rq u e e l P E G e s un p o lím e ro b io c o m p a t ib le , n o tó x ic o , s o lu b le en a g u a q u e g e n e ra lm e n te n o e s in m u n o g é n ic o
(Z h a o y H a rris , A C S S y m p o s iu m S e r ie s 680 :458 -72 , 1997 ). E n e l á re a d e l s u m in is tro d e fá rm a c o s , lo s d e r iv a d o s d e
P E G s e h a n u t iliz a d o a m p lia m e n te en e l a n c la je c o v a le n te (e s d e c ir , "P E G ila c ió n " ) a p ro te ín a s p a ra re d u c ir la
in m u n o g e n ic id a d , la p ro te ó lis is y e l a c la ra m ie n to re n a l y p a ra a u m e n ta r la s o lu b il id a d (Z a lip s k y , A d v . D ru g D e l. R ev.
16 :157 -82 , 1995 ). D e m a n e ra s im ila r, e l P E G s e h a a n c la d o a fá rm a c o s re la t iv a m e n te h id ró fo b o s d e b a jo p e s o
m o le c u la r p a ra m e jo ra r la s o lu b il id a d , re d u c ir la to x ic id a d y a lte ra r la b io d is tr ib u c ió n . N o rm a lm e n te , lo s fá rm a c o s
P E G ila d o s s e in y e c ta n en fo rm a d e s o lu c io n e s .
U n a a p lic a c ió n e s tre c h a m e n te re la c io n a d a e s la s ín te s is d e re d e s o fo rm u la c io n e s d e P E G d e g ra d a b le s
e n tre c ru z a d a s p a ra su u s o en e l s u m in is tro d e fá rm a c o s , y a q u e g ra n p a rte d e la m is m a q u ím ic a u t il iz a d a en el
d is e ñ o d e p o r ta d o re s d e fá rm a c o s s o lu b le s d e g ra d a b le s ta m b ié n s e p u e d e u t i l iz a r en e l d is e ñ o d e g e le s d e g ra d a b le s
(S a w h n e y e t a l., M a c ro m o le c u le s 26 :581 -87 , 1993 ). T a m b ié n s e s a b e q u e lo s c o m p le jo s in te rm a c ro m o le c u la re s se
p u e d e n fo rm a r m e z c la n d o s o lu c io n e s d e d o s p o lím e ro s c o m p le m e n ta r io s . T a le s c o m p le jo s g e n e ra lm e n te se
e s ta b il iz a n p o r in te ra c c io n e s e le c t ro s tá t ic a s (p o lia n ió n -p o l ic a t ió n ) y /o e n la c e s d e h id ró g e n o (p o liá c id o -p o lib a s e ) e n tre
lo s p o lím e ro s in v o lu c ra d o s , y /o p o r in te ra c c io n e s h id ró fo b a s e n tre lo s p o lím e ro s en un e n to rn o a c u o s o (K ru p e rs e t
a l., E u r. P o ly m J. 32 :785 -790 , 1996 ). P o r e je m p lo , la s s o lu c io n e s m ix ta s d e p o li(á c id o a c r í l ic o ) (P A A c ) y p o li(ó x id o d e
e t ile n o ) (P E O ) en la s c o n d ic io n e s a d e c u a d a s d a c o m o re s u lta d o la fo rm a c ió n d e c o m p le jo s b a s a d o s p r in c ip a lm e n te
en e n la c e s d e h id ró g e n o . L a d is o c ia c ió n d e e s to s c o m p le jo s en c o n d ic io n e s f is io ló g ic a s s e h a u t iliz a d o p a ra el
s u m in is tro d e fá rm a c o s lib re s (e s d e c ir , n o P E G ila d o s ) . A d e m á s , s e h a n fo rm a d o c o m p le jo s d e p o lím e ro s
c o m p le m e n ta r io s a p a r t ir d e h o m o p o lím e ro s y c o p o lím e ro s .
Figure imgf000076_0001
E n un e je m p lo , e l p o lie t i le n g l ic o l t ie n e un p e s o m o le c u la r q u e v a r ía d e a p ro x im a d a m e n te 3 kD a a p ro x im a d a m e n te
50 kD , y t íp ic a m e n te d e a p ro x im a d a m e n te 5 kD a a p ro x im a d a m e n te 30 kD . E l a n c la je c o v a le n te d e l P E G a l fá rm a c o
( c o n o c id o c o m o "P E G ila c ió n " ) s e p u e d e lo g ra r m e d ia n te té c n ic a s d e s ín te s is q u ím ic a c o n o c id a s . P o r e je m p lo , la
P E G ila c ió n d e la p ro te ín a s e p u e d e lo g ra r h a c ie n d o re a c c io n a r e l P E G a c t iv a d o c o n N H S c o n la p ro te ín a en
c o n d ic io n e s d e re a c c ió n a d e c u a d a s .
51 b ie n s e h a n d e s c r ito n u m e ro s a s re a c c io n e s p a ra la P E G ila c ió n , la s q u e s o n m á s g e n e ra lm e n te a p lic a b le s
c o n fie re n d ire c c io n a lid a d , u t iliz a n c o n d ic io n e s d e re a c c ió n m o d e ra d a s y n o re q u ie re n un e x te n s o p ro c e s a m ie n to
a g u a s a b a jo p a ra e lim in a r c a ta liz a d o re s o p ro d u c to s b io ló g ic o s tó x ic o s . P o r e je m p lo , e l m o n o m e to x i P E G (m P E G )
t ie n e s o la m e n te un h id ro x ilo te rm in a l re a c tiv o , y p o r lo ta n to su u s o lim ita a lg o d e la h e te ro g e n e id a d d e la m e z c la
p ro d u c to d e P E G -p ro te ín a re s u lta n te . L a a c t iv a c ió n d e l g ru p o h id ro x ilo en e l e x tre m o d e l p o lím e ro o p u e s to a l g ru p o
m e to x i te rm in a l g e n e ra lm e n te e s n e c e s a r ia p a ra lo g ra r u n a P E G ila c ió n d e la p ro te ín a e fic a z , c o n e l o b je t iv o d e h a c e r
q u e e l P E G d e r iv a t iz a d o s e a m á s s u s c e p tib le a l a ta q u e n u c le o fí lic o . E l n u c le ó fi lo a ta c a n te s u e le s e r e l g ru p o é p s ilo n -a m in o d e un re s id u o d e lis ilo , p e ro ta m b ié n p u e d e n re a c c io n a r o tra s a m in a s (p . e j., la a m in a a lfa N - te rm in a l o las
a m in a s a n u la re s d e la h is t id in a ) si la s c o n d ic io n e s lo c a le s s o n fa v o ra b le s . E s p o s ib le un a n c la je m á s d ir ig id o en
p ro te ín a s q u e c o n t ie n e n u n a s o la l is in a o c is te ín a . E l ú lt im o re s id u o p u e d e s e r d ir ig id o p o r P E G -m a le im id a p a ra la
m o d if ic a c ió n e s p e c íf ic a d e t io l. A lte rn a tiv a m e n te , la P E G h id ra z id a s e p u e d e h a c e r r e a c c io n a r c o n u n a e n z im a d e
d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o o x id a d a c o n p e ry o d a to y s e p u e d e re d u c ir en p re s e n c ia d e N a C N B H 3. M á s
e s p e c íf ic a m e n te , lo s a z ú c a re s d e C M P P E G ila d o s s e p u e d e n h a c e r re a c c io n a r co n u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e
h ia lu ro n a n o en p re s e n c ia d e g lic o s il- t ra n s fe ra s a s a p ro p ia d a s . U n a té c n ic a e s la té c n ic a d e "P E G ila c ió n " en la q u e
v a r ia s m o lé c u la s p o lim é r ic a s s e a c o p la n a l p o lip é p tid o en c u e s t ió n . C u a n d o s e u t il iz a e s ta té c n ic a , e l s is te m a inmunológico tiene dificultades para reconocer los epítopos sobre la superficie del polipéptido responsable de la formación de anticuerpos, lo que reduce la respuesta inmunitaria. Para los polipéptidos introducidos directamente en el sistema circulatorio del cuerpo humano para producir un efecto fisiológico particular (es decir, productos farmacéuticos) la respuesta inmunitaria potencial típica es una respuesta de IgG y/o IgM, mientras que los polipéptidos que se inhalan a través del sistema respiratorio (es decir, polipéptidos industriales) pueden causar potencialmente una respuesta de IgE (es decir, respuesta alérgica). Una de las teorías que explican la respuesta inmunitaria reducida es que las moléculas poliméricas protegen los epítopos sobre la superficie del polipéptido responsable de la respuesta inmunitaria que conduce a la formación de anticuerpos. Otra teoría o al menos un factor parcial es que cuanto más pesado es el producto conjugado, más se obtiene una respuesta inmunitaria reducida.
Típicamente, para preparar las enzimas de degradación de hialuronano PEGiladas proporcionadas en la presente memoria, incluyendo las hialuronidasas PEGiladas, los radicales de PEG se conjugan, mediante anclaje covalente, a los polipéptidos. Las técnicas para la PEGilación incluyen, pero no se limitan a, conectores y químicas de acoplamiento especializados (véase p. ej., Roberts et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), el anclaje de múltiples radicales de PEG a un solo sitio de conjugación (tal como a través del uso de PEG ramificados; véase p. ej., Guiotto et al., Bioorg. Medicina. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGilación específica del sitio y/o mono-PEGilación (véase p. ej., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase p. ej., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Los métodos y mecanismos descritos en la técnica pueden producir proteínas que tengan 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de 10 PEG o derivados de PEG anclados a una única molécula de proteína (véase p. ej., la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0104968).
Como ejemplo ilustrativo de la PEGilación de un método ilustrativo para preparar enzimas de degradación de hialuronano PEGiladas, tales como hialuronidasas PEGiladas, se han aplicado aldehídos, succinimidas y carbonatos de PEG, a los radicales de PEG conjugados, típicamente succinimidil PEG, a rHuPH2020. Por ejemplo, rHuPH20 se ha conjugado con reactivos de succinimidil monoPEG (mPEG) ilustrativos incluyendo mPEG-propionatos de succinimidilo (mPEG-SPA), mPEG-butanoatos de succinimidilo (mPEG-SBA), y (para el anclaje de PEG "ramificados") mPEG2-N-hidroxilsuccinimida. Estos ésteres de succinimidilo PEGilados contienen cadenas principales de carbono de longitud diferente entre el grupo PEG y el entrecruzador activado, y un grupo PEG simple o ramificado. Estas diferencias se pueden utilizar, por ejemplo, para proporcionar diferentes cinéticas de reacción y para restringir potencialmente los sitios disponibles para el anclaje de PEG a rHuPH20 durante el proceso de conjugación.
Los succinimidil PEG (como anteriormente) que comprenden PEG lineales o ramificados se pueden conjugar con rHuPH20. Los PEG se pueden utilizar para generar de manera reproducible rHuPH20 que contienen moléculas que tienen, como promedio, entre aproximadamente tres y seis o de tres a seis moléculas de PEG por hialuronidasa. Tales composiciones de rHuPH20 PEGiladas se pueden purificar fácilmente para producir composiciones que tienen actividades específicas de aproximadamente 25.000 o 30.000 Unidades/mg de proteína de actividad hialuronidasa, y que están sustancialmente libres de rHuPH20 no PEGilada (menos de 5% no PEGilada).
Utilizando varios reactivos de PEG, se pueden preparar versiones ilustrativas de enzimas de degradación de hialuronano, en particular hialuronidasas recombinantes humanas solubles (p. ej., rHuPH20), por ejemplo, utilizando mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD) y versiones ramificadas basadas en mPEG2-NHS (40 kD) y mPEG2-NHS (60 kD). Las versiones PEGiladas de rHuPH20 se han generado utilizando la química de NHS, así como carbonatos y aldehídos, utilizando cada uno de los siguientes reactivos: mPEG2-NHS-40K ramificado, mPEG-NHS-10K ramificado, mPEG-NHS-20K ramificado, mPEG2-NHS-60K ramificado; mPEG-SBA-5K, mPEG-SBA-20K, mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG-butiraldehído; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; y PEG-NHS-5K-biotina. Las hialuronidasas PEGiladas también se han preparado utilizando reactivos de PEG disponibles de Dowpharma, una división de Dow Chemical Corporation; incluyendo las hialuronidasas PEGiladas con carbonato de p-nitrofenilo PEG- de Dowpharma (30 kDa) y con propionaldehído PEG (30 kDa).
En un ejemplo, la PEGilación incluye la conjugación de mPEG-SBA, por ejemplo, mPEG-SBA-30K (que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa) u otros ésteres de succinimidilo de derivado de ácido PEG butanoico, a una hialuronidasa soluble. Los ésteres succinimidílicos de derivados de ácido PEG butanoico, tales como mPEG-SBA-30K, se acoplan fácilmente a grupos amino de proteínas. Por ejemplo, la conjugación covalente de m-PEG-SBA-30K y rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 KDa) proporciona enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema 1 a continuación.
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Típicamente, el mPEG-SBA-30K u otro PEG se añade a la enzima de degradación de hialuronano, en algunos casos una hialuronidasa, en una razón molar PEG:polipéptido de 10:1 en un tampón adecuado, p. ej., NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 o tampón fosfato 70 mM, pH 7, seguido de esterilización p. ej., filtración en condiciones estériles y conjugación continua, por ejemplo, con agitación, durante la noche a 4°C en una habitación fría. En un ejemplo, el PEG-enzima de degradación de hialuronano conjugado se concentra y se cambia el tampón.
Otros métodos de acoplamiento de ésteres de succinimidilo de derivados de ácido PEG butanoico, tales como mPEG-SBA-30K son conocidos en la técnica (véanse, p. ej., las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.672.662; 6.737.505; y la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2004/0235734). Por ejemplo, un polipéptido, tal como una enzima de degradación de hialuronano fp. ej., una hialuronidasa), se puede acoplar a un derivado de PEG activado con NHS por reacción en un tampón de borato (0,1 M, pH 8,0) durante una hora a 4°C. La proteína PEGilada resultante se puede purificar por ultrafiltración. Alternativamente, la PEGilación de una fosfatasa alcalina bovina se puede lograr mezclando la fosfatasa con mPEG-SBA en un tampón que contiene fosfato de sodio 0,2 M y NaCl 0,5 M (pH 7,5) a 4°C durante 30 minutos. El PEG sin reaccionar se puede eliminar mediante ultrafiltración. Otro método hace reaccionar el polipéptido con mPEG-SBA en agua desionizada a la que se añade trietilamina para elevar el pH a 7,2-9. La mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante varias horas para completar la PEGilación.
Los métodos para la PEGilación de polipéptidos de degradación de hialuronano, incluyendo, por ejemplo, hialuronidasas derivadas de animales y enzimas de degradación de hialuronano bacterianas, son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente Europea Núm. EP 0400472, que describe la PEGilación de hialuronidasa testicular bovina y condroitina ABC liasa. También, la Publicación de Estados Unidos Núm.
2006014968 describe la PEGilación de una hialuronidasa humana derivada de PH20 humana. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano PEGilada generalmente contiene al menos 3 radicales de PEG por molécula. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano puede tener una razón molar de PEG con respecto a proteína entre 5:1 y 9:1, por ejemplo, 7:1.
E. Composiciones y formulaciones farmacéuticas
En la presente memoria se proporcionan composiciones o combinaciones de un agente anti-hialuronano y un agente inhibidor de puntos de control inmunitario de acuerdo con las presentes reivindicaciones. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan composiciones o combinaciones de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y un agente inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como una formulación de anticuerpo antiproteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1. La formulación del agente anti-proteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario, se puede coformular o coadministrar con composiciones que contienen un agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano. Típicamente, el agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, se puede proporcionar como una combinación de composiciones separadas que se administran por separado, por ejemplo, para la administración previa de la enzima de degradación de hialuronano como se describe en la presente memoria. Las composiciones o combinación de composiciones se pueden formular para el suministro parenteral fes decir, para el suministro sistémico). Por ejemplo, las composiciones o combinación de composiciones se formulan para el suministro subcutáneo o para el suministro intravenoso.
Las composiciones y combinaciones se pueden formular para la administración de dosificaciones únicas o para la administración de dosificaciones múltiples. Los agentes se pueden formular para administración directa. Las composiciones se pueden proporcionar como una formulación líquida o liofilizada.
Los compuestos se pueden formular en preparaciones farmacéuticas adecuadas tales como soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida o elixires, para administración oral, así como preparación de parches transdérmicos e inhaladores de polvo seco. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas utilizando mecanismos y procedimientos bien conocidos en la técnica (véase p. ej., Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Cuarta edición, 1985, 126). En general, el modo de formulación es una función de la vía de administración. Las composiciones se pueden coformular o proporcionar en forma de composiciones separadas.
En general, las composiciones se formulan en forma liofilizada o líquida. Cuando las composiciones se proporcionan en forma liofilizada, se pueden reconstituir justo antes de su uso por medio un tampón apropiado, por ejemplo, una solución salina estéril. Las composiciones se pueden proporcionar juntas o por separado. Para los fines de la presente memoria, tales composiciones típicamente se proporcionan por separado. El agente anti-hialuronano, por ejemplo, la enzima de degradación del hialuronano (p. ej., una hialuronidasa soluble, tal como una PH20) y un agente anti-proteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario, se pueden empaquetar como composiciones separadas para la administración conjunta, secuencial o intermitente. Las combinaciones se pueden empaquetar en forma de un kit.
Las composiciones se pueden formular para la administración por cualquier vía conocida por los expertos en la técnica, incluyendo la inyección intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, intraperitoneal, la administración subcutánea, intratumoral, epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inhaladora bucal (p. ej., sublingual), y transdérmica o cualquier vía. También se contemplan otros modos de administración. La administración puede ser local, tópica o sistémica, dependiendo del lugar del tratamiento. La administración local en una zona que necesita tratamiento se puede lograr, por ejemplo, pero no se limita a, infusión local durante la cirugía, aplicación tópica, p. ej., junto con un apósito para heridas después de la cirugía, mediante inyección, por medio de un catéter, por medio de un supositorio o por medio de. Las composiciones también se pueden administrar con otros agentes biológicamente activos, ya sea de forma secuencial, intermitente o en la misma composición. La administración también puede incluir sistemas de liberación controlada que incluyen formulaciones de liberación controlada y liberación controlada del dispositivo, por ejemplo, mediante una bomba.
La ruta más adecuada en cualquier caso dado depende de una variedad de factores, tales como la naturaleza, el progreso y la gravedad del cáncer que se está tratando y de la composición particular que se utiliza. Para los fines de la presente memoria, se desea que un agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano (p. ej., una hialuronidasa soluble, como una PH20) y un agente anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario) se administran de manera tal que exista una cantidad o nivel farmacéuticamente disponible en el plasma. Por ejemplo, las composiciones se administran sistémicamente, por ejemplo, mediante administración intravenosa. También se pueden emplear métodos subcutáneos, aunque pueden ser necesarios tiempos de absorción más largos para asegurar una biodisponibilidad equivalente en comparación con los métodos intravenosos. Los agentes, tales como una enzima de degradación de hialuronano y un agente anti-proteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1, se pueden administrar por diferentes vías de administración. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
Se pueden emplear métodos de administración para disminuir la exposición de las enzimas de degradación de hialuronano. p. ej., hialuronidasas solubles y otras moléculas a procesos degradativos, tales como la degradación proteolítica y la intervención inmunológica a través de respuestas antigénicas e inmunogénicas. Los ejemplos de tales métodos incluyen la administración local en el sitio de tratamiento o la infusión continua del agente antihialurónico.
1. Formulaciones
Las composiciones farmacéuticamente aceptables se preparan a tenor de las aprobaciones de una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con una farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y en seres humanos. Las composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Una composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales, tales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio y otros agentes similares. La formulación debe adecuarse al modo de administración.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir portadores tales como un diluyente, coadyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra una enzima o activador. Los ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración apropiada al paciente. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales, tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidina, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes conocidos por los expertos en la técnica. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche en polvo desnatada, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH, por ejemplo, acetato, citrato de sodio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, sal de sodio de acetato de trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes similares.
En un ejemplo, la preparación farmacéutica puede estar en forma líquida, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones. Tales preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendra, ésteres oleosos o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo, o ácido sórbico). En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas pueden presentarse en forma liofilizada para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso.
Los compuestos farmacéuticamente y terapéuticamente activos y los derivados del mismo se formulan y administran típicamente en formas de dosificación unitaria o formas de dosificación múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el portador farmacéutico, vehículo o diluyente requerido. Las formas de dosificación unitaria, incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles y soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de agua y aceite que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las formas de dosis unitarias pueden estar contenidas en ampollas y jeringas o se pueden envasar individualmente en comprimidos o cápsulas. Las formas de dosis unitarias se pueden administrar en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosis unitarias idénticas empaquetadas en un solo recipiente para ser administradas en forma de dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o frascos de 0,57 litros o 4,55 litros. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es un múltiplo de dosis unitarias que no se segregan en el envase. En general, se pueden preparar formas de dosificación o composiciones que contengan ingrediente activo en el intervalo de 0,005% a 100% estando constituido el resto por un portador no tóxico.
La composición farmacéutica se puede formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
a. Inyectables, soluciones y emulsiones.
En la presente memoria se contempla la administración parenteral, generalmente caracterizada por la inyección, por vía subcutánea, intramuscular, intratumoral, intravenosa o intradérmica. Los inyectables se pueden preparar en formas convencionales, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol o etanol. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar también pueden contener un activador en forma de un disolvente tal como agentes tamponadores del pH, sales de iones metálicos u otros tampones similares. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otras cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH, estabilizadores, potenciadores de la solubilidad y otros agentes similares, tales como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y ciclodextrinas. La implantación de un sistema de liberación lenta o de liberación sostenida, de manera que se mantenga un nivel constante de dosificación (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 3.710.795) también se contempla en la presente memoria. El porcentaje de compuesto activo contenido en tales composiciones parenterales es altamente dependiente de la naturaleza específica del mismo, así como de la actividad del compuesto y de las necesidades del sujeto.
Los inyectables están diseñados para la administración local y sistémica. Para los fines de la presente memoria, la administración local se desea para la administración directa al intersticio afectado asociado con hialuronano en exceso o acumulado. Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones estériles listas para inyección, productos solubles secos estériles, tales como polvos liofilizados, listos para ser combinados con un disolvente justo antes de su uso, incluyendo comprimidos hipodérmicos, suspensiones estériles listas para inyección, productos insolubles secos estériles listos para ser combinados con un vehículo justo antes de su uso y emulsiones estériles. Las soluciones pueden ser acuosas o no acuosas. Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables utilizados en preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no acuosos, agentes antimicrobianos, agentes isotónicos, tampones, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsionantes, agentes secuestrantes o quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de vehículos acuosos incluyen la inyección de cloruro de sodio, la inyección de Ringers, la inyección de dextrosa isotónica, la inyección de agua estéril, la inyección de Ringers con dextrosa y lactato añadidos. Los vehículos parenterales no acuosos incluyen aceites fijados de origen vegetal, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz, aceite de sésamo y aceite de cacahuete. Se pueden añadir agentes antimicrobianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas a preparaciones parenterales envasadas en contenedores de dosis múltiples, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales, alcohol bencílico, clorobutanol, ésteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzoico, timerosal, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio.
Los agentes isotónicos incluyen cloruro de sodio y dextrosa. Los tampones incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaína. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona. Los agentes emulsionantes incluyen Polisorbato 80 (TWEEN 80). Un agente secuestrante o quelante de iones metálicos incluye EDTA. Los portadores farmacéuticos también incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y propilenglicol para vehículos miscibles con agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido láctico para ajustar el pH. Si se administran por vía intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica o solución salina tamponada con fosfato (PBS), y soluciones que contienen agentes espesantes y solubilizantes, tales como glucosa, polietilenglicol y polipropilenglicol y mezclas de los mismos.
La concentración del compuesto farmacéuticamente activo se ajusta de modo que una inyección proporcione una cantidad eficaz para producir el efecto farmacológico deseado. La dosis exacta depende de la edad, el peso y el estado del paciente o animal como se conoce en la técnica. Las preparaciones parenterales de dosis unitarias se envasan en una ampolla, un vial o una jeringa con una aguja. El volumen de solución líquida o preparación de polvo reconstituido, que contiene el compuesto farmacéuticamente activo, es una función de la enfermedad que se vaya a tratar y del artículo de manufactura particular elegido para el envase. Todas las preparaciones para administración parenteral deben ser estériles, como se conoce y se practica en la técnica.
b. Polvos liofilizados
Las composiciones proporcionadas en la presente memoria incluyen polvos liofilizados, que se pueden reconstituir para su administración como soluciones, emulsiones y otras mezclas. También se pueden reconstituir y formularse como sólidos o geles. Los polvos liofilizados se pueden preparar a partir de cualquiera de las soluciones descritas anteriormente.
El polvo liofilizado, estéril se prepara disolviendo un compuesto de un agente anti-hialuronano que es una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa soluble, y/o un agente anti-proteína de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1) en una solución tampón. La solución tampón puede contener un excipiente que mejora la estabilidad u otro componente farmacológico del polvo o solución reconstituida, preparado a partir del polvo. La posterior filtración en condiciones estériles de la solución seguida de liofilización en condiciones convencionales conocidas por los expertos en la materia proporciona la formulación deseada. Brevemente, el polvo liofilizado se prepara disolviendo un excipiente, tal como dextrosa, sorbitol, fructosa, jarabe de maíz, xilitol, glicerina, glucosa, sacarosa u otro agente adecuado, en un tampón adecuado, tal como citrato, fosfato de sodio o potasio u otro tampón similar conocido por los expertos en la técnica. A continuación, se añade una enzima seleccionada a la mezcla resultante y se agita hasta que se disuelve. La mezcla resultante se filtra en condiciones estériles o se trata para eliminar los productos particulados y asegurar la esterilidad, y se distribuye en viales para la liofilización. Cada vial contendrá una dosis única (1 mg - 1 g, generalmente 1-100 mg, tal como 1-5 mg) o dosis múltiples del compuesto. El polvo liofilizado se puede almacenar en condiciones apropiadas, tal como de aproximadamente 4°C a temperatura ambiente.
La reconstitución de este polvo liofilizado con una solución tampón proporciona una formulación para su uso en la administración parenteral. La cantidad precisa depende de la indicación tratada y del compuesto seleccionado. Tal cantidad puede ser determinada empíricamente.
c. Composiciones para otras vías de administración
Dependiendo de la afección tratada, también se contemplan en la presente memoria otras vías de administración, tales como aplicación tópica, parches transdérmicos, administración oral y rectal. Por ejemplo, las mezclas tópicas se preparan como se describe para la administración local y sistémica. La mezcla resultante puede ser una solución, suspensión, emulsiones o similares y se formulan como cremas, geles, pomadas, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendas, parches dérmicos o cualquier otra formulación adecuada para administración tópica.
Los compuestos se pueden formular para aplicación local o tópica, tal como para la aplicación tópica en la piel y las membranas mucosas, tal como en el ojo, en forma de geles, cremas y lociones y para la aplicación en el ojo o para aplicación intracisternal o intraespinal. Se contempla la administración tópica para suministro transdérmico y también para administración en los ojos o la mucosa, o para terapias de inhalación. También se pueden administrar soluciones nasales del compuesto activo solo o combinado con otros excipientes farmacéuticamente aceptables. Se proporcionan formulaciones adecuadas para la administración transdérmica. Se pueden proporcionar en cualquier formato adecuado, tal como parches discretos adaptados para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un período prolongado de tiempo. Tales parches contienen el compuesto activo en una solución acuosa opcionalmente tamponada, por ejemplo, a una concentración de 0,1 a 0,2 M con respecto al compuesto activo. Las formulaciones adecuadas para la administración transdérmica también se pueden administrar por iontoforesis (véase, p. ej., Pharmaceutical Research 3 (6), 318 (1986)) y típicamente adoptan la forma de una solución acuosa opcionalmente tamponada del compuesto activo.
Las formas de dosificación farmacéutica para administración rectal son supositorios rectales, cápsulas y comprimidos para el efecto sistémico. Los supositorios rectales incluyen cuerpos sólidos para la inserción en el recto que se funden o ablandan a la temperatura corporal, liberando uno o más ingredientes farmacológicamente o terapéuticamente activos. Las sustancias farmacéuticamente aceptables utilizadas en los supositorios rectales son bases o vehículos y agentes para elevar el punto de fusión. Los ejemplos de bases incluyen manteca de cacao (aceite de teobroma), glicerina-gelatina, Carbowax (polioxietilenglicol) y mezclas apropiadas de mono, di y triglicéridos de ácidos grasos. Se pueden utilizar combinaciones de las diversas bases. Los agentes para elevar el punto de fusión de los supositorios incluyen espermaceti y cera. Los supositorios rectales se pueden preparar por el método de compresión por moldeo. El peso típico de un supositorio rectal es de aproximadamente 2 a 3 g. Las formulaciones adecuadas para administración rectal se pueden proporcionar en forma de supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando el compuesto activo con uno o más portadores sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y a continuación moldeando la mezcla resultante. Los comprimidos y cápsulas para administración rectal se fabrican utilizando la misma sustancia farmacéuticamente aceptable y mediante los mismos métodos que para las formulaciones para administración oral.
Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar, por ejemplo, la forma de comprimidos o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrógeno fosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (p. ej., almidón de patata o sal de sodio de glicolato de almidón); o agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato de sodio). Los comprimidos se pueden recubrir mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las formulaciones adecuadas para la administración bucal (sublingual) incluyen, por ejemplo, píldoras que contienen el compuesto activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto; y pastillas que contienen el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar mediante formulaciones de liberación controlada y/o dispositivos de suministro (véase, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Núm. 3.536.809; 3.598.123; 3.630.200; 3.845.770; 3.847.770; 3.916.899; 4.008.719; 4.687.660; 4.769.027; 5.059.595; 5.073.543; 5.120.548; 5.354.556; 5.591.767; 5.639.476; 5.674.533 y 5.733.566).
Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden utilizar para administrar composiciones seleccionadas, tales como la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el compuesto, endocitosis mediada por receptores y suministro de moléculas de ácido nucleico que codifican una hialuronidasa soluble u otro agente tales como los sistemas de suministro de retrovirus.
Por lo tanto, en ciertas realizaciones, también se pueden emplear liposomas y/o nanopartículas con la administración de composiciones de la presente invención. Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)). Las MLV generalmente tienen diámetros de 25 nm a 4 pm. La sonicación de las MLV da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con diámetros en el in te rv a lo d e 200 a 500 a n g s tro m q u e c o n t ie n e n u n a s o lu c ió n a c u o s a en e l n ú c le o .
L o s fo s fo líp id o s p u e d e n fo rm a r u n a v a r ie d a d d e e s tru c tu ra s d is t in ta s d e lo s lip o s o m a s c u a n d o s e d is p e rs a n en a g u a , d e p e n d ie n d o d e la ra z ó n m o la r d e líp id o c o n re s p e c to a a g u a . A b a ja s p ro p o rc io n e s , s e fo rm a n lo s lip o s o m a s . L a s c a ra c te r ís t ic a s f ís ic a s d e lo s l ip o s o m a s d e p e n d e n d e l pH , la fu e rz a ió n ic a y la p re s e n c ia d e c a t io n e s d iv a le n te s . L o s lip o s o m a s p u e d e n m o s tra r u n a b a ja p e rm e a b ilid a d a s u s ta n c ia s ió n ic a s y p o la re s , p e ro a te m p e ra tu ra s e le v a d a s se s o m e te n a u n a t r a n s ic ió n d e fa s e q u e a lte ra n o ta b le m e n te su p e rm e a b ilid a d . La t ra n s ic ió n d e fa s e im p lic a un c a m b io d e u n a e s tru c tu ra o rd e n a d a y e s t re c h a m e n te e m p a q u e ta d a , c o n o c id a c o m o e s ta d o d e g e l, a u n a e s tru c tu ra m e n o s o rd e n a d a y e m p a q u e ta d a , c o n o c id a c o m o e s ta d o f lu id o . E s to o c u rre a u n a te m p e ra tu ra d e t r a n s ic ió n d e fa s e c a ra c te r ís t ic a y d a c o m o re s u lta d o un a u m e n to d e la p e rm e a b ilid a d a io n e s , a z ú c a re s y fá rm a c o s .
L o s lip o s o m a s in te ra c tú a n c o n la s c é lu la s a t ra v é s d e d ife re n te s m e c a n is m o s : e n d o c ito s is p o r c é lu la s fa g o c í t ic a s de l s is te m a re t ic u lo e n d o te lia l, ta le s c o m o m a c ró fa g o s y n e u tró f ilo s ; a d s o rc ió n a la s u p e r f ic ie c e lu la r, y a s e a p o r fu e rz a s h id ró fo b a s o e le c t ro s tá t ic a s d é b ile s n o e s p e c íf ic a s , o p o r in te ra c c io n e s e s p e c íf ic a s co n c o m p o n e n te s d e la s u p e r f ic ie c e lu la r ; fu s ió n c o n la m e m b ra n a c e lu la r p la s m á tic a m e d ia n te la in s e rc ió n d e la b ic a p a lip íd ic a d e l l ip o s o m a en la m e m b ra n a p la s m á tic a , c o n lib e ra c ió n s im u ltá n e a d e c o n te n id o s l ip o s o m a le s en e l c ito p la s m a ; y p o r t ra n s fe re n c ia d e líp id o s l ip o s o m a le s a m e m b ra n a s c e lu la re s o s u b c e lu la re s , o v ic e v e rs a , s in n in g u n a a s o c ia c ió n d e lo s c o n te n id o s d e lo s lip o s o m a s . L a v a r ia c ió n d e la fo rm u la c ió n d e l lip o s o m a p u e d e a lte ra r q u é m e c a n is m o e s o p e ra tiv o , a u n q u e p u e d e n o p e ra r m á s d e u n o a l m is m o t ie m p o . L a s n a n o c á p s u la s g e n e ra lm e n te p u e d e n a t ra p a r c o m p u e s to s d e m a n e ra e s ta b le y re p ro d u c ib le . P a ra e v ita r lo s e fe c to s s e c u n d a r io s d e b id o s a la s o b re c a rg a d e p o lím e ro s in tra c e lu la re s , e s ta s p a r t íc u la s u ltra f in a s (c o n un ta m a ñ o a p ro x im a d o d e 0,1 p m ) s e d e b e n d is e ñ a r u t i l iz a n d o p o lím e ro s c a p a c e s d e d e g ra d a rs e in vivo. L a s n a n o p a r t íc u la s d e p o lia lq u il-c ia n o a c r i la to b io d e g ra d a b le s q u e c u m p le n e s to s re q u is ito s s e c o n te m p la n p a ra su u so en la p re s e n te m e m o r ia , y ta le s p a r t íc u la s p u e d e n fa b r ic a rs e fá c ilm e n te .
2. Cantidades de formulación
L a s c o m p o s ic io n e s s e p u e d e n fo rm u la r p a ra la a d m in is tra c ió n d e d o s if ic a c ió n ú n ic a o p a ra la a d m in is tra c ió n d e d o s if ic a c io n e s m ú ltip le s . E n a lg u n o s e je m p lo s , lo s a g e n te s e s tá n fo rm u la d o s p a ra la a d m in is tra c ió n d ire c ta .
a. Formulaciones de enzimas de degradación de hialuronano
E n la s c o m p o s ic io n e s o c o m b in a c io n e s d e c o m p o s ic io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia en d o n d e el a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o e s u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro s e fo rm u la en u n a c a n t id a d p a ra a d m in is tra c ió n d ire c ta en un in te rv a lo e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,5 p g a 50 m g, ta l c o m o d e 100 p g a 1 m g , d e 1 m g a 20 m g , d e 100 p g a 5 m g , d e 0 ,5 p g a 1.450 pg , d e 1 p g a 1.000 p g , d e 5 p g a 1.250 p g , d e 10 p g a 750 pg , d e 50 p g a 500 pg , d e 0 ,5 p g a 500 p g o d e 500 p g a 1.450 p g . P o r e je m p lo , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro s e fo rm u la en u n a c a n t id a d p a ra a d m in is tra c ió n d ire c ta en un in te rv a lo e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 15 U n id a d e s (U ) o 150 U n id a d e s (U ) a 60.000 U n id a d e s p o r d o s is , d e 300 U a 30.000 U, d e 500 U a 25.000 U, d e 500 U a 10.000 U, d e 150 U a 15.000 U, d e 150 U a 5.000 U, d e 500 U a 1.000 U, d e 5000 U a 45.000 U, d e 10.000 U a 50.000 U o d e 20.000 U a 60.000 U, p o r e je m p lo a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te o 15 U, 50 U, 100 U, 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1.000 U; 1.250 U; 1.500 U; 2.000 U; 3.000 U; 4.000 U; 5.000 U; 6.000 U; 7.000 U; 8.000 U; 9.000 U; 10.000 U; 20.000 U; 30.000 U; 40.000 U; o 50.000 U.
L a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro en la c o m p o s ic ió n s e p u e d e p ro p o rc io n a r a u n a c o n c e n tra c ió n d e e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 10 U /m L a 15.000 U /m L , d e 10 U /m L a 5.000 U /m L , d e 10 U /m L a 2.000 U /m L , d e 10 U /m L a 1.000 U /m L , d e 10 U /m L a 600 U /m L , d e 10 U /m L a 500 U /m L , d e 30 U /m L a 3.000 U /m L , d e 30 U /m L a 1.000 U /m L , d e 50 U /m L a 4.000 U /m L , d e 100 U /m L a 2.000 U /m L , d e 100 U /m L a 1.000 U /m L , d e 300 U /m L a 2.000 U /m L , d e 600 U /m L a 2.000 U /m L , d e 600 U /m L a 1.000 U /m L , d e 1.000 U /m L a 15.000 U /m L , d e 100 U /m L a 5.000 U /m L , d e 500 U /m L a 5.000 U /m L o d e 100 U /m L a 400 U /m L , p o r e je m p lo a l m e n o s o a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te o a p ro x im a d a m e n te o 30 U /m L , 35 U /m L , 40 U /m L , 50 U /m L , 100 U /m L , 150 U /m L , 200 U /m L , 300 U /m L , 400 U /m L , 500 U /m L , 600 U /m L , 700 U /m L , 800 U /m L , 900 U /m L , 1.000 U /m L , 2.000 U n id a d e s /m L , 3.000 U /m L , 4.000 U /m L , 5.000 U /m L , 6.000 U /m L , 7.000 U /m L , 8.000 U /m L , 9.000 U /m L , 10.000 U /m L , 11.000 U /m L , 12.000 U /m L o 12.800 U /m L .
L a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro s e p u e d e p ro p o rc io n a r a u n a c o n c e n tra c ió n q u e e s tá e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,1 p g /m L y 10 m g /m L , ta l c o m o d e 1 p g /m L a 5 m g /m L o d e 1 m g /m L a 5 m g /m L . E n a lg u n o s e je m p lo s , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro en la c o m p o s ic ió n s e p u e d e p ro p o rc io n a r a u n a c o n c e n tra c ió n d e e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,1 p g /m L a 100 p g /m L , d e 0,1 p g /m L a 50 p g /m L , d e 0,1 p g /m L a 20 p g /m L , d e 1 p g /m L a 100 p g /m L , d e 1 p g /m L a 50 p g /m L , d e 1 p g /m L a 20 p g /m L , d e 20 p g /m L a 100 p g /m L , d e 20 p g /m L a 50 p g /m L o d e 50 p g /m L a 100 p g /m L , p o r e je m p lo a l m e n o s o a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te o a p ro x im a d a m e n te 0 ,1 p g /m L , 1 p g /m L , 5 p g /m L , 10 p g /m L , 20 p g /m L , 30 p g /m L , 40 p g /m L , 50 p g /m L , 60 p g /m L , 70 p g /m L , 80 p g /m L , 90 p g /m L o 100 p g /m L .
El volumen de la composición puede ser de 0,5 mL a 1.000 mL, tal como de 0,5 mLa 100 mL, de 0,5 mL a 10 mL, de 1 mLa 500 mL, de 1 mL a 10 mL, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL o más. La composición generalmente se formula de modo que la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero no se administre en volúmenes superiores a aproximadamente 50 mL, y típicamente se administre en un volumen de 5 a 30 mL, generalmente en un volumen que no sea superior a aproximadamente 10 mL. Para volúmenes más grandes, el tiempo de infusión se puede adaptar para facilitar el suministro del volumen más grande. Por ejemplo, el tiempo de infusión puede ser de al menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora o más.
Por ejemplo, una formulación estabilizada convencional de una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como una hialuronidasa soluble conjugada con polímero como se proporciona en la presente memoria, se formula con uno o más de EDTA, NaCl, CaCl2, histidina, lactosa, albúmina, Pluronic® F68, TWEEN® y/u otros detergentes u otros agentes similares. Por ejemplo, las composiciones proporcionadas en la presente memoria pueden contener uno o más tamponadores de pH (tales como, por ejemplo, histidina, fosfato u otros tampones), o un tampón ácido (tal como acetato, citrato, piruvato, Gly-HCl, succinato, lactato, maleato, u otros tampones), modificador de la tonicidad (tal como, por ejemplo, un aminoácido, polialcohol, NaCl, trehalosa, otras sales y/o azúcares), estabilizador, agente quelante, tal como etilendiaminotetraacetato (EDTA) o EDTA de calcio (CaEDTA), captador de oxígeno, tal como metionina, ácido ascórbico/ascorbato, ácido cítrico/citrato o albúmina y/o un conservante, tal como un conservante que contiene un anillo aromático (p. ej., fenol o cresol).
Los estabilizadores ilustrativos que son útiles para las composiciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano incluyen detergentes, tales como polisorbatos y proteínas tales como albúmina de suero humano. Las concentraciones ilustrativas de albúmina sérica que son útiles en las composiciones de la presente memoria incluyen de 0,1 mg/mL a 1 mg/mL, tal como al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente o 0,1 mg/mL, 0,2 mg/mL, 0,3 mg/mL, 0,4 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,6 mg/mL, 0,7 mg/mL, 0,8 mg/mL, 0,9 mg/mL o 1 mg/mL, pero puede ser más o menos.
Los polisorbatos también pueden estar presentes en las composiciones, por ejemplo, a concentraciones de o aproximadamente entre 0,001% y 0,1%, tales como al menos aproximadamente o al menos o aproximadamente o 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 00,007%, 0,008%, 0,009%, 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09% o 0,1%.
También puede estar presente un agente quelante de metales, tal como el EDTA de calcio (CaEDTA), tal como por ejemplo, a concentraciones de aproximadamente 0,02 mM a 20 mM, tal como al menos aproximadamente o al menos o aproximadamente o 0,02 mM, 0,04 mM, 0,06 mM, 0,08 mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM o más.
El pH y la osmolaridad de las composiciones pueden ser ajustados por un experto en la técnica para optimizar las condiciones para la actividad y estabilidad deseadas de la composición. En algunos ejemplos, las composiciones proporcionadas en la presente memoria tienen una osmolaridad entre 100 mOsm/kg y 500 mOsm/kg, tal como al menos o al menos aproximadamente o tienen o tienen aproximadamente 100 mOsm/kg, 120 mOsm/kg, 140 mOsm/kg, 160 mOsm/kg, 180 mOsm/kg, 200 mOsm/kg, 220 mOsm/kg, 240 mOsm/kg, 260 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 300 mOsm/kg, 320 mOsm/kg, 340 mOsm/kg, 360 mOsm/kg, 380 mOsm/kg, 400 mOsm/kg, 420 mOsm/kg, 440 mOsm/kg, 460 mOsm/kg, 500 o más mOsm/kg, y un pH entre o entre aproximadamente 6 y 8, tal como de 6 a 7,4, por ejemplo en o aproximadamente 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 u 8.
En general, el NaCl se proporciona en formulaciones que contienen una enzima de degradación de hialuronano en la presente memoria, por ejemplo, en una cantidad que es o es de aproximadamente 100 mM a 150 mM o más. Por ejemplo, una formulación ilustrativa puede contener o contener aproximadamente histidina 10 mM y/o contener o contener aproximadamente NaCl 130 mM. Otras formulaciones pueden contener además o alternativamente lactosa, por ejemplo, a o aproximadamente 13 mg/mL. Además, en la formulación puede estar presente un agente antibacteriano o antifúngico, que incluye, pero no se limitan a, tiomersal. Las formulaciones pueden además contener albúmina, Pluronic® F68, TWEEN® y/u otro detergente. Las formulaciones se proporcionan a un pH que es o es aproximadamente de 6,0 a 7,4, tal como al menos 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 o 7,4, en general, eso es o es aproximadamente pH 6,5. Las formulaciones concentradas de una hialuronidasa soluble modificada para su uso en la presente memoria generalmente se diluyen en una solución salina u otra solución tamponada con sal antes de la administración para mantener la concentración de sal apropiada.
b. Formulaciones de inhibidores de puntos de control
En las composiciones o combinaciones de composiciones proporcionadas en la presente memoria, el inhibidor de puntos de control inmunitario se formula en una cantidad para administración directa en un intervalo entre o entre aproximadamente 7,5 mg y aproximadamente 5,000 mg, de aproximadamente 7,5 mg a aproximadamente 1.500 mg, de aproximadamente 7,5 mg a aproximadamente 750 mg, o de aproximadamente 22,5 a aproximadamente 750 mg. En algunos ejemplos, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede formular como una formulación de dosis baja, por ejemplo, para una administración más frecuente. En tales formulaciones, el inhibidor de puntos de control inmunitario se formula para la administración de dosificación única en una cantidad que es menor o menor de aproximadamente 1 mg, 500 |jg, 400 |jg, 300 |jg, 200 |jg, 100 |jg, 50 |jg, 30 |jg, 20 |jg, 10 |jg, 5 |jg o menos de 1 |jg. Por lo tanto, las cantidades no limitantes de inhibidor de puntos de control inmunitario que se formulan para la administración directa incluyen una dosificación que es o es aproximadamente 1 jig 5 jig, 10 jig, 20 jig, 30 jig, 50 jig, 100 jig, 200 jig, 250 jig, 500 jig, 1 mg, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 20 mg, 22,5 mg, 30 mg, 35 mg, 37,5 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 210 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 375 mg, 500 mg, 750 mg, 1.000 mg, 1.500 mg, 2.000 mg, 2.500 mg, 3.000 mg, 3.500 mg, 4.000 mg, 4.500 mg, o 5.000 mg.
Las formulaciones que contienen un inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario, se pueden proporcionar como porcentaje de peso por volumen. Tales concentraciones de un inhibidor de puntos de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, una concentración que es o es aproximadamente de 0,01% a 99,5% p/v, tal como de 0,1% a 90% p/v, de 0,1% a 70% p/v, de 0,1% a 30% p/v, o de 5% a 22% p/v. En ejemplos, el inhibidor de puntos de control inmunitario en las composiciones se puede proporcionar a una concentración que está entre o aproximadamente entre 0,5 mg/mL y 500 mg/mL, tal como de 0,5 mg/mL a 250 mg/mL, de 0,5 mg/mL a 100 mg/mL, de 0,5 mg/mL a 50 mg/mL, de 0,5 mg/mL a 10 mg/mL, de 0,5 mg/mL a 6 mg/mL, de 0,5 mg/mL a 2 mg/mL, de 2 mg/mL a 250 mg/mL, de 2 mg/mL a 100 mg/mL, de 2 mg/mL a 50 mg/mL, de 2 mg/mL a 10 mg/mL, de 2 mg/mL a 6 mg/mL, de 6 mg/mL a 250 mg/mL, de 6 mg/mL a 100 mg/mL, de 6 mg/mL a 50 mg/mL, de 6 mg/mL a 10 mg/mL, de 10 mg/mL a 250 mg/mL, de 10 mg/mL a 100 mg/mL, de 10 mg/mL a 50 mg/mL, de 50 mg/mL a 250 mg/mL, de 50 mg/mL a 100 mg/mL, o de 100 mg/mL a 250 mg/mL. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede proporcionar en la composición a una concentración que sea al menos 0,5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL, 150 mg/mL, 180 mg/mL, 200 mg/mL, 220 mg/mL, 250 mg/mL o más. En algunos casos, el inhibidor de puntos de control inmunitario en la formulación se proporciona en una cantidad que es de al menos 1% (10 mg/mL) a 30% (300 mg/mL), por ejemplo, al menos 1%, 2%, 3 %, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% o más.
El volumen de la composición puede ser de 0,5 mL a 1.000 mL, tal como de 0,5 mL a 100 mL, de 0,5 mL a 10 mL, de 1 mL a 500 mL, de 1 mL a 10 mL, tal como al menos o aproximadamente al menos o aproximadamente o 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL , 70 mL, 80 mL, 90 mL o más. Cuando se administra, la composición se puede administrar por infusión. Para volúmenes más grandes, el tiempo de infusión se puede adaptar para facilitar la administración del volumen más grande. Por ejemplo, el tiempo de infusión puede ser de al menos 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 1 hora, 2 horas o más.
Las preparaciones de anticuerpos proporcionadas en la presente memoria se pueden formular como composiciones farmacéuticas para su uso en dosificaciones únicas o múltiples. Típicamente, el anticuerpo se formula en una cantidad tal que está lista para su uso y que no requiere una dilución adicional. Dependiendo de si la formulación se proporciona como una formulación de dosificación única o múltiple, un experto en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad exacta de anticuerpo en la formulación.
Se entiende que las formulaciones de anticuerpo pueden contener otros componentes, incluyendo portadores, polímeros, lípidos y otros excipientes. Las concentraciones de dosificación anteriores son con respecto al componente del anticuerpo, que es el ingrediente activo.
3. Artículos de empaquetamiento y manufactura
También se describen artículos de manufactura que contienen materiales de empaquetamiento, cualquier composición farmacéutica o combinación proporcionada en la presente memoria, y una etiqueta que indica que las composiciones y combinaciones deben utilizarse para el tratamiento de cánceres, tales como los cánceres caracterizados por tumores sólidos que tienen un fenotipo de HA al menos moderado a alto. Los artículos de manufactura ilustrativos son recipientes que incluyen recipientes de cámara única y de cámara doble. Los recipientes incluyen, pero no se limitan a, tubos, frascos y jeringas. Los recipientes pueden incluir además una aguja para administración subcutánea.
En un ejemplo, el artículo de manufactura contiene una composición farmacéutica que contiene el agente antihialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero y el inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., el anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario), y ningún agente o tratamiento adicional. En otro ejemplo, el artículo de manufactura contiene composiciones farmacéuticas que contienen el agente anti-hialuronano (p. ej., enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como PEGPH20), el inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., el anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario) y una a g e n te te ra p é u t ic o a d ic io n a l (p. e j., un a g e n te q u im io te ra p é u t ic o ) . E n e s te e je m p lo , lo s a g e n te s s e p u e d e n p ro p o rc io n a r ju n to s o p o r s e p a ra d o , p a ra e l e m p a q u e ta m ie n to c o m o a r t íc u lo s d e m a n u fa c tu ra .
L o s a r t íc u lo s d e m a n u fa c tu ra d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia c o n tie n e n m a te r ia le s d e e m p a q u e ta m ie n to . L o s m a te r ia le s d e e m p a q u e ta m ie n to p a ra su u s o en e l e m p a q u e ta d o d e p ro d u c to s fa rm a c é u t ic o s s o n b ie n c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . V é a n s e , p o r e je m p lo , la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 5.323.907 , 5.052.558 y 5.033.252. L o s e je m p lo s d e m a te r ia le s d e e m p a q u e ta m ie n to fa rm a c é u t ic o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, e n v a s e s d e t ip o b u rb u ja , fra s c o s , tu b o s , in h a la d o re s , b o m b a s , b o ls a s , v ia le s , re c ip ie n te s , je r in g a s , f ra s c o s y c u a lq u ie r m a te r ia l d e e m p a q u e ta d o a d e c u a d o p a ra u n a fo rm u la c ió n s e le c c io n a d a y un m o d o d e a d m in is tra c ió n y t r a ta m ie n to p re v is to .
L a e le c c ió n d e l p a q u e te d e p e n d e d e lo s a g e n te s y d e s i ta le s c o m p o s ic io n e s s e e m p a q u e ta rá n ju n ta s o p o r s e p a ra d o . En g e n e ra l, e l e m p a q u e ta d o n o e s re a c t iv o c o n la s c o m p o s ic io n e s c o n te n id a s en é l. E n o tro s e je m p lo s , a lg u n o s d e lo s c o m p o n e n te s s e p u e d e n e m p a q u e ta r c o m o u n a m e z c la . E n o tro s e je m p lo s , to d o s lo s c o m p o n e n te s s e e m p a q u e ta n p o r s e p a ra d o . A s í, p o r e je m p lo , lo s c o m p o n e n te s s e p u e d e n e n v a s a r c o m o c o m p o s ic io n e s s e p a ra d a s q u e , a l m e z c la rs e ju s to a n te s d e la a d m in is tra c ió n , s e p u e d e n a d m in is t ra r d ire c ta m e n te ju n to s . A lte rn a tiv a m e n te , lo s c o m p o n e n te s s e p u e d e n e m p a q u e ta r c o m o c o m p o s ic io n e s s e p a ra d a s p a ra su a d m in is tra c ió n p o r s e p a ra d o .
L o s c o m p o n e n te s p u e d e n s e r e m p a q u e ta d o s en un re c ip ie n te . L o s c o m p o n e n te s s e e m p a q u e ta n p o r s e p a ra d o en el m is m o re c ip ie n te . E n g e n e ra l, lo s e je m p lo s d e ta le s re c ip ie n te s in c lu y e n a q u e llo s q u e t ie n e n un e s p a c io c e r ra d o y d e f in id o q u e c o n t ie n e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , y un e s p a c io s e p a ra d o , c e r ra d o y d e f in id o q u e c o n t ie n e lo s o tro s c o m p o n e n te s o c o m p o n e n te , d e m a n e ra q u e la s á re a s s u b s ig u ie n te s e s tá n s e p a ra d a s p o r u n a m e m b ra n a fá c i lm e n te e x tra íb le q u e , a l re t ira r la , p e rm ite q u e lo s c o m p o n e n te s s e m e z c le n o q u e p e rm ite q u e lo s c o m p o n e n te s s e a d m in is tre n p o r s e p a ra d o . S e c o n te m p la c u a lq u ie r re c ip ie n te u o tro a r t íc u lo d e m a n u fa c tu ra , s ie m p re q u e lo s a g e n te s e s té n s e p a ra d o s d e lo s o tro s c o m p o n e n te s a n te s d e la a d m in is tra c ió n . P a ra e je m p lo s a d e c u a d o s v é a n s e p. e j., lo s re c ip ie n te s d e s c r ito s en la s P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 3.539.794 y 5.171.081.
L a s c o m p o s ic io n e s s e le c c io n a d a s q u e in c lu y e n a r t íc u lo s d e m a n u fa c tu ra d e lo s m is m o s ta m b ié n s e p u e d e n p ro p o rc io n a r en fo rm a d e k its . L o s k its p u e d e n in c lu ir u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e s c r ita en la p re s e n te m e m o r ia y un a r t íc u lo p a ra la a d m in is tra c ió n p ro p o rc io n a d o c o m o un a r t íc u lo d e m a n u fa c tu ra . E l k it p u e d e , o p c io n a lm e n te , in c lu ir in s tru c c io n e s d e a p lic a c ió n q u e in c lu y a n d o s if ic a c io n e s , re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n e in s t ru c c io n e s p a ra los m o d o s d e a d m in is tra c ió n . L o s k its ta m b ié n p u e d e n in c lu ir u n a c o m p o s ic ió n fa rm a c é u tic a d e s c r ita en la p re s e n te m e m o r ia y un a r t íc u lo p a ra d ia g n ó s tic o .
F. Métodos de seguimiento y evaluación de la actividad, biodisponibilidad y farmacocinética
L o s a g e n te s en la s c o m p o s ic io n e s d e la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e n e v a lu a r p o r s u s p ro p ie d a d e s y a c t iv id a d e s re la c io n a d a s c o n su u s o en la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia . L a s p ro p ie d a d e s y a c t iv id a d e s s e p u e d e n re la c io n a r c o n a c t iv id a d e s b io ló g ic a s , tu m o r ig é n ic a s y /o in m u n o re s p o n s a b le s . L o s e n s a y o s se p u e d e n re a liz a r in v itro o in vivo. L o s e n s a y o s s e p u e d e n u t il iz a r p a ra e v a lu a r lo s e fe c to s d e lo s a g e n te s , in c lu y e n d o lo s e fe c to s d e la d o s is y la v ía d e a d m in is tra c ió n .
1. Actividad de hialuronidasa
L a a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a s e p u e d e e v a lu a r u t i l iz a n d o m é to d o s b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . E n p a rt ic u la r , lo s e n s a y o s p a ra la h ia lu ro n id a s a s e p u e d e n d e te rm in a r m id ie n d o la c a n t id a d d e á c id o h ia lu ró n ic o (h ia lu ro n a n o , H A ) q u e s e d e g ra d a . L o s e n s a y o s p u e d e n in c lu ir m é to d o s v is c o s im é tr ic o s y tu rb id im é tr ic o s (D a u b e n m e rk l e t a l. (1957 ) A c ta P h a rm a c o l. e t T o x ic o l, 13 :1 -11 ). L o s e n s a y o s ta m b ié n p u e d e n in c lu ir m é to d o s d e E L IS A , c ro m a to g ra f ía y c o lo r im e tr ía . T a le s e n s a y o s s o n c o n o c id o s p o r un e x p e rto e n la té c n ic a . S e p u e d e n u t i l iz a r e l P a tró n d e R e fe re n c ia d e H ia lu ro n id a s a (U S P ), la S o lu c ió n d e H ia lu ro n id a s a P a tró n d e l F o rm u la r io N a c io n a l (N F ) o e l P a tró n d e re fe re n c ia d e H ia lu ro n id a s a In te rn a c io n a l, en e l q u e u n a u n id a d d e c a d a u n a e s e q u iv a le n te , n un e n s a y o p a ra d e te rm in a r la a c t iv id a d , en u n id a d e s , d e c u a lq u ie r h ia lu ro n id a s a .
U n m é to d o tu rb id im é tr ic o p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a p u e d e in c lu ir lo s p ro c e d im ie n to s d e e n s a y o d e s c r ito s en e l F o rm u la r io N a c io n a l d e la F a rm a c o p e a X X II I d e lo s E s ta d o s U n id o s m e d ia n te la m e d ic ió n d e la c a n t id a d d e á c id o h ia lu ró n ic o o h ia lu ro n a n o (H A ) no d e g ra d a d o , q u e q u e d a d e s p u é s d e q u e la e n z im a re a c c io n e co n e l H A d u ra n te 30 m ín . a 37 °C (U S P XXII-Nf Xv II (1990 ) 644 -645 U n ite d S ta te s P h a rm a c o p e ia C o n v e n tio n , Inc., R o c k v ille , M D ).
P o r e je m p lo , la a c t iv id a d s e p u e d e m e d ir u t i l iz a n d o un e n s a y o d e m ic ro tu rb id e z . E s te s e b a s a en la fo rm a c ió n d e un p ro d u c to p re c ip ita d o in s o lu b le c u a n d o el á c id o h ia lu ró n ic o s e u n e c o n la a lb ú m in a s é r ic a . L a a c t iv id a d s e m id e m e d ia n te la in c u b a c ió n d e h ia lu ro n id a s a c o n h ia lu ro n a to d e s o d io (á c id o h ia lu ró n ic o ) d u ra n te un p e r ío d o d e t ie m p o d e te rm in a d o (p . e j., 10 m in u to s ) y a c o n t in u a c ió n p re c ip ita c ió n d e l h ia lu ro n a to d e s o d io n o d ig e r id o c o n la a d ic ió n d e a lb ú m in a d e s u e ro a c id u la d a . L a tu rb id e z d e la m u e s tra re s u lta n te s e m id e a 640 n m d e s p u é s d e un p e r ío d o d e d e s a rro llo a d ic io n a l. L a d is m in u c ió n d e la tu rb id e z re s u lta n te d e la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a s o b re e l s u s tra to d e h ia lu ro n a to d e s o d io e s u n a m e d id a d e la a c t iv id a d e n z im á t ic a d e la h ia lu ro n id a s a .
E n o tro e je m p lo , la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a s e m id e u t il iz a n d o un e n s a y o d e m ic ro t itu la c ió n en e l q u e e l á c id o h ia lu ró n ic o b io t in ila d o re s id u a l s e m id e d e s p u é s d e la in c u b a c ió n c o n h ia lu ro n id a s a (v é a s e p. e j., F ro s t y S te rn (1997 ) A n a l. B io c h e m . 251 :263 -269 , P u b lic a c ió n d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 20050260186 ) . L o s g ru p o s c a rb o x ilo lib re s en lo s re s id u o s d e á c id o g lu c u ró n ic o d e l á c id o h ia lu ró n ic o e s tá n b io t in ila d o s , y e l s u s tra to d e á c id o h ia lu ró n ic o b io t in ila d o s e a c o p la c o v a le n te m e n te a u n a p la c a d e m ic ro t itu la c ió n . T ra s la in c u b a c ió n co n h ia lu ro n id a s a , e l s u s tra to d e á c id o h ia lu ró n ic o b io t in ila d o re s id u a l s e d e te c ta u t i l iz a n d o u n a re a c c ió n d e a v id in a -p e ro x id a s a , y s e c o m p a ra c o n e l o b te n id o d e s p u é s d e la re a c c ió n c o n p a tro n e s d e h ia lu ro n id a s a d e a c t iv id a d c o n o c id a . T a m b ié n s e c o n o c e n en la té c n ic a o tro s e n s a y o s p a ra m e d ir la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a y s e p u e d e n u t il iz a r en lo s m é to d o s d e la p re s e n te m e m o r ia (v é a s e p. e j., D e lp e c h e t a l., (1995 ) A n a l. B io c h e m . 229 :35 -41 ; T a k a h a s h i e t a l., (2003 ) A n a l. B io c h e m . 322 :257 -263 ) .
T a m b ié n s e p u e d e e v a lu a r la c a p a c id a d d e la h ia lu ro n id a s a p a ra a c tu a r c o m o un a g e n te d e d is p e rs ió n o d ifu s ió n . P o r e je m p lo , s e p u e d e in y e c ta r c o lo ra n te a z u l d e t r ip a n o p o r v ía s u b c u tá n e a c o n o s in h ia lu ro n id a s a en la p ie l la te ra l d e c a d a la d o d e lo s ra to n e s a tím ic o s . D e s p u é s s e m id e e l á re a d e l c o lo ra n te , p o r e je m p lo c o n un m ic ro c a lib re , p a ra d e te rm in a r la c a p a c id a d d e la h ia lu ro n id a s a p a ra a c tu a r c o m o un a g e n te d e d is p e rs ió n (P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 20060104968 ) .
2. Actividad del inhibidor de puntos de control inmunitario
L a a c t iv id a d d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o , s e p u e d e e v a lu a r u t iliz a n d o m é to d o s c o n o c id o s en la té c n ic a , in c lu y e n d o m é to d o s in v itro o in vivo. P o r e je m p lo , s e p u e d e n re a liz a r e n s a y o s in v itro p a ra e v a lu a r la c a p a c id a d d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l p a ra u n irs e a la m o lé c u la d e p u n to s d e c o n tro l d ia n a (p . e j., C T L A 4 o P D -1 ). S e p u e d e n u t i l iz a r o tro s e n s a y o s in v itro p a ra e v a lu a r o tra s a c t iv id a d e s b io ló g ic a s d e lo s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o un a n t ic u e rp o . P o r e je m p lo , s e p u e d e e v a lu a r la c a p a c id a d d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. ej., un a n t ic u e rp o ) p a ra b lo q u e a r lo s p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s y, p o r lo ta n to , e s t im u la r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia , en c é lu la s c u lt iv a d a s , ta le s c o m o la a c t iv a c ió n d e c é lu la s T , la e x p re s ió n d e re c e p to re s e x tra c e lu la re s o la s e c re c ió n d e c ito q u in a s . T a le s a c t iv id a d e s s e p u e d e n e v a lu a r u t iliz a n d o c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o en la té c n ic a , in c lu y e n d o , p e ro n o lim ita d o s a, E L IS A , t ra n s fe re n c ia W e s te rn , t ra n s fe re n c ia N o r th e rn , in m u n o f lu o re s c e n c ia , in m u n o h is to q u ím ic a y c ito m e tr ía d e f lu jo p a ra e v a lu a r la e x p re s ió n d e l m a rc a d o r.
E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , lo s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , p o r e je m p lo lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 , s e p u e d e n a n a liz a r p a ra d e te rm in a r la c a p a c id a d p a ra u n irs e a su a n tíg e n o d e p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o C T L A 4 o P D -1. L o s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , s e p u e d e n e v a lu a r p a ra d e te rm in a r su c a p a c id a d p a ra u n irs e a u n a p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p o r c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o p o r un e x p e rto en la m a te r ia . L o s e n s a y o s p a ra e v a lu a r la u n ió n in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, e n s a y o s d e u n ió n a un s o p o r te s ó lid o , e n s a y o s d e u n ió n en s o lu c ió n o e n s a y o s b a s a d o s en c é lu la s . L o s e n s a y o s i lu s tra t iv o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e rf ic ia l; in te r fe ro m e tr ía d e b io -c a p a ; in m u n o e n s a y o s , ta le s c o m o t ra n s fe re n c ia s W e s te rn , ra d io in m u n o e n s a y o s , E L IS A (e n s a y o d e in m u n o a b s o rc ió n c o n e n z im a lig a d a ), M e s o S c a le D is c o v e ry (M S D , G a ith e rs b u rg , M a ry la n d ), in m u n o e n s a y o s "s á n d w ic h " , e n s a y o s d e in m u n o p re c ip ita c ió n , E L IS P O T , re a c c io n e s c o n p re c ip it in a , re a c c io n e s d e p re c ip it in a p o r d ifu s ió n en g e l, e n s a y o s d e in m u n o d ifu s ió n , e n s a y o s d e a g lu t in a c ió n , e n s a y o s d e f i ja c ió n d e l c o m p le m e n to , e n s a y o s in m u n o r ra d io m é tr ic o s , in m u n o e n s a y o s f lu o re s c e n te s , in m u n o e n s a y o s d e p ro te ín a A , in m u n o f lu o re s c e n c ia , in m u n o h is to q u ím ic a o m ic ro s c o p ía in m u n o e le c tró n ic a ; c a lo r im e tr ía d e t itu la c ió n is o té rm ic a ( IT C ); e n s a y o s e s p e c tro s c ó p ic o s ; y o tro s e n s a y o s p a ra e v a lu a r la u n ió n c o n o c id o s p o r un e x p e rto en la té c n ic a .
S e p u e d e e v a lu a r la u n ió n a la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io c o r re s p o n d ie n te , ta l c o m o la u n ió n a C T L A 4 o P D -1. V a r ia s d e la s p ro te ín a s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io d e s c r ita s en la p re s e n te m e m o r ia so n re c e p to re s q u e e s tá n u n id o s a la m e m b ra n a . T a le s p ro te ín a s s e p u e d e n e x p re s a r en fo rm a d e u n a p ro te ín a s o lu b le , d o n d e la re g ió n u n id a a la m e m b ra n a , ta l c o m o el d o m in io tra n s m e m b ra n a , d e la p ro te ín a s e m o d if ic a o e lim in a , p o r e je m p lo , m e d ia n te e s c is ió n p ro te o lí t ic a o p o r e x p re s ió n re c o m b in a n te d e l á c id o n u c le ic o c o d if ic a n te , p a ra e lim in a r e l d o m in io d e a s o c ia c ió n a la m e m b ra n a y h a c e r q u e la p ro te ín a s e a s o lu b le . L a s fo rm a s s o lu b le s i lu s tra t iv a s d e la s p ro te ín a s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io in c lu y e n p é p tid o s q u e c o r re s p o n d e n a l d o m in io e x tra c e lu la r d e la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , o u n a p o rc ió n d e la m is m a q u e s e a s o lu b le y s e a re c o n o c id a p o r e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p . e j., e l a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io ) .
L o s e n s a y o s d e u n ió n s e p u e d e n re a liz a r en s o lu c ió n , s u s p e n s ió n o s o b re un s o p o r te s ó lid o . P o r e je m p lo , la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io o un f ra g m e n to d e la m is m a s e p u e d e n in m o v i l iz a r en un s o p o r te s ó lid o (p . e j., u n a s u p e r f ic ie d e p lá s t ic o o c a rb o n o , u n a p la c a o c h ip d e c u lt iv o d e te j id o s ) y p o n e r en c o n ta c to c o n e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o u o tro a g e n te d e u n ió n . El in h ib id o r n o u n id o (p. e j., el a n t ic u e rp o ) o la p ro te ín a d ia n a s e p u e d e n la v a r y a c o n t in u a c ió n s e p u e d e n d e te c ta r lo s c o m p le jo s u n id o s . L o s e n s a y o s d e u n ió n s e p u e d e n re a liz a r en c o n d ic io n e s p a ra re d u c ir la u n ió n n o e s p e c íf ic a , p o r e je m p lo , u t i l iz a n d o un ta m p ó n d e a lta fu e rz a ió n ic a (p. e j., N a C l 0 ,3 -0 ,4 M ) c o n d e te rg e n te n o ió n ic o (p . e j., T r ito n X -100 o T w e e n 20 a l 0,1 % ) y /o p ro te ín a s d e b lo q u e o (p. e j., a lb ú m in a d e s u e ro b o v in o o g e la t in a ) . T a m b ié n s e p u e d e n in c lu ir c o n tro le s n e g a t iv o s en d ic h o s e n s a y o s c o m o u n a m e d id a d e u n ió n d e l fo n d o . L a s a f in id a d e s d e u n ió n s e p u e d e n d e te rm in a r u t i l iz a n d o e l a n á lis is d e S c a tc h a rd (M u n s o n e t a l., (1980 ) A n a l. B io c h e m ., 107 :220 ) , re s o n a n c ia d e p la s m ó n s u p e rf ic ia l, c a lo r im e tr ía is o té rm ic a , E L IS A c u a n ti ta t iv o u o tro s m é to d o s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . (p. e j., L il io m e t a l. (1991 ) J. Im m u n o l M e th o d s . 143 (1 ) :119 -25 ).
E n a lg u n o s c a s o s , la u n ió n s e p u e d e e v a lu a r u t i l iz a n d o c é lu la s q u e s e s a b e q u e e x p re s a n la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io d ia n a (p. e j., C T L A 4 o P D -1 ). L a s c é lu la s p u e d e n s e r c é lu la s , lín e a s c e lu la re s o c é lu la s p r im a r ia s g e n e ra d a s p o r t ra n s fe c c ió n t r a n s ito r ia o e s ta b le . P o r e je m p lo , lín e a s c e lu la re s i lu s tra t iv a s q u e e x p re s a n C T L A 4 q u e s e p u e d e n u t i l iz a r en e n s a y o s b a s a d o s en c é lu la s p a ra e s c ru ta r p ro te ín a s d e u n ió n a C T L A , ta le s c o m o a n t ic u e rp o s a n ti-C T L A 4 , in c lu y e n d o , p e ro n o l im ita d o s a, lín e a s c e lu la re s d e a d e n o c a rc in o m a c o lo r re c ta l H C T -8 (A T C C C C L -244 ), H T -29 (A T C C H T B -38 ) , C O L O 205 (A T C C C C L -222 ) y C A C O -2 (A T C C H T B -37 ) ; lín e a s c e lu la re s d e c a rc in o m a d e m a m a , M C F -7 (A T C C H T B -22 ) , M D A -M B -231 (A T C C H T B -26 ) , T -47 D (A T C C H T B -133 ) ; lín e a s c e lu la re s d e c a rc in o m a d e p u lm ó n , C A L U -1 (A T C C H T B -54 ) , C A L U -6 (A T C C H T B -56 ) , A 549 (A T C C C C L -185 ) ; la lín e a c e lu la r d e c a rc in o m a d e o v a r io , S K O V -3 (A T C C H T B -77 ) ; y la lín e a c e lu la r d e c a rc in o m a u te r in o , C 33 A (A T C C H T B -31 ) . L a s lín e a s c e lu la re s ilu s tra t iv a s q u e e x p re s a n P D -1 q u e s e p u e d e n u t i l iz a r en e n s a y o s b a s a d o s en c é lu la s p a ra e s c ru ta r p ro te ín a s in h ib id o ra s d e P D -1 , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n ti-P D -1 , in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, E L 4 (A T C C T IB -39 ) y c é lu la s J u rk a t (A T C C T IB -152 ) .
L a u n ió n s e p u e d e e v a lu a r u t i l iz a n d o la c la s if ic a c ió n d e c é lu la s a c t iv a d a s p o r f lu o re s c e n c ia (F A C S ), in m u n o h is to q u ím ic a o in m u n o f lu o re s c e n c ia . A d e m á s d e la u n ió n c e lu la r , s e p u e d e e m p le a r un e n s a y o p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d fu n c io n a l d e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. e j., e l a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io ) , in c lu y e n d o , p e ro n o lim ita d o a, e n s a y o s p a ra e v a lu a r c a m b io s en la a c t iv a c ió n d e c é lu la s T, c a m b io s en la m o r fo lo g ía c e lu la r, y /o c a m b io s en la a c t iv a c ió n tra n s c r ip c io n a l, ta l c o m o la e x p re s ió n c e lu la r d e un g e n n a tu ra l o un g e n in fo rm a d o r.
S e p u e d e n t r a ta r c é lu la s d e te rm in a d a s a p ro p ia d a s p a ra un e n s a y o fe n o t íp ic o p a r t ic u la r (e s d e c ir , c u a lq u ie r c é lu la d e s c r ita en la p re s e n te m e m o r ia o c o n o c id a en la té c n ic a p o r e x p re s a r u n a p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e le c c io n a d a ) co n un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , a s í c o m o un c o n tro l. E n a lg u n o s e je m p lo s , la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io d ia n a es un re c e p to r y e l l ig a n d o , ta l c o m o C D 80 o C D 86 (p a ra C T L A 4 ) o P D -L 1 o P D -L 2 (p a ra P D -1 ), s e in c lu y e en e l e n s a y o p a ra q u e s e e fe c tú e la a c t iv a c ió n d e l re c e p to r . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t ra ta m ie n to , la s c é lu la s t ra ta d a s y n o tra ta d a s s e p u e d e n a n a liz a r m e d ia n te u n o o m á s m é to d o s d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia o c o n o c id o s en la té c n ic a . En a lg u n o s e je m p lo s , s e p u e d e e v a lu a r la a c t iv id a d d e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p ro p o rc io n a d o en la p re s e n te m e m o r ia m id ie n d o lo s c a m b io s en la m o r fo lo g ía c e lu la r , la p ro li fe ra c ió n c e lu la r o la s e ñ a liz a c ió n . L o s c a m b io s en la m o r fo lo g ía t ra s la a c t iv a c ió n d e c é lu la s T s o n d e s c r ito s p o r W ü lf in g e t a l., (1998 ) P ro c N a tl A c a d S c i U S A . 95 (11 ): 6302 -6307.
L o s e n s a y o s d e p ro li fe ra c ió n s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra m e d ir la a c t iv id a d d e lo s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e le c c io n a d o s , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io . L o s e n s a y o s p u e d e n m e d ir la p ro li fe ra c ió n d e c é lu la s q u e e x p re s a n u n a p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e le c c io n a d a t r a s e l t ra ta m ie n to c o n un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 , en p re s e n c ia d e un lig a n d o , c o m o C D 80 o C D 86 (p a ra C T L A 4 ) o P D -L 1 o P D -L 2 (p a ra P D -1 ). L a s c é lu la s s e p u e d e n in c u b a r d u ra n te un t ie m p o s u f ic ie n te p a ra q u e la s c é lu la s m u e s tre n u n a p ro li fe ra c ió n ( ta l c o m o , p o r e je m p lo , 12 h o ra s o 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 d ía s o m á s ). L a p ro li fe ra c ió n c e lu la r s e p u e d e m e d ir p o r c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o en la té c n ic a , in c lu y e n d o el e n s a y o d e in c o rp o ra c ió n d e 3H - t im id in a , 5 -b ro m o -2 -d e s o x iu r id in a (B rd U ), E L IS A , e n s a y o d e m ic ro p la c a d e te t ra z o lio y e n s a y o d e fo s fa ta s a á c id a (p . e j., M a g h n i e t a l. (1999 ) J. Im m u n o l. M e th o d 223 (2 ) :185 -194 ). L a p ro li fe ra c ió n c e lu la r ta m b ié n s e p u e d e m e d ir u t i l iz a n d o lo s k its d is p o n ib le s d e In v it ro g e n (k it d e e n s a y o d e p ro li fe ra c ió n d e c é lu la s C y q u a n t N F ), C a m b re x (V ia L ig h t H S (a lta s e n s ib il id a d ) B io A s s a y ), P ro m e g a (E n s a y o d e V ia b il id a d C e lu la r L u m in is c e n te C e llT ite r -G lo , G u a v a T e c h n o lo g ie s (e n s a y o C e llG ro w th ) , S tra ta g e n e (E n s a y o d e p ro li fe ra c ió n c e lu la r Q u a n to s (p. e j., E n s a y o s p a ra E s tu d io s d e P ro life ra c ió n C e lu la r , G e n e tic Eng. B io techno l. N e w s 26 (6 ) ) . E n a lg u n o s e je m p lo s , la p ro li fe ra c ió n c e lu la r s e p u e d e n o rm a liz a r a la p ro li fe ra c ió n d e c é lu la s s in e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io . E n e n s a y o s d e p ro li fe ra c ió n ilu s tra t iv o s , s e p u e d e n a g re g a r c é lu la s a un p o c il lo d e u n a p la c a d e 96 p o c il lo s en un m e d io d e c re c im ie n to n o rm a l q u e in c lu y a e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io q u e s e v a y a a a n a liz a r.
E l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , p o r e je m p lo , lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 , s e p u e d e n m a rc a r p a ra q u e la a c t iv id a d d e u n ió n s e p u e d a e v a lu a r y d e te rm in a r. P o r e je m p lo , p a ra d e te c ta r la u n ió n , e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 , s e p u e d e m a rc a r co n un ra d ic a l o e t iq u e ta d e te c ta b le p a ra fa c i l i ta r la d e te c c ió n .
El experto en la técnica puede seleccionar un radical o etiqueta detectables apropiados para las condiciones del ensayo. Por ejemplo, algunos reactivos secundarios, tales como los anticuerpos anti-Ig, no se pueden utilizar para detectar la unión de una proteína modificada que es un anticuerpo en una solución que contiene suero humano. Además, no se puede utilizar un anticuerpo anti-IgG para detectar la unión de una biomolécula que es un anticuerpo. Se puede utilizar cualquier radical detectable u otro radical conocido por un experto en la técnica que sea susceptible de ser detectado o identificado. El radical o la etiqueta se pueden ligar a la molécula de prueba, tal como una proteína terapéutica o un anticuerpo, directa o indirectamente, por ejemplo, utilizando un conector. La unión puede estar en el extremo N o C del anticuerpo terapéutico. Las etiquetas y los radicales ilustrativos que se pueden utilizar, incluyen pero no se limitan a, cualquiera de los expuestos en la Tabla 5.
Figure imgf000089_0001
Se puede utilizar cualquier conector conocido por un experto en la técnica que sea capaz de ligar el radical detectable a los anticuerpos terapéuticos descritos en la presente memoria. Los conectores ilustrativos incluyen los conectores flexibles ricos en glicina (-G4S-)n, donde n es un número entero positivo, tal como 1 (SEQ ID NO: 37), 2 (SEQ ID NO: 38), 3 (SEQ ID NO: 39), 4 (SEQ ID NO: 40), 5 (SEQ ID NO: 41), o más.
3. Actividad anticancerosa de la terapia combinada
Los sujetos humanos o no humanos o los modelos de tumores animales se pueden utilizar para determinar la eficacia del tratamiento combinado, realizando un seguimiento del tumor, la salud general del sujeto y/o el curso de la enfermedad en el sujeto. Se puede incluir cualquiera de una variedad de etapas de seguimiento para evaluar la eficacia de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria, incluyendo, pero no limitadas a, seguimiento del tamaño del tumor, seguimiento del título de anticuerpos anti-(antígeno tumoral), seguimiento de la presencia y/o el tamaño de las metástasis, seguimiento de los ganglios linfáticos del sujeto, y seguimiento del peso del sujeto u otros indicadores de salud incluyendo marcadores de sangre u orina.
Además, se puede evaluar la respuesta inmunitaria después de la administración de las combinaciones proporcionadas. Las combinaciones proporcionadas en la presente memoria activan una respuesta inmunitaria al inhibir las proteínas de puntos de control inmunitario. La activación de una respuesta inmunitaria provoca actividades clínicas que son distintas de las respuestas clínicas de las terapias citotóxicas que se utilizan tradicionalmente para tratar los cánceres. Por ejemplo, se espera observar las respuestas clínicas, tales como una disminución en el tamaño del tumor o un retraso en el crecimiento del tumor, a las terapias citotóxicas en las primeras semanas de tratamiento. En contraste, los sujetos a los que se les administraron tratamientos que activaban el sistema inmunológico para tratar un tumor podían mostrar una respuesta tardía, a continuación de un crecimiento estable o incluso progresivo del tumor en las primeras semanas o meses después del tratamiento. Los inhibidores de puntos de control inmunitario también pueden provocar una respuesta antitumoral que dure un período prolongado después de la interrupción del tratamiento. Por ejemplo, las respuestas duraderas después de la inhibición de una proteína de puntos de control inmunitario se pueden medir en meses o años, incluso después de la interrupción del tratamiento.
S e p u e d e n re a liz a r e s tu d io s in v ivo c o n m o d e lo s a n im a le s o s u je to s h u m a n o s o n o h u m a n o s p a ra e v a lu a r la a c t iv id a d te ra p é u t ic a d e la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a s c o n p o lím e ro s , ta le s c o m o P E G P H 20 , y lo s in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o lo s a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 , c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te m e m o r ia , in d iv id u a lm e n te y /o c o m b in a d o s . E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , s e e v a lú a la a c t iv id a d c o m b in a to r ia d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro (p. e j., P E G P H 20 ), y e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. e j., a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 ) . C o m o s e d e s c r ib e en o tra p a r te d e la p re s e n te m e m o r ia , t íp ic a m e n te lo s a g e n te s s e a d m in is tra n p o r s e p a ra d o , p o r lo q u e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o (p. e j., la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le P E G ila d a ) , s e a d m in is t ra a n te s de l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io .
E n a lg u n o s e je m p lo s , s e u t iliz a n m o d e lo s d e c á n c e r a n im a l p a ra e v a lu a r e l t ra ta m ie n to c o m b in a d o d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , ta l c o m o P E G P H 20 , y un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. e j., un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A 4 o a n t i-P D -1 ) . T a le s u s o s d e m o d e lo s a n im a le s s e p u e d e n u t il iz a r p a ra p re d e c ir la e f ic a c ia d e l t ra ta m ie n to c o m b in a d o en p a c ie n te s c o n c á n c e r, e v a lu a n d o la a c t iv a c ió n d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia y /o m id ie n d o la in h ib ic ió n d e la fo rm a c ió n d e tu m o re s , la re g re s ió n tu m o ra l o la m e tá s ta s is d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s . T a le s m o d e lo s a n im a le s ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r p a ra e v a lu a r lo s e fe c to s s e c u n d a r io s d e lo s a n t ic u e rp o s d e te ra p ia s c o m b in a d a s p ro p o rc io n a d o s en la p re s e n te m e m o r ia .
E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , s e e v a lú a la e f ic a c ia te ra p é u t ic a d e la te ra p ia c o m b in a d a p a ra t r a ta r tu m o re s q u e se c a ra c te r iz a n p o r te n e r un c o n te n id o d e H A m o d e ra d o a a lto . p. e j., tu m o re s H A alto (o H A 3 ). L o s m é to d o s p a ra d e te rm in a r y c la s if ic a r e l c o n te n id o d e H A d e un tu m o r s e d e s c r ib e n en la S e c c ió n H. S e p u e d e n s e le c c io n a r lo s s u je to s h u m a n o s p a ra e l t ra ta m ie n to y s e p u e d e e v a lu a r o h a c e r un s e g u im ie n to d e la e f ic a c ia te ra p é u t ic a d e la te ra p ia c o m b in a d a . E n o tro s c a s o s , s e p u e d e n g e n e ra r m o d e lo s a n im a le s (p. e j., m o d e lo s d e x e n o in je r to o a lo in je r to d e ra tó n ) q u e t ie n e n un tu m o r H A alto. E n a lg u n o s e je m p lo s , la s c é lu la s q u e s e in y e c ta n en e l ra tó n p a ra g e n e ra r el m o d e lo d e c á n c e r d e ra tó n e s tá n d is e ñ a d a s p a ra p ro d u c ir a lto s n iv e le s d e h ia lu ro n a n o , d e m a n e ra q u e e l tu m o r g e n e ra d o p o r la lín e a c e lu la r e s un tu m o r H A alí°. T a le s lín e a s c e lu la re s s e p u e d e n e s ta b le c e r m e d ia n te la in tro d u c c ió n e s ta b le d e u n o o m á s g e n e s e x ó g e n o s q u e c o d if ic a n u n a o m á s e n z im a s h ia lu ro n a n o s in ta s a s , ta le s c o m o la h ia lu ro n a n o s in ta s a 1 (H A S 1 ; e x p u e s ta en S E Q ID N O : 51 ), la h ia lu ro n a n o s in te ta s a 2 (H A S 2 ; e x p u e s ta en S E Q ID N O : 52 ), o la h ia lu ro n a n o s in ta s a 3 (H A S 3 ; e x p u e s ta en S e Q ID N O : 2).
a. Crecimiento y volumen del tumor
S e p u e d e n u t i l iz a r s u je to s h u m a n o s o n o h u m a n o s o m o d e lo s d e tu m o re s a n im a le s p a ra d e te rm in a r la e f ic a c ia de l t ra ta m ie n to c o m b in a d o , m id ie n d o la in h ib ic ió n d e la fo rm a c ió n d e tu m o re s , la re g re s ió n d e l tu m o r o la m e tá s ta s is d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s . T a le s e fe c to s p u e d e n in c lu ir e l s e g u im ie n to el c re c im ie n to y e l v o lu m e n d e l tu m o r p a ra e v a lu a r u n a re d u c c ió n en e l c re c im ie n to o e l v o lu m e n d e un tu m o r c o m o un in d ic a d o r d e la e f ic a c ia te ra p é u t ic a . P o r e je m p lo , la s fo rm u la c io n e s d e e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o (p. e j., h ia lu ro n id a s a ) , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro (p. e j., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a , ta l c o m o P E G P H 20 ) y un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , s e p u e d e n a d m in is t r a r a un a n im a l p o r ta d o r d e tu m o r , y c o n tro la r e l p e s o c o rp o ra l y e l v o lu m e n d e l tu m o r . El m o m e n to d e la a d m in is tra c ió n p re v ia d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o s e p u e d e a ju s ta r p a ra e v a lu a r e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n ó p t im o p a ra la te ra p ia c o m b in a d a .
L a a c t iv id a d d e la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e e v a lu a r c o n tro la n d o la a c t iv id a d a n t itu m o r ig é n ic a o tu m o r ic id a , ta l c o m o la re d u c c ió n d e l ta m a ñ o d e l tu m o r y /o e l re tra s o en la p ro g re s ió n d e l tu m o r . P o r lo ta n to , p o r e je m p lo , la s te ra p ia s c o m b in a d a s s e p u e d e n e v a lu a r p a ra id e n t if ic a r a q u e lla s q u e d is m in u y e n la ta s a d e c re c im ie n to d e l tu m o r o re d u c e n e l ta m a ñ o d e l tu m o r . S e p u e d e e v a lu a r e l ta m a ñ o d e l tu m o r in vivo en m o d e lo s h u m a n o s o a n im a le s p o r ta d o re s d e tu m o re s tra ta d o s c o n c u a lq u ie ra d e la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia . L a c o n tra c c ió n d e l tu m o r o e l ta m a ñ o d e l tu m o r s e p u e d e n e v a lu a r m e d ia n te d iv e rs o s e n s a y o s c o n o c id o s en la té c n ic a , ta le s c o m o , m e d ia n te m e d ic ió n d e l p e so , d e l v o lu m e n o fís ic a .
S e p u e d e n g e n e ra r m o d e lo s a n im a le s p o r ta d o re s d e tu m o re s . S e p u e d e n g e n e ra r tu m o re s in v ivo p o r m e d io d e c u a lq u ie r m é to d o c o n o c id o , in c lu y e n d o tu m o re s s in g é n ic o s g e n e ra d o s p o r in o c u la c ió n (p. e j., p o r in y e c c ió n s u b c u tá n e a ) d e u n a lín e a d e c é lu la s tu m o ra le s d e ra tó n o ra ta en la c e p a in m u n o c o m p e te n te d e ra tó n o ra ta c o r re s p o n d ie n te , tu m o re s m e ta s tá s ic o s g e n e ra d o s p o r m e tá s ta s is d e un tu m o r p r im a r io im p la n ta d o en e l m o d e lo a n im a l, tu m o re s d e a lo in je r to g e n e ra d o s p o r la im p la n ta c ió n d e c é lu la s tu m o ra le s en la m is m a e s p e c ie q u e e l o r ig e n d e la s c é lu la s tu m o ra le s , tu m o re s d e x e n o in je r to p o r t ra s p la n te d e lín e a s d e c é lu la s d e c á n c e r h u m a n o o tu m o re s s ó lid o s a un ra tó n q u e t ie n e un s is te m a in m u n o ló g ic o d e te r io ra d o (p. e j., ra to n e s a t ím ic o s ) y tu m o re s e s p o n tá n e o s g e n e ra d o s p o r m a n ip u la c ió n g e n é t ic a d e l a n im a l. L o s m o d e lo s d e tu m o re s s e p u e d e n g e n e ra r d e fo rm a o r to tó p ic a m e d ia n te la in y e c c ió n d e la s c é lu la s tu m o ra le s en e l te j id o u ó rg a n o d e su o r ig e n , p o r e je m p lo , la im p la n ta c ió n d e c é lu la s tu m o ra le s d e m a m a en u n a a lm o h a d illa d e g ra s a m a m a r ia d e ra tó n .
T íp ic a m e n te , s e u t i l iz a n m o d e lo s d e a n im a le s s in g é n ic o s o p o r a lo in je r to . E n ta le s m o d e lo s , lo s a n im a le s so n in m u n o c o m p e te n te s . S e re q u ie re un s is te m a in m u n o ló g ic o in ta c to p a ra e v a lu a r la a c t iv a c ió n d e l s is te m a in m u n o ló g ic o en re s p u e s ta a la te ra p ia c o m b in a d a q u e e m p le a in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io . S e u t iliz a n c é lu la s s in g é n ic a s o a lo g é n ic a s (e s d e c ir , c é lu la s de l m is m o fo n d o g e n é t ic o ) p a ra p re v e n ir e l re c h a z o y la in d u c c ió n d e u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia a s o c ia d a c o n un x e n o in je r to en un a n im a l in m u n o c o m p e te n te . L o s e je m p lo s n o l im ita n te s d e m o d e lo s d e ra to n e s co n tu m o re s s in g é n ic o s s e e x p o n e n en la T a b la 6 a c o n t in u a c ió n .
Figure imgf000091_0001
E n a lg u n o s e je m p lo s , lo s tu m o re s s e p u e d e n e s ta b le c e r m e d ia n te in y e c c ió n in tra m u s c u la r , a d y a c e n te a l p e r io s t io t ib ia l d e re c h o , en a x ila c o n u n a s u s p e n s ió n d e c é lu la s tu m o ra le s (p. ej., 2 x 105 c é lu la s /a n im a l) en c u a lq u ie r m o d e lo a n im a l d e tu m o r , y t íp ic a m e n te en un a n f it r ió n in m u n o c o m p e te n te (s in g é n ic o ) . L o s m o d e lo s a n im a le s in c lu y e n m o d e lo s en c u a lq u ie r o rg a n is m o d e s c r ito en la p re s e n te m e m o r ia o c o n o c id o en la té c n ic a , ta l c o m o , p o r e je m p lo , un m a m ífe ro , in c lu y e n d o m o n o s y ra to n e s . En a lg u n o s e je m p lo s , la p ru e b a d e la s c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s p u e d e in c lu ir e l e s tu d io d e la e f ic a c ia en p r im a te s (p. ej., m o d e lo d e m o n o c in o m o lg o ) p a ra fa c i l i ta r la e v a lu a c ió n d e la e f ic a c ia te ra p é u t ic a d ir ig id a c o n tra e l tu m o r . L o s m o d e lo s d e p r im a te s a d ic io n a le s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, lo s q u e u t iliz a n e l m o n o R h e s u s .
E n a lg u n o s e je m p lo s , e l re c e p to r d e l tu m o r p u e d e s e r c u a lq u ie r c e p a m u r in a a d e c u a d a . L o s e je m p lo s d e a n im a le s en lo s q u e s e p u e d e n t r a s p la n ta r c é lu la s tu m o ra le s in c lu y e n ra to n e s B A L B /c , ra to n e s C 57 B L /6. O tro s e je m p lo s in c lu y e n ra to n e s t r a n s g é n ic o s ( in c lu y e n d o m o d if ic a c io n e s g e n é t ic a s p a ra a c t iv a r la e x p re s ió n d e un g e n "k n o c k in " y m o d if ic a c io n e s g e n é t ic a s p a ra d e s a c t iv a r la e x p re s ió n d e un g e n "k n o c k o u t" ) . P o r e je m p lo , la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e s o m e te r a p ru e b a en un m o d e lo d e c á n c e r d e ra tó n , p o r e je m p lo , un m o d e lo d e ra tó n c o n tu m o r s in g é n ic o . E n e s te m é to d o , un tu m o r s in g é n ic o o u n a lín e a d e c é lu la s tu m o ra le s se in je r ta n o s e in y e c ta n en un ra tó n , y p o s te r io rm e n te e l ra tó n s e t ra ta c o n u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o (p. ej., u n a h ia lu ro n id a s a , ta l c o m o un a g e n te d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d o c o n p o lím e ro , p o r e je m p lo u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le P E G ila d a (p . e j., P E G P H 20 ), y un a g e n te in h ib id o r /b lo q u e a d o r d e p ro te ín a s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o un a n t ic u e rp o (p. e j., un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A 4 o a n t i-P D -1 ) p a ra d e te rm in a r la c a p a c id a d d e la te ra p ia c o m b in a d a p a ra re d u c ir o in h ib ir e l c re c im ie n to y /o la m e tá s ta s is d e l tu m o r .
E l ta m a ñ o y e l v o lu m e n d e l tu m o r s e p u e d e n c o n tro la r b a s á n d o s e en m e c a n is m o s c o n o c id a s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . P o r e je m p lo , e l ta m a ñ o y e l v o lu m e n d e l tu m o r se p u e d e n c o n tro la r m e d ia n te ra d io g ra fía , u ltra s o n id o s , n e c ro p s ia , u s o d e c a lib re s , m ic ro C T o m e d ia n te 18F -F D G -P E t . E l ta m a ñ o d e l tu m o r ta m b ié n s e p u e d e e v a lu a r v is u a lm e n te . E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , e l ta m a ñ o d e l tu m o r (d iá m e tro ) s e m id e d ire c ta m e n te u s a n d o c a lib re s . En o tro s e je m p lo s , e l v o lu m e n d e l tu m o r s e p u e d e m e d ir u t i l iz a n d o un p ro m e d io d e la s m e d ic io n e s d e l d iá m e tro de l tu m o r (D ) o b te n id o p o r m e d io d e c a lib re s o e v a lu a c io n e s d e u lt ra s o n id o . E l v o lu m e n s e p u e d e d e te rm in a r a p a r t ir d e la fó rm u la V = D 3 x n /6 (p a ra e l d iá m e tro m e d id o u t il iz a n d o c a lib re s ) ; la fó rm u la V = [ lo n g itu d * (a n c h u ra )2]/2 d o n d e la lo n g itu d e s e l d iá m e tro m á s la rg o y la a n c h u ra e s e l d iá m e tro m á s c o r to p e rp e n d ic u la r a la lo n g itu d ; o V = D 2 x d x n /6 (p a ra e l d iá m e tro m e d id o m e d ia n te u lt ra s o n id o d o n d e d e s la p ro fu n d id a d o e l e s p e s o r) . P o r e je m p lo , s e p u e d e n re a liz a r m e d ic io n e s c o n c a lib re d e la lo n g itu d d e l tu m o r (1 ) y la a n c h u ra (w ) y e l v o lu m e n d e l tu m o r s e p u e d e c a lc u la r c o m o lo n g itu d x a n c h u ra 2 x 0 ,52.
E n o tro e je m p lo , lo s v o lú m e n e s d e tu m o re s s e m id e n p o r u lt ra s o n id o . E n ta l e je m p lo , lo s a n im a le s s e p u e d e n a n e s te s ia r u t i l iz a n d o a n e s te s ia lig e ra c o n is o f lu ra n o y c u b r ie n d o la re g ió n d e in te ré s co n g e l d e u ltra s o n id o . El cabezal de exploración se coloca sobre la región de interés y se localiza el centro del tumor por ultrasonido (p. ej., utilizando un aparato de ultrasonido VisualSocnics Vevo 2100) en modo 2D. A continuación se captura una imagen en modo 3D y se analiza el volumen del tumor para calcular el volumen en mm3 (p. ej., utilizando el soporte lógico de obtención de imágenes Vevo 2100 v1.5.0).
En otro ejemplo, se pueden utilizar las exploraciones microCT para medir el volumen del tumor (véase p. ej., Huang et al. (2009) PNAS, 106: 3426-3430). En tal ejemplo, se puede inyectar a los ratones medio de contraste al 74% Optiray Pharmacy ioversol para inyección (p. ej., 741 mg de ioversol/mL), anestesiar a los ratones y explorar mediante CT realizada con un escáner MicroCat 1A u otro escáner similar (p. ej., IMTek) (40 kV, 600 jA, 196 etapas de rotación, ángulo total o rotación = 196). Las imágenes pueden ser reconstruidas utilizando un soporte lógico (p. ej., Programa de soporte lógico RVA3; ImTek). Los volúmenes tumorales se pueden determinar utilizando el soporte lógico disponible (p. ej., Software Amira 3.1; Mercury Computer Systems).
Una vez que los tumores implantados alcanzan un tamaño o volumen predeterminado, se puede administrar la terapia combinada. Los tumores en progreso se pueden visualizar y el tamaño del tumor y el volumen del tumor se pueden medir utilizando cualquier mecanismo conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el volumen del tumor o el tamaño del tumor se pueden medir utilizando cualquiera de los mecanismos descritos en la presente memoria. El volumen y el tamaño del tumor se pueden evaluar o medir a intervalos periódicos durante un período de tiempo posterior a la administración de la combinación que se proporciona en la presente memoria, tal como, por ejemplo, al menos, o hasta, o una vez cada hora, cada 6 horas, cada 12 horas, cada 24 horas, cada 36 horas, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, cada 7 días, cada 2 semanas, cada 3 semanas, cada mes o más después de la infección. Se puede hacer una gráfica del cambio de la mediana en el volumen del tumor a lo largo del tiempo. Se puede calcular el área total bajo la curva (AUC). También se puede calcular un índice terapéutico utilizando la fórmula AUCanimales de control - AUCanimales tratados/AUCanimales de control X 100. Los animales de control pueden ser animales no tratados (tratados con vehículo), animales tratados con una terapia de control, tal como un anticuerpo de control de isotipo, o animales tratados con la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p. ej., PEGPH20) sola o un inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-proteína de control inmunitario) solo.
La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se puede calcular en un punto de tiempo elegido utilizando el volumen promedio de tumor de los animales de prueba utilizando la fórmula: 1-(volumen de tumor promedio, artículo de prueba)(último día) - volumen de tumor promedio, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen de tumor promedio, control(último día)-volumen de tumor promedio, control(medición en el momento inicial)) x 100%, en donde el artículo de prueba es la administración de la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como PEGPH20, y el inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1), individualmente o como una terapia combinada, en donde la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p. ej., PEGPH20) y el inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario) se administran al mismo tiempo, o secuencialmente, como se describe en la presente memoria. En ejemplos particulares, el inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1), se administra después de la administración de la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como PEGPH20. Los tumores de control son aquellos provenientes de animales no tratados (tratados con vehículo), animales tratados con una terapia de control, tal como un anticuerpo de control de isotipo, o animales tratados con la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p. ej., PEGPH20) sola o un inhibidor de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario) solo.
La evaluación de la actividad de las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria puede incluir la identificación de dosificaciones o regímenes de dosificación que median una disminución en el tamaño del tumor (p. ej., diámetro), volumen o peso en comparación con los animales de control que portan tumores tratados o no tratados. Se entiende que una disminución en el tamaño del tumor, el volumen o el peso en comparación con los animales de control que portan tumores tratados o no tratados significa que la terapia combinada está mediando la regresión del tumor o la contracción observada o que la terapia combinada está mediando el retraso de la progresión del tumor en comparación con los animales que portan tumores tratados o no tratados. La contracción del tumor o el retraso en la progresión del tumor son parámetros indicativos de anti-tumorigenicidad.
La evaluación puede incluir la identificación de una terapia combinada que dé como resultado animales que muestren una razón de contracción del tumor, calculada como la razón del tumor de control: el tumor tratado, que es mayor que 1,0, por ejemplo, que es mayor que 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más. En ejemplos particulares, los resultados se presentan como una razón del área total de AUC durante el curso del tratamiento (AUC del tamaño del tumor o volumen de los animales de control/AUC tamaño del tumor o volumen de los animales tratados). Por ejemplo, una terapia combinada puede dar como resultado una razón de contracción del tumor en un sujeto según lo medido por el AUC que sea mayor que 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más. Se entiende que una razón de 1,2 o 5 significa que la terapia combinada produce una disminución del tamaño o volumen del tumor y da como resultado una actividad antitumoral de 120% o 500% en comparación con la referencia o el control.
En ejemplos particulares, el índice terapéutico se determina como una medida de los efectos de una terapia combinada proporcionada sobre el tamaño o volumen del tumor. Una terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede tener un índice terapéutico que sea al menos o aproximadamente al menos o 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800% o más en comparación con el índice terapéutico de un control.
En ejemplos adicionales, los tumores se pueden extraer de los animales y pesar. La administración de una combinación proporcionada en la presente memoria puede dar como resultado una disminución en el peso del tumor en comparación con los tumores recogidos de animales de control que portan tumores. El peso también se puede comparar con los tumores recogidos de animales tratados de control al mismo tiempo después de la administración. El cambio en el peso se puede presentar como una proporción del peso del tumor (peso del tumor de los animales de control/pesos del tumor de los animales tratados). Una terapia combinada proporcionada en la presente memoria puede dar como resultado sujetos que muestren una razón de peso del tumor de control:tratado que sea mayor que 1,0, por ejemplo, que sea mayor que 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más. Se entiende que una razón de peso del tumor que sea de 1,2 o 5 significa que la terapia combinada produce una disminución del peso del tumor y da como resultado una actividad antitumorigénica de 120% o 500% en comparación con la referencia o el control.
La eficacia de la terapia combinada también se puede evaluar de acuerdo con las pautas que proporcionan un criterio de respuesta objetivo para evaluar la terapéutica anti-tumoral. Tales pautas son conocidas por un experto en la técnica. Por ejemplo, las pautas publicadas incluyen aquellas publicadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (véase Organización Mundial de la Salud, "Manual de la OMS para informar sobre los resultados del tratamiento del cáncer" (1979) Publicación en offset de la OMS Núm. 48, Ginebra pág. 1-45 y Miller et al., (1981) Cancer. 47:207-214), y las publicadas como Criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) (Eisenhauer et al., (2009) Eur J Cancer. 45(2):228-247). Estas pautas se proporcionan para definir cuándo los tumores en pacientes con cáncer mejoran ("responden"), permanecen igual ("estabilizan") o empeoran ("progresan") durante los tratamientos. Estos criterios se aplican solo a los fenotipos tumorales y no son una medida de que un paciente haya mejorado. Un médico a cargo evalúa el tratamiento de la enfermedad utilizando una combinación de las mediciones objetivas descritas en las pautas y con los criterios sintomáticos del paciente.
Por ejemplo, de acuerdo con las pautas no limitantes para evaluar la eficacia terapéutica sobre los tumores, la evaluación de la respuesta tumoral puede implicar la selección de hasta 5 tumores por órgano y hasta 10 tumores en total, que sean representativos de todos los órganos afectados. Los tumores se pueden seleccionar en función de su tamaño (es decir, aquellos con el diámetro más largo) y su idoneidad para mediciones repetidas precisas utilizando técnicas de obtención de imágenes o clínicas. Para la OMS, la suma de los productos de los dos diámetros perpendiculares más grandes (SPD), y para RECIST, una suma del diámetro más largo (LD) para cada uno de los tumores, se puede calcular y se puede referir como los SPD en el momento inicial o la suma de LD en el momento inicial, respectivamente. El SPD en el momento inicial, o la suma de LD en el momento inicial, son la referencia con la cual se compara la respuesta del tumor para su evaluación. La presencia de otros tumores, no seleccionados para la medición, es decir, los tumores "no diana", también se indican en las pautas RECIST.
Los tumores se pueden medir por cualquier método reproducible. Por ejemplo, se pueden utilizar la TC (tomografía computarizada) o la MRI (imagen de resonancia magnética) con cortes de 10 mm o menos de grosor de la sección, o la TC espiral con un algoritmo de reconstrucción continua de 5 mm, para medir el tamaño del tumor. En algunos ejemplos, los tumores se pueden medir mediante una radiografía de tórax o una ecografía. También puede ser posible medir tumores mediante endoscopia o laparoscopia.
Al finalizar y/o en los puntos de tiempo intermedios predeterminados de un estudio clínico, se puede calcular el SPD o la suma de LD y se puede evaluar la respuesta de la siguiente manera. Una respuesta completa (CR) se define como la desaparición de todos los tumores medidos. Para la OMS, la desaparición debe observarse en dos observaciones consecutivas con un intervalo de no menos de 4 semanas. Los tumores se clasifican en los que muestran una respuesta parcial (RP) cuando hay al menos una disminución de 50% en el SPD (OMS) o una disminución de 30% en la suma de LD (RECIST), utilizando el PSD en el momento inicial o la suma de LD en el momento inicial como referencia, respectivamente. Para la OMS, el tumor se clasifica como una enfermedad progresiva (PD) cuando hay un aumento de al menos 25% en el SPD en comparación con el SPD más pequeño desde el inicio del tratamiento (es decir, nadir) y/o progresión de tumores no diana y/o la aparición de nuevos tumores en cualquier momento. Para RECIST, el tumor se clasifica como una enfermedad progresiva (PD) cuando hay al menos un aumento de 20% en la suma de LD, tomando como referencia la menor suma de LD registrada desde el inicio del tratamiento (es decir, nadir) o la aparición de nuevos tumores. El tumor se considera una enfermedad estable (SD) cuando la contracción del tumor es inferior a 50%, pero el crecimiento del tumor no supera 25% en comparación con el nadir, siempre que no haya nuevos tumores y el tamaño de los tumores no diana no aumente. De manera similar, de acuerdo con las pautas de RECIST, el cáncer se considera una SD cuando la contracción del tumor es inferior a 30%, pero no muestra un aumento de más de 20% en la suma de LD, sin tumores nuevos y sin aumento en el tamaño de tumores no diana.
Las pautas de la OMS y RECIST se desarrollaron para el seguimiento de las respuestas y para evaluar las terapias de los tumores citotóxicos. Como se describió anteriormente, los tratamientos de inmunoterapia muestran algunas respuestas distintas de las de los tratamientos citotóxicos. Por ejemplo, un aumento temprano en la carga tumoral y/o la aparición de nuevos tumores son una señal de enfermedad progresiva (PD), de acuerdo con las pautas de RECIST, y se considera una indicación de fracaso del fármaco. De acuerdo con los protocolos que se basan en tales pautas, a menudo se recomienda el cese del tratamiento una vez que un tumor se ha caracterizado como PD. En el caso de las inmunoterapias, sin embargo, un aumento inicial en el tamaño del tumor puede ser indicativo de infiltración de células inmunitarias o una respuesta inflamatoria transitoria, que indica eficacia en lugar de fracaso del fármaco. Por lo tanto, se ha desarrollado un conjunto de pautas, específicas para inmunoterapias, denominadas criterios de respuesta relacionada con el sistema inmunológico (irRC) (Wolchok et al., (2009) Clin Cancer Res.
15(23):7412-7420 y Nishino et al., (2013) Clin Cancer Res. 19(14):3936-3943). Por lo tanto, en los ejemplos de la presente memoria, la eficacia terapéutica se puede evaluar de acuerdo con las pautas de irRC, u otras pautas similares conocidas por un experto en la técnica. En la Tabla 7 a continuación se expone una comparación de las pautas.
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Cualquiera o todas las pautas de la OMS, RECIST e irRC, u otras pautas conocidas por un experto en la técnica e indicativas de una respuesta al tratamiento de un tumor, se puede utilizar para evaluar la eficacia de los tratamientos combinados que se proporcionan en la presente memoria. Los métodos ilustrativos para evaluar las actividades antitumorales de las combinaciones proporcionadas en la presente memoria se describen a continuación en la Sección G.3.
b. Presencia de marcadores tumorales
La presencia y la extensión de los marcadores tumorales, en la sangre, la orina o los tejidos corporales, también se pueden medir y utilizar para la evaluación de la respuesta. Un experto en la técnica sabe que tales marcadores se correlacionan con la respuesta al tratamiento del tumor. La presencia del marcador se puede comparar con un sujeto control o una población de sujetos que no tienen un tumor o una muestra del momento inicial de un sujeto antes del tratamiento o antes de la última dosis o intervalo de terapia. La expresión del marcador a niveles superiores a un control o muestra normal se correlaciona con la existencia de un tumor. Una disminución en el nivel o el grado del marcador en relación con una muestra del momento inicial puede indicar una respuesta al tratamiento. En algunos ejemplos, por ejemplo, cuando el marcador es un marcador intracelular, un aumento en el marcador en la sangre periférica es indicativo de la lisis de células tumorales y la eficacia terapéutica de la inmunoterapia. Se ha creado una base de datos que contiene secuencias de péptidos antigénicos asociados a tumores definidos por células T (Vigneron et al., (2013) Cancer Immun. 13:15; véase p. ej., también bases de datos, tales como cancer.gov/aboutcancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet). Los marcadores tumorales ilustrativos y sus tipos de tumores asociados se exponen en la Tabla 8 a continuación:
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En algunos casos, de acuerdo con varias pautas para evaluar la eficacia terapéutica, tales como las que se analizaron anteriormente, los niveles de marcadores combinados con los tamaños de los tumores no diana también se tienen en cuenta entre los criterios de respuesta, y refiriéndose la CR a la desaparición de todos tumores no diana y niveles normales de marcadores tumorales, refiriéndose la respuesta incompleta o SD a la persistencia de uno o más tumores no diana y/o niveles de marcadores tumorales por encima de los límites normales, y refiriéndose PD a la aparición de uno o más tumores nuevos y/o progresión de tumores no diana existentes.
c. Seguimiento inmunológico
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria actúa inhibiendo la actividad de la proteína de puntos de control inmunitario y, por lo tanto, reduciendo la inhibición de una respuesta inmunitaria o aumentando una respuesta inmunitaria, de modo que el sujeto que recibe la terapia combinada proporcionada en la presente memoria pueda desarrollar inmunidad anti-tumoral. Se pueden utilizar varios criterios para evaluar la terapia inmunológica en tumores sólidos para evaluar una respuesta inmunitaria en un sujeto, tal como en pacientes o modelos animales, que se correlacionan con la eficacia clínica de un tratamiento para el cáncer (véase, p. ej., Clay et al., (2001) Clin Cancer Res. 7:1127-1135). El seguimiento inmunológico puede incluir, pero no se limita a, el seguimiento de la frecuencia de tipos celulares específicos, tales como células inmunitarias específicas, en sangre periférica o en tumores, seguimiento de los cambios en los niveles de expresión de marcadores específicos en células inmunitarias, cuantificación de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno incluyendo las respuestas de anticuerpos y células T CD4+ o CD8+, y el seguimiento de los cambios en los niveles periféricos de citoquinas producidas por poblaciones de células inmunitarias específicas.
(i) Frecuencia de tipos celulares específicos en sangre periférica
Se pueden utilizar recuentos de tipos de células inmunitarias específicas en la sangre o tejidos periféricos, tales como los tejidos asociados con una respuesta inmunitaria (p. ej., bazo o ganglios linfáticos) o tumores, para correlacionar los tratamientos del cáncer con la eficacia clínica. La frecuencia de tipos celulares específicos en la sangre de pacientes o animales tratados se puede determinar, por ejemplo, utilizando métodos de citometría de flujo. Cuando se utiliza la citometría de flujo para obtener los recuentos de tipos celulares, se puede emplear un enfoque de plataforma dual o un enfoque de plataforma única.
En un enfoque de plataforma dual, se utiliza un citómetro de flujo para determinar las células de interés como porcentaje de una población de referencia, tal como los linfocitos T CD4+ como porcentaje de la población total de linfocitos. El recuento absoluto de glóbulos blancos (GB) y el porcentaje de linfocitos se determinan mediante un analizador de hematología, utilizando procedimientos convencionales. El recuento absoluto de linfocitos T CD4+, por lo tanto, es el producto de los GB absolutos, el porcentaje de linfocitos y el porcentaje de linfocitos T CD4+. La población de células de interés se puede identificar, por ejemplo, utilizando limitaciones de dispersión de luz, tales como las limitaciones de dispersión frontal y dispersión lateral, para identificar las células de interés basándose en la morfología. En métodos particulares, las muestras de sangre se pueden incubar con anticuerpos que reconocen uno o más marcadores inmunológicos y se pueden utilizar estrategias de selección unidimensionales o multidimensionales para identificar la población de interés. Estos métodos son rutinarios para los expertos en la técnica. Los marcadores ilustrativos no limitantes, que se pueden utilizar para distinguir poblaciones particulares de linfocitos, se exponen en la Tabla 9.
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En un enfoque de plataforma única, el recuento de células se obtiene del citómetro de flujo por sí solo, sin la necesidad de un analizador de hematología. Para este método, un volumen conocido y preciso de muestra se mezcla con los anticuerpos relevantes dirigidos al marcador o los marcadores inmunológicos que se vayan a detectar, y se emplea una estrategia de selección para identificar con precisión la población celular de interés. La población celular se puede relacionar a continuación con el volumen mediante una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen métodos de calibración con microcuentas, volumétricos, microfluorométricos y de velocidad de flujo.
El método más común para determinar la concentración de la población celular de interés es mediante el uso de microcuentas. Por ejemplo, se mezclan una muestra y microcuentas (con un diámetro de 5-10 |jm), suspendidas en una concentración conocida, en volúmenes iguales. El número de eventos celulares y el número de eventos de cuentas se cuentan, y la concentración de células absoluta se determina mediante la fórmula: Recuento de células absoluto = Número de eventos celulares/Número de eventos de cuentas x concentración de cuentas.
En algunos ejemplos de seguimiento inmunológico, se determina el recuento absoluto de linfocitos (ALC), por ejemplo, en muestras recolectadas de sangre, bazo o tejidos de ganglios linfáticos que drenan el tumor, o biopsias de tumores antes del tratamiento y en uno o más momentos predeterminados después de la administración de la Terapia proporcionada. El recuento absoluto de linfocitos es el número de linfocitos en sangre periférica por unidad de volumen. El ALC se puede determinar antes o en el mismo día de la administración de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria y periódicamente en varios momentos después de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración de un ciclo de administración, por ejemplo al menos o hasta o cada 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración de un ciclo de administración, de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria, tal como 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración. Un aumento en el ALC a lo largo del tiempo antes y durante el tratamiento inmunoterapéutico, indica un aumento en la proliferación de células inmunitarias y se ha correlacionado positivamente con el beneficio clínico (Berman et al., (2009) J Clin Oncol 27: 15s, (supl; resumen 3020)). En algunos ejemplos, el ALC 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración en un ciclo de administración, se incrementa 1,1 veces, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más veces, en comparación con el ALC en el momento anterior o en el mismo día de la administración y se correlaciona con un efecto terapéutico.
En otros ejemplos, los recuentos absolutos de células asesinas naturales (NK) (que expresan marcadores CD16 y CD56 pero no CD3), células T coadyuvantes (que expresan marcadores TCRap, CD3 y CD4), células T citotóxicas (o células T efectoras; que expresan los marcadores TCRap, CD3 yCD8 o los marcadores CD8, CD107 e IFN), o células B (que expresan marcadores del MHC de clase II, CD19 y CD21), se pueden determinar como un método para medir la actividad inmunológica en respuesta a la administración de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria, donde el aumento en una o más de estas poblaciones de linfocitos indica un aumento en la actividad inmunitaria. Los recuentos de células asesinas naturales (NK), células T coadyuvantes, células T citotóxicas (o células T efectoras) y/o células B, se pueden determinar antes o el mismo día de la administración de la terapia combinada inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria y a los 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración de un ciclo de administración, de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria, tal como 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración. Un aumento en los recuentos de células asesinas naturales (NK), células T coadyuvantes, células T citotóxicas (o células T efectoras) y/o células B a lo largo del tiempo antes y durante el tratamiento inmunoterapéutico, indica un aumento en la proliferación de células inmunitarias y se puede correlacionar positivamente con el beneficio clínico. En algunos ejemplos, los recuentos de células asesinas naturales (NK), células T coadyuvantes, células T citotóxicas (o células T efectoras) y/o células B a los 1 día; 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración de un ciclo de administración, se incrementan 1,1 veces, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más veces, en comparación con los recuentos de células asesinas naturales (NK), células T coadyuvantes, células T citotóxicas (o células T efectoras) y/o células B antes o el mismo día que la administración y se correlacionan con un efecto terapéutico.
La evaluación de números relativos de tipos de células supresoras, tales como las células Treg también se puede medir por citometría de flujo, por ejemplo, mediante la selección de la positividad para CD25, Foxp2 y CD4. Las muestras para determinar los recuentos de células Treg se pueden tomar, por ejemplo, del bazo, los ganglios linfáticos, tales como los ganglios linfáticos que drenan los tumores o la sangre. Un aumento en el número de células Treg se ha correlacionado con un resultado clínico pobre (véase Callahan et al., (2010) Semin Oncol. 37(5):473-484). Los recuentos de tipos de células inmunitarias supresoras, tales como las células Treg, se pueden medir antes y en diferentes puntos temporales después de la administración de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. Por ejemplo, los recuentos de tipos de células inmunitarias supresoras, tales como las células Treg se pueden determinar el mismo día de la administración de la terapia combinada inmunomoduladora proporcionada en la presente memoria y 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas. 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de la administración, tal como después de la administración previa o la última administración de un ciclo de administración, de la terapia combinada que se proporciona en la presente memoria, tal como 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días después de la administración. En algunos ejemplos, se puede determinar una dosis terapéutica máxima de la terapia combinada proporcionada como la dosis máxima que no induce un aumento en el número de tipos de células inmunitarias supresoras, tales como las células Treg, en un paciente o modelo animal a los 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días de la administración, tal como después de la administración anterior o la última administración de un ciclo de administración, en comparación con el nivel de células Treg antes de la administración, en donde se determina que un aumento en el número de tipos de células inmunitarias supresoras, tales como las células Treg, es un 1,1 veces, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 , 50 o más veces, el aumento en el número de tipos de células inmunitarias supresoras, tales como las células Treg, en el punto temporal medido en comparación con el número de tales células antes o en el mismo día de la administración de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria.
En algunos ejemplos, la administración de la terapia combinada proporcionada puede efectuar un cambio en la cantidad absoluta del número de células efectoras y/o supresoras, y/o la razón entre estos subconjuntos. En algunos ejemplos, un aumento en el efecto anti-tumoral se correlaciona con un aumento en la razón de células efectoras con respecto al número de células supresoras, en donde la razón de células efectoras con respecto a las células supresoras en el punto temporal medido es 1,1 veces, 1,2, 1,3 , 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o más que la razón anterior o el mismo día de la administración de la terapia combinada proporcionada.
(ii) Detección de marcadores de células inmunitarios
En algunos ejemplos, la detección de marcadores particulares en células inmunitarias se puede utilizar para correlacionar los tratamientos del cáncer con la eficacia terapéutica. Tales marcadores incluyen, pero no se limitan a, coestimulador inducible (ICOS), HLA-DR (MHC II humano) y CD45RO.
En algunos ejemplos, se detecta ICOS sobre la superficie de las células T para realizar un seguimiento de la eficacia terapéutica de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. El ICOS es un miembro de la familia de genes Ig y se expresa sobre las células T CD4+ y CD8+ después de la activación. Un aumento en la frecuencia de las células CD4+ que expresan altos niveles de ICOS se correlaciona con la activación del sistema inmunológico y la eficacia terapéutica.
HDLA-DR se expresa sobre las células T y se regula por aumento en los puntos temporales posteriores a la activación, y CD45RO es un marcador establecido para las células T de memoria. Los aumentos en el número de células inmunitarias que expresan HDLA-DR y/o CD45RO también se pueden utilizar para el seguimiento de la eficacia de las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria.
Las muestras para la detección de marcadores de células inmunitarias se pueden recoger de sangre periférica o tejidos, tales como tejidos asociados con una respuesta inmunitaria (p. ej., bazo o ganglios linfáticos) antes de la administración de una terapia combinada proporcionada en la presente memoria o en el mismo día de la a d m in is t ra c ió n y /o a lo s 1 d ía , 2 d ía s , 3 d ía s , 4 d ía s , 5 d ía s , 6 d ía s , 7 d ía s , 2 s e m a n a s , 3 s e m a n a s , 4 s e m a n a s , 5 s e m a n a s , 6 s e m a n a s , 7 s e m a n a s , 8 s e m a n a s o 12 s e m a n a s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n , ta l c o m o d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n a n te r io r o la ú lt im a a d m in is tra c ió n d e un c ic lo d e a d m in is tra c ió n , d e la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia , ta l c o m o 1 d ía , 2 d ía s , 3 d ía s , 4 d ía s , 5 d ía s , 6 d ía s o 7 d ía s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n . L o s m a rc a d o re s s e p u e d e n d e te rm in a r , p o r e je m p lo , u t i l iz a n d o m é to d o s d e c ito m e tr ía d e flu jo , in m u n o f lu o re s c e n c ia y /o t ra n s fe re n c ia W e s te rn . T a le s m é to d o s s o n b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a y s e d e s c r ib e n en la p re s e n te m e m o r ia .
(Mi) Respuestas inmunitarias específicas de antígeno
E n a lg u n o s e je m p lo s , s e p u e d e n u t i l iz a r re s p u e s ta s in m u n ita r ia s e s p e c íf ic a s d e a n tíg e n o s p a ra e v a lu a r la e f ic a c ia te ra p é u t ic a d e la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia . C u a n d o s e m o n ta u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia en un s u je to q u e p o rta un tu m o r , e l s u je to t íp ic a m e n te m o s tra rá n iv e le s e le v a d o s d e c é lu la s in m u n ita r ia s q u e re c o n o c e n a n t íg e n o s e s p e c íf ic o s d e l tu m o r , o a n tíg e n o s a s o c ia d o s a l tu m o r (T A A ), ta le s c o m o la s c é lu la s T e s p e c íf ic a s d e l a n tíg e n o tu m o ra l. P o r lo ta n to , un a u m e n to en e l n ú m e ro d e c é lu la s T e s p e c íf ic a s d e tu m o re s , p. e j., l in fo c ito s T c ito tó x ic o s (C T L ) o c é lu la s T C D 4 , q u e s e u n e n e s p e c íf ic a m e n te a u n o o m á s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s , ta le s c o m o lo s T A A en e l c o n te x to d e lo s c o m p le jo s p r in c ip a le s d e h is to c o m p a t ib il id a d (M H C ) (p . e j., lo s c o m p le jo s M H C d e c la s e I o c la s e II), p o r e je m p lo , d e s p u é s d e un tr a ta m ie n to in m u n o te ra p é u t ic o , e s in d ic a t iv o d e u n a m a y o r re s p u e s ta a n t itu m o ra l c o m o re s u lta d o d e l t ra ta m ie n to . P o r lo ta n to , lo s e n s a y o s d e u n ió n q u e u t iliz a n a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s y c é lu la s in m u n ita r ia s c irc u la n te s o lo c a liz a d a s en tu m o re s s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra d e te rm in a r si e l a n f it r ió n h a d e s a rro lla d o u n a re s p u e s ta in c re m e n ta d a a l a n tíg e n o o lo s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s en re s p u e s ta a u n a in m u n o te ra p ia . P o r e je m p lo , lo s e x p e r to s en la té c n ic a c o n o c e n a n t íg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s p a ra t ip o s e s p e c íf ic o s d e c á n c e r o s e p u e d e n d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te . L o s a n tíg e n o s tu m o ra le s ilu s tra t iv o s , n o lim ita n te s , y s u s c á n c e re s a s o c ia d o s , s e e n u m e ra n en la T a b la 8 a n te r io r , en la s e c c ió n G .3.b .
L a p ro m o c ió n d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia m e d ia n te la a d m in is tra c ió n d e u n a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia p u e d e p ro d u c ir , o m e jo ra r , u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia d ir ig id a a u n o o m á s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s , s e g ú n lo in d ic a d o p o r un a u m e n to en e l n ú m e ro d e c é lu la s in m u n ita r ia s en c ir c u la c ió n o en e l tu m o r . q u e se u n e n e s p e c íf ic a m e n te a l a n tíg e n o o lo s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a l tu m o r . P o r lo ta n to , la d e te c c ió n de , o un a u m e n to en , la re s p u e s ta in m u n ita r ia e s p e c íf ic a d e un a n tíg e n o tu m o ra l d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e u n a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia s o n in d ic a t iv o s d e la e f ic a c ia te ra p é u t ic a .
U n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e s p e c íf ic a d e a n tíg e n o tu m o ra l s e p u e d e m e d ir , p o r e je m p lo , e x vivo, u t i l iz a n d o un e n s a y o d e te t rá m e ro d e M H C , un e n s a y o d e in m u n o a b s o rc ió n co n e n z im a lig a d a , d e p u n to s (E L IS P O T ) , un e n s a y o d e e s t im u la c ió n d e c é lu la s T y /o un E L IS A . T a le s m é to d o s so n b ie n c o n o c id o s p o r e l e x p e r to en la té c n ic a (v é a n s e p. e j., J a m e s e t a l., (2009 ) J V is E xp . (25 ): 1167 , L y c k e e t a l., (2001 ) C u r r P ro to c Im m u n o l. C a p ítu lo 7: U n id a d 7.14 ; K ru is b e e k e t a l., (2004 ) C u r r P ro to c Im m u n o l. C a p ítu lo 3: U n id a d 3.12 , y en la p re s e n te m e m o r ia ) . L a s m u e s tra s d e s a n g re p e r ifé r ic a , d e p a c ie n te s q u e p o rta n tu m o re s o m o d e lo s a n im a le s , s e re c o g e n a n te s o e l m is m o d ía d e la a d m in is t ra c ió n d e u n a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia y en u n o o m á s p u n to s te m p o ra le s c u a le s q u ie ra p re d e te rm in a d o s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la te ra p ia p ro p o rc io n a d a , ta l c o m o 1 d ía , 2 d ía s , 3 d ía s , 4 d ía s , 5 d ía s , 6 d ía s , 7 d ía s , 2 s e m a n a s , 3 s e m a n a s , 4 s e m a n a s , 5 s e m a n a s , 6 s e m a n a s , 7 s e m a n a s , 8 s e m a n a s o 12 s e m a n a s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n , ta l c o m o d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n p re v ia o la ú lt im a a d m in is t ra c ió n d e un c ic lo d e a d m in is tra c ió n , d e la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia , ta l c o m o 1 d ía , 2 d ía s , 3 d ía s , 4 d ía s , 5 d ía s , 6 d ía s o 7 d ía s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n . A c o n tin u a c ió n , la s m u e s tra s d e s a n g re s e fra c c io n a n y s e a n a liz a n u t iliz a n d o u n o o m á s d e un e n s a y o d e te t rá m e ro d e M H C , un e n s a y o d e in m u n o a b s o rc ió n c o n e n z im a lig a d a d e p u n to s (E L IS P O T ) , un e n s a y o d e e s t im u la c ió n d e c é lu la s T y /o un E L IS A p a ra e v a lu a r la in d u c c ió n d e u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia . S e c o n s id e ra q u e s e e fe c tú a u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e s p e c íf ic a d e a n tíg e n o c u a n d o la re s p u e s ta m e d id a d e s p u é s d e l t ra ta m ie n to a u m e n ta 1,1 v e c e s , 1 ,2 , 1 ,3 , 1 ,4 , 1 ,5, 1 ,6 , 1 ,7 , 1 ,8 , 1 ,9 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20 , 30 , 40 , 50 o m á s , en c o m p a ra c ió n c o n la m u e s tra en e l m o m e n to in ic ia l, la re s p u e s ta m e d id a a n te s d e l t ra ta m ie n to o e l d ía d e l t ra ta m ie n to . L a in d u c c ió n d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia e s p e c íf ic a d e l a n tíg e n o tu m o ra l d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a e s in d ic a t iv a d e e f ic a c ia te ra p é u t ic a .
4. Ensayos farmacocinéticos y farmacodinámicos
L o s e s tu d io s fa rm a c o c in é t ic o s y d e to le ra b il id a d s e p u e d e n re a liz a r u t i l iz a n d o m o d e lo s a n im a le s o s e p u e d e n re a liz a r d u ra n te e s tu d io s c lín ic o s c o n p a c ie n te s p a ra e v a lu a r e l e fe c to d e la s c o m b in a c io n e s y c o m p o s ic io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia . L o s m o d e lo s a n im a le s in c lu y e n , p e ro no s e lim ita n a, m o d e lo s d e ra to n e s , ra ta s , c o n e jo s , p e rro s , c o b a y a s y p r im a te s n o h u m a n o s , ta le s c o m o m o n o s C y n o m o lg u s o m a c a c o s R h e s u s . En a lg u n o s c a s o s , lo s e s tu d io s fa rm a c o c in é t ic o s y d e to le ra b il id a d s e re a liz a n c o n a n im a le s s a n o s . E n o tro s e je m p lo s , lo s e s tu d io s s e re a liz a n u t il iz a n d o m o d e lo s a n im a le s d e u n a e n fe rm e d a d p a ra lo s c u a le s s e c o n s id e ra la te ra p ia co n u n a c o m b in a c ió n o c o m p o s ic ió n d e la p re s e n te m e m o r ia , ta le s c o m o lo s m o d e lo s a n im a le s d e c á n c e r.
L a s p ro p ie d a d e s fa rm a c o c in é t ic a s d e la s c o m b in a c io n e s o c o m p o s ic io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia se pueden evaluar midiendo parámetros tales como la concentración máxima (pico) de agente inmunoterapéutico (o enzima de degradación de hialuronano) (Cmax), el tiempo pico (es decir, cuando se produce la concentración máxima del agente inmunoterapéutico; Tmax), el agente inmunoterapéutico, o enzima de degradación de hialuronano mínimos, la concentración (es decir, la concentración mínima entre dosis de agente inmunoterapéutico; Cmin), la semi-vida de eliminación (T1/2) y área bajo la curva (es decir, el área bajo la curva generada al trazar el tiempo frente a la concentración; AUC), después de la administración. Típicamente, las composiciones que contienen los agentes activos de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria se administran sistémicamente, tal como típicamente por vía intravenosa. En los casos en los que el agente inmunoterapéutico, o la enzima de degradación del hialuronano, se administran por vía subcutánea, la biodisponibilidad absoluta del agente o la enzima se determina comparando el área bajo la curva del agente inmunoterapéutico, o la enzima de degradación del hialuronano, después del suministro subcutáneo (AUCsc) con el AUC del agente inmunoterapéutico, o enzima de degradación del hialuronano, después del suministro intravenoso (AUCiv). La biodisponibilidad absoluta (F) se puede calcular utilizando la fórmula: F = ([AUC]sc x dosissc)/([AUC]iv x dosisiv). La concentración de agente inmunoterapéutico, o enzima de degradación de hialuronano, en el plasma después de la administración subcutánea se puede medir utilizando cualquier método conocido en la técnica adecuado para evaluar las concentraciones de un agente inmunoterapéutico, o enzima de degradación de hialuronano, en muestras de sangre.
En los estudios farmacocinéticos se puede administrar un intervalo de dosis y una frecuencia de dosificación diferente de la dosificación para evaluar el efecto del aumento o la disminución de las concentraciones de una terapia coadministrada (p. ej., agente inmunoterapéutico y una enzima de degradación de hialuronano). Las propiedades farmacocinéticas de los agentes terapéuticos administrados, tales como la biodisponibilidad, también se pueden evaluar con o sin coadministración del otro agente, es decir, enzima de hialuronano conjugada con polímero y/o el inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, a los perros, tales como perros Beagle, se les puede administrar un inhibidor de puntos de control inmunitario combinado con un enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, tal como después de la administración de la enzima de degradación del hialuronano conjugada con polímero, o se pueden administrar un inhibidor de puntos de control inmunitario o una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero solos, utilizando una o más vías de administración. Tales estudios se pueden realizar para evaluar el efecto de la administración conjunta con un agente anti-hialuronano, tal como una hialuronidasa, sobre las propiedades farmacocinéticas, tales como la biodisponibilidad, del inhibidor de puntos de control inmunitario.
Los estudios para evaluar la seguridad y la tolerabilidad también son conocidos en la técnica y se pueden utilizar en la presente memoria. Tras la administración de la combinación y las composiciones de la presente memoria, se puede realizar un seguimiento del desarrollo de cualquier reacción adversa. Las reacciones adversas pueden incluir, pero no se limitan a, reacciones en el lugar de la inyección, tales como edema o hinchazón, dolor de cabeza, fiebre, fatiga, escalofríos, sofocos, mareos, urticaria, sibilancias u opresión en el pecho, náuseas, vómitos, rigidez, dolor de espalda, dolor de pecho, calambres musculares, ataques o convulsiones, cambios en la presión arterial y respuestas anafilácticas o de hipersensibilidad severa.
También se puede realizar un seguimiento del desarrollo de eventos adversos relacionados con el sistema inmunológico (irAE). Los irAE incluyen erupciones cutáneas, pero en casos raros pueden progresar a necrólisis epidérmica tóxica potencialmente mortal, y colitis, caracterizada por una diarrea leve a moderada, pero en ocasiones también severa y persistente. En algunos ejemplos, también se puede producir hipofisitis, hepatitis, pancreatitis, iridociclitis, linfadenopatía, neuropatías en respuesta a la inmunoterapia. Los efectos secundarios también pueden incluir efectos secundarios musculoesqueléticos (véase la Publicación de Estados Unidos Núm. 2012/0020951). Por lo general, se puede administrar un intervalo de dosificación y diferentes frecuencias de dosificación en los estudios de seguridad y tolerabilidad para evaluar el efecto del aumento o la disminución de las concentraciones del inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1) y/o un agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímeros, sobre cualquier efecto secundario observado.
G. Métodos y usos de la terapia combinada
Las combinaciones y composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden utilizar en métodos de terapia para el tratamiento de cánceres, y en particular cánceres caracterizados por tumores sólidos que tienen un fenotipo de HA de al menos moderado a alto. En los métodos, se administra una terapia combinada de enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, es decir, una hialuronidasa, tal como una PH20, por ejemplo PEGPH20 y un inhibidor de puntos de control inmunitario, es decir, un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., se administra un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1) a un sujeto que tiene un tumor sólido que se caracteriza por tener niveles de HA de al menos moderados a altos. En algunos ejemplos, se puede incluir un agente o terapia antineoplásicos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico, radioterapia o cirugía en las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria.
Como se encuentra en la presente memoria, los efectos anti-tumorales de un agente inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., anti-CTLA4 o anti-PD-1), cuando se administran en un régimen combinado con una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, exceden los efectos de la administración del anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario solo. En particular, tales resultados se producen cuando la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero (p. ej., la hialuronidasa soluble conjugada con polímero, tal como PEGPH20) se administra antes de administrar el inhibidor de puntos de control inmunitario, y generalmente hasta 48 horas (p. ej., 24 horas) antes. Por ejemplo, los efectos pueden ser sinérgicos o pueden ser aditivos. La actividad antitumoral observada en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria logra resultados que hasta ahora no se han logrado con las inmunoterapias existentes.
1. Cánceres
La terapia combinada de un agente anti-hialuronano, p. ej., enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, y un agente que aumenta la respuesta inmunitaria al bloquear una proteína de puntos de control inmunitario (es decir, un inhibidor de puntos de control inmunitario), tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1), se puede utilizar para el tratamiento de células cancerosas, neoplasias, tumores y metástasis. La terapia combinada proporcionada en la presente memoria activa la respuesta inmunitaria del anfitrión, mostrando así una eficacia antitumoral que produce como resultado una disminución o reducción del crecimiento del tumor, una disminución en el volumen del tumor y, en algunos casos, la eliminación o erradicación del tumor. Para los cánceres que se caracterizan por tener un alto contenido de HA, tal como el cáncer de páncreas, la terapia combinada proporciona beneficios significativos en comparación con la administración de una proteína de puntos de control inmunitario sola.
Por ejemplo, la terapia combinada se puede utilizar para tratar cualquier tumor, caracterizado por tener un contenido de hA de moderado a alto, tales como tumores de pulmón y bronquios, mama, colon y recto, riñón, estómago, esófago, hígado y conducto biliar intrahepático, vejiga urinaria, cerebro y otros del sistema nervioso, cabeza y cuello, cavidad bucal y faringe, cuello uterino, cuerpo uterino, tiroides, ovario, testículos, próstata, melanoma maligno, colangiocarcinoma, timoma, cáncer de piel distintos de melanoma, así como tumores y/o neoplasias malignas hematológicos, tales como leucemia y linfomas infantiles, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin, linfomas de origen linfocítico y cutáneo, leucemia aguda y crónica, tal como leucemia linfoblástica aguda, mielocítica aguda o mielocítica crónica, neoplasia maligna de células plasmáticas, neoplasia maligna linfoide y cánceres asociados con SIDA, en donde el tumor tiene un contenido de hA de moderado a alto. Típicamente, la terapia combinada se utiliza para el tratamiento de tumores sólidos que tienen un contenido de HA de moderado (HAmoderad° o HA+2) a alto (HAalto o HA+3), por ejemplo, cánceres estromales con tumor sólido HAalto. Los tumores con HAalto ilustrativos incluyen, por ejemplo, tumores pancreáticos, tumores de ovario, tumores de pulmón, tumores de colon, tumores de próstata, tumores cervicales y tumores de mama.
En particular, los cánceres ricos en hialuronano elegidos como por la terapia combinada proporcionada son adecuados para ser atacados por un agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano. Se han identificado varios cánceres ricos en hialuronano. Los tumores ricos en hialuronano incluyen, pero no se limitan a, tumores de próstata, mama, colon, ovario, estómago, cabeza y cuello y otros tumores y cánceres. En algunos casos, los niveles de hialuronano se correlacionan con un mal pronóstico, por ejemplo, una tasa de supervivencia reducida y/o una tasa de supervivencia sin recurrencia, metástasis, angiogénesis, invasión de células cancerosas en otros tejidos/áreas y otros indicadores de pronóstico desfavorable. Tal correlación se ha observado, por ejemplo, en tumores ricos en hialuronano que incluyen cáncer de ovario, CCE, CIS, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, incluyendo cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de páncreas (véanse, por ejemplo, Anttila et al., (2000) Cancer Research, 60:150-155.; Karvinen et al., (2003) British Journal of Dermatology, l48:86-94; Lipponen et al., (2001) Eur. Journal of Cancer, 849-856; Pirinen et al., (2001) Int. J. Cancer: 95:12-17; Auvinen et al., (2000) American Journal of Pathology, 156 (2):529-536; Ropponen et al., (1998) Cancer Research, 58:342-347). Por lo tanto, los cánceres ricos en hialuronano pueden tratarse mediante la administración de un agente antihialuronano, tal como una hialuronidasa, para tratar uno o más síntomas del cáncer.
En las terapias combinadas proporcionadas en la presente memoria, se pueden utilizar agentes anti-hialuronano, tales como enzimas de degradación de hialuronano, incluyendo hialuronidasas, para potenciar las actividades antitumorales basadas en el sistema inmunológico promovidas por agentes terapéuticos que activan el sistema inmunológico. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano pueden mejorar la respuesta inmunitaria antitumoral de un anfitrión al facilitar el acceso de los inhibidores de puntos de control del sistema inmunológico, tales como los anticuerpos anti-proteína de puntos de control inmunitario, al sitio del tumor, facilitando la infiltración de las células inmunitarias y/o mejorando el contacto superficial entre las células inmunitarias citotóxicas y las células tumorales diana. Por ejemplo, las enzimas de degradación de hialuronano, incluidas las hialuronidasas, tales como la rHuPH20, se pueden administrar a un paciente en una cantidad eficaz para aumentar la difusión alrededor del sitio del tumor (p. ej., para facilitar la circulación y/o las concentraciones de agentes inmunoterapéuticos y/o células inmunitarias en y alrededor del sitio del tumor), inhibir la motilidad de las células tumorales, por ejemplo mediante la degradación del ácido hialurónico, y/o disminuir el umbral de apoptosis de las células tumorales. Esto p u e d e l le v a r a la s c é lu la s tu m o ra le s a un e s ta d o d e a n o ik is , lo q u e h a c e q u e la s c é lu la s tu m o ra le s s e a n m á s s u s c e p tib le s a la lis is l in fo c í t ic a y /o la a c c ió n d e lo s a g e n te s te ra p é u t ic o s , in c lu id o s lo s a g e n te s te ra p é u t ic o s a d ic io n a le s .
E n a lg u n o s e je m p lo s , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o a d m in is t ra d a a u m e n ta e l s u m in is tro d e a g e n te s te ra p é u t ic o s (p. e j., in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io ) a lo s tu m o re s a l a u m e n ta r la d ifu s ió n a lre d e d o r y d e n tro d e l s it io d e l tu m o r (p. e j., fa c il ita n d o la c irc u la c ió n ) . (P a te n te s d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 7.767.429 , 8.202.517 , P u b lic a c ió n d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2010 -0003238 ) . P o r lo ta n to , s e p u e d e a d m in is t r a r u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o P H 20 , a un p a c ie n te en u n a c a n t id a d e f ic a z p a ra a u m e n ta r la d ifu s ió n a lre d e d o r d e l s it io de l tu m o r p a ra m e jo ra r e l a c c e s o d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , a d m in is tra d o en c o m b in a c ió n c o n (p. e j., d e s p u é s d e ) la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , en e l s it io d e l tu m o r , d o n d e p u e d e a c t iv a r la s c é lu la s in m u n ita r ia s , ta le s c o m o lo s lin fo c ito s , q u e re s id e n en e l tu m o r .
E n o tro s e je m p lo s , lo s a u m e n to s m e d ia d o s p o r la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o en la c irc u la c ió n a lre d e d o r y a t ra v é s d e l s it io d e l tu m o r ta m b ié n p u e d e n fa c i l i ta r la in f i lt ra c ió n d e c é lu la s in m u n ita r ia s , ta le s c o m o lo s l in fo c ito s in f i lt ra n te s d e tu m o re s (T IL ) , en e l tu m o r (S in g h e t a l., (2012 ) C lin C a n c e r R e s . 18 :B 6 ; S in g h e t a l., (2013 ) C a n c e r R e s . 73 (8 S u p le m e n to ) :4999 ) . P o r lo ta n to , e l a g e n te o lo s a g e n te s in h ib id o re s d e la p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , c u a n d o s e a d m in is tra n c o n la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , y g e n e ra lm e n te d e s p u é s d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p u e d e n a c t iv a r la s c é lu la s in m u n ita r ia s q u e s e h a n in f i lt ra d o en e l tu m o r d e s p u é s d e la d e g ra d a c ió n d e l h ia lu ro n a n o p o r la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p a ra e fe c tu a r u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia a n titu m o ra l.
E n o tro s e je m p lo s , la d e g ra d a c ió n d e l h ia lu ro n a n o , p o r la s e n z im a s d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p u e d e fa c i l i ta r la lis is c ito tó x ic a l in fo c í t ic a d e la s c é lu la s c a n c e ro s a s a l m e jo ra r e l c o n ta c to s u p e r f ic ia l e n tre la s c é lu la s in m u n ita r ia s y la s c é lu la s tu m o ra le s d ia n a (M c B r id e y B a rd (1979 ) J E x p M ed . 149 (2 ) :507 -515 ) . T a l a c t iv id a d a d e m á s p ro m u e v e u n a re s p u e s ta a n t itu m o ra l c o m o re s u lta d o d e la a d m in is tra c ió n d e u n a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia .
2. Selección de sujetos para tratamiento
L o s m é to d o s p a ra a d m in is t ra r u n a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia p a ra e l t ra ta m ie n to de l c á n c e r in c lu y e n e ta p a s p a ra s e le c c io n a r s u je to s p a ra e l t ra ta m ie n to q u e t ie n e n un tu m o r o c á n c e r q u e s e c a ra c te r iz a p o r te n e r un c o n te n id o d e H A d e m o d e ra d o a a lto . T a le s m é to d o s in c lu y e n m é to d o s p a ra d e te c ta r lo s n iv e le s d e H A en lo s tu m o re s d e s u je to s p o te n c ia le s p a ra id e n t if ic a r s u je to s , c o n tu m o re s c a ra c te r iz a d o s p o r un c o n te n id o d e H A d e m o d e ra d o a a lto q u e p ro b a b le m e n te re s p o n d a n a l t ra ta m ie n to d e la a d m in is t ra c ió n c o m b in a d a d e un a g e n te a n t ih ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o y un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io . C u a lq u ie r m u e s tra o te j id o d e un s u je to p u e d e s e r a n a liz a d a y c o m p a ra d a c o n u n a m u e s tra o te j id o n o rm a le s . L o s n iv e le s d e h ia lu ro n a n o s e p u e d e n m e d ir a p a r t ir d e c u a lq u ie r fu e n te , ta l c o m o un te j id o (p. e j., p o r b io p s ia ), tu m o r , c é lu la s o a p a r t ir d e s a n g re , s u e ro , o r in a u o tro s f lu id o s c o rp o ra le s . La e le c c ió n d e la m u e s tra e s tá d e n tro d e l n iv e l d e un e x p e rto en la té c n ic a .
E n o tro s e je m p lo s , lo s s u je to s s e le c c io n a d o s p a ra e l t ra ta m ie n to m u e s tra n m a rc a d o re s d e u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia e le v a d a e x is te n te . E n a lg u n o s e je m p lo s , la re s p u e s ta in m u n ita r ia e le v a d a e s tá in d ic a d a p o r un a u m e n to en el re c u e n to a b s o lu to d e l in fo c ito s (A L C ).
a. Medición del contenido de hialuronano en tumores
E s tá d e n tro d e l n iv e l d e un e x p e r to en la té c n ic a e v a lu a r , c u a n tif ic a r , d e te rm in a r y /o d e te c ta r lo s n iv e le s d e h ia lu ro n a n o en u n a m u e s tra . E l c o n te n id o d e h ia lu ro n a n o se p u e d e m e d ir , p o r e je m p lo , en u n a m u e s tra d e te jid o , c é lu la o líq u id o re c o g id a d e un s u je to p o te n c ia l. E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , e l c o n te n id o d e h ia lu ro n a n o s e m id e en te j id o s tu m o ra le s , p o r e je m p lo en b io p s ia s d e tu m o re s . P o r e je m p lo , ta le s m é to d o s in c lu y e n la in m u n o t in c ió n p o r in m u n o h is to q u ím ic a o in m u n o f lu o re s c e n c ia o e n s a y o s d e u n ió n en fa s e s ó lid a .
L o s m é to d o s d e s e le c c ió n d e s u je to s s e g ú n el g ra d o d e a c u m u la c ió n d e h ia lu ro n a n o (p . e j., d e m o d e ra d o a a lto ) so n c o n o c id o s en la té c n ic a (v é a n s e p. e j., la P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2013 /0202583 ; J ia n g e t a l. (2012 ) A n t ic a n c e r R e s ., 32 :1203 -1212 ; K u ltt i e t a l. (2012 ) C a n c e rs , 4 :873 -903 ; y J a c o b e tz e t a l. (2012 ) G u t, 62 :112 -120 ) . En ta le s m é to d o s , s e p u e d e e m p le a r u n a p ro te ín a d e u n ió n a h ia lu ro n a n o (H A B P ) p a ra d e te c ta r h ia lu ro n a n o .
E n un e je m p lo a d ic io n a l, la e x p re s ió n y p ro d u c c ió n d e h ia lu ro n a n o en c é lu la s tu m o ra le s in v itro s e p u e d e d e te rm in a r e v a lu a n d o la p ro d u c c ió n d e h ia lu ro n a n o s in ta s a (p. e j., H A S 1 , H A S 2 o H A S 3 ) y /o ta m b ié n s e p u e d e a n a liz a r la e x p re s ió n p o r c é lu la s in vitro, e x v ivo o in vivo, p o r e je m p lo , m e d ia n te E L IS A , S D S -P A G E , t r a n s fe re n c ia W e s te rn , P C R , R T -P C R , in m u n o h is to q u ím ic a , h is to lo g ía o c ito m e tr ía d e flu jo .
L o s e n s a y o s in c lu y e n e n s a y o s in v itro o en vivo. L o s e n s a y o s d e u n ió n ilu s tra t iv o s q u e s e p u e d e n u t i l iz a r p a ra v a lo ra r , e v a lu a r, d e te rm in a r, c u a n t i f ic a r y /o d e te c ta r d e o tra m a n e ra e s p e c íf ic a m e n te la e x p re s ió n o lo s n iv e le s d e h ia lu ro n a n o en u n a m u e s tra in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, e n s a y o s d e u n ió n en fa s e s ó lid a (p. e j., e n s a y o d e in m u n o a b s o rc ió n c o n e n z im a lig a d a (E L IS A ), ra d io in m u n o e n s a y o (R IA ), e n s a y o in m u n o r ra d io m é tr ic o , e n s a y o d e f lu o re s c e n c ia , e n s a y o d e q u im io lu m in is c e n c ia , e n s a y o b io lu m in is c e n te , t r a n s fe re n c ia W e s te rn e h is to q u ím ic o s , ta le s c o m o in m u n o h is to q u ím ic a ( 1H C ) o p s e u d o in m u n o h is to q u ím ic a u t il iz a n d o un a g e n te d e u n ió n d is t in to d e un a n t ic u e rp o . E n lo s m é to d o s d e e n s a y o d e u n ió n en fa s e s ó lid a , ta le s c o m o lo s m é to d o s E L IS A , p o r e je m p lo , el e n s a y o p u e d e s e r en fo rm a to s á n d w ic h o en fo rm a to d e in h ib ic ió n c o m p e t it iv a . E n o tro s e je m p lo s , s e p u e d e n u t il iz a r m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s in v iv o .
S e e n t ie n d e q u e e l c a m b io p a rt ic u la r , p. e j., e l a u m e n to o la d is m in u c ió n d e H A d e p e n d e d e l e n s a y o u t iliz a d o . P o r e je m p lo , en un E L IS A , e l a u m e n to o d is m in u c ió n d e la a b s o rb a n c ia a u n a lo n g itu d d e o n d a p a r t ic u la r o d e la c a n t id a d d e p ro te ín a (p. e j., s e g ú n lo d e te rm in a d o m e d ia n te e l u so d e u n a c u rv a p a tró n ) s e p u e d e e x p re s a r en re la c ió n c o n un c o n tro l. E n un e n s a y o d e P C R , ta l c o m o R T -P C R , e l c a m b io s e p u e d e c o m p a ra r c o n lo s n iv e le s d e e x p re s ió n d e c o n tro l (p. e j., e x p re s a d o c o m o m u lt ip l ic id a d d e c a m b io ) u t i l iz a n d o m é to d o s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a , ta le s c o m o el u s o d e p a tro n e s .
P o r e je m p lo , c u a n d o s e e s tá s o m e t ie n d o a p ru e b a la c a n t id a d d e h ia lu ro n a n o en u n a m u e s tra d e un s u je to , la d e te c c ió n d e l m a rc a d o r p u e d e d e te rm in a r q u e la c a n t id a d d e H A en la m u e s tra (p . e j., c é lu la s c a n c e ro s a s , te j id o o f lu id o ) d e l s u je to s e e le v a en c o m p a ra c ió n co n u n a m u e s tra d e c o n tro l, c o m o u n a m u e s tra d e c o n tro l d e s c r ita en el p á r ra fo a n te r io r . E n un e je m p lo , s e d e te rm in a q u e e l c á n c e r e s r ic o en h ia lu ro n a n o s i la c a n t id a d d e H A en e l te jid o , la c é lu la o e l f lu id o s e e le v a o s e e le v a a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 v e c e s , 1 ve z , 2 v e c e s , 3 v e c e s , 4 v e c e s , 5 v e c e s , 6 v e c e s , 7 v e c e s , 8 v e c e s , 9 v e c e s , 10 v e c e s , 11 v e c e s , 12 v e c e s , 13 v e c e s , 14 v e c e s , 15 v e c e s , 20 v e c e s , o m á s , en c o m p a ra c ió n c o n la m u e s tra d e c o n tro l. P o r e je m p lo , lo s tu m o re s c o n H A a lto g e n e ra lm e n te m u e s tra n a l m e n o s 2 v e c e s m á s d e H A o m á s q u e u n a m u e s tra d e c o n tro l (p . e j., tu m o r ) . L a m u e s tra d e c o n tro l p u e d e s e r la m u e s tra t r a ta d a co n u n a h ia lu ro n id a s a p a ra d ig e r ir e l A H y c o n f irm a r la e s p e c if ic id a d d e la t in c ió n . E n o tro s c a s o s , la m u e s tra d e c o n tro l p u e d e in c lu ir , p e ro no s e lim ita a, un f lu id o , te jid o , e x tra c to (p. e j., e x tra c to c e lu la r o n u c le a r) , á c id o n u c le ic o o p re p a ra c ió n d e p é p tid o s , lín e a c e lu la r , b io p s ia , m u e s tra p a tró n u o tra m u e s tra , co n u n a c a n t id a d c o n o c id a o u n a c a n t id a d re la t iv a d e h A , ta l c o m o u n a m u e s tra , p o r e je m p lo u n a lín e a d e c é lu la s tu m o ra le s , q u e s e s a b e q u e e x p re s a n iv e le s re la t iv a m e n te b a jo s d e H A , ta le s c o m o la s lín e a s c e lu la re s tu m o ra le s i lu s tra t iv a s d e s c r ita s en la p re s e n te m e m o r ia q u e e x p re s a n n iv e le s b a jo s d e H A , p o r e je m p lo , la lín e a c e lu la r H C T 116 , la lín e a c e lu la r H T 29 , la lín e a c e lu la r N C I h 460 , la lín e a c e lu la r D U 145 , la c é lu la C a p a n -1 lín e a , y tu m o re s a p a r t ir d e m o d e lo s d e tu m o re s g e n e ra d o s u t il iz a n d o ta le s lín e a s c e lu la re s .
i. Proteínas de unión a hialuronano (HABP)
L o s s u je to s s e p u e d e n s e le c c io n a r m e d ia n te la d e te c c ió n d e la u n ió n d e u n a H A B P ( ta m b ié n c o n o c id a c o m o h ia la d h e r in a s ) a u n a m u e s tra . L a H A B P p u e d e s e r u n a p ro te ín a d e u n ió n a á c id o h ia lu ró n ic o d e l c a r t í la g o n a sa l b o v in o (p. e j., H A B P d is p o n ib le c o m e rc ia lm e n te d e E M D M illip o re , B il le r ic a , M A c o n e l N ú m . d e C a tá lo g o 385911 ) . L a H A B P ta m b ié n p u e d e s e r c u a lq u ie r p ro te ín a q u e c o n te n g a un m ó d u lo d e c o n e x ió n o d o m in io s G 1 , q u e so n d o m in io s q u e s e s a b e q u e s e u n e n a l h ia lu ro n a n o , o m u ltím e ro s d e lo s m is m o s q u e c o n tie n e n d o s o m á s d e ta le s d o m in io s . T a le s p ro te ín a s s o n c o n o c id a s y s e d e s c r ib e n e n la P u b lic a c ió n d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m .
2013 /0202583. U n e je m p lo d e ta l p ro te ín a e s T S G -6 o e l m ó d u lo d e c o n e x ió n d e T S G -6 (T S G -6 -L M ) , o v a r ia n te s d e lo s m is m o s q u e m u e s tra n u n a u n ió n re d u c id a a la h e p a r in a , o m u ltím e ro s d e lo s m is m o s . P a ra la d e te c c ió n , la H A B P p u e d e s e r m a rc a d a d e m a n e ra d e te c ta b le . P o r e je m p lo , la H A B P p u e d e s e r b io t in ila d a .
E n e je m p lo s p a rt ic u la re s , la H A B P e s un m u ltím e ro c o m o s e d e s c r ib e en la P u b lic a c ió n d e P a te n te d e E s ta d o s U n id o s N ú m . 2013 /0202583. U n m u ltím e ro H A B P e s u n a m o lé c u la d e u n ió n q u e c o n t ie n e a l m e n o s d o s s it io s o d o m in io s d e u n ió n a H A (p . e j., a l m e n o s d o s m ó d u lo s d e c o n e x ió n ) q u e s o n c a p a c e s d e u n irs e a H A . P o r lo ta n to , un m u ltím e ro t íp ic a m e n te t ie n e u n a a f in id a d d e u n ió n , c u a n d o s e re p re s e n ta c o m o la c o n s ta n te d e d is o c ia c ió n (K d ), q u e e s g e n e ra lm e n te m e n o r q u e 1 x 10"8 M a 1 x 10"10 M , ta l c o m o m e n o r d e 9 x 10 -9 M , 8 x 10 -9 M , 7 x 10 -9 M , 6 x 10"9 M , 5 x 10"9 M 4 x 10"9 M , 3 x 10"9 M 2 x 10 "9 M 1 x 10"9 M , 9 x 10"10 M , 8 x 10"10 M , 7 x 10"10 M , 6 x 10"10 M , 5 x 10"10 M , 4 x 10"10 M 3 x 10"10 M, 2 x 10"10 M , 1 x 10"10 M o u n a K d m e n o r.
E l m u ltím e ro s e p u e d e fo rm a r a p a r t ir d e u n a p ro te ín a d e fu s ió n q u e c o n t ie n e un s it io d e u n ió n a H A (p. e j., d o m in io G 1 o m ó d u lo d e c o n e x ió n ) l ig a d o d ire c ta o in d ire c ta m e n te a un d o m in io d e m u lt im e r iz a c ió n . El d o m in io d e m u lt im e r iz a c ió n p ro p o rc io n a la fo rm a c ió n d e u n a in te ra c c ió n p ro te ín a -p ro te ín a e s ta b le e n tre e l d o m in io d e m u lt im e r iz a c ió n d e un p r im e r p o lip é p tid o d e H A B P y e l d o m in io d e m u lt im e r iz a c ió n d e un s e g u n d o p o lip é p tid o d e H A B P . E l p r im e r y s e g u n d o p o lip é p tid o s d e H A B P (p . e j., q u e c o n t ie n e n un d o m in io d e c o n e x ió n o d o m in io G 1 ) p u e d e n s e r ig u a le s o d ife re n te s . P o r e je m p lo , e l m u ltím e ro se p u e d e fo rm a r p o r la e x p re s ió n d e la p ro te ín a d e fu s ió n en u n a c é lu la . L a s p ro te ín a s q u im é r ic a s d e l d o m in io d e m u lt im e r iz a c ió n d e H A B P re s u lta n te s s e p u e d e n e x p re s a r en c é lu la s a n f it r io n a s tra n s fo rm a d a s co n e l v e c to r d e e x p re s ió n re c o m b in a n te , y s e p u e d e n e n s a m b la r en m u ltím e ro s , d o n d e lo s d o m in io s d e m u lt im e r iz a c ió n in te ra c tú a n p a ra fo rm a r p o lip é p tid o s m u lt iv a le n te s . El e n la c e q u ím ic o d e los d o m in io s d e m u lt im e r iz a c ió n a p o lip é p tid o s H A B P s e p u e d e e fe c tu a r u t i l iz a n d o c o n e c to re s h e te ro b ifu n c io n a le s c o m o se comentó anteriormente.
Los polipéptidos quiméricos resultantes, y los multímeros formados a partir de ellos, se pueden purificar mediante cualquier método adecuado tal como, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G. Cuando dos moléculas de ácido nucleico que codifican diferentes polipéptidos quiméricos de HABP se transforman en células, se producirá la formación de homo y heterodímeros. Las condiciones de expresión se pueden ajustar de modo que se favorezca la formación de heterodímeros sobre la formación de homodímeros.
Un ejemplo de HABP es TSG-6, o un polipéptido que contiene un módulo de conexión de TSG-6 (es decir, TSG-6-LM), una porción suficiente de un módulo de conexión para unirse a HA, variantes del mismo o un multímero del mismo. El gen 6 estimulado por el factor de necrosis tumoral (TSG-6, proteína 6 inducida por el factor de necrosis tumoral alfa, TNFAIP6; SEQ ID NO: 303) es una glicoproteína secretada de ~35 kDa compuesta de un único módulo de conexión N-terminal y un dominio CUB C-terminal. La expresión de TSG-6 es inducida en muchos tipos de células por mediadores inflamatorios, incluyendo citoquinas y factores de crecimiento. A través de su módulo de conexión, TSG-6 es un potente inhibidor de la migración de leucocitos polimorfonucleares. TSG-6 forma un complejo estable con el inhibidor de la serina proteasa Inhibidora Inter-alfa (IaI) y potencia la actividad anti-plasmina de IaI. TSG-6 también es importante para la formación y remodelación de capas pericelulares y matrices extracelulares ricas en HA.
El transcrito de TSG-6 humano (SEQ ID NO: 302) se traduce normalmente para formar un péptido precursor de 277 aminoácidos (SEQ ID NO: 303) que contiene una secuencia señal de 17 aminoácidos en el extremo N-terminal. El TSG-6 maduro (expuesto en SEQ ID NO: 304), por lo tanto, es una proteína de 260 aminoácidos que contiene los aminoácidos 18-277 de SEQ ID NO: 303 (Lee et al. (1992) J Cell Biol 116:545-557). TSG-6 se compone de dos dominios principales, el módulo de conexión y el dominio CUB. Se ha referido de diversas maneras en la bibliografía que el módulo de conexión de TSG-6 se encuentra en los aminoácidos 35-129, 36-128, 36-129 o 36-132 de SEQ ID NO: 303 (expuestos como SEQ ID NO: 305, 306, 307 o 308, respectivamente). Se entiende que la referencia a los loci de un dominio puede variar en varios aminoácidos debido a las diferencias en los alineamientos. Por lo tanto, para los fines de la presente memoria, un TSG-6-LM es uno expuesto en cualquiera de SEQ ID NO: 305-308 o que varía de tal secuencia en uno, dos o tres aminoácidos. El dominio CUB está ubicado en los aminoácidos 135-246 de SEQ ID NO: 303. El TSG-6 humano tiene dos glicanos unidos a N potenciales en los residuos N118 y N258 de SEQ ID NO: 303. Además, los residuos T259 y T262 de SEQ ID NO: 303 están fosforilados (Molina et al. (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104:2199-2204). El TSG-6 humano tiene ocho cisteínas nativas que forman cuatro enlaces disulfuro en los residuos C58-C127, C82-C103, C135-C161 y C188-C210 de la preproteína TSG-6 (SEQ ID NO: 303).
El módulo de conexión TSG-6 (p. ej., SEQ ID NO: 305-308) tiene un tamaño relativamente pequeño y una estructura bien caracterizada. Se determinó que la estructura tridimensional del dominio de enlace TSG-6 tiene el mismo plegamiento que otros módulos de conexión conocidos, que contienen dos hélices alfa y dos láminas beta antiparalelas dispuestas alrededor de un gran núcleo hidrófobo (Kohda et al. (1996) Cell 86:767-775). Además, se ha estudiado la interacción del módulo de conexión de TSG-6 y HA revelando que los anillos aromáticos de Tyr12, Tyr59, Phe70, Tyr78, Trp88 y los residuos alcalinos Lys11, Lys72, Asp77, Arg 81 y Glu86 del dominio de conexión de TSG-6 (SEQ ID NO: 305) son importantes para la unión a Ha (véanse, p. ej., Kahmann et al. (2000) Structure 15: 763-774; Mahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771; Kohda et al. (1996) Cell, 88:767-775.; Blundell et al. (2003) J Biol Chem 278:49261-49270; Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754; Blundell et al. (2005) J Biol Chem 280:18189-18201). Los estudios estructurales también muestran que solo hay un único sitio de unión a HA contenido en el módulo de conexión, que se localiza en una región de la molécula en función del mapa estructural de los residuos Lys11, Tyr12, Tyr59, Phe70 y Tyr78 que están más directamente implicados en la unión de HA (véase p. ej., Mahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771).
El módulo de conexión de TSG-6 muestra actividad de unión a varios glicosaminoglicanos. Por ejemplo, los estudios han revelado la unión del módulo de conexión a HA, condroitin-4-sulfato (C4S), dominio G1 del proteoglicano agrecano, heparina y la cadena de bikunina de IaI (véase p. ej., Milner et al. (2003) Journal of Cell Science, 116:1863-1873; Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055). La unión de TSG-6 a heparina y HA está mediada por un sitio de unión distinto en la LM de TSG-6. Los residuos involucrados en la unión de TSG-6-LM a hialuronano son Lys11, Tyr12, Tyr59, Phe70 y Tyr78, por lo que los mutantes K11Q, Y12F, Y59F, F70V y Y78F tienen entre 10 y 100 veces menos afinidad de unión a HA en comparación con el tipo salvaje; los residuos de TSG-6- LM implicados en la unión a heparina son Lys20, Lys34, Lys41, Lys54, Arg56 y Arg84, por lo que los mutantes K20A, K34A, K41A y K54A muestran propiedades de unión a heparina deterioradas; y los residuos implicados en la unión de TSG-6-LM a bikunina se superponen pero no son idénticos al sitio de unión de HA (Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055).
La unión de TSG-6 a hialuronano es dependiente del pH, con una actividad de unión mostrada a un pH ácido de 5,6 a 6,4 o a un pH ácido de aproximadamente 5,6 a 6,4, tal como un pH de 5,8 a 6,0 o un pH de aproximadamente 5,8 a pH 6,0.
Los polipéptidos TSG-6, sus dominios de unión a HA, p. ej., los módulos de conexión a TSG-6, o los fragmentos de los mismos suficientes para unirse a HA proporcionados en la presente memoria para su uso como un diagnóstico complementario pueden incluir cualquiera de SEQ ID NO: 303-308, o variantes de los mismos, tales como variantes que muestren al menos 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOS: 303-308. Las variantes ilustrativas incluyen, por ejemplo, variantes de especies, variantes alélicas y variantes que contienen mutaciones de aminoácidos conservativas y no conservativas. Las variantes alélicas naturales de t SG-6 humano incluyen, por ejemplo, TSG-6 que contiene el reemplazo de aminoácido Q144R (Nentwich et al. (2002) J Biol Chem 277:15354-15362). TSG-6 está altamente conservado entre las especies siendo las proteínas humanas y de ratón > 94% idénticas.
Las variantes de TSG-6 o fragmentos de unión a HA del mismo para su uso en los métodos proporcionados incluyen variantes con una modificación de aminoácido que sea un reemplazo de aminoácido (sustitución), deleción o inserción. Las modificaciones ilustrativas son reemplazos de aminoácidos tales como un reemplazo de aminoácidos en cualquiera de los residuos de aminoácido 4, 6, 8, 13, 20, 29, 34, 41, 45, 54, 67, 72 o 96 correspondientes a los residuos de TSG- 6 expuestos en SEQ ID NO: 305. El aminoácido de reemplazo puede ser cualquier otro residuo de aminoácido. Los remplazos de aminoácidos ilustrativos de un polipéptido TSG-6 o fragmentos de unión a HA del mismo proporcionados en la presente memoria para su uso como reactivo de diagnóstico complementario incluyen polipéptidos TSG-6 modificados o fragmentos de unión a HA de los mismos que contienen al menos un reemplazo de aminoácido correspondiente a H4K, H4S, E6A, E6K, R8A, K13A, K20A, H29K, K34A, K41A, H45S, K54A, N67L, N67S, K72A, H96K, K34A/K54A o K20A/K34A/K41A correspondiente a los residuos de TSG-6 expuestos en SEQ ID NO: 305 (véanse, p. ej., Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biol Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754, Kahmann et al. (2000) Structure 15:763-774). Se entiende que los residuos importantes o requeridos de otro modo para la unión de TSG-6 a HA, tales como los descritos anteriormente o conocidos por un experto en la técnica, son generalmente invariables y no se pueden cambiar. Así, por ejemplo, los residuos de aminoácidos 11, 12, 59, 70, 78 y 81 de SEQ ID NO: 305 en el módulo de conexión de TSG-6 son generalmente invariables y no están alterados. Además, se entiende que las modificaciones de aminoácidos que dan como resultado un plegamiento incorrecto o una perturbación del plegado del módulo de conexión son generalmente invariables. Así, por ejemplo, un TSG-6 modificado no contendrá una cualquiera o más de las modificaciones de aminoácidos H4S, H29A, H45A, H45K, R56A, D77A, R84A y D89A de SEQ ID NO: 305 (Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biot Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biot Chem 279:25745-25754).
En particular, la modificación, por ejemplo, reemplazo o reemplazos de aminoácidos, es aquella que confiere una actividad alterada, tal como mejorada, en comparación con un TSG-6 que no contiene la modificación. Tales variantes incluyen aquellas que contienen modificaciones de aminoácidos que mejoran la afinidad de unión de TSG-6 a HA, aumentan la especificidad de TSG-6 para HA, y/o aumentan la solubilidad de TSG-6. Por ejemplo, en la presente memoria se proporcionan para el uso en la presente memoria variantes de TSG-6, dominios de unión a HA, o porciones de los mismos suficientes para unirse a HA que aumentan la especificidad de TSG-6 para HA al disminuir la unión de TSG-6 a otros glicosaminoglicanos incluyendo heparina, condroitin-4-sulfato, sulfato de heparano y sulfato de dermatán. La unión al otro glicosaminoglicano que no es hialuronano se puede reducir al menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 100 veces o más en comparación con la unión de TSG-6-LM que no contiene la modificación. Por ejemplo, en la presente memoria se proporciona un TSG-6-LM mutante que contiene uno o más remplazos de aminoácidos en los residuos de aminoácidos 20, 34, 41, 54, 56, 72 y/u 84, y en particular en los residuos de aminoácidos 20, 34 , 41 y/o 54 (correspondientes a los residuos de aminoácidos expuestos en SEQ ID NO: 303). El aminoácido de reemplazo puede ser a cualquier otro residuo de aminoácido, y generalmente es a un residuo de aminoácido no alcalino. Por ejemplo, el reemplazo de aminoácidos puede ser Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (Q), Ala (A), Val (V), Ile (I), Leu (L), Met (M), Phe (F), Tyr (Y) o Trp (W). El reemplazo o reemplazo de aminoácidos confiere una menor unión a la heparina. Por ejemplo, las variantes que disminuyen la capacidad de TSG-6 para unirse a heparina son conocidas por los expertos en la técnica. Tales variantes son aquellas que incluyen al menos una mutación correspondiente a K20A, K34A, K41A y K54A, incluidas las variantes K34A/K54A o K20A/K34A/K41A (Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055). Las variantes ilustrativas que disminuyen o reducen la unión a la heparina son la variante TSG-6-LM expuesta en SEQ ID NO: 309 o 310.
Un ejemplo de polipéptido TSG-6 como un diagnóstico complementario es un polipéptido TSG-6 que contiene al menos un dominio de unión a HA, por ejemplo, un módulo de conexión de t SG-6. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona un módulo de conexión de TSG-6, o una variante del mismo, para su uso en los métodos proporcionados. Un ejemplo de un reactivo polipeptídico de este tipo es uno que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 305-310, o tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 95%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NO: 305-310. Por ejemplo, el módulo de conexión de TSG-6 se puede modificar para alterar su especificidad, afinidad o solubilidad, siempre que mantenga su capacidad de unirse a HA.
En otro ejemplo más, la afinidad del módulo de conexión de TSG-6 se incrementa mediante la dimerización o la multimerización, tal como, por ejemplo, la fusión a un dominio de multimerización, tal como un dominio Fc. Por lo tanto, el módulo de conexión de TSG-6 se puede modificar para producir un multímero que contenga dos o más módulos de conexión que estén vinculados directa o indirectamente a través de un dominio de multimerización para efectuar la formación de moléculas de dímero o trímero y la generación de múltiples sitios de unión a HA. Por ejemplo, un diagnóstico complementario es aquél que se genera mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica el módulo de conexión expuesto en una de SEQ ID NO: 305-310 o un ácido nucleico que codifica un módulo de conexión que tiene una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 305-310 unida directa o indirectamente a un ácido nucleico que codifica un dominio de multimerización, tal como una porción Fc de una inmunoglobulina. Por lo tanto, el multímero de TSG-6-LM resultante contiene un primer polipéptido expuesto en uno de SEQ ID NO: 305-310 o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 84 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 305-310 unida directa o indirectamente a un dominio de multimerización; y un segundo polipéptido expuesto en uno cualquiera de SEQ ID NO: 305-310 o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 305-310 unida directa o indirectamente a un dominio de multimerización. En general, el LM o una porción suficiente del mismo para efectuar la unión de HA es la única porción de TSG-6 del multímero.
Los ejemplos de polipéptidos quiméricos de HABP-Fc incluyen la proteína de fusión del módulo de conexión TSG-6 (TSG-6-LM) y Fc. Por ejemplo, la molécula TSG-6-LM:Fc puede ser una expuesta en SEQ ID NO: 312 o 313. Una TSG-6-LM-Fc ilustrativa se expone en SEQ ID NO: 312, y está codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 314 o 316. Una TSG-6-LM-Fc ilustrativa se expone en SEQ ID NO: 313, y está codificada por una secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 315. Además las moléculas de HABP-Fc, que incluyen, por ejemplo, las moléculas de TSG-6-Fc ilustrativas, pueden contener opcionalmente una etiqueta epitópica o una señal de expresión y secreción. Por ejemplo, el polipéptido quimérico TSG-6-LM-Fc ilustrativo expuesto como SEQ ID NO: 312 contiene la secuencia del péptido señal líder de la cadena ligera kappa (k) de la inmunoglobulina humana, un fragmento Fc de la cadena pesada de IgG1 humana (SEQ ID NO: 311) y un módulo de conexión TSG-6 humano (SEQ ID NO: 306). La secuencia de ADNc que codifica el polipéptido quimérico TSG-6-LM-Fc se expone en SEQ ID NO: 314.
ii. Métodos histoquímicos e inmunohistoquímicos
Los niveles de hialuronano en una muestra recogida, tal como una muestra de un tumor, se pueden medir en función de la capacidad de una HABP para unirse a HA en una muestra y detectar la HABP, de modo que la cantidad del diagnóstico complementario de la HABP se correlaciona con la cantidad de HA en la muestra. Se puede utilizar cualquier diagnóstico complementario de HABP para detectar HA utilizando métodos de tinción de tejidos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, métodos citoquímicos o histoquímicos, tales como inmunohistoquímica (IHC) o histoquímica utilizando un agente de unión distinto de un anticuerpo (p. ej., pseudoinmunohistoquímica). Tales métodos histoquímicos permiten la detección cuantitativa o semicuantitativa de la cantidad de HABP que se une a HA en una muestra, tal como una muestra de tejido tumoral. En tales métodos, se puede poner en contacto una muestra de tejido con un reactivo HABP proporcionado en la presente memoria, y en particular uno que esté marcado de forma detectable o que se pueda detectar, en condiciones que permitan la unión al HA asociado con el tejido o la célula.
Una muestra para determinar los niveles de HA por histoquímica puede ser cualquier muestra biológica que pueda analizarse para determinar sus niveles de HA, tal como un tejido, tal como un tejido tumoral o una muestra celular. Por ejemplo, una muestra de tejido puede ser tejido sólido, incluyendo una muestra de órgano o tejido fresco, congelado y/o conservado o biopsia o producto aspirado, o células. En algunos ejemplos, la muestra de tejido es tejido o células obtenidos de un tumor sólido, tal como tumores primarios y metastásicos, que incluyen, pero no se limitan a, tumores de mama, colon, recto, pulmón, estómago, ovario, cuello uterino, útero, testículos, vejiga, próstata, tiroides y pulmón. En ejemplos particulares, la muestra es una muestra de tejido de un cáncer en estadio tardío, cáncer metastásico, cáncer no diferenciado, cáncer de ovario, carcinoma in situ (CIS), carcinoma de células escamosas (CCE), cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, cáncer de colon. En otros ejemplos, la muestra de tejido contiene células de células o líneas celulares primarias o cultivadas. Las células pueden tener diversos estados de diferenciación y pueden ser normales, precancerosas o cancerosas, pueden ser tejidos frescos, células dispersas, células inmaduras, incluyendo células madre, células de madurez intermedia y células completamente maduras. Típicamente, las células seleccionadas para su uso en los métodos proporcionados en la presente memoria son células cancerosas.
Cuando el tumor es un tumor sólido, el aislamiento de las células tumorales se logra típicamente mediante biopsia quirúrgica. Las técnicas de biopsia que se pueden utilizar para extraer células tumorales de un sujeto incluyen, pero no se limitan a, biopsia con aguja, biopsia con aguja guiada por TC, biopsia por aspiración, biopsia endoscópica, biopsia broncoscópica, lavado bronquial, biopsia incisional, biopsia por escisión, biopsia por punción, biopsia por afeitado, biopsia de piel, biopsia de médula ósea y el Procedimiento de Extirpación Electroquirúrgico de Lazo (LEEP). Típicamente, se obtiene una biopsia o espécimen no necrótico, estéril que es mayor que 100 mg, pero que puede ser más pequeño, tal como por ejemplo menos de 100 mg, 50 mg o menos, 10 mg o menos o 5 mg o menos; o más grande, tal como más de 100 mg, 200 mg o más, o 500 mg o más, 1 g o más, 2 g o más, 3 g o más, 4 g o más o 5 g o más. El tamaño de la muestra que se extraerá para el ensayo puede depender de una serie de factores que incluyen, pero no se limitan a, el número de ensayos que se realizarán, la salud de la muestra de tejido, el tipo de cáncer y el estado del sujeto. El tejido tumoral se coloca en un recipiente estéril, tal como un tubo o placa de cultivo estériles, y se puede sumergir opcionalmente en un medio apropiado.
El tejido obtenido del paciente después de la biopsia a menudo se fija, generalmente por medio de inmersión en formalina (formaldehído) o glutaraldehído, por ejemplo, o en alcohol. Para los métodos histoquímicos, la muestra de tumor se puede procesar utilizando técnicas conocidas, tales como la deshidratación e inclusión del tejido tumoral en una cera de parafina u otros soportes sólidos conocidos por los expertos en la técnica (véase Plenat et al., (2001) Ann Pathol January 21(1):29-47), cortando el tejido en secciones adecuadas para la tinción, y procesando las secciones para la tinción de acuerdo con el método de tinción histoquímica seleccionado, incluyendo la eliminación de soportes sólidos para la inclusión con disolventes orgánicos, por ejemplo, y la rehidratación del tejido conservado. Por lo tanto, las muestras para su uso en los métodos de la presente memoria pueden contener compuestos que no están presentes de forma natural en una muestra de tejido o celular, incluyendo, por ejemplo, conservantes, anticoagulantes, tampones, fijadores, nutrientes y antibióticos.
En los métodos ilustrativos para seleccionar un sujeto para el tratamiento con una enzima de degradación de hialuronano, la recogida del tejido tumoral se realiza generalmente antes del tratamiento del sujeto con una enzima de degradación de hialuronano. En métodos ilustrativos de seguimiento de la terapia de un tumor con una enzima de degradación de hialuronano, la recogida del tejido tumoral del sujeto se puede realizar antes, durante o después de que el sujeto haya recibido uno o más tratamientos con una enzima de degradación de hialuronano.
Los ensayos para medir el HA presente en una muestra realizan la detección mediante histoquímica o inmunohistoquímica. La histoquímica (HC) es un método de tinción basado en reacciones enzimáticas que utilizan un compañero de unión, tal como un anticuerpo (p. ej., anticuerpos monoclonales o policlonales) u otro compañero de unión, para detectar células o proteínas específicas tales como antígenos de tejidos o biomarcadores, por ejemplo, HA. Por ejemplo, los ensayos de histoquímica incluyen aquellos en los que se utiliza una HABP como un compañero de unión para detectar el AH asociado con células o tejidos, particularmente tejidos de cáncer. Por lo general, los protocolos de histoquímica incluyen sistemas de detección que hacen visible la presencia de los marcadores, ya sea a simple vista o en un sistema de detección automático, para análisis cualitativos o cuantitativos. En un ensayo directo de HC, la unión se determina directamente después de la unión del compañero de unión (p. ej., primer anticuerpo) al tejido o biomarcador debido al uso de un reactivo marcado. En un ensayo de HC indirecto, es necesario un anticuerpo secundario o segundo compañero de unión para detectar la unión del primer compañero de unión, ya que éste no está marcado.
En tales métodos, generalmente una muestra de tejido montada en un portaobjetos se tiñe con un reactivo de unión marcado (p. ej., HABP marcada) utilizando técnicas comunes de histoquímica. De este modo, en algunos ensayos de HC, la HABP o el anticuerpo anti-HA se modifican para que contengan un radical detectable, tal como una proteína fluorescente, una proteína bioluminiscente o una enzima. En algunos ejemplos, la HABP o el anticuerpo anti-HA se conjugan con una molécula pequeña, p. ej., biotina, que se detecta a través de un compañero de unión o anticuerpo marcados. En algunos ejemplos, el método de IHC se basa en la tinción con una HABP o anticuerpo que se detectan mediante tinción enzimática con peroxidasa de rábano picante. Por ejemplo, la HABP o el anticuerpo anti-HA pueden ser biotinilados y detectados con avidina o estreptavidina conjugadas con proteínas detectables, tales como la estreptavidina-peroxidasa de rábano picante. En otros ejemplos, la HABP o el anticuerpo anti-HA se conjugan con proteínas detectables que permiten la detección directa, tal como, por ejemplo, el diagnóstico complementario de HABP conjugada con una proteína fluorescente, una proteína bioluminiscente o una enzima. Se conocen diversos métodos de tinción enzimática en la técnica para detectar una proteína de interés. Por ejemplo, las interacciones enzimáticas se pueden visualizar utilizando diferentes enzimas tales como la peroxidasa, la fosfatasa alcalina o diferentes cromógenos tales como DAB, AEC o Fast Red. En otros ejemplos, los diagnósticos complementarios de HABP se conjugan con péptidos o proteínas que se pueden detectar a través de un compañero de unión o anticuerpo marcados.
Se toman imágenes de cada uno de los especímenes teñidos resultantes utilizando un sistema para visualizar la señal detectable y obtener una imagen, tal como una imagen digital de la tinción. Los métodos para la obtención de imágenes son bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una vez que la muestra se ha teñido, se puede utilizar cualquier dispositivo de obtención de imágenes óptico o no óptico para detectar el colorante o la marca biomarcadora, tal como, por ejemplo, microscopios ópticos verticales o invertidos, microscopios confocales de barrido, cámaras, microscopios electrónicos de barrido o de efecto túnel, microscopios de sonda de barrido y detectores infrarrojos de imágenes.
En algunos ejemplos, la imagen puede ser capturada digitalmente. Las imágenes obtenidas se pueden utilizar a que una puntuación de HA+2 o HA+3 indica niveles de moderados a altos de HA en las muestras sometidas a prueba.
Mi. Ensayos de unión en fase sólida
Los ensayos de unión en fase sólida también se pueden utilizar para determinar cuantitativa o semicuantitativamente la cantidad de HA en una muestra. Los ejemplos de ensayos de unión en fase sólida que se pueden utilizar para valorar, evaluar, determinar, cuantificar y/o detectar de otra manera específicamente la expresión o los niveles de hialuronano en una muestra incluyen, pero no se limitan a, ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunorradiométrico, ensayo fluorométrico, ensayo quimioluminiscente, ensayo bioluminiscente. Por ejemplo, se puede emplear una HABP o un anticuerpo anti-HA para detectar HA utilizando cualquier ensayo de unión en fase sólida conocido por un experto en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, el ensayo de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) u otro inmunoensayo similar, incluyendo un ELISA tipo sándwich o un ensayo ELISA competitivo. Los métodos ilustrativos proporcionados en la presente memoria incluyen métodos basados en ELISA para la detección cuantitativa o semicuantitativa de la cantidad de HABP que se une al HA en una muestra, tal como una muestra de tejido tumoral o una muestra de fluido de un sujeto que tiene un tumor o se sospecha que tiene un tumor. El uso de ensayos de unión en fase sólida se puede utilizar cuando se detecta HA en un fluido corporal.
Los pacientes que muestran altos niveles de producción de hialuronano en el tejido tumoral también muestran altos niveles de hialuronano en sangre y otras muestras de fluidos. Las muestras de fluidos para el análisis de la producción de HA en una enfermedad asociada con HA, tal como el cáncer, incluyen, pero no se limitan a, suero, orina, plasma, líquido cefalorraquídeo y linfa. El sujeto puede tener o ser sospechoso de tener un cáncer, tal como tumores primarios y metastásicos, en la mama, colon, recto, pulmón, estómago, ovario, cuello uterino, útero, testículos, vejiga, próstata, tiroides, cáncer de pulmón. En ejemplos particulares, el cáncer es un cáncer de estadio tardío, un cáncer metastásico, un cáncer indiferenciado, un cáncer de ovario, un carcinoma in situ (CIS), un carcinoma de células escamosas (CCE), un cáncer de próstata, un cáncer de páncreas, un cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, o cáncer de colon.
En métodos ilustrativos para seleccionar sujetos para el tratamiento, la recogida de una muestra de fluido de un sujeto se realiza generalmente antes del tratamiento del sujeto según se proporciona en la presente memoria. En métodos ilustrativos de seguimiento de la terapia de un tumor con una enzima de degradación de hialuronano, la recogida de la muestra de fluido de un sujeto se puede realizar antes, durante o después de que el sujeto haya recibido uno o más tratamientos con una enzima de degradación de hialuronano. La recogida de la muestra de fluido también se puede realizar antes, durante o después de que el sujeto se haya sometido a una o más rondas de terapia contra el cáncer, tal como el tratamiento de radiación y/o quimioterapia.
A continuación se puede evaluar la muestra de fluido para determinar la presencia o la cantidad de HA utilizando un ensayo de unión en fase sólida. Los ensayos de unión en fase sólida pueden detectar un sustrato (p. ej., HA) en una muestra de fluido mediante la unión del sustrato a un agente de unión que se fija o se inmoviliza a una superficie sólida. Un anticuerpo o una proteína de unión específicos del sustrato (p. ej., una HABP proporcionada en la presente memoria), acoplados a una marca detectable (p. ej., una enzima), se aplican y se deja que se unan al sustrato. La presencia del anticuerpo o la proteína unida se detecta y cuantifica. Los métodos de detección y cuantificación incluyen, pero no se limitan a, métodos colorimétricos, fluorescentes, luminiscentes o radiactivos. La elección del método de detección depende de la marca detectable utilizada. En algunos ejemplos, una reacción colorimétrica emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Por ejemplo, las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina. La cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producida. Generalmente se emplea un patrón de sustrato para mejorar la precisión cuantitativa. La concentración de HA en una muestra se puede calcular interpolando los datos en una curva patrón. La cantidad de HA se puede expresar como una concentración de muestra de fluido.
Los métodos conocidos para la detección de la expresión de hialuronano en el cáncer incluyen ensayos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, el ensayo de tipo ELISA descrito por Lokeshwar et al., (1997) Cancer Res.
57:773-777 (véanse también, Veiseh et al., (2014) Proc. Natl Acad Sci. U.S.A. 29:111(17):E1731-9, que describe un ensayo basado en fluorescencia que utiliza HA marcado flurorescentemente; y la Solicitud Internacional Publicada PCT Núm. WO2009/128917) para medir los niveles de HA en orina o extractos de tejido de vejiga de sujetos con cáncer de vejiga. Para el ensayo, la orina o los extractos se recubren en placas de micropocillos (e1HA de cordón umbilical utilizado como patrón también se recubre), seguido de incubación (p. ej., 16 horas, temperatura ambiente) con una proteína de unión a HA marcada (p. ej., biotinilada), tal como las descritas en la presente memoria, se lavan y la proteína de unión a HA unida a los pocillos se cuantifica utilizando un sustrato de agente de detección de avidina-biotina. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. En un ejemplo, la orina de un sujeto con un cáncer de vejiga asociado a HA contenía niveles de HA que aumentaron de 2 a 9 veces en comparación con la orina/extractos de pacientes normales (sujetos sanos o sujetos con otras enfermedades o afecciones gastrourinarias); por lo tanto, el marcador se detectaría si los niveles de HA en la orina fueran elevados en comparación con los sujetos normales, p. ej., elevado entre 2 o aproximadamente 2 veces y 9 o aproximadamente 9 v e c e s , p. e j., u n a e le v a c ió n d e 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 o 9 o a p ro x im a d a m e n te 2 , 3, 4 , 5, 6, 7, 8 o 9 v e c e s en c o m p a ra c ió n c o n e l s u je to n o rm a l.
iv. Ensayos de obtención de imágenes in vivo
E n a lg u n o s e je m p lo s d e la p re s e n te m e m o r ia , la c a n t id a d d e H A s e d e te c ta u t i l iz a n d o m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s in vivo. E n ta le s m é to d o s , u n a H A B P , ta l c o m o T S G -6 o u n a v a r ia n te d e l m is m o , ta l c o m o un m u ltím e ro d e l m is m o , o un a n t ic u e rp o a n t i-H A s e c o n ju g a n c o n un ra d ic a l d e te c ta b le o un ra d ic a l q u e e s s u s c e p tib le d e d e te c c ió n p o r un m é to d o d e fo rm a c ió n d e im á g e n e s . L o s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s ilu s t ra t iv o s in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a, o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r f lu o re s c e n c ia , ra y o s X , m é to d o s d e re s o n a n c ia m a g n é tic a , ta le s c o m o o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r re s o n a n c ia m a g n é t ic a (M R I) y e s p e c tro s c o p ia d e re s o n a n c ia m a g n é t ic a (M R S ), y m é to d o s to m o g rá fic o s , in c lu y e n d o to m o g ra fía c o m p u ta d a (C T ), to m o g ra fía a x ia l c o m p u ta r iz a d a (C A T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a p o r h a z d e e le c tro n e s (E B C T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a d e a lta re s o lu c ió n (H R C T ), to m o g ra fía h ip o c ic lo id a l, to m o g ra fía p o r e m is ió n d e p o s it ro n e s (P E T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a p o r e m is ió n d e fo tó n ú n ic o (S P E C T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a en e s p ira l y to m o g ra fía p o r u lt ra s o n id o s . P o r e je m p lo , p a ra la o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r f lu o re s c e n c ia , la s s e ñ a le s f lu o re s c e n te s s e p u e d e n a n a liz a r u t i l iz a n d o un m ic ro s c o p io d e f lu o re s c e n c ia 0 un e s te re o m ic ro s c o p io d e f lu o re s c e n c ia . A d e m á s , ta m b ié n s e p u e d e u t i l iz a r u n a c á m a ra d e im á g e n e s c o n p o c a luz.
E n p a rt ic u la r , la H A B P o a n t ic u e rp o e s tá n m a rc a d o s o c o n ju g a d o s c o n un ra d ic a l q u e p ro p o rc io n a u n a s e ñ a l o in d u c e u n a s e ñ a l q u e e s d e te c ta b le in vivo, c u a n d o s e to m a n im á g e n e s , ta le s c o m o , p e ro n o l im ita d a s a, im á g e n e s d e re s o n a n c ia m a g n é t ic a (M R I) , to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a p o r e m is ió n d e fo tó n ú n ic o (S P E C T ), to m o g ra fía p o r e m is ió n d e p o s it ro n e s (P E T ), e s c in t ig ra f ía , c á m a ra g a m m a , un d e te c to r p+ , un d e te c to r y , o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r f lu o re s c e n c ia y o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r b io lu m in is c e n c ia . L o s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s /s e g u im ie n to i lu s tra t iv o s in c lu y e n c u a lq u ie ra d e u n a v a r ie d a d d e m é to d o s d e re s o n a n c ia m a g n é tic a , ta le s c o m o la o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r re s o n a n c ia m a g n é t ic a (M R I) y la e s p e c tro s c o p ia d e re s o n a n c ia m a g n é t ic a (M R S ), y ta m b ié n in c lu y e n c u a lq u ie ra d e u n a v a r ie d a d d e m é to d o s to m o g rá f ic o s q u e in c lu y e n to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a (C T ), to m o g ra fía a x ia l c o m p u ta r iz a d a (C A T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a p o r h a z d e e le c tro n e s (E B C T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a d e a lta re s o lu c ió n (T C A R ), to m o g ra fía h ip o c ic lo id a l, to m o g ra fía p o r e m is ió n d e p o s it ro n e s (P E T ) , ra y o s g a m m a (d e s p u é s d e la a n iq u ila c ió n d e un p o s it ró n y un e le c tró n en la e x p lo ra c ió n p o r P E T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a p o r e m is ió n d e fo tó n ú n ic o (S P E C T ), to m o g ra fía c o m p u ta r iz a d a en e s p ira l y to m o g ra fía u lt ra s ó n ic a . O tro s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s ilu s tra t iv o s in c lu y e n o b te n c ió n d e im á g e n e s c o n p o c a luz, ra y o s X , s e ñ a l d e u lt ra s o n id o , a b s o rc ió n d e f lu o re s c e n c ia y b io lu m in is c e n c ia . A d e m á s , la s p ro te ín a s s e p u e d e n m a rc a r c o n c o m p u e s to s e m is o re s d e lu z u o tro s c o m p u e s to s e le c tro m a g n é t ic o s , ta le s c o m o lo s c o m p u e s to s o las m o lé c u la s f lu o re s c e n te s . L a d e te c c ió n s e p u e d e e fe c tu a r d e te c ta n d o la lu z e m it id a u o tra ra d ia c ió n e le c t ro m a g n é t ic a e m itid a .
L a s e t iq u e ta s d e te c ta b le s in c lu y e n re a c t iv o s c o n e le m e n to s d ire c ta m e n te d e te c ta b le s (p. e j., ra d io m a rc a s ) y re a c t iv o s c o n e le m e n to s d e te c ta b le s in d ire c ta m e n te (p . e j., un p ro d u c to d e re a c c ió n ) . L o s e je m p lo s d e m a rc a d o re s d e te c ta b le s in c lu y e n ra d io is ó to p o s , c o m p u e s to s b io lu m in is c e n te s , c o m p u e s to s q u im io lu m in is c e n te s , c o m p u e s to s f lu o re s c e n te s , q u e la to s m e tá lic o s y e n z im a s . S e p u e d e in c o rp o ra r u n a m a rc a d e te c ta b le a u n a H A B P p o r m é to d o s q u ím ic o s o re c o m b in a n te s .
L a s m a rc a s a p ro p ia d a s p a ra la o b te n c ió n d e im á g e n e s d e ra y o s X s o n c o n o c id a s en la té c n ic a e in c lu y e n , p o r e je m p lo , B is m u to (III) , O ro (III) , L a n ta n o ( III) o P lo m o (II) ; un io n ra d io a c tiv o , ta l c o m o 67C o b re , 67G a lio , 68G a lio , 1 11ndio, 113In d io , 23Y o d o , 125Y o d o , 131Y o d o , 197M e rc u r io , 203M e rc u r io , 116F e n io 188R e n io 97R u b id io , 103R u b id io , 99T e c n e c io o 90Itrio ; un is ó to p o d e re s o n a n c ia m a g n é t ic a n u c le a r d e e s p ín , ta l c o m o C o b a lto (II) , C o b re (II), C ro m o (III) , D is p ro s io (III) , E rb io (III) , G a d o lin io (III) , H o lm io (III) , H ie r ro (II), H ie r ro (III) , M a n g a n e s o (II) , N e o d im io (III) , N íq u e l (II) , S a m a r io (III) , T e rb io (III) , V a n a d io ( II) o I te rb io (III) ; o ro d a m in a o f lu o re s c e ín a .
L o s a g e n te s d e c o n tra s te s e u t il iz a n p a ra la o b te n c ió n d e im á g e n e s p o r re s o n a n c ia m a g n é tic a . L o s a g e n te s d e c o n tra s te i lu s tra t iv o s in c lu y e n h ie rro , o ro , g a d o lin io y g a lio . L a s m a rc a s a p ro p ia d a s p a ra la o b te n c ió n d e im á g e n e s d e re s o n a n c ia m a g n é t ic a s o n c o n o c id a s en la té c n ic a e in c lu y e n , p o r e je m p lo , f lú o r, q u e la to s d e g a d o lin io , m e ta le s y ó x id o s m e tá lic o s , ta le s c o m o , p o r e je m p lo , h ie rro , g a lio , o ro , g a d o lin io , m a g n e s io , c o m p u e s to s m a rc a d o s c o n 1H 19F, 13C, y 15 N . El u s o d e q u e la to s en a g e n te s d e c o n tra s te e s c o n o c id o en la té c n ic a . L a s m a rc a s a p ro p ia d a s p a ra los m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s to m o g rá f ic a s s o n c o n o c id o s en la té c n ic a e in c lu y e n , p o r e je m p lo , e m is o re s p ta le s c o m o 11C, 13N, 15O o 64C u o (b ) e m is o re s y ta le s c o m o 1231. O tro s ra d io n ú c lid o s i lu s tra t iv o s q u e s e p u e d e n u t iliz a r , p o r e je m p lo , c o m o m a rc a d o re s p a ra P E T in c lu y e n 55C o , 67G a , 68G a , 60C u (II) , 67C u (II) , 99T c , 57Ni, 52F e y 18F. E l a n t ic u e rp o o H A B P s e p u e d e n c o n ju g a r c o n u n a m a rc a a d e c u a d a y /o la p ro te ín a p u e d e in c lu ir u n a ra d io m a rc a en s u s m o lé c u la s c o n s t itu y e n te s .
U n a lis ta i lu s tra t iv a d e n ú c lid o s11 ú tile s * p a 1 ra 1 lo s m é t io , d o s d e o b n te n c ió n d e im i r á ^ g e n e s p ro p o rc io n a d o s 1 1 en la * pÍ Q re s e n te m e m o r ia in c lu y e , p o r e je m p lo , C a rb o n o F lú o r C a rb o n o , N itró g e n o , N itró g e n o , O x íg e n o , F lú o r , F I ú o r , 24S o d io , 32F o s fa to , 42P o ta s io , 51C ro m o , 55H ie rro , 59H ie rro , 57C o b a l t o , C o b a l t o , 64C o b re , 67G a lio , 68G a lio , 75S e le n io , 81K r ip to n , 82R u b id io , 89E s t r o n c io ,92E s tro n c io , 90Itrio , 99T e c n e c io , 103P a la d io , 106R u te n io , 111In d io , 117L u te c io 123Y o d o , 125Y o d o , 131Y o d o , 133X e n o n , l37C e s io , 153S a m a rio , 153G a d o lin io , 165D is p ro s io , 166H o lm io , 169Ite rb io , l77L e u tiu m , 196R e n io , 188R e n io , 192Ir id io , 198O ro , 201T a lio , 211A s ta to , 212B is m u to y 213B is m u to . U n e x p e r to en la té c n ic a p u e d e a lte ra r lo s p a rá m e tro s u t i l iz a d o s en d ife re n te s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s (M R I, p o r e je m p lo ) p a ra v is u a liz a r d ife re n te s n ú c lid o s /m e ta le s .
T a m b ié n s e p u e d e n u t i l iz a r m a rc a s f lu o re s c e n te s . E s ta s in c lu y e n p ro te ín a s f lu o re s c e n te s , s o n d a s f lu o re s c e n te s o s u s tra to s f lu o re s c e n te s . P o r e je m p lo , la s p ro te ín a s f lu o re s c e n te s p u e d e n in c lu ir , p e ro n o s e lim ita n a, p ro te ín a s f lu o re s c e n te s , ta le s c o m o la p ro te ín a v e rd e f lu o re s c e n te (G F P ) o s u s h o m ó lo g o s o R F P ; c o lo ra n te s f lu o re s c e n te s (p. e j., f lu o re s c e ín a y d e r iv a d o s ta le s c o m o is o t io c ia n a to d e f lu o re s c e ín a (F IT C ) y O re g o n G re e n ® , ro d a m in a y d e r iv a d o s (p . e j., ro jo T e x a s e is o t io c ia n a to d e te t ra m e t i l ro d a m in a (T R IT C )) , b io tin a , f ic o e r it r in a , A M C A , A le x a F lu o r® , L i- C O R ® , C y D y e s ® o D y L ig h t® F lu o rs ) ; td T o m a to , m C h e rry , m P lu m , N e p tu n e , T a g R F P , m K a te 2 , T u rb o R F P y T u rb o F P 635 (K a tu s h k a ) . El re a c tiv o f lu o re s c e n te s e p u e d e e le g ir en fu n c ió n d e lo s e s p e c tro s d e e x c ita c ió n y e m is ió n d e s e a d o s p o r e l u s u a rio . T a m b ié n s e p u e d e n u t i l iz a r s u s tra to s f lu o re s c e n te s q u e d a n c o m o re s u lta d o p ro d u c to s d e e s c is ió n f lu o re s c e n te s .
L o s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s in v ivo s e p u e d e n u t i l iz a r en e l d ia g n ó s t ic o d e tu m o re s o c á n c e re s a s o c ia d o s c o n H A . T a l té c n ic a p e rm ite e l d ia g n ó s t ic o s in e l u s o d e b io p s ia . L o s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s in v ivo b a s a d o s en e l g ra d o o e l n iv e l d e u n ió n d e u n a H A B P a un tu m o r ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r p a ra los p ro n ó s t ic o s d e p a c ie n te s co n c á n c e r. L o s m é to d o s d e o b te n c ió n d e im á g e n e s in v ivo ta m b ié n s e p u e d e n u t il iz a r p a ra d e te c ta r c á n c e re s m e ta s tá s ic o s en o tra s p a rte s d e l c u e rp o o c é lu la s tu m o ra le s c irc u la n te s (C T C ). E s tá d e n tro de l n iv e l d e un e x p e r to en la té c n ic a d e te rm in a r lo s n iv e le s d e fo n d o d e h ia lu ro n a n o en te j id o s d is t in to s d e lo s tu m o re s . L o s tu m o re s q u e e x p re s a n h ia lu ro n a n o te n d rá n n iv e le s m á s a lto s d e s e ñ a l q u e lo s te j id o s d e fo n d o . E n a lg u n o s e je m p lo s , lo s c r ite r io s u m b ra l s e p u e d e n d e te rm in a r m e d ia n te c o m p a ra c io n e s c o n la s e ñ a l d e te c ta d a en s u je to s n o rm a le s o s a n o s .
b. Recuento de linfocitos pre-tratamiento
L a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia in ic ia u n a re s p u e s ta in m u n ita r ia , a l m e n o s en p a rte , m e d ia n te e l b lo q u e o d e la s p ro te ín a s d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p a ra t r a ta r lo s c á n c e re s , en p a rt ic u la r , los c á n c e re s c a ra c te r iz a d o s p o r te n e r un c o n te n id o d e H A d e m o d e ra d o a a lto . D e b id o a q u e la a c t iv a c ió n d e la re s p u e s ta in m u n ita r ia s e b a s a en lo s l in fo c ito s , s e p u e d e u t i l iz a r e l re c u e n to a b s o lu to d e l in fo c ito s (A L C ) e n tre lo s c r ite r io s d e s e le c c ió n p a ra q u e lo s s u je to s re c ib a n la te ra p ia c o m b in a d a q u e s e p ro p o rc io n a en la p re s e n te m e m o r ia . E l A L C y lo s m é to d o s p a ra d e te rm in a r e l A L C s e d e s c r ib e n en o tra p a r te en la p re s e n te m e m o r ia (p a ra el s e g u im ie n to d e la re s p u e s ta a la s te ra p ia s c o m b in a d a s q u e s e p ro p o rc io n a n en la p re s e n te m e m o r ia ) . U n A L C n o rm a l, en un in d iv id u o n o e n fe rm o , v a r ía d e 800 /m L a 3.500 /m L . L o s s u je to s s e le c c io n a d o s p a ra e l t ra ta m ie n to u t i l iz a n d o la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a n o rm a lm e n te m u e s tra n un A L C d e n tro o a p ro x im a d a m e n te d e n tro de l in te rv a lo n o rm a l a n te s d e la s e le c c ió n . P o r e je m p lo , un s u je to s e le c c io n a d o p a ra la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia t íp ic a m e n te t ie n e un A L C d e a l m e n o s 800 /m L , ta l c o m o 800 /m L , 900 /m L , 1.000 /m L , 1.250 /m L , 1.500 /m L , 2.000 /m L , 2.500 /m L , 3.000 /m L o 3.500 /m L . En e je m p lo s p a rt ic u la re s , lo s s u je to s s e le c c io n a d o s p a ra la te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia t ie n e n un A L C d e a l m e n o s 1.000 /m L .
2. Dosificación y administración
L a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia , q u e c o n t ie n e un a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o c o n ju g a d o c o n p o lím e ro , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , y un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. e j., un a n t ic u e rp o a n t i-C T L A 4 o a n ti-P D -1 ) , s e a d m in is t ra en u n a c a n t id a d s u f ic ie n te p a ra e je rc e r un e fe c to te ra p é u t ic a m e n te ú til. T íp ic a m e n te , lo s a g e n te s a c t iv o s s e a d m in is tra n en u n a c a n t id a d q u e n o d a lu g a r a e fe c to s s e c u n d a r io s in d e s e a b le s d e l p a c ie n te q u e s e e s tá t ra ta n d o , o q u e m in im iz a o re d u c e lo s e fe c to s s e c u n d a r io s o b s e rv a d o s en c o m p a ra c ió n c o n la s d o s if ic a c io n e s y las c a n t id a d e s re q u e r id a s p a ra e l t ra ta m ie n to ú n ic o c o n u n o d e lo s a g e n te s a n te r io re s . P o r e je m p lo , c o m o s e d e s c r ib e en o tra p a r te en la p re s e n te m e m o r ia , s e e n c u e n tra en la p re s e n te m e m o r ia q u e la te ra p ia c o m b in a d a c o n un e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro y un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io p ro d u c e c o m o re s u lta d o u n a d is m in u c ió n d e la p ro g re s ió n tu m o ra l en c o m p a ra c ió n c o n la a d m in is tra c ió n d e v e h íc u lo o c u a lq u ie ra d e lo s a g e n te s so lo . P o r lo ta n to , e s p o s ib le , re d u c ir la c a n t id a d d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n t i-p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , q u e s e p u e d e a d m in is t ra r en la te ra p ia c o m b in a d a q u e s e p ro p o rc io n a en la p re s e n te m e m o r ia , en c o m p a ra c ió n c o n la s c a n t id a d e s d e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io (p. e j., e l a n t ic u e rp o a n tip ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io ) a d m in is tra d a s u t iliz a n d o m é to d o s d e la té c n ic a a n te r io r , m ie n tra s q u e lo g ra s u s ta n c ia lm e n te la m is m a o m e jo r e f ic a c ia te ra p é u t ic a . E n v ir tu d d e la d is m in u c ió n d e la d o s if ic a c ió n q u e se p u e d e a d m in is tra r , lo s e fe c to s s e c u n d a r io s a s o c ia d o s co n la a d m in is tra c ió n d e a n t ic u e rp o s a n t i- p ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta le s c o m o lo s e v e n to s a d v e rs o s re la c io n a d o s co n e l s is te m a in m u n o ló g ic o , d e s c r ito s en o tra p a r te en la p re s e n te m e m o r ia , s e re d u c e n , m in im iz a n o e v ita n .
E s tá d e n tro d e l n iv e l d e un e x p e r to en la té c n ic a d e te rm in a r la s c a n t id a d e s p re c is a s d e a g e n te s a c t iv o s , in c lu y e n d o el a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p. e j., la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro y e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io q u e s e v a n a a d m in is t ra r a un s u je to . P o r e je m p lo , ta le s a g e n te s y u s o s p a ra el t ra ta m ie n to d e c á n c e re s y tu m o re s s ó lid o s , s o n b ie n c o n o c id o s en la té c n ic a . P o r lo ta n to , la s d o s if ic a c io n e s d e ta le s a g e n te s en u n a c o m p o s ic ió n o te ra p ia c o m b in a d a s e p u e d e n e le g ir en fu n c ió n d e lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n c o n v e n c io n a le s p a ra e s e a g e n te en u n a v ía d e a d m in is tra c ió n d e te rm in a d a .
S e e n t ie n d e q u e la d o s if ic a c ió n p re c is a y la d u ra c ió n d e l t ra ta m ie n to s o n u n a fu n c ió n d e l te j id o o tu m o r q u e s e e s tá t r a ta n d o y s e p u e d e n d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te u t il iz a n d o p ro to c o lo s d e p ru e b a c o n o c id o s o p o r e x t ra p o la c ió n a p a r t ir d e d a to s d e p ru e b a in v ivo o in v itro y /o s e p u e d e n d e te rm in a r a p a r t ir d e re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n c o n o c id o s d e l a g e n te en p a rt ic u la r . C a b e s e ñ a la r q u e la s c o n c e n tra c io n e s y lo s v a lo re s d e d o s if ic a c ió n ta m b ié n p u e d e n v a r ia r c o n la e d a d d e l in d iv id u o tra ta d o , e l p e s o d e l in d iv id u o , la v ía d e a d m in is t ra c ió n y /o e l g ra d o o g ra v e d a d d e la e n fe rm e d a d y o tro s fa c to re s q u e e s tá n d e n tro d e l n iv e l d e c o n s id e ra c ió n d e un fa c u lta t iv o m é d ic o . E n g e n e ra l, lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n s e e lig e n p a ra lim ita r la to x ic id a d . S e d e b e te n e r en c u e n ta q u e e l m é d ic o a c a rg o s a b rá c ó m o y c u á n d o f in a liz a r , in te r ru m p ir o a ju s ta r la te ra p ia a u n a d o s if ic a c ió n m á s b a ja d e b id o a to x ic id a d , d is fu n c ió n d e la m é d u la ó s e a , h íg a d o o r iñ ó n u o tro te jid o . P o r e l c o n tra r io , e l m é d ic o a c a rg o ta m b ié n s a b rá c ó m o y c u á n d o a ju s ta r e l t ra ta m ie n to a n iv e le s m á s a lto s si la re s p u e s ta c lín ic a n o e s a d e c u a d a (e x c lu y e n d o lo s e fe c to s s e c u n d a r io s tó x ic o s ) . S e d e b e e n te n d e r a d e m á s q u e p a ra c u a lq u ie r s u je to en p a rt ic u la r , lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n e s p e c íf ic o s d e b e n a ju s ta rs e a lo la rg o d e l t ie m p o d e a c u e rd o c o n la n e c e s id a d in d iv id u a l y e l c r ite r io p ro fe s io n a l d e la p e rs o n a q u e a d m in is t ra o s u p e rv is a la a d m in is tra c ió n d e la s fo rm u la c io n e s , y q u e lo s in te rv a lo s d e c o n c e n tra c ió n e x p u e s ta s en la p re s e n te m e m o r ia s o n s o la m e n te ilu s tra t iv o s y n o e s tá n d e s t in a d o s a lim ita r e l a lc a n c e d e lo s m is m o s .
P o r e je m p lo , la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a , p o r e je m p lo , u n a P H 20 (p . e j., P E G P H 20 ), s e a d m in is t ra en u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z p a ra d e g ra d a r o e s c in d ir e l h ia lu ro n a n o a s o c ia d o a tu m o re s . L a c a n t id a d d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a s o lu b le , q u e s e a d m in is t ra rá p a ra e l t ra ta m ie n to d e u n a e n fe rm e d a d o a fe c c ió n , p o r e je m p lo un c á n c e r o un tu m o r s ó lid o ta l c o m o un tu m o r r ic o en H A , s e p u e d e d e te rm in a r m e d ia n te té c n ic a s c lín ic a s c o n v e n c io n a le s . A d ic io n a lm e n te , s e p u e d e n e m p le a r e n s a y o s in v itro y m o d e lo s a n im a le s p a ra a y u d a r a id e n t if ic a r in te rv a lo s d e d o s if ic a c ió n ó p tim o s . L a d o s is p re c is a , q u e s e p u e d e d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te , p u e d e d e p e n d e r d e la e n z im a p a rt ic u la r , la v ía d e a d m in is tra c ió n , e l t ip o d e e n fe rm e d a d a t r a ta r y la g ra v e d a d d e la e n fe rm e d a d . E l in te rv a lo d e d o s if ic a c ió n i lu s tra t iv o e s d e a p ro x im a d a m e n te 50 U n id a d e s a 50.000.000 U n id a d e s d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n un p o lím e ro , o u n a c a n t id a d fu n c io n a lm e n te e q u iv a le n te d e o tra e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e l h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n un p o lím e ro . S e e n t ie n d e en la p re s e n te m e m o r ia q u e u n a u n id a d d e a c t iv id a d s e n o rm a liz a a u n a a c t iv id a d c o n v e n c io n a l, p o r e je m p lo , u n a a c t iv id a d m e d id a en un e n s a y o d e m ic ro tu rb id e z q u e a n a liz a la a c t iv id a d d e la h ia lu ro n id a s a .
A s í, p o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a , p o r e je m p lo , u n a P H 20 , c o n ju g a d a c o n un p o lím e ro , p o r e je m p lo , un P E G , s e p u e d e a d m in is t r a r a o a p ro x im a d a m e n te a 10 a 50.000.000 u n id a d e s , d e 10 a 40.000.000 u n id a d e s , d e 10 a 36.000.000 u n id a d e s , d e 10 a 12.000.000 u n id a d e s , d e 10 a 1.200.000 u n id a d e s , d e 10 a 1.000.000 u n id a d e s , d e 10 a 500.000 u n id a d e s , d e 100 a 100.000 u n id a d e s , d e 500 a 50.000 u n id a d e s , d e 1.000 a 10.000 u n id a d e s , d e 5.00 a 7.500 u n id a d e s , d e 5.000 u n id a d e s a 50.000 u n id a d e s , o d e 1.000 a 10.000 U n id a d e s . E n g e n e ra l, s e a d m in is t ra u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a co n p o lím e ro a un s u je to en u n a c a n t id a d q u e e s tá e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,01 p g /k g y 25 m g /k g , ta l c o m o d e 0 ,0005 m g /k g (0 ,5 p g /k g ) a 25 m g /k g , d e 0 ,5 p g /k g a 10 m g /k g , d e 0 ,02 m g /k g a 1 ,5 m g /k g , d e 0 ,01 p g /k g a 15 p g /k g , d e 0 ,05 p g /k g a 10 p g /k g , d e 0 ,75 p g /k g a 7 ,5 p g /k g o d e 1 ,0 p g /k g a 3 ,0 p g /k g . P o r e je m p lo , la c a n t id a d d e l in te rv a lo d e d o s if ic a c ió n p u e d e e s ta r e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,01 p g /k g y 100 p g /k g (d e l s u je to ) , d e 0 ,01 p g /k g a 50 p g /k g , d e 0 ,01 p g /k g a 15 p g /k g , d e 0 ,05 p g /k g a 10 p g /k g , d e 0 ,75 p g /k g a 7 ,5 p g /k g , d e 1 ,0 p g /k g a 5 ,0 o d e 1 ,0 p g /k g a 3 ,0 p g /k g d e l s u je to . L a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro s e p u e d e a d m in is tra r , p o r e je m p lo , a u n a d o s is d e a l m e n o s o a p ro x im a d a m e n te a l m e n o s 0 ,00001 m g /k g (0 ,01 p g /k g ) de l s u je to , ta l c o m o 0 ,0005 m g /k g , 0 ,0006 m g /k g , 0.0007 m g /k g , 0 ,0008 m g /k g , 0 ,0009 m g /k g , 0 ,001 m g /k g , 0 ,0016 m g /k g , 0 ,002 m g /k g , 0 ,003 m g /k g , 0 ,004 m g /k g , 0 ,005 m g /k g , 0 ,006 m g /k g 0 ,007 m g /k g , 0 ,008 m g /k g , 0 ,009 m g /k g , 0 ,01 m g /k g , 0 ,016 m g /k g , 0 ,02 m g /k g , 0 ,03 m g /k g , 0 ,04 m g /k g , 0 ,05 m g /k g , 0 ,06 m g /k g , 0 ,07 m g /k g , 0 ,08 m g /k g , 0 ,09 m g /k g , 0,1 m g /k g , 0 ,15 m g /k g , 0 ,2 m g /k g , 0 ,25 m g /k g , 0 ,30 m g /k g , 0 ,35 m g /k g , 0 ,40 m g /k g , 0 ,45 m g /k g , 0 ,5 m g /k g , 0 ,55 m g /k g , 0 ,6 m g /k g , 0 ,7 m g /k g , 0 ,8 m g /k g , 0 ,9 m g /k g , 1 ,0 m g /k g , 1,1 m g /k g , 1 ,2 m g /k g , 1 ,3 m g /k g , 1 ,4 m g /k g , 1 ,5 m g /k g , 1 ,6 m g /k g , 1 ,7 m g /k g , 1 ,8 m g /k g , 1 ,9 m g /k g , 2 m g /k g , 2 ,5 m g /k g , 3 m g /k g , 3 ,5 m g /k g , 4 m g /k g , 4 ,5 m g /k g , 5 m g /k g , 5 ,5 m g /k g , 6 m g /k g , 6 ,5 m g /k g , 7 m g /k g , 7 ,5 m g /k g , 8 m g /k g , 8 ,5 m g /k g , 9 m g /k g , 9 ,5 m g /k g , 10 m g /k g , 11 m g /k g , 12 m g /k g , 13 m g /k g , 14 m g /k g , 15 m g /k g , 16 m g /k g , 17 m g /k g , 18 m g /k g , 19 m g /k g , 20 m g /k g , 21 m g /k g , 22 m g /k g , 23 m g /k g , 24 m g /k g , 25 m g /k g o m á s , p a ra un s u je to h u m a n o a d u lto p ro m e d io , q u e t íp ic a m e n te p e s a a p ro x im a d a m e n te d e 70 kg a 75 kg.
U n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a (p. e j., P E G P H 20 ), p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia s e a d m in is t ra a m á s d e 0 ,5 U n id a d e s /k g , ta l c o m o e n tre o a p ro x im a d a m e n te e n tre 1 U n id a d /k g y 800.000 U n id a d e s /k g , ta l c o m o d e 10 a 800.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 750.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 700.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 650.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 600.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 550.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 500.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 450.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 400.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 350.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 320.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 300.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 280.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 260.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 240.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 220.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 200.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 180.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 160.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 140.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 120.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 100.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 80.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 70.000 U n id a d e s /k g , d e 10 a 60.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 50.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 40.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 30.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 20.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 15.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 12.800 u n id a d e s /k g , d e 10 a 10.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 9.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 8.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 7.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 6.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 5.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 4.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 3.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 2.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 1.000 u n id a d e s /k g , d e 10 a 900 u n id a d e s /k g , d e 10 a 800 u n id a d e s /k g , d e 10 a 700 U n id a d e s /k g , d e 10 a 500 U n id a d e s /k g , d e 10 a 400 U n id a d e s /k g , d e 10 a 300 U n id a d e s /k g , d e 10 a 200 U n id a d e s /k g , d e 10 a 100 U n id a d e s /k g , d e 16 a 600.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 500.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 400.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 350.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 320.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 160.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 80.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 40.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 20.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 16.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 12.800 U n id a d e s /k g , d e 16 a 10.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 5.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 4.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 3.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 2.000 U n id a d e s /k g , d e 16 a 1.000 u n id a d e s /k g , d e 16 a 900 u n id a d e s /k g , d e 16 a 800 u n id a d e s /k g , d e 16 a 700 u n id a d e s /k g , d e 16 a 500 u n id a d e s /k g , d e 16 a 400 u n id a d e s /k g , d e 16 a 300 u n id a d e s /k g , d e 16 a 200 U n id a d e s /k g , d e 16 a 100 U n id a d e s /k g , d e 160 a 12.800 U n id a d e s /k g , d e 160 a 8.000 U n id a d e s /k g , d e 160 a 6.000 U n id a d e s /k g , d e 160 a 4.000 U n id a d e s /k g , d e 160 a 2.000 U n id a d e s /k g , d e 160 a 1.000 u n id a d e s /k g , d e 160 a 500 u n id a d e s /k g , d e 500 a 5.000 u n id a d e s /k g , d e 100 0 a 100.000 U n id a d e s /k g o d e 1.000 a 10.000 U n id a d e s /k g , d e la m a s a d e l s u je to a l q u e s e a d m in is tra . E n a lg u n o s e je m p lo s , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a (p . e j., P E G P H 20 ) s e p u e d e a d m in is t r a r a, o a p ro x im a d a m e n te e n tre 0 ,5 U n id a d e s /k g y 4.000 U n id a d e s /k g , d e 1 U n id a d /k g a 1.000 U n id a d e s /k g , d e 1 U n id a d /k g a 500 U n id a d e s /k g , d e 5 u n id a d e s /k g a 500 u n id a d e s /k g , d e 10 u n id a d e s /k g a 500 u n id a d e s /k g , d e 20 u n id a d e s /k g a 400 u n id a d e s /k g o d e 10 u n id a d e s /k g a 50 u n id a d e s /k g .
G e n e ra lm e n te , c u a n d o la a c t iv id a d e s p e c íf ic a d e la h ia lu ro n id a s a P E G ila d a e s o e s d e a p ro x im a d a m e n te 10.000 U /m g a 80.000 U /m g , ta l c o m o d e 20.000 U /m g a 60.000 U /m g o d e 18.000 U /m g a 45.000 U /m g , g e n e ra lm e n te se a d m in is tra n a l m e n o s o a l m e n o s a p ro x im a d a m e n te 1 U n id a d e s /k g (U /k g ) , 2 U /kg , 3 U /kg , 4 U /kg , 5 U /kg , 6 U /kg , 7 U /k g , 8 U /kg , 8 U /k g 10 U /kg , 16 U /kg , 32 U /kg , 64 U /kg , 100 U /kg , 200 U /kg , 300 U /kg , 400 U /kg , 500 U /kg , 600 U /k g , 700 U /kg , 800 U /kg , 900 U /kg , 1.000 U /kg , 2.000 U /kg , 3.000 U /kg , 4.000 U /kg , 5.000 U /kg , 6.000 U /kg , 7.000 U /k g , 8.000 U /kg , 9.000 U /kg , 10.000 U /kg , 12.800 U /kg , 20.000 U /kg , 32.000 U /kg , 40.000 U /kg , 50.000 U /kg , 60.000 U /kg , 70.000 U /kg , 80.000 U /kg , 90.000 U /kg , 100.000 U /kg , 120.000 U /kg , 140.000 U /kg , 160.000 U /kg , 180.000 U /kg , 200.000 U /kg , 220.000 U /kg , 240.000 U /kg , 260.000 U /kg , 280.000 U /kg , 300.000 U /kg , 320.000 U /kg , 350.000 U /kg , 400.000 U /kg , 450.000 U /kg , 500.000 U /kg , 550.000 U /kg , 600.000 U /kg , 650.000 U /kg , 700.000 U /kg , 750.000 U /kg , 800.000 U /k g o m á s , p o r m a s a d e l s u je to . P o r e je m p lo , s e a d m in is tra n a l m e n o s 1.000 U n id a d e s (U ); 2.000 U; 3.000 U; 4.000 U; 5.000 U; 6.000 U; 7.000 U; 8.000 U; 9.000 U; 10.000 U; 20.000 U; 30.000 U; 40.000 U; 50.000 U; 60.000 U; 70.000 U; 80.000 U; 90.000 U; 100.000 U; 200.000 U; 300.000 U; 400.000 U; 500.000 U; 600.000 U; 700.000 U; 800.000 U; 900.000 U; 1.000.000 U; 1.500.000 U; 2.000.000 U; 2.500.000 U; 3.000.000 U; 3.500.000 U; 4.000.000 U o m ás .
E n lo s e je m p lo s d e la p re s e n te m e m o r ia , e l in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , ta l c o m o un a n t ic u e rp o a n tip ro te ín a d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io , s e p ro p o rc io n a en u n a c a n t id a d te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z p a ra e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n p a rt ic u la r . L a s c o n c e n tra c io n e s te ra p é u t ic a m e n te e f ic a c e s s e p u e d e n d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te s o m e tie n d o a p ru e b a lo s c o m p u e s to s en s is te m a s in v itro e in v ivo c o n o c id o s , ta le s c o m o lo s e n s a y o s p ro p o rc io n a d o s en la p re s e n te m e m o r ia . L a c o n c e n tra c ió n d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e le c c io n a d o en la c o m p o s ic ió n d e p e n d e d e la s ta s a s d e a b s o rc ió n , in a c t iv a c ió n y e x c re c ió n d e l c o m p le jo , d e las c a ra c te r ís t ic a s f is ic o q u ím ic a s d e l c o m p le jo , d e l p ro g ra m a d e d o s if ic a c ió n y d e la c a n t id a d a d m in is tra d a , a s í c o m o d e o tro s fa c to re s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a .
P o r e je m p lo , s e e n t ie n d e q u e la d o s if ic a c ió n p re c is a y la d u ra c ió n d e l t ra ta m ie n to s o n u n a fu n c ió n d e l t ip o d e c á n c e r q u e s e e s tá t r a ta n d o y s e p u e d e d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te u t il iz a n d o p ro to c o lo s d e p ru e b a c o n o c id o s o p o r e x tra p o la c ió n d e d a to s d e p ru e b a s in v ivo o in v itro . C a b e s e ñ a la r q u e la s c o n c e n tra c io n e s y lo s v a lo re s d e d o s if ic a c ió n ta m b ié n p u e d e n v a r ia r c o n la e d a d d e l in d iv id u o tra ta d o . S e d e b e e n te n d e r a d e m á s q u e p a ra c u a lq u ie r s u je to en p a rt ic u la r , lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n e s p e c íf ic o s s e d e b e n a ju s ta r a lo la rg o d e l t ie m p o d e a c u e rd o co n la n e c e s id a d in d iv id u a l y e l c r ite r io p ro fe s io n a l d e la p e rs o n a q u e a d m in is tra o s u p e rv is a la a d m in is tra c ió n d e la s fo rm u la c io n e s , y q u e lo s in te rv a lo s d e c o n c e n tra c ió n e x p u e s to s en la p re s e n te m e m o r ia s o n s o la m e n te ilu s tra t iv o s y n o e s tá n d e s t in a d o s a lim ita r e l a lc a n c e d e lo s m is m o s .
L a c a n t id a d d e un in h ib id o r d e p u n to s d e c o n tro l in m u n ita r io s e le c c io n a d o q u e s e a d m in is t ra rá p a ra e l t ra ta m ie n to d e lo s c á n c e re s s e p u e d e d e te rm in a r m e d ia n te té c n ic a s c lín ic a s c o n v e n c io n a le s u o tro s m é to d o s c o m o s e d e s c r ib e en la p re s e n te m e m o r ia . A d ic io n a lm e n te , s e p u e d e n e m p le a r e n s a y o s in v itro y m o d e lo s a n im a le s p a ra a y u d a r a identificar los intervalos de dosificación óptimos. Por lo tanto, la dosificación precisa, que se puede determinar empíricamente, puede depender de la preparación de inmunoglobulina particular, del régimen y el programa de dosificación con la hialuronidasa soluble, la vía de administración, el tipo de cáncer que se vaya a tratar y la progresión de la enfermedad. Los regímenes de dosificación ilustrativos (dosis y frecuencias) de las formulaciones de inhibidores de puntos de control inmunitario para el tratamiento de cánceres se proporcionan a continuación. Otros regímenes de dosificación son bien conocidos por los expertos en la técnica. Si es necesario, la dosificación particular, la duración y el protocolo de tratamiento se pueden determinar empíricamente o se pueden extrapolar.
En algunos ejemplos, la dosis de un inhibidor de puntos de control inmunitario es una función de las poblaciones de células inmunitarias. Por ejemplo, la dosis del inhibidor de puntos de control inmunitario se puede modular para minimizar el aumento en el número de células Treg en respuesta al agente administrado. Por ejemplo, se puede determinar que la dosis máxima es la dosis máxima que no produce un aumento en el número de células Treg. En otro ejemplo, la dosis de un inhibidor de puntos de control inmunitario se puede modular para maximizar el aumento en el número de células efectoras en el sujeto que porta un tumor. En un ejemplo adicional, se selecciona la dosis de un inhibidor de puntos de control inmunitario que minimice o prevenga y aumente el número de células Treg, pero maximice el aumento en el número de células efectoras. Los métodos para determinar tales dosis son conocidos en la técnica y se describen en la presente memoria. Por ejemplo, el número de células Treg y/o las células efectoras se puede medir mediante citometría de flujo (descrita en la presente memoria anteriormente) en uno o más puntos temporales diferentes después de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo el número de células Treg y/o células efectoras se puede determinar el mismo día de la administración y/o 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas o más después de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o 1 semana después de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario. La siguiente dosis se puede modular para lograr los efectos deseados con respecto a los niveles de células Treg y/o células efectoras detectados.
En algunos ejemplos, se pueden utilizar dosis ilustrativas de un inhibidor de puntos de control inmunitario administrado por vía intravenosa, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario, como punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Los niveles de dosificación se pueden determinar en función de una variedad de factores, tales como el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la tasa de excreción, la combinación de fármacos, la gravedad y el curso de la enfermedad, y la posición del paciente con respecto a la enfermedad y el juicio del médico a cargo. Las dosificaciones ilustrativas no limitantes de los inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionados son de aproximadamente 0,1 mg por kg de peso corporal (mg/kg de PC) a aproximadamente 50 mg/kg de PC, tal como de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg de PC, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de PC, de aproximadamente 0,3 a aproximadamente 10 mg/kg de PC, de aproximadamente 0,5 mg/kg a 5 mg/kg o de 0,5 mg/kg a 1 mg/kg. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar a animales portadores de tumores en dosis de, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg.kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg o más. En particular, el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra a una dosis de al menos 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3, mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, o 15 mg/kg. En algunos ejemplos, las dosificaciones ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, aproximadamente o de 0,01 mg/m2 a aproximadamente 500 mg/m2, tal como por ejemplo, aproximadamente o 0,01 mg/m2, aproximadamente o 0,1 mg/m2, aproximadamente o 0,5 mg/m2, aproximadamente o 1 mg/m2, aproximadamente o 5 mg/m2, aproximadamente o 10 mg/m2, aproximadamente o 15 mg/m2, aproximadamente o 20 mg/m2, aproximadamente o 25 mg/m2, aproximadamente o 30 mg/m2, aproximadamente o 35 mg/m2, aproximadamente o 40 mg/m2, aproximadamente o 45 mg/m2, aproximadamente o 50 mg/m2, aproximadamente o 100 mg/m2, aproximadamente o 150 mg/m2, aproximadamente o 200 mg/m2, aproximadamente o 250 mg/m2, aproximadamente o 300 mg/m2, aproximadamente o 400 mg/m2, aproximadamente o 500 mg/m2. Se entiende que un experto en la técnica puede reconocer y convertir las dosificaciones entre unidades de mg/kg y mg/m2 (véase, p. ej., Michael J. Derelanko, TOXICOOGIST'S POCKET HANDBOOK, CRC Press, pág.16 (2000)).
Se entiende que la cantidad que se vaya a administrar será una función del tipo de cáncer que se esté tratando, de la vía de administración y de la tolerabilidad de los posibles efectos secundarios. Si es necesario, la dosificación se puede determinar empíricamente. Para lograr tales dosificaciones, los volúmenes de formulaciones que contienen inhibidores de puntos de control inmunitario administrados por vía subcutánea pueden ser de aproximadamente 1 mL a 700 mL, por ejemplo, de 10 mL a 500 mL, tal como de 100 mL a 400 mL. Por ejemplo, los volúmenes de formulaciones que contienen inhibidores de puntos de control inmunitario administradas por vía subcutánea pueden ser al menos o aproximadamente al menos 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL , 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL o más para la administración de una sola dosificación.
En otros ejemplos, la dosis del inhibidor de puntos de control inmunitario es una dosis baja, tal como menor o igual a 1 mg por administración, por ejemplo, menor o igual a 500 |jg, 400 |jg, 300 |jg, 200 |jg, 100 |jg, 50 |jg, 30 |jg, 20 |jg, 10 |jg, 5 |jg o 1 jig por administración. Se apreciará que tales dosis bajas se pueden administrar en un volumen adecuado repetidamente al paciente a lo largo del tiempo, por ejemplo, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, dos veces a la semana, una vez a la semana, dos veces al mes, mensualmente, etc.
La enzima de degradación de hialuronano y las formulaciones de inhibidores de puntos de control inmunitario proporcionadas en la presente memoria se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, intratumoral, intradérmica, oral o por otras vías de administración. La ruta particular puede diferir entre los agentes administrados o puede ser la misma. Por ejemplo, uno o más, o todos los agentes, se pueden administrar por vía intravenosa. En algunos ejemplos, se contempla en la presente memoria que una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se administre por vía intravenosa y el inhibidor de puntos de control inmunitario se administre por vía intravenosa.
Para la administración intravenosa, uno o más, o todos, los agentes se pueden administrar por inyección intravenosa lenta o en embolada, por infusión, o por una combinación de los mismos. El tiempo de infusión puede ser de aproximadamente 1 minuto a tres horas, tal como de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente dos horas o de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 60 minutos, y generalmente al menos 10 minutos, 40 minutos o 60 minutos. Los agentes se pueden administrar por infusión concurrente o por infusión subsiguiente. Por ejemplo, los agentes administrados se administran por separado y se proporcionan en bolsas separadas para infusiones separadas. En ejemplos particulares, la composición de enzima de degradación de hialuronano y la composición inhibidora de puntos de control inmunitario se formulan y administran por separado.
3. Régimen de dosificación: frecuencia y ciclo de administración
El agente anti-hialuronano, tal como la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, se puede administrar antes, simultáneamente con o casi simultáneamente con, secuencialmente o de manera intermitente con el inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano, p. ej., PEGPH20, y el inhibidor de puntos de control inmunitario, p. ej., un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario (p. ej., un anticuerpo anti-CTLA4 o anti-PD-1) se pueden administrar conjuntamente o por separado. En general, el agente anti-hialuronano, tal como una enzima de degradación de hialuronano, se administra antes del inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero se administra hasta 48 horas antes de administrar el inhibidor de puntos de control inmunitario. Por ejemplo, el agente anti-hialuronano, o enzima de degradación de hialuronano, se administra al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 6 horas.
8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, 22 horas, 24 horas, 30 horas, 36 horas, 40 horas, hasta 48 horas antes de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario.
La frecuencia y el momento de la administración, y las cantidades de dosificación, se pueden administrar periódicamente durante un ciclo de administración para mantener un efecto continuo y/o a largo plazo de los agentes activos durante un tiempo deseado y no es necesario que sean iguales para la enzima de degradación de hialuronano y el inhibidor de puntos de control inmunitario. Las combinaciones o composiciones proporcionadas se pueden administrar cada hora, diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente o una vez. La duración del ciclo de administración se puede determinar empíricamente y depende de la enfermedad a tratar, de la gravedad de la enfermedad, del paciente en particular y de otras consideraciones dentro del nivel de conocimiento práctico del médico a cargo. La duración del tratamiento con una terapia combinada en la presente memoria proporcionada puede ser una semana, dos semanas, un mes, varios meses, un año, varios años o más.
Por ejemplo, la frecuencia de administración de la enzima de degradación de hialuronano es una vez al día, una vez cada dos días, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas o una vez cada 4 semanas. Las dosificaciones se pueden dividir en una pluralidad de ciclos de administración durante el curso del tratamiento. Por ejemplo, una enzima hialuronidasa se puede administrar con una frecuencia de aproximadamente un mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, un año o más. La frecuencia de administración puede ser la misma durante todo el período del ciclo o puede diferir. Por ejemplo, una frecuencia de dosificación ilustrativa es dos veces por semana al menos durante una primera semana de un ciclo de administración. Después de la primera semana, la frecuencia puede continuar dos veces por semana, puede aumentar a más de dos veces por semana o se puede reducir a no más de una vez por semana. Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar la frecuencia de dosificación particular y el ciclo de administración en función de la dosificación particular que se vaya a administrar, la enfermedad o afección que se esté tratando, la gravedad de la enfermedad o afección, la edad del sujeto y otros factores similares.
El inhibidor de puntos de control inmunitario se puede administrar a la misma frecuencia o a una frecuencia diferente, pero cada administración del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una administración de enzima de degradación de hialuronano en no más de 48 horas. Por ejemplo, en algunos ejemplos, cada dosis de enzima de degradación de hialuronano está seguida de 24 a 48 h más tarde por una dosis de inhibidor de puntos de control inmunitario. En ejemplos particulares, el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra con menos frecuencia que la enzima de degradación de hialuronano, pero cada dosis del inhibidor de puntos de control inmunitario está precedida por una dosis de la enzima de degradación del hialuronano. Por ejemplo, el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra dos veces a la semana, una vez a la semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada 6 semanas, una vez cada 2 meses, una vez cada 3 meses, una vez cada 4 meses. una vez cada 5 meses, o una vez cada 6 meses, y de una manera que está precedida por la administración de una enzima de degradación de hialuronano. En tales ejemplos, la dosis de la enzima de degradación de hialuronano que precede al inhibidor de puntos de control inmunitario está sincronizada con el programa de dosificación de la enzima de degradación de hialuronano. En general, el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra no más de una vez al mes, tal como una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.
Si los síntomas de la enfermedad persisten en ausencia de un tratamiento interrumpido, el tratamiento se puede continuar durante un período de tiempo adicional. A lo largo del tratamiento, se puede realizar un seguimiento de la evidencia de enfermedad y/o la toxicidad o los efectos secundarios relacionados con el tratamiento.
El ciclo de administración, de la enzima de degradación del hialuronano y/o del inhibidor de puntos de control inmunitario, se puede adaptar para añadir períodos de tratamiento interrumpido con el fin de proporcionar un período de descanso de la exposición a los agentes. El período de tiempo para la interrupción del tratamiento puede ser durante un tiempo predeterminado o se puede determinar empíricamente según la respuesta del paciente o según los efectos secundarios observados. Por ejemplo, el tratamiento se puede suspender durante una semana, dos semanas, un mes o varios meses. En general, el período interrupción del tratamiento se basa en un ciclo de régimen de dosificación para un paciente.
Por ejemplo, un régimen de dosificación ilustrativo es un ciclo de tratamiento o ciclo de administración de 28 días. El agente, como el agente anti-hialuronano, p. ej., una enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero, se puede administrar el día 1, seguido de la administración del inhibidor de puntos de control inmunitario, tal como un anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario el día 2, seguido de 26 días sin dosificación. En otro ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano se puede administrar dos veces por semana, los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 y 25, y el inhibidor de puntos de control inmunitario se administra una vez el día 2. En otro ejemplo, la enzima de degradación de hialuronano se administra dos veces por semana, los días 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 y 25, y el inhibidor de puntos de control inmunitario también se administra dos veces por semana los días 2, 5, 9, 12, 16, 19, 23, y 26. Se entiende que la descripción anterior es solo para fines ilustrativos y que se pueden emplear variaciones de lo anterior. Adicionalmente, se pueden aplicar ciclos de administración similares a todos los agentes administrados, o se puede emplear cada agente administrado en su propio régimen de dosificación en la terapia combinada proporcionada en la presente memoria.
Está dentro del nivel de un experto en la técnica determinar el ciclo preciso de administración y el programa de dosificación. Como se indicó anteriormente, el ciclo de administración puede ser durante cualquier período de tiempo deseado. Por lo tanto, el ciclo de administración de 28 días se puede repetir durante cualquier período de tiempo. Está dentro del conocimiento práctico de la técnica del médico a cargo adoptar un ciclo de administración y un régimen de dosificación que satisfagan las necesidades del paciente según las consideraciones personales específicas del paciente y de la enfermedad a tratar.
Los métodos proporcionados también pueden incluir la administración de un corticosteroide antes, concurrentemente, intermitentemente o después de la administración del agente anti-hialuronano. El ciclo de administración puede ser durante cualquier período de tiempo, y está dentro del nivel del médico o clínico a cargo. Normalmente, el número predeterminado de semanas es de 3 semanas o 4 semanas, pero puede ser más largo. El ciclo de administración se puede repetir varias veces según el estado de la enfermedad y la respuesta del sujeto.
4. Tratamientos Combinados Adicionales
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria se puede utilizar sola y combinada adicionalmente con otras terapias o tratamientos. Las combinaciones o composiciones proporcionadas en la presente memoria se pueden formular o administrar conjuntamente junto con, antes, de forma intermitente o con posterioridad a otros agentes o tratamientos terapéuticos o farmacológicos, tales como procedimientos. Por ejemplo, tales agentes incluyen, pero no se limitan a, otros agentes biológicos, agentes anticancerosos, compuestos de moléculas pequeñas, agentes dispersantes, anestésicos, vasoconstrictores y cirugía, y combinaciones de los mismos. Tales agentes también pueden incluir uno o más agentes para mejorar, reducir o prevenir efectos secundarios. En algunos casos, la terapia combinada se puede utilizar combinada con uno o más tratamientos para el cáncer que extirpan el tumor primario antes del tratamiento. Por ejemplo, se puede utilizar quimioterapia o radioterapia adicionales y sus combinaciones, además de la terapia combinada que se proporciona en la presente memoria. En otros ejemplos, la extirpación quirúrgica puede no ser necesaria. Otros métodos ilustrativos que se pueden combinar incluyen la administración de un compuesto que disminuye la velocidad de proliferación del tumor o las células neoplásicas sin debilitar el sistema inmunológico (p. ej., administrando compuestos supresores de tumores o administrando compuestos específicos de células tumorales) o administrando un compuesto inhibidor de la angiogénesis. En un ejemplo adicional, se puede administrar una vacuna como parte de la terapia combinada proporcionada en la presente memoria. En algunos ejemplos, la vacuna puede ser una vacuna contra el tumor que expresa citoquinas, tal como una vacuna contra el tumor que expresa GM-CSF (véase p. ej., Jinushi et al., (2007) J Clin Invest 117: 1902-1913), o una vacuna de antígeno tumoral para promover adicionalmente una respuesta inmunitaria antitumoral.
Se puede administrar una preparación de un segundo agente o agentes o tratamiento o tratamientos de una vez, o se puede dividir en numerosas dosis más pequeñas que se van a administrar a intervalos de tiempo. Las preparaciones de agente/tratamiento seleccionadas se pueden administrar en una o más dosis a lo largo del tiempo de tratamiento, por ejemplo, durante varias horas, días, semanas o meses. En algunos casos, la administración continua es útil. Se entiende que la dosificación precisa y el curso de la administración dependen de la indicación y la tolerabilidad del paciente. En general, los regímenes de dosificación para segundos agentes/tratamientos en la presente memoria son conocidos por un experto en la técnica.
a. Corticosteroides
La terapia combinada proporcionada en la presente memoria se puede utilizar sola o combinada adicionalmente con uno o más corticosteroides. Un corticosteroide se administra en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para mejorar o reducir uno o más efectos adversos de la administración de un enzima de degradación de hialuronano conjugada con polímero u otro agente, en particular, efectos musculoesqueléticos adversos que pueden ocurrir en la administración sistémica de una enzima de degradación de hialuronano, tal como una hialuronidasa, y particularmente una hialuronidasa modificada con polímero, tal como una PEGPH20. Una cantidad terapéuticamente eficaz es la dosificación suficiente para mejorar, prevenir, eliminar o reducir uno o más síntomas o efectos adversos. Los indicadores de mejora o de un tratamiento previo satisfactorio incluyen la determinación de la imposibilidad para manifestar una puntuación relevante en la escala CTCAE o un cambio en la calificación o la gravedad en la escala CTCAE.
Los corticosteroides son una clase de hormonas esteroideas que se producen en la corteza suprarrenal. Los corticosteroides están involucrados en una amplia gama de sistemas fisiológicos, tales como la respuesta al estrés, la respuesta inmunitaria y la regulación de la inflamación, el metabolismo de los carbohidratos, el catabolismo de las proteínas, los niveles de electrolitos en la sangre y el comportamiento. Estos incluyen glucocorticoides, que son agentes antiinflamatorios con una gran cantidad de otras funciones y mineralocorticoides, que controlan el equilibrio salino e hídrico principalmente a través de la acción sobre los riñones.
Los glucocorticoides son una clase de hormonas esteroideas, p. ej., corticosteroides, que se unen al receptor de glucocorticoides. Los glucocorticoides causan sus efectos al unirse al receptor de glucocorticoides. Entre otras actividades, el complejo glucocorticoide activado regula por aumento a su vez la expresión de proteínas antiinflamatorias en el núcleo y reprime la expresión de proteínas proinflamatorias en el citosol al prevenir la translocación de otros factores de transcripción del citosol al núcleo.
En general, se puede utilizar cualquier corticosteroide, p. ej., glucocorticoide, en las combinaciones o combinaciones para su uso que se proporcionan en la presente memoria. Los glucocorticoides incluyen glucocorticoides sintéticos y no sintéticos. Los glucocorticoides ilustrativos incluyen, pero no se limitan a: alclometasonas, algestonas, beclometasonas (p. ej., beclometasona dipropionato), betametasonas (p. ej., 17-valerato de betametasona, acetato sódico de betametasona, fosfato sódico de betametasona, valerato de betametasona), budesonidas, clobetasoles (p. ej., propionato de clobetasol), clobetasonas, clocortolonas (p. ej., pivalato de clocortolona), cloprednoles, corticosteronas, cortisonas e hidrocortisonas (p. ej., acetato de hidrocortisona), cortivazoles, deflazacort, desonidas, desoximetasonas, dexametasonas (p. ej., 21-fosfato de dexamethasona, acetato de dexametasona, fosfato sódico de dexametasona), diflorasonas (p. ej., diacetato de diflorasona), diflucortolonas, difluprednatos, enoxolonas, fluazacort, flucloronidas, fludrocortisonas (p. ej., acetato de fludrocortisona), flumetasonas (p. ej., pivalato de flumetasona), flunisolidas, fluocinolonas (p. ej., acetónido de fluocinolona), fluocinonidas, fluocortinas, fluocortolonas, fluorometolonas (p. ej., acetato de fluorometolona), fluperolonas (p. ej., acetato de fluperolona), fluprednidenos, fluprednisolonas, flurandrenolidas, fluticasonas (p. ej., propionato de fluticasona), formocortales, halcinonidas, halobetasoles, halometasonas, halopredonas, hidrocortamatos, hidrocortisonas (p. ej., 21-butirato de hidrocortisona, aceponato de hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, buteprato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, cipionato de hidrocortisona, hemisuccinato de hidrocortisona, probutato de hidrocortisona, fosfato sódico de hidrocortisona, succinato sódico de hidrocortisona, valerato de hidrocortisona), etabonato de loteprednol, mazipredonas, medrisonas, meprednisonas, metilprednisolonas (aceponato de metilprednisolona, acetato de metilprednisolona, hemisuccinato de metilprednisolona, succinato sódico de metilprednisolona), mometasonas (p. ej., furoato de mometasona), parametasonas (p. ej., acetato de parametasona), prednicarbatos, prednisolonas (p. ej., 25-dietilaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, 21-hemisuccinato de prednisolona, acetato d e p re d n is o lo n a ; fa rn e s ila to d e p re d n is o lo n a , h e m is u c c in a to d e p re d n is o lo n a , p re d n is o lo n a -21 (b e ta -D -g lu c u ro n id o ) , m e ta s u lfo b e n z o a to d e p re d n is o lo n a , e s te a g la to d e p re d n is o lo n a , te b u ta to d e p re d n is o lo n a , te t ra h id ro f ta la to d e p re d n is o lo n a ) , p re d n is o n a s , p re d n iv a l, p re d n ilid e n o s , r im e x o lo n a s , t ix o c o r to le s , t r ia m c in o lo n a s (p. e j., a c e tó n id o d e tr ia m c in o lo n a , b e n e tó n id o d e t r ia m c in o lo n a , h e x a c e tó n id o d e t r ia m c in o lo n a , a c e tó n id o d e tr ia m c in o lo n a 21 -p a lm ita to , d ia c e ta to d e t r ia m c in o lo n a ) . E s to s g lu c o c o r t ic o id e s y la s s a le s d e lo s m is m o s s e c o m e n ta n c o n d e ta lle , p o r e je m p lo , en R e m in g to n 's P h a rm a c e u t ic a l S c ie n c e s , A . O s o l, e d ., M a c k P u b . C o ., E a s to n , Pa. (16 a ed . 1980 ).
E n a lg u n o s e je m p lo s , e l g lu c o c o r t ic o id e s e s e le c c io n a e n tre c o r t is o n a s , d e x a m e ta s o n a s , h id ro c o r t is o n a s , m e t i lp re d n is o lo n a s , p re d n is o lo n a s y p re d n is o n a s . En un e je m p lo p a rt ic u la r , e l g lu c o c o r t ic o id e e s d e x a m e ta s o n a .
E l c o r t ic o s te ro id e s e p ro p o rc io n a a u n a d o s is te ra p é u t ic a m e n te e f ic a z . L a c o n c e n tra c ió n te ra p é u t ic a m e n te e fe c t iv a s e p u e d e d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te p ro b a n d o en s is te m a s in v itro o in v ivo (p . e j., m o d e lo s a n im a le s ) . P o r e je m p lo , la c a n t id a d d e un c o r t ic o s te ro id e s e le c c io n a d o q u e s e v a a a d m in is t ra r p a ra m e jo ra r lo s e fe c to s a d v e rs o s s e p u e d e d e te rm in a r m e d ia n te té c n ic a s c lín ic a s c o n v e n c io n a le s . A d e m á s , s e p u e d e n e m p le a r m o d e lo s a n im a le s p a ra a y u d a r a id e n t if ic a r in te rv a lo s d e d o s if ic a c ió n ó p tim o s . L a d o s if ic a c ió n p re c is a , q u e s e p u e d e d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te , p u e d e d e p e n d e r d e la p re p a ra c ió n te ra p é u t ic a p a rt ic u la r , e l ré g im e n y e l p ro g ra m a d e d o s if ic a c ió n , la v ía d e a d m in is t ra c ió n y la g ra v e d a d d e la e n fe rm e d a d .
L a c o n c e n tra c ió n d e un a g e n te te ra p é u t ic o s e le c c io n a d o en la c o m p o s ic ió n d e p e n d e d e la s ta s a s d e a b s o rc ió n , in a c t iv a c ió n y e x c re c ió n , la s c a ra c te r ís t ic a s f is ic o q u ím ic a s , e l p ro g ra m a d e d o s if ic a c ió n y la c a n t id a d a d m in is tra d a , a s í c o m o d e o tro s fa c to re s c o n o c id o s p o r lo s e x p e r to s en la té c n ic a . P o r e je m p lo , s e e n t ie n d e q u e la d o s if ic a c ió n p re c is a y la d u ra c ió n d e l t ra ta m ie n to s o n u n a fu n c ió n d e la e n fe rm e d a d o a fe c c ió n , e l te j id o q u e s e e s tá t ra ta n d o , el p a c ie n te o s u je to y e l a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , in c lu y e n d o la c a n t id a d y e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n . L a d o s is de l c o r t ic o s te ro id e ta m b ié n p u e d e v a r ia r s e g ú n la e d a d y la s a lu d d e l p a c ie n te , la d o s is d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o c o n ju g a d a c o n p o lím e ro (p. e j., d o s if ic a c ió n d e e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a ) , la p o te n c ia d e l c o r t ic o s te ro id e y la v ía d e a d m in is tra c ió n . P o r e je m p lo , s e d e b e o b s e rv a r q u e la s c o n c e n tra c io n e s y lo s v a lo re s d e d o s if ic a c io n e s v a r ia rá n c o n la d o s is te ra p é u t ic a y e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . A d e m á s , e l c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is t r a r d ia r ia m e n te , s e m a n a lm e n te , m e n s u a lm e n te o d u ra n te p e r ío d o s m á s p ro lo n g a d o s d e t ie m p o p a ra lo g ra r lo s re s u lta d o s d e s e a d o s . E l v o lu m e n d e d o s if ic a c ió n p a r t ic u la r p u e d e v a r ia r y d e p e n d e d e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n , la f re c u e n c ia d e a d m in is tra c ió n y la v e lo c id a d d e a d m in is t ra c ió n d e s e a d a . C a b e s e ñ a la r q u e la s c o n c e n tra c io n e s y lo s v a lo re s d e d o s if ic a c ió n ta m b ié n p u e d e n v a r ia r c o n la e d a d d e l in d iv id u o tra ta d o .
L a d o s if ic a c ió n p re c is a y la d u ra c ió n d e l t ra ta m ie n to s e p u e d e n d e te rm in a r e m p ír ic a m e n te u t il iz a n d o p ro to c o lo s d e p ru e b a c o n o c id o s o p o r e x t ra p o la c ió n d e d a to s d e p ru e b a in v ivo o in v itro . S e d e b e e n te n d e r a d e m á s q u e p a ra c u a lq u ie r s u je to en p a rt ic u la r , lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n e s p e c íf ic o s s e d e b e n a ju s ta r a lo la rg o d e l t ie m p o d e a c u e rd o c o n la n e c e s id a d in d iv id u a l y e l c r ite r io p ro fe s io n a l d e la p e rs o n a q u e a d m in is t ra o s u p e rv is a la a d m in is t ra c ió n d e la s fo rm u la c io n e s , y q u e lo s in te rv a lo s d e c o n c e n tra c ió n e x p u e s to s en la p re s e n te m e m o r ia so n s o la m e n te ilu s t ra t iv o s y n o e s tá n d e s t in a d o s a lim ita r e l a lc a n c e d e la m is m a . G e n e ra lm e n te , lo s re g ím e n e s d e d o s if ic a c ió n s e e lig e n p a ra l im ita r la to x ic id a d , y en la p re s e n te m e m o r ia s e e lig e n p a ra m e jo ra r lo s e fe c to s s e c u n d a r io s a d v e rs o s . S e d e b e te n e r en c u e n ta q u e e l m é d ic o a c a rg o s a b rá c ó m o y c u á n d o f in a liz a r , in te r ru m p ir o a ju s ta r la te ra p ia a u n a d o s if ic a c ió n m á s b a ja d e b id o a la to x ic id a d , d is fu n c ió n d e la m é d u la ó se a , h íg a d o o r iñ ó n u o tro te jid o . P o r e l c o n tra r io , e l m é d ic o a c a rg o ta m b ié n s a b rá c ó m o y c u á n d o a ju s ta r e l t r a ta m ie n to a n iv e le s m á s a lto s s i la re s p u e s ta c lín ic a n o e s a d e c u a d a (e x c lu y e n d o lo s e fe c to s s e c u n d a r io s tó x ic o s ) . L a a d m in is tra c ió n d e un a g e n te te ra p é u t ic o n o d e b e e x c e d e r lo s n iv e le s d e d o s if ic a c ió n m á x im o s e x p u e s to s p o r la A d m in is t ra c ió n d e F á rm a c o s y A lim e n to s d e lo s E s ta d o s U n id o s o p u b lic a d o s en P h y s ic ia n 's D e s k R e fe re n c e .
E n g e n e ra l, la d o s is d e c o r t ic o s te ro id e a d m in is t ra d a d e p e n d e d e lo s c o r t ic o s te ro id e s e s p e c íf ic o s , y a q u e e x is te u n a d ife re n c ia en la p o te n c ia e n tre lo s d ife re n te s c o r t ic o s te ro id e s (v é a s e la T a b la 10 a c o n t in u a c ió n ) . E l c o r t ic o s te ro id e , o g lu c o c o r t ic o id e , p o r e je m p lo d e x a m e ta s o n a , s e p u e d e a d m in is t r a r p o r v ía o ra l (c o m p r im id o s , líq u id o o p ro d u c to c o n c e n tra d o líq u id o ), p o r v ía in tra v e n o s a ( IV ) o p o r v ía in tra m u s c u la r . E l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra t íp ic a m e n te en fo rm a d e e m b o la d a , p e ro m u c h o s s e a d m in is tra n d u ra n te un p e r ío d o d e t ie m p o , s ie m p re q u e la d o s is s e a e f ic a z p a ra m e jo ra r u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a s o c ia d o s c o n la a d m in is tra c ió n d e l a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a .
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E l c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is t r a r en c u a lq u ie r c a n t id a d q u e s e a e f ic a z p a ra m e jo ra r u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a s o c ia d o s co n la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . A s í, e l c o r t ic o s te ro id e , p. e j., g lu c o c o r t ic o id e , s e p u e d e a d m in is tra r , p o r e je m p lo , en u n a c a n t id a d e n tre a p ro x im a d a m e n te 0,1 y 100 m g , p o r d o s is , d e 0 ,1 a 80 m g , d e 0 ,1 a 60 m g , d e 0 ,1 a 40 m g , d e 0,1 a 30 m g , d e 0 ,1 a 20 m g, d e 0 ,1 a 15 m g , d e 0 ,1 a 10 m g , d e 0 ,1 a 5 m g , d e 0 ,2 a 40 m g , d e 0 ,2 a 30 m g , d e 0 ,2 a 20 m g , d e 0 ,2 a 15 m g , d e 0 ,2 a 10 m g , d e 0 ,2 a 5 m g , d e 0 ,4 a 40 m g , d e 0 ,4 a 30 m g , d e 0 ,4 a 20 m g , d e 0 ,4 a 15 m g , d e 0 ,4 a 10 m g, d e 0 ,4 a 5 m g , d e 0 ,4 a 4 m g , d e 1 a 20 m g , d e 1 a 15 m g o d e 1 a 10 m g , a un s u je to h u m a n o a d u lto d e 70 kg . T íp ic a m e n te , e l c o r t ic o s te ro id e , ta l c o m o un g lu c o c o r t ic o id e , s e a d m in is t ra en u n a c a n t id a d e n tre a p ro x im a d a m e n te 0 ,4 y 20 m g , p o r e je m p lo , a o a p ro x im a d a m e n te 0 ,4 m g , 0 ,5 m g , 0 ,6 m g , 0 ,7 m g , 0 ,75 m g , 0 ,8 m g , 0 ,9 m g , 1 m g , 2 m g , 3 m g , 4 m g , 5 m g , 6 m g , 7 m g , 8 m g , 9 m g , 10 m g , 11 m g , 12 m g, 13 m g, 14 m g , 15 m g , 16 m g , 17 m g , 18 m g, 19 m g o 20 m g p o r d o s is , p a ra un s u je to h u m a n o a d u lto p ro m e d io .
E l c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is tra r , p o r e je m p lo , a u n a d o s if ic a c ió n d e o d e a p ro x im a d a m e n te 0 ,001 m g /k g (d e l s u je to ) , 0 ,002 m g /k g , 0 ,003 m g /k g , 0 ,004 m g /k g , 0 ,005 m g /k g , 0 ,006 m g /k g , 0 ,007 m g /k g , 0 ,008 m g /k g , 0 ,009 m g /k g , 0 ,01 m g /k g , 0 ,015 m g /k g , 0 ,02 m g /k g , 0 ,025 m g /k g , 0 ,03 m g /k g , 0 ,035 m g /k g , 0 ,04 m g /k g , 0 ,045 m g /k g , 0 ,05 m g /k g , 0 ,055 m g /k g , 0 ,06 m g /k g , 0 ,065 m g /k g , 0 ,07 m g /k g , 0 ,075 m g /k g , 0 ,08 m g /k g , 0 ,085 m g /k g , 0 ,09 m g /k g , 0 ,095 m g /k g , 0,1 m g /k g , 0 ,15 m g /k g , 0 ,2 m g /k g , 0 ,25 m g /k g , 0 ,30 m g /k g , 0 ,35 m g /k g , 0 ,40 m g /k g , 0 ,45 m g /k g , 0 ,50 m g /k g , 0 ,55 m g /k g , 0 ,60 m g /k g , 0 ,65 m g /k g , 0 ,70 m g /k g , 0 ,75 m g /k g , 0 ,80 m g /k g , 0 ,85 m g /k g , 0 ,90 m g /k g , 0 ,95 m g /k g , 1 m g /k g , 1 ,05 m g /k g , 1,1 m g /k g , 1 ,15 m g /k g , 1 ,20 m g /k g , 1 ,25 m g /k g , 1 ,3 m g /k g , 1 ,35 m g /k g o 1 ,4 m g /k g , p a ra un s u je to h u m a n o a d u lto p ro m e d io , t íp ic a m e n te c o n un p e s o d e a p ro x im a d a m e n te 70 kg a 75 kg.
L a d o s is a d m in is t ra d a p u e d e v a r ia r s ie m p re y c u a n d o la a d m in is tra c ió n d e l c o r t ic o s te ro id e m e jo re u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a d v e rs o s a s o c ia d o s c o n la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . E n un e je m p lo , la d o s if ic a c ió n d e g lu c o c o r t ic o id e , p o r e je m p lo , d e x a m e ta s o n a , s e a d m in is t ra en d o s if ic a c io n e s s u c e s iv a m e n te m á s b a ja s p o r c ic lo d e tra ta m ie n to . P o r lo ta n to , en ta le s re g ím e n e s d e t ra ta m ie n to , la d o s is d e c o r t ic o s te ro id e s s e re d u c e g ra d u a lm e n te . P o r e je m p lo , la d e x a m e ta s o n a s e a d m in is t ra a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , a u n a d o s is in ic ia l d e 4 m g , y d e s p u é s d e c a d a a d m in is tra c ió n s u c e s iv a d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , la d o s is d e d e x a m e ta s o n a s e re d u c e , d e m a n e ra q u e la d o s is e s d e 3 m g p a ra la p ró x im a a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a , a c o n t in u a c ió n 2 m g p o r a d m in is tra c ió n d e a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p. e j., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a , y a c o n t in u a c ió n 1 m g p o r a d m in is t ra c ió n d e a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p. e j., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . S e c o n te m p la c u a lq u ie r d o s is s ie m p re q u e la d o s is d e l c o r t ic o s te ro id e s e a e f ic a z p a ra re d u c ir u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a s o c ia d o s c o n la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . p. e j., u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a .
E l t ie m p o d e a d m in is tra c ió n p u e d e v a r ia r s ie m p re q u e la a d m in is tra c ió n d e l c o r t ic o s te ro id e m e jo re u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a d v e rs o s a s o c ia d o s c o n la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o la h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . El c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is t ra r s e c u e n c ia lm e n te , d e fo rm a in te rm ite n te , a l m is m o t ie m p o o en la m is m a c o m p o s ic ió n q u e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o . p. ej., e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a . P o r e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is t r a r a n te s , d u ra n te , s im u ltá n e a m e n te o d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. ej., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . E n o tro e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e y la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., la h ia lu ro n id a s a P E G ila d a se a d m in is tra n d e fo rm a in te rm ite n te . G e n e ra lm e n te , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . P o r e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e , p. e j., el g lu c o c o r t ic o id e , ta l c o m o la d e x a m e ta s o n a , s e p u e d e a d m in is t r a r o a d m in is t ra r a p ro x im a d a m e n te 0 ,5 m in u to s , 1 m in u to , 2 m in u to s , 3 m in u to s , 4 m in u to s , 5 m in u to s , 6 m in u to s , 7 m in u to s , 8 m in u to s , 9 m in u to s , 10 m in u to s , 15 m in u to s , 20 m in u to s , 25 m in u to s , 30 m in u to s , 45 m in u to s , 1 h o ra , 2 h o ra s , 3 h o ra s , 4 h o ra s , 5 h o ra s , 6 h o ra s , 7 h o ra s , 8 h o ra s , 9 h o ra s , 10 h o ra s , 11 h o ra s , 12 h o ra s , 18 h o ra s , 24 h o ra s , 36 h o ra s o m á s a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e l a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a .
E n a lg u n o s e je m p lo s , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra a l m is m o t ie m p o q u e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a . E n e s te e je m p lo , el c o r t ic o s te ro id e s e p u e d e a d m in is t r a r ju n to c o n , o p o r s e p a ra d o , d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . N o rm a lm e n te , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra p o r s e p a ra d o d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a . E n o tro s e je m p lo s , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is tra a p ro x im a d a m e n te a lo s 0 ,5 m in u to s , 1 m in u to , 2 m in u to s , 3 m in u to s , 4 m in u to s , 5 m in u to s , 6 m in u to s , 7 m in u to s , 8 m in u to s , 9 m in u to s , 10 m in u to s , 15 m in u to s , 20 m in u to s . 25 m in u to s , 30 m in u to s , 45 m in u to s , 1 h o ra , 2 h o ra s , 3 h o ra s , 4 h o ra s , 5 h o ra s , 6 h o ra s , 7 h o ra s , 8 h o ra s , 9 h o ra s , 10 h o ra s , 11 h o ra s , 12 h o ra s , 18 h o ra s , 24 h o ra s 36 h o ra s o m á s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo , u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a .
E n un e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . P o r e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e , p. e j., g lu c o c o r t ic o id e , p o r e je m p lo , d e x a m e ta s o n a , s e a d m in is t ra 1 h o ra a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . E n o tro e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra 5 m in u to s a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a . E n o tro e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e s e a d m in is t ra a n te s y d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . E n e s te e je m p lo , e l c o r t ic o s te ro id e , ta l c o m o la d e x a m e ta s o n a , s e a d m in is t ra d e u n o a c in c o m in u to s in m e d ia ta m e n te a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a y o c h o h o ra s d e s p u é s d e la a d m in is t ra c ió n d e l a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a . En o tro e je m p lo , un c o r t ic o s te ro id e , ta l c o m o la d e x a m e ta s o n a , s e a d m in is t ra u n a h o ra a n te s d e la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p. e j., u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a y o c h o a d o c e h o ra s d e s p u é s d e la a d m in is tra c ió n d e l a g e n te a n t i-h ia lu ro n a n o , p. ej., u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o P E G ila d a .
S e c o n te m p la c u a lq u ie r ré g im e n d e d o s if ic a c ió n s ie m p re q u e e l t ie m p o d e d o s if ic a c ió n d e l c o r t ic o s te ro id e m e jo re u n o o m á s e fe c to s s e c u n d a r io s a s o c ia d o s c o n la a d m in is tra c ió n d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , p o r e je m p lo u n a h ia lu ro n id a s a P E G ila d a . A d e m á s , la d o s is o e l ré g im e n d e d o s if ic a c ió n d e c o r t ic o s te ro id e s e s u n o q u e n o in te r f ie re n i re d u c e e l e fe c to te ra p é u t ic o d e la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o u o tro a g e n te en la s c o m p o s ic io n e s y c o m b in a c io n e s p ro p o rc io n a d a s en la p re s e n te m e m o r ia , in c lu y e n d o el t ra ta m ie n to d e un c á n c e r o un tu m o r s ó lid o .
C o m o s e d e s c r ib e y s e m u e s tra en lo s e je m p lo s , la a d m in is tra c ió n d e un c o r t ic o s te ro id e , ta l c o m o un g lu c o c o rt ic o id e , ta l c o m o la d e x a m e ta s o n a , n o d is m in u y e la e f ic a c ia d e la te ra p ia c o n in h ib id o re s d e p u n to s d e c o n tro l, ta le s c o m o los a n t ic u e rp o s a n t i-C T L A 4 y a n t i-P D -L l, c u y a e f ic a c ia e s m e jo ra d a p o r la a d m in is tra c ió n c o n u n a e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , ta l c o m o u n a h ia lu ro n id a s a , ta l c o m o P E G P H 20 , p a r t ic u la rm e n te s i la e n z im a d e d e g ra d a c ió n d e h ia lu ro n a n o , s e a d m in is tra 8 -24 h o ra s o se a d m in is t ra a p ro x im a d a m e n te 8 -24 h o ra s a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e l a n tic u e rp o .
b. Agentes anticancerosos y otros tratamientos
L a te ra p ia c o m b in a d a p ro p o rc io n a d a en la p re s e n te m e m o r ia s e p u e d e u t i l iz a r s o la o c o m b in a d a a d ic io n a lm e n te co n o tro s a g e n te s a n t ic a n c e ro s o s . El a g e n te o lo s a g e n te s o e l t r a ta m ie n to o lo s t ra ta m ie n to s c o n tra e l c á n c e r p u e d e n s e r c iru g ía , ra d ia c ió n , fá rm a c o s , a g e n te s q u im io te ra p é u t ic o s , p o lip é p tid o s , a n t ic u e rp o s , p é p tid o s , m o lé c u la s p e q u e ñ a s o v e c to re s d e te ra p ia g é n ic a , v iru s , A D N , v a c u n a s , a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s , ta le s c o m o c é lu la s d e n d r í t ic a s q u e e x p re s a n u n o o m á s c u a le s q u ie ra d e lo s a n tíg e n o s a s o c ia d o s a tu m o re s d e s c r ito s en la p re s e n te m e m o r ia (S e c c ió n G ) o c o n o c id o s en la té c n ic a .
L o s a g e n te s a n t ic a n c e ro s o s i lu s tra t iv o s q u e s e p u e d e n a d m in is t r a r d e s p u é s , c o in c id e n te m e n te c o n o a n te s d e la a d m in is t ra c ió n d e la te ra p ia c o m b in a d a d e la p re s e n te m e m o r ia , in c lu y e n , p e ro n o s e lim ita n a,
A c iv ic in a s ; A v ic in a ; A c la r ru b ic in a s ; A c o d a z o le s ; A c ro n in a s ; A d o z e le s in a s ; A ld e s le u q u in a s ; A le m tu z u m a b ; A l i t re t in o in a s (Á c id o 9 -C is -R e t in o ic o ) ; A lo p u r in o le s ; A lt re ta m in a s ; A lv o c id ib ; A m b a z o n a s ; A m b o m in in a s ; A m e ta n tro n a s ; A m ifo s t in a s ; A m in o g lu te t im id a s ; A m s a c r in a s ; A n a s tro z o le s ; A n a x iro n a s ; A n c ita b in a s ; A n tra m ic in a s ; A p a z ic u o n a s ; A rg im e s n a s ; T r ió x id o s d e a rs é n ic o ; A s p a r ra g in a s a s ; A s p e r lin a s ; A tr im u s t in a s ; A z a c it id in a s ; A z e te p a s ; A z o to m ic in a s ; B a n o x a n tro n a s ; B a ta b u lin a s ; B a tim a s ta t; B C G V iv o ; B e n a x ib in a s ; B e n d a m u s t in a s ; B e n z o d e p a s ; B e x a ro te n o s ; B e v a c iz u m a b ; B ic a lu ta m id a s ; B ie ta s e rp in a s ; B ir ic o d a r; B is a n tre n o s ; D im e s ila to s d e B is n a fid a ; B iz e le s in a s ; B le o m ic in a s ; B o r te z o m ib ; B re q u in a r ; B ro p ir im in a s ; B u d o tita n o s ; B u s u lfa n o s ; C a c t in o m ic in a s ; C a lu s te ro n a s ; C a n e rt in ib ; C a p e c ita b in a s ; C a ra c e m id a s ; C a rb e tím e ro s ; C a rb o p la t in o s ; C a rb o c u o n a s ; C a rm o fu r ; C a rm u s t in a s c o n P o life p ro s a n ; C a rm u s t in a s ; C a r ru b ic in a s ; C a rz e le s in a s ; C e d e f in g o le s ; C e le c o x ib ; C e m a d o t in a s ; C lo ra m b u c ilo s ; C io te ro n e l; C ip la t in o s ; C iro le m ic in a s ; C is p la t in o s ; C la d r ib in a s ; C la n fe n u r ; C lo fa ra b in a s ; C r is n a to le s ; C ic lo fo s fa m id a s ; C ita ra b in a s L ip o s o m a le s ; C ita ra b in a s ; D a c a rb a z in a s ; D a c t in o m ic in a s ; D a rb e p o e t in a s A lfa ; D a u n o r ru b ic in a s L ip o s o m a le s ; D a u n o rru b ic in a s /D a u n o m ic in a s ; D a u n o rru b ic in a s ; D e c ita b in a s ; D e n ile u c in a D ift ito x ; D e x n ig u ld ip in a s ; D e x o n a s ; D e x ra z o x a n o s ; D e z a g u a n in a s ; D ia z ic u o n a s ; D ib ro s p id iu m ; D ie n o g e s t; D in a lin a s ; D is e rm o lid a ; D o c e ta x e l; D o fe q u id a r ; D o x if lu r id in a s ; D o x o rru b ic in a s L ip o s o m a le s ; D o x o rru b ic in a H C L ; in y e c c ió n d e D o x o rru b ic in a H C L lip o s o m a l; D o x o rru b ic in a s ; D ro lo x ife n o s ; P ro p io n a to s d e D ro m o s ta n o lo n a ; D u a z o m ic in a s ; E c o m u s t in a s ; E d a tre x a to s ; E d o te c a r in a s ; E flo rn it in a s ; E la c r id a r ; E lin a f id a s ; S o lu c io n e s B d e E llio tt ; E ls a m itru c in a s ; E m ite fu r ; E n lo p la t in o s ; E n p ro m a to s ; E n z a s ta u r in a s ; E p ip ro p id in a s ; E p ir ru b ic in a s ; E p o e t in a s a lfa ; E p ta lo p ro s t; E rb u lo z o le s ; E s o rru b ic in a s ; E s tra m u s t in a s ; E ta n id a z o le s ; E to g lu c id o s ; F o s fa to s d e E to p ó s id o ; E to p o s id o s V P -16 ; E to p ó s id o s ; E to p r in a s ; E x e m e s ta n o s ; E x is u lin d ; F a d ro z o le s ; F a z a ra b in e s ; F e n re t in id a s ; F ilg ra s t im ; F lo x u r id in a s ; F lu d a ra b in a s ; F lu o ro u ra c ilo s ; 5 - f lu o ro u ra c ilo s ; F lu o x im e s te ro n a s ; F lu ro c ita b in a s ; F o s q u id o n e s ; F o s tr ie c in a s ; Fostriecinas; Fotretaminas; Fulvestrant; Galarrubicinas; Galocitabinas; Gemcitabinas; Gemtuzumab/Ozogamicinas; Geroquinoles; Gimatecanos; Gimeracilos; Gloxazonas; Glufosfamidas; Acetatos de goserelina; Hidroxiureas; Ibritumomab/Tiuxetano; Idarrubicinas; Ifosfamidas; Ilmofosinas; Ilomastat; Mesilatos de imatinib; Imexonas; Improsulfanos; Indisulam; Inprocuonas; Interferones alfa-2; Interferones alfa-2b; Interferones Alfa; Interferones Beta; Interferones Gamma; Interferones; Interleuquina-2 y otras interleuquinas (incluyendo las interleuquinas recombinantes); Intoplicinas; Iobenguanos [131-1]; Iproplatinos; Irinotecán; Irsogladinas; Ixabepilonas; Cetotrexatos; L-alanosinas; Lanreotidas; Lapatinib; Ledoxantronas; Letrozoles; Leucovorinas; Leuprolidas; Leuprorelinas (Leuprorelidas); Levamisoles; Lexacalcitoles; Liarozoles; Lobaplatinos; Lometrexoles; Lomustinas/CCNU; Lomustinas; Lonafarnib; Losoxantronas; Lurtotecán; Mafosfamidas; Manosulfanos; Marimastat; Masoprocoles; Maytansinas; Mecloretaminas; Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas; Acetatos de Megestrol; Megestroles; Melengestroles; Melfalán; Menogarilos; Mepitiostanos; Mercaptopurinas; 6-Mercaptopurina; Mesna; Metesind; Metotrexatos; Metoxsalenos; Metomidatos; Metoprinas; Meturedepas; Miboplatinos; Miproxifenos; Misonidazoles; Mitindomidas; Mitocarcinas; Mitocrominas; Mitoflaxonas; Mitogilinas; Mitoguazonas; Mitomalcinas; Mitomicina C; Mitomicinas; Mitonafidas; Mitoquidonas; Mitosper; Mitotanos; Mitoxantronas; Mitozolomidas; Mivobulinas; Mizoribinas; Mofarotenos; Mopidamoles; Mubritinib; Ácidos micofenólicos; Fenpropionatos de Nandrolona; Nedaplatinos; Nelzarabinas; Nemorrrubicinas; Nitracrinas; Nocodazoles; Nofetumomab; Nogalamicinas; Nolatrexed; Nortopixantronas; Octreótidos; Oprelvequinas; Ormaplatinos; Ortataxel; Oteracilos; Oxaliplatinos; Oxisuranos; Oxofenarsinas; Paclitaxel; Pamidronatos; Patubilonas; Pegademasas; Pegaspargasas; Pegfilgrastim; Peldesinas; Peliomicinas; Pelitrexoles; Pemetrexed; Pentamustinas; Pentostatinas; Peplomicinas; Perfosfamidas; Perifosinas; Picoplatinos; Pinafidas; Pipobromanos; Piposulfanos; Pirfenidonas; Piroxantronas; Pixantronas; Plevitrexed; Plicamicinas; Plomestanos; Plomestanos; Porfímero sódico; Porfímeros; Porfiromicinas; Prednimustinas; Procarbazinas; Propamidinas; Prospidios; Pumitepas; Puromicinas; Pirazofurinas; Quinacrinas; Ranimustinas; Rasburicasas; Riboprinas; Ritrosulfanos; Rituximab; Rogletimidas; Roquinimex; Rufocromomicinas; Sabarubicinas; Safingoles; Sargramostim; Satraplatinos; Sebriplatinos; Semustinas; Simtrazenos; Sizofiranos; Sobuzoxanos; Sorafenib; Esparfosatos; Ácidos esparfósicos; Esparsomicinas; Espirogermanios; Espiromustinas; Espiroplatinos; Espiroplatinos; Escualaminas; Estreptonigrinas; Estreptovaricinas; Estreptozocinas; Sufosfamidas; Sulofenur; Malato de Sunitinib; 6-tioguanina (6-TG); Tacedinalinas; Talcos; Talisomicinas; Talimustinas; Tamoxifenos; Tariquidar; Tauromustinas; Tecogalanos; Tegafur; Teloxantronas; Temoporfinas; Temozolomidas; Teniposidos/VM-26; Teniposidos; Teroxironas; Testolactonas; Tiamiprinas; Tioguaninas; Tiotepas; Tiamiprinas; Tiazofurinas; Tilomisoles; Tiloronas; Timcodar; Timonacic; Tirapazaminas; Topixantronas; Topotecán; Toremifenos; Tositumomab; Trabectedinas (Ecteinascidina 743); Trastuzumab; Trestolonas; Tretinoínas/ATRA; Triciribinas; Trilostanos; Trimetrexatos; Tetranitratos de Triplatino; Triptorelinas; Trofosfamidas; Tubulozoles; Ubenimex; Mostazas de Uracilo; Uredepas; Valrubicinas; Valspodar; Vapreotidas; Verteporfinas; Vinblastinas; Vincristinas; Vindesinas; Vinepidinas; Vinfluninas; Vinformidas; Vinglicinatos; Vinleucinoles; Vinleurosinas; Vinorelbinas; Vinrosidinas; Vintriptoles; Vinzolidinas; Vorozoles; Xantomicinas A (Guameciclinas); Zeniplatinos; Zilascorb [2-H]; Zinostatinas; Zoledronato; Zorrubicinas; yZosuquidar, por ejemplo:
Aldesleuquinas (p. ej., PROLe Uk iN®); Alemtuzumab (p. ej., CAMPATH®); Alitretinoínas (p. ej., PANRETIN®); Alopurinoles (p. ej., ZYLOPRIM®); Altretaminas (p. ej., HexAlEN®); Amifostinas (p. ej., Et Hy o L®); Anastrozoles (p. ej., ARIMiDeX®); Trióxidos de arsénico (p. ej., t RiSENOX®); Asparraginasas (p. ej., ELSPAR®); BCG Vivo (p. ej., TICE® BCG); Bexarotenos (p. ej., TARGRETIN®); Bevacizumab (AvAsTIN®); Bleomicinas (p. ej., BLENOXANE®); Busulfán intravenoso (p. ej., BUSULFEX®); Busulfán oral (p. ej., MYLERa N®); Calusteronas (p. ej., METHOSARB®); Capecitabinas (p. ej., XELODA®); Carboplatinos (p. ej., PARAPLATIN®); Carmustinas (p. ej., BCNU®, BiCNU®); Carmustinas con Polifeprosanos (p. ej., Oblea de GLiAd EL®); Celecoxib (p. ej., CELEBREX®); Clorambucilos (p. ej., LEUKERAN®); Cisplatinos (p. ej., PLATINOL®); Cladribinas (p. ej., LEUSTATIN®, 2-CdA®); Ciclofosfamidas (p. ej., CYTOXAN®, NeOsAR®); Citarabinas (p. ej., CYTOSAR-U®); Citarabinas Liposomales (p. ej., DepoCyt®); Dacarbazinas (p. ej., DTIC-Dome): Dactinomicinas (p. ej., COSMEGEN®); Darbepoetinad Alfa (p. ej., a Ra n Es P®); Daunorrubicinas liposomales (p.ej., DANUOXOMe®); Daunorrubicinas/Daunomicinas (p. ej., CERUBIDINE®); Denileucina Diftitox (p. ej., OnTa K®); Dexrazoxanos (p. ej., ZINECARD®); Docetaxel (p. ej., TAXOTERE®); Doxorrubicinas (p. ej., ADRiAmYCIN®, RUBEX®); Doxorrubicina Liposomal, incluyendo inyección de Doxorrubicina HCL liposomal (p. ej., DOXIL®); Propionatos de Dromostanolona (p. ej., DROMOSTAnOlONE® y MASTERONE® Inyectable); Soluciones B de Elliott (p. ej., Elliott's B Solution®); Epirrubicinas (p. ej., ELLENCE®); Epoetinas alfa (p. ej., EPOGEN®); Estramustinas (p. ej., EMCYT®); Fosfatos de Etopósido (p. ej., ETOPOPHOS®); Etoposidos VP-16 (p. ej., VEPESID®); Exemestanos (p. ej., a Ro MASIN®); Filgrastim (p. ej., NEUPOGEN®); Floxuridinas (p. ej., FUDR®); Fludarabinas (p. ej., fLudArA®); Fluorouracilo incl. 5-Fu (p.ej., ADRUCIL®); Fulvestrant (p. ej., FASLODEX®); Gemcitabinas (p. ej., GEMZAR®); Gemtuzumab/Ozogamicina (p. ej., MYLOTARG®); Acetatos de goserelina (p. ej., ZOLADEX®); Hidroxiureas (p. ej., HYDREA®); Ibritumomab/Tiuxetan (p. ej., ZEVALIN®); Idarrubicinas (p. ej., IDAMYCIN®); Ifosfamidas (p. ej., iFeX®); Mesilatos de imatinib (p. ej., Gle Ev EC®); Interferones alfa-2a (p. ej., ROFERON-A®); Interferones alfa-2b (p. ej., INTRON A®); Irinotecán (p. ej., CAMPTOSAR®); Letrozoles (p.ej. FEMARA®); Leucovorinas (p. ej., WELLCOVORIN®, LEUCOVORIN®); Levamisoles (p. ej., ERGAMIs Ol®); Lomustinas/CCNU (p. ej., CeeBU®); Mecloretaminas/mostazas nitrogenadas (p. ej., MUSTARGEN®); Acetatos de Megestrol (p. ej., MEGACE®); Melfalán/L-PAM (p. ej., ALKERAN®); Mercaptopurina, incluyendo 6-mercaptopurinas (6-MP; p.ej. PURIn Et HOL®); Mesna (p. ej., MESNEX®); Metotrexatos; Metoxsalenos (p. ej., UVADEX®); Mitomicinas C (p. ej., MUTAMYCIN®, MIToZy Tr Ex ®); Mitotanos (p. ej., LYSODREN®); Mitoxantronas (p. ej., NOVANTRONE®); Fenpropionatos de Nandrolona (p. ej., d UrABOLIN50®); Nofetumomab (p. ej., VERLUMA®); Oprelvequinas (p. ej., NEUMEGA®); Oxaliplatinos (p. ej., ELOXATIN®); Paclitaxel (p. ej., pAXe Ne®, TAXOL®); Pamidronatos (p. ej., AREDIA®); Pegademasas (p. ej., ADAGEN®); Pegaspargasas (p. ej., ONCASPAR®); Pegfilgrastim (p. ej., NEULASTA®); Pentostatinas (p. ej., NIPENT®); Pipobromanos (p. ej., VERCYTE®); Plicamicina/mitramicinas (p. ej., MITHRACIN®); Porfímeros sódicos (p. ej., p Ho TOFRIN®); Procarbazinas (p. ej., MATULANE®); Quinacrinas (p. ej., ATABRINE®); Rasburicasas (p. ej., ELITEK®); Rituximab (p. ej., RIt Ux a N®); Sargramostim (p. ej., PROKINE®); Estreptozocinas (p. ej., ZANOSAR®); Malatos de Sunitinib (p. ej., SUTENT®); Talcos (p. ej., SCLEROSOL®); Tamoxifenos (p. ej., NOLVADEX®); Temozolomidas (p. ej., TEMODAR®); Teniposidos/VM-26 (p. ej., VUMo N®); Testolactonas (p. ej., TESLAC®); Tioguaninas incluyendo, 6-tioguanina (6-t G); Tiotepas (p. ej., THIOPLEX®); Topotecán (p. ej., HYCAMTIN®); Toremifenos (p. ej., FARESTON®); Tositumomab (p. ej., BEXXAR®); Trastuzumab (p. ej., HERCEPTIN®); Tretinoínas/ATRA (p. ej., VESANOID®); Mostazas de Uracilo; Valrubicinas (p. ej., VALSTa R®); Vinblastinas (p. ej., VELBAN®); Vincristinas (p. ej., ONCOVIN®); Vinorelbinas (p. ej., NAVELBIn E®); y Zoledronatos (p. ej., ZOMeTa ®).
H. ejemplos
Los siguientes ejemplos se incluyen solo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. Ejemplo 1
Generación de modelos de ratones con tumores singénicos con alto contenido hialuronano (HA)
A. Generación de un modelo de ratón con tumor de colon singénico con alto contenido de hialuronano (HA) I. Generación de la línea celular CT26/HAS3 con alto contenido de hialuronano (HA)
Se modificaron células de carcinoma de colon de ratón Balb/c CT26 (ATCC, Núm. de catálogo CRL-2638) para que expresaran de forma constitutiva la hialuronano sintasa 3 (HAS3) humana. Se generó un vector de lentivirus, denominado pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg (SEQ ID NO: 1) insertando el ADNc de HAS3 (SEQ ID NO: 2) entre los sitios de restricción XbaI y MluI dentro del sitio de clonación múltiple de pLV EF1a-MCS-IRES-Hyg (BioSettia, Inc.; SEQ ID NO: 3). Las células CT26 se infectaron con el vector pLV-EF1a-hHAS3-IRES-Hyg resultante (SEQ ID NO: 1), y las células transducidas de forma estable, denominadas células CT26/HAS3, se seleccionaron mediante tratamiento con higromicina. Las células CT26/HAS3 se mantuvieron en cultivo de tejidos como una monocapa adherente en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10% a 37°C y 5% de CO2.
2. Generación de un modelo de tumor CT26/HAS3 singénico
Las células parentales CT26/HAS3 o CT26 descritas en la parte 1 anterior se recogieron con tripsina a 80-90% de confluencia, se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) estéril y se diluyeron con HBSS a una concentración de 4 x 106 células/mL. Se obtuvieron ratones Balb/c macho a las 4-6 semanas de Taconic Farms y se alojaron 4/jaula. Para las inoculaciones de tumores, a los ratones se les inyectaron 50 pl de suspensión celular (2 x 105 células totales) intramuscularmente, adyacentes al periostio tibial derecho.
Los volúmenes de los tumores se midieron por ultrasonido utilizando VisualSonics Vevo 2100 (Toronto, Canadá) y el soporte lógico de obtención de imágenes Vevo 2100 v1.5.0. Los animales se anestesiaron utilizando anestesia ligera con isoflurano mientras se medían los volúmenes de los tumores. Para la medición del tumor, la región de interés se cubrió con gel de ultrasonido (Parker Laboratories, Fairfield, NJ) y el cabezal de exploración RMV-716 (profundidad focal = 17,5 mm) se colocó directamente sobre la región de interés. Mientras estaba en el modo 2D, se localizó el centro aproximado del tumor y, posteriormente se capturó una imagen (150 - 200 fotogramas) utilizando el modo 3D. Se analizaron aproximadamente 15-30 fotogramas de los 150-200 fotogramas y se calculó el volumen del tumor y se expresó en mm3.
3. Medición de los niveles de HA en el tejido tumoral
Al concluir los experimentos de crecimiento tumoral, los tumores se extirparon y las porciones se almacenaron congeladas a < -60°C. Para obtener extractos para la cuantificación de HA, el tejido tumoral se digirió 24 horas a 55°C en un tubo basculante utilizando 40 pl por mg de tejido de una solución que contenía proteinasa K (Sigma, Núm. de catálogo P4850) a 1 mg/mL en Tris-HCl 50 mM pH 8,0, MgCh 10 mM y CaCl22 mM. La proteinasa K se inactivó a continuación por calor a 100°C durante 30 minutos, la solución resultante se centrifugó a 10.000 g durante 20 minutos a 4-10°C, y el sobrenadante se utilizó para la cuantificación de HA por medio de Hyaluronan Duo Set ELISA (R&D Systems, Núm. de catálogo DY3614) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La curva patrón se obtuvo utilizando una serie de dilución 1:3 de seis diluciones totales, comenzando a 90 ng/mL, y todas las muestras se diluyeron de tal manera que sus concentraciones resultantes estuvieron dentro del intervalo de 0,37 -20 ng/mL. Utilizando este procedimiento, los tumores desarrollados a partir de células parentales CT26 de bajo contenido de HA tenían 73 ± 8 ng de HA/mg de tejido, mientras que los tumores desarrollados a partir de células CT26/HAS3 de alto contenido de HA tenían 1087 ± 126 ng de HA/mg de tejido.
B. Generación de un modelo de ratón con tumor pancreático singénico con alto contenido de hialuronano (HA)
1. Generación de una línea celular MH194/HAS3 con alto contenido de hialuronano (HA)
Las células de carcinoma pancreático de ratón MH194 (derivadas del modelo de ratón modificado genéticamente KrasLSL.G12D/+p53R172H/+PdxCretg/+) se modificaron para que expresaran constitutivamente la hialuronano sintetasa humana 3 (HAS3) como en el Ejemplo 1A. Las células transducidas establemente, denominadas células MH194/HAS3, se seleccionaron mediante tratamiento con higromicina. Las células MH194/HAS3 y MH194 parentales se mantuvieron en cultivo de tejidos como una monocapa adherente en medio DMEM con un suplemento de L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10% a 37°C y 5% de CO2.
2. Aislamiento e inmortalización de células estrelladas pancreáticas
El páncreas de los ratones C57BL/6 se picó con cuchillas de afeitar y se colocó en 2 mL de un tampón de digestión que contenía colagenasa P al 0,05%, ADNasa al 0,1% y pronasa al 0,02% en la solución salina equilibrada de Gey (GBSS). Después de dos incubaciones de digestión de 15 minutos a 37°C con un mezclado exhaustivo después de cada incubación, la suspensión celular resultante se filtró a través de una malla de nailon de 100 pm, se lavó dos veces en GBSS con albúmina de suero bovino (BSA) al 0,3% y se resuspendió en 10 mL de GBSS/BSA. Se añadieron ocho mL de Histodenz (Sigma, Núm. de catálogo D2158) a la suspensión celular, y todo el volumen se pipeteó bajo 6 mL de GBSS/BSA para generar un gradiente de densidad discontinua. Después de la centrifugación durante 20 minutos a 1.400 g con el freno puesto a cero, las células deseadas se recolectaron de la interfase entre los dos volúmenes de densidad y se lavaron una vez con PBS y una vez con medio DMEM suplementado con L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10%, y anfotericina B al 1% (DMEM completa). Las células se inmortalizaron utilizando Lenti-SV40 (Capital Biosciences, Núm. de catálogo CIP-0011) utilizando el protocolo del fabricante. La línea celular resultante, denominada PSC4, se mantuvo en cultivo de tejidos como una monocapa adherente en DMEM completo a 37°C y 5% de CO2.
3. Generación de un modelo de tumor MH194/HAS3 singénico
Las células MH194/HAS3 descritas en la parte A anterior se recogieron con tripsina a una confluencia de 80-90%, se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) estéril y se diluyeron con HBSS a una concentración de 4 x 106 células/mL. Se obtuvieron ratones C57BL/6 macho a las 4-6 semanas de Taconic Farms y se alojaron 4/jaula. Para las inoculaciones de tumores, a los ratones se les inyectaron 50 pL de suspensión celular que contenía 2 x 105 Células MH194/HAS3 o células MH194 parentales junto con 5 x 105 PSC4 (7 x 105 células totales) intramuscularmente, adyacentes al periostio tibial derecho.
Los volúmenes tumorales se midieron por ultrasonido como en el Ejemplo 1A2. Se analizaron aproximadamente 15­ 30 fotogramas de 150-200 fotogramas y se calculó el volumen de tumor y se expresó en mm3. Cuando se utilizó el procedimiento de cuantificación de HA descrito en el Ejemplo 1A3, los tumores desarrollados a partir de células PS194+MH194 parentales contenían 263 ± 16 ng de HA/mg de tejido, mientras que los tumores desarrollados a partir de células MH194/HAS3+PSC4 contenían 1783 ± 99 ng de HA/mg de tejido.
Ejemplo 2
Generación de un modelo de ratón con tumor de xenoinjerto humano de alto contenido de HA
A. Generación de la línea celular SKOV3/HAS2 con alto contenido de hialuronano (HA)
Se modificaron células de cáncer de ovario humano SKOV3 (ATCC, Núm. de catálogo HTB-77) para expresar de forma constitutiva la hialuronano sintetasa humana 2 (HAS2). Se insertó el ADNc de HAS2 (SEQ ID NO: 317) entre los sitios de restricción Xbal y MluI dentro del sitio de clonación múltiple del vector de lentivirus pLV-EF1a-MCS-IRES-Hyg (BioSettia, Inc.; SEQ ID NO: 3) para generar el vector pLV-EF1a-hHAS2-IRES-Hyg. Las células SKOV3 se infectaron con el vector resultante. Las células transducidas establemente, denominadas células SKOV3/HAS2, se seleccionaron mediante tratamiento con higromicina. Las células SKOV3/HAS2 se mantuvieron en cultivo de tejidos como una monocapa adherente en medio 5A de McCoy con un suplemento de L-glutamina 2 mM y suero bovino fetal al 10% a 37°C y 5% de CO2.
B. Modelo de ratón con tumor de xenoinjerto SKOV3/HAS2
Las células SKOV3/HAS2, descritas en la parte A anterior, se recogieron con tripsina a una confluencia de 80-90%; se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) estéril y se diluyeron con HBSS a una concentración de 100 x 106 células/mL. Se obtuvieron ratones hembra atímicos (nu/nu) a las 4-6 semanas de Taconic Farms y se alojaron 4/jaula. Para las inoculaciones de tumores, a los ratones se les inyectaron 50 pL de suspensión celular (5x 106 células totales) intramuscularmente, adyacentes al periostio tibial derecho. Los volúmenes tumorales se midieron como se describe en el Ejemplo 1B anterior.
Utilizando el procedimiento de cuantificación de HA descrito en el Ejemplo 1A3, los tumores desarrollados a partir de células SKOV3/HAS2 contenían 2343 ± 199 ng de HA/mg de tejido.
Ejemplo 3
Producción y purificación de PH20 humana recombinante (rHuPH20)
A. Generación de una línea celular que expresa rHuPH20 soluble inicial
Las células de ovario de hámster chino (CHO) se transfectaron con el plásmido HZ24 (expuesto en SEQ ID NO: 4). El vector plasmídico HZ24 para la expresión de rHuPH20 soluble contiene un esqueleto del vector pCI (Promega), ADN que codifica los aminoácidos 1-482 de la hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO: 5), un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) del virus ECMV ( Clontech), y el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) del ratón. El esqueleto del vector pCI también incluye el gen de resistencia a la ampicilina (AmpR), un origen de replicación de fl, una región de potenciador/promotor temprano inmediato de Citomegalovirus (CMV), un intrón quimérico y una señal de poliadenilación tardía de SV40 (SV40). El ADN que codifica la construcción de rHuPH20 soluble contiene un sitio NheI y una secuencia consenso de Kozak antes del ADN que codifica la metionina en la posición de aminoácido 1 de la secuencia de señal de 35 aminoácidos nativa de la PH20 humana, y un codón de parada que sigue al ADN que codifica la tirosina. correspondiente a la posición de aminoácido 482 de la hialuronidasa PH20 humana expuesta en SEQ ID NO: 6), seguido de un sitio de restricción BamHI. La construcción pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24), por lo tanto, da como resultado una única especie de ARNm dirigida por el promotor de CMV que codifica los aminoácidos 1-482 de PH20 humana (expuesta en SEQ ID NO: 7) y los aminoácidos 1-186 de la dihidrofolato reductasa de ratón (expuesta en SEQ ID NO: 8) separados por el sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
Las células CHO no transfectadas que crecían en medios CD-CHO modificados de GIBCO para células DHFR(-), con un suplemento de glutamina 4 mM y 18 mL/L de Pluronic F68/L (Gibco), se sembraron a 0,5 x 106 células/mL en un matraz oscilante en preparación para la transfección. Las células se cultivaron a 37°C en 5% de CO2 en una incubadora humidificada, con movimiento oscilante a 120 rpm. Las células CHO no transfectadas en crecimiento exponencial se sometieron a prueba para determinar la viabilidad antes de la transfección.
Se sedimentaron sesenta millones de 7 células viables del cultivo de células CHO no transfectadas y J se resuspendieron a una densidad de 2 x 10 células en 0,7 mL de tampón de transfección 2x (2x HeBS: HEPES 40 mM, pH 7,0, NaCl 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1,4 mM, dextrosa 12 mM). A cada alícuota de células resuspendidas, se le añadieron 0,09 mL (250 pg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado por medio de digestión durante la noche con ClaI (New England Biolabs)), y las soluciones de células/ADN se transfirieron a cubetas de electroporación BTX con una ranura de 0,4 cm (Gentronics) a temperatura ambiente. Se realizó una electroporación de control negativa sin ADN plasmídico mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmidos se sometieron a electroporación con una descarga de condensador de 330 V y 960 pF o a 350 V y 960 pF.
Las células se retiraron de las cubetas después de la electroporación y se transfirieron a 5 mL de medio CD-CHO modificado para células DHFR(-), se les añadió un suplemento de glutamina 4 mM y 18 mL/L de Pluronic F68/L (Gibco), y se dejaron crecer un pocillo de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos sin selección durante 2 días a 37°C en 5% de CO2 en una incubadora humidificada.
Dos días después de la electroporación, se retiraron 0,5 mL de medio de cultivo de tejido de cada pocillo y se sometieron a prueba para determinar la presencia de actividad hialuronidasa utilizando el ensayo de microturbidez descrito en el Ejemplo 4. Se recogieron células que expresaban los niveles más altos de actividad hialuronidasa del pocillo de cultivo de tejido, se sometieron a recuento y se diluyeron de 1 x 104 a 2 x 104 células viables por mL. Se transfirió una alícuota de 0,1 mL de la suspensión celular a cada pocillo de cinco placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos. Se agregaron cien microlitros de medio CD-CHO (GIBCO) que contenía GlutaMAX™-1 4 mM (GIBCO™, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de hipoxantina y timidina a los pocillos que contenían las células (volumen final: 0,2 mL).
Se identificaron diez clones de las 5 placas cultivadas sin metotrexato. Seis de estos clones HZ24 se expandieron en cultivo y se transfirieron a matraces oscilantes en forma de suspensiones de células individuales. Los clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 y 4D10 se colocaron en placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos utilizando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la que las células se diluyeron 1:2 hacia abajo en la placa y 1:3 transversalmente en la placa. comenzando en 5.000 células en el pocillo superior izquierdo. Los clones diluidos se cultivaron en un fondo de 500 células DG44 CHO no transfectadas por pocilio, para proporcionar los factores de crecimiento necesarios para los días iniciales al cultivo. Se prepararon diez placas por subclón, con 5 placas que contenían metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.
El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM). Se midió la actividad hialuronidasa significativa en los sobrenadantes de 8 de los 24 subclones (> 50 Unidades/mL), y estos 8 subclones se expandieron en matraces de cultivo de tejidos T-25. Los clones aislados del protocolo de tratamiento con metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. El clon 3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM en matraces oscilantes y dio lugar a clones que produjeron más de 1.000 Unidades/mL de actividad hialuronidasa (clon 3D35M; o Geni 3D35M). Después se preparó un banco de células maestras (MCB) de las células 3D35M.
B. Generación de una línea celular de segunda generación que expresa rHuPH20 soluble
La línea celular Gen1 3D35M, descrita en la parte A anterior, se adaptó a niveles más altos de metotrexato para producir clones de generación 2 (Gen2). Se sembraron células 3D35M a partir de cultivos que contenían metotrexato establecidos en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 1,0 pM. Las células se adaptaron a un nivel más alto de metotrexato haciéndolas crecer y pasándolas 9 veces durante un período de 46 días en una incubadora humidificada a 37°C, 7% de CO2. La población de células amplificada se clonó mediante dilución limitante en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contenían medio con metotrexato 2,0 pM. Después de aproximadamente 4 semanas, se identificaron los clones y se seleccionó el clon 3E10B para la expansión. Las células 3E10B se hicieron crecer en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 2,0 pM durante 20 pases. Se creó un banco de células maestras (MCB) de la línea celular 3E10B y se congeló y se utilizó para estudios posteriores.
La amplificación de la línea celular continuó cultivando células 3E10B en medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 4,0 pM. Después del 12o pase, las células se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB). Se descongeló un vial de RCB y se cultivó en un medio que contenía metotrexato 8.0 pM. Después de 5 días, la concentración de metotrexato en el medio se incrementó a 16,0 pM, a continuación se aumentó a 20,0 pM 18 días después. Las células del 8o pase en medio que contenía metotrexato 20,0 pM se clonaron mediante dilución limitante en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos que contenían medio CD CHO que contenía GlutaMAX-1™ 4 mM y metotrexato 20,0 pM. Los clones se identificaron 5-6 semanas más tarde y el clon 2B2 se seleccionó para la expansión en un medio que contenía metotrexato 20,0 pM. Después del 11° pase, las células 2B2 se congelaron en viales como banco de células de investigación (RCB).
Las células 2B2 resultantes son células DG44 CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20). La PH20 soluble está presente en las células 2B2 a un número de copias de aproximadamente 206 copias/célula. El análisis de transferencia Southern del ADN genómico de las células 2B2 digeridas con Spel, Xbal y BamHI/HindlII utilizando una sonda específica para rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión con enzimas de restricción: una banda de hibridación principal de ~7,7 kb y cuatro bandas de hibridación menores (~13,9, ~6,6, ~5,7 y ~4,6 kb) con ADN digerido con Spel; una banda de hibridación principal de ~5 kb y dos bandas de hibridación menor (~13,9 y ~6,5 kb) con ADN digerido con Xbal; y una única banda de hibridación de ~1,4 kb observada utilizando ADN de 2B2 digerido con BamHI/HindlII. El análisis de la secuencia del transcrito de ARNm indicó que el ADNc derivado (SEQ ID NO: 9) era idéntico a la secuencia de referencia (SEQ ID NO: 5) excepto por una diferencia en un par de bases en la posición 1.131, que se observó que era una timidina (T) en lugar de la citosina esperada (C). Esta es una mutación silenciosa, sin efecto sobre la secuencia de aminoácidos.
C. Producción de rHuPH20 soluble de Gen 2 en 300 L de cultivo celular con biorreactor
Se descongeló un vial de células HZ24-2B2 (descrito en la parte B anterior) y se expandió desde matraces oscilantes a través de matraces giratorios de 36 L en medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un suplemento de metotrexato 20 pM y GlutaMAX-1™ (Invitrogen ). Brevemente, se descongeló un vial de células en un baño de agua a 37°C, se añadió medio y se centrifugaron las células. Las células se resuspendieron en un matraz oscilante de 125 mL con 20 mL de medio de nueva aportación y se colocaron en una incubadora a 37°C, 7% de CO2. El volumen se aumentó a 40 mL en el matraz oscilante de 125 mL. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 125 mL en un volumen de cultivo de 100 mL. El matraz fue incubado a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 250 mL en un volumen de cultivo de 200 mL y el matraz se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 1 L en un volumen de cultivo de 800 mL y se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz giratorio de 6 L en un volumen de cultivo de 5.000 mL y se incubó a 37°C, 7% de CO2. Cuando la densidad celular alcanzó más de 1,5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz de 36 L en un volumen de cultivo de 32 L y se incubó a 37°C, 7% de CO2.
S e e s te r il iz ó un re a c to r d e 400 L y s e le a ñ a d ie ro n 230 m L d e m e d io C D -C H O . A n te s d e su u so , e l re a c to r fu e re v is a d o p a ra v e r i f ic a r la p re s e n c ia d e c o n ta m in a c ió n . S e tra n s f ir ie ro n a p ro x im a d a m e n te 30 L d e c é lu la s d e lo s m a tra c e s g ira to r io s d e 36 L a l b io r re a c to r d e 400 L (B ra u n ) a u n a d e n s id a d d e in o c u la c ió n d e 4 ,0 x 105 c é lu la s v ia b le s p o r m L y un v o lu m e n to ta l d e 260 L. L o s p a rá m e tro s fu e ro n e l p u n to d e a ju s te d e la te m p e ra tu ra , 37 °C ; V e lo c id a d d e l im p u ls o r 40 -55 R P M ; P re s ió n d e l R e c ip ie n te : 0 ,20 a tm ; P u rg a d o d e a ire 0 ,5 -1 ,5 L /M in .; S u p e rp o s ic ió n d e a ire : 3 L /m in . S e to m a ro n m u e s tra s d e l re a c to r d ia r ia m e n te p a ra lo s re c u e n to s c e lu la re s , la v e r i f ic a c ió n d e l pH , el a n á lis is d e l m e d io , la p ro d u c c ió n d e p ro te ín a s y la re te n c ió n . A d e m á s , d u ra n te la e je c u c ió n , s e a ñ a d ie ro n a l im e n ta c io n e s d e n u tr ie n te s . A la s 120 h (d ía 5), s e a ñ a d ie ro n 10 ,4 L d e m e d io d e a lim e n ta c ió n n ú m . 1 (4 x C D -C H O 33 g /L g lu c o s a 160 m L /L G lu ta M A X -1 ™ 83 m L /L Y e a s to la te 33 m g /L in s u lin a rH u ). A la s 168 h o ra s (d ía 7 ), s e a ñ a d ie ro n 10 ,8 lit ro s d e A lim e n ta c ió n n ú m . 2 (2 x C D -C H O 33 g /L d e g lu c o s a 80 m L /L d e G lu ta M A X -1 ™ 167 m L /L d e Y e a s to la te 0 ,92 g /L d e b u t ira to d e s o d io ) a ñ a d id o , y la te m p e ra tu ra d e c u lt iv o s e re d u jo a 36 ,5 °C . A la s 216 h o ra s (d ía 9), s e a ñ a d ie ro n 10 ,8 litro s d e a lim e n ta c ió n n ú m . 3 (1 x C D -C H O 50 g /L d e g lu c o s a 50 m L /L d e G lu ta M A X -1 ™ 250 m L /L d e Y e a s to la te 1 ,80 g /L d e b u tira to d e s o d io ), y la te m p e ra tu ra d e c u lt iv o s e re d u jo a 36 °C . A la s 264 h o ra s (d ía 11 ), s e a ñ a d ie ro n 10 ,8 lit ro s d e a lim e n ta c ió n n ú m . 4 (1 x C D -C H O 33 g /L d e g lu c o s a 33 m L /L d e G lu ta M A X -1 ™ 250 m L /L d e Y e a s to la te 0 ,92 g /L d e b u t ira to d e s o d io ), y la te m p e ra tu ra d e c u lt iv o se re d u jo a 35 ,5 °C . S e o b s e rv ó q u e la a d ic ió n d e lo s m e d io s d e a lim e n ta c ió n m e jo ra b a d rá s t ic a m e n te la p ro d u c c ió n d e rH u P H 20 s o lu b le en la s e ta p a s f in a le s d e p ro d u c c ió n . S e re c o g ió la c o s e c h a d e l r e a c to r a lo s 14 o 15 d ía s o c u a n d o la v ia b il id a d d e la s c é lu la s c a y ó p o r d e b a jo d e 40 % . El p ro c e s o d io c o m o re s u lta d o u n a p ro d u c t iv id a d f in a l d e 17.000 u n id a d e s p o r m L c o n u n a d e n s id a d c e lu la r m á x im a d e 12 m illo n e s d e c é lu la s /m L . E n la c o s e c h a , s e to m a ro n m u e s tra s d e l c u lt iv o p a ra d e te c ta r m ic o p la s m a , c a rg a b io ló g ic a , e n d o to x in a y v iru s in v itro e in vivo, M ic ro s c o p ía e le c tró n ic a d e tra n s m is ió n (T E M ) y a c t iv id a d e n z im á tic a .
E l c u lt iv o s e b o m b e ó p o r m e d io d e u n a b o m b a p e r is tá lt ic a a t ra v é s d e c u a tro m ó d u lo s d e l s is te m a d e f ilt ra c ió n M ill is ta k (M ill ip o re ) en p a ra le lo , c o n te n ie n d o c a d a u n o d e lo s c u a le s u n a c a p a d e t ie r ra d e d ia to m e a s g ra d u a d a a 4 -8 | jm y u n a c a p a d e t ie r ra d e d ia to m e a s g ra d u a d a a 1 ,4 -1 ,1 jm , s e g u id o d e u n a m e m b ra n a d e c e lu lo s a , a c o n t in u a c ió n a tra v é s d e un s e g u n d o s is te m a d e f i lt r a c ió n M ill is ta k (M ill ip o re ) ú n ic o q u e c o n te n ía u n a c a p a d e t ie r ra d e d ia to m e a s g ra d u a d a a 0 ,4 -0 ,11 j m y u n a c a p a d e t ie r ra d e d ia to m e a s g ra d u a d a a <0 ,1 jm , s e g u id o d e u n a m e m b ra n a d e c e lu lo s a y a c o n t in u a c ió n a t ra v é s d e un f i lt r o d e 0 ,22 j m f in a l en u n a b o ls a f le x ib le e s té r il d e un s o lo u s o c o n u n a c a p a c id a d d e 350 L. E l f lu id o d e c u lt iv o c e lu la r re c o g id o s e c o m p le m e n tó c o n E D T A 10 m M y T r is 10 m M a un pH d e 7 ,5. E l c u lt iv o s e c o n c e n tró 10 x c o n un a p a ra to d e f i lt r a c ió n d e f lu jo ta n g e n c ia l (T F F ) u t i l iz a n d o c u a tro f i l t r o s d e p o lie te rs u lfo n a (P E S ) (S a r to r iu s ) d e c o r te d e p e s o m o le c u la r (P M C ) d e 30 kD a , s e g u id o d e un in te rc a m b io d e ta m p ó n 10 x c o n T r is 10 m M , N a 2S O 420 m M , pH 7 ,5 en un f i lt ro f in a l d e 0 ,22 j m en u n a b o ls a d e a lm a c e n a m ie n to e s té r il d e 50 L.
S e d e s a c tiv a ro n lo s v iru s d e la c o s e c h a c o n c e n tra d a , s o m e tid a a d ia f i lt ra c ió n . A n te s d e la in a c t iv a c ió n v ira l, se p re p a ró u n a s o lu c ió n d e T r ito n X -100 a l 10% , fo s fa to d e t r i(n -b u t i lo ) (T N B P ) a l 3 % . L a c o s e c h a c o n c e n tra d a , s o m e tid a a d ia f i lt ra c ió n s e e x p u s o a T r ito n X -100 a l 1% , T N B P a l 0 ,3 % d u ra n te 1 h o ra en un re c ip ie n te d e re a c c ió n d e v id r io d e 36 L in m e d ia ta m e n te a n te s d e la p u r if ic a c ió n en la c o lu m n a Q.
D. Purificación de rHuPH20 soluble Gen2
S e p re p a ró u n a c o lu m n a d e in te rc a m b io ió n ic o d e Q S e fa ro s a (P h a rm a c ia ) (9 L d e re s in a , H = 29 cm , D = 20 cm ). S e re c o g ie ro n m u e s tra s d e la v a d o p a ra d e te rm in a r e l pH , la c o n d u c t iv id a d y e l e n s a y o d e e n d o to x in a s (L A L ). La c o lu m n a s e e q u ilib ró c o n 5 v o lú m e n e s d e c o lu m n a d e T r is 10 m M , N a 2S O 4 20 m M , pH 7 ,5. D e s p u é s d e la in a c t iv a c ió n v ira l, la c o s e c h a c o n c e n tra d a , s o m e tid a a d ia f i lt ra c ió n (d e s c r ita en la p a rte C a n te r io r ) s e c a rg ó s o b re la c o lu m n a Q a u n a v e lo c id a d d e f lu jo d e 100 c m /h o ra . L a c o lu m n a s e la v ó co n 5 v o lú m e n e s d e c o lu m n a d e T r is 10 m M , N a 2S O 4 20 m M , pH 7 ,5 y H E P E S 10 m M , N a C l 50 m M , pH 7 ,0. L a p ro te ín a s e h iz o e lu ir c o n H E P E S 10 m M , N a C l 400 m M , pH 7 ,0 en un f i lt r o f in a l d e 0 ,22 j m en u n a b o ls a e s té r il. L a m u e s tra d e p ro d u c to e lu id o s e s o m e tió a p ru e b a p a ra d e te rm in a r la c a rg a b io ló g ic a , la c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a s y la a c t iv id a d h ia lu ro n id a s a . S e to m a ro n le c tu ra s d e la a b s o rb a n c ia A 280 a l p r in c ip io y a l f in a l d e l in te rc a m b io .
A c o n t in u a c ió n s e re a liz ó la c ro m a to g ra fía d e in te ra c c ió n h id ró fo b a d e F e n il-S e fa ro s a (P h a rm a c ia ) . S e p re p a ró u n a c o lu m n a d e F e n il-S e fa ro s a (P S ) (19 -21 L d e re s in a , H = 29 cm , D = 30 cm ). S e re c o g ió e l la v a d o y s e to m a ro n m u e s tra s p a ra d e te rm in a r e l pH , la c o n d u c t iv id a d y la s e n d o to x in a s (e n s a y o L A L ). L a c o lu m n a s e e q u ilib ró co n 5 v o lú m e n e s d e c o lu m n a d e fo s fa to d e p o ta s io 5 m M , s u lfa to d e a m o n io 0 ,5 M , C a C l2 0 ,1 m M , pH 7 ,0. E l p ro d u c to e lu id o d e p ro te ín a s d e la c o lu m n a Q S e fa ro s a s e c o m p le m e n tó c o n s o lu c io n e s d e p a r t id a d e s u lfa to d e a m o n io 2 M, fo s fa to d e p o ta s io 1 M y C a C l2 1 M p a ra o b te n e r c o n c e n tra c io n e s f in a le s d e 5 m M , 0 ,5 M y 0,1 m M , re s p e c t iv a m e n te . L a p ro te ín a s e c a rg ó en la c o lu m n a d e P S a u n a v e lo c id a d d e f lu jo d e 100 c m /h o ra y s e re c o g ió e l f lu jo d e la c o lu m n a . L a c o lu m n a s e la v ó co n fo s fa to d e p o ta s io 5 m M , s u lfa to d e a m o n io 0 ,5 M y C a C h 0,1 m M pH 7 ,0 a 100 c m /h o ra y e l la v a d o s e a ñ a d ió a l f lu jo d ire c to re c o g id o . C o m b in a d o c o n e l la v a d o d e la c o lu m n a , e l f lu jo d ire c to se h iz o p a s a r a t ra v é s d e un f i lt r o f in a l d e 0 ,22 j m a u n a b o ls a e s té r il. S e to m a ro n m u e s tra s d e l f lu jo d ire c to p a ra d e te rm in a r la c a rg a b io ló g ic a , la c o n c e n tra c ió n d e p ro te ín a s y la a c t iv id a d e n z im á tic a .
S e p re p a ró u n a c o lu m n a d e b o ro n a to d e a m in o fe n ilo (P ro M e d ic s ) . S e re c o g ió e l la v a d o y s e to m a ro n m u e s tra s p a ra determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M. El flujo directo de PS que contenía la proteína purificada se cargó sobre la columna de boronato de aminofenilo a una velocidad de flujo de 100 cm/hora. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 7,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, sulfato de amonio 0,5 M, pH 9,0. La columna se lavó con bicina 20 mM, cloruro sódico 100 mM, pH 9,0. La proteína se hizo eluir con HEPEs 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,9 y se hizo pasar a través de un filtro estéril a una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a prueba para determinar la carga biológica, la concentración de proteínas y la actividad enzimática.
Se preparó la columna de hidroxiapatita (HAP) (Bio-Rad). El lavado se recogió y se sometió a prueba para determinar el pH, la conductividad y las endotoxinas (ensayo LAL). La columna se equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl20,1 mM, pH 7,0. La proteína purificada con boronato de aminofenilo se complementó con concentraciones finales de fosfato de potasio 5 mM y CaCl20,1 m y se cargó en la columna HAP a una velocidad de flujo de 100 cm/hora. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0,1 mM. La columna se lavó a continuación con fosfato de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl20,1 mM. La proteína se hizo eluir con fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 y se hizo pasar a través de un filtro estéril de 0,22 pm a una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a prueba para determinar la carga biológica, la concentración de proteínas y la actividad enzimática.
La proteína purificada por HAP se hizo pasar a continuación a través de un filtro de eliminación de virus. El filtro Virosart® esterilizado (Sartorius) se preparó primero lavando con 2 L de fosfato potásico 70 mM, pH 7,0. Antes del uso, se tomaron muestras del tampón filtrado para determinar el pH y la conductividad. La proteína purificada por HAP se bombeó a través de una bomba peristáltica a través del filtro de eliminación de virus 20 nM. La proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7,0 se hizo pasar a través de un filtro final de 0,22 pm a una bolsa estéril. La muestra sometida a filtración de virus se analizó para determinar la concentración de proteínas, la actividad enzimática, el oligosacárido, el monosacárido y el perfilado de ácido siálico. La muestra también se analizó para detectar impurezas relacionadas con el procedimiento.
Ejemplo 4
Determinación de la actividad de hialuronidasa de rHuPH20 soluble
Se determinó la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble en muestras tales como cultivos celulares, plasma, fracciones de purificación y soluciones purificadas mediante un ensayo turbidimétrico, que se basaba en la formación de un producto precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico se une con la albúmina sérica, o un ensayo de sustrato de ácido hialurónico biotinilado, que mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activas mediante la digestión del sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) unido de forma no covalente a placas de microtitulación de múltiples pocillos de plástico.
A. Ensayo de microturbidez
La actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble se mide incubando rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) durante un período de tiempo establecido (10 minutos) y a continuación precipitando el hialuronato de sodio no digerido con la adición de albúmina sérica acidulada. La turbidez de la muestra resultante se mide a 640 nm después de un período de desarrollo de 30 minutos. La disminución de la turbidez resultante de la actividad enzimática sobre el sustrato de hialuronato de sodio es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de trabajo del ensayo de rHuPH20 soluble, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan en relación con esta curva de calibración.
Las diluciones de la muestra se prepararon en Soluciones Diluyentes de Enzimas. La Solución Diluyente de Enzima se preparó disolviendo 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolizada en 25,0 mL del Tampón de Reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM, PIPES 50 mM, pH 5,5) y 25,0 mL de agua estéril para inyectables (SWFI), y diluyendo 0,2 mL de solución de Buminate al 25% en la mezcla y sometiendo a agitación vorticial durante 30 segundos. Esto se realizó dentro del margen de 2 horas antes del uso y se almacenó en hielo hasta que fue necesario. Las muestras se diluyeron a 1-2 U/mL estimadas. En general, la dilución máxima por etapa no excedió 1:100 y el tamaño inicial de la muestra para la primera dilución no fue inferior a 20 pL. Los volúmenes de muestra mínimos necesarios para realizar el ensayo fueron los siguientes: Muestras en proceso, Fracciones de FPLC: 80 pL; Sobrenadantes de cultivo de tejidos: 1 mL; Material concentrado: 80 pL; Material de la etapa final o purificado: 80 pL. Las diluciones se realizaron por triplicado en una placa de 96 pocillos de Baja Unión a Proteína y se transfirieron 30 pl de cada dilución a las placas de fondo transparente/negro Optilux (BD BioSciences).
Se prepararon diluciones de rHuPH20 soluble conocida con una concentración de 2,5 U/mL en Solución Diluyente de Enzima para generar una curva patrón y se añadieron a la placa Optilux por triplicado. Las diluciones incluyeron 0 U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL y 2,5 U/mL. Los pocillos de "Blanco reactivo" que contenían 60 pL de Solución Diluyente de Enzima se incluyeron en la placa como control negativo. A continuación se cubrió la placa y se calentó sobre un bloque térmico durante 5 minutos a 37°C. Se retiró la cubierta y se agitó la placa durante 10 segundos. Después de someter a movimiento oscilante, la placa se devolvió al bloque térmico y el Dispositivo de Manejo de Líquidos MULTIDROP 384 se cebó con la solución tibia de hialuronato de sodio de 0,25 mg/mL (preparada disolviendo 100 mg de hialuronato de sodio (LifeCore Biomedical) en 20,0 mL de SWFI. Esto se mezcló girando suavemente y/o meciendo a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta que estuvo completamente disuelto). La placa de reacción se transfirió al MULTIDROP 384 y la reacción se inició al presionar la tecla de inicio para dispensar 30 pL de hialuronato de sodio en cada pocillo. Después se retiró la placa del MULTIDROP 384 y se sometió a movimiento oscilante durante 10 segundos antes de transferirla a un bloque térmico con la cubierta de la placa reemplazada. La placa se incubó a 37°C durante 10 minutos.
El MULTIDROP 384 se preparó para detener la reacción cebando la máquina con la Solución de Trabajo de Suero y cambiando el ajuste de volumen a 240 pL (25 mL de Solución de Partida de Suero [1 volumen de Suero de Caballo (Sigma) se diluyó con 9 volúmenes de Solución de Tampón Acetato 500 mM y el pH se ajustó a 3,1 con ácido clorhídrico] (en 75 mL de Solución de Tampón Acetato 500 mM). La placa se retiró del bloque térmico y se colocó en el MULTIDROP 384, y se dispensaron 240 pL de Solución de Trabajo de suero en los pocillos. La placa se retiró y se sometió a movimiento oscilante sobre un lector de placas durante 10 segundos. Después de otros 15 minutos, se midió la turbidez de las muestras a 640 nm y se determinó la actividad hialuronidasa (en U/mL) de cada muestra ajustándola a la curva patrón.
La actividad específica (Unidades/mg) se calculó dividiendo la actividad hialuronidasa (U/mL) por la concentración de proteína (mg/mL).
B. Ensayo de hialuronano biotinilado
El ensayo de ácido hialurónico biotinilado mide la cantidad de rHuPH20 o PEGPH20 enzimáticamente activas en muestras biológicas mediante la digestión de un sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) de elevado peso molecular (~ 1,2 megadalton) unido de forma no covalente a placas de microtitulación de múltiples pocillos. La rHuPH20 o la PEGPH20 en los patrones y las muestras se dejan incubando en una placa recubierta con b-HA a 37°C. Después de una serie de lavados, el b-HA no escindido/unido restante se trata con producto conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante (SA-HRP). La reacción entre SA-HRP inmovilizado y el sustrato cromogénico, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), produce una solución de color azul. Después de detener la reacción con ácido, se determina la formación del producto de reacción amarillo soluble leyendo la absorbancia a 450 nm utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La disminución de la absorbancia a 450 nm que resulta de la actividad de la enzima en el sustrato de ácido hialurónico biotinilado (b-HA) es una medida de la actividad hialuronidasa de rHuPH20 soluble. El método se realiza utilizando una curva de calibración generada con diluciones de un patrón de referencia de rHuPH20 soluble o PEGPH20, y las mediciones de la actividad de la muestra se realizan en relación con esta curva de calibración.
Las diluciones de la muestra y el calibrador se prepararon en Diluyente de Ensayo. El Diluyente de Ensayo se preparó agregando un 1% v/v de plasma reunido (de la especie apropiada) a un bSa al 0,1% (p/v) en HEPES, pH 7,4. Esto se preparó diariamente y se almacenó a 2-8°C. Dependiendo del tipo de especie, así como del nivel de hialuronidasa previsto, se prepararon diluciones simples o múltiples para garantizar que al menos una dilución de la muestra caería dentro del intervalo de la curva de calibración. Para guiar la selección de las diluciones de la muestra de prueba, se utilizó información conocida sobre la dosis de hialuronidasa administrada, la vía de administración, el volumen de plasma aproximado de la especie y el momento puntual para estimar los niveles de actividad hialuronidasa. Cada dilución de la muestra se mezcló a medida que se preparaba mediante un breve pulso de agitación vorticial y se cambiaron las puntas de las pipetas entre cada dilución. En general, las diluciones comenzaron con una dilución inicial de 50 o 100 veces seguidas por diluciones en serie adicionales. Se preparó una curva de calibración de siete puntos de rHuPH20 o PEGPH20 (dependiendo del tratamiento administrado) con una concentración que oscilaba entre 0,004 y 3,0 U/mL para rHuPH20 y entre 0,037 y 27 U/mL para PEg Ph20. Se aplicaron cien microlitros (100 pL) de cada dilución de la muestra de prueba y el punto de la curva de calibración a pocillos por triplicado de una placa de microtitulación de 96 pocillos (Immulon 4HBX, Thermo) que se había recubierto previamente con 100 pL por pocillo de b-HA 0,1 mg/mL y se bloquearon con 250 pl de albúmina de suero bovino al 1,0% (p/v) en PBS. Las placas se cubrieron con un sello de placa adhesivo y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 90 minutos. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 pL por pocillo de Tampón de Lavado (tampón fosfato 10 mM, cloruro potásico 2,7 mM, cloruro de sodio 137 mM, pH 7,4, con Tween 20 al 0,05% (v/v), PBST) utilizando un lavador de placas automático (BioTek ELx405 Select CW, Programa '4HBX1'). Se añadieron cien microlitros de Solución de Trabajo de producto conjugado de estreptavidina-HRP [producto conjugado de estreptavidina-HRP (1:5.000 v/v) en Tris-HCl 20 mM, cloruro de sodio 137 mM, Tween 20 al 0,025% (v/v), albúmina de suero bovino al 0,1% (w/v)] por pocillo. La placa se selló y se dejó incubando a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 minutos sin movimiento oscilante y se protegió de la luz. Al final del período de incubación, el sello adhesivo se retiró de la placa, las muestras se aspiraron y la placa se lavó cinco (5) veces con 300 pL por pocillo de Tampón de Lavado como se ha descrito anteriormente. Se añadió solución TMB (a temperatura ambiente) a cada pocilio y se dejó incubando protegida de la luz durante aproximadamente cinco (5) minutos a temperatura ambiente. La solución de Parada TMB (KPL, número de catálogo 50-85-06) se agregó a continuación a 100 qL por pocillo. La absorbancia de cada pocillo a 450 nm se determinó utilizando un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La respuesta de la Curva de Calibración en cada placa se modeló mediante un ajuste de curva logística de 4 parámetros. La actividad hialuronidasa de cada incógnita se calculó por interpolación a partir de la curva de calibración, se corrigió por el factor de dilución de la muestra y se refirió en U/mL.
Ejemplo 5
PEGilación de rHuPH20
Se PEGiló rHuPH20 (PEGPH20) por reacción de la enzima con el éster N-hidroxisuccinimidílico lineal del ácido metoxipoli(etilenglicol) butanoico (mPEG-SBA-30K).
A. Conjugación de mPEG-SBA-30K a rHuPH20
Se conjugó covalentemente rHuPH20 (que tiene un tamaño de aproximadamente 60 kDa), generado como se describe en el Ejemplo 3, con un éster N-hidroxisuccinimidílico lineal de ácido metoxipoli(etilenglicol)butanoico (mPEG-SBA-30K), con un peso molecular aproximado de 30 kDa. La estructura de mPEG-SBA se muestra en el esquema 2, a continuación:
Esquema 2
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Los métodos utilizados para preparar el mPEG-SBA-30K que se utilizó para PEGilar la rHuPH20 se describen, por ejemplo, en el documento U.S. 5.672.662. Brevemente, el mPEG-SBA-30K se elabora de acuerdo con el siguiente procedimiento:
Una solución de etilmalonato (2 equivalentes) disuelto en dioxano se añade gota a gota a hidruro de sodio (2 equivalentes) y tolueno bajo una atmósfera de nitrógeno. El metanosulfonato de mPEG (1 equivalente, PM 30 kDa, Shearwater) se disuelve en tolueno y se añade a la mezcla anterior. La mezcla resultante se calienta a reflujo durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se concentra a la mitad de su volumen original, se extrae con una solución acuosa de NaCl al 10%, se extrae con ácido clorhídrico acuoso al 1% y los extractos acuosos se combinan. Las capas acuosas recogidas se extraen con diclorometano (3x) y la capa orgánica se seca con sulfato de magnesio, se filtra y se evapora hasta sequedad. El residuo resultante se disuelve en hidróxido de sodio 1 N que contiene cloruro de sodio y la mezcla se agita durante 1 hora. El pH de la mezcla se ajusta a aproximadamente 3 por adición de ácido clorhídrico 6N. La mezcla se extrae con diclorometano (2x).
La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra, se concentra y se vierte en dietil éter frío. El producto precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío. El compuesto resultante se disuelve en dioxano y se somete a reflujo durante 8 horas y a continuación se concentra hasta sequedad. El residuo resultante se disuelve en agua y se extrae con diclorometano (2x), se seca sobre sulfato de magnesio y la solución se concentra por evaporación rotatoria y a continuación se vierte en dietil éter frío. El producto precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío. El compuesto resultante (1 equivalente) se disuelve en diclorometano y se agrega N-hidroxisuccinimida (2,1 equivalentes). La solución se enfría a 0°C y se añade gota a gota una solución de diciclohexilcarbodiimida (2,1 equivalentes) en diclorometano. La solución se agita a temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. La mezcla de reacción se filtra, se concentra y se precipita en dietil éter. El producto precipitado se recoge por filtración y se seca a vacío para proporcionar mPEG-SBA-30K.
Para elaborar la rHuPH20 PEGilada, se acopló mPEG-SBA-30K al grupo o los grupos amino de rHuPH20 mediante conjugación covalente, proporcionando enlaces amida estables entre rHuPH20 y mPEG, como se muestra en el Esquema 3.
Esquema 3
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Para la conjugación, el mPEG-SBA-30K se añadió en forma de polvo a rHuPH20 (a una concentración de 10 mg/mL en NaCl 130 mM/HEPES 10 mM; pH 7). La razón de PEG:rHuPH20 fue 10:1 (razón molar). Una vez que el PEG se hubo disuelto en el tampón, la solución se filtró en condiciones estériles (Corning 50 mL Filtro para parte superior de tubo, de poliestireno, con membrana de acetato de celulosa de 0,22 qm). La conjugación se llevó a cabo durante la noche, con agitación, a 4°C en una habitación fría.
Después de la conjugación, la solución se concentró, utilizando una membrana TFF de 100.000 PMC, y se intercambió el tampón frente a NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8. El material resultante, que se sometió a prueba para determinar la actividad de la enzima, como se describe en el Ejemplo 4 anterior, se diluyó utilizando NaCl 130 mM/HEPES 10 mM a pH 6,8 para obtener una actividad enzimática final de 100.000 U/mL (correspondiente a aproximadamente 2,5 mg de péptido/mL). Este material de rHuPH20 PEGilada se cargó, en volúmenes de 1 mL, en un vial de vidrio Tipo-1 de 13 mm con sello de bromobutilo y se almacenó congelado (congelado durante la noche en un congelador a -20°C, a continuación se puso en un congelador a -80°C para un almacenamiento más largo).
B. Análisis de rHuPH20 PEGilada
El material rHuPH20 PEGilada se analizó mediante electroforesis en gel. Tres lotes de rHuPH20 PEGilada, elaborados como en la parte A anterior, revelaron un patrón idéntico de bandas múltiples, que representaban PEG sin reaccionar y múltiples especies de productos conjugados de mPEG-rHuPH20, que migraron a diferentes distancias. Según la comparación con la migración de un marcador de peso molecular, las bandas que representaban las especies oscilaron entre aproximadamente 90 kDa y 300 kDa, con tres bandas oscuras que migran por encima del marcador de 240 kDa. Estos datos indicaron que la rHuPH20 PEGilada, generada por la conjugación covalente de mPEG-SBA-30K, contenía una mezcla heterogénea de especies rHuPH20 PEGilada, que probablemente incluían proteínas mono-, di- y tri-PEGiladas. La falta de una banda visible a 60 kDa indica que toda la proteína había reaccionado con PEG y que no había rHuPH20 nativa detectable en la mezcla.
Ejemplo 6
Efecto del anticuerpo anti-CTLA4 y la hialuronidasa en el modelo de ratón de tumor CT26 Singénico con alto contenido de HA
Los ratones que contenían tumores singénicos CT26 con alto contenido de HA se generaron como se describe en el Ejemplo 1A2, y se trataron con la PEGPH20 descrita en el Ejemplo 5 sola o combinada con anti-CTLA4 o controles apropiados de la siguiente manera:
A. Co-Administración de PEGPH20 y Anti-CTLA4
Los ratones que contenían tumores singénicos CT26 con alto contenido de HA, con un volumen tumoral medio de 185 ±24 mm3, se asignaron al azar a grupos de tratamiento, cada uno con 7 ratones, de manera que el volumen medio del tumor de cada grupo era sustancialmente el mismo. Los tratamientos se administraron dos veces a la semana los días 1, 4, 8 y 11, como se indica en la Tabla 11 a continuación. Se administraron PEGPH20 como se describe en el Ejemplo 5 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) por vía intravenosa (IV) y anti-CTLA4 (BioXCell Inc., Núm. de catálogo BE0164), IgG2b de ratón de control de isotipo (BioXCell Inc., Núm. de catálogo BE0086) o solución salina por vía intraperitoneal (IP), todo a los niveles de dosis indicados. Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 3, 7, 10 y 14. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 2.000 mm3, los animales fueron sacrificados por sobredosis de dióxido de carbono.
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Los resultados se presentan en la Tabla 12. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba^™ día)-volumen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo^™ día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Los resultados muestran que los tumores en los animales de control, a los que se administró solución salina sola (Grupo 1) o anticuerpo de control (Grupo 2) mostraron un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. Los tumores en animales a los que se administró PEGPH20 sola (Grupo 3) se redujeron a aproximadamente la mitad del tamaño de los tumores no tratados al finalizar el estudio. Los tumores en animales tratados con anti-CTLA4 a cualquiera de las dosis sometidas a prueba (Grupos 4-6) también se redujeron y en mayor medida que con el tratamiento con PEGPH20. La administración de 2 mg/kg (Grupo 4) y 4 mg/kg (Grupo 5) de anti-CTLA4 produjo una reducción similar en el crecimiento tumoral, con una mayor reducción en el volumen tumoral observada en el grupo al que se habían administrado 8 mg/kg de anti-CTLA4 (Grupo 6). En comparación con los animales tratados con cualquier agente solo, la administración conjunta de PEGPH20 y 4 mg/kg de anti-CTLA4 dio como resultado una mayor reducción en el volumen del tumor. Esta reducción fue mayor que la observada para cualquier otro grupo de tratamiento en los primeros momentos después de la administración, pero el día 14, a medida que el volumen del tumor comenzaba a aumentar, el tamaño del tumor fue sustancialmente el mismo que el observado en los animales a los que se administró la dosis máxima de anti-CTLA4 (8 mg/kg) (Grupo 6).
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B. Comparación de la administración conjunta frente a la administración previa de PEGPH20
Para evaluar los efectos de la administración previa de PEGPH20 antes del tratamiento con anti-CTLA4 en comparación con la administración conjunta de PEGPH20 con anti-CTLA4, se asignaron al azar ratones con tumores CT26/HAS3, con un volumen tumoral medio de 215 ± 32 mm3, en grupos de tratamiento. Cada grupo contenía 9 ratones, de manera que el volumen tumoral medio de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. Los tratamientos administrados para cada grupo se exponen en la Tabla 13 a continuación. Para todos los grupos de tratamiento, PEGPH20 o el tampón API se administraron por vía intravenosa (IV) dos veces por semana los días 1, 4, 8 y 11. A los ratones también se les administró solución salina, control de isotipo de IgG2b de ratón o anti-CTLA4, que se administraron por vía intraperitoneal (IP), a los niveles de dosis indicados en la Tabla 13. A los ratones de los Grupos 4 y 5 se les administró conjuntamente anticuerpo anti-CTLA4 el mismo día que el tratamiento con PEGPH20. Para el Grupo 6, a los ratones se les administró previamente PEGPH20 el día anterior al tratamiento con anti-CTLA4 (días 0, 3, 7 y 10) como se indicó, y se les administró anti-CTLA424 horas después (los días 1, 4, 8 y 11).
Los volúm3enes tumorales se midieron en los días 0, 3, 7, 10 y 14. Cuando los volúmenes tumorales alcanzaron 2.000 mm , los animales fueron sacrificados por sobredosis de dióxido de carbono.
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Los resultados se presentan en la Tabla 14. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volumen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(mediciónenelmomentoinicial)) x 100%. Al igual que en los resultados del estudio anterior, los tumores en los animales de control, la solución salina administrada sola (Grupo 1) o el anticuerpo de control (Grupo 2) mostraron un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. Los tumores en animales a los que se administró PEGPH20 sola (Grupo 3) se redujeron a aproximadamente la mitad del tamaño de los tumores no tratados al finalizar el estudio (p <0,05 para el vehículo). El tamaño promedio del tumor en los animales a los que se administró solo anti-CTLA4 (Grupo 4) también se redujo en comparación con los de los animales de control (p <0,05 para el vehículo). El tamaño promedio del tumor en animales que recibieron PEGPH20 y anti-CTLA4 (Grupos 5 y 6) se redujo aún más en volumen en comparación con los tratamientos individuales. La mayor reducción en el volumen del tumor se observó en animales que recibieron PEGPH20 y anti-CTLA4, donde se administró PEGPH20 24 horas antes de la administración de anti-CTLA4 (Grupo 6) (p = 0,0152 para anti-CTLA4 solo). Los resultados de este estudio muestran que hay una mayor reducción en el crecimiento del tumor cuando se administran PEGPH20 y anti-CTLA4, lo que se potencia al administrar PEGPH20 antes de administrar anti-CTLA4.
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C. Efecto dependiente de la dosis de Anti-CTLA4 Administrado previamente, después y conjuntamente con PEGPH20
Para evaluar el efecto de la administración previa, posterior o conjunta de PEGPH20 con anti-CTLA4, se asignaron al azar ratones que contenían tumores CT26/HAS3, con un volumen tumoral medio de 201 ± 27 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 9 ratones, de modo que el volumen medio del tumor de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. El régimen de dosificación se establece en la Tabla 15. Para todos los grupos de tratamiento, excepto el Grupo 9, la PEGPH20 o el control con tampón API se administraron por vía intravenosa (IV) dos veces por semana los días 1, 4, 8 y 11. A los grupos 4, 5 y 7 también se les administró anti-CTLA4 los días 1, 4, 8 y 11, recibiendo los Grupos 5 y 7 una administración conjunta de 0,0375 mg de PEGPH20 y 1 mg/kg de anti-CTLA4 (Grupo 5) o 4 mg/kg de anti-CTLA4 (Grupo 7). A los ratones de los grupos 6 y 8 se les administró previamente PEGPH20 el día antes del tratamiento con anti-CTLA4 (días 0, 3, 7 y 10), y 24 horas después (los días 1, 4, 8 y 11) se les administraron 1 mg/kg o 4 mg/kg de anti-CTLA4, respectivamente. Para el Grupo 9, se administró PEGPH20 como una administración posterior en la que a los ratones se les administró anti-CTLA4 los días 0, 3, 7 y 10 y, 24 horas después, se les administró PEGPH20 los días 1, 4, 8 y 11.
Se administraron por vía intravenosa (IV) PEGPH20 o el tampón API, y se administraron por vía intraperitoneal (IP) anti-CTLA4, el control de isotipo IgG2b de ratón o la solución salina, todo a los niveles de dosis indicados. Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 3, 7, 10 y 14.
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Los resultados se presentan en la Tabla 16. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volurnen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo^™ día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. De manera similar a los resultados de los experimentos presentados anteriormente, los tumores en los animales de control, con solución salina administrada sola (Grupo 1) o con el anticuerpo de control (Grupo 2) mostraron un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. Los animales a los que se administró PEGPH20 sola (Grupo 3) mostraron una inhibición del crecimiento tumoral final (TGI) del 41%, en comparación con los animales de control. La administración de anti-CTLA4 solo, a 1 mg/kg (Grupo 4) o 4 mg/kg (Grupo 5), dio como resultado una TGI de 49% y una TGI de 57%, respectivamente.
La administración conjunta de PEGPH20 y anti-CTLA4 a 1 mg/kg y 4 mg/kg proporcionó una TGI de 57% y 65%, respectivamente. De acuerdo con los resultados descritos anteriormente, la administración conjunta de PEGPH20 incrementó la TGI en comparación con la administración de cualquiera de los agentes solo. Los resultados muestran que la administración previa de PEGPH20 aumenta aún más la TGI observada, mientras que la administración posterior de PEGPH20 después del tratamiento con anti-CTLA4 no aumentó más la TGI. Por ejemplo, la administración previa de PEGPH20 antes de administrar 4 mg/kg de anti-CTLA4 dio como resultado un aumento en la TGI de 65% cuando los agentes se administraron conjuntamente de 79% cuando la PEGPH20 se administró 24 h antes de la administración del anticuerpo (p = 0,0011 para anti-CTLA4 solo). Se observó un efecto menor cuando se administró PEGPH20 previamente 24 h antes del tratamiento con 1 mg/kg de anti-CTLA4 (p = 0,0641 para anti-CTLA4 solo). Cuando se administró PEGPH20 después de la administración de 4 mg/kg de anti-CTLA4, no hubo beneficio de PEGPH20 (p = 0,35 para anti-CTLA4 solo). Los resultados muestran que un régimen de dosificación en el que PEGPH20 se administra previamente antes de la administración del anticuerpo anti-CTLA4 da como resultado un aumento sustancial en la TGI.
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D. Efecto dependiente de la dosis de PEGPH20 administrada previamente
Para evaluar si los efectos de la administración previa de PEGPH20 eran dependientes de la dosis, los ratones que contenían tumores CT26/HAS3, con un volumen tumoral medio de 211 ± 33 mm3, fueron asignados al azar a grupos de tratamiento. Cada grupo de tratamiento contenía 10 ratones, de manera que el volumen medio del tumor de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. El régimen de dosificación para los grupos tratados se expone en la Tabla 17. Para todos los grupos de tratamiento, 0 (control de tampón API) o 0,0375 mg/kg o 1 mg/kg de PEGPH20 se administraron por vía intravenosa (IV) dos veces por semana los días 1, 4, 8 y 11. El grupo 4 también recibió 4 mg/kg de anti-CTLA4 en los días 1, 4, 8 y 11. Para los grupos 5 y 6, a los ratones se les administró previamente PEGPH20 en los días 0, 3, 7 y 10 a 1 mg/kg o 0,0375 mg/kg, respectivamente, como se indica en la Tabla 17 y, 24 horas después, se administró anti-CTLA4 los días 1, 4, 8 y 11. Los tratamientos con anti-CTLA4 o solución salina se administraron por vía intraperitoneal (IP). Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 3, 7, 10 y 14.
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Los resultados se presentan en la Tabla 18. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volurnen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. De manera similar a los resultados descritos anteriormente, los tumores en los animales de control a los que se había administrado solución salina sola (Grupo 1) mostraron un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. Los animales a los que se había administrado PEGPH20 sola, a 0,0375 mg/kg (Grupo 2) o 1 mg/kg (Grupo 3), mostraron volúmenes de tumor promedio ligeramente reducidos en comparación con los animales de control. Es posible que la eficacia reducida de PEGPH20 observada en este experimento se deba a la presencia de menos HA tumoral en los animales utilizados en estos experimentos. La administración de anti-CTLA4 (4 mg/kg) solo (Grupo 4), dio como resultado una reducción ligeramente mayor de 50% en el volumen del tumor en comparación con el control de vehículo. Los animales que recibieron anti-CTLA4 combinado con PEGPH20 administrada previamente a 0,0375 o 1 mg/kg, mostraron un volumen tumoral reducido adicional en comparación con los animales tratados solo con anti-CTLA4, con poca diferencia entre las diferentes dosis de PEGPH20.
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Ejemplo 7
Efecto del anticuerpo anti-PD-Ll y la hialuronidasa administrada previamente en el modelo de ratón con tumor MH194 PSC4 singénico con alto contenido de HA
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores singénicos MH194+PSC4 con alto contenido de HA generados como se describe en el Ejemplo 1, con un volumen tumoral medio de 168 ± 24 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 8 ratones, de modo que el volumen medio tumoral de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. Se administraron PEGPH20 como se describe en el Ejemplo 5 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) por vía intravenosa (IV) los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17, y se administraron anti PD-Ll (BioXCell Inc, clon 10F.9G2, Núm. de catálogo BE0101) o control de isotipo IgG2b de rata (BioXCell Inc, Núm. de catálogo BE0090) por vía intraperitoneal (IP) los días 1, 4, 8, 11, 15 y 18, todos a los niveles de dosis indicados en la Tabla 19. Los volúmenes de tumores se midieron los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21.
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Los resultados se presentan en la Tabla 20. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volurnen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Los resultados mostraron que los tumores con alto contenido de HA MH194+PSC4 en los animales de control, con administración de tampón API y control de isotipo solo (Grupo 1) mostraron un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. El desarrollo de tumores en animales a los que se administró PEGPH20 sola (Grupo 2) se redujo significativamente (p = 0,004 para el Grupo 1) a aproximadamente 2/3 del tamaño de los tumores tratados con vehículo/isotipo al finalizar el estudio. El crecimiento de tumores en animales tratados con anti-PD-L1 a cualquiera de las dosis sometidas a prueba (Grupos 3, 5 y 7) también se redujo significativamente (p = 0,0015, 0,0008 y <0,0001, respectivamente, para anti-PD-L1 a 1, 2 y 4 mg/kg). La administración de PEGPH20 a 1 mg/kg 24 h antes de 2 mg/kg de anti-PD-L1 (Grupo 6) produjo una reducción significativamente mayor en el volumen del tumor en comparación con 2 mg/kg de anti-PD-L1 solo (p = 0,005) o 1 mg/kg de PEGPH20 solo (p = 0,007). Los resultados muestran que el tratamiento combinado con PEGPH20 y anti-PD-L1 reduce el crecimiento del tumor mejor que PEGPH20 o anti-PD-L1 individualmente.
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Ejemplo 8
Efecto del anticuerpo anti-PD-LI y la dosis más baja de hialuronidasa administrada previamente en el modelo de ratón con tumor MH194+PSC4 singénico con alto contenido de HA
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores singénicos MH194+PS194 con alto contenido de HA generados como se ha descrito en el Ejemplo 1, con un volumen tumoral medio de 131 ± 20 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 8 ratones, de modo que el volumen tumoral medio de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. La PEGPH20 como se describe en el Ejemplo 5 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) se administraron por vía intravenosa (IV) los días 0, 3, 6, 8, 12, 15 y 19, y anti-PD-L1 (BioXCell Inc, clon 10F.9G2, Núm. de catálogo BE0101) o el control de isotipo IgG2b de rata (BioXCell Inc, Núm. de catálogo BE0090) se administraron por vía intraperitoneal (IP) los días 1, 4, 7, 9 , 13, 16 y 20, todos a los niveles de dosis indicados en la Tabla 21. Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 2, 6, 9, 13, 16 y 20.
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Una dosis equivalente humana de PEGPH20 es de 37,5 pg/kg, cuando la dosis humana es de 3 pg/kg. Los resultados se presentan en la Tabla 22. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(último día)-volumen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículoptimo día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Los resultados mostraron que los tumores MH194+PSC4 con alto contenido de Ha en los animales de control, a los que se habían administrado el tampón API administrado y el control de isotipo solo (Grupo 1) mostraban un crecimiento progresivo a lo largo del estudio. El crecimiento de los tumores en animales a los que se había administrado anti-PD-L1 solo (Grupo 2) se redujo significativamente (p = 0,049 al Grupo 1) a aproximadamente 2/3 del tamaño de los tumores tratados con vehículo/isotipo al finalizar el estudio . La administración de PEGPH20 a 37,5 pg/kg 24 h antes de los 2 mg/kg de anti-PD-LI (Grupo 6) produjo una reducción significativamente mayor en el volumen del tumor en comparación con 2 mg/kg de anti-pD-L1 solo (p <0,0001) o 37,5 pg/kg de PEGPH20 sola (p <0,0001), y también dio como resultado una inhibición del crecimiento tumoral significativamente mejorada cuando se comparó con PEGPH20 a 1 mg/kg 24 h antes de 2 mg/kg de anti-PD-L1 (Grupo 4) (p <0,0001).
Los resultados muestran que el tratamiento combinado con 37,5 pg/kg de PEGPH20 y anti-PD-L1 reduce el crecimiento del tumor mejor que la combinación de 1 mg/kg de PEGPH20 y anti-PD-L1. Esta dosificación es la dosificación de roedor que corresponde a las dosis utilizadas en seres humanos. Por lo tanto, la dosificación de la enzima de degradación de hialuronano se puede titular o seleccionar.
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Ejemplo 9
Efecto del anticuerpo anti-PD-1 y la hialuronidasa administrada previamente en el modelo de ratón con tumor MH194+PSC4 singénico con alto contenido de HA
Los ratones que contenían tumores singénicos MH194+PSC4 con alto contenido de HA se generaron como se ha descrito en el Ejemplo 1, y se trataron con la PEGPH20 descrita en el Ejemplo 5 sola y combinada con anti-PD-1 o controles apropiados de la siguiente manera:
A. Administración previa de PEGPH20 y dosis altas de anti-PD-1
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores MH194+PSC4 singénicos con alto contenido de HA con un volumen tumoral medio de 128 ± 24 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 8 ratones, de modo que el volumen tumoral medio de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. La PEGPH20 descrita en el Ejemplo 5 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) se administraron por vía intravenosa (IV) los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21, y anti-PD-1 (BioXCell Inc, clon RMP1-14, Núm. de catálogo BE0146) o la solución salina se administraron por vía intraperitoneal (IP) los días 1, 4, 8, 11, 15 y 18, todos a los niveles de dosis indicados en Tabla 23. Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21.
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Los resultados se presentan en la Tabla 24. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volurnen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Los resultados mostraron que el crecimiento de tumores en animales a los que se administró PEGPH20 sola (Grupo 2) se redujo significativamente (p <0,0001 para el Grupo 1) a aproximadamente la mitad del tamaño de los tumores tratados con vehículo (Grupo 1) al finalizar el estudio . El crecimiento de tumores en animales tratados con anti-PD-1 a 4 mg/kg (Grupo 3) se inhibió casi completamente (p <0,0001) y la administración de PEGPH20 a 1 mg/kg 24 h antes de 4 mg/kg de anti-PD-1 (Grupo 4) no produjo ninguna reducción adicional en el volumen del tumor en comparación con 4 mg/kg de anti-PD-1 solo (p = 0,63).
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B. Administración previa de PEGPH20 y dosis más baja de anti-PD-1, el tratamiento comenzó a diferentes tamaños de tumores
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores singénicos MH194+PSC4 con alto contenido de HA con un volumen tumoral medio de 138 ± 24 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 8 ratones, de modo que el volumen medio tumoral de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. La PEGPH20 descrita en el Ejemplo 5 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) se administraron por vía intravenosa (IV) los días 0 (grupos 1-4 solamente), 3 (grupos 1-7 solamente ), 7, 10, 14, 17 y 21, y el anti-PD-1 (BioXCell Inc, clon RMP1-14, Núm. de Catálogo BE0146) o el control de isotipo IgG2a de rata (BioXCell Inc, Núm. de catálogo BE0089) se administraron por vía intraperitoneal (IP) los días 1 (grupos 1-4 solamente), 4 (grupos 1-7 solamente), 8, 11, 15 y 18, todos a los niveles de dosis indicados en la Tabla 23. Los volúmenes de los tumores se midieron los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21, excepto lo indicado para los grupos 8-10 en la Tabla 25.
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Los resultados se presentan en la Tabla 26. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodía)-volurnen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Cuando el tratamiento comenzaba el día 0 del estudio, los resultados mostraban que el crecimiento de los tumores en animales a los que se había administrado PEGPH20 sola (Grupo 2) o anti-PD-1 solo (Grupo 3) se reducía significativamente (p = 0,0021 y <0,0001, respectivamente, para el Grupo 1) hasta aproximadamente la mitad del tamaño de los tumores tratados con vehículo (Grupo 1) al finalizar el estudio. La administración de PEGPH20 a 1 mg/kg 24 h antes de 2 mg/kg de anti-PD-1 (Grupo 4) no produjo ninguna reducción adicional en el volumen del tumor en comparación con 2 mg/kg de anti-PD-1 solo (p = 0,07). Cuando el tratamiento se iniciaba el día 3 del estudio (Grupos 5-7), el anti-PD-1 todavía tenía un efecto inhibidor significativo sobre el crecimiento del tumor (p <0,0001), y nuevamente no se observaba ningún efecto adicional en presencia de PEGPH20. Finalmente, cuando se iniciaba el tratamiento el día 7 del estudio (Grupos 8-10), el efecto de anti-PD-1 solo o PEGPH20 sola ya no era significativo (p = 0,70), y el efecto de la combinación no era significativamente diferente del de la PEGPH20 sola (p = 0,45). Por lo tanto, PEGPH20 no mejoró la eficacia de anti-PD-1 en este modelo de tumor.
Tabla 26. Resultados
Volumen tumoral (mm3), Media ± ETM Grupo Tratamiento
Día 0 Día 3 Día 7 Día 10
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Volumen tumoral (mm3), Media ± ETM TGI Grupo Tratamiento
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Ejemplo 10
Efecto del anticuerpo anti-PD-1 y de la dexametasona administrada previamente en el modelo de ratón con tumor MH194+PSC4 singénico
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores singénicos MH194+PSC4 parentales generados como se describe en el Ejemplo 1C, con un volumen tumoral medio de 131 ± 26 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 6 ratones, de modo que el volumen tumoral medio de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. La dexametasona o la solución salina (cloruro de sodio al 0,9% para inyectables) se administraron por vía intraperitoneal (IP) los días 0, 3, 7, 10, 14 y 17, y el anti-PD-1 (BioXCell Inc, clon RMP1-14, Núm. de catálogo BE0146) o la solución salina se administraron por vía intraperitoneal (IP) los días 1, 4, 8, 11, 15 y 18, todos a los niveles de dosis indicados en la Tabla 27. Los volúmenes tumorales se midieron los días 0, 3, 7, 10, 14, 17 y 21. La dosis media de dexametasona (3 mg/kg) se seleccionó para que se aproximara a la dosis humana equivalente para los ensayos clínicos en los que se administra PEGPH20 con dexametasona para aliviar las molestias musculoesqueléticas.
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Los resultados se presentan en la Tabla 28. La inhibición del crecimiento tumoral (TGI) se calculó utilizando la siguiente fórmula: 1-(volumen del tumor, artículo de prueba)(últimodia)-volumen del tumor, artículo de prueba(medición en el momento inicial))/(volumen del tumor, vehículo(último día)-volumen del tumor, vehículo(medición en el momento inicial)) x 100%. Los resultados mostraron que el crecimiento de tumores en animales tratados con anti-PD-1 a 4 mg/kg (Grupo 2) fue inhibido en aproximadamente 2/3 (p <0,0001), mientras que la dexametasona inhibió significativamente el crecimiento del tumor solo en la dosis más alta sometida a prueba, 5 mg/kg (p = 0,0009). La administración de dexametasona a dosis de 1 a 5 mg/kg 24 h antes de los 4 mg/kg de anti-PD-1 (Grupo 4) no alteró el efecto de anti-PD-1 (p = 0,12, 0,65, y 0,70, respectivamente, para la dexametasona a 1, 3 y 5 mg/kg más anti-PD-1 vs. anti-PD-1 solo).
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Ejemplo 11
Generación de anticuerpos anti-CTLA4, PD-1 y PD-L1 humanos marcados con Alexa Fluor 488 (AF488)
Se utilizó el kit de marcaje de proteínas Alexa Fluor 488 (AF488) (Life Technologies, Núm. de catálogo A-10235) para marcar el anticuerpo anti-PD-L1 humano (G&P Biosciences, Núm. de catálogo MAB0199), el anticuerpo anti PD-1 humano (G&P Biosciences, Núm. de catálogo MAB1732), y el anticuerpo anti-CTLA4 humano (G&P Biosciences, Núm. de catálogo MAB1718).
El marcaje se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se preparó una solución 1 M de bicarbonato de sodio y se añadieron 100 pL de la solución preparada a 1 mL de 1 mg/mL de anticuerpo (total de 1 mg de anticuerpo). Esta mezcla se añadió a un tubo de colorante reactivo AF488, suministrado por el fabricante. La mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con balanceo suave.
Los anticuerpos anti-humanos marcados con AF488, denominados AF488-anti-PD-L1, AF488-anti-PD-1, y AF488-anti-CTLA4, y como grupo denominado anticuerpo AF488, se separaron utilizando columnas Bio-Rad micro Bio -Spin 6 (Bio-Rad, Núm. de catálogo 732-6621). La concentración total de proteínas se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Pierce, Núm. de catálogo 23227).
Ejemplo 12
Efecto de la hialuronidasa sobre anti-PD-LI humano, anti-CTLA4 humano y anti-PD-1 humano: accesibilidad al modelo de ratón con tumor de xenoinjerto con alto contenido de HA
Se generaron ratones que portaban tumores de xenoinjerto SKOV3/HAS2 con alto contenido de HA como se describe en el Ejemplo 2, y se trataron con la PEGPH20 descrita en el Ejemplo 5 sola y combinada con AF488-anti-PD-L1, -PD-1 o -CTLA4 (descritos en el Ejemplo 9) como sigue:
Se asignaron al azar ratones que contenían tumores de xenoinjerto con alto contenido de HA, con un volumen tumoral medio de 500 mm3, a grupos de tratamiento, cada uno con 4 ratones, de manera que el volumen medio tumoral de cada grupo fuera sustancialmente el mismo. Los tratamientos se administraron una vez como se indica en la Tabla 29 a continuación. El anticuerpo AF488 como se describe en el Ejemplo 7 o el tampón de Ingrediente Farmacéutico Activo (API) (histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6,5) o la PEGPH20 (descrita en el Ejemplo 5) y el anticuerpo AF488 se administraron por vía intravenosa (IV), todo a los niveles de dosis indicados. Los tumores se recogieron 48 h después del tratamiento y se tomaron imágenes con un sistema de obtención de imágenes Bio-Rad Chemidoc MP (Bio-Rad).
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Los resultados se presentan en la Tabla 30 (recuento de píxeles positivo) y en la Tabla 31 (intensidad de fluorescencia media). Los recuentos de píxeles y las medias de la intensidad de fluorescencia se obtuvieron con el soporte lógico Image Pro (MediaCybernetics Image Pro Analyzer 7.0), y se restó el fondo promedio de los tumores en animales a los que no se había inyectado el anticuerpo AF488. Los resultados mostraron que la fluorescencia era detectable en los tumores en los animales que recibieron el anticuerpo AF488 solo (Grupos 2, 4 y 6). La intensidad de la fluorescencia aumentó significativamente en los tumores en animales tratados con la combinación de PEGPH20 y AF488-anti-PD-L1 (Grupo 3). Por otro lado, no se observó un aumento en la intensidad de fluorescencia en animales tratados con PEGPH20 y AF488-anti-PD-1 o AF488-anti-CTLA4, cuando se compararon con los animales tratados solo con AF488-PD-1 o -CTLA4, en ausencia de PEGPH20 (Grupos 5 y 7). Por lo tanto, los resultados muestran que el tratamiento combinado de PEGPH20 y anti-PD-L1 humano incrementó la accesibilidad de anti-PD-Ll a los tumores con alto contenido de HA de una manera específica para el anti-PD-L1.
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Ejemplo 13
Formulaciones de PH20 en liposomas multivesiculares (MVL)
Para la administración sistémica, se pueden preparar hialuronidasas, incluyendo hialuronidasas solubles, en vesículas lipídicas, tales como liposomas. Son ejemplos de estos los liposomas multivesiculares (MVL). Se prepararon varias formulaciones de liberación prolongada de liposomas multivesiculares con PH20 (MVL-PH20) utilizando el siguiente procedimiento general, véanse también la Solicitud Internacional PCT publicada Núm. WO 2012/109387 y la Publicación de Estados Unidos US-2013-0251786-A1. Las soluciones lipídicas contenían mezclas de varios lípidos neutros, incluyendo triglicéridos (TG) trioleina (C181), tricaprilina (Cbü) y colesterol, y lípidos con cargas tanto positivas como negativas, incluyendo fosfatidilcolinas (PC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC, C-^-i), dierucoilfosfatidilcolina (DEPC, C221) y dipalmitoil fosforilglicerol (DPPG, C161). La concentración total de PC fue hasta 19,8 mM, la concentración de colesterol fue de 30 mM, la concentración de TG fue hasta 3,9 mM y la concentración de DPPG fue 4,2 mM.
A. Generación de formulaciones MVL-PH20
Se prepararon formulaciones de MVL que contenían un porcentaje molar variable de DEPC y DOPC (0-100%) y un porcentaje molar variable de trioleína y tricaprilina (0-100%), DPPG, colesterol y 0,1, 0,25, 0,5, 1 o 2 mg/mL de PH20. En la primera etapa, se combinaron los lípidos en cloroformo (fase oleosa) y la PH20 en una primera solución acuosa (fase acuosa) y se emulsionaron para formar una emulsión de agua en aceite, por lo que la PH20 se encapsuló con la monocapa de fosfolípidos. En la segunda etapa, se añadió una segunda solución acuosa y se emulsionó, por lo que se formó una emulsión de agua en aceite en agua. Después de la adición de una segunda alícuota de la segunda solución acuosa, se evaporó el cloroformo disolvente y el producto resultante que contenía liposomas multivesiculares se lavó varias veces en una tercera solución acuosa y se resuspendió a aproximadamente 50% de lipocrito (volumen de partículas empaquetadas) y se almacenó a 2- 8°C.
Se prepararon formulaciones ilustrativas utilizando un Mini Vórtex o se prepararon a mayor escala utilizando un mezclador Omni (Omni Macro ES, Omni International, Kennesaw, GA). En el último método del mezclador Omni, la solución lipídica en cloroformo (6 mL) se emulsionó a 7.000 rpm durante 8 minutos con un Mezclador Omni con 6 mL de la primera solución acuosa (His-HCl 10 mM, pH 6,5 con sacarosa al 5% que contenía concentraciones variables de p H20) produciendo una emulsión de agua en aceite. Una emulsificación posterior a 4.500 rpm durante 1-3 minutos con 20 mL de una segunda solución acuosa de glucosa al 3,2% que contenía lisina 40 mM, pH 10,0, dio como resultado una segunda emulsión de agua en aceite en agua. La segunda emulsión se transfirió por igual a dos matraces Erlenmeyer y se añadió otra alícuota de 50 mL de la segunda solución acuosa a ambos matraces. El cloroformo se eliminó mediante lavado con nitrógeno sobre la superficie de la emulsión a 35°C. Las partículas de MVL que contenían PH20 se lavaron tres veces con 50 mL de una tercera solución acuosa (tampón de His-HCl 25 mM, pH 6,0 que contenía NaCl 120 mM) añadiendo la solución, mezclando el tubo de centrifugación por inversión y centrifugación a 3.500 rpm durante 10 min. a 4°C en una centrífuga de mesa refrigerada. Finalmente, las partículas de MVL se resuspendieron en la tercera solución acuosa para formar una formulación de lipocrito de aproximadamente 50% y se almacenaron refrigeradas a 2-8°C. El procedimiento de Mini Vórtex fue similar, utilizando los parámetros expuestos en la Tabla 30.
La siguiente Tabla 32 resume la primera, segunda y tercera soluciones acuosas. La Tabla 32 también resume los volúmenes, las concentraciones de reactivos y otros parámetros de cada etapa del procedimiento de MVL.
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B. Resumen de las formulaciones de MVL-PH20 ilustrativas
Se prepararon varias formulaciones de MVL-PH20 que contenían razones molares variables de lípidos, PH20 y otros aditivos utilizando los mismos procedimientos generales descritos anteriormente. Los diversos aditivos adicionales fueron incluidos en la 1a solución acuosa para mejorar y preservar la estabilidad de la PH20 encapsulada. Por ejemplo, las formulaciones F68 y F69 contenían cloruro de calcio. La formulación F82 contenía 150 pL de glicerol como una interfase que separaba la fase de 600 pL de cloroformo y la primera fase de la primera solución acuosa de 600 pL. La formulación f83 contenía dextrano 40.000 al 0,1% y PEG-6000 al 0,1%. Las formulaciones F85-F87 contenían oligómeros de ácido hialurónico (HA). Varias formulaciones diferían en sus procedimientos de mezclado/emulsificación. Por ejemplo, para la formulación F66, la primera etapa de emulsificación se llevó a cabo durante 4 minutos, en lugar de 8 minutos, dando como resultado bolitas liposomales más pequeñas. La formulación F67 se mezcló con una rueda del rotor, en lugar de un Mini Vórtex para generar una menor cizalla durante la mezcla.
La siguiente Tabla 33 presenta varias formulaciones de MVL-PH20, que contienen el número de formulación, las razones en % en moles de PC (fosfatidilcolina) y TG (triglicéridos) de la formulación, la concentración inicial de PH20 en mg/mL, el mezclador utilizado para preparar las emulsiones, y cualquier aditivo que haya sido incluido en la primera solución acuosa.
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Las modificaciones de los ejemplos serán evidentes para los expertos en esta técnica. Por consiguiente, esta invención debe limitarse únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Una combinación, que comprende:
una primera composición que comprende una hialuronidasa, en donde la hialuronidasa se conjuga con un polímero o se formula para la liberación lenta o se codifica en un vector para su suministro en un tumor; y una segunda composición que comprende un inhibidor de puntos de control inmunitario, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-Ll o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
2. La combinación de la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento del cáncer en un animal en donde el animal se expone primero a la hialuronidasa y a continuación se pone en contacto con el inhibidor de puntos de control inmunitario.
3. Un inhibidor de puntos de control inmunitario para su utilización en el tratamiento de un cáncer en un sujeto, en donde:
el sujeto ha sido tratado con una hialuronidasa;
la hialuronidasa se conjuga con un polímero o se formula para la liberación sostenida, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, anti-PD-1 o anti-PD-Ll o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
4. La combinación de la reivindicación 1, combinación para su uso de acuerdo con la reivindicación 2 o inhibidor de puntos de control inmunitario para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la hialuronidasa es una PH20 o una forma truncada de la misma que carece de un sitio de unión a glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal o una porción del sitio de unión a GPI, por lo que la PH20 es soluble.
5. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de la reivindicación 4, en donde:
la hialuronidasa es una PH20 truncada C-terminal seleccionada entre:
a) una secuencia de aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 217 que contiene los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 217 y residuos hasta un residuo de aminoácido C-terminal, por lo que el polipéptido está truncado en el extremo C de manera que no incluye la longitud completa del polipéptido cuya secuencia se expone como los aminoácidos 1-509 o 36-509 de SEQ ID NO: 217; y
b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de a) que es soluble y conserva la actividad hialuronidasa.
6. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de la reivindicación 4, en donde la PH20 comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158, o una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NO: 123-158 y conserva la actividad hialuronidasa.
7. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-6, en donde el polímero es un polialquilenglicol, dextrano, pululano o celulosa.
8. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de la reivindicación 7, en donde el polialquilenglicol se selecciona entre polietilenglicol (PEG) o metoxipolietilenglicol (mPEG).
9. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:
la composición de la enzima de degradación de hialuronano contiene entre 0,1 pg/mL y 100 pg/mL, de 1 |jg/mL a 50 pg/mL o de 1 pg/mL a 20 pg/mL de enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero; o
la composición de la enzima de degradación de hialuronano contiene entre 10 U/mL y 5.000 U/mL, de 50 U/mL a 4.000 U/mL, de 100 U/mL a 2.000 U/mL, de 300 U/mL a 2.000 U/mL, de 600 U/mL a 2.000 U/mL, o de 100 U/mL a 1.000 U/mL de enzima de degradación de hialuronano conjugada con un polímero.
10. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un fragmento de unión a antígeno.
11. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-10, en donde el inhibidor de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-Ll o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
12. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-10, en donde el anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-CTLA4, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, seleccionado entre:
a) Ipilimumab, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 22 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 24; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 22 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 24; y b) Tremelimumab, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36; y
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 34 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 36.
13. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-1, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, seleccionado entre:
a) Nivolumab, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 56; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 54 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 56; b) MK-3475, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 70; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 68 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 70; y c) Pidilizumab, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 82 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 84; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 82 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 84.
14. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-9, en donde el anticuerpo anti-proteína de puntos de control inmunitario es un anticuerpo anti-PD-L1, un derivado del mismo, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, seleccionado entre:
a) BMS-936559, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 92 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 94; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 92 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 94; b) MEDI4736, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 102 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 104; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 102 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 104; y c) MPDL3280A, un derivado del mismo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 114 y un dominio variable de la cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 115; o
una cadena pesada variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98% o 99% con la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO: 114 y una cadena ligera variable que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% con la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO: 115.
15. La combinación o combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende adicionalmente un glucocorticoide.
16. La combinación o combinación para el uso de la reivindicación 15, en donde el glucocorticoide se selecciona entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas y prednisonas.
17. La combinación o combinación para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la hialuronidasa y el inhibidor de puntos de control inmunitario se formulan para la administración por la misma vía de administración o una vía de administración diferente.
18. La combinación o combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la hialuronidasa y el inhibidor de puntos de control inmunitario están formulados para la administración sistémica.
19. La combinación o combinación para el uso de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la hialuronidasa y el inhibidor de puntos de control inmunitario están formulados para la administración intravenosa.
20. La combinación o combinación para el uso de las reivindicaciones 1-19, en donde la hialuronidasa se expone al animal hasta 48 horas antes de que el inhibidor de puntos de control inmunitario se exponga al animal.
21. La combinación, combinación para su uso o inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de las reivindicaciones 1-20, en donde el cáncer es un tumor y el tumor es un tumor sólido.
22. La combinación, combinación para su uso o el inhibidor de puntos de control inmunitario para el uso de la reivindicación 21, en donde el cáncer se selecciona entre cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, mesotelioma, CPCNP y cáncer de colon.
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