BR112014009797A2 - diagnóstico de companhia para terapia de agente anti-hialuronano e métodos de uso do mesmo - Google Patents

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Abstract

diagnóstico de acompanhamento para a terapia de agente anti-hialuronan e métodos de uso do mesmo. métodos e agentes de diagnóstico para a identificação de indivíduos para o tratamento do câncer, com um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan, são fornecidos. agentes de diagnóstico para a detecção e quantificação de hialuronan em uma amostra biológica e a monitoração do tratamento do câncer com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, são fornecidos. combinações e kits para utilização na prática dos métodos também são fornecidos.

Description

DIAGNÓSTICO DE ACOMPANHAMENTO PARA A TERAPIA DE AGENTE ANTI-HIALURONAN E MÉTODOS DE USO DO MESMO REQUERIMENTOS RELACIONADOS
[0001] O benefício de prioridade é reivindicado para o Requerimento Provisório Serial U.S. Nº 61/ 628, 187, de 24 de outubro de 2011, intitulado “Diagnóstico de acompanhamento para a terapia de enzima que degrada hialuronan e métodos de uso da mesma”, para o Requerimento Provisório U.S. Nº 61/ 559, 011, de 11 de novembro de 2011, intitulado “Diagnóstico de acompanhamento para a terapia de enzima que degrada hialuronan e métodos de uso da mesma”, para Requerimento Provisório U.S. Nº 61/ 630, 765, de 16 de dezembro de 2011, intitulado “Diagnóstico de acompanhamento para a terapia de enzima que degrada hialuronan e métodos de uso da mesma” para o Requerimento Provisório U.S. Nº 61/ 714, 700, de 16 de outubro de 2012, intitulado “Diagnóstico de acompanhamento para a terapia de agente anti- hialuronan e métodos de uso da mesma”. O objetivo de cada uma das aplicações acima indicadas é incorporado por referência na sua totalidade.
[0002] Este requerimento está relacionado ao Requerimento de Patente U.S. No. 13/694,071, arquivado no mesmo dia em anexo, intitulado “Diagnóstico de acompanhamento para a terapia de agente anti-hialuronan e métodos de uso da mesma”, que reivindica prioridade para os Requerimentos Provisórios Seriais U.S. Nºs 61/628, 187; 61/559, 011; 61/630, 765 e 61/ 714, 700.
[0003] A objetivo do requerimento relacionado acima mencionado é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIA FORNECIDA ELETRONICAMENTE
[0004] Uma versão eletrônica da Listagem de Sequências está arquivada em anexo, os conteúdos dos quais são incorporados por referência na sua totalidade. O arquivo eletrônico foi criado em 24 de outubro de 2012, tem 1827 Kb de tamanho, e é intitulado 3096segPCl.txt.
CAMPO DE INVENÇÃO
[0005] Métodos e meios de diagnóstico para a identificação das pessoas para o tratamento do câncer com uma enzima que degrada hialuronan são fornecidos. Os agentes de diagnóstico para a detecção e quantificação de hialuronan em uma amostra biológica, e a monitoramento do tratamento do câncer, a enzima degradadora de hialuronan são fornecidos. Combinações e kits para utilização na prática dos métodos também são fornecidos.
ANTECEDENTES
[0006] Enzimas degradantes de hialuronan vem sendo utilizadas terapeuticamente, normalmente como dispersantes e agentes em combinação com outros agentes de propagação terapêuticos. Enzimas degradantes de hialuronan podem também ser utilizadas em terapia de agente único para o tratamento de doenças e distúrbios associados ao hialuronan. Por exemplo, tumores e tipos de câncer associados com a acumulação de hialuronan, e tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, inibe o crescimento do tumor e aumenta a perfusão vascular, e melhora a entrega de agentes —“quimioterapêuticos para o tumor. Existe uma necessidade de métodos e reagentes para melhorar o tratamento de pacientes que são tratados com enzimas que degradam hialuronan.
SUMÁRIO
[0007] Proporciona-se aqui um método para a seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrade hialuronan. No método fornecido, uma amostra de tecido ou fluido corporal de um indivíduo com um tumor ou câncer é contactado com uma proteína de ligação ao hialuronan (HABP) que não tenha sido preparada a partir, ou isolada a partir de cartilagem de animais. A ligação da proteina de ligação a hialuronan para a amostra é detectada, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, na qual se a quantidade de hialuronan na amostra for igual ou superior a um nível predeterminado, há a seleção do indivíduo para o tratamento com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima de degradação de hialuronan.
[0008] Proporciona-se aqui um método para a seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan, em que um fluido corporal de um indivíduo com um tumor ou câncer esteja em contato com uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) que não tenha sido preparada a partir de, ou isolada a partir de cartilagem de animais, e a ligação de HABP para a amostra é efetuada através de um ensaio de ligação de fase sólida com um sinal colorimétrico ou fluorescente, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, em que um indivíduo é selecionado para o tratamento com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima degradante de hialuronan, quando o nível de limiar predeterminado é HA elevado. Em alguns exemplos do método, o nível de limiar predeterminado é de pelo menos ou acima de 0,025 ug de HA/ml de amostra, 0,030 pg/mL, 0,035 upg/mL, 0,040 pg/mL,
0,045 po/mL, 0,050 pg/ml, 0,055 mg/ml, 0,060 ng/ml, 0,065 ng/mL, 0,070 pa/ml, 0,08 pg/mL, 0,09 pg/ml. 0,1 pg/ml, O,2 ug/ml, 0,3 pg/ml ou superior.
[0009] Proporciona-se aqui um método para a seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, em que uma amostra de tecido tumoral de um indivíduo com um tumor ou câncer está em contato com uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) que não tenha sido preparada a partir de, ou isolada a partir de cartilagem de animais, e que a ligação de HABP para a amostra seja efetuada por histoquímica, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, em que um indivíduo seja selecionado para o tratamento com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima degradante de hialuronan, quando o nível de limiar predeterminado é um score de HA de pelo menos dois +2 (HA?) ou, pelo menos, +3 (HA). Em alguns exemplos, o nível de limiar predeterminado é uma pontuação de HA de pelo menos +3 (HA**) (níveis elevados). Em outros exemplos, o nível de limiar predeterminado é de pelo menos um por cento de pixels positivos de HA no tumor (células e estroma) para coloração total no tecido tumoral de, pelo menos, 10%, 10% a 25% ou maior do que 25%. Por exemplo, o nível de limiar predeterminado é de pelo menos um por cento de pixels positivos de HA no tumor (células e estroma) e a coloração no tecido tumoral total de, pelo menos, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% ou 40%.
[0010] É também aqui proporcionado um método para a seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan, como por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, em que o indivíduo é então tratado com o agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan. Em alguns exemplos, o agente anti- hialuronan é uma enzima que degrada hialuronan, que é administrada em uma quantidade de dosagem compreendida entre cerca de, ou entre 0,01 npg/kg (do indivíduo) a 50 vg/kg, 0,01 pg/kg a 20 pg/kg, 0,01 pg/kg a 15 pg/kg, 0,05 vg/kg a 10 ug/kg, 0,75 pg/kg a 7,5 mg/kg ou 1,0 vg/kg a 3,0 mg/kg e uma frequência de administração de duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada 14 dias, uma vez a cada 21 dias, ou uma vez por mês. Em exemplos particulares do método, um corticosteroide é administrado antes da administração de uma enzima de degradação de hialuronan, ou após a administração da enzima degradadora de hialuronan, normalmente em uma quantidade suficiente para melhorar um efeito adverso no indivíduo, a partir da enzima degradadora de hialuronan administrada. Por exemplo, a quantidade de corticosteroides é administrada entre, ou cerca de 0,1 a 20 mg, 0,1 a 15 mg, 0,1 a 10 mg, 0,1 a 5 mg, 0,2 a 20 mg, 0,2 a 15 mg, 0,2 a 10 mg, 0,2 a 5 mg, 0,4 a 20 mg, 0,4 a 15 mg, 0,4 a 10 mg, 0,4 a 5 mg, 0,4 a 4 mg, l a mg, 1 a 15 mg ou 1 a 10 mg.
[0011] É também aqui proporcionado um método para prever a eficácia de tratamento de um indivíduo com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima de degradação de hialuronan. No método fornecido, uma amostra de tecido ou fluido corporal de um indivíduo que seja, Ou tenha sido tratado com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima degradante de hialuronan, é posto em contato com uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) que não tenha sido preparada a partir de, ou isolada a partir de cartilagem de animais, e a ligação da proteína de ligação a hialuronan para a amostra é detectada,
determinando assim, a quantidade de hialuronan na amostra, em que a detecção de uma diminuição no hialuronan em comparação com o tratamento anterior com o agente anti- hialuronan (por exemplo enzima que degrada hialuronan) ou a última dose de agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) indica que o tratamento é eficaz.
[0012] É também aqui proporcionado um método para a monitorização do tratamento de um indivíduo com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). No método fornecido, uma amostra de tecido ou fluido corporal de um indivíduo com um tumor ou câncer está em contato com uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) que não tenha sido preparada a partir de, ou isolada a partir de cartilagem animal, e a quantidade de proteína de ligação a hialuronan, que se liga à amostra é detectada, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, e o nível de hialuronan seja comparado com uma amostra de controle ou de referência, para determinar, assim, a quantidade de hialuronan na amostra em relação ao controle ou a amostra de referência, em que a quantidade de hialuronan seja um indicador da evolução do tratamento.
[0013] São também aqui fornecidos os métodos para prever a eficácia de tratamento de um indivíduo com um agente anti-hialuronan (por exemplo uma enzima degradadora de hialuronan) e tratamento de monitoramento de um indivíduo com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), em que o tratamento é alterado com base na quantidade determinada de hialuronan na amostra, em relação ao controle ou amostra de referência, de tal forma que se a quantidade de hialuronan na amostra é igual ou superior ao valor no controle ou amostra de referência, o tratamento é continuado ou encaminhado através do aumento da dose e/ou posologia; ou se a quantidade de hialuronan na amostra é inferior ao valor do controle ou amostra de referência, o tratamento é continuado, reduzido, diminuindo a dose e/ou programa de dose, ou encerrado. Em alguns exemplos, a amostra de controle ou de referência é uma amostra de um indivíduo saudável, é uma amostra de base a partir do indivíduo, antes do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima degradadora de hialuronan) ou é uma amostra de um indivíduo, antes da última dose do agente anti- hialuronan (por exemplo, enzima degradante de hialuronan). Em alguns exemplos, o indivíduo possui um tumor ou câncer, e a amostra é uma amostra de tecido tumoral, e a detecção é efetuada por histoquímica. Em outros exemplos, o indivíduo possui um tumor ou câncer, e a amostra é um fluido corporal e a detecção é feita por um ensaio de ligação em fase sólida. Em alguns exemplos, o ensaio de ligação em fase sólida é um ensaio em placa de microtitulação e a ligação é detectada colorimetricamente ou por meio de fluorescência.
[0014] Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a etapa de contato da amostra com uma HABP pode ser efetuada a, ou entre cerca de pH 5,6 a 6,4. Por exemplo, a etapa de contato da amostra com uma HABP é efetuada a um pH de cerca de 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 ou 6,2. Em alguns exemplos, a HABP se liga especificamente ao HA com uma afinidade de ligação representada pela constante de dissociação (Kd) de pelo menos, ou menos do que 1 x 107 M, 9 x 10º M, 8x 10º M 7 x10ºM, 6x 10º M, 5 x10º M, 4 x 10º M, 3 x 10º M, 2 x 10º M, 1 x 10º M, 9 x 10º M, 8 x 10º M, 7 x 10º M, 6 x 10º M, 5 x 10º M, 4 x 10º M, 3 x 10º M, 2 x 10º M, 1 x 10ºM ou Kd inferior.
[0015] Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, a HABP pode ser gerada de forma recombinante ou sintética. Em alguns exemplos, a HABP contém um módulo de ligação. Em outros exemplos, a HABP contém dois ou mais módulos de ligação. Em outros exemplos, o módulo de ligação (ou módulos) são a única porção HABP da molécula. Assim, são aqui fornecidos métodos em que a HABP contém um módulo de ligação selecionado entre CD44, LYVE-l, proteína de ligação/HAPLNl, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, TSG-6, Stabilin-l, Stabilin -2, CAB61358 e KIAAO5S27. Em alguns exemplos do método, a HABP contém uma porção de um CD44, LYVE-l, proteína de ligação/HAPLNl, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, TSG-6, Stabilin-l, Stabilin -2, CAB61358 e KIAAO5S27, incluindo um módulo de ligação ou uma porção suficiente de um módulo de ligação para ligar ao HA. Em um exemplo particular, a HABP é uma proteína de gene estimulado por fator de necrose tumoral (TSG-6) Ou um módulo de ligação TSG-6 ou uma porção suficiente de um módulo de ligação TSG-6 para se ligar ao HA. Em outros exemplos do método aqui descrito, a HABP contém um domínio Gl de uma proteína de ligação ao hialuronan do tipo C, por exemplo, um domínio Gl selecionado entre Aggrecan Gl, Versican Gl, Neurocan Gl e Brevican Gl. Em exemplos particulares, o domínio Gl é a única porçãa HABP da molécula.
[0016] Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, a HABP contém a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS : 207, 222, 360, 361, 371-394, 4116-418 e 423-426, ou tem a sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207 360, 361, 371-394, 416-418 e 423-426, e se liga especificamente ao HA, ou é um domínio de ligação ao HA da mesma, ou uma porção suficiente da mesma, para se ligar especificamente ao HA. Em um exemplo, a HABP contém um módulo de ligação TSG-6 (LM) ou uma porção suficiente do mesmo, que especificamente se liga ao HA. Por exemplo, o TSG-6-LM contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos ácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418 e, especificamente, se liga ao HA. Em exemplos específicos do método, a HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 207 ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 65% da identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207 e, especificamente, se liga ao HA. Em outros exemplos, a HABP contém um módulo de ligação que apresenta, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA.
[0017] Em alguns exemplos do método aqui proporcionado, o módulo de ligação TSG-6 é modificado para reduzir ou eliminar a ligação à heparina. Por exemplo, a ligação a heparina é reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais. Em alguns exemplos do método aqui proporcionado, o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 20, 34, 41, 54, 56, 72 ou 84, estabelecido na SEQ ID NO: 360, em que um resíduo de aminoácido correspondente é identificado por alinhamento de um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360. Por exemplo, a substituição de aminoácidos está em um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 207, e a substituição ou substituições de aminoácidos estão no resíduo de aminoácido 21, 35, 42, 55, 57, 73 ou 85. À substituição de aminoácidos pode ser a de um resíduo de aminoácido não básico selecionado a partir de Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gin (Q), Ala (A), Val (V), He (1), Leu (L), Met (M), Phe (EF), Tyr (Y) e Trp (W). Em um outro exemplo, o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácidos correspondente às substituições de aminoácidos K20A, K34A ou K41A em um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360, ou a substituição pelo resíduo correspondente em outro TSG-6-LM. Em outro exemplo, o módulo de ligação TSG-6 contém substituições de aminoácidos correspondentes às substituições de aminoácidos K20A, K34A e K41A em um TSG-6- LM estabelecido na SEQ ID NO: 360, ou a substituição pelo resíduo correspondente no outro TSG-6-LM. Por exemplo, a HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 361 ou 416, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 361 ou 416, que se liga especificamente ao HA.
[0018] Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, a HABP contém um módulo de ligação que apresenta, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 361 ou 416, pela qual HABP se liga especificamente ao HA. Em exemplos particulares, HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 361 ou SEQ ID NO: 416. Em outros exemplos, o módulo de ligação é a única parte
TSG-6 de HABP. Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, HABP é um multímero contendo um primeiro domínio de ligação ao HA ligado diretamente ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização e um segundo domínio de ligação ao HA ligado direta ou indiretamente por meio de um ligante a um domínio de multimerização. Por exemplo, o domínio de ligação ao HA é um módulo de ligação ou um domínio Gl. O primeiro e segundo domínios de ligação de HA podem ser o mesmo ou diferentes. Em um exemplo particular, o primeiro e segundo domínios de ligação ao HA são um módulo de ligação TSG-6, uma variante do mesmo, ou uma porção suficiente do mesmo, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, o TSG-6-LM contém uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418 ou uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, o módulo de ligação apresenta, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418 pela qual a HABP se liga especificamente ao HA. Em alguns métodos aqui fornecidos, o módulo de ligação contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418.
[0019] Nos métodos fornecidos, as HABPs, domínios de ligação ao HA, módulos de ligação, ou porções dos mesmos, podem ser ligados a um domínio de multimerização que é selecionado entre uma região constante de imunoglobulina (Fc), um fecho de leucina, regiões hidrofóbicas complementares, regiões hidrofílicas complementares, domínios de interação proteína-proteína compatíveis, tióis livres que formam uma ligação intermolecular de dissulfeto entre duas moléculas, e uma protuberância-em-cavidade e uma cavidade de compensação de tamanho idêntico ou semelhante que formam multímeros estáveis.
Em um exemplo particular, o domínio de multimerização é um domínio de Fc ou uma variante deste que efetiva a multimerização.
Por exemplo, o domínio Fc é de IgG, IgM ou IgE, ou o domínio Fc tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 359. Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, HABP é uma proteína de fusão que contém um módulo de ligação TSG-6 e um domínio Fc de imunoglobulina.
Por exemplo, HABP é TSG -6-LM-Fc que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 212, e se liga especificamente ao HA, tal como uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 212, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA.
Em exemplos particulares, HABP tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212 ou 215. Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, HABP pode ser TSG-6-LM-Fc/nHep que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 215 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 215 e, especificamente, se liga ao HA, tal como uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 215, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA.
[0020] Em determinados métodos aqui previstos, HABP é TSG-6 ou uma região de ligação ao hialuronan do mesmo. Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, HABP ou TSG-6 tem uma afinidade de ligação ao HA de pelo menos 1 x 10º M, 2 x 10º MC, 3 x 10º MU, 4 x 10º MI, 5 x 10º MO, 6 x 10º MC, 7 x 10º MC, 8 x 10º MT, 9 x 10º MI, 1x 10º MT ou superior. Em outros exemplos, HABP ou TSG-6 é conjugado com uma porção detectável que é marcada de forma detectável ou que possa ser detectada. Por exemplo, HABP ou TSG-6 é biotinilado.
[0021] Em alguns exemplos dos métodos aqui proporcionados a amostra é uma amostra de tecido do estroma, tal como uma amostra de tecido de estroma do tumor. O tecido recolhido nos métodos aqui presentes pode ser fixado, fresco, congelado ou embebido em parafina. Em alguns exemplos, a amostra é colhida a partir de uma biópsia de um tumor sólido, por exemplo, obtido por biópsia de agulha, agulha guiada por CT, biópsia aspirativa, biópsia endoscópica, biópsia por broncoscopia, lavagem brônquica, biópsia incisional, biópsia excisional, biópsia por punch, biópsia por raspagem, biópsia de pele, biópsia de medula óssea, e biópsia Loop Electrosurgical Excision Procedure (LEEP). Em outros exemplos, a amostra é uma amostra de fluido que é sangue, soro, urina, suor, sêmen, saliva, fluido cerebro-espinal, ou a amostra de linfa. Em qualquer um dos métodos aqui proporcionados, a amostra pode ser obtida a partir de um mamífero. Em um exemplo especial, o mamífero é um ser humano.
[0022] Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o tumor pode ser de um câncer selecionado entre o câncer de mama, câncer pancreático, câncer de ovário,
câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pulmão de células não-pequenas, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas (SCC), câncer de tireoide, câncer cervical, câncer uterino, câncer de próstata, câncer testicular, câncer cerebral, câncer de bexiga, câncer de estômago, hepatoma, melanoma, glioma, retinoblastoma, mesotelioma, mieloma, linfoma e leucemia. Em alguns exemplos, o tumor é um câncer que é um câncer de fase final, um câncer metastático e um câncer indiferenciado.
[0023] Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente anti-hialuronan pode ser um agente que degrada hialuronan, ou pode ser um agente que inibe a síntese de hialuronan. Por exemplo, o agente anti- hialuronan pode ser uma enzima de degradação de hialuronan. Em outro exemplo, o agente anti-hialuronan é um agente que inibe a síntese de hialuronan. Por exemplo, o agente anti- hialuronan é um agente que inibe a síntese de hialuronan como uma molécula de ácido nucleico sense ou anti-sense contra uma sintase de HA ou é um fármaco de pequena molécula. Por exemplo, um agente anti-hialuronan é 4- metilumbeliferona (MU), ou um derivado seu, ou leflunomida ou um derivado seu. Tais derivados incluem, por exemplo, um derivado de 4- metilumbeliferona (MU), que é 6,7-di- hidroxi-4-metil- cumarina ou 5, 7-di-hidroxi-4-metil cumarina.
[0024] Em outros exemplos de métodos aqui proporcionados, a enzima degradadora de hialuronan é uma hialuronidase. Em alguns exemplos, a enzima degradadora de hialuronan é hialuronidase PH20 ou a forma truncada da mesma para a falta de um local de ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal ou uma parte do local de ligação de GPI. Em exemplos específicos, a hialuronidase PH20 é selecionada a partir de um ser humano,
macaco, bovino, ovino, rato, camundongo, ou porcos-da- Guiné. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan é um hialuronidase PH20 humana que é neutro-ativa e N- glicosilada, e é selecionada entre (a) um polipeptídeo que é uma hialuronidase PH20 de comprimento total ou é uma forma truncada do C-terminal de PH20, em que a forma truncada inclui, pelo menos, os resíduos de aminoácidos 36- 464 de SEQ ID NO: 1, tal como 36-481, 36-482, 36-483, em que a PH20 de comprimento completo tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; Ou (b) um polipeptídeo da hialuronidase compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polipeptídeo, Ou forma truncada da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou (c) um polipeptídeo da hialuronidase de (a) ou (b) compreendendo as substituições de aminoácidos, em que o polipeptídeo da hialuronidase tem uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2, ou com as formas truncadas correspondentes dos mesmos. Nos exemplos, a enzima degradadora de hialuronan é uma PH20 que compreende uma composição rHuPH20 designada.
[0025] Em outros exemplos, o agente anti- hialuronan é uma enzima de degradação de hialuronan que é modificada por conjugação com um polímero. O polímero pode ser um PEG e o agente anti-hialuronan uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado. Assim, em alguns exemplos dos métodos aqui proporcionados, a enzima degradadora de hialuronan é modificada por conjugação com um polímero. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan é conjugada a um PEG, assim, a enzima que degrada o hialuronan é
PEGuilada. Em um exemplo exemplificativo, a enzima degradadora de hialuronan é uma enzima PH20 PEGuilada (PEGPH20). Nos métodos aqui proporcionados, o corticosteroide pode ser um glucocorticoide que é selecionado entre cortisonas, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas e prednisonas.
[0026] É também aqui proporcionado um kit contendo um agente de ligação de hialuronan (HABP) para detectar a quantidade de hialuronan em uma amostra, em que a HABP não tenha sido preparada a partir de cartilagem de animais, e de uma enzima que degrada hialuronan. HABP pode ser gerada de forma recombinante ou sintética. Em alguns exemplos, HABP contém um módulo de ligação. Em outros exemplos, HABP contém dois ou mais módulos de ligação. Em alguns exemplos, o módulo de ligação, ou módulos, são a única porção HABP da molécula. Por exemplo, HABP contém um módulo de ligação selecionado entre CD44, LYVE-l, proteína de ligação/HAPLNI, HAPLN2, HAPLN3, HAPLNA4, aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, TSG-6, Stabilin- 1, Stabilin -2, CAB61358 e KIAAOS27 ou uma porção destes compreendendo um módulo de ligação, ou uma porção suficiente de um módulo de ligação para se ligar ao HA. Em outros exemplos, a HABP contém um domínio Gl de uma proteína de ligação ao hialuronan do tipo C, por exemplo, um domínio Gl selecionado entre Aggrecan Gl, Versican Gl, Neurocan Gl, e Brevican Gl. Em exemplos particulares, o domínio Gl é a única porção HABP da molécula.
[0027] Em alguns exemplos, o kit contém uma HABP contendo a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 222, 360, 361, 371-394 e 416-418, e 423-426, Ou uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,
92%, 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS : 207, 360, 361, 371-394, 416-418 e 423-426, e se liga especificamente ao HA, ou um domínio de ligação ao HA da mesma, ou uma porção suficiente da mesma, para se ligar especificamente ao HA. Em um exemplo, HABP contém um módulo de ligação TSG-6 (LM) ou uma porção suficiente do mesmo que especificamente se liga ao HA. Por exemplo, TSG-6 -LM contém a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, Ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácido para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418 e, especificamente, se liga ao HA. Em alguns exemplos, HABP contém um módulo de ligação que apresenta, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 360, pela qual a HABP se liga ao HA. Em exemplos particulares, HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418.
[0028] Em alguns exemplos de kits aqui proporcionados, o módulo de ligação TSG-6 é modificado para reduzir ou eliminar a ligação à heparina. Por exemplo, a ligação à heparina é reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais. Em alguns exemplos, o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 20, 34, 41, 54, 56, 72 ou 84, estabelecido na SEQ ID NO: 360, em que o resíduo de aminoácido correspondente é identificado por um alinhamento ao TSG-6- LM estabelecido na SEQ ID NO: 360. Por exemplo, a substituição de aminoácido é para um resíduo de aminoácido não básico selecionado a partir de Asp (D), GIu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gin (0), Ala (A), Val (V), He (1) Leu (L), Met (M), Phe (F), Tyr (Y) e Trp (W). Assim, é aqui proporcionado um kit em que o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácidos correspondente à substituição de aminoácido K20A, K34A ou K41A em um TSG-6- LM estabelecido na SEQ ID NO: 360 ou o seu substituto no resíduo correspondente em outro TSG-6-LM. Por exemplo, o módulo de ligação TSG-6 contém substituições de aminoácidos correspondentes às substituições de aminoácidos K20A, K34A e K41A em um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360, ou à substituição ao resíduo correspondente em outro TSG-6-LM. São também aqui proporcionados, kits em que a HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 361 ou 416, ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 361 ou 416, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, HABP contém um módulo de ligação que apresenta, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 361 ou 416, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA. Em exemplos particulares, a HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO:361 ou 416. Em outros exemplos, o módulo de ligação é a única parte TSG-6 de HABP.
[0029] Em alguns exemplos de kits aqui proporcionados, a HABP é um multímero contendo um primeiro domínio de ligação ao HA ligado diretamente ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização, e um segundo domínio de ligação ao HA ligado diretamente ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização. Por exemplo, o domínio de ligação ao HA é um módulo de ligação ou um domínio Gl. O primeiro e segundo domínios de ligação ao HA podem ser o mesmo ou diferentes. Em um exemplo particular, o primeiro e segundo domínios de ligação ao HA são um módulo de ligação TSG-6, uma variante sua ou uma porção suficiente sua, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, o TSG-6-LM contém uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418, ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, o módulo de ligação apresenta, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA. Em alguns métodos aqui fornecidos, o módulo de ligação contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418.
[0030] Nos kits fornecidos, as HABPs podem ser ligadas a um domínio de multimerização que é selecionado entre uma região constante de imunoglobulina (Fc), um fecho de leucina, regiões hidrofóbicas complementares, regiões hidrofílicas complementares, domínios de interação proteína-proteína compatíveis, tióis livres que formam uma ligação intermolecular de dissulfeto entre duas moléculas, e uma protuberância-em-cavidade e uma cavidade de compensação de tamanho idêntico ou semelhante que formam multímeros estáveis. Em um exemplo particular, o domínio de multimerização é um domínio de Fc ou uma variante deste que efeitiva a multimerização. Por exemplo, o domínio Fc é de IgG, IgM ou IgE, ou o domínio Fc tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 359. Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, HABP é uma proteína de fusão que contém um módulo de ligação TSG-6 e um domínio Fc de imunoglobulina. Por exemplo, HABP é TSG -6-LM-Fc que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212 ou 215, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 212 ou 215, e se liga especificamente ao HA, tal como uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 212 ou 215, pela qual a HABP se liga especificamente a HA. Em exemplos particulares, HABP tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 212 ou 215. Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, HABP pode ser TSG-6-LM-Fc/nHep que tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 215 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 215 e, especificamente, se liga ao HA, tal como uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 215, pela qual a HABP se liga especificamente ao HA.
[0031] Em exemplos particulares de kits aqui proporcionados, HABP é uma região de ligação a hialuronan ou TSG-6 da mesma. Em alguns exemplos dos métodos aqui fornecidos, HABP possui uma afinidade de ligação, representada pela constante de associação (Ka) para HA de pelo menos, 10º Nº, por exemplo, pelo menos, 1 x 10º MN, 2 x 10º MC, 3 x 10º MT, 4 x 10º MO, 5 x 10º MI, 6 x 10º MT, 7 x 10º Mo, 8 x 10º Mo, 9 x 10º Mo, 1x 10º M? ou superior. Por exemplo, HABP possui uma afinidade de ligação, representada pela constante de dissociação (Kd) para HA de pelo menos, menos do que, ou menor do que 1x10 M, 9x10 *M, 8x10 º M, 7x10 ºM, 6x10 MM, 5x10 ºM, 4x10 ºM, 3x10ºM, 2x10M, 1x10 ºM, 9x10 ºM, 8x10 ºM, 7x10 MM, 6x10 ºM, 5x10 ºM, 4x10 ºM, 3x10 ºM, 2x10 M, 1x10 º*M ou Kd inferior. Em outros exemplos, HABP é conjugada com uma porção detectável que é marcada de forma detectável ou que possa ser detectada. Por exemplo, a HABP é biotinilada.
[0032] são também aqui proporcionados kits contendo um agente de ligação a hialuronan (HABP) para detectar a quantidade de hialuronan em uma amostra, em que a HABP não tenha sido preparada a partir de cartilagem animal, e um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Qualquer um dos kits aqui proporcionados podem ainda conter os reagentes para a detecção da HABP. Em qualquer exemplo dos kits aqui proporcionados, o agente anti-hialuronan pode ser qualquer um dos acima descritos, ou qualquer outra parte inclusa. Por exemplo, o agente anti-hialuronan pode ser uma enzima degradante de hialuronan como uma hialuronidase. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan é hialuronidase PH20 ou a forma truncada da mesma, para a falta de um local de ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal ou uma parte do local de ligação de GPI. Em alguns exemplos, PH20 é selecionada a partir de um ser humano, macaco, bovino, ovino, rato, camundongo, ou porco-da-Guiné PH20. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan é um hialuronidase PH20 humana que é neutro-ativa e N- glicosilada, e é selecionada entre (a) um polipeptídeo que é uma hialuronidase PH20 de comprimento total ou é uma forma truncada do C-terminal de PH20, em que a forma truncada inclui, pelo menos, os resíduos de aminoácidos 36- 464 de SEQ ID NO: 1, em que a PH20 de comprimento completo tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou (b) um polipeptídeo da hialuronidase compreendendo uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 983%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polipeptídeo, ou forma truncada da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2; ou (c) um polipeptídeo da hialuronidase de (a) ou (b) compreendendo as substituições de aminoácidos, em que o polipeptídeo da hialuronidase tem uma sequência de aminoácidos que possui pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polipeptídeo descrito na SEQ ID NO: 2, Ou com as formas truncadas correspondentes dos mesmos. Em exemplos particulares, a enzima degradadora de hialuronan é uma PH20 que compreende uma composição rHuPH20 designada. Em alguns exemplos, a enzima degradadora de hialuronan é modificada por conjugação com um polímero, tal como, por exemplo, um PEG, e a enzima que degrada hialurônico é PEGuilada. Portanto, é aqui proporcionado um kit em que a enzima degradadora de hialuronan é uma enzima PH20 PEGuilada (PEGPH20). São também aqui fornecidos kits que contêm ainda um corticosteroide. Qualquer um dos kits fornecidos aqui podem ainda conter um rótulo ou bula para utilização dos seus componentes.
[0033] são aqui proporcionados métodos de utilização de uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) para seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), em que a HABP não tenha sido preparada ou isolada a partir de cartilagem de animais. Aqui também estão presentes as composições farmacêuticas que contêm uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) para utilização na seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), em que a HABP não tenha sido preparada ou isolada a partir de cartilagem animal.
[0034] são aqui proporcionados métodos de utilização de uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) para prever a eficácia de tratamento de um indivíduo com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), em que a HABP não tenha sido preparada ou isolada a partir de cartilagem de animais. Aqui também estão presentes composições farmacêuticas que contêm uma proteína de ligação a hialuronan (HABP) para prever a eficácia de tratamento de um indivíduo com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), em que a HABP não tenha sido preparada Ou isolada a partir de cartilagem de animais.
[0035] Em qualquer uma das utilizações ou composições farmacêuticas aqui fornecidas, HABP pode conter um módulo de ligação (ou módulos) ou um domínio Gl. Em alguns exemplos, HABP contém um módulo de ligação TSG-6 (LM), uma variante sua, ou uma porção sua suficiente, que se liga ao HA. Em um exemplo particular, o módulo de ligação TSG-6 é modificado para reduzir ou eliminar a ligação à heparina. Em alguns exemplos, a HABP contém uma sequência de aminoácidos conforme descrito em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 212, 215, 222, 360, 361, 371-394 e 416-418, e 423-426, Ou uma sequência de aminoácidos que exibem pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92% 93%, 95%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, Ou mais de identidade de sequência para uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 212, 215, 222, 360, 361,
371-394 e 416-418, e 423-426 e se liga especificamente ao HA, ou um domínio de ligação ao HA dos mesmos, ou uma porção suficiente de ligação dos mesmos, para se ligarem especificamente ao HA.
[0036] É também aqui proporcionado um multímero TSG-6-LM contendo um primeiro módulo de ligação direta ou indiretamente ligado através de um ligante a um domínio de multimerização, e um segundo módulo de ligação direta ou indiretamente ligado através de um ligante a um domínio de multimerização, em que o primeiro e segundo polipeptídeos não fazem parte da sequência de comprimento total de TSG-6. Em alguns exemplos, o módulo de ligação é a única porção TSG-6 do primeiro polipeptídeo e do segundo polipeptídeo. O primeiro e segundo módulos de ligação podem ser o mesmo ou diferentes. Em alguns exemplos, o módulo de ligação contém uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418 ou uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, que se liga especificamente ao HA. Por exemplo, o módulo de ligação exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, que se liga especificamente ao HA. Em alguns exemplos, o módulo de ligação contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418.
[0037] Em alguns exemplos, o módulo de ligação TSG-6 é modificado para reduzir ou eliminar a ligação à heparina. A ligação a heparina é reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais. Em alguns exemplos, o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 20, 34, 41, 54, 56, 72 ou 84, estabelecido na SEQ ID NO: 360, em que um resíduo de aminoácido correspondente é identificado por alinhamento de um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360. Por exemplo, a substituição de aminoácidos está em um TSG- 6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 207 e a substituição Ou substituições de aminoácidos está no resíduo de aminoácido 21, 35, 42, 55, 57, 73 ou 85. A substituição de aminoácidos pode ser a de um resíduo de aminoácido não básico selecionado a partir de Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (7), Asn (N), Gin (0), Ala (A), Val (V), He (1), Leu (L), Met (M), Phe (F), Tyr (Y) e Trp (W). Por exemplo, o módulo de ligação TSG-6 contém uma substituição de aminoácidos correspondente às substituições de aminoácidos K20A, K34A ou K41A em um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360, ou à substituição pelo resíduo correspondente em outro TSG-6-LM.
Em outro exemplo particular, o módulo de ligação TSG-6 contém substituições de aminoácidos correspondentes às substituições de aminoácidos K20A, K34A e K41A em um TSG-6- LM estabelecido na SEQ ID NO: 360, ou a substituição pelo resíduo correspondente no outro TSG-6-LM.
Por exemplo, a HABP contém um módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 361 ou 416 ou uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 361 ou 416, que se liga especificamente ao HA.
Por exemplo, o módulo de ligação apresenta, pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 361 ou 416, e se liga especificamente ao HA.
Em exemplos particulares, o módulo de ligação contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 361 ou 416.
[0038] É também aqui proporcionado um multímero TSG-6-LM em que o domínio de multimerização é selecionado entre uma região constante de imunoglobulina (Fc), um fecho de leucina, regiões hidrofóbicas complementares, regiões hidrofílicas complementares, domínios de interação proteína-proteína compatíveis, tióis livres que formam uma ligação intermolecular de dissulfeto entre duas moléculas, e uma protuberância-em-cavidade e uma cavidade de compensação de tamanho idêntico ou semelhante que formam multímeros estáveis. Em alguns exemplos, o domínio de multimerização é um domínio de Fc ou uma variante deste que efetiva a multimerização. Por exemplo, o domínio Fc é de IgG, IgM ou um IgE. Em um exemplo particular, o domínio Fc tem uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:
359.
[0039] É também aqui proporcionado um multímero TSG-6-LM contendo um módulo de ligação TSG-6 e um domínio Fc de imunoglobulina. Em alguns exemplos, o multímero TSG- 6-LM contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 212 ou 215, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65% de identidade de sequência de aminoácidos para a SEQ ID NO: 212 ou 215. Por exemplo, o multímero TSG -6 contém uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 9394 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência para a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 212 ou 215, e que se liga especificamente ao HA. Em exemplos particulares, o multímero TSG-6-LM contém uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 212 ou
215. Em alguns exemplos, o multímero TSG -6-LM tem uma afinidade de ligação ao HA de pelo menos 10' M', por exemplo, pelo menos, 1 x 10º Mº, 2 x 10º Mo, 3 x 10º Mo, 4 x 10º MT, 5 x 10º M, 6 x 10º MC, 7 x 10º MO, 8 x 10º MO, 9 x 10º Mº, 1x 10º M* ou inferior.
[0040] São também aqui fornecidos métodos de seleção de um indivíduo, previsão de eficácia e/ou monitoramento do tratamento, usando qualquer uma das HABP acima fornecidas para detectar HA in vivo por métodos de imagem. O método de imagem in vivo pode ser imagem de ressonância magnética (MRI), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada (CT), tomografia axial computadorizada (CAT), tomografia computadorizada de feixe de elétrons (EBCT), tomografia computadorizada de alta resolução (HRCT), tomografia hipocicloidal, tomografia por emissão de pósitrons (PET), cintilografia, câmera de gama, detector de B+, um detector de y, imagens de fluorescência, imagens de pouca luz, raios-X, e/ou imagem de bioluminescência. Em tais métodos, a HABP é conjugada, diretamente ou indiretamente, a uma parte que fornece um sinal ou induz um sinal que é detectável in vivo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0041] Esboço: A. DEFINIÇÕES B. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A HIALURONAN E DIAGNÓSTICO DE
ACOMPANHAMENTO
1. Acumulação de Hialuronan na Doença e Correlação com Prognóstico
2. Terapia de tumores com um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan) e capacidade de resposta ao tratamento
3. Reagente e Diagnóstico de Proteínas de Ligação ao Hialuronan (HABPs)
4. Diagnóstico de acompanhamento e Métodos prognósticos C. PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO HIALURONAN (HABPS) PARA USO COMO
UM DIAGNÓSTICO DE ACOMPANHAMENTO
1. Proteínas de Ligação ao HA com Módulos de ligação ou Domínios Gl a. Tipo A: Subgrupo TSG-6 i. TSG-6 ii. Stabilin- 1 e Stabilin-2 b. Tipo B: subgrupo CD44 i. CD44 ii. LYVE-l c. Tipo C : sub-grupo de proteína de ligação i. HAPLN/família de proteína de Ligação (1) HAPLNI (2) HAPLN2 (3) HAPLN3 (4) HAPLNA4 (5) Aggrecan (6) Brevican (7) Versican (8) Neurocan (9) Phosphacan
2. Proteínas de Ligação ao HA sem módulos de ligação a. HABP1/C1QBP b. lailina c. RHAMM d. Outros
3. Modificações de Proteínas de Ligação ao HA a. Multímeros de HABP i. Ligantes de peptídeos ii. Agentes de ligação heterobifuncionais iii. Domínios de multimerização de polipeptídeo (1) domínio de imunoglobulina (a) Domínio Fc (2) Fecho de leucina (3) Interação proteína-proteína entre Subunidades iv. Outros domínios de multimerização b. Mutações para melhorar a ligação HA c. Modificações de Proteínas de Ligação HA para Detecção i. Conjugação de proteínas detectáveis ou porções
4. Seleção de Proteínas de ligação HA para utilização em diagnóstico D. ENSAIOS E CLASSIFICAÇÃO
1. Ensaios para medição de hialuronan a. Métodos Histoquímicos e Imuno-histoquímicos b. Ensaios de ligação de Fase Sólida c. Ensaios de imagem in vivo
2. Classificação de indivíduos E. TRATAMENTO DO INDIVÍDUO SELECIONADO COM UM AGENTE ANTI-
HIALURONAN
1. Agente anti-hialuronan a. Agentes que inibem a síntese de hialuronan b. Enzimas que degradam hialuronan i. hialuronidases (1) hialuronidases do tipo mamífero (a) PH20 (2) Outras hialuronidases (3) Outras enzimas que degradam Hialuronan ii. Enzimas que degradam hialuronan solúvel
(1) PH20 Humana Solúvel (2) rHuPH20 iii. Glicosilação de enzimas que degradam hialuronan àiv. Enzimas que degradam hialuronan (conjugado de polímero) modificado
2. Composições e Formulações Farmacêuticas
3. Dosagens e Administração a. Administração de uma enzima degradadora de hialuronan PEGuilado
4. Tratamentos combinados F. MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPEPTÍDEOS
CODIFICADOS DE ENZIMAS QUE DEGRADAM HIALURONAN E PROTEÍNAS LIGADAS AO HIALURONAN
1. Vetores e Células
2. Expressão a. células procariotas b. células de levedura c. células de insetos d. células de mamíferos e. plantas
3. Técnicas de purificação
4. PEGuilação de polipeptídeos de enzimas que degradam hialuronan G. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES E MONITORAMENTO DOS EFEITOS DOS AGENTES ANTI-HIALURONAN
1. Métodos para avaliar os efeitos colaterais
2. Avaliação de biomarcadores associados à atividade de um Agente anti-hialuronan (por exemplo, uma atividade de enzima que degrada hialuronan) a. Ensaios para avaliar a atividade de uma enzima que degrada hialuronan b. Medição de catabólitos HA c. Atividade metabólica do tumor d. Aumento da difusão aparente e melhora na Perfusão do Tumor
3. Tamanho e Volume do tumor
4. Ensaios Farmacocinéticos e Farmacodinâmicos H. KITS E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO IT. EXEMPLOS A. DEFINIÇÕES
[0042] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por um perito na arte à qual a invenção pertence. Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos publicados e publicações, sequências GenBank, sites e outros materiais publicados referidos ao longo de toda a presente descrição, a menos que indicado de outra forma, são incorporados por referência na sua totalidade. No caso em que exista uma pluralidade de definições para termos aqui presentes, aqueles nesta seção prevalecem. sempre que se faça referência a uma URL ou outros identificadores ou endereços, entende-se que tais identificadores podem mudar e informações particulares na internet podem ir e vir, mas a informação equivalente é conhecida e pode ser facilmente acessada, como através de pesquisa na internet e/ou bases de dados apropriadas. A referências aos mesmos evidencia a disponibilização e divulgação pública de tais informações.
[0043] Tal como aqui utilizado, um diagnóstico de acompanhamento refere-se a um método e/ou um reagente de diagnóstico que é usado para identificar indivíduos sensíveis ao tratamento, com um tratamento particular, ou para monitorar o tratamento e/ou para identificar uma dose eficaz para um indivíduo ou sub-grupo ou outro grupo de indivíuduos. Para os fins aqui descritos, um diagnóstico de acompanhamento refere-se aos reagentes, tais como proteínas TSG-6 modificadas, que são usadas para detectar hialuronan em uma amostra. O diagnóstico de acompanhamento refere-se a reagentes e também ao (s) teste (s) que é/são realizados (s) com o reagente.
[0044] Tal como aqui utilizado, hialuronan (HA, também conhecido como ácido hialurônico ou hialuronato) refere-se a um polímero de ocorrência natural de unidades dissacarídicas repetidas de N-acetilglucosamina e de ácido D-glucurônico. O hialuronan é produzido por certos tumores.
[0045] Tal como aqui utilizado, "HA elevado", com referência à quantidade ou nível de HA em um tecido ou amostra de fluido corporal, refere-se ao grau ou extensão do HA na amostra de tecido ou fluido do corpo, em comparação com um tecido normal ou saudável, ou amostra do fluido corporal. A quantidade de HA é maior se a quantidade for pelo menos, ou, pelo menos cerca de 2,5 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes ou mais elevada do que a quantidade ou nível de HA em um tecido normal ou saudável correspondente. Entende-se que a quantidade de HA pode ser determinada e quantificada ou semi-quantificada usando métodos tais como ensaios de ligação em fase sólida ou histoquímica. Por exemplo, a quantidade pode basear-se na comparação dos níveis de plasma ou na comparação da intensidade da coloração (por exemplo, porcentagem de pixels positivos), como determinado por histoquímica. Por exemplo, HA elevado existe se o marcador de HA por histoquímica ou outro método é de HA”? e/ou se há coloração de HA de mais de 25% da seção do tumor. Por exemplo, existe HA elevado se houver uma relação de coloração positiva forte (tal como coloração marrom) para a soma do total de área colorida que é maior do que
25% de coloração positiva forte para a coloração total do tecido do tumor.
[0046] Tal como aqui utilizado, um score de HA refere-se a uma contagem semi-quantitativa de níveis de positividade de HA sobre os membros da célula e no estroma de tumores. O score pode ser determinado por detecção de HA em tecidos tumorais, tal como fixado em formalina e tecido embebido em parafina, por métodos histoquímicos, tais como os métodos de imunohistoquímica ou pseudo imuno- histoquímica, para HA utilizando uma HABP. O grau de coloração em células e estroma pode ser determinado visualmente sob um microscópio ou por programas e softwares de algoritmo de computador disponíveis. Por exemplo, as imagens podem ser analisadas quantitativamente usando um algoritmo de contagem de pixels para coloração de HA (por exemplo, Software Aperio Spectrum e outros "métodos convencionais que medem ou quantificam ou semi-quantificam o grau de coloração). Um tumor é classificado ou marcado como HA"**" (HA **) sob uma coloração forte de HA de mais de 25% da seção de tumor; como HA"º*"ra*º (HA **) na coloração forte de HA entre 10 e 25% da seção do tumor; e como HA“ (HA **) na coloração forte de HA de menos de 10% da seção de tumor. Por exemplo, uma proporção de coloração positiva forte (tal como coloração marrom) para a soma do total de área colorida pode ser calculada e marcada, se a proporção for superior a 25% de coloração positiva forte para coloração total de tecido tumoral é marcado como HA, se a proporção for de 10-25% de coloração positiva forte para coloração total de tecido tumoral é marcado como HA”, se a proporção for inferior a 10% de coloração positiva forte para coloração total de tecido tumoral é marcado como HA", e se a proporção de coloração positiva forte para coloração total for de 0, o tecido tumoral é marcado como 0. O método
Aperio, bem como o software para o mesmo, são conhecidos por peritos na arte (ver, por exemplo Patente dos EUA No.
8.023.714; Patente dos EUA no. 7, 257,268).
[0047] Tal como aqui utilizado, uma proteína de ligação a hialuronan (proteína de ligação ao HA; HABP) refere-se a qualquer proteína que se liga especificamente a HA para permitir a detecção do HA. A afinidade de ligação é uma que tenha uma associação constante Ka que seja pelo menos, cerca de, ou seja, pelo menos, 10' M'*. Para os métodos e produtos de diagnóstico de acompanhamento aqui previstos, a proteína de ligação ao HA é uma proteína sintética ou produzida de forma recombinante, não é uma proteína derivada de uma fonte biológica ou fisiológica, tal como cartilagem. Proteínas de ligação ao HA incluem domínios de ligação ao HA, incluindo módulos de ligação que se ligam ao HA e porções suficientes destes, que se ligam especificamente ao HA para permitir a sua detecção. Assim, HABPs incluem qualquer proteína que contenha uma região de ligação ao hialuronan, ou um domínio ou uma porção suficiente da mesma, para se ligar especificamente ao HA. Regiões de ligação ao hialuronan exemplares são módulos de ligação (domínios de ligação) ou domínios Gl. Uma porção suficiente inclui, pelo menos, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 95 ou mais aminoácidos contíguos de um domínio de ligação ou módulo de ligação. Proteínas de ligação ao HA também incluem proteínas de fusão que contêm uma proteína de ligação ao HA, e um ou mais polipeptídeos adicionais, incluindo domínios de multimerização. Exemplos de proteínas de ligação ao HA incluemy mas não estão limitadas a aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, TSG-6, TSG-6 mutantes, tais como as aqui fornecidas, incluindo os polipeptídeos que contêm os domínios de ligação ao HA, e os módulos de ligação dos mesmos que se ligam ao HA.
[0048] Tal como aqui utilizado, o domínio de ligação ao hialuronan ou um domínio de ligação ao AH refere-se a uma região ou domínio de um polipeptídeo de HABP que se liga especificamente ao hialuronan com uma afinidade de ligação que tem como uma constante de associação Ka, que é, pelo menos, cerca de ou é, pelo menos, 10'M ou 10'M ou maior, ou uma constante de dissociação Kd, que é inferior a 10 “Mou 10 M ou inferior. Domínios de ligação ao hialuronan exemplares incluem, por exemplo, módulos de ligação (também chamados de domínios de ligação aqui descritos) ou domínios Gl, ou porções suficientes de um módulo de ligação ou de domínio Gl que se ligam especificamente ao HA.
[0049] Tal como aqui utilizado, a referência a "a única porção de uma HABP" é um módulo de ligação ou domínio Gl ou variações gramaticais dos mesmos, significa que a molécula de HABP (por exemplo, um módulo de ligação TSG-6) consiste ou consiste essencialmente do módulo de ligação ou do domínio Gl, mas não inclui a sequência de comprimento total completa de aminoácidos da HABP de referência. Assim, a HABP contém apenas uma região de ligação ao hialuronan, ou uma porção suficiente da mesma, para se ligar especificamente ao HA. Entende-se que a HABP pode conter sequências adicionais de aminoácidos não-HABP, incluindo, mas não limitados às sequências que correspondem a uma porção detectável ou porção capaz de detecção, Ou um domínio de multimerização.
[0050] Tal como aqui utilizado, modificado, no que diz respeito às proteínas de ligação ao HA modificado refere-se às modificações para alterar, normalmente melhorar, uma ou mais propriedades de uma proteína de ligação ao HA, para detecção dos métodos de diagnóstico aqui fornecidos. As modificações incluem mutações que aumentam a afinidade e/ou especificidade da proteína para HA.
[0051] Tal como aqui utilizado, um domínio refere-se a uma porção (uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 7 ou mais aminoácidos) de um polipeptídeo que é estruturalmente e/ou funcionalmente distinguível ou definível. Por exemplo, um domínio inclui aqueles que podem formar uma estrutura dobrada, independentemente, dentro de uma proteína constituída por um ou mais motivos estruturais (por exemplo, combinações de hélices alfa e/ou cadeias beta ligados por regiões circulares) e/ou que seja reconhecido em virtude de uma atividade funcional, tal como a atividade de quinase. Uma proteína pode ter um, ou mais de um domínio distinto. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido ou distinguido pela homologia da respectiva sequência para os membros da família relacionados, tais como a homologia e motivos, que definem um domínio extracelular. Em outro exemplo, um domínio pode ser distinguido pela sua função, tal como por atividade enzimática, por exemplo, atividade da quinase, ou uma capacidade de interagir com uma biomolécula, tal como ligação de DNA, ligação do ligante e dimerização. Um domínio pode, independentemente, apresentar uma função Ou atividade, de tal modo que o domínio de forma independente ou fundido com outra molécula, pode exercer uma atividade, tal como, por exemplo, a atividade proteolítica Ou a ligação do ligante. Um domínio pode ser uma sequência linear de aminoácidos ou uma sequência não-linear de aminoácidos do polipeptídeo. Muitos polipeptídeos contêm uma pluralidade de domínios.
[0052] Tal como aqui utilizado, uma proteína de fusão refere-se a uma proteína quimérica contendo duas ou mais porções, de mais duas proteínas ou peptídeos que estão direta ou indiretamente ligados através de ligações peptídicas.
[0053] Tal como aqui utilizado, um domínio de multimerização refere-se a uma sequência de aminoácidos que promove a interação estável da molécula de polipeptídeo com uma outra molécula de polipeptídeo contendo um domínio de multimerização complementar, que pode ser o mesmo ou um domínio de multimerização diferente, para formar um multímero estável com o primeiro domínio. Geralmente, um polipeptídeo está ligado diretamente ou indiretamente ao domínio de multimerização. Domínios de multimerização exemplares incluem as sequências de imunoglobulina ou suas porções, fechos de leucina, regiões hidrofóbicas, regiões hidrofílicas, domínios de interação proteína-proteína compatíveis, tais como, mas não se limitando a uma subunidade R de PKA e um domínio de ancoragem (AD), um tiol livre que forma uma ligação de dissulfeto intermolecular entre duas moléculas, e uma protuberância-em-cavidade (por exemplo, “knobs into holes”) e uma cavidade de compensação de tamanho idêntico ou semelhante, que formam multímeros estáveis. O domínio de multimerização, por exemplo, pode ser uma região constante de imunoglobulina. A sequência de imunoglobulina pode ser um domínio constante de imunoglobulina, tal como o domínio Fc ou porções do mesmo, a partir de IgGl, IgG2, IgG3 ou subtipos de IgG4, IgA, IgE, IgD e IgM.
[0054] Tal como aqui utilizado, "knobs into holes” (também aqui referidos como protuberância-em- cavidade) refere-se a determinados domínios de multimerização modificados de tal forma que as interações estéricas entre esses domínios, não só promovem a interação estável, mas também promovem a formação de heterodímeros (ou multímeros) sobre homodímeros (ou homomultímeros) a partir de uma mistura de monômeros. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da construção de protuberâncias e cavidades. As protuberâncias podem ser construídas através da substituição de cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são opcionalmente criadas na interface de um segundo polipeptídeo, substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por menores (por exemplo, alanina ou treonina).
[0055] Tal como aqui utilizado, os domínios de multimerização complementares referem-se a dois ou mais domínios de multimerização que interagem para formar multímeros de polipeptídeos com ligações estáveis para cada um desses domínios. Domínios de multimerização complementares podem ser o mesmo domínio ou um membro de uma família de domínios, tais como, por exemplo, regiões Fc, fechos de leucina, e “knobs” e orifícios.
[0056] Tal como aqui utilizado,"Fc" ou "região Fc" ou "domínio Fc" refere-se a um polipeptídeo que contém a região constante de uma cadeia pesada de anticorpo, com exceção do primeiro domínio da região constante de imunoglobulina. Assim, Fc refere-se aos últimos dois domínios de imunoglobulina das regiões constantes de IgA, Igb, e IgE, ou os últimos três domínios de imunoglobulina das regiões constantes de IgE e IgM. Opcionalmente, um domínio Fc pode incluir a totalidade ou parte do N-terminal de articulação flexível para estes domínios. Para IgA e IgM, Fc pode incluir a cadeia J. Para um domínio Fc de IgG exemplar, contém domínios de imunoglobulina Cy2 e Cy3, e, opcionalmente, todos ou parte da articulação entre Cyl e Cy2. As fronteiras da região Fc podem variar, mas normalmente, incluem, pelo menos, parte da região de articulação. Além disso, Fc também inclui qualquer variante alélica ou da espécie, ou qualquer variante ou uma forma modificada, tal como qualquer variante ou forma modificada que altere a ligação para um FCcR ou altere uma função efetora mediada por Fc. Exemplos de sequências de outros domínios de Fc, incluindo domínios de Fc modificados são conhecidos.
[0057] Tal como aqui utilizado, "quimera de Fc" refere-se a um polipeptídeo quimérico em que um ou mais polipeptídeos estão ligados, diretamente ou indiretamente, a uma região Fc ou um seu derivado. Normalmente, uma quimera de Fc combina a região Fc de uma imunoglobulina com um outro polipeptídeo, tal como, por exemplo, um polipeptídeo ECD. Polipeptídeos Fc modificados Ou seus derivados são conhecidos por peritos na arte.
[0058] Tal como aqui utilizado, "multímero", com referência a uma proteína de ligação a hialuronan, refere- se a uma HABP que contém múltiplos locais de ligação ao HA, por exemplo, pelo menos dois, três, ou quatro locais de ligação ao HA. Por exemplo, um multímero de HABP refere-se a uma HABP que contém, pelo menos, dois módulos de ligação em que, cada um é capaz de se ligar ao HA. Por exemplo, um multímero pode ser gerado, por ligação, diretamente ou indiretamente, de dois ou mais módulos de ligação (por exemplo, o módulo de ligação TSG-6). A ligação pode ser facilitada pelo uso de um domínio de multimerização, tal como uma proteína Fc.
[0059] Tal como aqui utilizado, uma variante alélica ou uma variação alélica fazem referência a um polipeptídeo codificado por um gene que é diferente de uma forma de referência de um gene (ou seja, é codificado por um alelo). Normalmente, a forma de referência do gene codifica uma forma do tipo selvagem e/ou uma forma predominante de um polipeptídeo, de uma população ou membro, de uma espécie de referência única. Normalmente, as variantes alélicas, que incluem variantes entre algumas espécies, têm normalmente pelo menos 80%, 90% ou mais, de identidade de aminoácidos com uma forma do tipo selvagem e/ou uma forma predominante da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene, e se a comparação é feita entre espécies ou intra-espécies. Geralmente, variantes alélicas intra-específicas têm pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou mais, com uma forma do tipo selvagem e/ou uma forma predominante, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade com uma forma do tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo.
[0060] Tal como aqui utilizado, variantes de espécies referem-se a variantes do mesmo polipeptídeo entre duas ou mais espécies. Geralmente, variantes interespécies têm pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade ou mais, com uma forma de tipo selvagem e/ou forma predominante de outras espécies, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade com uma forma do tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo.
[0061] Tal como aqui utilizado, modificações refere-se à modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo, ou uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico, e inclui deleções, inserções, e substituições de aminoácidos e de nucleotídeos, respectivamente.
[0062] Tal como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, pasta, solução aquosa, não aquosa, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0063] Tal como aqui utilizado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou mais itens. A combinação pode ser de dois ou mais elementos separados, tais como dois ou mais conjuntos de composições, pode ser uma mistura dos mesmos, tal como uma única mistura de dois ou mais itens, ou qualquer variação. Os elementos de uma combinação são geralmente funcionalmente associados Ou relacionados. Um kit é uma combinação de pacote que, opcionalmente, inclui instruções para uso da combinação ou dos seus elementos.
[0064] Tal como aqui utilizado, níveis ou valores normais podem ser definidos em uma variedade de formas conhecidas por um perito na arte. Normalmente, os níveis normais referem-se aos níveis de expressão de um HA através de uma população saudável. Os níveis normais (ou níveis de referência) são baseados em medições de indivíduos saudáveis, como de uma fonte especificada (ou seja, sangue, soro, tecidos, ou outra fonte). Muitas vezes, um nível normal será especificado como uma "variação normal", que normalmente se refere ao intervalo de valores da média de 95% da população saudável. O valor de referência é aqui utilizado indiferentemente com o nível normal, mas pode ser diferente em relação aos níveis normais, dependendo dos indivíduos ou da fonte. Os níveis de referência são normalmente dependentes dos níveis normais de um determinado segmento da população. Assim, para efeitos desta invenção, um nível normal ou de referência é um padrão ou controle predeterminado, pelo qual um paciente teste pode ser comparado.
[0065] Tal como aqui utilizado, níveis elevados referem-se a qualquer nível de expressão ou quantidade de HA acima de um limiar recitado ou normal.
[0066] Tal como aqui utilizado, amostra biológica refere-se a qualquer amostra obtida a partir de uma fonte viva ou viral, ou outra fonte de macromoléculas e biomoléculas, e inclui qualquer tipo de célula ou tecido de um indivíduo, a partir do qual, o ácido nucleico ou proteína, ou outra macromolécula pode ser obtida. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente a partir de uma fonte biológica, Ou que seja processada. Por exemplo, ácidos nucleicos isolados que são amplificados constituem uma amostra biológica. As amostras biológicas incluem, mas não estão limitadas aos fluidos corporais, tais como sangue, plasma, soro, fluido cérebro-espinal, fluido sinovial, urina e suor, tecidos e amostras de órgãos de animais, incluindo amostras de tumores biopsiados.
[0067] Tal como aqui utilizado, detecção inclui métodos que permitem a visualização (por olho ou equipamento) de uma proteína. Uma proteína pode ser visualizada utilizando um anticorpo específico para a proteína. A detecção de uma proteína pode também ser facilitada por meio da fusão de uma proteína com uma marcação, incluindo um epítopo marcado ou tag.
[0068] Tal como aqui utilizado, uma marcação refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indiretamente com um polipeptídeo, de modo a gerar um polipeptídeo marcado. O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de uma composição de composto de substrato que é detectável. Exemplos não limitativos de marcadores incluem porções fluorogênicas, proteína fluorescente verde, Ou luciferase.
[0069] Tal como aqui utilizado, afinidade refere- se a força da interação entre duas moléculas, tal como, entre uma proteína de ligação ao hialuronan e hialuronan. A afinidade é frequentemente medida pela constante de equilíbrio de associação (Ka) ou constante de equilíbrio de dissociação (Kd). A afinidade de ligação entre as moléculas aqui descritas, tem, normalmente, uma afinidade de ligação com uma constante de associação (Ka) de, pelo menos, cerca de 10º 1/mol, 10º l1/mol, 10º l1/mol, 10º l1/mol ou mais (geralmente 10' 1/mol- 10º 1/mol ou maior). A afinidade de ligação de moléculas aqui presente também pode ser descrita com base na constante de dissociação (Kd) de, pelo menos, menos, ou menor do que, ou 10 M, 10º M, 10º M, 10º M, 107 "!M, 10º M ou inferior.
[0070] Tal como aqui utilizada, a referência a uma porção suficiente da mesma que se liga ao HA, significa que a molécula de ligação apresenta uma Ka de, pelo menos, ou pelo menos cerca de 10º a 10º Mº, ou uma constante de dissociação (Kd) de 1 x 107? ou 1 x 10º Mou inferior ao HA.
[0071] Tal como aqui utilizado, especificidade (também aqui referida como seletivamente) no que diz respeito a duas moléculas, tais como em relação à uma proteína de ligação a hialuronan e HA, refere-se a uma maior afinidade que as duas moléculas exibem, uma para a outra, em relação à sua afinidade para outras moléculas. Assim, uma proteína de ligação ao hialuronan (HABP) com uma especificidade maior para HA significa que se liga a outras moléculas, tais como à heparina, com uma afinidade mais baixa do que quando se liga ao HA. A ligação específica normalmente resulta em ligação seletiva.
[0072] Tal como aqui utilizado, um "domínio Gl" refere-se a um domínio de ligação ao HA de um tipo C da proteína de ligação ao HA. O domínio Gl contém um módulo de
Ig e dois módulos de ligação. Proteínas exemplares que contêm um domínio Gl incluem proteína HAPLNl/proteína de ligação, HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLNA4, aggrecan, versican, brevican, neurocan e phosphacan.
[0073] Tal como aqui utilizado, os módulos de ligação ou domínios de ligação, aqui utilizados alternadamente, são domínios de ligação ao hialuronan que ocorrem em proteínas e facilitam a ligação ao HA, e que estão envolvidos na montagem de matriz extracelular, adesão celular e migração. Por exemplo, o módulo de ligação de TSG-6 humano contém duas hélices alfa e duas folhas beta antiparalelas dispostas em torno de um núcleo hidrofóbico. Isto define a dobra de consenso para a superfamília do módulo de ligação, que inclui CD44, TSG-6, proteína de ligação à cartilagem, agrecan e outros, tal como aqui descritos. Tal como aqui utilizado, um "módulo Ig" refere- se à porção do domínio Gl HABPs do tipo C, que se encontra envolvida na ligação entre HABPs do Tipo C. Módulos Ig de hialuronans do tipo C interagem um com o outro, para formar uma estrutura terciária estável com hialuronan.
[0074] Tal como aqui utilizado, um "ensaio de ligação de fase sólida" refere-se a um ensaio in vitro em que um antígeno entre em contato com um ligante, em que um antígeno ou ligante, é ligado a um suporte sólido. A fase sólida pode ser uma fase em que os componentes são fisicamente imobilizados a um suporte sólido. Por exemplo, os suportes sólidos incluem, mas não estão limitados a uma placa de microtitulação, uma membrana (por exemplo, nitrocelulose), um grânulo, uma vareta, uma placa de cromatografia em camada fina, ou outro suporte sólido. Após a interação antígeno-ligante, os componentes indesejados ou não-específicos podem ser removidos (por exemplo, por lavagem) e o complexo antígeno-ligante detectado.
[0075] Tal como aqui utilizado, a prevenção da eficácia do tratamento com um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan, significa que o diagnóstico de acompanhamento pode ser um indicador de prognóstico de tratamento com um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan. Por exemplo, com base nos resultados de detecção de hialuronan ou outro marcador com o diagnóstico de acompanhamento, pode ser determinado que um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan, provavelmente possui algum efeito no tratamento de indivíduos.
[0076] Tal como aqui utilizado, indicador de prognóstico refere-se a um parâmetro que indica a probabilidade de um determinado resultado, de tal modo que a probabilidade de tratamento seja eficaz para uma doença particular ou indivíduo.
[0077] Tal como aqui utilizado, HA elevado em uma amostra, refere-se a uma quantidade de HA em uma amostra que é aumentada em comparação ao nível presente em uma amostra correspondente, a partir de uma amostra saudável ou em comparação com um padrão predeterminado.
[0078] Tal como aqui utilizado, níveis elevados de hialuronan referem-se aos valores de hialuronan, em particular, do tecido, fluido corporal ou de células, dependendo da doença ou condição, como uma consequência, ou de outro modo, observado na doença. Por exemplo, como consequência da presença de um tumor rico em hialuronan, os níveis de hialuronan (HA), podem ser elevados em fluidos corporais, tais como sangue, urina, saliva e soro, e/ou no tecido tumoral ou uma célula. O nível pode ser comparado com um padrão ou outro controle apropriado, tal como uma amostra comparável a partir de um indivíduo, que não tenha a doença associada ao HA, tal como um indivíduo que não possua um tumor.
[0079] Tal como aqui utilizado, os resíduos correspondentes referem-se aos resíduos que ocorrem em locais alinhados. Polipeptídeos relacionados ou variantes estão alinhados por qualquer método conhecido pelos peritos na arte. Tais métodos normalmente maximizam combinações, e incluem métodos tais como a utilização de alinhamentos manuais e dos numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos pelos especialistas na arte. Ao alinhar as sequências de polipeptídeos, um perito na arte pode identificar resíduos correspondentes, utilizando os resíduos de aminoácidos conservados e idênticos, como guias. Posições correspondentes também podem basear-se em alinhamentos estruturais, por exemplo, por meio de alinhamentos da estrutura da proteína simulados por computador. Em outros casos, as regiões correspondentes podem ser identificadas.
[0080] Tal como aqui utilizado, um agente anti- hialuronan refere-se a qualquer agente que modula a síntese ou degradação de hialuronan (HA), alterando, assim, os níveis de hialuronan em um tecido ou célula. Para os fins desta invenção, os agentes anti-hialuronan reduzem os níveis de hialuronan em um tecido ou células, em comparação com a ausência do agente. Tais agentes incluem compostos que modulam a expressão do material genético que codifica a sintase de HA(HAS), e outras enzimas ou receptores envolvidos no metabolismo do hialuronan, ou que modulam as proteínas que sintetizam ou degradam hialuronan, incluindo a função ou a atividade HAS. Os agentes incluem pequenas moléculas, ácidos nucleicos, peptídeos, proteínas ou outros compostos. Por exemplo, agentes anti-hialuronan incluem, mas não estão limitados a moléculas sense ou antisense,
anticorpos, enzimas, inibidores de moléculas pequenas e análogos de substrato HAS.
[0081] Tal como aqui utilizado, uma enzima que degrada hialuronan refere-se a uma enzima que catalisa a clivagem de um polímero de hialuronan (também referido como hialuronan ou HA) em fragmentos de peso molecular mais reduzido. Exemplos de enzimas que degradam hialuronan são hialuronidases, e em particular condroitinases e liases que têm a capacidade de despolimerizar hialuronan. Condroitinases exemplificativas que são enzimas que degradam hialuronan incluem, mas não estão limitados a, condroitina ABC liase (também conhecida como condroitinase ABC), condroitina AC liase (também conhecida como condroitina sulfato liase ou condroitina sulfato eliminase) e condroitina C liase. Condroitina ABC liase compreende duas enzimas, condroitina-sulfato-ABC endoliase (EC
4.2.2.20) e condroitina-sulfato-ABC exoliase (EC 4.2.2.21). Exemplos de condroitina-sulfato-ABC endoliases e condroitina-sulfato-ABC exoliases incluem, mas não estão limitados aos de Proteus vulgaris e Pedobacter heparinus (o Proteus vulgaris condroitina-sulfato-ABC endoliase estabelecido na SEQ ID NO: 98; Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1):39-46). Exemplos de enzimas de condroitinase AC de bactérias incluem, mas não estão limitados aos de Pedobacter heparinus, estabelecido na SEQ ID NO: 99, Victivallis vadensis, estabelecido na SEQ ID NO:100, e Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5) :387-444). Exemplos de enzimas condroitinase C da bactéria incluem mas não estão limitados aos de Streptococcus e Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al.
(1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
[0082] Como aqui utilizado, hialuronidase refere- se a uma classe de enzimas que degrada hialuronan. Hialuronidases incluem hialuronidases bacterianas (EC
4.2.2.1 ou EC 4.2.99.1), hialuronidases de sanguessugas, e outros parasitas, e crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidases de mamíferos (EC 3.2.1.35). Hialuronidases incluem qualquer uma de origem não humana, incluindo, mas não limitadas, a murina, canina, felina, leporino, aviária, bovina, ovina, suína, equina, de peixes, de rã, bacteriana, e qualquer sanguessuga, outros parasitas, e crustáceos. Exemplos de hialuronidases não-humanas incluem, hialuronidases de vacas (SEQ ID NOS:10, 11, 64 e BH55 (U.S. Pat. Nos. 5,747,027 e 5,827,721), vespa amarela (SEQ ID NOS:12 e 13), abelha (SEQ ID NO:14), vespão de cara branca (SEQ ID NO:15), vespa-do-papel(SEQ ID NO:16), camundongo (SEQ ID NOS:17-19, 32), porco (SEQ ID NOS:20-21), rato (SEQ ID NOS:22-24, 31), coelho (SEQ ID NO:25), ovelha (SEQ ID NOS:26, 27, 63 e 65), chimpanzé (SEQ ID NO:101), macaco Rhesus (SEQ ID NO:102), orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cynomolgus (SEQ ID NO:29), porco-da-guinea (SEQ ID NO:30), Arthrobacter sp. (cepa FB24 (SEQ ID NO:67)), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); sorotipo Ia (SEQ ID NO:72); sorotipo III (SEQ ID NO:73)), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO:74); cepa MRSA252 (SEQ ID NOS:75 e 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO:77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NOS:79 e 80); cepa USA300 (SEQ ID NO:81)), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO:83); sorotipo 2, cepa D39/NCTC
7466 (SEQ ID NO:84)), Streptococcus pyogenes (sorotipo Ml (SEQ ID NO:85); sorotipo M2, cepa MGAS 10270 (SEQ ID NO:86); sorotipo M4, cepa MGAS 10750 (SEQ ID NO:87); sorotipo M6 (SEQ ID NO:88); sorotipo Ml2, cepa MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 e 90); sorotipo M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO:91); sorotipo M28 (SEQ ID NO:92)), Streptococcus suis (SEQ ID NOS: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ESI 14 (SEQ ID NO:96)), e a enzima Streptomyces hyaluronolyticus hialuronidase, que é específica para oO hialuronan e não cliva a condroitina ou o sulfato de condroitina (Ohya, T. e Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys. Acta 198:607). Hialuronidase também incluem aquelas de origem humana. Hialuronidases humanas exemplares incluem HYAL1 HYAL1 (SEQ ID NO:36), HYAL2 (SEQ ID NO:37), HYAL3 (SEQ ID NO:38), HYAL4 (SEQ ID NO:39), e PH20 (SEQ ID NO:1). Também estão incluídas entre as hialuronidases, hialuronidases solúveis, incluindo, PH20 de ovinos e bovinos, PH20 humana solúvel e rHuPH20 solúvel. Exemplos de hialuronidases de bovinos ou ovinos solúveis disponíveis comercialmente incluem VitraseO (hialuronidase ovina) AmphadaseO (hialuronidase bovina) e Hydase" (hialuronidase bovina).
[0083] Tal como aqui utilizado, "hialuronidase testicular bovina purificada" refere-se a uma hialuronidase bovina purificada a partir de extratos de testículo bovino (ver Patente dos EUA. Nºs 2.488.564, 2.488.565, 2.806.815,
2.808.362, 2.676.139, 2.795.529, 5.747.027 e
5.827.721). Exemplos comercialmente disponíveis de hialuronidase testicular bovina purificada incluem AmphadaseO e Hydase", e hialuronidases bovinas, incluindo, mas não limitadas às disponíveis a partir de Sigma Aldrich, Abnova, EMD Chemicals, Gen Way Biotech, Inc., Raybiotech, Inc., e Calzyme. Também estão incluídas as hialuronidases bovinas produzidas de forma recombinante, tal como, mas não limitadas às geradas por expressão de uma molécula de ácido nucleico, conforme descrito em qualquer uma das SEQ ID NOS:190-192.
[0084] Tal como aqui utilizado, "hialuronidase testicular ovina purificada" refere-se a uma hialuronidase ovina purificada a partir de extratos de testículo ovinos (ver Patente dos EUA. Nºs 2.488.564, 2.488.565 e 2.806.815 e Requerimento de Patente Internacional PCT Nº WO2005/118799). Exemplos de extrato testicular ovino purificado disponível comercialmente incluem VitraseO e hialuronidases ovinas, incluindo, mas não limitadas às disponíveis em Sigma Aldrich, Cell Sciences, EMD Chemicals, GenWay Biotech, Inc., Mybiosource.com e Raybiotech, Inc. Também estão incluídas hialuronidases produzidas de forma recombinante, tais como ovinas, mas não limitadas às geradas por expressão de uma molécula de ácido nucleico, conforme descrito em qualquer das SEQ ID Nºs: 66 e 193-194.
[0082] Tal como aqui utilizado, "PH20" refere-se a um tipo de hialuronidase que ocorre no esperma e é neutro-ativa. PH-20 ocorre na superfície do espermatozoide e do acrossoma derivado do lisossoma, onde é ligada à membrana acrossomal interior. PH20 inclui aquelas de qualquer origem, incluindo, mas não limitadas as de origem humana, de chimpanzés, macacos cynomolgus, macaco Rhesus murino, bovino, ovino, porco-da-Guiné, de coelho e de rato. Polipeptídeos PH20 exemplares incluem aquelas de origem humana (SEQ ID NO: 1), chimpanzé (SEQ ID NO: 101), macaco Rhesus (SEQ ID NO: 102), macaco cynomolgus (SEQ ID NO: 29), vaca (SEQ ID NOS: 11 e 64), camundongo (SEQ ID NO: 32), rato (SEQ ID NO: 31), coelho (SEQ ID NO: 25), ovelha (SEQ ID NOS : 27, 63 e 65) e de porco-da-Guiné (SEQ ID NO: 30).
[0085] Referências para as enzimas que degradam hialuronan incluem polipeptídeos de enzimas que degradam polipeptídeos precursores, e enzimas que degradam hialuronan maduras (tais como aquelas em que a sequência de sinal foi removida), formas truncadas destas que possuem atividade, e incluem variantes alélicas e espécies variantes, variantes codificadas por variantes splice, e outras variantes, incluem polipeptídeos que possuem pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com os polipeptídeos precursores estabelecidos nas SEQ ID Nºs: 1 e 10-48, 63-65, 67-102, ou as formas maduras dos mesmos. Por exemplo, a referência à enzima degradadora de hialuronan inclui também as variantes do polipeptídeo precursor PH20 humanas estabelecidas na SEQ ID NOS :50-51. Enzimas degradantes de hialuronan incluem também aquelas que contêm modificações químicas ou pós-traducionais e aquelas que não contêm modificações pós-traducionais Ou química. Tais modificações incluem, mas não estão limitados a, PEGuilação, albuminação, glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, e outras modificações polipeptídicas conhecidas na arte. Uma hialuronidase PH20 incompleta é qualquer forma encurtada no terminal C da mesma, formas particularmente truncadas que são neutro-ativas quando N-glicosiladas.
[0086] Tal como aqui utilizado, uma "PH20 solúvel" refere-se a qualquer forma de PH20 que é solúvel sob condições fisiológicas. Uma PH20 solúvel pode ser identificado, por exemplo, pela sua partição na fase aquosa de uma solução de X-114 Tritono a 37ºC. (Bordier et al., (1981) UU. Biol. Chem., 256:1604-7). PH20 ancorada à membrana, tal como PH20 ancorada ao lipídeo, incluindo PH20 ancorada a GPI, vai particionar para a fase rica em detergente, mas irá particionar para a fase aquosa pobre em detergente, seguido pelo tratamento com fosfolipase-C. Incluídas entre as PH20 solúveis estão PH20 ancoradas à membrana, nas quais uma ou mais regiões associadas com a ancoragem de PH20 à membrana foram removidas ou modificadas, em que a forma solúvel retém a atividade de hialuronidase. PH20 solúveis também incluem PH20 solúveis recombinantes e as contidas em, ou purificadas a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, a partir de extratos de testículo de ovinos ou bovinos. Um exemplo de tais PH20 solúveis é a PH20 humana solúvel.
[0087] Tal como aqui utilizado, a PH20 humana solúvel ou sHuPH20 inclui polipeptídeos PH20 em que falta toda ou uma porção da sequência âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) na extremidade C-terminal, de tal forma que após a expressão, os polipeptídeos são solúveis sob condições fisiológicas. A solubilidade pode ser determinada por qualquer método adequado que demonstre a solubilidade sob condições fisiológicas. Exemplos de tais métodos é o ensaio X-l114 Triton O, que avalia oO particionamento na fase aquosa, e que é descrito acima e nos exemplos. Além disso, um polipeptídeo PH20 humano solúvel é, se produzido em células CHO, tal como células CHO-S, um polipeptídeo que é expresso e segregado para oO meio de cultura celular. Polipeptídeos PH20 humanos solúveis, no entanto, não estão limitados aos produzidos em células CHO, mas podem ser produzidos em qualquer célula ou por qualquer método, incluindo a expressão recombinante e síntese de polipeptídeos. A referência para secreção em células CHO é de definição. Assim, se um polipeptídeo pode ser expresso e segregado em células CHO e é solúvel, ou seja, divisões para a fase aquosa, quando extraído com X- 114 Tritono, é um polipeptídeo PH20 solúvel, ou não é assim produzido. Os polipeptídeos precursores para polipeptídeos sHuPH20 podem incluir uma sequência de sinal, tal como uma sequência de sinal heteróloga ou não heteróloga (isto é, nativa). Exemplos dos precursores são aqueles que incluem uma sequência de sinal, tal como a sequência de sinal de 35 aminoácidos, nas posições dos aminoácidos 1-35 (ver, por exemplo, os aminoácidos 1-35 da SEQ ID NO:1).
[0088] Tal como aqui utilizado, uma "PH20 solúvel estendida" ou "esPH20" inclui polipeptídeos PH20 solúveis que contêm resíduos até a sequência de sinal fixada à ancoragem ao GPI, e um ou mais resíduos contíguos da sequência de sinal fixada à ancoragem ao GPI, de modo que a esPH20 seja solúvel sob condições fisiológicas. A solubilidade sob condições fisiológicas, pode ser determinada por qualquer método conhecido por peritos na arte. Por exemplo, pode ser avaliada pelo ensaio de X-114 Tritono descrito acima e nos exemplos. Além disso, como discutido acima, um PH20 solúvel é, se produzido em células CHO, tal como células CHO-S, um polipeptídeo que é expresso e é segregado para o meio de cultura celular. Polipeptídeos PH20 humanos solúveis, no entanto, não estão limitados aos produzidos em células CHO, mas podem ser produzidos em qualquer célula ou por qualquer método, incluindo a expressão recombinante e síntese de polipeptídeos. A referência para secreção em células CHO é de definição. Assim, se um polipeptídeo pode ser expresso e segregado em células CHO e é solúvel, ou seja, divisões para a fase aquosa, quando extraído com X-114 TritonO, é um polipeptídeo PH20 solúvel ou não é assim produzido. Polipeptídeos esPH20 solúveis humanos incluem, além dos resíduos 36-490, um ou mais aminoácidos contíguos a partir de posição de resíduo de aminoácido 491 da SEQ ID NO: 1, inclusive, de tal modo que o polipeptídeo resultante seja solúvel. Polipeptídeos solúveis esPH20 humanos exemplares são aqueles que têm os resíduos de aminoácidos correspondentes aos aminoácidos 36-491, 36-492, 36-493, 36- 494, 36-495, 36-496 e 36-497 da SEQ ID NO: 1. São exemplos destes, aqueles com uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS :151-154 e 185-
187. Também estão incluídas variantes alélicas e outras variantes, tais como qualquer uma com 40%, 45%, 50%, 55% 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência com os polipeptídeos correspondentes às SEQ ID NOS: 151-154 e 185- 187, que retêm a atividade neutra e são solúveis. A referência à identidade da sequência refere-se a variantes com substituições de aminoácidos.
[0089] Tal como aqui utilizado, a referência a "esPH20s" inclui —polipeptídeos esPH20 precursores e polipeptídeos esPH20 maduros(tais como aqueles em que a sequência de sinal foi removida), formas incompletas destes que têm atividade enzimática (retenção, pelo menos, de 1% 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ou mais da forma de comprimento total) e são solúveis, e inclui variantes alélicas e espécies variantes, variantes codificadas por variantes splice, e outras variantes, incluindo os polipeptídeos que têm pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de sequência com os polipeptídeos precursores estabelecidos nas SEQ ID Nºs: 1 e 3, Ou as suas formas maduras.
[0090] Tal como aqui utilizado, a referência a "esPH20s" também inclui aqueles que contêm modificações químicas ou pós-traducionais e aqueles que não contêm modificações pós-traducionais ou química. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a PEGuilação, albuminação,
glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, e outras modificações polipeptídicas conhecidas na arte.
[0091] Tal como aqui utilizado, "PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20)" refere-se a uma composição que contém formas solúveis de PH20 humana como expressas e segregadas de forma recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO). rHuPH20 solúvel é codificada por molécula de ácido nucleico que inclui uma sequência de sinal, e é estabelecida na SEQ ID NO: 49. O ácido nucleico que codifica rHuPH20 solúvel é expresso em células CHO, que segregam o polipeptídeo maduro. Tal como produzido no meio de cultura, existe uma grande heterogeneidade no C-terminal para que o produto inclua uma mistura de espécies, que podem incluir qualquer um ou mais aminoácidos 36-481 e 36- 482 de PH20 (por exemplo, SEQ ID NO: 4 a SEQ ID NO: 9) em abundância variada.
[0092] De modo semelhante, polipeptídeos e composições, para outras formas de PH20, tais como os esPH20s expressas de forma recombinante da mesma, podem incluir uma pluralidade de espécies cujo C-terminal exibe heterogeneidade. Por exemplo, as composições de esPH20 expressas de forma recombinante produzidas por expressão do polipeptídeo de SEQ ID NO: 151, que codifica uma esPH20 que possui os aminoácidos 36-497, podem incluir formas com menos aminoácidos, tais como 36-496, 36-495.
[0093] Tal como aqui utilizado, uma "porção ligada a N" refere-se a um resíduo de aminoácidos de asparagina (N) de um polipeptídeo que é capaz de ser glicosilado por modificação pós-tradução de um polipeptídeo. Exemplos de porções ligadas a N de PH20 humana incluem aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368 e N393 de PH20 humana descrita na SEQ ID NO:1.
[0094] Tal como aqui utilizado, um "polipeptídeo N- glicosilado" refere-se a um polipeptídeo ou uma forma PH20 truncada da mesma ligação que contém oligossacarídeo de, pelo menos, três resíduos de aminoácidos ligados a N, por exemplo, porções ligadas a N correspondentes aos resíduos de aminoácidos N235, N368 e N393 da SEQ ID NO: 1. Um polipeptídeo N-glicosilado pode incluir um polipeptídeo em que três, quatro, cinco e até todos os grupos ligados a N estão ligados a um oligossacarídeo. Os oligossacarídeos ligados a N podem incluir oligossacarídeos oligomanose, complexos, híbridos ou sulfatados, ou outros oligossacarídeos e monossacarídeos.
[0095] Tal como aqui utilizado, um "polipeptídeo parcialmente N-glicosilado" refere-se a um polipeptídeo que contém minimamente um glicano N-acetilglucosamina ligado a, pelo menos, três porções ligadas a N. Um polipeptídeo parcialmente glicosilado pode incluir várias formas de glicano, incluindo monossacarídeos, oligossacarídeos, e formas de açúcar ramificadas, incluindo os que são formados por tratamento de um polipeptídeo com EndoH, EndoFl, EndoF2 e/ou EndoF3.
[0096] Tal como aqui utilizado, um "polipeptídeo PH20 desglicosilado" refere-se a um polipeptídeo PH20 em que poucos de todos os possíveis locais de glicosilação são glicosilados. A desglicosilação pode ser efetuada, por exemplo, através da remoção de glicosilação, evitando, ou modificando o polipeptídeo para eliminar um local de glicosilação. Os locais de N-glicosilação, em particular, não são necessários para a atividade, ao passo que outros são.
[0097] Tal como aqui utilizado, "PEGuilado" refere-se a ligação covalente ou outra fixação estável de moléculas poliméricas, tais como polietileno glicol (porção de PEGuilação PEG) a enzimas degradadoras de hialuronan, tais como hialuronidases, normalmente para aumentar a meia- vida da enzima degradadora de hialuronan.
[0098] Tal como aqui utilizado, um "conjugado" refere-se a um polipeptídeo ligado diretamente ou indiretamente a um ou mais outros polipeptídeos ou grupos químicos. Tais conjugados incluem as proteínas de fusão, as produzidas pelos conjugados químicos e aquelas produzidas por quaisquer outros métodos. Por exemplo, um conjugado refere-se a polipeptídeos PH20 solúveis ligados diretamente ou indiretamente a um ou mais outros polipeptídeos, Ou grupos “químicos, através dos quais, pelo menos, um polipeptídeo de PH20 solúvel está ligado, diretamente ou indiretamente, a outro polipeptídeo ou porção química, desde que o conjugado retenha a atividade de hialuronidase.
[0099] Tal como aqui utilizado, uma proteína de "fusão" refere-se a um polipeptídeo codificado por uma sequência de ácido nucleico que contém uma sequência de codificação de uma molécula de ácido nucleico, e a sequência de codificação de outra molécula de ácido nucleico, em que as sequências codificantes estão no mesmo quadro de leitura, de tal forma que quando a construção de fusão é transcrita e traduzida em uma célula hospedeira, a proteína é produzida, contendo as duas proteínas. As duas moléculas podem ser adjacentes na construção ou separadas por um ligante polipeptídico que contenha, 1, 2, 3, ou mais, mas seja normalmente menor do que 10, 9, 8, 7, ou 6 aminoácidos. O produto de proteína codificada por uma construção de fusão é referido como um polipeptídeo de fusão.
[0100] Tal como aqui utilizado, um "polímero" refere-se a qualquer porção do peso natural ou sintético de elevado peso molecular que seja conjugado com, ou seja estavelmente ligado direta ou indiretamente através de um ligante, a um polipeptídeo. Tais polímeros, normalmente aumentam a meia-vida no soro, e incluem, mas não estão limitados às porções siálicas, porções de PEGilação, dextrano, açúcar e outros radicais, tais como a glicosilação. Por exemplo, a hialuronidase, como por exemplo uma PH20 ou rHuPH20 solúvel, pode ser conjugada com um polímero.
[0101] Tal como é aqui utilizado, um substrato de hialuronidase refere-se a um substrato (por exemplo, a proteína ou polissacarídeo) que é clivado e/ou despolimerizado por uma enzima hialuronidase. Geralmente, um substrato de hialuronidase é um glicosaminoglicano. Um substrato de hialuronidase exemplar é hialuronan (HA).
[0102] Tal como aqui utilizado, uma doença, distúrbio ou condição associada a hialuronan, refere-se a qualquer doença ou condição em que os níveis de hialuronan sejam elevados como causa, consequência, ou de outro modo, observados na doença ou condição. Doenças e condições associadas a hialuronan estão associados com a expressão elevada de hialuronan em um tecido ou células, aumento da pressão do fluido intersticial, diminuição do volume vascular e/ou aumento do teor de água no tecido. Doenças, distúrbios ou condições associadas a hialuronan podem ser tratadas por administração de uma composição que contenha um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase, por exemplo, uma hialuronidase solúvel, quer isoladamente ou em combinação com, ou em adição a outro tratamento e/ou agente. Doenças e condições exemplares, incluem, mas não estão limitadas a doenças inflamatórias e tipos de câncer rico em hialuronan. Tipos de câncer rico em hialuronan incluem, por exemplo, tumores, incluindo tumores sólidos, como os cânceres em estágio avançado, câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer de ovário, carcinoma in situ (ISC) carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama, câncer de cólon e outros tipos de câncer. São também exemplos de doenças e condições associadas a hialuronan, doenças que estão associadas com a pressão do fluido intersticial elevada, tais como doenças associadas com a pressão no disco, edema, por exemplo, edema causado por transplante de órgão, acidente vascular cerebral, trauma cerebral ou outra lesão. Doenças e condições associadas ao hialuronan ilustrativas incluem doenças e condições associadas com a pressão do fluido intersticial elevada, diminuição do volume vascular e/ou aumento do teor de água em um tecido, incluindo câncer, pressão no disco e edema. Em um exemplo, o tratamento da doença ou distúrbio associado a hialuronan, inclui melhora, redução, ou outro efeito benéfico sobre um ou mais da pressão do fluido intersticial (IFP), diminuição do volume vascular, e aumento do teor de água no tecido.
[0103] Tal como aqui utilizado, "atividade" refere-se a uma atividade ou atividades funcionais de um polipeptídeo, ou uma porção sua relacionada com uma proteína de comprimento completo (total). Por exemplo, fragmentos ativos de um polipeptídeo podem exibir uma atividade de uma proteína de comprimento total. Atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas à atividade biológica, atividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com um polipeptideo para se ligar a um anticorpo anti- polipeptídeo), imunogenicidade, capacidade de formar multímeros, e a capacidade de especificamente se ligar a um receptor ou ligante para o polipeptídeo.
[0104] Tal como aqui utilizado, "atividade de hialuronidase" refere-se à capacidade de catalisar a clivagem enzimática de hialuronan. O ensaio United States Pharmacopeia (USP) XXIII, para hialuronidase, determina atividade hialuronidase indiretamente através da medição da quantidade de hialuronan de maior peso molecular, Ou substrato de hialuronan (HA) remanescente após a enzima, é deixado para reagir com o HA durante 30 min. a 37ºC (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Uma Solução Padrão de Referência pode ser utilizada em um ensaio, para determinar a atividade relativa, em unidades, de qualquer hialuronidase. Os ensaios in vitro para determinar a atividade hialuronidase de hialuronidases, como por exemplo PH20, incluindo PH20 solúveis e esPH20, são conhecidas na arte e aqui descritas. Ensaios exemplificativos, incluem o ensaio de microturbidez que mede a clivagem do hialuronan por hialuronidase indiretamente, detectando-se o precipitado insolúvel formado quando o ácido hialurônico não clivado liga-se à albumina do soro; e o ensaio do hialuronan biotinilado, que mede a clivagem do hialuronan indiretamente por detecção da ligação de ácido hialurônico biotinilado restante, não covalentemente ligado aos poços de placas de microtitulação, com um conjugado de peroxidase streptavidina-rábano e um substrato cromogênico. Padrões de referência podem ser utilizados, por exemplo, para gerar uma curva padrão para determinar a atividade em unidades de hialuronidase a ser testadas.
[0105] Tal como aqui utilizado, atividade específica refere-se às unidades de atividade por mg de proteína. Os miligramas de hialuronidase são definidos pela absorção de uma solução a 280 nm, assumindo um coeficiente de extinção molar de cerca de 1,7 em unidades de M* cm".
[0106] Tal como aqui utilizado, "neutro-ativa" refere-se à capacidade de um polipeptídeo PH20 catalisar a clivagem enzimática do ácido hialurônico com um pH neutro (por exemplo, a, ou cerca de pH 7,0). Geralmente, um PH20 solúvel e neutro-ativo, por exemplo, um PH20 incompleto de C-terminal ou glicolisado parcialmente de N, tem, ou tem cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% ou mais, de atividade, em comparação com a atividade de hialuronidase de uma PH20 neutro-ativa correspondente, que não é incompleto de C- terminal ou glicolisado parcialmente de N.
[0107] Tal como aqui utilizado, uma "sequência de sinal fixada à âncora de GPI", é uma sequência C-terminal de aminoácidos que se dirige em adição a uma âncora de GPI pré-formada com o polipeptídeo no interior do lúmen de ER. As sequências de sinal fixadas à âncora de GPI estão presentes nos polipeptídeos precursores de polipeptídeos ancoradas por GPI, como polipeptídeos PH20 ancoradas a GPI. A sequência de sinal fixada à âncora de GPI C-terminal, normalmente, contém uma região predominantemente hidrofóbica de 8 a 20 aminoácidos, precedida por uma região espaçadora hidrofílica de 8 a 12 aminoácidos, imediatamente a jusante do local àw, ou local da âncora fixada ao GPI. As sequências de sinal fixadas à âncora de GPI podem ser identificadas utilizando métodos bem conhecidos na arte. Estes incluem, mas não estão limitados aos métodos e algoritmos in silico (ver, por exemplo, Udenfriend et al. (1995) Methods Enzymol. 250:571-582, Eisenhaber et al., (1999) J. Biol. Chem. 292: 741-758, Fankhauser et al., (2005) Bioinformatics 21:1846-1852, Omaetxebarria et al., (2007) Proteomics 7:1951-1960, Pierleoni et al., (2008) BMC Bioinformatics 9:392), incluindo aqueles que estão prontamente disponíveis em sites de bioinformática, como ferramentas do site ExXPASy Proteomics (por exemplo, o site www. expasy.ch/tools/).
[0108] Tal como aqui utilizado, "ácidos nucleicos" incluem DNA, RNA e seus análogos, incluindo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) e suas misturas. Ácidos nucleicos podem ser simples ou de cadeia dupla. Ao referir-se a sondas ou primers, que estão opcionalmente marcados, tal como com um marcador detectável, tal como um marcador radioativo ou fluorescente, as moléculas de cadeia simples estão contempladas. Essas moléculas são normalmente de um comprimento tal que o seu objetivo é estatisticamente único ou de um número baixo de cópias (normalmente menos do que 5, geralmente inferior a 3), para sondar ou iniciar uma biblioteca. Geralmente, uma sonda ou um primer contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleotídeos contíguos da sequência de modo complementar ou idêntico a um gene de interesse. As sondas e primers podem ser 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucleicos de comprimento.
[0109] Tal como aqui utilizado, um peptídeo refere-se a um polipeptídeo que é maior do que, ou igual a dois aminoácidos, em comprimento, e inferior ou igual a 40 aminoácidos, em comprimento.
[0110] Tal como aqui utilizado, os aminoácidos que ocorrem nas diferentes sequências de aminoácidos aqui disponibilizadas são identificados de acordo com as abreviaturas conhecidas, de três letras ou de uma letra (Tabela 1). Os nucleotídeos que ocorrem nos vários fragmentos de ácidos nucleicos são designados com as designações padrão, de uma só letra, utilizadas rotineiramente na arte.
[0111] Tal como aqui utilizado, um "aminoácido" é um composto orgânico que contém um grupo amina e um grupo de ácido carboxílico. Um polipeptídeo contém dois ou mais aminoácidos. Para os fins aqui descritos, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente, aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos (isto é, aminoácidos em que o carbono a possui uma cadeia lateral).
[0112] Tal como aqui utilizado, "resíduo de aminoácido" refere-se a um aminoácido formado por digestão química (hidrólise) de um polipeptídeo nas suas ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácidos aqui descritos estão presumivelmente na forma isomérica "L"., Resíduos na forma isomérica "D", que são assim designados, podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido L, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipeptídeo. NH2 refere-se ao grupo amina livre presente no terminal amina de um polipeptídeo. COOH refere-se ao grupo carboxila livre presente no terminal carboxila de um polipeptídeo. Mantendo a nomenclatura polipeptídica padrão descrita em J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), e adotando 37 C.F.R. SS1.821-1.822, as abreviaturas para resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela 1: TABELA 1 - Tabela de correspondência
SIMBOLO AMINOÁCIDO [reta [emas E [Er Broa Ácido Glutâmico Triptofan [D asp [Ácido Aspártico |B las —jasn e/ou Asp Desconhecido ou outro
[0113] Todas as sequências de resíduos de aminoácidos, aqui representadas por fórmulas, têm uma orientação da esquerda para a direita na direção convencional de terminal amina para o terminal carboxila. Além disso, o termo "resíduo de aminoácido" é definido para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 1) e os aminoácidos modificados e incomuns, tais como os referidos em 37 C.F.R. S S 1,821- 1,822, e aqui incorporados por referência. Além disso, deve notar-se que um traço no início ou no fim de uma sequência de resíduos de aminoácido indica uma ligação peptídica a uma outra sequência de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo amina-terminal tal como NH, Ou um grupo carboxila-terminal tal como COOH.
[0114] Tal como aqui utilizado, "ácidos a-amina de ocorrência natural" são os resíduos dos respectivos 20 ácidos a- amina encontrados na natureza, que são incorporados na proteína pelo reconhecimento específico da molécula de tRNA carregada com o seu códon de mRNA cognato em humanos. Aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem assim, por exemplo, os aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos que ocorrem naturalmente, e incluem, mas não estão limitados aos D- estereoisômeros de aminoácidos. Aminoácidos não naturais exemplificativos são aqui descritos e são conhecidos por peritos na arte.
[0115] Tal como aqui utilizado, uma construção de DNA é uma molécula de DNA única ou de cadeia dupla, linear ou circular que contém os segmentos de DNA combinados e justapostos de uma forma não encontrada na natureza. As construções de DNA existem como um resultado de manipulação humana, e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.
[0116] Tal como aqui utilizado, um segmento de DNA é uma porção de uma molécula de DNA maior, que possui atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA que codifica um polipeptídeo especificado é uma porção de uma molécula de DNA maior, tal como um plasmídeo Ou fragmento de plasmídeo, que a partir da direção 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipeptídeo especificado.
[0117] Tal como é aqui utilizado, o termo polinucleotídeo significa um polímero simples ou de cadeia dupla de bases de desoxiribonucleotídeos ou ribonucleotídeos lidos da extremidade 5' para a extremidade 3'. Os polinucleotídeos incluem DNA e RNA, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. O comprimento de uma molécula de polinucleotídeo é aqui dada em termos de nucleotídeos (abreviado como "nt") ou pares de bases (abreviado como "bp"). O termo nucleotídeo é usado para moléculas de cadeia simples e de cadeia dupla onde o contexto o permita. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento global, e será entendido como sendo equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido por peritos na arte, que as duas cadeias de um polinucleotídeo de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em comprimento, Ee que as suas extremidades podem ser escalonadas; assim, todos os nucleotídeos em uma molécula de polinucleotídeo de cadeia dupla podem não estar emparelhados. Tais extremidades não emparelhadas — serão, em geral, não superiores a 20 nucleotídeos em comprimento.
[0118] Tal como aqui utilizado, "similaridade" entre duas proteínas ou ácidos nucleicos refere-se ao relacionamento entre a sequência de aminoácidos das proteínas ou as sequências de nucleotídeos dos ácidos nucleicos. A similaridade pode ser com base no grau de identidade e/ou homologia de sequências de resíduos e os resíduos nela contidos. Métodos para avaliar o grau de similaridade entre as proteínas ou os ácidos nucleicos são conhecidos por peritos na arte. Por exemplo, em um método de avaliação da semelhança de sequência, duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos são alinhadas de uma maneira que proporcione um nível máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se à extensão a qual o aminoácido ou as sequências de nucleotídeos são invariantes. O alinhamento das sequências de aminoácidos, e algumas sequências de nucleotídeos extensos, também pode considerar as diferenças conservadoras e/ou substituições frequentes em aminoácidos (ou nucleotídeos). Diferenças conservadoras são aquelas que preservam as propriedades físico-químicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências e incluindo todos os resíduos) ou locais (o alinhamento de uma porção das sequências, que inclui apenas a região ou regiões mais semelhantes).
[0119] "Identidade" per se possui um significado reconhecido na técnica e pode ser calculada utilizando técnicas publicadas. (Ver, por exemplo, Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer,
Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Apesar de existir um número de métodos para a medição da identidade entre dois polinucleotídeos ou polipeptídeos, o termo "identidade" é bem conhecido por peritos na arte (Carrillo, H. and Lipton, D., (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).
[0120] Tal como aqui utilizado, homólogo (em relação ao ácido nucleico e/ou sequências de aminoácidos) significa cerca de ou igual a 25% de homologia de sequência, normalmente superior ou igual a 25%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homologia de sequência; a porcentagem exata pode ser especificada, se necessário. Para fins aqui propostos, o termo "homologia" e "identidade" são muitas vezes usados como sinônimos, salvo indicação em contrário. Em geral, para determinação da porcentagem de homologia ou identidade, as sequências são alinhadas de modo que a maior correspondência de ordem é obtida (ver, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo, H. e Lipton, D., (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por homologia de sequência, o número de aminoácidos conservados é determinado por programas de alinhamento de algoritmos convencionais, e pode ser usado com as penalidades de desvio padrão estabelecidas por cada fornecedor. Moléculas de ácidos nucleicos substancialmente homólogas poderiam hibridizar normalmente sob rigor moderado ou elevado em todo o comprimento do ácido nucleico de interesse. Estão também contempladas moléculas de ácidos nucleicos que contêm códons degenerados em lugar de códons da molécula de ácido nucleico de hibridização.
[0121] Se quaisquer duas moléculas possuem sequências de nucleotídeos ou sequências de aminoácidos que são pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% “idênticas" ou "homólogas" pode ser determinado usando algoritmos de computador conhecidos como o programa “FASTA", usando, por exemplo, os parâmetros padrão como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444 (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F., et al., Mol Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, Ee Carrillo, H. e Lipton, D., (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST do National Center for Biotechnology Information database pode ser utilizada para determinar a identidade. Outros programas comercialmente ou publicamente disponíveis incluem o programa DNAStar "MegaAlign" (Madison, WI) e o programa "Gap" do University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI). A porcentagem de homologia ou identidade de proteínas e/ou moléculas de ácidos nucleicos pode ser determinada, por exemplo, comparando a informação das sequências utilizando um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, como revisto por Smith e Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (ou seja, nucleotídeos ou aminoácidos) que são semelhantes, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências.
Parâmetros predefinidos para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e O para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, conforme descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna, e (3) nenhuma penalidade para lacunas finais.
[0122] Portanto, como aqui utilizado, o termo "identidade" ou "homologia" representa uma comparação entre um teste e um polipeptídeo de referência ou polinucleotídeo. Tal como aqui utilizado, o termo pelo menos “90% idêntico a" refere-se a identidade por cento de 90 a 99,99 em relação à sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos referência do polipeptídeo. Identidade a um nível de 90% ou mais é um indicativo do fato de que, assumindo para efeitos de exemplificação, um teste e polipeptídeo de referência, o comprimento dos 100 aminoácidos é comparado. Não mais do que 10% (isto é, de 10 em 100) dos aminoácidos no polipeptídeo de teste, difere daquela do polipeptídeo de referência. Comparações semelhantes podem ser feitas entre o polinucleotídeo de teste e o de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente ao longo de todo o comprimento de um polipeptídeo, ou podem ser agrupadas em um ou mais locais de comprimento variável até ao máximo permitido, por exemplo, diferença de aminoácidos 10/100 (cerca de 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácidos nucleicos ou aminoácidos. No nível de homologia ou identidade acima,
cerca de 85 a 90%, o resultado deve ser independente do programa e parâmetros gap definidos; tais níveis elevados de identidade podem ser avaliados prontamente, muitas vezes por alinhamento manual, sem depender de software.
[0123] Tal como aqui utilizado, uma sequência alinhada refere-se à utilização de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar as posições correspondentes em uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. Normalmente, duas ou mais sequências que estão relacionadas em 50% ou mais de identidade estão alinhadas. Um conjunto de sequências alinhadas refere-se a duas ou mais sequências que são alinhadas em posições correspondentes e podem incluir sequências que alinham derivados de RNAs, como ESTs e outros cDNAs, alinhados com a sequência de DNA genômico.
[0124] Tal como aqui utilizado, "primer" refere- se a uma molécula de ácido nucleico que pode funcionar como um ponto de iniciação da síntese de DNA dirigida por molde sob condições apropriadas (por exemplo, na presença de quatro trifosfatos de nucleósidos diferentes, e um agente de polimerização, tal como DNA polimerase, RNA polimerase ou transcriptase reversa) em um tampão apropriado, e sob uma temperatura adequada. Será apreciado, que certas moléculas de ácidos nucleicos podem servir como uma "sonda" e como um "primer". Um primer, no entanto, tem um grupo hidroxila 3' por extensão. Um primer pode ser usado em uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase reversa (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, PCR multiplex, PCR panhandle, captura por PCR, expressão de PCR, RACE 3' e 5', PCR in situ, PCR por ligação, e outros protocolos de amplificação.
[0125] Tal como aqui utilizado, "par primer" refere-se a um conjunto de primers que inclui um primer 5 (a montante) que hibridiza com o complemento da extremidade
5' de uma sequência a ser amplificada (por exemplo, por PCR) e um primer 3' (a jusante) que hibridiza com a extremidade 3' da sequência a ser amplificada.
[0126] Tal como aqui utilizado, "hibridiza especificamente" refere-se ao tratamento térmico (annealing), por emparelhamento de bases complementares, de uma molécula de ácido —nucleico (por “exemplo, um oligonucleotídeo) a uma molécula de ácido nucleico alvo. Os peritos na arte estão familiarizados com parâmetros in vitro e in vivo que afetam a hibridização específica, tais como o comprimento e composição da molécula particular. Parâmetros particularmente relevantes para a hibridização in vitro incluem ainda o tratamento térmico e a temperatura de lavagem, composição de tampão e concentração de sal. Exemplos de condições de lavagem para a remoção de moléculas de ácidos nucleicos não ligados especificamente com elevado rigor são 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65ºC, e em rigor médio são 0,2 x SSPE, 0,1% SDS, 50ºC. As condições de rigor equivalentes são conhecidas na arte. O perito na arte pode facilmente ajustar os parâmetros para obter uma hibridização específica de uma molécula de ácido nucleico para uma molécula de ácido nucleico alvo adequada para uma aplicação particular. De modo complementar, quando se refere a duas sequências de nucleotídeos, significa que as duas sequências de nucleotídeos são capazes de hibridizar, normalmente com menos do que 25%, 15% ou 5% de combinação negativa entre os nucleotídeos opostos. Se necessário, será especificado o percentual de complementaridade. Normalmente, as duas moléculas são escolhidas de tal modo que elas hibridizam sob condições de elevado rigor.
[0127] Tal como aqui utilizado, substancialmente idêntico a um produto, significa suficientemente semelhante de modo que a propriedade de interesse é suficientemente estável para que o produto substancialmente idêntico possa ser usado no lugar do produto.
[0128] Tal como aqui utilizado, entende-se também que os termos "substancialmente idênticos" ou "semelhante" variam de acordo com o contexto, como entendido pelos peritos na arte relevante.
[0129] Tal como aqui utilizado, uma variante alélica ou variação alélica é referente a qualquer uma, de duas ou mais formas alternativas de um gene, que ocupam o mesmo “locus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo fenotípico dentro das populações. As mutações genéticas podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências de aminoácidos alteradas. O termo "variante alélica" também é utilizado aqui para designar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Normalmente, a forma de referência do gene codifica uma forma do tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo, de uma população ou membro de uma espécie de referência único. Normalmente, as variantes alélicas, que incluem variantes entre algumas espécies, têm normalmente pelo menos 80%, 90% ou mais, de identidade de aminoácidos com um tipo selvagem e/ou forma predominante da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene, e se a comparação é feita entre espécies ou intra-espécies. Geralmente, variantes alélicas intra-específicas têm pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de identidade com uma forma selvagem e/ou forma predominante, incluindo 96% 97%, 98%, 99% ou mais, de identidade com uma forma selvagem e/ou uma forma predominante de um polipeptídeo. A referência a uma variante alélica aqui presente refere-se geralmente a variações em proteínas entre membros da mesma espécie.
[0130] Tal como aqui utilizado, "alelo", que é usado alternadamente aqui, com "variante alélica" refere-se a formas alternativas de um gene ou de partes dos mesmos. Os alelos ocupam o mesmo lugar ou posição em cromossomos homólogos. Quando um indivíduo possui dois alelos idênticos de um gene, o indivíduo é referido como sendo homozigótico para aquele gene ou alelo. Quando um indivíduo possui dois alelos diferentes de um gene, o indivíduo é referido como sendo heterozigótico para o gene. Os alelos de um gene específico podem diferir um do outro em um único nucleotídeo ou vários nucleotídeos, e podem incluir modificações, tais como substituições, deleções e inserções de nucleotídeos. Um alelo de um gene pode também ser uma forma de um gene que contém a mutação.
[0131] Tal como aqui utilizado, variantes de espécies refere-se a variantes de polipeptídeos entre espécies diferentes, incluindo diferentes espécies de mamíferos, tais como o rato e o homem. Por exemplo, para a PH20, exemplos de espécies variantes aqui fornecidas são PH20 de primatas, tais como, mas não limitados aos humanos, chimpanzés e macaco cynomolgus. Geralmente, as variantes de espécies têm 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% ou mais, de identidade de sequência. Correspondentes de resíduos entre 2 ou mais espécies variantes podem ser determinados pela comparação e alinhamento de sequências para maximizar o número de nucleotídeos correspondentes ou de resíduos, por exemplo, de tal forma que, a identidade entre as sequências seja igual ou superior a 95%, igual a ou maior do que 96%, igual ou superior a 97%, igual a ou maior do que 98% ou igual ou superior a 99%. A posição de interesse então determina o número atribuído na molécula de ácido nucleico de referência. O alinhamento pode ser efetuado manualmente ou visualmente, em particular, onde a identidade de sequência seja superior a 80%.
[0132] Tal como aqui utilizado, uma proteína humana é codificada por uma molécula de um ácido nucleico, tal como DNA, presente no genoma de um ser humano, incluindo todas as variantes alélicas e as variações conservadoras destes. Uma variante ou modificação de uma proteína é uma proteína humana, se a modificação baseia-se na sequência de tipo selvagem, ou proeminente de uma proteína humana.
[0133] Tal como aqui utilizado, uma variante splice refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um transcrito primário de DNA genômico, que resulta em mais do que um tipo de mRNA.
[0134] Tal como aqui utilizado, a modificação está na referência à modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo, ou uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucleico, e inclui deleções, inserções e substituições (por exemplo, substituições) dos aminoácidos e nucleotídeos, respectivamente. Exemplos de modificações são substituições de aminoácidos. Um polipeptídeo com substituições de aminoácido pode apresentar 65%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou mais, de identidade de sequência para um polipeptídeo que não contenha as substituições de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser conservadoras ou não conservadoras. Geralmente, qualquer modificação de um polipeptídeo retém uma atividade do polipeptídeo. Os métodos de modificação de um polipeptídeo são rotina para os peritos na arte, tal como pela utilização de metodologias de DNA recombinante.
[0135] Tal como aqui utilizado, as substituições conservadoras de aminoácidos adequadas são conhecidas por peritos na arte, e podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Os peritos na arte reconhecem que, em geral, as substituições de um único aminoácido em regiões não essenciais de um polipeptídeo, não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p. 224). Tais substituições podem ser feitas em conformidade com as apresentadas na Tabela 2 a seguir: TABELA 2 Resíduo original | Substituição conservadora exemplar Ala (A) Gly; Ser arg (8) Asn (N) ve O Gln (9) ERã Gly (6) HS O) TIe (1) Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (5) Thr (D) Trp (1) Tyr (Y) Trp; Phe
TEL
[0136] Outras substituições também são admissíveis e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadoras conhecidas.
[0137] Tal como aqui utilizado, o termo promotor significa uma porção de um gene que contém sequências de DNA que proporcionam a ligação da polimerase de RNA e a iniciação da transcrição. As sequências de promotor são normalmente, mas não sempre, encontradas na região não codificante 5' de genes.
[0138] Tal como aqui utilizado, o polipeptídeo ou proteína isolada ou purificada, ou porção biologicamente ativa dos mesmos é substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes, a partir da célula ou do tecido do qual a proteína é derivada, Ou substancialmente isenta de precursores químicos ou de outras substâncias químicas quando sintetizados quimicamente. As preparações podem ser determinadas para ser substancialmente livres, se aparentam ser livres de impurezas facilmente detectáveis, como determinado por métodos padrão de análise, como a cromatografia em camada fina (TLC), eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizados pelos peritos da arte para avaliar a referida pureza, Ou pureza suficiente, de tal modo que a purificação adicional que não seria detectável, altere as propriedades físicas e químicas, tais como as atividades enzimáticas e biológicas da substância. Métodos de purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos por peritos na arte. Um composto substancialmente quimicamente puro, no entanto, pode ser uma mistura de estereoisômeros. Em tais casos, a purificação posterior pode aumentar a atividade específica do composto.
[0139] Assim, a referência a um polipeptídeo substancialmente purificado, tal como PH20 solúvel substancialmente purificado, refere-se a preparações de proteínas que são substancialmente livres de material celular, o que inclui preparações de proteínas, em que a proteína é separada dos componentes celulares das células, a partir das quais, é isolada ou recombinantemente produzida. Em uma modalidade, o termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas enzimáticas com menos do que cerca de 30% (por peso seco) de proteínas não-enzimáticas (também aqui referidas como uma proteína contaminante), geralmente menos do que cerca de 20% de proteínas não-enzimáticas, ou 10% de proteínas não-enzimáticas, ou menos do que cerca de 5% de proteínas não-enzimáticas. Quando a proteína de enzima é produzida por via recombinante, é também substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos de cerca de, ou 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação de proteína de enzima.
[0140] Tal como aqui utilizado, o termo substancialmente livre de percursores químicos ou outras substâncias químicas inclui preparações de proteínas enzimáticas, em que a proteína é separada a partir de precursores químicos, ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui preparações de proteínas de enzima que possuem menos do que cerca de 30% (em peso seco), 20%, 10%, 5% ou menos, de precursores químicos ou de produtos químicos ou componentes não-enzimáticos.
[0141] Tal como aqui utilizado, sintética, com referência a, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico sintético ou um gene sintético, ou um peptídeo sintético refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou uma molécula de polipeptídeo que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
[0142] Tal como aqui utilizado, a produção por meios recombinantes ou através de métodos de DNA recombinante, significa a utilização dos métodos bem conhecidos de biologia molecular, para a expressão de proteínas codificadas pelo DNA clonado.
[0143] Como aqui utilizado, vetor (ou plasmídeo) refere-se a elementos distintos que são utilizados para introduzir um ácido nucleico heterólogo em células tanto para expressão, como para replicação destes. Os vetores normalmente permanecem epissomais, mas podem ser concebidos para efetuar a integração de um gene ou parte dele, em um cromossoma do genoma. Também estão contemplados os vetores que são os cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais de levedura e cromossomas artificiais de mamíferos. A seleção e utilização de tais veículos são bem conhecidos por peritos na arte.
[0144] Tal como aqui utilizado, um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar o DNA que está operacionalmente ligado a sequências reguladoras, como regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão desses fragmentos de DNA. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e de terminação e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um potenciador, um sinal de poliadenilação. Os vetores de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou de DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vetor de expressão refere-se a um DNA recombinante ou DNA de construção, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, após introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Os vetores de expressão adequados são bem conhecidos por peritos na arte, e incluem aqueles que são replicáveis em células eucariotas e/ou células procariotas, e aqueles que permanecem epissomais, ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.
[0145] Como aqui utilizado, vetor também inclui "vetores de vírus" ou "vetores virais". Vetores virais são os vírus que estão operacionalmente ligados a genes exógenos para transferir (como veículos ou transportadores os genes exógenos em células.
[0146] Tal como aqui utilizado, “operacionalmente" ou "operacionalmente ligado" quando se refere a segmentos de DNA, significa que os segmentos estão dispostos de modo que funcionem em conjunto para as suas finalidades pretendidas, como por exemplo, a transcrição inicia a jusante do promotor, e a montante de quaisquer sequências transcritas. O promotor é geralmente o domínio para o qual a maquinaria transcricional se liga para iniciar a transcrição, e prossegue através do segmento codificante até o terminador.
[0147] Tal como aqui utilizado o termo "avaliar" destina-se a incluir a determinação quantitativa e qualitativa, no sentido de obter um valor absoluto para a atividade de uma proteína, tal como uma enzima, ou um domínio seu, presente na amostra, e também obter um índice, razão, porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível de atividade. A avaliação pode ser direta Ou indireta. Por exemplo, as espécies químicas efetivamente detectadas não precisam, evidentemente, ser o próprio produto enzimaticamente clivado, mas pode ser, por exemplo, um derivado seu ou alguma outra substância. Por exemplo, a detecção de um produto de clivagem pode ser uma porção detectável, tal como uma porção fluorescente.
[0148] Tal como aqui utilizado, atividade biológica refere-se a atividades in vivo de um composto, ou respostas fisiológicas que resultam após a administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. A atividade biológica, portanto, abrange os efeitos terapêuticos e a atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro projetados para testar ou usar tais atividades. Assim, para os fins aqui descritos, uma atividade biológica de uma enzima hialuronidase é a sua degradação de ácido hialurônico.
[0149] Tal como aqui utilizado, equivalente, quando se refere a duas sequências de ácidos nucleicos, significa que as duas sequências em questão codificam a mesma sequência de aminoácidos ou proteínas equivalentes. Quando equivalente é utilizado em referência a duas proteínas ou peptídeos, significa que as duas proteínas ou peptídeos têm substancialmente a mesma sequência de aminoácidos, com substituições apenas de aminoácidos que não alteram substancialmente a atividade, ou a função da proteína, ou do peptídeo. Quando equivalente refere-se a uma propriedade, a propriedade não precisa estar presente na mesma medida (por exemplo, dois peptídeos podem apresentar diferentes taxas do mesmo tipo de atividade enzimática), mas as atividades são geralmente, substancialmente, as mesmas.
[0150] Tal como aqui utilizado, "modular" e "modulação" ou "alterar" referem-se a uma mudança de uma atividade de uma molécula, tal como uma proteína. Exemplos de atividades incluem, mas não estão limitadas às atividades biológicas, tais como a transdução de sinal. A modulação pode incluir um aumento na atividade (ou seja, aumento da regulação ou atividade agonista), uma diminuição na atividade (ou seja, a infra-regulação ou inibição) ou qualquer outra alteração em uma atividade (como uma mudança na periodicidade, frequência, duração, cinética ou outro parâmetro). A modulação pode ser dependente do contexto, e normalmente é comparada a um estado designado, por exemplo, a proteína de tipo selvagem, a proteína em um estado constitutivo, ou a proteína expressa em um tipo de célula ou condição designada.
[0151] Tal como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Pode ser uma solução, suspensão, líquido, pó, pasta, solução aquosa, não aquosa, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0152] Tal como aqui utilizado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou mais itens. A combinação pode ser de dois ou mais elementos separados, tais como duas composições ou dois conjuntos, pode ser uma mistura dos mesmos, tal como uma única mistura de dois ou mais itens, ou qualquer variação. Os elementos de uma combinação estão geralmente funcionalmente associados ou relacionados. Por exemplo, uma combinação pode ser uma combinação das composições aqui proporcionadas.
[0153] Tal como é aqui utilizado um kit refere-se a uma combinação de componentes, tais como uma combinação das composições da invenção e um outro item para os fins, incluindo, mas não limitados a reconstituição, ativação e instrumentos/dispositivos de entrega, administração, diagnóstico e avaliação de uma atividade biológica Ou propriedade. Kits opcionalmente incluem instruções de utilização.
[0154] Tal como aqui utilizado, "doença Ou distúrbio" refere-se a um estado patológico em um organismo, resultante da causa ou condição, incluindo, mas não limitada às infeções, condições, doenças genéticas, e caracterizada por sintomas identificáveis adquiridos. Doenças e distúrbios de interesse aqui presentes são as doenças e distúrbios associados ao hialuronan.
[0155] Tal como aqui utilizado, "tratamento" de um indivíduo com uma doença ou condição significa que os sintomas do indivíduo estão parcialmente ou totalmente aliviados, ou permanecem estáticos após o tratamento. Assim, o tratamento abrange a profilaxia, terapia e/ou cura. Profilaxia refere-se à prevenção de uma doença de potencial e/ou prevenção de um agravamento dos sintomas ou progressão de uma doença.
[0156] Tal como aqui utilizado, um agente farmaceuticamente eficaz, inclui qualquer agente terapêutico ou agentes bioativos, incluindo, mas não limitados a, por exemplo, agentes quimioterapêuticos, anestésicos, vasoconstritores, agentes dispersantes, fármacos terapêuticos convencionais, incluindo medicamentos de pequenas moléculas e proteínas terapêuticas.
[0157] Tal como aqui utilizado, tratamento significa qualquer maneira pela qual, os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença, ou outra indicação, são melhorados ou de outro modo beneficamente alterados.
[0158] Tal como aqui utilizado, efeito terapêutico significa um efeito resultante do tratamento de um indivíduo que altera, normalmente melhora, os sintomas de uma doença ou condição, ou que cura uma doença Ou condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere-se à quantidade de uma composição, molécula ou composto que resulta em um efeito terapêutico, após a administração a um indivíduo.
[0159] Tal como aqui utilizado, o termo "indivíduo" refere-se a um animal, incluindo um mamífero, tal como um ser humano.
[0160] Tal como aqui utilizado, um "paciente" refere-se a um ser humano, que apresente sintomas de uma doença ou distúrbio.
[0161] Tal como aqui utilizado, um "indivíduo" pode ser um sujeito.
[0162] Tal como aqui utilizado, sobre os mesmos meios dentro de uma quantidade que um perito na arte considere ser a mesma, ou estar dentro de um intervalo de erro aceitável. Por exemplo, normalmente, para as composições farmacêuticas, uma quantidade dentro de, pelo menos, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% ou 10%, é considerada aproximadamente a mesma. Tal quantidade pode variar, dependendo da tolerância de variação da composição, em particular, por indivíduos.
[0163] Tal como aqui utilizado, regime de dosagem refere-se à quantidade do agente, por exemplo, da composição que contém uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase solúvel ou outro agente administrado, e da frequência de administração. O regime de dosagem é uma função da doença ou condição a ser tratada, e assim pode variar.
[0164] Tal como aqui utilizado, a frequência de administração refere-se ao tempo entre as administrações sucessivas de tratamento. Por exemplo, a frequência pode ser dias, semanas ou meses. Por exemplo, a frequência pode ser mais de uma vez por semana, por exemplo, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, OU diariamente. Frequência também pode ser uma, duas, três ou quatro semanas. A frequência particular é função da doença particular ou estado tratado. Geralmente, a frequência é mais do que uma vez por semana, e é geralmente, duas vezes por semana.
[0165] Tal como aqui utilizado, um "ciclo de administração" refere-se ao programa de administração repetido do regime de dosagem de administração da enzima e/ou um segundo agente que é repetido ao longo de administrações sucessivas. Por exemplo, um ciclo de administração exemplar é um ciclo de 28 dias com a administração duas vezes por semana, durante três semanas, seguido por uma semana de doseamento descontinuado.
[0166] Tal como aqui utilizado, quando se refere a dosagem com base em mg/kg do indivíduo, um ser humano médio é considerado como tendo uma massa de cerca de 70 kg -75 kg, tal como 70 kg.
[0167] Tal como aqui utilizado, a melhora dos sintomas de uma determinada doença ou distúrbio de um tratamento, tal como por administração de uma composição farmacêutica ou outro agente terapêutico, refere-se a qualquer redução, permanente ou temporária, duradoura Ou transitória, dos sintomas ou, efeitos adversos de uma condição, tal como, por exemplo, redução de efeitos adversos associados com, ou que ocorrem . após a administração de uma enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase PEGuilada.
[0168] Tal como aqui utilizado, prevenção Ou profilaxia refere-se a redução do risco de desenvolver uma doença ou condição.
[0169] Tal como aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "dose terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente, composto, material, ou composição, que contém um composto que é, pelo menos, suficiente para produzir um efeito terapêutico. Por isso, é a quantidade necessária para prevenir, curar, melhorar, interromper ou prender parcialmente um sintoma de uma doença ou distúrbio.
[0170] Tal como aqui utilizado, forma de dose unitária refere-se a unidades fisicamente distintas adequadas para indivíduos humanos e animais, e embaladas individualmente como é conhecido na arte.
[0171] Tal como aqui utilizado, uma formulação de dosagem única refere-se a uma formulação como uma dose única.
[0172] Tal como aqui utilizado, formulação para administração direta significa que a composição não necessita de posterior diluição para administração.
[0173] Tal como aqui utilizado, um "artigo de fabricação", é um produto que é feito e vendido. Tal como utilizado ao longo deste requerimento, o termo destina-se a englobar agentes anti-hialuronan, por exemplo, a enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase, e composições de segundo agente contidas nos artigos de embalagem.
[0174] Tal como aqui utilizado, fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Fluidos englobam composições que estão sob a forma de semi-sólidos, pomadas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras composições.
[0175] Tal como aqui utilizado, um extrato celular ou lisado refere-se a uma preparação ou fração que é feita a partir de uma célula lisada ou interrompida.
[0176] Tal como aqui utilizado, animal inclui qualquer animal, tais como, mas não limitados aos primatas, incluindo os seres humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como camundongos e ratos; aves, tais como frangos; ruminantes, como cabras, vacas, veados, ovelhas; porcos e outros animais. Os animais não-humanos não incluem seres humanos, como o animal contemplado. As hialuronidases são aqui fornecidas a partir de qualquer fonte animal, vegetal, procariótica e fúngica. A maioria das hialuronidases são de origem animal, incluindo a origem dos mamíferos. Geralmente hialuronidases são de origem humana.
[0177] Tal como aqui utilizado, os tratamentos anticâncer incluem a administração de fármacos e outros agentes para o tratamento do câncer, e também os protocolos de tratamento, tais como a cirurgia e a radioterapia. Tratamentos anticâncer incluem a administração de agentes anticâncer.
[0178] Tal como aqui utilizado, um agente anticâncer refere-se a quaisquer agentes ou compostos, utilizados no tratamento anticâncer. Estes incluem quaisquer agentes, quando utilizados isoladamente ou em combinação com outros compostos, que podem aliviar, reduzir, melhorar, prevenir, ou colocar, ou manter em estado de remissão de sintomas clínicos, ou marcadores de diagnóstico associados com tumores e câncer, e podem ser utilizados em combinações e composições aqui proporcionados. Agentes anticâncer exemplares incluem, mas não estão limitados a, enzimas degradadoras, tais como hialuronan, enzimas que degradam o hialuronan PEGuilado aqui proporcionado, utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes anti câncer, tais como agentes quimioterapêuticos, polipeptídeos, anticorpos, peptídeos, moléculas pequenas ou vetores de terapia genética, vírus ou DNA.
[0179] Tal como aqui utilizado, um controle refere-se a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, exceto que não é tratada com um parâmetro de ensaio, ou, se for uma amostra de plasma, pode ser de um voluntário normal, não afetado com a condição de interesse. Um controle pode ser também um controle interno.
[0180] Tal como aqui utilizadas, as formas singulares "um", "uma" e "o (a)" incluem referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um composto que compreende ou contém um "domínio extracelular " inclui compostos com um ou uma pluralidade de domínios extracelulares.
[0181] Tal como aqui utilizado, gamas e quantidades podem ser expressos como "cerca de" um valor ou um intervalo particular, que também inclui o valor exato. Então, "cerca de 5 bases" significa “cerca de 5 bases" e também "5 bases". Geralmente "cerca" inclui um montante que se espera que esteja dentro do erro experimental.
[0182] Tal como aqui utilizado, "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância descrita subsequentemente ocorre ou não, e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre, e exemplos em que isso não acontece. Por exemplo um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo é não substituído ou é substituído.
[0183] Tal como aqui utilizado, as abreviaturas para quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos, estão, a não ser que indicado de outra forma, de acordo com o seu uso comum, abreviaturas reconhecidas, ou a Comissão IUPAC-IUB em Nomenclatura Bioquímica (ver, (1972) Biochem. 11:17226).
B. PROTEÍNA DE LIGAÇÃO A HIALURONAN E DIAGNÓSTICO DE ACOMPANHAMENTO
[0184] Métodos sensíveis e específicos são aqui proporcionados para detectar e monitorar estreitamente níveis de hialuronan (HA) associados com a doença, em particular na matriz extracelular (ECM) dos tecidos tumorais. Os métodos de diagnóstico de acompanhamento aqui fornecidos são baseados na constatação de que a acumulação de HA se correlaciona especificamente com, e prevê a doença agressiva, em particular, no que diz respeito ao câncer. Além disso, o método de diagnóstico de acompanhamento aqui proporcionado também é baseado na constatação de que o HA proporciona especificamente informação de seleção de prognóstico e tratamento superior, em comparação com outros marcadores envolvidos na via metabólica de HA associada a doenças e condições associadas a hialuronan, tais como as sintases de hialuronidase ou hialuronidases. Assim, oO método aqui fornecido utiliza reagentes de proteína de ligação ao hialuronan melhorados (HABP) que apresentam especificidade, alta afinidade e baixa variabilidade, para a detecção específica e sensível da HA. São também aqui fornecidos reagentes de HABP melhorados.
[0185] Em um exemplo, as HABPs melhoradas aqui fornecidas, como qualquer uma descrita na Seção C, podem ser um diagnóstico de acompanhamento para a seleção de pacientes com doenças associadas ao HA, por exemplo tumores associados ao HA, por tratamento com um agente anti- hialuronan, ou uma enzima que degrada hialuronan, como qualquer um estabelecido na Seção E (por exemplo, uma hialuronidase ou hialuronidase modificada como PH20 PEGuilado, ou seja PEGPH20). Em tal exemplo, o método é útil para a classificação dos pacientes para a seleção de terapias, tais como a terapia de câncer, e em particular, refere-se a medição dos níveis de HA que se correlacionam com a capacidade de resposta à terapia com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma terapia com uma enzima que degrada hialuronan, tal como a terapia por PEGPH20 para o tratamento de pacientes com tumores avançados.
[0186] Em outro exemplo, as HABPs melhoradas aqui proporcionadas, tais como qualquer uma descrita na Seção C, podem também ser usadas em métodos de monitoramento da eficácia ou a capacidade de resposta ao tratamento com um agente anti-hialuronan ou enzima degradadora de hialuronan, como qualquer uma definida na Seção E (por exemplo, uma hialuronidase ou hialuronidase modificada, tal como PH20
PEGuilada, ou seja PEGPH20) através da detecção dos níveis de HA durante o tratamento. Assim, a HABP melhorada pode ser utilizada em conjunto com a terapia com um agente anti -hialuronan, por exemplo, a terapia enzimática que degrada hialuronan, para monitorar os níveis de HA e ajustar e/ou alterar a terapia para personalizar o tratamento individual a um doente, dependendo do paciente particular e do curso da doença, de forma que se correlacione com a resposta clínica.
[0187] São também aqui proporcionados combinações e kits que contêm um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan (por exemplo, qualquer uma fornecida aqui, a seguir, na Seção E) e uma HABP melhorada (por exemplo, qualquer uma fornecida aqui, a seguir, na Seção C), e opcionalmente, outros reagentes que acompanham, para uso na seleção, monitoramento e/ou tratamento de doenças e condições associadas ao HA, em especial câncer.
1. Acumulação de Hialuronan na Doença e Correlação com Prognóstico
[0188] Hialuronan (HA; também chamado de hialuronan ou hialuronato) é um polímero glicosaminoglicano linear (GAG) que contém subunidades dissacarídeo de N- acetil-glucosamina e ácido D-glucurônico repetidas através de ligações GlcUA-B1,3-GleNAC-Bl1,4. Hialuronan é sintetizado por uma classe de sintases de hialuronan, HAS1, HAS2 e HAS3. Estas enzimas atuam através de um alongamento de hialuronan adicionando ácido glucurônico e Nº acetilglucosamina ao polissacarídeo nascente, uma vez que é extrudido através da célula. Além das sintases de HA, os níveis de HA normalmente são mantidos pelo seu catabolismo por hialuronidases, especificamente a enzima modificada hialuronidase 1l1(Hyall). A transformação dinâmica do HA é equilibrada pela biossíntese e catabolismo, para manter uma concentração constante no tecido normal.
[0189] HA é um componente da matriz extracelular (ECM). É ubiquamente distribuído nos tecidos e localizado nas matrizes extracelulares, pericelulares, bem como no interior das células. HA tem uma ampla variedade de funções biológicas tais como a contribuição para a homeostase dos tecidos e biomecânica, proliferação celular, adesão e ativação imunitária, e a migração de células durante processos celulares dinâmicos. Estes processos são mediados por interação de HA com as proteínas de ligação ao HA, tal como TSG-6, versican, inibidor de inter-alfa-tripsina, CD44, receptor de HA endotelial dos vasos linfáticos (LYVE- 1-1) e RHAMM.
[0190] A acumulação de hialuronan está associada a várias condições de doenças malignas e auto-imunes (Járvelãinen H, et al. (2009) Pharmacol Rev 61: 198-223; Whatcott C J, et al. (2011) Cancer Discovery 1:291-296). Por exemplo, certas doenças estão associadas com a expressão e/ou a produção de hialuronan, incluindo doenças inflamatórias e cânceres. HA está ligado a uma variedade de processos biológicos envolvidos na progressão de tais doenças (por exemplo, ver Itano et al. (2008) Semin Cancer Bioll18(4):268-274; Tammi et al. (2008) Semin Cancer Biol 18(4):288-295).
[0191] Em particular, o HA é um componente da matriz tumoral e está presente em muitos tumores sólidos. O acúmulo de HA dentro de um foco tumoral impede o contato célula-célula, promove transições epitélio-mesenquimal, está envolvido com a via supressora de tumor p53 através de seus receptores RHAMM e CD44, e recruta macrófagos associados a tumores (Itano et al. (2008) Cancer Sci 99: 1720-1725; Camenisch et al. (2000) J Clin Invest 106:349-
360; Thompson et al. (2010) Mol. Cancer. Ther. 9:3052-64). A montagem de uma matriz pericelular rica em HA é um pré- requisito para a proliferação e migração de células mesenquimais que podem promover um comportamento metastático. Os tumores caracterizados pela acumulação de HA também apresentam absorção de água no tumor, e tem alta pressão de fluido intersticial (IFP) que pode inibir a penetração e acessibilidade do tumor às terapias aplicadas sistematicamente, tais como quimioterapia. Além disso, os oligômeros de HA, gerados pela degradação por Hyall, também demonstraram resultar na angiogênese ou apoptose, que podem contribuir para a patogênese do tumor.
[0192] A acumulação de HA tem sido correlacionada com a expressão do gene HAS e/ou a expressão do gene HYAL (Kosaki et al. (1999)Cancer Res. 59:1141-1145; Liu et al. (2001) Cancer Res. 61:5207-5214; Wang et al. (2008) PLoS 3:3032; Nykopp et al. (2010) BMC Cancer 10:512). Estudos na arte de forma diversa mostraram que HA, HAS ou Hyall podem ser usados como indicadores de prognóstico de câncer. Além disso, estudos vem sugerindo que a inibição seletiva de Hyall, tal como por meio de métodos anti-sense, ou de síntese de hialuronan por HAS, tal como pela utilização de 4-metilumbeliferona, são métodos de tratamento de tumores (Yoshihara et al. (2004) JJ. Biol. Chem. 279:33281-33289). Além disso, a hialuronidase, como por exemplo, PH20 como discutido a seguir, também vem sendo utilizada para tratar doenças e condições associadas ao hialuronan (ver por exemplo, Thompson et al. (2010) Mol. Cancer. Ther 9:3052- 3064).
[0193] Como se mostra nos Exemplos, é agora observado aqui que o fenótipo de uma célula de HA, e em particular a formação de uma matriz pericelular de tumor,
correlaciona-se com a agressividade do tumor, e de que um ensaio para os níveis de HA prevê especificamente a capacidade de células de tumores que sintetizam HA formar uma matriz pericelular. Especificamente, é observado aqui entre os potenciais marcadores de acumulação de HA, incluindo HAS1,2,3; Hyall ou 2; ou HA, que apenas determina o HA correlacionado com a formação da matriz pericelular e, assim, prevê a competência de células de tumor para formar matrizes pericelulares mediadas por HA-aggrecan e, assim, a agressividade do tumor. Assim, para efeitos de um diagnóstico para prever ou para prognóstico de uma terapia de tumores, uma proteína de ligação a HA (HABP) é contemplada. Como descrito aqui, a produção de tumor HA pode ser medida quantitativamente usando uma HABP como uma sonda, e HABP para hialuronan mostra uma correlação com a formação de matriz pericelular, enquanto não foi encontrada correlação entre a formação de matriz pericelular e níveis relativos de HAS ou Hyal mRNA. Estes resultados mostram que a medição direta do HA associado a células, e não os outros marcadores envolvidos na via metabólica de HA, oferece um preditor confiável para a formação da matriz pericelular.
2. Terapia de tumores com um agente anti- hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan) e capacidade de resposta ao tratamento
[0194] Encontra-se também aqui, que a quantidade ou a extensão da acumulação de HA medida, também se correlaciona com a capacidade de resposta ao tratamento com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tal como PH20. Agentes anti-hialuronan, como por exemplo, enzimas que degradam hialuronan, como por exemplo PH20, exibem propriedades úteis para o agente único ou uma terapia combinada de doenças e condições que exibem a acumulação de hialuronan (ácido hialurônico, HA). Tais doenças condições e/ou distúrbios associados a hialuronan, incluem cânceres e doenças inflamatórias. Cânceres ricos em hialuronan incluem, mas não estão limitados a tumores, incluindo tumores sólidos, por exemplo, tipos de câncer em estágio avançado, câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer do ovário, carcinoma in situ (I1SC) carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de mama, câncer de cólon e outros tipos de câncer.
[0195] Por exemplo, enzimas que degradam HA, tal com hialuronidase, por exemplo PH20, vem demostrando a remoção de HA de tumores, resultando na redução do volume do tumor, a redução de IFP, o abrandamento da proliferação de células tumorais, e a eficácia melhorada de medicamentos quimioterápicos e agentes biológicos co-administrados, permitindo o aumento da penetração no tumor (ver, por exemplo, Requerimento Publicado U.S. No. 20100003238 e Requerimento PCT International Publicado No. WO 2009/128917; Thompson et al. (2010) Mol. Cancer. Ther 9:3052-3064).
[0196] A capacidade de uma hialuronidase, tal como PH20, de degradar HA para servir como um agente terapêutico de doenças e distúrbios associados ao hialuronan, pode ser explorada, por modificação, para aumentar a meia-vida sistêmica. O aumento da meia-vida permite não só a remoção de HA, mas também, devido à sua presença contínua no plasma e a sua capacidade para degradar o HA, reduz ou diminui o grau de regeneração de HA dentro de tecidos doentes, como o tumor. Assim, a manutenção dos níveis de enzimas do plasma pode remover HA, como o tumor HA, e também neutralizar a ressíntese de HA. PEGuilação é uma tecnologia estabelecida utilizada para aumentar a meia-vida de proteínas terapêuticas no corpo,
permitindo assim a sua utilização em protocolos de tratamento sistêmicos. A PEGuilação de agentes anti- hialuronan, como enzimas degradadoras de hialuronan, tal como hialuronidase, prolonga sua meia-vida no corpo a partir de menos de um minuto a cerca de 48 a 72 horas, e permite o tratamento sistêmico de tumores ricos em HA (ver, por exemplo o Requerimento dos EUA publicado No. 20100003238 e o Requerimento PCT Internacional Publicado No WO 2009/128917; Thompson et al (2010) Mol Cancer Ther 9:3052-3064).
[0197] Encontra-se aqui, que a atividade inibidora do crescimento de um agente anti -hialuronan, e, em particular, uma enzima que degrada hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase, como PH20 ou PEGPH20, em células tumorais está correlacionada com o grau de níveis de HA. Como mostrado nos Exemplos, os tumores podem ser caracterizados em grupos fenotípicos (por exemplo, HA”, HA”?, HA”) com base na quantidade de expressão de HA no tumor. HA elevado associado a um tumor (HA) resultou em um crescimento do tumor acelerado em modelos animais, e em uma maior inibição de tumor por uma enzima degradadora de hialuronan (por exemplo PEGPH20). Por exemplo, a inibição do crescimento do tumor associada a um fenótipo HA” foi de 97%, ao passo que era de apenas 44% e 16% para os fenótipos HA”? ou HA” do tumor, respectivamente. Os dados indicam que o crescimento continuado de alguns tumores depende da densidade e da quantidade de HA no microambiente do tumor, e que a depleção de HA a partir de um tumor rico em HA (por exemplo, HA”**) tem um efeito mais pronunciado sobre o crescimento do tumor, do que a depleção de HA a partir de um tumor moderado ou pobre de HA (por exemplo, HA *º, HA“!) ou um tumor deficiente de HA. Assim, como mostrado aqui, o grau de acumulação de HA em tecidos tumorais, medido usando uma HABP, é preditivo do grau de inibição de crescimento tumoral in vivo mediado por um agente anti-hialuronan (por exemplo, PEGPH20).
3. Reagente e Diagnóstico de Proteínas de Ligação ao Hialuronan (HABPs)
[0198] Com base nos resultados apresentados anteriormente e aqui nos Exemplos, o biomarcador de HA, detectado utilizando uma HABP, foi especificamente correlacionado com a resposta a um tratamento anti- hialuronan, por exemplo, um tratamento com enzimas que degradam hialuronan (por exemplo PEGPH20). Assim, é aqui proporcionado um método de utilização de uma HABP para prognóstico e para prevenção do grau de sensibilidade e, portanto, a capacidade de resposta, a um agente anti- hialruonan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan (por exemplo, uma hialuronidase ou hialuronidase modificada, tal como PH20 PEGuilado, ou seja PEGPH20).
[0199] Por valor como um reagente, a sensibilidade e especificidade de uma HABP é desejada, bem como a reprodutibilidade devido a uma baixa variabilidade. Por exemplo, a detecção e medição de HA em tecidos é limitada, utilizando reagentes existentes. Atualmente, o método utilizado para detectar ou medir HA em tecidos através de coloração imuno-histológica depende principalmente das proteínas ou domínios de ligação ao HA derivados do tecido de cartilagem de animais. Estes incluem a HABP purificada a partir de proteoglican da cartilagem nasal bovina por extração com 4 M guanidina-HCl, e em seguida, por cromatografia de afinidade, utilizando resina acoplada ao HA. O HA de origem animal resultante é composto por dois componentes principais: domínio Gl Aggrecan e módulo de ligação. Devido à variação de lote para lote, bem como modificações diferentes utilizadas no método para preparar a HABP, há a variabilidade na arte, em termos de diferenças nos padrões de coloração da HABP e nos perfis de coloração, fazem difíceis as comparações entre os estudos. Assim, devido à sua existência como uma mistura heterogênea de componentes e de qualquer procedimento validado para a sua produção, as proteínas HABP alternativas são aqui proporcionadas para utilização em diagnósticos de acompanhamento para o prognóstico da doença e prevenção da eficácia do tratamento em conjunto com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan).
[0200] Assim, o reagente HABP para utilização nos métodos proporcionados aqui, inclui qualquer HABP que não seja uma HABP purificada a partir de cartilagem de animais, como por exemplo, purificada a partir de cartilagem nasal de osso, tal como utilizado na arte, empregando um método tal como descrito por E-Laurent et al. (1985) Ann. Rheum. Dis. 44:83-88) ou seu método modificado. HABPs exemplificativas para utilização nos métodos aqui descritos são apresentadas na seção C. Tais proteínas incluem, por exemplo, HABPs contendo domínios de ligação de um ou mais HA, incluindo um ou mais módulos de ligação para a ligação ao HA. Em alguns exemplos, a HABP contém um domínio de ligação ao HA (por exemplo, um módulo de ligação) de aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan HAPLNl, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4, TSG-6, Stabilin- 1, Stabilin -2, CAB61358 e KIAAO5S27. Em alguns exemplos, a HABP contém um domínio Gl aggrecan, domínio Gl versican, domínio Gl neurocan, domínio Gl brevican, ou um domínio Gl phosphacan. Em alguns exemplos, a HABP contém um domínio Gl do aggrecan, versican, neurocan, brevican, ou phosphacan e uma proteína de ligação selecionada a partir de HAPLN-1 HAPLN-2, HAPLN-3, ou HAPLN-4. Em alguns exemplos, a HABP contém um módulo de ligação TSG-6, Stabilin-l, Stabilin-2, CAB61358, ou KIAAOS27.
[0201] Em alguns exemplos, a HABP é uma HABP modificada, tal como, por exemplo, uma proteína modificada aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, HAPLN- 1, HAPLN-2, HAPLN-3, HAPLN-A4, Stabilin-1l, Stabilin-2, CAB61358, KIAAON5S27, ou TSG-6, tais como, por exemplo, TSG- 6-LM-Fc. Em alguns exemplos, a HABP é uma HABP modificada que é modificada para melhorar a sua ligação ao HA, tais como, por exemplo, TSG-6-LM-FcAHep.
[0202] Em particular, a HABP aqui fornecida 1) pode ser produzida de modo recombinante em um sistema de expressão, tal como um sistema de expressão de mamífero; 2) apresenta propriedades biofísicas melhores, tais como a estabilidade e/ou solubilidade; 3) pode ser purificada por métodos de purificação simples, como por uma etapa de métodos de purificação por afinidade; 4) é capaz de ser detectada através de procedimentos compatíveis com os ensaios de ligação, e, em particular, métodos de imuno- histoquímica ou ELISA; 5) podem ser expressas na forma multimérica (por exemplo, através de dimerização) para apresentar um aumento ou uma elevada afinidade para HA; e/ou 6) exibe especificidade para HA, em comparação com outros GAGs.
[0203] Em um exemplo, são fornecidas para uso nos métodos aqui presentes, HABPs que são proteínas de HA de módulos individuais, que podem ser produzidas de modo recombinante em sistemas de expressão. Em particular, são aqui proporcionados reagentes HABP que contêm um módulo de ligação. Por exemplo, as HABPs aqui fornecidas são do tipo classe A de HABPs contendo apenas o módulo de ligação (LM) ou uma porção suficiente da mesma, para se ligar ao hialuronan. Exemplos de tais HABPs são os genes estimulados por fator de necrose tumoral (TSG)-6-LM (módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 360), Stabilin-1-LM ou Stabilin- 2-LM (módulo de ligação estabelecido na SEQ ID no: 371 ou 372, respectivamente), CAB61358-LM (módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 373) ou KIAAON5S27-LM (módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 374).
[0204] Em outro exemplo, são fornecidas para uso nos métodos aqui presentes, HABPs que estão direta Ou indiretamente ligadas a um domínio de multimerização. Domínios de ligação ao HA, como por exemplo, um módulo de ligação, de HABPs, pode ser diretamente ou indiretamente ligado, tal como covalentemente ligado, não covalentemente ligado, ou quimicamente ligado, para formar multímeros de dois ou mais domínios de ligação ao HA. Os domínios de ligação ao HA podem ser o mesmo ou diferentes. Em particular, o domínio de ligação ao HA é um domínio ou módulo de ligação. Assim, os multímeros podem ser formados por dimerização de dois ou mais domínios de ligação. Em um exemplo, os multímeros podem ser ligados através de ligações de dissulfeto formadas entre resíduos de cisteína em diferentes domínios de ligação ao HA. Por exemplo, um domínio de multimerização pode incluir uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc). Em outro exemplo, os multímeros podem incluir um domínio de ligação ao HA juntos através de interações covalentes ou não-covalentes às porções de peptídeos fundidas para o polipeptídeo. Tais peptídeos podem ser ligantes peptídicos (espaçadores), ou peptídeos que tenham a propriedade de promover multimerização. No exemplo adicional, os multímeros podem ser formados entre dois polipeptídeos através de ligação química, como por exemplo, utilizando ligantes heterobifuncionais. Uma descrição de domínios de multimerização é fornecida abaixo. Exemplos de um multímero HABP é um módulo de ligação (LM) fundido a um Fc. Por exemplo, um reagente HABP para utilização nos métodos aqui descritos é TSG-6-LM-Fc.
[0205] Em um outro exemplo, são fornecidos para uso nos métodos aqui presentes HABP que são modificadas, por exemplo, por substituição de aminoácidos, para apresentar especificidade aumentada para o hialuronan em comparação com outros GAGs. Por exemplo, é aqui proporcionado um TSG-6-LM mutante contendo a substituição de aminoácido (s) nos resíduos de aminoácidos 20, 34, 41, 54, 56, 72 e/ou 84, e em particular, nos resíduos de aminoácidos 20, 34, 41, e/ou 54 (correspondentes aos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 206). À substituição de aminoácidos pode ser a de qualquer outro resíduo de aminoácido, e, geralmente, é um resíduo de aminoácido não- básico. Por exemplo, a substituição de aminoácidos pode ser para Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (Q), Ala (A), Val (V), Ile (1), Leu (L) Met (M), Phe (F), Tyr (Y) ou Trp (W). A substituição ou substituições de aminoácidos conferem diminuição de ligação à heparina. A ligação pode ser reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes,10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais, em comparação com a ligação de TSG-6-LM à heparina que não contém a substituição de aminoácido. Exemplos de um mutante TSG-6- LM para utilização como um reagente no processo aqui fornecido é K20A/K34A/K41A. Assim, por exemplo, a ligação a heparina é reduzida de tal modo que a especificidade para o hialuronan é aumentada. O mutante TSG-6-LM pode ser conjugado direta ou indiretamente para um domínio de multimerização para gerar multímeros. Um exemplo de um reagente para utilização nos métodos aqui presentes é TSG- 6-LM(K20A/K34A/K41A)-Fc.
[0206] Qualquer um dos reagentes pode ser utilizado sozinho ou em combinação, em um método de diagnóstico de acompanhamento. Por exemplo, em um ELISA sandwich ou ELISA competitivo, dois ou mais dos reagentes acima referidos podem ser utilizados. Como aqui descrito abaixo, qualquer uma das HABPs aqui proporcionadas podem ser conjugadas direta ou indiretamente a uma unidade que é capaz de detecção. Em alguns exemplos, as HABPs que se ligam ao HA, por exemplo, em uma amostra de tumor, podem ser detectadas usando um reagente secundário, tal um anticorpo que se liga à HABP. Em alguns exemplos, as HABPs são modificadas para permitir a detecção da ligação ao HA. Por exemplo, as HABPs podem ser conjugadas com uma molécula detectável, que permite tanto a detecção direta, como através de agentes de detecção secundários, tais como anticorpos que se ligam às HABPs modificadas e estão acoplados a proteínas detectáveis, tais como sondas fluorescentes ou enzimas detectáveis, tais como peroxidase de rábano.
4. Diagnóstico de acompanhamento e Métodos Prognósticos
[0207] As HABPs aqui proporcionadas podem ser usadas individualmente ou em combinação, em métodos de prognóstico ou de monitorização de diagnóstico, que utilizam ensaios de ligação em várias amostras biológicas de pacientes com uma doença ou condição associada ao hialuronan, ou em risco ou suspeitos de terem uma doença ou condição associada ao hialuronan. Por exemplo, as HABPs podem ser utilizadas em ensaios em pacientes com um tumor sólido, ou em risco de desenvolver um tumor sólido ou outro tipo de câncer. Em exemplos particulares, TSG-6-LM, TSG-6-
LM-Fc ou sua variante ou mutante, tal como um que exiba ligação reduzida para a heparina e maior especificidade para o hialuronan, é utilizado nos métodos aqui descritos. Os métodos de diagnóstico e de prognóstico podem ser utilizados em conjunto com a terapia com uma enzima que degrada hialuronan, a fim de classificar e/ou selecionar doentes para o tratamento ou para alterar ou modificar o curso do tratamento.
[0208] Nos métodos exemplificativos aqui proporcionados, os métodos de diagnóstico e de prognóstico são métodos de acompanhamento para a terapia com um agente anti-hialuronan, tais como uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase ou hialuronidase modificada, tal como PH20 ou PEGPH20. A detecção de HA pode informar a seleção do tratamento, a iniciação, a personalização da dose ou a rescisão, e, portanto, pode servir para individualizar o tratamento com um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan.
[0209] Por exemplo, um método de diagnóstico de acompanhamento de HABP pode ser usado para determinar se um indivíduo que tenha predisposição para uma doença Ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer), ou que sofra de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer) se beneficiará, ou é previsto ser responsivo a receber um tratamento com um agente anti- hialuronan, tal como uma enzima degradadora de hialuronan. No método, o nível de expressão de HA a partir de amostras de indivíduos predispostos ou conhecidos por terem uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer) pode ser determinado, e o nível de expressão de HA em amostras de indivíduos em comparação com os níveis predeterminados de HA que classificam responsividade de um agente anti-hialuronan, por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar o nível de limiar de HA para classificar a resposta ao tratamento com uma enzima que degrada hialuronan. Por exemplo, verifica-se aqui que existe uma correlação significativa entre a acumulação de HA elevado, e a inibição do crescimento do tumor, em que a resposta de inibição de crescimento do tumor está correlacionada com um fenótipo HA”? como quantificado por imuno-histoquímica de tecidos tumorais. Assim, no método de diagnóstico de acompanhamento aqui proporcionado, uma amostra do tumor é avaliada para os níveis de HA, utilizando um reagente de HABP aqui proporcionado por métodos de imuno-histoquímica ou outros métodos adaptáveis, para score. Se o fenótipo HA é HA”, tal como determinado por métodos conhecidos por um perito na arte e aqui descritos, então o indivíduo é selecionado como um candidato para o tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, tal como —hialuronidase ou hialuronidase modificada (ex. PH20 ou PEGPH20). Métodos de quantificação e classificação semelhantes podem ser utilizados mediante a avaliação de HA em fluidos corporais, tais como sangue ou plasma. As dosagens e os regimes de uma enzima degradadora de hialuronan, tais como PH20 ou PEGPH2O0, para o tratamento, são fornecidos aqui.
[0210] Os reagentes de HABP aqui proporcionados podem detectar HA utilizando qualquer ensaio de ligação conhecido por um perito na arte, incluindo, mas não limitado ao ensaio imunoenzimático (ELISA) ou qualquer outro imunoensaio semelhante, incluindo um ensaio ELISA sandwich ou ELISA competitivo; imuno-histoquímica (IHC); citometria de fluxo, ou western blot. O ensaio de ligação pode ser realizado em amostras obtidas a partir de um fluido corporal do paciente, de células ou amostra de tecido de qualquer tipo, incluindo plasma, urina, tecidos tumorais ou suspeita de tumor (incluindo tecido fresco, congelado, e fixo ou embebido em parafina), tecido de nódulo linfático ou medula óssea.
[0211] Uma vez que a quantidade de HA na amostra é determinada, o valor pode ser comparado com um nível de limiar ou de controle. Por exemplo, se a quantidade de HA está determinada a ser elevada na amostra, o individuo é selecionado como um candidato para a terapia de tumores. Exemplos de métodos para a estratificação das amostras tumorais ou amostras de fluidos corporais para O diagnóstico, prognóstico ou a seleção de indivíduos para o tratamento, são fornecidos aqui.
[0212] Em um exemplo, um método de diagnóstico utiliza uma amostra de tecido do tumor, células de tumor ou de um fluido corporal contendo proteínas, de um paciente. No método, a presença e nível de expressão de HA podem ser determinados utilizando uma HABP, por exemplo, TSG-6-LM, TSG-6-LM-Fc ou sua variante ou mutante, como aqui proporcionado. O nível de expressão do HA, é determinado e/ou pontuado, e comparado com fenótipos de HA predeterminados associados com a doença. Tal como descrito abaixo, estes valores predeterminados podem ser determinados por comparação ou conhecimento dos níveis de HA em uma amostra normal correspondente, tal como determinado pelo mesmo ensaio de detecção e utilizando o mesmo reagente HABP. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar o nível de limiar para o diagnóstico de doenças, dependendo da doença em particular, o ensaio a ser utilizado para a detecção de HA e/ou o reagente de detecção de HABP sendo usado. Por exemplo, em fluidos corporais tais como o plasma, níveis de HA maiores do que 0,02 pg/ml, 0,03 pg/mL, 0,04 po/mL, 0,05 uvg/mL, 0,06 pg/ml ou mais elevados, sao correlatos para a presença de um tumor ou câncer. Em outro exemplo, em métodos de imuno-histoquímica de tecidos do tumor, uma pontuação de HA”? ou HA”? pode ser determinante da doença. Se o nível é indicativo de doença, então o paciente é diagnosticado com um tumor.
[0213] Em outro exemplo, um método de prognóstico utiliza uma amostra de tecido do tumor, células de tumor ou um fluido corporal contendo proteínas de um paciente. No método, a presença e nível de expressão de HA podem ser determinados utilizando uma HABP, por exemplo, TSG-6-LM, TSG-6-LM-Fc ou sua variante ou mutante, como aqui proporcionado. O nível de expressão de HA, é determinado e/ou pontuado, e em comparação com fenótipos HA predeterminados associados com a doença. Tal como descrito abaixo, estes valores predeterminados podem ser determinados por comparação ou conhecimento dos níveis de HA em uma amostra normal correspondente, ou amostras de pacientes doentes tal como determinada pelo mesmo ensaio de detecção, e utilizando o mesmo reagente HABP. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar os níveis de limiar para o prognóstico de doenças, dependendo da doença em particular, o ensaio a ser utilizado para a detecção de HA e/ou o reagente de detecção de HABP utilizado. O nível de expressão de HA indica o curso esperado da progressão da doença no paciente. Por exemplo, altos níveis de HA, avaliados por métodos de imuno- histoquímica usando um esquema de score quantitativo (por exemplo, HA”) correlacionado à existência de doença maligna em uma variedade de tipos de câncer. Em outro exemplo, os níveis de HA em fluidos corporais, tais como plasma superior a 0,06 mg/mL de HA, também estão associados ao estágio da doença avançada.
[0214] Em um outro exemplo de métodos de diagnóstico de acompanhamento, o nível de expressão de HA em amostras de indivíduos previamente tratados com uma enzima que degrada hialuronan pode ser monitorado para determinar se um individuo administrado com o agente, obteve um nível eficaz do fármaco no sangue, a fim de otimizar a dosagem ou programação.
[0215] As seções seguintes descrevem os reagentes HABP exemplares e ensaios para a realização dos métodos de detecção de HA para utilização nos métodos de diagnóstico e de prognóstico, e, em particular, como companhia para a terapia com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan. Também são descritos agentes anti-hialuronan, que incluem agentes de enzima que degrada hialuronan, para utilização no tratamento de doenças e distúrbios associados ao hialuronan, e kits e combinações de reagentes HABP, com os referidos agentes (por exemplo, enzimas que degradam hialuronan). Qualquer um dos métodos acima referidos pode ser realizado utilizando qualquer um dos reagentes HABP descritos, e os métodos de detecção de ensaio, isoladamente ou em conjunto com a terapia com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan).
C. Proteínas de Ligação ao hialuronan (HABPS) para uso como um diagnóstico de acompanhamento
[0216] Os métodos aqui proporcionados são dirigidos para a medição quantitativa ou semi-quantitativa do hialuronan, em uma amostra, tal como um tumor ou amostra de fluido de um indivíduo que tenha um tumor, ou em suspeita de ter um tumor, utilizando uma proteína de ligação a hialuronan (HABP). Como aqui descrito, os tumores que expressam níveis elevados de hialuronan são responsivos ao tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo,
uma enzima que degrada hialuronan) e o grau de inibição do tumor por um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan) correlaciona-se com a grau Ou quantidade de acúmulo de hialuronan, e não de outros marcadores, como expressão de sintases hialuronan endógenas ou hialuronidases. As HABPs fornecidas para uso nos métodos aqui apresentados, em conjunto com os ensaios para a detecção das mesmas, descritas na seção D, permitem a detecção específica e sensível de HA nas amostras.
[0217] Os diagnósticos de acompanhamento HABP aqui proporcionados podem ser utilizados em conjunto com a terapia com um agente anti-hialuronan, tal como terapia com enzimas que degradam hialuronan, ou qualquer uma descrita na Seção E, para selecionar ou identificar pacientes previstos como responsivos ao tratamento e/ou para monitorar o tratamento e a sua eficácia, proporcionando assim, um melhor esquema de tratamento de doenças Ou condições “associadas ao hialuronan. Por exemplo, o diagnóstico de acompanhamento HABP aqui proporcionado pode ser utilizado para selecionar e/ou monitorar indivíduos ou doentes que possuam um tumor ou câncer. Além disso, os diagnósticos de acompanhamento HABP também podem ser usados em outros métodos de diagnóstico e de prognóstico, de doenças ou condições associadas ao hialuronan, tais como tumores ou cânceres.
[0218] São aqui proporcionadas proteínas de ligação ao hialuronan, para utilização nos métodos aqui proporcionados, para a detecção e quantificação de hialuronan em uma amostra. As proteínas de ligação ao hialuronan podem conter polipeptídeos HABP de comprimento total, ou partes dos mesmos contendo domínios de ligação de HA de HABPs, ou partes dos mesmos suficientes para se vincular ao HA. Normalmente, as HABPs ou porções das mesmas que contêm um domínio de ligação ao HA ou porção suficiente do mesmo, que se ligam ao HA, ou variantes ou multímeros dos mesmos, exibem uma afinidade de ligação com uma constante de dissociação (Kd) de, pelo menos, menos do que, ou menor do que, ou 1 x 10”M e, em geral, de pelo menos, menos do que, ou menor do que, ou 9x10 *M, 8x10 *M, 7x10*? M, 6x10 MM, 5x10 ºM, 4x10 ºM, 3x10 ºM, 2x10 ºM, 1x10 ºM, 9x10 ºM, 8x10 MM, 7x10 ºM, 6x10ºM, 5x10ºM, 4x10M, 3x10M, 2x10M, 1x10º M ou Kd inferior. Como é aqui discutido, a afinidade de ligação exibida é geralmente exibida em condições que permitam atingir o ideal, ou perto do ideal de ligação ao hialuronan. Em um exemplo, as condições de pH podem afetar a ligação. Por exemplo, aqui como diagnóstico de acompanhamento, ensaios de ligação usando um reagente TSG- 6, incluindo TSG -6-LM ou porções suficientes do mesmo para se ligar ao HA, suas variantes e multímeros dos mesmos, são geralmente conduzidos a um pH de cerca de 5,8 a 6,4, tal como cerca de, ou pH 6,0.
[0219] Proteínas de ligação ao hialuronan são de dois tipos: proteínas de ligação ao hialuronan que possuem um domínio de ligação ao HA, que contém um ou dois módulos de ligação, e proteínas que possuem um domínio de ligação ao HA que não é um módulo de ligação. Em exemplos particulares, os diagnósticos de acompanhamento aqui fornecidos são derivados de moléculas de ligação ao HABP que têm apenas um domínio de ligação único que confere ligação ao HA, que pode simplificar métodos de expressão, produção e purificação.
[0220] As HABPs aqui proporcionadas podem ser derivadas a partir de HABPs conhecidas ou podem ser geradas sinteticamente. Em alguns exemplos, HABPs podem ser geradas sinteticamente, com base em resíduos conservados dos domínios de ligação ao HA de HABPs conhecidas. As HABPs aqui proporcionadas também podem ser derivadas de HABPs geradas a partir de métodos de rastreio de proteínas de ligação ao HA, tais como a exibição por fagos ou métodos de rastreio baseados em afinidade.
[0221] As HABPs, incluindo os domínios de ligação ao HA de HABPs, ou porções das mesmas, que são suficientes para se ligar ao HA, aqui proporcionadas, podem ser modificadas para melhorar uma ou mais propriedades das HABPs para utilização nos métodos aqui fornecidos. Por exemplo, as HABPs, ou fragmentos de ligação ao HA respectivos, proporcionados aqui, podem ser modificados para aumentar a expressão de proteínas em sistemas de expressão de mamíferos, melhorar as propriedades biofísicas, tais como a estabilidade e a solubilidade, melhorar a purificação e detecção de proteínas, para aumentar a especificidade de HA e/ou aumentar a afinidade ao HA, desde que retenham a sua capacidade de se ligar ao HA. Por exemplo, um fragmento de ligaçãa HABP ou HA da mesma, aqui fornecido para uso nos métodos, pode ser modificado para aumentar a sua especificidade ao hialuronan em comparação com outros glicosaminoglicanos. Em outro exemplo, uma HABP ou fragmento de ligação ao HA da mesma, aqui fornecido para uso nos métodos, pode ser ligado diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização, para aumentar o número de sítios de ligação ao HA na molécula e, portanto, aumentar a afinidade para a ligação ao HA.
[0222] Além disso, para uso como um diagnóstico de acompanhamento aqui referido, qualquer uma das HABPs, ou partes destas (por exemplo, módulos de ligação ou porções suficientes dos mesmos para se ligar ao HA) podem ser modificadas para facilitar a detecção. Por exemplo, os diagnósticos de acompanhamento são modificados por conjugação, diretamente ou indiretamente, a biotina, uma fração fluorescente, um marcador radioativo ou outro marcador detectável.
[0223] Uma descrição de HABPs exemplares para uso como agentes de diagnóstico de acompanhamento aqui descritos, e modificações destes, é fornecida abaixo.
1. Proteínas de Ligação ao HA com Módulos de ligação ou Domínios Gl
[0224] São aqui proporcionadas como reagentes de diagnóstico de acompanhamento para utilização nos métodos aqui apresentados, proteínas de ligação ao HA (HABP) ou suas porções, que contenham pelo menos um módulo de ligação ou domínio de ligação, e, em geral, pelo menos, dois ou mais módulos de ligação. Em alguns exemplos, a HABP contém um domínio Gl que contém dois módulos de ligação. A ligação ao HA é mediada através do módulo de ligação. Módulos de ligação, também chamados de repetições em tandem de proteoglicanos, são cerca de 100 aminoácidos (aa) em comprimento, com quatro cisteínas que são dissulfeto ligadas no padrão Cysl-Cys4 e Cys2-Cysôi. A estrutura tridimensional dos módulos de ligação é constituída por duas hélices alfa e duas folhas beta antiparalelas de cadeia tripla.
[0225] Existem três categorias de proteínas que contêm o módulo de ligação: uma proteína do tipo de domínio A que contém um único módulo de ligação; Proteínas do tipo do domínio B, que contêm um único módulo de ligação estendido por uma região de flanco -N e C-terminal; e proteínas do tipo do domínio C que possuem uma estrutura alargada denominada domínio Gl, que contém um domínio semelhante a Ig de tipo V, n-terminal, seguido por um par adjacente de dois módulos de ligação. Estudos de modelagem e comparação demonstraram um elevado grau de resolução e de conservação de certos aminoácidos entre proteínas que contém módulos de ligação que se correlacionam à interação com HA (Blundell et al. (2005) J. Biol. Chem., 280:18189- 18201). Por exemplo, resíduo de aminoácido de ligação ao HA central correspondente a Tyr59 e Tyr78, com a numeração com referência ao TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360 são conservados entre as HABPs que contém módulo-ligação através de aminoácidos idênticos ou conservadores (por exemplo, resíduos hidrofóbicos de frente plana e larga ou aromáticos, que também podem acumular-se contra um anel de GlcNAc, por exemplo, Phe, His, Leu ou Val) na posição correspondente, com base no alinhamento com TSG-6-LM (por exemplo, descrito na SEQ ID NO:360). Além disso, os resíduos básicos nas posições correspondentes às posições 11 e 81 apresentadas na SEQ ID NO: 360, também são encontrados em outros módulos de ligação, tal como determinado pelo alinhamento.
[0226] Proteínas de ligação ao HA contendo módulos de ligação para utilização nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a, TSG-6 (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO: 206 como o precursor e na SEQ ID NO0:222 como a proteína madura sem uma sequência de sinal; ou LM estabelecida na SEQ ID NO:207, 360, 417 ou 418, que representa vários comprimentos do LM como relatado na literatura), stabilin-l (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:223 ou a forma madura da mesma; ou LM estabelecida na SEQ ID NO:371), stabilin-2 (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:224 ou a forma madura da mesma; ou LM estabelecida na SEQ ID NO:372), CD44 (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:227 ou a forma madura da mesma; ou LM estabelecida na SEQ ID NO:375), LYVE-l (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:228 ou a forma madura da mesma; ou o módulo de ligação estabelecido na SEQ ID
NO:376), HAPLNI (por exemplo HAPLNI-l e HAPLN1I-2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:229 ou a forma madura da mesma; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:377 ou 378), HAPLN2 (por exemplo, HAPLN2-l1 e HAPLN2-2; por exemplo, estabelecidas na SEQ ID NO:230 ou a forma madura das mesmas; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO: 379 ou 380), HAPLN3 (por exemplo, HAPLN3-1 e HAPLN3-2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:231 ou a forma madura da mesma; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:381 ou 382), HAPLN4 (por exemplo, HAPLN4-1 e HAPLN4-2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:232 ou a forma madura da mesma, ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:383 ou 384), aggrecan (por exemplo aggrecan l, aggrecan 2, aggrecan 3 e aggrecan 4; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:233 ou à forma madura da mesma; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO: 385, 386, 387 or 388), versican (por exemplo versican 1 e versican 2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:235 ou a forma madura da mesma; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:391 ou 392), brevican (por exemplo brevican 1 e brevican 2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:234 ou a forma madura da mesma; ou LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:389 ou 390), neurocan (por exemplo neurocan 1 e neurocan 2; por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:236 ou a forma madura da mesma; por exemplo LM ou LMs estabelecida na SEQ ID NO:393 ou 394) e phosphacan (por exemplo, estabelecida na SEQ ID NO:340 ou a forma madura da mesma). Exemplo de uma HABP fornecida para uso nos métodos aqui descritos é TSG-6.
[0227] Em particular, nos exemplos aqui apresentados, a HABP utilizada nos métodos aqui descritos contém, pelo menos, um módulo de ligação, e em alguns casos, contém, pelo menos, dois ou, pelo menos, três módulos de ligação. A HABP pode ser uma HABP completa contendo um módulo de ligação. Por exemplo, o reagente de diagnóstico de acompanhamento, para utilização no método desta invenção, pode conter uma sequência de aminoácidos conforme descrita em qualquer uma das SEQ ID NOS: 206, e 223-236, a forma madura da mesma, Ou uma sequência de aminoácidos que exiba pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 206, e 223-236. Por exemplo, a HABP para uso como um diagnóstico de acompanhamento aqui presente pode ser TSG-6 de comprimento total, possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 222, ou uma sequência de aminoácidos que exiba, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência, com uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 222.
[0228] Em outros exemplos, o reagente de diagnóstico de acompanhamento, para utilização nos métodos aqui descritos contém apenas o módulo de ligação ou uma porção suficiente de um módulo de ligação, para se ligar ao HA derivado de uma HABP de comprimento total, apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 206 e 223-236, ou a forma madura da mesma (sem a sequência do sinal). Em alguns exemplos, a HABP que contém um módulo de ligação Ou módulos, não é a sequência completa de uma HABP estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 206, e 223- 236, ou a forma madura da mesma (sem a sequência de sinal). Entende-se que a porção de um módulo de ligação ou HABP é geralmente uma sequência contígua de aminoácidos que é, geralmente, pelo menos 50 aminoácidos em comprimento, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 ou mais aminoácidos. Em alguns exemplos, o módulo ou módulos de ligação são a única porção HABP da molécula de ligação de diagnóstico de acompanhamento. Por exemplo, o reagente de diagnóstico de acompanhamento, para utilização no método aqui descrito, contém apenas uma parte de uma HABP de comprimento total, e possui uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416 -418, ou uma sequência de aminoácidos que exiba, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361 371-394 e 416-418.
[0229] Nos exemplos aqui apresentados, o reagente de diagnóstico de acompanhamento para utilização nos métodos aqui descritos contém um domínio Gl ou porção suficiente do mesmo, para ligar-se especificamente ao HA. A HABP contendo o domínio Gl pode ser derivada a partir de uma HABP de comprimento total apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 233-236, ou uma forma madura da mesma. Em alguns exemplos, a HABP contendo o domínio Gl não é a sequência completa de HABPs estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 233-236 ou forma madura da mesma. Entende- se que a porção de uma HABP que contém um domínio Gl é geralmente uma sequência contígua de aminoácidos que é, geralmente, pelo menos 100 aminoácidos em comprimento, tal como 150, 200, 250, 300, 400 ou mais aminoácidos. Em alguns exemplos, o domínio Gl é a única porção HABP da molécula de ligação de diagnóstico de acompanhamento. Por exemplo, o reagente de diagnóstico de acompanhamento para utilização no método aqui descrito contém apenas uma parte de uma HABP de comprimento total, e tem um domínio Gl com uma sequência de aminoácidos como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOS: 423-426, Ou uma sequência de aminoácidos que exiba, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 423-426.
[0230] Em alguns exemplos, o diagnóstico de acompanhamento pode conter mais do que um módulo de ligação, tal como dois ou três módulos de ligação. Os módulos de ligação podem ser a partir do mesmo ou diferentes da HABP. Os diagnósticos de acompanhamento podem conter módulos de ligação que estão ligados direta Ou indiretamente, para formar um único polipeptídeo. Em outros exemplos, o diagnóstico de acompanhamento podem conter módulos de ligação que são estabelecidos como um polipeptídeo separado que está ligado quimicamente, como através de uma ligação de dissulfeto. Exemplo de um fragmento de HABP fornecido, para uso nos métodos aqui descritos, é o domínio de ligação TSG-6 (TSG-6-ME), ou uma porção sua, suficiente para se ligar ao HA.
[0231] Em alguns exemplos, a HABP é um multímero contendo dois ou mais módulos de ligação que estão ligados diretamente ou indiretamente através de um domínio de multimerização, para efetuar a formação de moléculas de dímeros ou trímeros, e a geração de múltiplos locais de ligação ao HA. Por exemplo, um diagnóstico de acompanhamento para utilização nos métodos aqui descritos é aquele que é gerado pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica para o módulo de ligação apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-39 e 416-418, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência, com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416-418 ligada diretamente ou indiretamente a um ácido nucleico que codifica um domínio de multimerização, tal como uma parte Fc de uma imunoglobulina. Assim, o multímero HABP ou multímero LM resultante contém um primeiro polipeptídeo definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416- 418, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416-418, ligada diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização; e um segundo polipeptídeo como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416-418, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 371-394 e 416- 418, ligada direta ou indiretamente a um domínio de multimerização. A sequência do módulo de ligação, no primeiro e no segundo polipeptídeo pode ser a mesma Ou diferente. Exemplo de um multímero de HABP fornecido para uso nos métodos aqui descritos é um multímero contendo duas cadeias polipeptídicas, em que cada uma contém o TSG-6-LM, variante sua, ou uma porção sua suficiente, para ligar ao HA ligado diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização, que efetua multimerização. Por exemplo, é aqui fornecida para uso nos métodos, uma molécula TSG-6-LM: Fc (ver por exemplo, SEQ ID NO: 212 ou 215).
[0232] Uma descrição de HABPs exemplares contendo domínios de ligação, incluindo estrutura e descrição da função, é fornecida abaixo. Qualquer uma das HABPsS ou porções das mesmas, descritas como um fragmento que contém apenas um domínio de ligação, ou porção suficiente do mesmo para ligar ao HA, pode ser utilizado como um reagente de diagnóstico de acompanhamento nos métodos aqui descritos.
Entende-se que a referência aos aminoácidos, incluindo uma sequência específica definida como uma SEQ ID usada para descrever a organização do domínio de um domínio de ligação, ou outro domínio, são para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito das modalidades fornecidas. Entende-se que os polipeptídeos e a descrição dos mesmos domínios são teoricamente derivados com base na análise de homologia e alinhamentos com moléculas semelhantes. Assim, o local exato pode variar, e não é necessariamente o mesmo para cada HABP. Assim, o domínio específico, tal como a ligação de domínio específico, pode ser de vários aminoácidos (um, dois, três ou quatro) mais longos ou mais curtos.
a. Tipo A: Subgrupo TSG-6
[0233] São aqui fornecidas como diagnóstico de acompanhamento, para uso nos métodos aqui descritos, HABPs que são membros do subgrupo do tipo A, que contém um módulo de ligação único que se liga ao hialuronan. HABPs do tipo À ligam-se ao HA com um comprimento de cadeia mínimo de seis açúcares, hexassacarídeo (HA), Ou maior. Os membros do subgrupo do tipo A, que podem ser usados como diagnóstico de acompanhamento nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a, TSG-6, Stabilin-l, Stabilin-2, CAB61358 e KIAAO5S27, módulos de ligação dos mesmos, ou partes suficientes de um módulo de ligação ligado ao HA.
i. TSG-6
[0234]É um exemplo de uma HABP do subgrupo do tipo A fornecido para utilização como um reagente de diagnóstico de acompanhamento nos métodos proporcionados aqui, TSG-6, ou um módulo de ligação do mesmo, uma porção suficiente de um módulo de ligação para se ligar ao HA, as suas variantes ou seus multímeros. O Gene 6 que estimula o fator de necrose tumoral (TSG-6, proteína 6 alfa-induzida de fator de necrose tumoral, TNFAIP6; SEQ ID NO:206) é uma glicoproteína de - 35 kDa secretada, composta por um único domínio CUB C-terminal e módulo de ligação N-terminal. A expressão de TSG-6 é induzida em diferentes tipos celulares por mediadores inflamatórios, incluindo citocinas e fatores de crescimento. Através do seu módulo de ligação, TSG-6 é um potente inibidor da migração de leucócitos polimorfonucleares. TSG-6 forma um complexo estável com o inibidor de serina-protease Inter-alfa-inibidor (IalI) e potencializa a atividade antiplasmina de Ial. TSG-6 também é importante para a formação e remodelação de revestimentos pericelulares ricos em HA e matrizes extracelulares.
[0235] A transcrição humana TSG-6 (SEQ ID NO: 205) é normalmente traduzida para formar um precursor de 277 aminoácidos de peptídeos (SEQ ID NO: 206) que contém uma sequência de sinal de 17 aminoácidos no N-terminal. A TSG- 6 madura (estabelecida na SEQ ID NO: 222), portanto, é uma proteína de 260 aminoácidos contendo os aminoácidos 18- 277 da SEQ ID NO: 206 (Lee et al. (1992) J Cell Biol 116:545-557). TSG-6 é composta por dois domínios principais, o módulo de ligação e o domínio CUB. O módulo de ligação de TSG-6 é variadamente referido na literatura para ser localizado nos aminoácidos 35-129, 36-128, 36-129 ou 36-132 da SEQ ID NO: 206 (apresentada como SEQ ID NOS: 207, 360, 417 ou 418, respectivamente). Entende-se que a referência ao locus de um domínio pode variar de acordo com vários aminoácidos, devido a diferenças nos alinhamentos. Assim, para os presentes fins, uma TSG-6-LM é estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 417 ou 418, ou que varia a partir de tal sequência, por um, dois ou três aminoácidos. O domínio CUB está localizado nos aminoácidos 135-246 da SEQ ID NO: 206. A TSG-6 humana tem dois potenciais glicanos N-ligados aos resíduos N118 e N258 da
SEQ ID NO: 206. Além disso, os resíduos T259 e T262 de SEQ ID NO: 206 são fosforilados (Molina et al (2007) Proc Natl Acad Sci EUA 104:2199-2204). A TSG-6 humana tem oito cisteínas nativas que formam quatro pontes de dissulfeto em resíduos C58-Cl27, C82-C103, C135-Cl61 e C188-C210 da pré- proteína TSG-6 (SEQ ID NO:206).
[0236] O módulo de ligação TSG-6 (SEQ ID NO: 360) tem uma dimensão relativamente pequena e uma estrutura bem caracterizada. A estrutura do domínio de ligação TSG-6 tridimensional foi determinada e verificou-se ter a mesma dobra que outros módulos de ligação conhecidos, com duas hélices alfa e duas folhas beta antiparalelas dispostas em torno de um grande núcleo hidrofóbico (Kohda et al. (1996) Cell 86:767-775). Além disso, a interação do módulo de ligação de TSG-6 e HA tem sido estudada revelando que os anéis aromáticos de Tyrl2, Tyr59, Phe70, Tyr78, Trp88 o os resíduos básicos Lysll, Lys72, Asp77, Arg 81, e Glu86 do domínio de TSG-6(SEQ ID NO: 360) são importantes para a ligação ao HA (ver, por exemplo, Kahmann et al. (2000) Structure 15:763-774; Mahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771; Kohda et al. (1996) Cell, 88:767-775; Blundell et al. (2003) 3 Biol Chem 278:49261-49270; Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754; Blundell et al. (2005) J Biol Chem 280:18189-18201). Os estudos estruturais mostram também que há apenas um único local de ligação ao HA contido no módulo de ligação, que está localizado a uma região da molécula com base no mapa estrutural dos resíduos Lysll, Tyrl2, Tyr59, Phe70 e Tyr7/78, mais diretamente implicados na ligação ao HA (ver, por exemplo Mahoney et al. (2001) J Biol Chem 276:22764-22771).
[0237] O módulo de ligação TSG- 6 apresenta a atividade de ligação a vários glicosaminoglicanos. Por exemplo, os estudos revelaram a ligação do módulo de ligação ao HA, a condroitina-4-sulfato (C4S), domínio G1 do proteoglicano aggrecan, heparina e a cadeia de bicunina de IaIl (ver, por exemplo, Milner et al. (2003) Journal of Cell Science, 116:1863-1873; Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055). A ligação do TSG-6 à heparina e ao HA é mediada por um sítio de ligação distinto no LM de TSG-6. Os resíduos envolvidos na ligação TSG-6-LM ao HA são Lysll, Tyrl2, Tyr59, Phe70 e Tyr'78, em que os mutantes Kl1Q, Y12F, Y59F, F70V e Y78F possuem entre e 100 vezes menos afinidade de ligação ao AH, em comparação ao tipo selvagem ; os resíduos no TSG-6-LM envolvido na ligação à heparina são Lys20, Lys34, Lys41l, Lys54, Arg56 e Arg84, pelos quais os mutantes K20A, K34A, K41A e K54A exibem propriedades de ligação à heparina enfraquecidas; e os resíduos envolvidos na ligação TSG-6-LM à bicunina se sobrepõem mas não são idênticos ao sítio de ligação ao HA (Mahoney et al. (2005) Journal of Biological Chemistry, 280:27044-27055).
[0238] A ligação de TSG-6 para hialuronan é dependente do pH, com a atividade de ligação mostrada em um pH ácido ou de cerca de 5,6-6,4, tal como, ou cerca de 5,8 a 6,0.
[0239] Polipeptídeos TSG-6, domínios de ligação ao HA dos mesmos, por exemplo, módulos de ligação TSG-6, Ou seus fragmentos suficientes para se ligar ao HA, aqui fornecidos para uso como um diagnóstico de acompanhamento nos métodos desta invenção, podem incluir qualquer uma de SEQ ID NOS : 206, 207, 222, 360, 417 ou 418, ou suas variantes, tais como as variantes que exibem pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 206, 207, 222, 360, 417 ou
418. Exemplos de variantes incluem, por exemplo, variantes de espécie, variantes alélicas e variantes que contêm as mutações de aminoácidos conservadoras e não-conservadoras. Variantes alélicas naturais da TSG-6 humana incluem, por exemplo, TSG-6 que contém o aminoácido de substituição Q144R (SEQ ID NO: 407, Nentwich et al (2002) J Biol Chem 277:15354-15362). TSG-6 é altamente conservada entre as espécies com proteína humana e de rato 94% idênticas. Espécies variantes de TSG-6 ou fragmentos de ligação ao HA, para utilização como um diagnóstico de acompanhamento, nos métodos “aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a, camundongo (SEQ ID NO:252), coelho (SEQ ID NO:253), bovina (SEQ ID NO:254), cavalo (SEQ ID NO:409), chimpanzé (SEQ ID NO:408), cachorro (SEQ ID NO:410), camundongo (SEQ ID NO:411), frango (SEQ ID NO:412), rã Xenopus laevis (SEQ ID NO:413), peixe-zebra (SEQ ID NO:414), as formas maduras dos mesmos, ou módulos de ligação ou porções suficientes dos mesmos para ligação ao HA.
[0240] Variantes de TSG-6 ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes com uma modificação de aminoácido que é uma substituição de aminoácidos (substituição), deleção ou inserção. Modificações exemplificativas são as substituições de aminoácidos, tais como uma substituição de aminoácidos em qualquer um dos resíduos de aminoácidos 4, 6, 8, 13, 20, 29, 34, 41, 45, 54, 67, 72 ou 96, correspondentes aos resíduos na TSG-6 estabelecida na SEQ ID NO: 360, 417 ou 418. A substituição de aminoácidos pode ser a de qualquer outro resíduo de aminoácido. Exemplos de substituições de aminoácidos de polipeptídeos TSG-6 ou fragmentos de ligação ao HA, dos mesmos aqui proporcionados, para utilização como um reagente de diagnóstico do companhia nos métodos aqui proporcionados, incluem polipeptídeos TSG-6 modificados ou seus fragmentos de ligação ao HA, que contêm pelo menos uma substituição de aminoácidos que corresponde a H4K, EHA4S, E6A, E6K, R8A, K13A, K20A, H29K, K34A, K41A, H45S, K54A, N67L, N67S, K72A, H96K, K34A/K54A ou K20A/K34A/K41A correspondente aos resíduos na TSG-6 estabelecida na SEQ ID NO:360, 417 ou 418 (ver, por exemplo, Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biol Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biol Chem279:25745-25754, Kahmann et al. (2000) Structure 15:763-774). Entende-se que os resíduos importantes ou de outro modo necessários para a ligação de TSG-6 ao HA, tal como descrito acima, ou qualquer um conhecido por um perito na arte, são geralmente invariáveis e não podem ser alterados. Assim, por exemplo, os resíduos de aminoácido 11, 12, 59, 70, 78 e 81 da SEQ ID NO: 360 no módulo de ligação de TSG-6 são geralmente invariáveis e não são alterados. Além disso, entende-se que as modificações de aminoácidos que resultam em dobra imprópria Ou perturbação da dobra do módulo de ligação são geralmente invariáveis. Assim, por exemplo, uma modificação TSG-6, fornecida para utilização nos métodos aqui descritos, não irá conter qualquer uma ou mais das modificações de aminoácidos H4S, H29A, H45A, H45K, R56A, D77A, R84A e D89A da SEQ ID NO:360 (Mahoney et al. (2005) J Biol Chem 280:27044-27055, Blundell et al. (2007) J Biol Chem 282:12976-12988, Lesley et al. (2004) J Biol Chem 279:25745-25754).
[0241] Em particular, a modificação, por exemplo, a substituição ou substituições de aminoácido, são aquelas que conferem uma alteração, tal como uma melhoria, da atividade em relação a uma TSG-6 que não contenha a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de TSG-6 ao HA, aumentam a especificidade de TSG-6 para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de TSG-6. Por exemplo, aqui fornecidas para utilização nos métodos aqui descritos são variantes de TSG-6, domínios de ligação ao HA, ou porções dos mesmos, suficientes para se ligar ao HA, que aumentam a especificidade de TSG-6 para o HA, diminuindo a ligação de TSG-6 a outros glicosaminoglicanos, incluindo heparina, condroitina-4-sulfato, sulfato de heparan e sulfato de dermatan.
A ligação a outro glicosaminoglicano que não é hialuronan pode ser reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, oito vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais, em comparação com a ligação de TSG-6-LM que não contém a modificação.
Por exemplo, é aqui proporcionado uma TSG-6-LM mutante que contém a substituição de aminoácido (s) nos resíduos de aminoácidos 20, 34, 41, 54, 56, 72 e/ou 84, e em particular nos resíduos de aminoácidos 20, 34, 41, e/ou 54 (correspondentes aos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 206). A substituição de aminoácidos pode ser a de qualquer outro resíduo de aminoácido, e geralmente, é um resíduo de aminoácido não- básico.
Por exemplo, a substituição de aminoácidos pode ser para Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (O), Ala (A), Val (V), Ile (1), Leu (L), Met (M), Phe (F), Tyr (Y) ou Trp (W). A substituição ou substituições de aminoácidos conferem diminuição de ligação à heparina.
Por exemplo, as variantes que diminuem a capacidade de TSG-6 para se ligar à heparina são conhecidas por um perito na arte.
Tais variantes são aquelas que incluem pelo menos uma mutação correspondente a K20A, K34A, K41A e K54A, incluindo as variantes K34A/K54A ou K20A/K34A/K41A (Mahoney et al.
(2005) J Biol Chem 280:27044-27055). Exemplos de variantes que diminuem ou reduzem a ligação à heparina são as variantes TSG-6-LM estabelecidas na SEQ ID NO: 361 ou 416.
[0242] Exemplo de um polipeptídeo TSG-6 aqui fornecido para uso nos métodos aqui descritos é um polipeptídeo TSG-6 que contém, pelo menos, um domínio de ligação ao HA, por exemplo, um módulo de ligação TSG-6. Assim, é aqui proporcionado um módulo de ligação TSG-6, Ou uma variante sua, para utilização nos métodos fornecidos. Exemplo de tal reagente é um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418, ou possui uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 95%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 416, 417 ou 418. Por exemplo, o módulo de ligação TSG-6 pode ser modificado para alterar a sua especificidade, afinidade ou solubilidade, enquanto retém a sua capacidade de se ligar ao HA.
[0243] Em ainda outro exemplo, a afinidade do módulo de ligação de TSG-6 é aumentada por dimerização ou multimerização, tais como, por exemplo, por fusão de um domínio de multimerização, tal como um domínio Fc (ver Seção C3 abaixo). Assim, o módulo de ligação TSG-6 pode ser modificado para produzir um multímero contendo dois ou mais módulos de ligação que estão ligados diretamente ou indiretamente através de um domínio de multimerização para efetuar a formação de moléculas de dímeros ou trímeros, e à geração de múltiplos locais de ligação ao HA. Por exemplo, um diagnóstico de acompanhamento, para utilização nos métodos aqui descritos, é aquele que é gerado pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica para o módulo de ligação apresentado em qualquer uma das
SEQ ID NOS : 207, 360, 361, 417 ou 418, ou um ácido nucleico que codifica um módulo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70% 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 417 ou 418, ligada diretamente ou indiretamente a um ácido nucleico que codifica um domínio de multimerização, tal como uma parte Fc de uma imunoglobulina. Assim, o multímero TSG-6-LM resultante contém um primeiro polipeptídeo definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 417 ou 418, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 417 ou 418, ligada direta ou indiretamente a um domínio de multimerização ; e um segundo polipeptídeo estabelecido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 417 ou 418, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 207, 360, 361, 417 ou 418, ligada direta ou indiretamente a um domínio de multimerização. Geralmente, LM, ou uma porção sua suficiente para efetuar a ligação ao HA, é a única parte TSG-6 do multímero. Por exemplo, aqui fornecido para uso nos métodos é uma molécula TSG-6-LM: Fc (ver por exemplo, SEQ ID NO: 212 ou 215).
[0244] Em outro exemplo, o módulo de ligação TSG- 6 está ligado a um domínio Fc para aumentar a sua solubilidade (ver Seção C3 abaixo).
ii. Stabilin-l1 e Stabilin-2
[0245] É exemplo de uma HABP do subgrupo do tipo A, fornecida para utilização como um reagente de diagnóstico de acompanhamento nos métodos proporcionados aqui, Stabilin-l ou Stabilin-2, ou um módulo de ligação das mesmas, uma porção suficiente de um módulo de ligação para se ligar ao HA, variantes da mesma ou multímeros da mesma. Stabilin-l1 (também chamada STABl, CLEVER-l, KIAAO246, FEEL- 1, FEX-l e FELE-l; SEQ ID NO0:223) e Stabilin-2 (também chamada STAB2, FEEL-2, precursor FELL2 do tipo CD-44, DKFZp434E0321, FEX2, e o receptor de hialuronan para endocitose/HARE; SEQ ID NO: 224) são membros de transmembranas de tipo I, de uma família de homólogos dos receptores de hialuronan (HA) do tipo faciclina. Ambas contêm sete domínios de adesão do tipo faciclina, múltiplas repetições do tipo EGF, e módulos de ligação ligados ao HA. Ambas (Stabilin-l e Stabilin-2) são expressas no endotélio sinusoidal e macrófagos, embora cada uma seja funcionalmente distinta. Stabilin-1 está envolvida em duas vias de tráfego intracelular: endocitose mediada por receptores e reciclagem; e transitando entre o compartimento endosomal e a rede trans-Golgi (TGN) . Stabilin-2 age como um receptor scavenger para o HA e proteínas modificadas por AGE.
[0246] A sequência precursora de Stabilin-l está descrita na SEQ ID NO: 223. O módulo de ligação de Stabilin-l1 está localizado em 2208-2300 da SEQ ID NO: 223, e é descrito na SEQ ID NO: 371. A sequência precursora de Stabilin-2 é apresentada na SEQ ID NO: 224, e o módulo de ligação de Stabilin-2 está localizado nos aminoácidos 2198- 2290 da SEQ ID NO: 224, e é descrito na SEQ ID NO: 372.
[0247] polipeptídeos Stabilin-l ou Stabilin-2, domínios de ligação de HA dos mesmos, por exemplo, módulos
Stabilin-LM ou seus fragmentos, suficientes para se ligar ao HA, aqui fornecidos para uso como um diagnóstico de acompanhamento nos métodos aqui descritos, incluem o módulo de ligação estabelecido na SEQ ID NO: 371 ou 372, ou suas variantes, que apresentam pelo menos 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NºS: 371 ou 372. As variantes incluem variantes que apresentam ligação específica ao HA. As variantes incluem variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácidos (por exemplo, para aumentar a afinidade ou especificidade para HA). Espécies variantes de Stabilin-l previstas para utilização nos métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO:255) e bovino (SEQ ID NO: 256), e espécies variantes de Stabilin-2 fornecidas para utilização nos métodos aqui descritos incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO: 257) e de rato (SEQ ID NO: 258).
[0248] É também aqui proporcionado para uso como um diagnóstico de acompanhamento nos métodos aqui descritos um multímero Stabilin-1-LM ou Stabilin-1-LM que exibe uma afinidade aumentada para o HA. Por exemplo, um diagnóstico de acompanhamento, para utilização nos métodos aqui descritos, é aquele que é gerado pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica para o módulo de ligação apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ou um ácido nucleico que codifica um módulo de ligação que possui uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ligada diretamente ou indiretamente a um ácido nucleico que codifica um domínio de multimerização, tal como uma porção Fc de uma imunoglobulina. Assim, OO multímero LM resultante contém um primeiro polipeptídeo definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70% 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência, com uma Sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ligada diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização; e um segundo polipeptídeo como descrito em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ou uma sequência de aminoácidos que exibe, pelo menos, 65%, 70%, 75%, 80% 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 371 ou 372, ligada diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização.
b. Tipo B: Subgrupo CD44
[0249] São aqui proporcionadas como um reagente de diagnóstico de acompanhamento, para utilização nos métodos aqui descritos, HABPs que são membros do subgrupo do tipo B com um domínio de ligação ao HA, que contém um módulo de ligação único com as extensões N- e C-terminal, que se ligam ao hialuronan. Ao contrário do domínio de ligação ao HA do subgrupo do Tipo A/ TSG-6, as sequências que flanqueiam os domínios de ligação são essenciais para a integridade estrutural do domínio de tipo B, e são necessárias para a ligação ao HA. Os membros do subgrupo do Tipo B de HABPs, para utilização nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a CD44 e LYVE-l1, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas.
ài. CD44
[0250] Uma HABP do subgrupo do Tipo B fornecida para uso nos métodos aqui descritos é CD44, domínios de ligação ao HA de CD44, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA.
CD44 é uma glicoproteína de transmembrana do Tipo I de 80 a 250 kDa que se liga ao hialuronan e uma variedade de ligantes extracelulares e da superfície das células.
CD44 tem diversas funções e está envolvida na ligação, e modificações da matriz extracelular e mediação da migração dos linfócitos durante a inflamação.
A capacidade de CD44 para interagir com HA é regulada por fatores, incluindo o agrupamento de receptores e alterações na glicosilação do domínio extracelular.
CD existe em numerosas isoformas devidas a splicing alternativo de 10 exons variantes, os quais contêm o domínio de ligação ao hialuronan, contendo o módulo de ligação.
Uma sequência de comprimento total de CD44 exemplar está descrita na SEQ ID NO: 227. O domínio de ligação ao hialuronan de CD44 é cerca de 160 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 341) e contém o módulo de ligação flanqueado por extensões N- e C- terminais ligadas por uma ligação de dissulfeto (Cys9 e Cysl110 do domínio de ligação CD44 HA apresentado na SEQ ID NO: 341). Arg4l e Arg/78 são críticos para a ligação de HA (que corresponde aos aminoácidos Arg22 e Arg59 do domínio de ligação a CD44 HA estabelecido na SEQ ID NO: 341) e Tyr42 e Tyr79 (correspondente aos aminoácidos Tyr23 e Tyr60 do domínio de ligação CD44 HA estabelecido na SEQ ID NO: 341) são essenciais para a atividade funcional de CD44. O domínio de ligação CD44 é estabelecido na SEQ ID NO: 375. Assim, fornecidos para uso nos métodos aqui descritos, são fragmentos de CD44 que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de CD44 que contém um domínio de ligação, e os domínios N- e C-terminal que flanqueiam, ou uma porção suficiente dos mesmos, para efetuar a ligação ao HA.
[0251] são também aqui proporcionadas, para utilização nos métodos fornecidos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de CD44 para uso nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO: 259), de rato (SEQ ID NO: 260), bovina (SEQ ID NO: 261), cão (SEQ ID NO: 262), cavalo (SEQ ID NO: 263), hamster (SEQ ID NO: 264), babuíno (SEQ ID NO: 265) e hamster dourado (SEQ ID NO: 266). As variantes de CD44, ou fragmentos de ligação de HA aceitáveis, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos, e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de CD44 que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de CD44 ao HA, aumento da especificidade de CD44 para HA, e/ou aumento da solubilidade de CD44.
ii. LYVE-l
[0252] É aqui fornecida para uso nos métodos aqui descritos uma HABP do subgrupo de tipo B, que é LYVE-1, domínios de ligação ao HA de LYVE-l, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. Receptor hialuronan (HA) endotelial de vaso linfático (LYVE-l, também chamado CRSBP- 1, HAR, e XLKDl; SEQ ID NO: 228) é um tipo de glicoproteína de transmembrana de 60-kDa que é expresso tanto nas superfícies do lúmen e ablumenal do endotélio linfático, como também no endotélio sinusoidal arterial hepático. LYVE-l1 participa na internalização do HA para degradação e transporte do HA, a partir de tecidos para o lúmen dos vasos linfáticos. A localização do HA direcionada à Lyve-l para as superfícies linfáticas, também afeta os aspectos das “metástases tumorais ou de resposta do sistema imunológico. O módulo de ligação de LYVE-1l está localizado nos aminoácidos 40-129 da SEQ ID NO: 228 e é descrito na SEQ ID NO: 376. Assim, fornecidos para uso nos métodos aqui descritos, são fragmentos de LYVE-l1 que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de LYVE-1 que contém um domínio de ligação, e os domínios N- e C-terminal que flanqueiam, ou uma porção sua suficiente para efetuar a ligação ao HA.
[0253] são também aqui proporcionadas para utilização nos métodos fornecidos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de LYVE-l incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO: 267) e bovino (SEQ ID NO: 268). Variantes de LYVE-l, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade LYVE-l que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de LYVE-1 ao HA, aumentam a especificidade de LYVE -1 para HA, e/ou aumentam a solubilidade de LYVE-1.
c. Tipo C: Subgrupo de Proteína de ligação
[0254] Aqui proporcionadas para utilização como um reagente de diagnóstico de acompanhamento nos métodos aqui descritos são HABPs que são membros do subgrupo tipo C, possuindo um domínio de ligação ao HA que contém um domínio de imunoglobulina (Ig), que pode mediar a ligação entre a proteína de ligação e outras proteínas de ligação ao HA do tipo C, e dois módulos de ligação, ambos os quais são necessários para a ligação ao HA. O domínio Ig e dois módulos de ligação coletivamente compõem o domínio Gl de HABPs do Tipo C. Os membros do subgrupo do tipo C das HABPs, para utilização nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitados a HAPLNl/proteína de ligação, HAPLN2, HAPLN3, HAPLNA4, aggrecan, versican, brevican, neurocan, e phosphacan, ou fragmentos de ligação ao HA dos mesmos.
i. HAPLN/Família de proteína de Ligação
[0255] A família de proteína de ligação ao hialuronan e proteoglican (HAPLN) é composta por quatro proteoglicanos secretados que se ligam ao HA, e contêm um domínio C2 do tipo Ig e dois domínios de ligação.
(1) HAPLNI
[0256] Uma HABP do subgrupo do tipo C aqui fornecida para uso nos métodos é HAPLNlI, os domínios de ligação ao HA de HAPLNI, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. A Proteína 1 de ligação ao hialuronan e proteoglican (HAPLN1, também chamada de proteína de ligação e CRTL1; SEQ ID NO: 229) contribui para a estabilidade e flexibilidade da matriz extracelular, através de interações de estabilização de HA com proteoglicanos de sulfato de condroitina. HALPN1 contém dois módulos de ligação (aminoácidos 159-253 e aminoácidos 260-350 da SEQ ID NO: 229) que se ligam ao HA e um módulo de Ig (aminoácidos 53- 160 da SEQ ID NO: 229) que se liga ao módulo Ig do domínio Gl de aggrecan. HAPLNl] estabiliza associações de HA com aggrecan, formando um complexo ternário, contendo “um esqueleto linear HA com aggrecan e HAPLN 1 perpendicularmente ligadas. Aggrecan e HAPLN1] se posicionam paralelamente uma a outra, enquanto o HA corre entre os dois módulos de ligação HAPLN1 e os dois módulos de ligação aggrecan. O complexo cria uma substância gelatinosa com resistência à deformação. HAPLNI também estabiliza a interação de HA com outros proteoglicanos de sulfato de condroitina, como versican, neurocan, e brevican, que também possuem domínios Gl contendo um módulo Ig e dois módulos de ligação, semelhantes ao aggrecan.
[0257] O domínio Gl de HAPLN1] contém o domínio de Ig e os dois módulos de ligação. O domínio Ig do domínio G1 de HAPLN]1 está localizado nos aminoácidos 53-160 da SEQ ID NO: 229. Os módulos de ligação do domínio Gl de HAPLNI estão localizados nos aminoácidos 159-253 e 259-350 de SEQ ID NO: 229 e são apresentados nas SEQ ID NOS: 377 e 378. Assim, são proporcionados para utilização nos métodos aqui descritos, fragmentos de HAPLN1I] que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de HAPLN1 que contém o domínio Gl, ou uma porção sua suficiente para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, fornecido para uso nos métodos aqui descritos, é um fragmento de ligação ao HA de HAPLNI que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação.
[0258] Normalmente, para uso como um diagnóstico para a detecção de HA, HAPLN 1 é fornecida em combinação com outra proteína de ligação ao HA que contenha a região de ligação ao HA, tais como, por exemplo, o domínio Gl de uma outra HABP do tipo C, tal como aggrecan, versican, brevican, neurocan ou phosphacan.
[0259] É também aqui proporcionada para utilização nos métodos fornecidos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA.
[0260] Espécies variantes de HAPLN1] incluem, mas não estão limitadas a bovinos (SEQ ID NO: 269 e 273),
camundongo (SEQ ID NO: 270), rato (SEQ ID NO: 271), frango (SEQ ID NO: 272), cavalo (SEQ ID NO: 274) e porco (SEQ ID NO: 275). Variantes de HAPLN1, ou fragmentos de ligação ao HA da mesma, para uso nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos, e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de HAPLN 1 que não contenha a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de HAPLN] para HA, aumentam a especificidade de HAPLN1 para HA, e/ou aumentam a solubilidade de HAPLN1.
(2) HAPLN2
[0261] Aqui fornecida para uso nos métodos aqui descritos é uma HABP do subgrupo do tipo C que é HAPLN2, domínios de ligação ao HA de HAPLN2, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. A proteína 2 de ligação ao Hialuronan e proteoglicano (HAPLN2; SEQ ID NO: 230), também conhecida como proteína 1 de ligação ao cérebro, é predominantemente expressa no cérebro. O domínio Gl de HAPLN2 contém o domínio Ig e os dois módulos de ligação. O domínio Ig do domínio Gl de HAPLN2 está localizado nos aminoácidos 49-149 da SEQ ID NO: 230. Os módulos de ligação do domínio Gl de HAPLN2 estão localizados nos aminoácidos 148-241 e 247-337 de SEQ ID NO: 230 e são apresentados nas SEQ ID NOS: 379 e 380.
[0262] Assim, fornecidos para uso nos métodos aqui descritos, são fragmentos de HAPLN2 que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de HAPLN2 que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, é fornecido para uso nos métodos aqui descritos, um fragmento de ligação ao HA de HAPLN2 que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação. Normalmente, para uso como um diagnóstico para a detecção de HA, HAPLN2 é fornecido em combinação com outra proteína de ligação ao HA que contém a região de ligação do ao HA, tais como, por exemplo, o domínio Gl de uma outra HABP do tipo C, tal como aggrecan, versican, brevican, neurocan ou phosphacan.
[0263] são também aqui proporcionadas para utilização nos métodos fornecidos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de HAPLN2 incluem, mas não estão limitadas a, camundongo (SEQ ID NO: 276), rato (SEQ ID NO:277) e bovino (SEQ ID NO: 278). Variantes de HAPLN2, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para uso nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de HAPLN2 que não contenha a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de HAPLN2 para HA, aumentam a especificidade de HAPLNI para HA, e/ou aumentam a solubilidade de HAPLN2.
(3) HAPLN3
[0264] Uma HABP do subgrupo de tipo C fornecida para uso nos métodos aqui descritos é HAPLN3, domínios de ligação ao HA de HAPLN3, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. Proteína 3 de ligação ao hialuronan e proteoglicano, (HAPLN3; SEQ ID NO: 231), funções na ligação de ácido hialuronan e adesão celular. HAPLN3 é regulada no câncer de mama e, portanto, pode estar relacionada ao desenvolvimento de câncer e metástase. O domínio Gl contém o domínio Ig e os dois módulos de ligação. O domínio Ig do domínio Gl de HAPLN3 está localizado nos aminoácidos 62-167 da SEQ ID NO: 231. Os módulos de ligação do domínio G1 de HAPLN3 estão localizados nos aminoácidos 166-260 e 266-357 de SEQ ID NO: 231, e são apresentados na SEQ ID NOS: 381 e
382.
[0265] Assim, são fornecidos para uso nos métodos aqui descritos, fragmentos de HAPLN3 que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de HAPLN3 que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo, para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, é fornecido para uso nos métodos aqui descritos, um fragmento de ligação ao HA de HAPLN3 que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação. Normalmente, para uso como um diagnóstico para a detecção de HA, HAPLN3 é fornecida em combinação com outra proteína de ligação ao HA que contém a região de ligação ao HA, tais como, por exemplo, o domínio Gl de uma outra HABP do Tipo C, tal como aggrecan, versican, brevican, neurocan ou phosphacan.
[0266] São também fornecidas para uso nos métodos aqui descritos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de HAPLN3 incluem, mas não estão limitadas a, camundongo (SEQ ID NO: 279), rato (SEQ ID NO: 280) e bovina (SEQ ID NO: 281). Variantes de HAPLN3, ou fragmentos de ligação ao HA da mesma, para uso nos métodos proporcionados incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade HAPLN3 que não contenha a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de HAPLN3 para o HA, aumentam a especificidade de HAPLN3 para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de HAPLN3.
(4) HAPLN4
[0267] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma HABP do subgrupo de Tipo C, que é HAPLNA4, domínios de ligação ao HA de HAPLN4, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. A proteína 4 de ligação ao hialuronan e proteoglicano, (HAPLN4; SEQ ID NO:232), também conhecida como proteína 2 de ligação do cérebro, é predominantemente expressa no cérebro. HAPLN4 participa no desenvolvimento da matriz perineuronal. HAPLN4 humana e de camundongo compartilham 91% de identidade de sequência de aminoácidos. O domínio Gl de HAPLN4 contém o domínio Ig e os dois módulos de ligação. O domínio Ig do domínio Gl de HAPLN4 está localizado nos aminoácidos 60-164 da SEQ ID NO:
232. Os módulos de ligação do domínio Gl de HAPLN4 estão localizados nos aminoácidos 163-267 e 273-364 de SEQ ID NO: 232, e são apresentados nas SEQ ID NOS: 383 e 384.
[0268] Assim, são fornecidos para uso nos métodos aqui descritos, fragmentos de HAPLN4 que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de HAPLN4 que contém o domínio Gl ou uma porção sua suficiente, para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, é fornecido para uso nos métodos aqui descritos, um fragmento de ligação ao HA de HAPLN4 que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação. Normalmente, para uso como um diagnóstico para a detecção de HA, HAPLN4 é fornecida em combinação com outra proteína de ligação ao HA que contém a região de ligação do HA, tal como, por exemplo, o domínio Gl de uma outra HABP do tipo C, tal como aggrecan, versican, brevican, neurocan ou phosphacan.
[0269] São também proporcionadas para utilização nos métodos aqui fornecidos, variantes de HAPLN4, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de HAPLN4 incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO:282), bovina (SEQ ID NO: 283) e rato (SEQ ID NO: 284). Variantes de HAPLN4, ou fragmentos de ligação ao HA da mesma, para uso nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos, e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade HAPLN4 que não contenha a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de HAPLN4 para o HA, aumentam a especificidade de HAPLNA4 para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de HAPLNA4.
(5) Aggrecan
[0270] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos uma HABP do subgrupo de Tipo C que é aggrecan, os domínios de ligação de HA de aggrecan, ou porções da mesma suficiente para se ligar ao HA. Aggrecan (SEQ ID NO: 233) pertence à família de proteoglicanos de sulfato de condroitina (CS), que também inclui versican, brevican, neurocan, e phosphacan. Cada molécula de aggrecan contém aproximadamente 100 e 30 cadeias laterais de sulfato de ceratano e glicosaminoglicanos (GAG), respectivamente. Agrecam se associa de forma não covalente com hialuronan através dos módulos de ligação e um domínio Ig na sua extremidade N-terminal. É o mais abundante de proteoglicanos na cartilagem, e contribui para a capacidade de suporte de carga deste tecido.
[0271] O domínio Gl de aggrecan está localizado nos aminoácidos 45-352 da SEQ ID NO: 233. O domínio Ig do domínio Gl de aggrecan está localizado nos aminoácidos 45- 154 da SEQ ID NO: 233 e é descrito na SEQ ID NO: 423. Os módulos de ligação do domínio Gl de aggrecan estão localizados nos aminoácidos 153-247 e 254-349 da SEQ ID NO: 233, e são apresentados nas SEQ ID NOS: 385 e 386. Os módulos de ligação 3 e 4 são apresentados na SEQ ID NOS: 387 e 388. Deste modo, são proporcionados para utilização nos métodos aqui descritos, fragmentos de aggrecan que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de aggrecan que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo, para efetuar a ligação ao HA.
[0272] são também aqui proporcionadas para utilização nos métodos fornecidos, variantes de aggrecan, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de aggrecan incluem, mas não estão limitadas as de porco (SEQ ID NO: 285), frango (SEQ ID NO: 286), camundongo (SEQ ID NO: 287), bovino (SEQ ID NO: 288), cão (SEQ ID NO: 289), rato (SEQ ID NO: 290) e de coelho (SEQ ID NO:291). Variantes de aggrecan, ou fragmentos de ligação ao HA da mesma, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de aggrecan que contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de aggrecan para o HA, aumentam a especificidade de aggrecan para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de aggrecan.
(6) Brevican
[0273] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma HABP do subgrupo de Tipo C que é brevican, domínios de ligação de HA de brevican, ou porções da mesma, suficiente para se ligar ao HA. Brevican (SEQ ID NO: 234) é um membro da família de proteoglicanos aggrecan/ versican de 160 kDa de proteínas de matriz. É derivado do cérebro e serve como um elemento de ligação entre hialuronan e outras moléculas da matriz, tais como as tenacinas e fibulinas. O domínio Gl de brevican está localizado nos aminoácidos 51- 356 da SEQ ID NO: 234, e é descrito na SEQ ID NO: 424. O domínio Ig do domínio Gl de brevican está localizado nos aminoácidos 51-158 da SEQ ID NO: 234. Os módulos de ligação do domínio de Gl de brevican estão localizadas nos aminoácidos 157-251 e 258-353 de SEQ ID NO: 234, e são apresentados nas SEQ ID NOS: 389 e 390. Deste modo, são proporcionados para utilização nos métodos aqui descritos, fragmentos de brevican que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de brevican que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo para efetuar a ligação a HA. Por exemplo, é fornecido para uso nos métodos aqui descritos, um fragmento de ligação ao HA de brevican, que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação.
[0274] São também proporcionadas para utilização nos métodos aqui fornecidos, variantes de brevican, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácidos, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de brevican incluem, mas não estão limitadas a rato (SEQ ID NO: 292), camundongo (SEQ ID NO: 293), bovino (SEQ ID NO: 294) e de gato (SEQ ID NO: 295). As variantes de brevican, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos, e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de brevican que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de brevican para o HA, aumentam a especificidade de brevican para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de brevican.
(7) Versican
[0275] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma uma HABP do subgrupo de Tipo C que é versican, domínios de ligação ao HA de versican, ou porções dos mesmos, suficiente para se ligar ao HA. Versican (SEQ ID NO: 235) é um grande proteoglicano da matriz extracelular, que está presente em uma variedade de tecidos. Desempenha papéis estruturais importantes, formando matrizes hidratadas soltas, durante o desenvolvimento e doença. Também interage diretamente ou indiretamente com as células, para regular esses processos fisiológicos, como a adesão, a sobrevivência, a proliferação, e a motilidade de células. O domínio Gl de versican está localizado nos aminoácidos 38-349 da SEQ ID NO: 235 e é descrito na SEQ ID NO: 425. O domínio Ig do domínio Gl de versican está localizado nos aminoácidos 38- 151 da SEQ ID NO: 235. Os módulos de ligação do domínio Gl de versican estão localizados nos aminoácidos 150-244 e 251-346 da SEQ ID NO: 235, e são apresentados nas SEQ ID NOS: 391 e 392. Assim, são proporcionados para utilização nos métodos aqui descritos, fragmentos de versican que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de versican que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo, para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, é fornecido para uso nos métodos aqui descritos, um fragmento de ligação ao HA de versican que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação.
[0276] Também proporcionadas para utilização nos métodos aqui fornecidos, são variantes de versican, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido,
desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de versican incluem, mas não estão limitadas a, camundongo (SEQ ID NO: 296), rato (SEQ ID NO: 297), macaco rabo-de-porco (SEQ ID NO: 298), bovina (SEQ ID NO: 299) e de frango (SEQ ID NO: 300). Variantes de versican, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de versican que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de versican ao HA, aumentam a especificidade de versican para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de versican.
(8) Neurocan
[0277] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma HABP do subgrupo do Tipo C que é neurocan, domínios de ligação ao HA de neurocan, ou porções dos mesmos, suficiente para se ligar ao HA. Neurocan, também conhecida como CSPG3 e 1Dl (SEQ ID NO: 236), é um proteoglicano de sulfato de condroitina segregado, que é principalmente expresso no sistema nervoso central. Neurocan humana está prevista para ser clivada seguida a Met635, resultando em fragmentos N-terminal (Neurocan-130) e C-terminal (Neurocan-C). Neurocan e Neurocan-C são produzidas pelos astrócitos e se acumulam na matriz envolvendo os feixes de axônios, e corpos celulares neuronais. Neurocan-130 encontra-se principalmente no citoplasma das células da glia. Neurocan inibe adesão neuronal e crescimento de neuritos através de interações com uma variedade de matrizes e moléculas de transmembrana. O domínio Gl de neurocan está localizado nos aminoácidos 53-359 da SEQ ID NO: 236 e é descrito na SEQ ID NO: 426. O domínio Ig do domínio Gl de neurocan está localizado nos aminoácidos 53-161 da SEQ ID NO: 236. Os módulos de ligação do domínio Gl de neurocan estão localizados nos aminoácidos 160-254 e 261-356 de SEQ ID NO: 236, e são apresentados nas SEQ ID NOS: 393 e 394. Deste modo, proporcionados para utilização nos métodos aqui descritos, são fragmentos de neurocan que retêm a capacidade de se ligar ao HA, por exemplo, um fragmento de neurocan que contém o domínio Gl ou uma porção suficiente do mesmo, para efetuar a ligação ao HA. Por exemplo, fornecido para uso nos métodos aqui descritos, é um fragmento de ligação ao HA de neurocan que contém, pelo menos, os dois módulos de ligação.
[0278] Também aqui proporcionadas para utilização nos métodos fornecidos são variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de neurocan incluem, mas não estão limitadas a, camundongo (SEQ ID NO: 301), rato (SEQ ID NO: 302) e de chimpanzé (SEQ ID NO: 303). Variantes de neurocan, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de neurocan que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação ao HA de neurocan, aumentam a especificidade de neurocan para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de neurocan.
(9) Phosphacan
[0279] É proporcionada para utilização no método aqui fornecido, uma HABP do subgrupo de Tipo C que é phosphacan, domínios de ligação ao HA de phosphacan, Ou partes suas suficientes, para ligar ao HA. Phosphacan (SEQ ID NO: 340), um proteoglicano de sulfato de condroitina isolado a partir de cérebro de rato, que se liga aos neurônios e moléculas de adesão celular neural, e modula interações celulares, e outros processos de desenvolvimento do tecido nervoso através de ligação heterofílica à superfície da célula e moléculas da matriz extracelular, e por competição com ligantes da fosfatase da transmembrana. Phosphacan tem 76% de identidade com a porção extracelular de uma proteína tirosina fosfatase de receptor humana (RPTP zeta/beta) e representam uma variante de splicing de mRNA da maior proteína de transmembrana.
[0280] São também fornecidas para uso nos métodos aqui descritos, variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de phosphacan incluem, mas não estão limitadas a phosphacan de rato (SEQ ID NO: 237). Variantes de phosphacan, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de phosphacan que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de phosphacan para o HA, aumentam a especificidade de phosphacan para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de phosphacan.
2. Proteínas de Ligação ao HA sem módulos de ligação
[0281] Em alguns exemplos, proporcionadas para utilização nos métodos aqui descritos, são proteínas de ligação ao HA que não contêm módulos de ligação. Proteínas de ligação ao HA sem módulos de ligação para utilização nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a, HABP1/CIQBP, lailina, RHAMM, IaI, CDC37, PHBP, SPACR, SPACRCAN, CD38, IHABP4 e PEP-l, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas.
a. HABP1/C1QBP
[0282] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma proteína 1 de ligação ao hialuronan, domínios de ligação de HABPl ou suas porções suficientes, para se ligar ao HA. A proteína 1 de ligação ao hialuronan (HABP1; SEQ ID NO: 240), também conhecida como C1IqBP/C1aR e p32, é uma glicoproteína ácida ubíqua que funciona na espermatogênese, e como um receptor para as moléculas pró- inflamatórias. HABPl se liga ao hialuronan extracelular, vitronectina, componente do complemento cla, HMW cininogênio, e proteínas bacterianas e virais. HABP1l intracelular liga-se a moléculas que contêm o domínio globular Claq, múltiplas isoformas de PKC, HRK mitocondrial, receptores adrenérgicos e GABA-A, o mRNA de fator de splicing ASF/SF2, e o fator de transcrição CBF.
[0283] Também fornecidas para uso nos métodos aqui descrito são variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie e outras variantes, que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Variantes de HABP1, ou fragmentos de ligação ao HA dos mesmos, para uso nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de HABP1l que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de HABPl para o HA, aumentam a especificidade de HABPl para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de HABP1.
b. lailina
[0284] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma lailina, domínios de ligação ao HA de lailina, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. Lailina (SEQ ID NOS: 238 e 239) é a proteína transmembrana com homologia para lecitinas do tipo C, e é nomeada após o aminoácido seis L-A-Y-I-L-I, em seu segmento de transmembrana. Lailina se liga especificamente ao hialuronan e é encontrada na matriz extracelular da maior parte dos tecidos animais e nos fluidos corporais. E, portanto, são capazes de modular o comportamento celular e funções durante a remodelação de tecidos, o desenvolvimento, a homeostase e doenças.
[0285] Também fornecidas para uso nos métodos aqui descritos são variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de lailina incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO: 304), de hamster chinês (SEQ ID NO: 305) e de rato (SEQ ID NO: 306). Variantes de lailina, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para utilização nos métodos proporcionados, incluem variantes que possuem uma modificação de aminoácido, e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de lailina que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de lailina ao HA, aumentam a especificidade de lailina para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de lailina.
c. RHAMM
[0286] É fornecida para uso nos métodos aqui descritos, uma RHAMM, domínios de RHAMM, ou suas porções suficientes para se ligar ao HA. O receptor para a motilidade mediada por HA (RHAMM, SEQ ID NO: 242) é uma proteína associada à membrana, cujo tamanho varia entre - 59 a 80 kDa. RHAMM é expressa na maioria dos tipos de células e funções para mediar a adesão e a motilidade celular, em resposta à ligação ao HA. São também aqui fornecidas para uso nos métodos aqui descritos variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie, e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA. Espécies variantes de RHAMM incluem, mas não estão limitadas a camundongo (SEQ ID NO: 307) e rato (SEQ ID NO: 308). Variantes de RHAMM, ou fragmentos de ligação ao HA das mesmas, para uso nos métodos proporcionados incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de RHAMM que não contém a modificação. Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de RHAMM para o HA, aumentam a especificidade de RHAMM para o HA, e/ou aumentam a solubilidade de HABP1.
d. outras
[0287] Outras HABPs que se ligam ao HA, algumas das quais contêm domínios de ligação ao hialuronan que podem ser utilizadas nos métodos aqui proporcionados incluem, mas não estão limitadas a, TIoaI (SEQ ID NOS:243- 245), CDC37 (SEQ ID NO:250), PHBP (SEQ ID NO:251), SPACR (SEQ ID NO:246), SPACERCAN (SEQ ID NO:247), CD38 (SEQ ID NO:248), IHABP4 (SEQ ID NO:249) e PEP-l1 (SEQ ID NO:241), ou domínios de ligação ao HA, ou partes dos mesmos suficientes para se ligar ao HA.
São também aqui fornecidas para uso nos métodos aqui descritos variantes, incluindo variantes alélicas, variantes de espécie e outras variantes que contêm uma modificação de aminoácido, desde que as variantes conservem a sua capacidade de se ligar ao HA.
Espécies variantes incluem, mas não estão limitadas a, Ial de camungongo (SEQ ID NOS:309-311) e bovino (SEQ ID NOS:312-314), CDC37 de levedura de panificação (SEQ ID NO:326), mosca de fruta (SEQ ID NO:327), rato (SEQ ID NO:328), camundongo (SEQ ID NO:329), levedura de fissão (SEQ ID NO:330), mosca de fruta (SEQ ID NO:331), frango (SEQ ID NO:332), bovino (SEQ ID NO: 333), Candida albicans (SEQ ID NO:334). (CC. elegans (SEQ ID NO:335) e baiacu verde (SEQ ID NO:336), SPACR de frango (SEQ ID NO:315) e camundongo (SEQ ID NO:316), SPACRCAN de camundongo (SEQ ID NO:317), rato (SEQ ID NO:318) e frango (SEQ ID NO:319), CD38 de camundongo (SEQ ID NO:320), rato (SEQ ID NO:321) e coelho (SEQ ID NO:322), IHABP4 de camundongo (SEQ ID NO:324) e frango (SEQ ID NO:325), e PHBP de camundongo (SEQ ID NO:337), rato (SEQ ID NO:338) e bovino (SEQ ID NO:339). Variantes de HABPs, ou fragmentos de ligação ao HA da mesma, para uso nos métodos proporcionados incluem variantes que possuem uma alteração de aminoácidos e que exibem uma alteração, tal como uma melhoria, em relação a uma atividade de HABP que não contém a modificação.
Estas variantes incluem aquelas que contêm as modificações de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação de uma HABP para HA, aumentam a especificidade de uma HABP para HA, e/ou aumentam a solubilidade de uma HABP, tal como um Ial, Cdc37, PHBP, SPACR, SPACRCAN, CD38, IHABP4 e PEP-1 ou seus fragmentos de ligação ao HA.
3. Modificações de Proteínas de Ligação ao HA
[0288] HABPs modificadas são fornecidas aqui para melhorar uma ou mais propriedades de HABPs para utilização nos métodos aqui fornecidos. Tais propriedades incluem modificações que aumentam a expressão de proteínas em sistemas de expressão de mamífero, melhoram as propriedades biofísicas, tais como a estabilidade e a solubilidade, melhoram a purificação de proteínas e detecção e/ou aumento de afinidade para o HA, via dimerização da proteína de fusão.
a. Multímeros de HABP
[0289] HABPs previstas para utilização nos métodos aqui descritos podem ser ligadas direta Ou indiretamente a um domínio de multimerização. A presença de um domínio de multimerização pode gerar multímeros dos domínios de ligação ao HA das HABPs, ou mesmo para aumentar os locais de ligação ao HA de uma molécula. Isto pode resultar em um aumento da afinidade da HABP para HA. Por exemplo, a afinidade de um multímero de HABP pode ser aumentada em 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais, em comparação com um polipeptídeo de HABP que não contém um domínio de multimerização. A afinidade de um multímero de HABP para HA, quando representada como a constante de dissociação (Kd), é em geral, pelo menos, menos do que ou menor do que ou 1x10 º M to 1x10*º M, tal como, pelo menos, menos do que, ou menos que, Ou 9x10 ºM, 8x10 ºM, 7x10 M, 6x10 ºM, 5x10 M, 4x10 M, 3x10ºM, 2x10ºM, 1x10ºM, 9x10ºM, 8x10*ºM, TxX10 *º M, 6x10 ºº M, 5x10 ºM, 4x10ººM, 3x10 ºM, 2x10ººM, 1x10 *º M ou Kd inferior.
[0290] São aqui proporcionados multímeros que incluem um domínio de ligação ao HA ou porção suficiente do mesmo, para ligar ao HA de uma primeira HABP e um domínio de ligação ao HA ou porção suficiente da mesma, para ligar o HA de uma segunda HABP, em que oO primeiro e segundo domínio de ligação ao HA estão ligados diretamente ou indiretamente por meio de um ligante a um domínio de multimerização. O primeiro e segundo domínios de ligação ao HA podem ser da mesma HABP ou de uma HABP diferente. Por exemplo, se o domínio de ligação ao HA é o mesmo, então homodímeros ou homotrímeros podem ser gerados. Se o domínio de ligação ao HA é diferente, heterodímeros ou heterotrímeros podem ser gerados. Por exemplo, os domínios de ligação ao HA, tais como um domínio de ligação Ou O módulo, de HABPs, pode ser covalentemente ligado, não covalentemente ligado, ou quimicamente ligado, para formar multímeros de dois ou mais domínios de ligação ao HA. Os módulos de ligação podem ser ligados para formar dímeros, trímeros ou multímeros superiores. Em alguns casos, os multímeros podem ser formados por dimerização de dois ou mais polipeptídeos de de HABP, em que cada um contém um domínio de ligação ao HA.
[0291] Qualquer parte de uma HABP, incluindo um domínio de ligação ao HA, pode ser utilizada como um parceiro de multímero. Por exemplo, qualquer uma das HABPs descritas acima, ou as apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOS:206-207, 222-340, 407-414 ou qualquer porção de uma HABP, incluindo um domínio de ligação ao HA, por exemplo, um domínio de ligação ou módulo e as suas variantes, incluindo os domínios de ligação ao HA estabelecidos em qualquer uma das SEQ ID NOS : 341 e 371-394 podem ser usados, para gerar polipeptídeos de HABP quiméricos, em que todo ou parte do polipeptídeo HABP está ligado a um domínio de multimerização. Normalmente, pelo menos uma, mas, por vezes, as duas porções HABP são totalmente ou uma parte de uma HABP suficiente para ligar ao HA ligado a um domínio de multimerização. Exemplos de HABPs, ou porções das mesmas, para uso como parceiros de multimerização são aqui descritos acima e são apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOS: 206-207, 222-341, 371-394, 407-414, 416-418 ou 423 -426. Em alguns exemplos, pelo menos um dos parceiros de multímeros é toda ou parte da HABP incluindo o domínio de ligação ao HA. Um exemplo de polipeptídeo de HABP multimérico é um multímero formado entre o domínio de ligação ao HA (por exemplo, domínio de ligação ou módulo de ligação), ou parte dele, de aggrecan, versican, neurocan, brevican, phosphacan, HAPLN1, HAPLN2, HAPLN3, HAPLN4 Stabilin-1, Stabilin-2, CAB61358, KIAAON5S27 ou proteína TSG-
6. Além disso, um polipeptídeo de HABP quimérico para uso na formação de um multímero de HABP pode incluir polipeptídeos de HABP híbridos ligados a um domínio de multimerização. Exemplos de um multímero aqui fornecido é um multímero, tal como um homodímero, gerado por multimerização do módulo de ligação (LM) da TSG-6 ou porção suficiente do mesmo, que se liga ao HA.
[0292] A multimerização entre dois polipeptídeos de HABP pode ser espontânea, ou pode ocorrer devido à ligação forçada de dois ou mais polipeptídeos. Em um exemplo, multímeros podem ser ligados por pontes de dissulfeto formadas entre resíduos de cisteína em diferentes polipeptídeos de HABP ou domínio, ou porções suficientes dos mesmos, que se ligam ao HA. Em outro exemplo, os multímeros podem incluir um polipeptídeo HABP ou domínio, ou parte suficiente do mesmo para se ligar ao HA, unidos através de interações covalentes ou não- covalentes a porções de peptídeos fundidas para cada polipeptídeo. Tais peptídeos podem ser ligantes peptídicos (espaçadores) ou por exemplo, peptídeos que tenham a propriedade de promover multimerização. Em um exemplo adicional, os multímeros podem ser formados entre dois polipeptídeos através de ligação química, como por exemplo, utilizando ligantes heterobifuncionais.
i. Ligantes de peptídeos
[0293] Os ligantes de peptídeo podem ser usados para produzir multímeros polipeptídicos de HABP, tais como, por exemplo, um multímero em que pelo menos um parceiro de multimerização contenha um domínio de ligação ao HA (por exemplo, um domínio ou módulo de ligação). Em um exemplo, os ligantes de peptídeos podem ser fundidos com a extremidade C-terminal de um primeiro polipeptídeo e a extremidade N-terminal de um segundo polipeptídeo. Esta estrutura pode ser repetida múltiplas vezes, de tal modo que pelo menos um, de preferência dois, três, quatro, ou mais polipeptídeos sejam ligados um ao outro por meio de ligantes peptídicos, nos seus respectivos terminais. Por exemplo, um polipeptídeo multímero pode ter uma sequência de Z,-X-Z,, em que 2; e Z;, são, cada um deles, uma sequência de toda ou parte de uma HABP incluindo um domínio de ligação ao HA, e onde X é uma sequência de um peptídeo de ligação. Em alguns casos, 72,1 e/ou Z7 É a totalidade de uma HABP incluindo um domínio de ligação ao HA. Em outros casos, 2; e/ou Z, é parte de uma HABP incluindo um domínio de ligação ao HA. 72, e Z7, são O mesmo ou são diferentes. Em outro exemplo, o polipeptídeo tem uma sequência de 2Z;-X- Z2(-X-2), em que '"n" é um número inteiro, isto é, geralmente, 1 ou 2.
[0294] Normalmente, o ligante peptídico é de um comprimento suficiente para permitir que um ou ambos os domínios de ligação ao HA se liguem a um substrato de hialuroran, ou para permitir a interação entre os domínios de ligação de HA (por exemplo, interação de dois módulos Ig dos domínios de ligação de Gl ao de HABPs do Tipo C).
Exemplos de ligantes peptídicos incluem, mas não estão limitados a: -Gly-Gly-, GGGGG (SEQ ID NO:342), GGGGS ou (GGGGS)Nn (SEQ ID NO:343), SSSSG ou (SSSSG)N (SEQ ID NO:344), GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:345), GGSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 346), GSTSGSGKSSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 347) GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 348), EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO: 349), ou AlaAlaProAla ou (AlaAlaProAla)n (SEQ TD NO:350), em que n é 1 a 6, tal como 1, 2, 3, ou 4. Ligantes exemplificativos incluem: (1) Gly4Ser com extremidades NcolI (SEQ ID NO: 351)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GCCATGG (2) (Gly4Ser)2 com extremidades NcoI (SEQ ID NO: 352)
CCATGGGCGG CGGCGGCTCT GGCGGCGGCG GCTCTGCCAT GG (3) (Ser4Gly)4 com extremidades NcolI (SEQ ID NO: 353)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCTC
GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGGCGC CATGG (4) (Ser4Gly)2 com extremidades NcolI (SEQ ID NO: 354)
CCATGGCCTC GTCGTCGTCG GGCTCGTCGT CGTCGGECGC CATGG
[0295] Porções de ligação encontram-se descritas, por exemplo, em Huston et al. (1988) PNAS 85:5879-5883, Whitlow et al. (1993) Protein Engineering 6:989-995, e Newton et al., (1996) Biochemistry 35:545-553. Outros ligantes peptídicos adequados incluem qualquer um dos descritos na Patente dos EUA Nº 4751180 ou 4935233, que são aqui incorporadas por referência. Um polinucleotídeo que codifica um ligante peptídico desejado pode ser inserido entre, e no mesmo quadro de leitura, como um polinucleotídeo que codifica a totalidade ou parte de uma
HABP incluindo um domínio de ligação ao HA, utilizando qualquer técnica convencional adequada. Em um exemplo, um polipeptídeo de fusão tem de dois a quatro polipeptídeos HABP, incluindo um que é a totalidade ou parte de um polipeptídeo HABP, que inclui um domínio de ligação ao HA, separados por ligantes peptídicos.
ii. agentes de ligação Heterobifuncionais
[0296] A ligação de um polipeptídeo HABP a outro polipeptídeo HABP para criar um polipeptídeo de fusão heteromultimérico pode ser direta ou indireta. Por exemplo, a ligação de dois ou mais polipeptídeos HABP pode ser conseguida por ligação química ou facilitada por ligantes heterobifuncionais, tal como qualquer um conhecido na arte, ou aqui proporcionado.
[0297] Numerosos reagentes de ligação cruzada heterobifuncionais que são utilizados para formar ligações covalentes entre os grupos amina e os grupos tiol, e para introduzir grupos tiol em proteínas, são conhecidos pos peritos na arte (ver, por exemplo, the PIERCE CATALOG, ImmunoTechnology Catalog & Handbook, 1992-1993, que descreve a preparação, e a utilização de tais reagentes, e fornece uma fonte comercial de tais reagentes, ver, também, por exemplo, Cumber et al. (1992) Bioconjugate Chem. 3:397- 401; Thorpe et al. (1987) Cancer Res. 47:5924-5931; Gordon et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84:308-312; Walden et al. (1986) J. Mol. Cell. Immunol. 2:191-197; Carlsson et al. (1978) Biochem. J. 173: 7723-737; Mahan et al. (1987) Anal. Biochem. 162:163-170; Wawryznaczak et al. (1992) Br. J. Cancer 66:361-366; Fattom et al. (1992) Infection & Immun. 60:584-589). Estes reagentes podem ser utilizados para formar ligações covalentes entre a porção N-terminal de um polipeptídeo HABP, incluindo um domínio de ligação ao HA e a porção C-terminal do outro polipeptídeo HABP, incluindo um domínio de ligação ao HA, ou entre cada uma dessas porções e um ligante.
Estes reagentes incluem, mas não estão limitados a N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP; ligante de dissulfeto); sulfosuccinimidil 6-[3-(2- piridilditio)propionamida] hexanoato (sul fo-LC-SPDP); succinimidiloxicarbonil-a-metil benzil tiosulfato (SMBT, ligante dissulfato impedido); succinimidil 6-[3- (2- piridilditio) propionamida] hexanoato (LC-SPDP); sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil)ciclohexano-l1- carboxilato (sulfo-SMCC); succinimidil 3- (2-7 piridilditio)butirato (SPDB; ligante de ligação dissulfeto impedido); sulfosuccinimidil 2-(7-azida-4-metilcumarin-3- acetamida) etil-1,3'-ditiopropionato (SAED) ; sulfo- succinimidil 7T-azida-4-metilcoumarin-3-acetato (SAMCA) ; sulfosuccinimidil-6-[alfa-metil-alfa-(2- piridilditio)toluamida] -hexanoato (sulfo-LC-SMPT); 1,4-di- [3'-(2'-piridilditio)propionamida]butano (DPDPB) ; 4- succinimidiloxicarbonil-a-metil-a- (2-piridiltio)tolueno (SMPT, ligante dissulfato impedido); sulfosuccinimidil-6- [a-metil-a- (2-pirimildi-tio)toluamida]hexanoato (sul fo-LC- SMPT); m-maleimidabenzoil-N-hidroxi-succinimida éster (MBS); m-maleimidabenzoil-N-hidroxisulfo-succinimida éster (sulfo-MBS); N-succinimidil (4-iodoacetil)aminabenzoato (SIAB; ligante de tioeter); sulfosuccinimidil- (4- iodoacetil)amina benzoato (sulfo-SIAB); succinimidil-4-(p- maleimi-dofenil)butirato (SMPB) ; sulfosuccinimidil4- (p- maleimida-fenil)butirato (sul fo-SMPB); azidabenzoil hidrazida (ABH). Estes ligantes, por exemplo, podem ser utilizados em combinação com agentes de ligação de peptídeos, tais como aqueles que aumentam a flexibilidade ou a solubilidade, ou que fornecem para eliminar impedimento estérico.
Quaisquer outros ligantes conhecidos pelos peritos na arte, para a ligação de uma molécula a outra molécula de polipeptídeo, podem ser utilizados. As propriedades gerais são, de tal modo, que a molécula resultante se liga ao HA. Para diagnóstico in vivo o uso do reagente HABP, geralmente, o ligante deve ser biocompatível para a administração a animais, incluindo seres humanos.
iii. Domínios de Multimerização de polipeptídeo
[0298] A interação de dois ou mais polipeptídeos HABP pode ser facilitada pela sua ligação, quer direta quer indiretamente, para qualquer porção ou outro polipeptídeo que sejam, eles próprios, capazes de interagir para formar uma estrutura estável. Por exemplo, as cadeias de polipeptídeos codificados HABP separadas podem ser unidas por multimerização, em que a multimerização de polipeptídeos é mediada por um domínio de multimerização. Normalmente, o domínio de multimerização fornece a formação de uma interação proteína-proteína estável, entre um primeiro polipeptídeo HABP e um segundo polipeptídeo HABP. Polipeptídeos HABP incluemy por exemplo, uma ligação (diretamente ou indiretamente) de um ácido nucleico que codifica um domínio de ligação ao HA (por exemplo, um domínio ou módulo de ligação) de uma HABP com um ácido nucleico que codifica um domínio de multimerização. Normalmente, pelo menos um parceiro de multimerização é um ácido nucleico que codifica toda a parte de uma HABP incluindo um domínio de ligação ao HA, ligada diretamente ou indiretamente a um domínio de multimerização, formando assim uma molécula quimérica. Polipeptídeos homo ou heteromultiméricos podem ser gerados a partir de co- expressão de polipeptídeos de HABP separados. O primeiro e o segundo polipeptídeo de HABP pode ser o mesmo ou diferente.
[0299] Geralmente, um domínio de multimerização inclui qualquer um capaz de formar uma interação proteína- proteína estável. Os domínios de multimerização podem interagir através de uma sequência de imunoglobulina (por exemplo, domínio Fc; Ver, por exemplo, Patentes Internacionais Pub. nºs WO 93/10151 e WO 2005/ 063816; e nº 2006/ 0024298; No. 5457035 dos EUA), fecho de leucina (por exemplo, de proteínas de transformação nuclear, fos e jun ou o proto-oncogene c-myc, ou de controle geral de Nitrogênio (GCN4)), uma região hidrofóbica, uma região hidrofílica, ou tiol livre, que forma uma ponte de dissulfeto intermolecular entre as moléculas quiméricas de um homo- ou heteromultímero. Além disso, um domínio de multimerização pode incluir uma sequência de aminoácidos que compreende uma protuberância complementar a uma sequência de aminoácidos que compreende um orifício, tal como é descrito, por exemplo, na Patente dos EUA. No.
5.731.168; Pub. Patente Internacional Nos WO 98/50431 e WO 2005/ 063816; Ridgway et al. (1996) Protein Engineering, 9:617-621. Tal região de multimerização pode ser manipulada de tal forma, que as interações estéricas não só promovem a interação estável, mas continuam a promover a formação de heterodímeros sobre homodímeros de uma mistura de monômeros quiméricos. Geralmente, as protuberâncias são construídas através da substituição de cadeias laterais pequenas de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (p.ex., tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são opcionalmente criadas na interface do segundo polipeptídeo, substituindo cadeias laterais grandes de aminoácidos por menores (por exemplo, alanina ou treonina). Domínios de multimerização exemplificativos estão descritos a seguir.
[0300] UM polipeptídeo HABP, tal como, por exemplo, qualquer um aqui proporcionado, incluindo qualquer domínio de ligação ao HA (por exemplo, um domínio ou módulo de ligação) de uma HABP, podem ser unidos em qualquer lugar, mas normalmente através do seu N- ou C-terminal, para o N- ou C- terminal de um domínio de multimerização, para formar um polipeptídeo quimérico, a ligação pode ser direta ou indireta por meio de um ligante. Além disso, o polipeptídeo quimérico pode ser uma proteína de fusão, ou pode ser formado por ligação química, como por exemplo através de interações covalentes ou não-covalentes. Por exemplo, quando se prepara um polipeptídeo quimérico que contém um domínio de multimerização, oO ácido nucleico que codifica toda ou parte de uma HABP que inclui um domínio de ligação ao HA, pode ser operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica a sequência do domínio de multimerização, diretamente ou indiretamente, ou, opcionalmente, através de um domínio ligante. Normalmente, a construção codifica uma proteína quimérica em que o C- terminal do polipeptídeo HABP está unido ao n-terminal do domínio de multimerização. Em alguns casos, a construção pode codificar uma proteína quimérica em que o N-terminal do polipeptídeo HABP é unido à extremidade N- ou C-terminal do domínio de multimerização.
[0301] Um multímero polipeptídeo contém duas proteínas quiméricas criadas através da ligação, direta ou indiretamente, dois dos mesmos, ou de diferentes polipeptídeos de HABP diretamente ou indiretamente, a um domínio de multimerização. Em alguns exemplos, em que oO domínio de multimerização é um polipeptídeo, um gene de fusão que codifica o polipeptídeo quimérico do domínio multimerização HABP, é inserido em um vetor de expressão apropriado. As proteínas quiméricas do domínio de multimerização HABP resultantes podem ser expressas em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e deixadas para reunir em multímeros, nos quais os domínios de multimerização interagem para formar polipeptídeos multivalentes. A ligação química de domínios de multimerização para polipeptídeos HABP pode ser efetuada utilizando agentes de ligação heterobifuncionais, tal como discutido acima.
[0302] Os polipeptídeos quiméricos resultantes, e multímeros formados a partir deles, podem ser purificados por qualquer método adequado, tal como, por exemplo, por cromatografia de afinidade sobre as colunas de proteína A ou proteína G. Quando duas moléculas de ácido nucleico que codificam diferentes polipeptídeos quiméricos HABP são transformadas em células, a formação do homo- e heterodímeros irá ocorrer. Condições para a expressão podem ser ajustadas de modo que a formação de heterodímeros seja favorecida em relação a formação de homodímeros.
(1) Domínio Imunoglobulina
[0303] Domínios de multimerização incluem os que compreendem uma porção tiol livre capaz de reagir para formar uma ligação dissulfeto intermolecular, com um domínio de multimerização de uma sequência de aminoácidos adicional. Por exemplo, um domínio de multimerização pode incluir uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como, a partir de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD, IoM e IgE. Geralmente, tal porção é uma região constante de imunoglobulina (Fc). As preparações de proteínas de fusão contendo polipeptídeos fundidos com várias porções de polipeptídeos derivados de anticorpos (incluindo o domínio Fc) foram descritas, ver, por exemplo, Ashkenazi et al. (1991) PNAS 88: 10535; Byrn et al. (1990) Nature, 344:677; e Hollenbaugh and Aruffo, (1992) “Construction of
Immunoglobulin Fusion Proteins, “in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pp. 10.19.1-10.19.11.
[0304] os anticorpos ligam-se a antígenos específicos e contêm duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, covalentemente ligadas por ligações dissulfeto. Ambas as cadeias pesadas e leves possuem regiões variáveis que se ligam ao antígeno, e regiões constantes (c). Em cada cadeia, um domínio (V) possui uma sequência de aminoácidos variável, dependendo da especificidade do anticorpo da molécula. O outro domínio (C) tem uma sequência mais ou menos constante comum entre as moléculas da mesma classe. Os domínios são numerados sequencialmente a partir da extremidade amino-terminal. Por exemplo, a cadeia leve de IgG é composta por dois domínios de imunoglobulina com ligações de N- ao C-terminal, na ordem V,-Crn, referindo-se ao domínio variável da cadeia leve e domínio constante da cadeia leve, respectivamente. A cadeia pesada IgG é composta por quatro domínios de imunoglobulina ligados a partir do N- para o C- terminal da ordem de Vi Crl-Cr2-Cx3, referindo-se ao domínio pesado variável, contêm um domínio pesado constante 1, domínio pesado constante 2, e domínio pesado constante 3. A molécula de anticorpo resultante é uma molécula de quatro cadeias em que cada cadeia pesada está ligada a uma cadeia leve por uma ligação dissulfeto, e as duas cadeias pesadas estão ligadas uma à outra através de ligações dissulfeto. A ligação das cadeias pesadas é mediada por uma zona flexível da cadeia pesada, conhecida como uma região de articulação. Os fragmentos de moléculas de anticorpo podem ser gerados, tal como, por exemplo, através de clivagem enzimática. Por exemplo, após a clivagem por protease papaína, um dímero das regiões constantes da cadeia pesada, o domínio Fc, é clivado a partir das duas regiões Fab (isto é, as porções que contenham as regiões variáveis).
[0305] Nos seres humanos, existem cinco isotipos de anticorpos classificados com base nas suas cadeias pesadas designadas como delta (3), gama (y), mu (p), alfa e (a) e epsilon (c), dando origem às classes de anticorpos IgD, IgG, IgM, IgA e IgE, respectivamente. As classes IgA e IgG contêm as subclasses IgAl, IgA2, IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. As diferenças de sequência entre as cadeias pesadas de imunoglobulina ocasionam o fato dos vários isotipos diferirem em, por exemplo, número de domínios C, presença de uma região de articulação, e número e localização das pontes dissulfeto intercadeias. Por exemplo, as cadeias pesadas IgM e IgE contêm um domínio C adicional (C4), que substitui a região de articulação. As regiões Fc de IgG, IgD, IgA fazem par, uma com a outra, através dos seus domínios Cy3, Cô3, e Ca3i, ao passo que as regiões Fc de IgM e IgE dimerizam através dos seus domínios Cyp4 e C£e4. IgM e IgA formam estruturas multiméricas com dez e quatro locais de ligação ao antígeno, respectivamente.
[0306] Polipeptídeos quiméricos de imunoglobulina HABP aqui fornecidos incluem um polipeptídeo de imunoglobulina de comprimento total. Alternativamente, oO polipeptídeo de imunoglobulina é menor do que o comprimento completo, ou seja, contém uma cadeia pesada, cadeia leve, Fab, Fabo, Fv, ou Fc. Em um exemplo, os polipeptídeos quiméricos de imunoglobulinas HABP são montados como monômeros ou hetero- ou homomultímeros, e particularmente como dímeros ou tetrâmeros. Cadeias ou unidades básicas de estruturas diferentes podem ser utilizadas para montar os monômeros e hetero- e homo-multímeros. Por exemplo, um polipeptídeo HABP pode ser fundido totalmente ou em parte de uma molécula de imunoglobulina, incluindo a totalidade ou parte de um domínio CH, Cr, Vu, ou V, de uma molécula de imunoglobulina (como, por exemplo, Patente dos EUA No.
5.116.964). Polipeptídeos HABP É quiméricos podem ser prontamente produzidos e segregados por células de mamífero transformadas com a molécula de ácido nucleico adequada. As formas segregadas incluem aquelas em que o polipeptídeo HABP está presente em dímeros de cadeia pesada; monômeros ou dímeros da cadeia leve; e heterotetrâmeros de cadeia leve e pesada, em que o polipeptídeo HABP está fundido com uma ou mais cadeias leves e pesadas, incluindo heterotetrâmeros onde até, e incluindo, todos os quatro análogos da região variável são substituídos. Em alguns exemplos, uma ou mais de uma molécula de fusão do ácido nucleico pode ser transformada em células hospedeiras, para produzir um multímero onde as porções HABP do mesmo são a mesma ou diferente. Em alguns exemplos, um domínio do tipo variável de cadeia leve-pesada de polipeptídeo não-HABP está presente, produzindo assim, um anticorpo heterobifuncional. Em alguns exemplos, um polipeptídeo quimérico pode ser fundido a uma parte de uma molécula de imunoglobulina em que faltam dissulfetos de articulação, em que as interações não covalentes ou covalentes das duas porções HABPs polipeptídicas associam a molécula em um homo- ou heterodímero.
(a) Domínio Fc
[0307] Normalmente, a porção de imunoglobulina de uma proteína quimérica HABP inclui a cadeia pesada de um polipeptídeo de imunoglobulina, mais geralmente, os domínios constantes da cadeia pesada. Exemplos de sequências de regiões constantes da cadeia pesada de sub- tipos de IgG humana são apresentados nas SEQ ID NOS: 355 (IgGl1), SEQ ID NO: 356 (IgG2), SEQ ID NO: 357 (IgG3), e SEQ ID NO: 358 (IgG4). Por exemplo, para a região constante da cadeia pesada exemplar descrita na SEQ ID NO: 355, o domínio Cxl corresponde aos aminoácidos 1-98, a região de articulação corresponde aos aminoácidos 99-110, o domínio Cx2 corresponde aos aminoácidos 111-223, e o domínio Cr;x3 corresponde aos aminoácidos 224-330.
[0308] Em um exemplo, uma proteína quimérica de polipeptídeo de imunoglobulina pode incluir a região Fc de um polipeptídeo de imunoglobulina. Normalmente, tal fusão retém pelo menos uma articulação funcionalmente ativa, domínios Cy,2 e C1i3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, uma sequência de comprimento total de Fc da IgGl inclui os aminoácidos 99- 330 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 355. Uma sequência de Fc exemplar para hIgGl está estabelecida na SEQ ID NO: 359, e contém quase toda a sequência de articulação que corresponde aos aminoácidos 100-110 da SEQ ID NO: 355, e a sequência completa para o domínio Cr62 e Cx3, como apresentada na SEQ ID NO: 355. Outro polipeptídeo Fc exemplar é o polipeptídeo Fc apresentado na SEQ ID NO:
212. Outro polipeptídeo Fc exemplar é apresentado no requerimento de patente PCT WO 93/10151, e é um polipeptídeo de cadeia simples que se estende desde a região de articulação N- terminal para o C-terminal nativa da região Fc de um anticorpo da IgGl humana (SEQ ID NO: 359). O local preciso em que a ligação é realizada não é crítico: locais particulares são bem conhecidos e podem ser selecionados de modo a otimizar a atividade biológica, secreção ou características de ligação do polipeptídeo HABP. Por exemplo, outras sequências de polipeptídeos Fc começam no aminoácido C109 ou P113 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 355 (ver, por exemplo, EUA Pub. No. 2006/ 0024298).
[0309] Além de hIgG1l Fc, outras regiões Fc também podem ser incluídas nos polipeptídeos quiméricos HABP aqui proporcionados. Por exemplo, quando as funções efetoras mediadas pelas interações Fe/FeyR estão para ser minimizadas, a fusão com isotipos IgG que mal recrutam complemento ou células efetoras de, tais como, por exemplo, Fc de IgG2 ou IgG4, são contempladas. Além disso, as fusões de Fc podem conter sequências de imunoglobulina que são substancialmente codificadas por genes de imunoglobulinas pertencentes a qualquer uma das classes de anticorpos, incluindo, mas não limitadas a IgG (incluindo as subclasses humanas IgG1l, 19G2, I19gG3, ou I19G4), IgA (incluindo subclasses humanas IgAl e IgA2), classes de anticorpos IgD, IgE, e IgM. Além disso, os ligantes podem ser utilizados para ligar covalentemente a outro polipeptídeo Fc para gerar uma quimera de Fc.
[0310] Domínios Fc modificados são também aqui contemplados para uso em quimeras com polipeptídeos HABP. Em alguns exemplos, a região Fc está modificada de tal forma que apresenta alteração na ligação a um FcR, portanto, deve resultar em uma função efetora (isto é, mais ou menos) alterada do que a função efetora de uma região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina do tipo selvagem. Assimy um domínio Fc modificado pode ter afinidade alterada, incluindo, mas não limitada ao aumento ou diminuição ou nenhuma afinidade para o receptor Fc. Por exemplo, as diferentes subclasses de IgG possuem diferentes afinidades para FcyR5, com IgGl e IgG3, normalmente, uma ligação substancialmente melhor do que os receptores de Ig6G2 e IgGi. Além disso, diferentes FcyR5 podem mediar diferentes funções efetoras. FcyRl, FcyRIIa/c, e FcyRIIIa são reguladores positivos da ativação desencadeada no complexo imune, caracterizada por possuir um domínio intracelular que tem um motivo de ativação imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM). FcyRIIb, no entanto, tem um motivo de inibição imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) e é, portanto, inibidor. Em alguns casos, uma proteína quimérica Fc de polipeptídeo HABP aqui fornecida pode ser modificada para aumentar a ligação à proteína do complemento Clq. Além disso, um Fc pode ser modificado para alterar a sua ligação ao FcRn, melhorando assim, a farmacocinética de um polipeptídeo quimérico HABP-Fc. Assim, a alteração à afinidade de uma região Fc para um receptor é capaz de modular as funções efetoras e/ou propriedades farmacocinéticas associadas pelo domínio Fc. Domínios Fc modificados são conhecidos por um perito na arte e descritos na literatura, ver por exemplo, Patente dos EUA No. 5.457.035; Publicação de Patente EUA No. 2006/ 0024298; e Publicação de Patente Internacional No. WO 2005/ 063816 para modificações exemplares.
[0311] Normalmente, um multímero polipeptídeo é um dímero de duas proteínas quiméricas criadas através da ligação, direta ou indiretamente, de dois dos mesmos ou de diferentes polipeptídeos HABP para um polipeptídeo Fc. Em alguns exemplos, um gene de fusão que codifica a proteína quimérica HABP-Fc é inserido em um vetor de expressão apropriado. As proteínas quiméricas HABP-Fc resultantes podem ser expressas em células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão recombinante, e deixadas para se reunirem como moléculas de anticorpos, em que se formam ligações dissulfeto intercadeias entre as porções Fc, para produzir polipeptídeos HABP bivalentes.
[0312] Os polipeptídeos quiméricos resultantes contendo porções Fc e multímeros formados a partir deles, podem ser facilmente purificados por cromatografia de afinidade sobre as colunas de proteína A ou proteína G.
Para a produção de heterodímeros, etapas adicionais de purificação podem ser necessárias. Por exemplo, onde dois ácidos nucleicos que codificam diferentes polipeptídeos HABP quiméricos são transformados em células, a formação de heterodímeros deve ser conseguida uma vez, bioquimicamente, desde que as moléculas quiméricas HABP que transportam o domínio Fc sejam expressas como homodímeros ligados por dissulfeto. Assim, os homodímeros podem ser reduzidos sob condições que favorecem a ruptura de ligações dissulfeto intercadeias, mas não efetuam dissulfetos intracadeias. Normalmente, os monômeros quiméricos com diferentes porções do domínio de ligação ao HA são misturados em quantidades equimolares, e oxidados, para formar uma mistura de homo- e heterodímeros. Os componentes desta mistura são separados através de técnicas cromatográficas. Alternativamente, a formação deste tipo de heterodímero pode ser polarizada por engenharia genética e expressão de moléculas de fusão HABP que contêm um polipeptídeo HABP, seguido pelo domínio Fc da hlgG, seguido por ambos os fechos de leucina c-jun ou c-fos (veja abaixo). Uma vez que os fechos de leucina formam predominantemente heterodímeros, eles podem ser utilizados para conduzir a formação de heterodímeros, quando desejado.
[0313] Polipeptídeos quiméricos HABP que contém as regiões Fc podem também ser modificados para incluir uma etiqueta com os quelatos de metal ou outro epítopo. O domínio marcado pode ser utilizado para purificação rápida através de cromatografia de quelato de metais, e/ou através de anticorpos, para permitir a detecção de western blots imunoprecipitação, ou depleção/bloqueio de atividade em bioensaios.
[0314] Polipeptídeos quiméricos HABP-Fc exemplificativos incluem a proteína de fusão do módulo de ligação TSG-6 (TSG-6-LM) e Fc. Um exemplar TSG-6-LM-Fc está descrito na SEQ ID NO: 212, e codificado por uma sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID NO:211. Além disso, as moléculas de HABP-Fc, incluindo, por exemplo, as moléculas exemplares TSG-6-Fc, podem conter opcionalmente um marcador de epítopo, ou um sinal de expressão e secreção. Por exemplo, o polipeptídeo quimérico exemplar TSG-6-LM-Fc apresentado como a SEQ ID NO: 212 contém uma sequência de peptídeo de sinal kappa (x) líder de cadeia leve de imunoglobulina humana (SEQ ID NO: 210), um fragmento Fc de uma cadeia pesada da IgGl humana (SEQ ID NO: 204) e um módulo de ligação da TSG-6 humana (SEQ ID NO: 207). A sequência de cDNA que codifica o polipeptídeo quimérico TSG-6-LM-Fc está descrita na SEQ ID NO: 211. O DNA que codifica as regiões de cadeia pesada da IgGl humana e do módulo de ligação da TSG-6 humana está conectado com um local de clivagem da enzima de restrição 6 pb Agel e uma sequência de 12 pb, GACAAAACTCAC (SEQ ID NO: 208), que codifica quatro aminoácidos adicionais (DKTH; SEQ ID NO:209).
(2) fecho de leucina
[0315] Outro método de preparação de multímeros de polipeptídeos HABP para utilização nos métodos aqui proporcionados envolve a utilização de um domínio de fecho de leucina. Os fechos de leucina são peptídeos que promovem multimerização das proteínas nas quais estes se encontram. Normalmente, fecho de leucina é um termo usado referente a um padrão repetitivo hepta contendo 4-5 resíduos de leucina presentes como um domínio conservado em várias proteínas. Os fechos de leucina dobram como, espirais enrolados paralelos curtos, e acredita-se que sejam responsáveis pela oligomerização das proteínas das quais formam um domínio. O dímero formado por um domínio de fecho de leucina é estabilizado pela repetição de sete, designada (abcdefg)n
(ver por exemplo, McLachlan and Stewart (1978) J. Mol. Biol. 98:293), em que os resíduos a e d são geralmente resíduos hidrofóbicos, com d sendo uma leucina, que se alinha na mesma face de uma hélice. Resíduos com cargas opostas ocorrem usualmente nas posições g e e. Assim, em uma espiral enrolada paralela formada a partir de dois domínios de fecho de leucinas helicoidais, os "knobs" formados pelas cadeias laterais hidrofóbicas da primeira hélice são acondicionados nos "orifícios" formados entre as cadeias laterais da segunda hélice.
[0316] Fechos de leucina exemplificativos, para utilização como domínios de multimerização aqui descritos, são derivados a partir de qualquer uma das duas proteínas de transformação nuclear, fos e jun, que apresentam domínios de fecho de leucina, ou o produto do proto- oncogene murino, c-myc. O domínio de fecho de leucina é necessário para atividade biológica (ligação de DNA) nestas proteínas. Os produtos dos oncogenes nucleares fos e jun contêm domínios de fecho de leucina que preferencialmente formam um heterodímero (0' Shea et al. (1989) Science, 245:646; Turner and Tijian (1989) Science, 243:1689). Por exemplo, os domínios de fecho de leucina dos fatores de transcrição humanos c-jun e c-fos demonstraram que formam heterodímeros estáveis com uma estequiometria de 1:1 (ver, por exemplo, Busch e Sassone-Corsi (1990) Trends Genetics, 6:36-40; Gentz et al., (1989) Science, 243:1695-1699). Embora a formação de homodimeros Jun-Jun, também vem sendo mostrada, eles são cerca de 1000 vezes menos estáveis do que os heterodímeros jun-fos.
[0317] Assim normalmente um multímero polipeptídeo HABP aqui proporcionado é gerado usando uma combinação jun- fos. Geralmente, o domínio de fecho de leucina tanto de c-jun como de c- fos é fundido na estrutura, ao C-terminal, de uma HABP de um polipeptídeo por engenharia genética de genes de fusão. Exemplos de sequências de aminoácidos de fechos de leucina c-jun e c- fos são apresentados nas SEQ ID NOS: 362 e 363, respectivamente. Em alguns casos, uma sequência de um fecho de leucina pode ser modificada, tal como pela adição de um resíduo de cisteína, para permitir a formação de pontes dissulfeto, ou a adição de um resíduo de tirosina na parte C-terminal para facilitar a medição da concentração de peptídeo. Tais sequências exemplares de aminoácidos codificados de um fecho de leucina c-jun e c-fos modificado são apresentadas nas SEQ ID NOS: 362 e 363, respectivamente. Além disso, a ligação de um polipeptídeo HABP com um fecho de leucina pode ser direta ou pode empregar um domínio ligante flexível, tal como, por exemplo, uma região de articulação da IgG, ou outros agentes de ligação polipeptídicos de pequenos aminoácidos tais como glicina, serina, treonina, ou alanina, em vários comprimentos e combinações. Em alguns casos, a separação de um fecho de leucina a partir do C-terminal de um polipeptídeo codificado pode ser efetuada por fusão com uma sequência que codifica sítios de clivagem de protease, tais como, por exemplo, um local de clivagem da trombina. Além disso, as proteínas quiméricas podem ser marcadas, tais como, por exemplo, por uma 6XHistag, para permitir a rápida purificação por meio de cromatografia de quelato de metal e/ou por epítopos, aos quais os anticorpos estão disponíveis, tais como, por exemplo, myc tag, para permitir a detecção em western blots, imunoprecipitação, ou bioensaios por depleção/bloqueio de atividade.
[0318] Um outro domínio de fecho de leucina exemplar para uso como um domínio de multimerização é derivado de uma proteína nuclear que funciona como um ativador da transcrição de uma família de genes envolvida no metabolismo geral de controle de nitrogênio (GCN4) em S. cerevisiae.
A proteína é capaz de formar dímeros e ligar sequências de promotor contendo a sequência de reconhecimento para GCN4, ativando a transcrição em ocasiões de privação de nitrogênio.
Uma sequência exemplar de um fecho de leucinas GCN4 capaz de formar um complexo dimérico é estabelecida na SEQ ID NO: 364. Substituições de aminoácidos em resíduos a e d de um peptídeo sintético representando o domínio de fecho de leucina GCN4 (ou seja, substituições de aminoácidos na sequência apresentada como SEQ ID NO: 364) foram encontradas para alterar as propriedades de oligomerização do domínio de fecho de leucina.
Por exemplo, quando todos os resíduos na posição a são alterados para isoleucina, o fecho de leucinas ainda forma um dímero paralelo.
Quando, em adição a esta alteração, todos os resíduos de leucina na posição d são também alterados para isoleucina, o peptídeo resultante forma espontaneamente uma espiral enrolada paralela trimérica, em solução.
Uma sequência exemplar de tal domínio de fecho de leucina GNC4 capaz de formar um trímero está estabelecida na SEQ ID NO: 365. A substituição de todos os aminoácidos na posição d, por isoleucina, e na posição a, com leucina, resulta em um peptídeo que tetrameriza.
Tal sequência exemplar de um domínio de fecho de leucina de GCN4, capaz de formar tetrâmeros é estabelecida na SEQ ID NO: 366. Os peptídeos contendo essas substituições são ainda referidos como domínios de fecho de leucina, uma vez que se acredita que o mecanismo da formação de oligômeros é o mesmo que o descrito para os domínios de fecho de leucina tradicionais, tais como o GCN4 descrito acima, e descrito na SEQ ID NO: 364.
(3) Interação proteína-proteína entre Subunidades
[0319] Exemplo de um outro tipo de domínio de multimerização, para uso na modificação de uma HABP fornecida para uso nos métodos aqui descritos, é um em que a multimerização é facilitada pelas interações proteína- proteína entre os diferentes polipeptídeos de subunidade. Exemplos de tal domínio de multimerização são derivados a partir do mecanismo de quinase de proteína dependente de CAMP (PKA), com o seu domínio de ancoragem (AD) de proteínas de ancoragem à quinase A (AKAP). Assim, um polipeptídeo HABP heteromultimérico pode ser gerado através da ligação (direta ou indireta) de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo HABP, tal como um domínio de ligação ao HA de um polipeptídeo HABP, com um ácido nucleico que codifica uma sequência de subunidades R de PKA (isto é, SEQ ID NO: 367). Isto resulta em uma molécula homodimérica, devido à formação espontânea de um dímero efetuada pela subunidade R. Paralelamente, um outro polipeptídeo de fusão HABP pode ser gerado através da ligação de um ácido nucleico que codifica outro polipeptídeo HABP a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência AD de AKAP (isto é, SEQ ID NO: 368). Após a co-rexpressão dos dois componentes, tal como a cor transfeção dos componentes HABP quiméricos em células hospedeiras, a seguir, a subunidade R dimérica fornece um local de acoplamento para a ligação à sequência de AD, o que resulta em uma molécula heteromultimérica. Este evento de ligação pode ser ainda mais estabilizado por ligações covalentes, tais como, por exemplo, pontes de dissulfeto. Em alguns exemplos, um resíduo de ligação flexível pode ser fundido entre o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo HABP e o domínio de multimerização. Em outro exemplo, a fusão de um ácido nucleico, que codifica um polipeptídeo
HABP, pode ser a um ácido nucleico, que codifica para uma sub-unidade R, que contenha um resíduo de cisteína incorporado adjacente à extremidade do terminal amina da subunidade R, para facilitar a ligação covalente (ver por exemplo, SEQ ID NO: 369). De igual modo, a fusão de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo parceiro HABP pode ser para um ácido nucleico que codifica uma subunidade AD, que contenha também a incorporação de resíduos de cisteína para ambas as extremidades amina e carboxi- terminais de AD (ver por exemplo, SEQ ID NO: 370).
iv. Outros domínios de multimerização
[0320] Outros domínios de multimerização que podem ser utilizados para multimerização de uma HABP fornecida, para uso nos métodos aqui presentes, são conhecidos por peritos na arte, e são os que facilitam a interação proteína- proteína de dois ou mais polipeptídeos, que são gerados e expressos separadamente como fusões de HABP. Exemplos de outros domínios de multimerização que podem ser utilizados para fornecer as interações proteína- proteína entre dois polipeptídeos quiméricos incluem, mas não estão limitados ao módulo barnase-barstar (ver, por exemplo, Deyev et al., (2003) Nat. Biotechnol. 21:1486- 1492); utilização de determinados domínios de proteínas (ver, por exemplo, Terskikh et al., (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94: 1663-1668 e Muller et al., (1998) FEBS Lett. 422:259-264); utilização de motivos peptídicos específicos (ver, por exemplo, Kruif et al., (1996) JJ. Biol. Chem. 271:7630-7634 e Muller et al., (1998) FEBS Lett. 432: 45-49); e a utilização de pontes de dissulfeto para uma estabilidade aumentada (de Kruif et al., (1996) JU. Biol. Chem. 271:7630-7634 and Schmiedl et al., (2000) Protein Eng. 13:725-734).
b. Mutações para melhorar a ligação ao HA
[0321] Em um outro exemplo, são fornecidas para uso nos métodos presentes, HABPs que são modificadas, como por exemplo, por substituição de aminoácidos, para expor uma maior especificidade para o hialuronan em comparação com outros GAGs. Por exemplo, é aqui proporcionado um TSG- 6-LM mutante contendo a substituição de aminoácido (s) no resíduo de aminoácido 20, 34, 41, 54, 56, 72 e/ou 84, e, em particular, no resíduo de aminoácido 20, 34, 41, e/ou 54 (correspondentes aos resíduos de aminoácidos estabelecidos na SEQ ID NO: 360). A substituição de aminoácidos pode ser a de qualquer outro resíduo de aminoácido, e, geralmente, é um resíduo de aminoácido não-básico. Por exemplo, a substituição de aminoácidos pode ser para Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (0), Ala (A), Val (V), Ile (1), Leu (L), Met (M), Phe (F), Tyr (Y) ou Trp (W). A substituição ou substituições de aminoácidos conferem diminuição de ligação à heparina. A ligação pode ser reduzida, pelo menos, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes 100 vezes ou mais, em comparação com a ligação de TSG-6-LM à heparina que não contém a substituição de aminoácido. Exemplos de um mutante TSG-6-LM para utilização como um reagente no processo aqui fornecido é K20A/K34A/K41A. Assim, por exemplo, a ligação a heparina é reduzida de tal modo que a especificidade para o hialuronan é aumentada. O mutante TSG-6-LM pode ser conjugado direta ou indiretamente a um domínio de multimerização para gerar multímeros. Por exemplo, um exemplo de um reagente para utilização nos métodos aqui descritos é TSG-6-LM (K20A/K34A/K41A)-Fc.
c. Modificações de Proteínas de Ligação ao HA para Detecção
[0322] Para utilização nos métodos de diagnóstico aqui fornecidos, as proteínas de ligação ao HA podem ser modificadas para conter uma proteína detectável ou uma porção para facilitar a detecção.
i. Conjugação para proteínas detectáveis ou porções
[0323] As proteínas de ligação ao HA para utilização nos métodos de diagnóstico aqui fornecidos podem ser modificadas por, conjugação para porções detectáveis incluindo, mas não limitadas a, peptídeos, marcações radioativas, moléculas fluorescentes, moléculas quimioluminescentes, moléculas bioluminescentes, domínios Fc, biotina, enzimas que catalisam uma reação detectável ou catalisam a formação de um produto detectável, e proteínas que se ligam a um composto detectável. Porções detectáveis, incluindo proteínas e compostos, ou porções que facilitam a detecção são conhecidos por um perito na arte. As porções detectáveis podem ser utilizadas para facilitar a detecção e/ou purificação da HABP.
[0324] Em um exemplo, a proteína de ligação ao HA é modificada por conjugação com uma proteína detectável ou uma proteína que induz um sinal detectável. A proteína detectável ou proteína que induz um sinal detectável pode ser selecionada entre uma luciferase, uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, uma proteína do receptor ou veículo que se liga a, e/ou transporta um agente de contraste, cromóforo, composto ou ligante que pode ser detectado. Por exemplo, a proteína detectável ou proteína que induz um sinal detectável é uma proteína fluorescente verde (GFP) ou uma proteína fluorescente vermelha (RFP).
[0325] Os marcadores detectáveis podem ser usados em qualquer um dos métodos de diagnóstico aqui fornecidos.
Exemplos de marcadores detectáveis incluem, por exemplo, porções quimioluminescentes, porções bioluminescentes, porções fluorescentes, radionuclídeos, e metais. Os métodos para a detecção de marcadores são bem conhecidos na arte. Tal marcador pode ser detectado, por exemplo, por inspeção visual, por espectroscopia de fluorescência, por medição de refletância, por citometria de fluxo, por raios X, por uma variedade de métodos de ressonância magnética, tais como a imagiologia de ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS). Os métodos de detecção também incluem qualquer um de uma variedade de métodos tomográficos incluindo tomografia computadorizada (CT), tomografia axial computadorizada (CAT), tomografia computadorizada de feixe de elétrons (EBCT), tomografia computadorizada de alta resolução (HRCT), tomografia hipocicloidal, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada espiral, e a tomografia ultra-sônica.
[0326] Exemplos de tais proteínas são as enzimas que podem catalisar uma reação detectável ou catalisam a formação de um produto detectável, tal como, por exemplo, as luciferases, tais como uma luciferase de besouro, uma luciferase de Renilla, uma luciferase de pirilampo ou a beta-glucuronidase (GusA) . São também exemplos dessas proteínas, as proteínas que emitem um sinal detectável, incluindo proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP) ou uma proteína fluorescente vermelha (RFP). Uma variedade de sequências de DNA que codificam proteínas que emitem um sinal detectável ou que possam catalisar uma reação detectável, tais como proteínas fluorescentes ou luminescentes, são conhecidas e podem ser usadas nos métodos aqui fornecidos. Exemplos de genes que codificam para proteínas emissoras de luz incluem, por exemplo, os genes de luciferase bacteriana de Vibrio harveyi (Belas et al., (1982) Science 218:791-793), luciferase bacteriana de Vibrio fischerii (Foran and Brown, (1988) Nucleic acids Res. 16:177), luciferase de pirilampo (de Wet et al., (1987) Mol. Biol. 7:725-737), aequorina de Aequorea victoria (Prasher et al., (1987) Biochem. 26:1326- 1332), Renilla luciferase de Renilla renformis (Lorenz et al, (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4438-4442) e proteína fluorescente verde de Aequorea victoria (Prasher et al., (1987) Gene 111:229-233). Os genes luxA e luxB de luciferase bacteriana podem ser combinados para produzir o gene de fusão (Fab2), que pode ser expresso para produzir uma proteína de luciferase totalmente funcional (Escher et al., (1989) PNAS 86: 6528-6532).
[0327] Proteínas detectáveis exemplificativas que podem ser conjugadas com as proteínas de ligação ao HA, para utilização nos métodos de diagnóstico aqui proporcionados, também incluem proteínas que podem ligar um agente de contraste, cromóforo, ou um composto ou ligante, que pode ser detectado, tal como um receptor de transferrina ou uma ferritina; e proteínas repórter, tais como E. coli B- galactosidase, B-glucuronidase, fosforribosiltransferase xantina-guanina (gpt), e fosfatase alcalina. Também são exemplos de proteínas detectáveis, proteínas que podem ligar especificamente um composto detectável, incluindo, mas não limitado a receptores, proteínas de ligação de metal (por exemplo, siderófagos, ferritinas, receptores de transferrina), proteínas de ligação ao ligante, e anticorpos.
[0328] A HABP também pode ser conjugada para uma marcação de proteína ou peptídeo. Em um exemplo, a proteína de ligação ao HA é conjugada com um domínio de Fc.
Marcações de proteínas e peptídeos também incluem, mas não estão limitadas a, HexaHis tag (SEQ ID NO:54), hemaglutinina tag (SEQ ID NO:420), FLAG tag (SEQ ID NO:55), c-myc tag (SEQ ID NO:419), VSV-G tag (SEQ ID NO:421), HSV tag (SEQ ID NO:422) e V5 tag (SEQ ID NO:415), proteína de ligação a quitina (CBP), proteína de ligação a maltose (MBP), e a glutationa s-transferase (TSG).
[0329] os marcadores detectáveis podem ser acoplados ou conjugados com uma HABP através de métodos recombinantes ou por métodos químicos. Por exemplo, a conjugação pode ser realizada pela ligação da proteína, direta ou indiretamente, a um ligante tal como um ligante peptídico ou um agente de ligação química. Os ligantes podem ser sequências de polipeptídeo, tais como sequências de poli- glicina entre cerca de 5 e 200 aminoácidos. Resíduos de prolina podem ser incorporados em um polipeptídeo ligante para evitar a formação de elementos estruturais secundários significativos, isto é, hélice a /folha B, pelo ligante. Um exemplo de um ligante flexível é um polipeptídeo que inclui uma cadeia de glicina com um intermediário de prolina. Em outros exemplos, um agente de ligação química é utilizado para ligar sinteticamente ou produzir de forma recombinante subsequências do domínio de ligação e de marcação. Tais elementos de ligação flexíveis são conhecidos por indivíduos com conhecimentos na arte. Por exemplo, ligantes poli (etilenoglicol) estão disponíveis a partir de Shearwater Polymers, Inc. Huntsville, Ala. Estes ligantes possuem opcionalmente ligações amida, ligações sulfidrila, ou ligações heterofuncionais.
4. Seleção de Proteínas de ligação ao HA para utilização em diagnóstico
[0330] Uma proteína de ligação ao HA adequada para uso como um agente de diagnóstico pode ser selecionada com base em uma ou mais propriedades ou atividades desejadas, incluindo, mas não se limitando, a especificidade ou afinidade para o HA, a solubilidade, a estabilidade de peptídeos, homogeneidade, facilidade de expressão e purificação, lote mínimo de variações para variações de lote no peptídeo expresso, e baixa variabilidade da amostra na ligação ao HA e detecção. Em alguns exemplos, um único agente de diagnóstico polipeptídico está contemplado em mais de um diagnóstico com múltiplos componentes polipeptídicos. Por exemplo, um módulo de ligação que se liga ao HA, na ausência de uma proteína de ligação completa. A capacidade de uma HABP aqui proporcionada para ligar-se ao hialuronan pode ser avaliada através de métodos bem conhecidos na arte, incluindo, mas não se limitando a ensaios baseados em ELISA, ensaios de ligação competitiva com HA, heparina e outros glicosaminoglicanos, tais como sulfatos de condroitina A ou C, sulfatos de heparan ou sulfatos de dermatan. Exemplos de ensaios para avaliar a atividade de ligação ao HA são fornecidos aqui na seção D, e nos Exemplos.
D. ENSAIOS E CLASSIFICAÇÃO
[0331] Os métodos aqui proporcionados são baseados no ensaio da expressão ou níveis de hialuronan (HA) em uma amostra ou amostras, tal como uma amostra de tecido ou amostra de fluido corporal. Os métodos aqui baseiam-se em métodos de ligação utilizando um diagnóstico de acompanhamento de proteína de ligação ao hialuronan (HABP, tal como TSG-6-LM, multímero ou variante) para a avaliação, a determinação, quantificação e/ou de outro modo, especificamente, detecção da expressão ou níveis de hialuronan em uma amostra. Os ensaios podem ser realizados in vitro ou in vivo. Através da comparação com um controle ou amostra de referência, ou classificações com base em um nível predeterminado, esses valores podem ser usados para Oo diagnóstico ou prognóstico de uma doença ou condição associada ao hialuronan, para prever a capacidade de resposta de um indivíduo que tem uma doença ou condição associada ao hialuronan para uma terapia de enzima que degrada hialuronan, e/ou para controlar ou prever a eficácia do tratamento de um indivíduo que tem uma doença ou condição associada ao hialuronan, que foi tratado com uma terapia de enzima que degrada hialuronan. Por exemplo, como aqui descrito, verificou-se que os níveis e medida de HA especificamente se associam com a capacidade de resposta ao tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, tal como um hialuronidase ou hialuronidase modificada (por exemplo, hialuronidase PEGuilada como PEGPH20).
[0332] Em qualquer um dos exemplos acima, as doenças ou condições associadas a hialuronan são as doenças e as condições em que os níveis de hialuronan são elevados como causa ou efeito, ou de outro modo, observados na doença ou condição. Doenças ou condições associadas ao hialuronan exemplares, incluem, mas não estão limitadas as que estão associadas com a pressão do fluido intersticial elevada, um câncer e, em particular, um câncer rico em hialuronan, edema, pressão no disco, doença inflamatória, e outras doenças associadas com hialuronan. Em alguns casos, as doenças e condições associadas a hialuronan estão associadas com o aumento da pressão do fluido intersticial, diminuição do volume vascular e/ou aumento do teor de água no tecido, tal como um tumor. Em particular, as doenças e condições associadas a hialuronan, incluem, mas não estão limitadas a, tipos de câncer ricos em hialuronan, por exemplo, tumores, incluindo tumores sólidos tais como os cânceres de fase final, cânceres metastáticos, cânceres indiferenciados, câncer do ovário, carcinoma in situ (ISC), carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama, câncer de cólon e outros tipos de câncer.
[0333] Em um exemplo, com base nos níveis ou expressão de hialuronan, um doente ou indivíduo pode ser selecionado para o tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Por exemplo, uma amostra de um indivíduo pode ser contactada com um diagnóstico de acompanhamento de proteína de ligação a hialuronan (HABP), tais como TSG-6-LM, um multímero ou uma variante sua, e a ligação da HABP para a amostra pode ser detectada para determinar a quantidade de hialuronan na amostra. Com base nos critérios de seleção ou de classificação predeterminados, como aqui descritos, um paciente pode ser diagnosticado com uma doença ou condição associada a hialuronan, e, portanto, selecionado para oO tratamento da doença ou condição. Além disso, com base nos critérios de seleção ou de classificação predeterminados, caqui descritos, os presentes métodos podem ser utilizados para prognóstico do indivíduo. Dependendo do curso da doença ou condição, a dose, esquema de tratamento e/ou regime de dosagem do agente terapêutico (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) pode ser optimizado e ajustado em conformidade. Em exemplos particulares aqui descritos, com base nos critérios de seleção ou de classificação predeterminado, tal como aqui descrito, um doente ou indivíduo pode ser selecionado para o tratamento, que é previsto para ser responsivo ao tratamento com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tal como uma hialuronidase ou hialuronidase modificada (por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada como PEGPH20). Assim, o método pode ser usado para prever a eficácia do tratamento por um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan.
[0334] Nos exemplos de métodos aqui descritos, a eficácia do tratamento por um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, pode ser determinada através da monitorização da expressão ou níveis de hialuronan, ao longo do curso do tratamento. Assim, o método é um método de pós-tratamento do estado e/ou resolução da doença monitorada, cuja informação pode ser usada para alterar o curso do tratamento de um indivíduo que dependa das informações de estado individualizado. Por exemplo, uma amostra de um indivíduo pode ser contactada com um diagnóstico de acompanhamento de proteína de ligação a hialuronan (HABP), por exemplo, TSG-6-LM, um multímero ou uma variante sua, e a ligação da HABP para a amostra pode ser detectada, a fim de determinar a quantidade de hialuronan na amostra. A expressão ou o nível de hialuronan na amostra pode ser comparada com uma amostra de controle ou de referência, a fim de avaliar as diferenças nos níveis ou expressão de hialuronan. Por exemplo, os níveis elevados ou acumulados de hialuronan em um individuo doente, em comparação com um indivíduo saudável ou normal são indicativos de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, tumor ou câncer) e a extensão da expressão ou níveis de hialuronan correlaciona-se com a agressividade da doença. Em tais métodos, a amostra de controle ou de referência é uma amostra de um indivíduo saudável, é uma amostra de linha de base a partir do indivíduo, antes do tratamento com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan)
(referência pré-tratamento), ou é uma amostra de um indivíduo, antes da última dose de um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Por exemplo, para monitorar a resposta do paciente, o ensaio pode ser executado no momento do início da terapia para estabelecer níveis de linha de base (ou predeterminados) de hialuronan em uma amostra (por exemplo, tecido ou fluido corporal). A mesma amostra (por exemplo, tecido ou fluido corporal) é então amostrada usando o mesmo ensaio, e os níveis de hialuronan em comparação com a linha de base ou os níveis predeterminados.
1. Ensaios para medição de hialuronan
[0335] Está dentro do nível de um especialista na técnica, avaliar, quantificar, determinar e/ou detectar os níveis de hialuronan em uma amostra usando um diagnóstico de acompanhamento de HABP, tais como TSG-6-LM, multímero (por exemplo, TSG-6LM-Fc) ou uma variante sua, tal como aqui descrito. Os ensaios incluem ensaios in vitro ou in vivo. Exemplos de ensaios de ligação que podem ser utilizados para avaliar, determinar, quantificar e/ou de outro modo detectar especificamente a expressão de hialuronan ou níveis em uma amostra incluem, mas não estão limitados aos ensaios de ligação em fase sólida (por exemplo, ensaio imunoenzimático (ELISA)), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunorradiométrico, ensaio de fluorescencia, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente, western blot e métodos histoquímicos, tais como imuno-histoquímica (IHC) ou pseudo imuno-histoquímica, usando um agente de ligação não-anticorpo. Os métodos de ensaio de ligação na fase sólida, tais como os métodos ELISA, por exemplo, o ensaio pode ser em formato sandwich ou formato de inibição competitiva. Em outros exemplos, podem ser utilizados métodos de imagiologia in vivo.
a. Métodos Histoquímicos e Imuno-histoquímicos
[0336] Os métodos para avaliar a acumulação de hialuronan baseiam-se na capacidade de um diagnóstico de acompanhamento HABP para se ligar ao HA, em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido ou de células, de tal modo que a quantidade do diagnóstico de acompanhamento de HABP que se liga, está correlacionada com a quantidade de HA na amostra. Qualquer diagnóstico de acompanhamento HABP aqui fornecido pode ser usado para detectar HA, usando métodos de coloração para tecidos conhecidos por um perito na arte, incluindo, mas não limitados aos métodos citoquímicos ou histoquímicos, tais como imuno-histoquímica (IHC) ou histoquímica, utilizando um agente não-anticorpo (por exemplo, pseudo imuno-histoquímica). Tais métodos histoquímicos permitem a detecção quantitativa ou semi- quantitativa da quantidade de HABP que se liga ao HA de uma amostra, tal como uma amostra de tecido tumoral. Em tais métodos, uma amostra de tecido pode ser contactada a um reagente de HABP aqui fornecido, e em particular um que é marcado de forma detectável ou capaz de detecção, em condições que permitem a ligação ao HA associado ao tecido ou à célula.
[0337] Uma amostra para a utilização nos métodos aqui fornecidos, tal como determinado por histoquímica pode ser qualquer amostra biológica, que possa ser analisada para os seus níveis de HA, tais como uma amostra de tecido ou celular. Por exemplo, uma amostra de tecido pode ser um tecido sólido, incluindo um órgão fresco, congelado e/ou conservado, ou amostra de tecido ou biopsia ou aspirado, ou células. Em alguns exemplos, a amostra de tecido é um tecido ou células obtidas a partir de um tumor sólido, tal como os tumores primários e metastáticos, incluindo mas não se limitando a, mama, cólon, reto, pulmão, estômago,
ovário, colo uterino, útero, testículos, bexiga, tumores de próstata, tireoide e câncer de pulmão. Em exemplos particulares, a amostra é uma amostra de tecido de câncer, que é um câncer em estágio avançado, um câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer do ovário, carcinoma in situ (ISC), carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de pulmão de células não- pequenas, câncer de mama, câncer de cólon. Em outros exemplos, a amostra de tecido contém células a partir de células primárias ou de cultura, ou linhagens celulares. As células podem ter vários estados de diferenciação, e podem ser normais, pré-cancerosas ou cancerosas, podem ser tecidos frescos, células dispersadas, células imaturas, incluindo células estaminais, células de maturidade intermediária e células completamente maduras. Normalmente, as células selecionadas para utilização nos métodos aqui proporcionados, são células cancerosas.
[0338] Quando o tumor é um tumor sólido, o isolamento de células tumorais é normalmente conseguido por biópsia cirúrgica. Técnicas de biópsia que podem ser utilizadas para colher as células tumorais de um indivíduo incluem, mas não estão limitadas a, biópsia de agulha, agulha guiada por cT, biópsia aspirativa, biópsia endoscópica, biópsia por broncoscopia, lavagem brônquica, biópsia incisional, biópsia excisional, biópsia por punch, biópsia por raspagem, biópsia de pele, biópsia de medula óssea, e biópsia Loop Eletrosurgical Excision Procedure (LEEP). Normalmente, uma amostra de biópsia, estéril não- necrótica é obtida com mais do que 100 mg, mas que pode ser menos, tal como menos do que 100 mg, 50 mg ou menos, 10 mg ou menos, ou 5 mg ou menos; ou mais, tal como mais de 100 mg, 200 mg ou mais, ou 500 mg ou mais, de 1 g ou mais, de 2 g ou mais, de 3 g ou mais, 4 g ou mais, ou 5 g ou mais. O tamanho da amostra a ser extraída para o doseamento pode depender de um número de fatores incluindo, mas não limitado, ao número de ensaios a serem realizados, a saúde da amostra de tecido, o tipo de câncer, e a condição do indivíduo. O tecido do tumor é colocado em um recipiente esterilizado, tal como um tubo estéril ou em placa de cultura, e pode ser opcionalmente imerso em um meio apropriado.
[0339] O tecido obtido a partir do paciente após a biópsia é frequentemente fixado, geralmente, por formalina (formaldeído) ou glutaraldeído, por exemplo, ou por imersão em álcool. Para os métodos de histoquímica, a amostra de tumor pode ser processada, utilizando técnicas conhecidas, tais como a desidratação e a incorporação do tecido de tumor em uma cera de parafina ou outros suportes sólidos conhecidos por peritos na arte (ver Plenat et al., (2001) Ann Pathol January 21(1) :29-47), que corta o tecido em seções adequadas para a coloração, e processando as seções para a coloração, de acordo com o método de coloração histoquímico selecionado, incluindo a remoção de suportes sólidos para a incorporação de solventes orgânicos, por exemplo, e re-hidratação de tecido preservado. Assim, as amostras para utilização nos métodos aqui descritos podem conter compostos que não estão naturalmente presentes em uma amostra de tecido ou celular, incluindo, por exemplo, conservantes, anticoagulantes, tampões, fixadores, nutrientes e antibióticos.
[0340] Em métodos exemplares para selecionar um objeto para o tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, a colheita do tecido tumoral é geralmente efetuada antes do tratamento do indivíduo com uma enzima que degrada hialuronan. Em métodos exemplares de terapia de acompanhamento de um tumor com uma enzima que degrada hialuronan, a colheita do tecido do tumor, a partir do indivíduo, pode ser realizada antes, durante ou depois do referido indivíduo ter recebido um ou mais tratamentos com uma enzima degradadora de hialuronan.
[0341] Os ensaios para a utilização nos métodos aqui proporcionados são aqueles em que o HA presente na amostra é detectado através de histoquímica ou imuno- histoquímica. Histoquímica (HC) é um método de coloração, com base em reações enzimáticas utilizando um parceiro de ligação, tal como um anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais ou policlonais) ou outro parceiro de ligação, para detectar células ou proteínas específicas, tais como os antígenos de tecido, ou biomarcadores, por exemplo, HA. Por exemplo, os ensaios de histoquímica, para utilização nos métodos aqui descritos, incluem aqueles em que uma HABP é utilizada como uma parceira de ligação para detectar HA associado com células ou tecidos. Normalmente, os protocolos de histoquímica incluem os sistemas de detecção que formam a presença dos marcadores visíveis, quer para O olho humano ou um sistema de varredura automatizado, para análises qualitativas ou quantitativas. Em um ensaio de HC direto, a ligação é determinada diretamente após a ligação do parceiro de ligação (por exemplo, primeiro anticorpo) para o tecido ou biomarcadores, devido à utilização de um reagente marcado. Em um ensaio HC indireto, um anticorpo secundário ou segundo parceiro de ligação é necessário para detectar a ligação do primeiro parceiro de ligação, uma vez que não está marcado.
[0342] Em tais métodos, em geral, uma amostra de tecido posta em lâmina é marcada com um reagente de ligação marcado (por exemplo HABP marcado) usando técnicas de histoquímica comuns. Assim, nos métodos de HC exemplificativos aqui fornecidos, os diagnósticos de acompanhamento HABP são modificados para conter um grupo capaz de ser detectado (tal como descrito na seção 3C acima). Em alguns exemplos, os diagnósticos de acompanhamento de HABP são conjugados com moléculas pequenas, por exemplo, biotina, que são detectadas através de um parceiro de ligação marcado, ou anticorpo. Em alguns exemplos, o método IHC é baseado na coloração com uma proteína HABP que é detectada por coloração enzimática com peroxidase de rábano. Por exemplo, a HABP pode ser biotinilada e detectada com avidin ou straptavidin conjugado com a proteína detectável, tal como peroxidase de rábano-estreptavidina (ver Exemplo 6 abaixo). Em outros exemplos, os diagnósticos de acompanhamento HABP são conjugados com proteínas detectáveis que permitem a detecção direta, tais como, por exemplo, diagnósticos de acompanhamento HABP conjugados com uma proteína fluorescente, proteína ou enzima bioluminescente. Vários métodos de coloração enzimáticos são conhecidos na arte para a detecção de uma proteína de interesse. Por exemplo, as interações enzimáticas podem ser visualizadas utilizando diferentes enzimas tais como a peroxidase, fosfatase alcalina, ou diferentes cromogênios, tais como DAB, AEC ou Fast Red. Em outros exemplos, os diagnósticos de acompanhamento HABP são conjugados com peptídeos Ou proteínas que podem ser detectados através de um parceiro ou anticorpo de ligação marcado.
[0343] EM outros exemplos, o HA é detectado por métodos de HC utilizando um diagnóstico de acompanhamento HABP aqui fornecido, em que os diagnósticos de acompanhamento HABP são detectados por reagentes secundários marcados, como anticorpos marcados que reconhecem um ou mais epítopos HABPs, domínios de ligação HABP, ou fragmentos de ligação ao HA. Em outros exemplos,
diagnóstico de acompanhamento HABP são detectados utilizando um anticorpo anti-HABP. Para a detecção de uma HABP, qualquer anticorpo anti-HABP pode ser utilizado, desde que se ligue à HABP, domínio ligação HABP, ou um fragmento de ligação ao HA seu, usado para detectar HA. Por exemplo, para a detecção de TSG-6 ou um TSG-6-LM, um anticorpo monoclonal do módulo de ligação anti -TSG-6 pode ser utilizado, tais como anticorpos designados A38 e Q75 (ver, Lesley et al. (2002) 3 Biol Chem 277:26600-26608). Os anticorpos anti-HABP podem ser marcados para detecção ou podem ser detectados com um anticorpo secundário que se liga ao primeiro anticorpo. A seleção de um anticorpo anti- HABP apropriado está dentro do nível de um especialista na arte.
[0344] Os espécimes marcados resultantes são, cada um fotografado usando um sistema para a visualização do sinal detectável e aquisição de uma imagem, tal como uma imagem digital da coloração. Os métodos para a aquisição de imagens são bem conhecidos por um perito na arte. Por exemplo, uma vez que a amostra foi colorida, qualquer dispositivo de imagem óptico ou não óptico pode ser usado para detectar a coloração ou marca de biomarcadores, como, por exemplo, microscópios ópticos verticais ou invertidos, microscopia confocal de varredura, câmeras, microscópio eletrônico de digitalização ou tunelamento, microscópios de sonda e detectores infravermelhos de imagem. Em alguns exemplos, a imagem pode ser capturada digitalmente. As imagens obtidas podem então ser utilizadas para determinar quantitativamente ou semi-quantitativamente, a quantidade de HA na amostra. Vários sistemas de processamento, digitalização e análise automática de amostras, adequados para uso com imuno-histoquímica, estão disponíveis na arte. Tais sistemas “podem incluir coloração automática e varredura microscópica, análise de imagem computadorizada, a comparação seção serial (para controlar a variação na orientação e tamanho da amostra), a geração de relatório digital, e arquivamento e rastreamento de amostras (como slides, nos quais, cortes de tecido são colocados). Sistemas de imagiologia celular estão comercialmente disponíveis, nos quais se combinam microscópios convencionais de luz com sistemas de processamento de imagens digitais, para realizar a análise quantitativa em células e tecidos, incluindo amostras de imunomarcação. Ver, por exemplo, o sistema CAS-200 (Becton, Dickinson & Co.). Em particular, a detecção pode ser feita manualmente ou por meio de técnicas de processamento de imagens que envolvem os processadores de computador e software. No uso de softwares, por exemplo, as imagens podem ser configuradas, calibradas, padronizadas e/ou validadas com base em fatores incluindo, por exemplo, a qualidade de coloração ou a intensidade da coloração, utilizando procedimentos conhecidos por um perito na arte (ver por exemplo, patente dos EUA publicada No. US20100136549).
[0345] A imagem pode ser quantitativamente ou semi- quantitativamente analisada e classificada com base na intensidade de coloração da amostra. Histoquímica quantitativa ou semi-quantitativa, refere-se ao método de digitalização e score das amostras que tenham sido submetidas a histoquímica, para identificar e quantificar a presença de um biomarcador especificado, tal como um antígeno ou outras proteínas (por exemplo, HA). Os métodos quantitativos ou semi-quantitativos podem empregar software de imagem para detectar densidades de coloração Ou quantidade de coloração, ou métodos de detecção de coloração pelo olho humano, em que um operador treinado classifica os resultados numericamente. Por exemplo, as imagens podem ser analisadas quantitativamente usando um algoritmo de contagem de pixels (por exemplo Aperio Spectrum Software, plataforma Automated QUantitatative Analysis (AQUAO platform), e outros métodos padrão que medem ou quantificamy ou semi-quantificamy o grau de coloração; ver, por exemplo Pat. dos EUA No. 8.023.714 ; Patente dos EUA No. 7.257.268 ; Patente dos EUA No.
7.219.016 ; Patente dos EUA No. 7.646.905, Requerimento de Patente dos EUA publicados nºs US20100136549 e 20110111435; Camp et al. (2002) Nature Medicine,8:1323-1327; Bacus, et al. (1997) Analyt Quant Cytol Histol, 19:316-328). Uma proporção de forte coloração positiva (tal como coloração marrom) para a soma do total da área colorida pode ser calculada e marcada.
[0346] Utilizando histoquímica, tal como métodos de imuno-histoquímica ou pseudo histoquímica, a quantidade de HA detectado é quantificada e dada como um score e/ou pixels positivos para HA. Por exemplo, a quantidade de HA detectado na amostra pode ser quantificada como uma porcentagem de pixels de HA positivos. Em alguns exemplos, a quantidade de HA presente em uma amostra é quantificada como a porcentagem da área colorida, por exemplo, a porcentagem de pixels de HA positivos. Por exemplo, uma amostra pode ter, pelo menos, ou cerca de, pelo menos, ou cerca de O, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11% 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%,24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34% 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais de pixels positivos de HA em comparação com a área total de coloração.
[0347] Em alguns exemplos, é atribuída uma pontuação à amostra que é uma representação numérica da intensidade ou quantidade da coloração histoquímica da amostra, e representa a quantidade de biomarcador alvo (por exemplo, HA) presente na amostra. Aos valores de densidade óptica ou área percentual podem ser atribuídos uma pontuação em escala, por exemplo, em uma escala de número inteiro, por exemplo, 0-10, 0-5, ou 0-3. Em exemplos particulares, a quantidade de hialuronan em que uma amostra é classificada em uma escala de 0-3, por exemplo, 0, HA", HA”, e HA”. A quantidade de HA presente é relativa à porcentagem de pixels de HA, ou seja, baixos percentuais de pixels HA indicam um baixo nível de HA, ao passo que altos percentuais de pixels de HA indicam altos níveis de HA. Scores podem estar correlacionados com porcentagens de pixels positivos de HA, de tal modo que a porcentagem da superfície que está pintada é pontuada como 0, HA, HA”, e HA*?, representando nenhuma coloração, menos de 10% de coloração, 10-25% de coloração ou mais de 25% de coloração, respectivamente. Por exemplo, se a razão (por exemplo, forte coloração de pixel para área colorida total) é maior do que 25%, o tecido tumoral é marcado, como HA+3, se a proporção é de 10-25% de forte coloração positiva para coloração total, o tecido tumoral é pontuado como HA+2, se a proporção for inferior a 10% de forte coloração positiva para coloração total, o tecido tumoral é pontuado, como HA+l1, e se a proporção de forte coloração positiva para coloração total é de O, o tecido tumoral é pontuado como 0. Uma pontuação de O ou HA+l indica baixos níveis de HA na amostra analisada, enquanto uma pontuação de HA +2 ou +3 indica altos níveis de HA nas amostras testadas.
b. Ensaios de ligação de Fase Sólida
[0348] Os métodos para avaliar a acumulação de hialuronan baseiam-se na capacidade de um diagnóstico de acompanhamento de HABP de se ligar ao HA de uma amostra, de tal modo que, a quantidade do diagnóstico de acompanhamento de HABP que se liga ao HA, está correlacionada com a quantidade de HA na amostra. Em especial, ensaios de ligação em fase sólida, podem ser usados. Exemplos de ensaios de ligação que podem ser utilizados para avaliar, determinar, quantificar e/ou de outro modo especificamente, detectar a expressão, ou níveis de hialuronan em uma amostra incluem, mas não estão limitados ao ensaio imunoenzimático (ELISA), radioimunoensaio (RIA), ensaio imunorradiométrico, ensaio de fluorescencia, ensaio quimioluminescente, ensaio bioluminescente. Por exemplo, um diagnóstico de acompanhamento de HABP aqui fornecido pode detectar HA utilizando qualquer ensaio de ligação conhecido por um perito na arte, incluindo mas não se limitando ao ensaio imunoenzimático (ELISA), ou qualquer outro imunoensaio semelhante, incluindo um ELISA por sandwich ou competitivo. Exemplos de métodos aqui proporcionados incluem métodos baseados em ELISA para a detecção quantitativa ou semi-quantitativa da quantidade de HABP que se liga ao HA de uma amostra, tal como uma amostra de tecido de tumor ou amostra de fluido, a partir de um indivíduo que tem um tumor ou com suspeita de ter um tumor. Ensaios de ligação em fase sólida podem ser utilizados quando HA é detectado em um fluido corporal.
[0349] Como aqui descrito, os pacientes que exibem níveis elevados de produção de hialuronan no tecido do tumor, também apresentam níveis elevados de hialuronan no sangue. Deste modo, os métodos aqui proporcionados abrangem métodos de predição da capacidade de resposta do indivíduo ao tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, a escolha para o tratamento de indivíduos com uma enzima que degrada hialuronan, ou para monitorar o tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, incluem a avaliação da acumulação de hialuronan em uma amostra de fluido, a partir de um paciente com um tumor, ou de um doente suspeito de ter um tumor.
[0350] Amostras de fluidos para análise da produção de HA em uma doença associada ao HA, tais como câncer, incluem mas não estão limitadas a soro, urina, plasma, fluido cérebro-espinal, e linfa. O indivíduo pode ter ou ser suspeito de ter um câncer, tal como tumores primários e metastáticos, na mama, cólon, reto, pulmão, estômago, ovário, colo uterino, útero, testículos, bexiga, próstata, tiróide, câncer do pulmão. Em exemplos particulares, o câncer é um câncer em estágio avançado, um câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer do ovário, carcinoma in situ (ISC), carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama, câncer de cólon.
[0351] Em métodos exemplares para prever a capacidade de resposta do indivíduo a um tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, ou para selecionar indivíduos em tratamento com uma enzima que degrada hialuronan, a coleta de uma amostra de fluido de um indivíduo, é geralmente efetuada antes do tratamento do indivíduo com uma enzima que degrada hialuronan. Em métodos exemplares de terapia de acompanhamento de um tumor com uma enzima que degrada hialuronan, a coleta da amostra de fluido a partir de um indivíduo, pode ser efetuada antes, durante ou depois do referido indivíduo ter recebido um ou mais tratamentos com uma enzima degradadora de hialuronan. A coleta da amostra de fluido pode também ser realizada antes, durante, ou após o respectivo indivíduo ser submetido a um ou mais ciclos de terapia anti-câncer, tais como radiação e/ou quimioterapia.
[0352] A amostra de fluido, em seguida, pode ser avaliada para a presença ou a quantidade de HA, usando um ensaio de ligação em fase sólida. Os ensaios de ligação em fase sólida podem detectar um substrato (por exemplo, HA) em uma amostra de fluido através da ligação do substrato a um agente de ligação que está fixado ou imobilizado sobre uma superfície sólida. Um anticorpo específico de substrato ou da proteína de ligação (por exemplo, uma HABP aqui proporcionada), acoplado ao marcador detectável (por exemplo, uma enzima), é aplicado e deixado para ligar-se ao substrato. A presença do anticorpo ou proteína de ligação é então detectada e quantificada. Os métodos de detecção e de quantificação incluem, mas não estão limitados aos métodos, colorimétrico, fluorescente, luminescente ou métodos radioativos. A escolha do método de detecção é dependente do marcador detectável utilizado. Em alguns exemplos, uma reação colorimétrica utilizando a enzima ligada ao anticorpo. Por exemplo, as enzimas geralmente utilizadas neste método incluem a peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. A quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de cor produzida. Um padrão de substrato é geralmente utilizado para melhorar a precisão quantitativa. A concentração de HA em uma amostra pode ser calculada por interpolação dos dados para a curva padrão. A quantidade de HA pode ser expressa como uma concentração de amostra de fluido.
[0353] Em um método exemplar, um reagente HABP que é geralmente não marcado é primeiro imobilizado sobre um suporte sólido (por exemplo, revestido nos poços de uma placa de microtitulação), seguido por incubação com uma amostra de fluido contendo HA (por exemplo, soro ou plasma) para capturar o HA. Depois de se lavar a amostra de fluido com um tampão apropriado, a ligação ao HA pode ser detectada. Em alguns exemplos para detectar a ligação ao HA, uma segunda HABP que é a mesma ou diferente da HABP imobilizada, e que é marcado (HABP marcada), tal como uma HABP biotinilado, é usada para se ligar ao HA sobre a placa. Após a remoção da HABP marcada não ligada, a HABP ligada marcada é detectada através do uso de um reagente de detecção. Por exemplo, a biotina pode ser detectada usando um reagente de detecção avidina. Em alguns exemplos, a HABP ligada à placa é diferente da HABP usada para a detecção. Em outros exemplos, a HABP ligado à placa e a HABP para detecção são a mesma. Em outros exemplos, para detectar a ligação ao HA, esta é detectada por adição de HABP e subsequente adição de um anticorpo anti-HABP. Por exemplo, para a detecção de TSG-6 Ou TSG-6-LM, um anticorpo monoclonal do módulo de ligação anti-TSG-6 pode ser utilizado, tais como os anticorpos designados A38 e Q75 (ver, Lesley et al. (2002) J Biol Chem 277:26600-26608). Os anticorpos anti-HABP podem ser marcados para detecção Ou podem ser detectados com um anticorpo secundário que se liga ao primeiro anticorpo. Ainda em outros exemplos para detectar a ligação ao HA, a referida está diretamente detectada com um anticorpo anti-HA. Os anticorpos anti-HA, são bem conhecidos por um perito na arte, e incluem, por exemplo, um anticorpo policlonal anti-hialuronan de ovelha (por exemplo, Abcam t* 53842 e À 93321).
c. Ensaios de imagem in vivo
[0354] Em alguns exemplos aqui presentes, a quantidade de HA é detectada através de métodos de imagem in vivo. Em tais métodos, a HABP, tal como um TSG-6-LM, multímero ou uma variante sua (por exemplo, TSG-6LLM-Fc), é conjugada com uma porção detectável ou uma fração que é capaz de detecção por um método de imagem. Métodos de imagem exemplares incluem, mas não estão limitados a,
imagem de fluorescência, os raios X, métodos de ressonância magnética, tais como imagiologia por ressonância magnética (MRI) e espectroscopia de ressonância magnética (MRS), e métodos de tomografia, incluindo a tomografia computorizada (CT), tomografia axial computadorizada (CAT) computadorizada por feixe de elétrons (EBCT), computadorizada de alta resolução (TCAR), tomografia hipocicloidal, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada espiral e tomografia ultra-sônica. Por exemplo, para imagens de fluorescência, os sinais fluorescentes podem ser analisados utilizando-se um microscópio fluorescente ou estereomicroscópio de fluorescência. Além disso, uma câmera em baixa luz também pode ser usada.
[0355] Em particular, a HABP, tal como TSG-6-LM, multímero ou uma variante sua (por exemplo,TSG-6LLM-Fc), é marcado ou conjugado com uma unidade que fornece um sinal ou induz um sinal que é detectável in vivo, quando trabalhada, tal como, mas não se limitando, a ressonância magnética (MRI), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia por emissão de pósitrons (PET), a cintilografia, câmera de gama, um detector de B+, um detector de y, imagem de fluorescência e imagem de bioluminescência. os métodos de imagem/monitoramento ilustrativos incluem qualquer um de uma variedade de métodos de ressonância magnética, como a imagem por ressonância magnética(MRI) e espectroscopia por ressonância magnética (MRS), e também incluem qualquer um de uma variedade de métodos tomográficos incluindo tomografia computadorizada (CT), tomografia axial computadorizada (CAT), computadorizada por feixe de elétrons (EBCT) computadorizada de alta resolução (TCAR), tomografia hipocicloidal, tomografia por emissão de pósitrons (PET), raios gama (após a aniquilação de um pósitron e um elétron em PETscan), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), tomografia computadorizada espiral e tomografia ultra-sônica. Outros métodos de imagem exemplar incluem imagens com pouca luz, raios-X, sinal de ultra-som, absorção de fluorescência e bioluminescência. Além disso, as proteínas podem ser marcadas com emissores de luz ou outros compostos emissores de espectro eletromagnético, tal como os compostos ou moléculas fluorescentes. A detecção pode ser efetuada através da detecção de luz emitida ou outra radiação eletromagnética emitida.
[0356] os marcadores detectáveis incluem reagentes com elementos diretamente detectáveis (por exemplo radiomarcados) e reagentes com elementos detectáveis indiretamente (por exemplo, um produto de reação). A seção C.3.c também descreve marcadores detectáveis. Exemplos de marcadores detectáveis incluem radioisótopos, compostos bioluminescentes, compostos quimioluminescentes, compostos fluorescentes, quelatos de metais e enzimas. Um marcador detectável pode ser incorporado em uma HABP por métodos recombinantes Ou químicos.
[0357] Marcadores adequados para imagiologia de raios-X são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, bismuto (III), ouro (III), lantânio (III) ou chumbo (II); um íon radioativo, tal como 67Copper, 67Gallium, 68Gallium, l11INdium, 113Indium, 123Iodine, 125Iodine, 131Iodine, 197Mercury, 203Mercury, l86Rhenium, 188Rhenium, 97Rubidium, 103Rubidium, 99Technetium ou 90Yttrium; um isótopo de spin- ressonância magnética nuclear, tais como o cobalto (IT), cobre (II), cromo (III), Disprósio (III), Érbio (III), Gadolínio (III), Hólmio (III), ferro (II), Ferro (III),
manganês (II), neodímio (III), níquel (II), samário (III) térbio (III), vanádio (II) ou itérbio (III); rodamina ou fluoresceína.
[0358] Os agentes de contraste são utilizados para a ressonância magnética. Exemplos de agentes de contraste incluem ferro, ouro, gadolínio e gálio. Marcadores “adequados para imagiologia por ressonância magnética são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, flúor, quelatos de gadolínio, metais e óxidos de metais, tais como, por exemplo, de ferro, de gálio, ouro, gadolínio, magnésio, compostos marcados “H, “F, ºC, e “N. O uso de quelatos em agentes de contraste é conhecido na arte. Marcadores adequados para métodos de imagiologia por tomografia são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, Bremissores, tais como "o, *N, “Vo ou” ”Cu ou (b) yY- emissores, tais como “ºI. Outros radionuclídeos exemplares que podem ser utilizados, por exemplo, como marcadores para a PET incluem “co, “Ga, “Ga, “Cu(II), Sou(II), Tc, Ni, Fe e **F. O reagente, tal comoTSG-6 Ou a sua porção FC pode ser conjugada para um marcador e/ou a proteína adequada pode incluir um marcador radioativo nas suas moléculas constituintes.
[0359] Uma lista com exemplos de radionuclídeos úteis para os métodos de imagem fornecidos aqui inclui, por exemplo, carbono, “Flúor, “Pearbono, UPNitrogênio, "Nitrogênio, “Poxigênio, “Flúor, “Flúor, “sódio, * Fosfato, “Potássio, cromo, Ferro, “Ferro, Cobalto, “Cobalto, cobre, “Gálio, “ºGálio, "Selênio, “criptônio, CRubídio, PEStrôncio, ”PEstrôncio, Pítrio, *Tecnécio, 1ºPpaládio, óRutênio, “Índio, “Lutécio, “Iodo, “Iodo, “Iodo, "PxXxenônio, Vcésio, 1 Ssamário, *PGadolínio, *Disprósio, !6HÓI1mio, ““Itérbio, “Leutium, **Rênio, *ºRênio, “*Irídio,
ouro, ?Tálio, ?!'ASstatina, *VBismuto e **Bismuto. Um dos peritos na arte pode alterar os parâmetros utilizados em diferentes métodos de imagem (MRI, por exemplo), a fim de visualizar diferentes radionuclídeos/metais.
[0360] Os marcadores fluorescentes podem também ser utilizados. Estes incluem as proteínas fluorescentes sondas fluorescentes ou substrato fluorescente. Por exemplo, as proteínas fluorescentes podem incluir, mas não estão limitadas a, proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP), ou seus homólogos Ou RFP; corantes fluorescentes (por exemplo, fluoresceína e os seus derivados, tais como isotiocianato de fluoresceína (FITC) e Oregon Greene O, rodamina e seus derivados (por exemplo, vermelho Texas e isotiocianato tetrametil rodamina (TRITC)), biotina, ficoeritrina, AMCA, Alexa FluorO, Li-CORO, CyDyesO ou DyLightoe Fluors); tdTomato, mCherry, mPlum, Neptune, TagRFP, mKate2, TurboRFP e TurboFP635 (Katushka). O reagente fluorescente pode ser escolhido com base na excitação desejada do usuário e os espectros de emissão. Substratos fluorescentes também podem ser utilizados, e resultam em produtos de clivagem fluorescente.
[0361] Os métodos in vivo de imagens podem ser utilizados para o diagnóstico de tumores ou cânceres associados ao HA. Essa técnica permite o diagnóstico, sem o uso de biópsia. Os métodos de imagem in vivo com base na medida ou grau de ligação de uma HABP a um tumor, podem também ser usados para prognóstico de doentes com câncer. Os métodos de imagem in vivo também podem ser utilizados para detectar cânceres metastáticos em outras partes do corpo ou células tumorais circulantes (CTC). Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar os níveis de base de hialuronan em outros tecidos, além dos tumores.
Tumores que expressam hialuronan terão maiores níveis de sinal do que os tecidos antecedentes. Em alguns exemplos, um critério de limiar pode ser determinado por meio de comparações de sinal detectado em indivíduos normais ou saudáveis.
2. Classificação de indivíduos
[0362] Uma vez que a quantidade de hyaluonan na amostra é determinada, o valor pode ser comparado com um nível de limiar ou de controle. O controle ou o nível de limiar é geralmente um nível de limiar predeterminado, ou quantidade que é indicativa de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, um tumor ou câncer). Tal nível ou quantidade pode ser determinada empiricamente por um perito na arte. Entende-se que os critérios de seleção ou de classificação específicos predeterminados, para os métodos aqui descritos, são dependentes do ensaio particular que é usado para detectar o hialuronan e da amostra particular a ser testada. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar se um ensaio é compatível com o teste de uma amostra em particular. Geralmente, os ensaios in vitro em fase sólida são utilizados para testar amostras de fluidos corporais. Os ensaios de fase sólida, tais como histoquímica ou imuno- histoquímica são geralmente usados para testar amostras de tecido. Entende-se também que, em métodos que envolvem as comparações com um nível ou quantidade predeterminada, Ou para um controle ou uma amostra de referência, que as referências são feitas com o mesmo tipo de amostra e utilizando o mesmo ensaio e reagente HABP (incluindo a mesma porção detectável e método de detecção).
[0363] Por exemplo, o nível de limiar predeterminado pode ser determinado com base no nível ou quantidade do marcador em uma amostra ou referência de controle, tal como o nível médio ou mediano, ou quantidade do marcador em uma população de indivíduos, de modo a avaliar as diferenças de níveis ou expressão. Em um exemplo, o nível de limiar predeterminado pode representar o nível médio ou mediano, ou a quantidade de hialuronan em uma amostra de um indivíduo saudável, ou de um indivíduo conhecido por ter uma doença ou condição associada a hialuronan (por exemplo, um tumor ou câncer). Em uma modalidade, o nível ou a quantidade predeterminada de hialuronan de um tecido normal ou amostra de fluido corporal é o nível médio ou a quantidade observada nas amostras normais (por exemplo, todas as amostras normais analisadas). Em uma outra modalidade, oO nível ou a quantidade de hialuronan a partir de um tecido normal ou amostra de fluido corporal é o valor médio para o nível ou a quantidade observada nas amostras normais. O nível de limiar predeterminado pode também ser baseado no nível ou quantidade de hialuronan em uma linhagem de células ou outra amostra de controle (por exemplo, linhagem de células de tumor). Tal como descrito abaixo, estes valores predeterminados podem ser determinados por comparação Ou conhecimento dos níveis de HA em uma amostra normal correspondente, tal como determinado pelo mesmo ensaio de detecção e utilizando o mesmo reagente HABP.
[0364] A amostra ou referência de controle pode ser um outro tecido, células ou fluido corporal, tal como um tecido, célula ou fluido corporal, por exemplo, um tecido, célula ou fluido corporal que é análogo ao da amostra a ser testada, mas isolado a partir de um indivíduo diferente. O controle ou indivíduo de referência pode ser um indivíduo ou uma população de indivíduos normal (ou seja, que não tenha uma doença ou condição), um indivíduo que tem uma doença, mas não tem o tipo de doença Ou condição que o indivíduo testado possui ou é suspeito de ter, por exemplo, um indivíduo que não tem uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, um tumor ou câncer), ou um tecido análogo de outro indivíduo que tem uma doença ou condição semelhante, mas cuja doença não é tão grave e/ou expressa relativamente menos hialuronan. Por exemplo, quando a célula, tecido ou fluido a ser testado é um indivíduo ou uma população de indivíduos que possuem um tipo de câncer, o nível ou a quantidade do marcador pode ser comparado com o nível ou a quantidade do marcador em um tecido, células ou fluido de um indivíduo que tem um câncer menos grave, tal como um câncer em estágio inicial, diferenciado ou outro tipo de câncer. Em outro exemplo, uma amostra ou controle de referência é um fluido, tecido, extrato (por exemplo, celular ou extrato nuclear), ácido nucleico ou preparação de peptídeos, linhagem celular, biopsia, amostra padrão ou outra, com uma quantidade conhecida ou quantidade relativa de hialuronan, tal como uma amostra, por exemplo, uma linhagem de células de tumor, conhecida por expressar níveis relativamente baixos de HA, tais como linhagens de células de tumores exemplares que expressam baixos níveis de HA, por exemplo, linhagem celular HCT 116, a linhagem célular HT29, linhagem celular NCI H460, linhagem celular DUl45, linhagem celular Capan-l, e tumores de modelos de tumores gerados utilizando tais linhagens celulares.
[0365] Em qualquer método aqui descrito, o nível (ou níveis) de hialuronan em amostras de indivíduos conhecidos ou suspeitos de sofrer de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer) pode ser determinado em simultâneo com a determinação do nível (ou níveis) de hialuronan em referência ou tecidos normais. Alternativamente, os níveis de hialuronan em amostras de indivíduos conhecidos ou suspeitos de sofrer de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer podem ser comparados com o nível (ou níveis) de hialuronan previamente determinado no tecido normal ou fluido corporal. Assim, o nível de hialuronan em amostras normais ou saudáveis ou de outras amostras de referência utilizadas em qualquer detecção, comparação, determinação, ou avaliação pode ser um nível ou quantidade determinada antes de qualquer detecção, determinação ou avaliação do nível ou da quantidade de hialuronan, em uma amostra de um paciente humano.
[0366] O nível ou a quantidade de hialuronan é determinado e/ou pontuado, e comparado com os fenótipos predeterminados de hialuronan associados à doença. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar o nível de limiar para o diagnóstico de doenças, dependendo da doença em particular, o ensaio a ser utilizado para a detecção do hialuronan e/ou do reagente de detecção à HABP sendo utilizada. Está dentro do nível de um especialista na técnica, determinar o nível de limiar do hialuronan para classificar a resposta ao tratamento com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Exemplos de métodos para a estratificação das amostras tumorais ou amostras de fluidos corporais para oO diagnóstico, prognóstico ou a seleção de indivíduos para o tratamento, são fornecidos aqui.
[0367] Entende-se que a mudança em particular, por exemplo, aumento ou diminuição do hialuronan é dependente do ensaio utilizado. Em um ensaio ELISA, aumento ou decréscimo na absorvância a um comprimento de onda particular ou da quantidade de proteína (por exemplo, tal como determinado por meio de uma curva padrão) pode ser expresso em relação a um controle. Em um ensaio de PCR, tal como RT-PCR, pode ser comparado ao controle dos níveis de expressão (por exemplo, expressos como alteração de vezes) utilizando métodos conhecidos pelos especialistas na arte, tal como o uso de padrões.
[0368] Nos exemplos particulares dos métodos aqui descritos, um indivíduo é selecionado como um candidato para a terapia com um agente anti-hialuronan, se a quantidade de hialuronan está determinada a ser elevada na amostra. Por exemplo, os níveis elevados ou acumulados de hialuronan em um indivíduo doente, em comparação com um indivíduo saudável ou normal, são indicativos de uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, tumor ou câncer). O hialuoronan pode ser elevado a 0,5 vezes, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais. Assim, em exemplos dos métodos aqui descritos, quando a quantidade de hialuronan em uma amostra de um indivíduo está para ser testada, a detecção do marcador pode determinar se a quantidade de HA para a amostra (por exemplo, células cancerosas, tecido ou fluido) do indivíduo é elevada, em comparação com um nível ou quantidade predeterminada, ou amostra de controle. Em um exemplo, o indivíduo é determinado para ter uma doença ou condição associada ao hialruonan, se a quantidade de HA no tecido, células ou fluido for elevada a, ou cerca de 0,5 vezes, |] vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 20 vezes, ou mais, em comparação com o nível ou quantidade predeterminada, Ou valor, ou amostra de controle.
[0369] Um indivíduo pode ser selecionado como um candidato para terapia com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan) com base no nível ou quantidade de hialuronan de uma amostra (por exemplo, um fluido corporal ou outro fluido) do indivíduo. HA maior do que 0,010 pg/mL, 0,015 pg/ml, e, geralmente, maior do que 0,02 po/mL, 0,03 pg/mL, 0,04 pg/mL, 0,05 vg/mL, 0,06 pg/ml ou superior, tem correlação com a presença de um tumor ou câncer. Utilizando tais métodos, nos métodos exemplificativos aqui proporcionados, um indivíduo pode ser selecionado para o tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan), se a concentração de HA na amostra de fluido, tal como uma amostra de soro, contém níveis de HA maiores do que 0,010 upg/mL, 0,015 pg/ml, e, geralmente, maior do que 0,02 ug/mL, 0,03 pg/mL, 0,04 pg/mL, 0,05 pg/mL, 0,06 vg/mL ou superior.
[0370] Um indivíduo pode ser selecionado como um candidato para terapia com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) com base no nível ou na quantidade de hialuronan em uma amostra celular ou tecido. Em um exemplo, se o nível é indicativo de doença, então o paciente é diagnosticado com uma doença ou condição associada a hialuronan. Por exemplo, usando métodos de imuno-histoquímica de tecidos do tumor um score de HA? ou HAº* pode ser determinante da doença. Por exemplo, uma porcentagem de coloração de HA sobre a área total tumoral superior a 10%, tal como 10 a 25%, ou maior do que 25% é indicativa de doença. Nos métodos aqui descritos, um indivíduo é selecionado para o tratamento com um agente anti-hialurônico (por exemplo, uma enzima que degrada o hialuronan), se o score em escala da amostra é uma amostra HA? ou HA”. Por exemplo, uma pontuação mais alta, por exemplo, HA , indica que o indivíduo tem um tumor rico em HA, indicativo da presença de um tumor que se beneficiaria do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuonan) e assim é um candidato para terapia com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Em outros exemplos, um indivíduo pode ser selecionado para O tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) com base na porcentagem de coloração, por exemplo, se o grau de coloração de HA é de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, da área de coloração total, e geralmente pelo menos 25% ou mais.
[0371] A eficácia do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), ou a capacidade de resposta ao tratamento, também pode ser monitorizada por meio da comparação do nível ou da quantidade de hialuronan de um indivíduo ao longo do tempo. Alterações no nível ou na quantidade de hialuronan podem ser utilizadas para otimizar a dosagem ou a programação do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). No método, o nível de expressão em amostras de HA, em particular, avaliado em tecidos tumorais (por exemplo, por meio de imuno-histoquímica ou outro método semelhante), a partir de indivíduos tratados, é comparado com um nível predeterminado de expressão de HA. Para efeitos de monitoramento do tratamento após a administração de uma enzima degradadora de hialuronan, em particular, uma com meia-vida prolongada (por exemplo, PEGPH20), a amostra que é controlada não é um fluido corporal, em que os níveis sistêmicos de enzima podem estar presentes.
[0372] Para fins de tratamento de monitoramento, o nível predeterminado de HA pode ser a partir de um indivíduo normal ou saudável, um valor de linha de base de HA anterior ao tratamento, o nível de HA medido anteriormente, no mesmo indivíduo em um momento anterior após o tratamento, ou uma classificação ou estratificação dos níveis de HA conhecidos por estarem associados com a progressão ou regressão da doença.
Por exemplo, se o nível de hialuronan é aproximadamente o mesmo ou inferior (ou diminuído) em relação a referencia ou amostra de controle, o tratamento é provavelmente eficaz e pode ser continuado ou interrompido, ou alterado.
Por exemplo, o nível predeterminado de HA pode ser os níveis de HA a partir de uma amostra de tecido normal ou saudável, e se o nível de HA medido no indivíduo depois de tratamento é maior do que os níveis normais de AH, então o tratamento é retomado ou continuado.
Por exemplo, o nível predeterminado de HA pode ser o nível de HA, como determinado a partir de um valor de linha de base de HA antes do tratamento, e o curso do tratamento determinado em conformidade.
Por exemplo, se o nível de HA é o mesmo que o HA de base, então o tratamento é continuado ou retomado, se o nível de HA é maior do que o da linha de base de HA, então, o tratamento é continuado ou restabelecido, ou o tratamento é acelerado ou aumentado (por exemplo, aumentando a dose de enzima degradadora de hialuronan ou aumentando o esquema de dose de um ciclo de regime de dosagem), se o nível de HA é inferior a linha de base de HA, então, o tratamento é continuado ou retomado, ou encerrado ou reduzido(por exemplo, diminuindo a dosagem de enzima degradadora de hialuronan ou diminuindo a posologia em um ciclo de regime de dosagem). Em um outro exemplo, o nível predeterminado de HA pode ser o nível de HA, como determinado em uma medida de um curso de tratamento anterior com o mesmo indivíduo.
Por exemplo, se o nível de HA é o mesmo que o HA anteriormente medido, então o tratamento é continuado ou retomado, se o nível de HA é maior do que o HA medido anteriormente, então, o tratamento é continuado ou restabelecido, ou acelerado ou aumentado (por exemplo, através do aumento da dosagem de enzima degradadora de hialuronan ou aumentando o esquema de dose de um ciclo de regime de dosagem), se o nível de HA é menor do que o HA medido anteriormente, então, o tratamento é continuado ou retomado, encerrado ou reduzido (por exemplo, diminuindo a dosagem da enzima que degrada hialuronan ou diminuindo o esquema de dose em um ciclo de regime de dosagem) .
[0373] Nos métodos de monitoramento e métodos de determinação da eficácia do tratamento, a terapia particular pode ser alterada durante o decorrer do tratamento, para maximizar a resposta individual. A dosagem e programação do tratamento podem ser modificadas em resposta às mudanças de níveis. A terapia de combinação com outros agentes anti-câncer também pode ser utilizada em tais métodos de tratamento. Está dentro do nível da perícia do médico assistente determinar O curso exato de tratamento. Por exemplo, o tratamento pode ser modificado, de tal modo que a quantidade de dosagem, programação (por exemplo, a frequência de administração), Ou oO regime é ajustado em conformidade, tal como descontinuado, diminuído ou tornado menos frequente, ou em combinação com um segundo tratamento para a doença ou condição. Por outro lado, se o nível de hialuronan está acima de uma referência ou amostra de controle comparada, é provável que o paciente não responda ao tratamento. Em tais casos, a natureza e o tipo particular de agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) ou terapia de combinação podem ser modificados ou alterados. Em outros casos, a dosagem, quantidade, programação e/ou o regime pode ser ajustado de acordo, tal como aumentado ou tornado mais frequente. Está incluído no nível do tratamento, o médico para determinar o curso exato do respectivo tratamento.
[0374] Para efeitos de monitoramento da eficácia do tratamento, os níveis ou quantidades predeterminadas de hialuronan podem ser determinados empiricamente, em que oO nível ou quantidade indica que o tratamento está funcionando. Estes valores predeterminados podem ser determinados por comparação ou conhecimento dos níveis de HA em uma amostra normal correspondente, ou amostras de pacientes com a doença tal como determinada pelo mesmo ensaio de detecção e utilizando o mesmo reagente HABP. Por exemplo, os elevados níveis de HA, tal como avaliado por métodos de imuno-histoquímica utilizando um esquema de pontuação quantitativa (por exemplo, HA”) ou a porcentagem de coloração do tumor para o hialuronan maior do que 25% é correlata com a existência de doença maligna em uma variedade de tipo de câncer, e indica que o paciente não está respondendo ao tratamento. Em outro exemplo, os níveis de HA em fluidos corporais tais como o plasma maior do que 0,015 upg/mL, e, geralmente, maior do que 0,02 ug/ml, tal como 0,03 ug/mL, 0,04 pg/mL, 0,05 pg/ml ou 0,06 pg/ml de HA, estão associados com doença em estágio avançado. Por outro lado, é provável que um indivíduo esteja respondendo ao tratamento, se a escala de média da amostra é inferior a HA”? ou HA”, ou se a porcentagem de coloração de HA é inferior a 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou menos. Um indivíduo é susceptível de resposta ao tratamento, se o nível de HA em fluidos corporais tais como o plasma é inferior a 0,03 ug/mL, 0,02 pg/mL, 0,01 pg/mL ou menos.
[0375] Nos métodos aqui descritos, a comparação de um nível predeterminado ou níveis de uma amostra de controle ou de referência pode ser determinada por qualquer método conhecido pelos peritos na arte. Por exemplo, a comparação de um nível de hialuronan com uma referência,
controle ou nível predeterminado pode ser realizada por um sistema automatizado, tal como o programa de software ou sistema de inteligência que seja parte de, ou compatível com o equipamento (por exemplo, plataforma de computador) em que o ensaio é realizado. Alternativamente, esta comparação pode ser realizada por um médico ou outro profissional treinado, ou experiente ou técnico.
E. TRATAMENTO DO INDIVÍDUO SELECIONADO COM UM AGENTE ANTI- HIALURONAN
[0376] Os métodos aqui proporcionados incluem métodos de tratamento de um indivíduo portador de um tumor, com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, em que o indivíduo foi selecionado para o tratamento com base no nível de HA detectado no tumor. Os métodos de tratamento incluem métodos para avaliar os efeitos do tratamento com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tal como a eficácia de um tratamento, tal como, por exemplo, a inibição ou regressão do tumor, ou efeitos colaterais do tratamento, tal como por exemplo, efeitos colaterais músculo-esqueléticos. Terapias combinadas com um ou mais agentes anti-câncer adicionais, ou um agente para o tratamento de um ou mais efeitos colaterais da terapia com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada o hialuronan) também são fornecidos.
1. Agente anti-hialuronan
[0377] Os agentes anti-hialuronan incluem agentes que inibem a síntese de hialuronan ou degradam hialuronan. os agentes anti-hialuronan, tais como as enzimas degradantes de hialuronan, podem ser utilizadas para tratar uma doença ou condição associada ao hialuronan, incluindo tumores e cânceres, ou doenças ou estados inflamatórios. Por exemplo, a acumulação de HA, tal como por metabolismo alterado de hialuronan, a distribuição e a função associada com a artrite, doenças imunes e inflamatórias, doenças pulmonares e vasculares, e câncer (Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345:1454-1459). Tais doenças podem ser tratadas através da inibição da síntese de HA ou degradantes do HA (ver, por exemplo Morohashi 2006; pedido dos EUA publicado No. 20100003238 e Requerimento Internacional publicado PCT nº WO 2009/128917). Em alguns exemplos, tais tratamentos que diminuem os níveis de hialuronan em células e tecidos podem ser associados a efeitos secundários adversos, tais como efeitos colaterais músculo-esqueléticos. Assim, o tratamento com um agente anti-hialuronan pode incluir ainda o tratamento com um corticosteroide para melhorar Ou reduzir estes efeitos secundários.
a. Agentes que inibem a síntese de hialuronan
[0378] HA pode ser sintetizado por três enzimas, que são os produtos de três genes de mamíferos relacionados, identificados como sintases de HA, designadas como has-l, has-2 e has-3. Diferentes tipos de células expressam diferente enzimas HAS, e a expressão de HAS mRNAs está correlacionada com a biossíntese de HA. Sabe-se que O silenciamento de genes HAS em células tumorais inibe o crescimento de tumores e metástases. Um agente anti- hialuronan inclui qualquer agente que inibe, reduz Ou regula negativamente a expressão ou o nível de uma sintase de HA. Tais agentes são conhecidos por um perito na arte ou podem ser identificados.
[0379] Por exemplo, a regulação negativa de uma HAS pode ser conseguida proporcionando os oligonucleotídeos que hibridizam especificamente, ou de outra forma, interagem com uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam uma HAS. Por exemplo, agentes anti-hialuronan que inibem a síntese de hialuronan incluem moléculas sense ou anti-sense contra um gene has.
Tal inibição sense ou anti- sense é normalmente baseada na hibridização à base de ligação de hidrogênio, de fios de oligonucleotídeos ou segmentos de tal modo que, pelo menos, um fio ou um segmento seja clivado, degradado, ou de outra forma, tornado inoperável.
Em outros exemplos, o silenciamento gênicos pós- transcricional (PTGS), RNAi, ribozimas e DNAzimas podem ser utilizados.
Está dentro do nível de um especialista na arte, gerar estas construções com base na sequência de hasl (estabelecida na SEQ ID NO: 219), HAS2 (estabelecida na SEQ ID NO: 220) ou HAS3 (estabelecida na SEQ ID NO: 221). É entendido na arte, que a sequência de um composto sense ou anti-sense, não necessita ser 100% complementar à do seu ácido nucleico alvo, para ser especificamente hibridável.
Além disso, um oligonucleido pode hibridizar durante um ou mais segmentos, de tal modo que segmentos de intervenção ou adjacentes não estão envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura loop ou estrutura hairpin). Geralmente, os compostos sense ou anti-sense tem, pelo menos, 70% de complementaridade de sequência com uma região alvo no ácido nucleico alvo, por exemplo, 75% a 100% de complementaridade, tal como 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Exemplos de moléculas sense ou anti-sense são conhecidas na arte (ver por exemplo, Chao et al. (2005) JJ.
Biol.
Chem., 280:27513-27522; Simpson et al. (2002) JJ.
Biol.
Chem., 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am.
JJ.
Path.,161:849; Nishida et al. (1999) JJ.
Biol.
Chem., 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British O Dermatology, 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res., 65:6139; e Requerimento de patente publicada dos EUA No.
US20070286856).
[0380] Outro exemplo de agente anti-hialuronan que é um inibidor da síntese de HA é 4-metilumbeliferona (4-MU; 7-hidroxi-4-metilcumarina) ou um derivado seu. 4-MU age reduzindo o precursor UDP-GlIcUA, que é necessário para a síntese de HA. Por exemplo, em células de mamíferos, o HA é sintetizado por HAS usando ácido UDP-ácido glucurônico (UGA) e precursores UDP-N-acetil-D-glucosamina. 4-MU interfere com o processo pelo qual é gerado UGA, esgotando assim, a acumulação intracelular de UGA, e resultando na inibição da síntese do HA. 4-MU é conhecido por ter atividade anti-tumoral (ver por exemplo, Lokeshwar et al. (2010) Cancer Res., 70:2613-23; Nakazawa et al. (2006) Cancer Chemother. Pharmacol., 57:165-170; Morohashi et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Comm., 345-1454-1459). A administração oral de 4-MU com 600 mg/kg/d reduz metástases em 64% no modelo de melanoma Bl6 (Yoshihara et al. (2005) FEBS Lett., 579:2722-6). A estrutura de 4-MU encontra-se abaixo. Além disso, os derivados de 4-MU exibem atividade anti-câncer, em particular 6,7 dihidroxi cumarina-4-metil- cumarina e 5,7- di-hidroxi-4-metil (ver, por exemplo 4-Metilumbeliferona (4-MU; C10oHgO3) HO. O O
OS CHz3
[0381] Outros exemplos de agentes anti-hialuronan são os inibidores da tirosina quinase, tais como a leflunomida (Arava), ou genisteína ou erbstatina. Leflunomida também é um inibidor da síntese de pirimidina. A leflunomida é um medicamento conhecido para o tratamento de artrite reumatoide (RA), e também é eficaz no tratamento da rejeição de aloenxertos bem como de xenoenxertos. HA é conhecido por, contribuir direta ou indiretamente para a RA (ver, por exemplo Stuhlmeier (2005) J Immunol., 174:7376- 7382). Inibidores de tirosina quinase inibem a expressão do gene hasl (Stuhlmeier 2005).
[0382] Em um exemplo, leflunomida Ou os seus derivados, em geral, estão disponíveis na forma de comprimidos “contendo 1-100 mg de fármaco ativo, por exemplo, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg de fármaco. Para o tratamento de uma doença e condições associadas a hialuronan, por exemplo, artrite reumatoide, ou um tumor ou de câncer, é administrada a 10 a 500 mg por dia, normalmente 100 mg por dia. A dosagem pode ser continuada conforme necessário para o tratamento da doença ou condições, ou pode ser diminuída ou reduzida a doses sucessivamente mais baixas. Por exemplo, para o tratamento de artrite reumatoide, a leflunomida pode ser administrada em uma dose de carga inicial de 100 mg por dia, durante três dias e, em seguida, administrada a uma dose constante de 20 mg/dia.
b. Enzimas que degradam hialuronan
[0383] Hialuronan é um componente essencial da matriz extracelular e um dos principais constituintes da barreira intersticial. Por catalisar a hidrólise do hialuronan, enzimas que degradam hialuronan diminuem a viscosidade de hialuronan, aumentando assim a permeabilidade do tecido, e a taxa de absorção de fluidos administrados parentericamente. Como tal, as enzimas que degradam o hialuronan, tais como hialuronidases, vem sendo utilizadas, por exemplo, como agentes de dispersão ou de propagação, em conjunto com outros agentes, fármacos e proteínas para melhorar a sua dispersão e entrega.
[0384] Enzimas que degradam hialuronan atuam para degradá-lo por clivagem de polímeros de hialuronan, que são compostos de unidades de repetição de dissacarídeos, ácido D-glucurônico (GlcA) e N-acetil-D-glucosamina (GleNAC), ligados entre si através da alternância das ligações glicosídicas B-l1 — 4 e B-1 — 3. Cadeias de hialuronan podem atingir cerca de 25.000 repetições de dissacarídeo ou mais, em comprimento, e polímeros de hialuronan podem variar em tamanho de cerca de 5000 a 20.000.000 Da, in vivo. Por conseguinte, enzimas que degradam hialuronan, para as utilizações e métodos fornecidos, incluem qualquer enzima que tenha a capacidade de catalisar a clivagem de um polímero ou cadeia de dissacarídeo de hialuronan. Em alguns exemplos a enzima que degrada o ácido hialurônico cliva a ligação glicosídica fB-l> 4 na cadeia ou polímero de hialuronan. Em outros exemplos, a enzima que degrada ácido hialurônico catalisa a clivagem da ligação glicosídica B-1l » 3 da cadeia ou polímero de hialuronan.
[0385] Assim, as enzimas que degradam hialuronan, tais como hialuronidases, são uma família de enzimas que degradam o ácido hialurônico, que é um componente essencial da matriz extracelular, e um dos principais constituintes da barreira intersticial. Por catalisar a hidrólise do ácido hialurônico, um dos principais constituintes da barreira intersticial, enzimas degradantes de hialuronan diminuem a viscosidade de ácido hialurônico, aumentando assim, a permeabilidade do tecido. Como tal, enzimas degradantes de hialuronan, tais como hialuronidases, vem sendo utilizadas, por exemplo, como um agente de propagação ou de dispersão em conjugação com outros agentes, fármacos e proteínas para melhorar a sua dispersão e entrega. Enzimas degradantes de hialuronan também são utilizadas como um adjuvante para aumentar a absorção e dispersão de outros fármacos injetados, por hipodermóclise (administração subcutânea de fluido), e como um adjuvante na urografia subcutânea para melhorar a reabsorção de agentes radiopacos. Enzimas que degradam hialuronan, como por exemplo, a hialuronidase, podem ser usadas em aplicações de procedimentos oftálmicos, por exemplo, bloco de sub-Tenon e peribulbar na anestesia local antes da cirurgia oftálmica. A hialuronidase pode também ser utilizada em outros usos terapêuticos e cosméticos, por exemplo, através da promoção de acinesia em cirurgia cosmética, tais como blefaroplastias e lifting facial.
[0386] Várias formas de enzimas degradantes de hialuronan, incluindo hialuronidases foram preparadas e aprovadas para uso terapêutico em indivíduos, incluindo seres humanos. As composições e os métodos proporcionados podem ser utilizados, por meio destes e de outros usos terapêuticos, para o tratamento de doenças e condições associadas a hialuronan. Por exemplo, preparações de hialuronidase de origem animal incluem Vitrase (ISTA Pharmaceuticals), uma hialuronidase testicular de ovinos purificada, Amphadase (Amphastar "Pharmaceuticals), uma hialuronidase testicular bovina e Hydase (Prima Pharm Inc.), uma hialuronidase testicular bovina. Entende-se que qualquer preparação de hialuronidase de origem animal pode ser usada nos métodos e utilizações aqui proporcionados (ver, por exemplo, Patentes dos EUA. Nos 2.488.564
2.488.565, 2.676.139, 2.795.529, 2.806.815, 2.808.362,
5.747.027 e 5.827.721 e Pedido de Patente Internacional PCT no. WO2005/118799). Hylenex (Halozyme Therapeutics) é uma hialuronidase humana recombinante produzida pelas células de ovário de hamster chinês (CHO), geneticamente modificadas, que contêm o ácido nucleico que codifica para as formas solúveis de PH20, designadas rHuPH20.
[0387] São exemplos de enzimas que degradam hialuronan nas composições e métodos aqui proporcionados,
hialuronidases “solúveis. Outras enzimas que degradam hialuronan exemplares incluem, mas não estão limitadas a determinadas condroitinases e liases que têm a capacidade para clivar o hialuronan.
[0388] Como descrito abaixo, as enzimas que degradam hialuronan existem em formas ligadas à membrana ou solúveis que são segregadas a partir de células. Para os fins desta invenção, as enzimas que degradam hialuronan solúveis são fornecidas para uso nos métodos, utilizações, composições ou combinações aqui descritas. Assim, quando as enzimas degradantes de hialuronan incluem uma âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI) e/ou são de outro modo ancoradas à membrana ou insolúveis, tais enzimas degradadoras de hialuronan são aqui fornecidas na forma solúvel, por truncagem ou supressão da âncora de GPI, para processar a enzima secretada e solúvel. Assim, as enzimas que degradam hialuronan incluem variantes incompletas, por exemplo, incompletas para remover a totalidade ou uma porção de uma âncora de GPI. Enzimas de degradação de hialuronan aqui fornecidas também incluem alelos ou variantes de espécies, ou outras variantes, de uma enzima que degrada hialuronan solúvel. Por exemplo, enzimas degradadoras de hialuronan podem conter uma ou mais variações na sua sequência primária, tais como substituições, adições e/ou eliminações de aminoácidos. Uma variante de uma enzima degradadora de hialuronan geralmente exibe, pelo menos, ou cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência, em relação à enzima degradadora de hialuronan que não contém a variação. Qualquer variação pode ser incluída na enzima degradante de hialuronan para os fins aqui descritos, desde que a enzima retenha a atividade de hialuronidase, tal como, pelo menos, ou cerca de, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais, da atividade de uma enzima degradante de hialuronan que não contém a variação (como medido em ensaios in vitro e/ou in vivo bem conhecidos na arte, e aqui descritos).
[0389] Onde os métodos e utilizações aqui fornecidas descrevem a utilização de uma hialuronidase solúvel, de acordo com qualquer enzima degradante de hialuronan, geralmente uma enzima degradante de hialuronan solúvel, pode ser utilizada. Entende-se que qualquer hialuronidase pode ser usada nos métodos e utilizações aqui fornecidos (ver, por exemplo, Patente dos EUA. No.
7.767.429 Ee Publicação dos EUA Nºs US20040268425 e US20100143457).
i. hialuronidases
[0390] Hialuronidases são membros de uma grande família de enzimas degradantes de hialuronan. Existem três classes gerais de hialuronidases: de mamíferos, hialuronidases bacterianas e hialuronidases de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos. Tais enzimas podem ser utilizadas em composições, combinações e métodos aqui fornecidos.
(1) hialuronidases do tipo mamífero
[0391] Hialuronidases do tipo mamífero (EC
3.2.1.35) são endo-B-N-acetil-hexosaminidases que hidrolisam a ligação glicosídica B-l1 — 4 de hialuronan em vários comprimentos de oligossacarídeos, tais como tetrassacarídeos e hexassacarídeos. Estas enzimas têm ambas as atividades hidrolíticas e transglicosidase, e podem degradar hialuronan e sulfatos de condroitina (CS), em geral, C4-S e C6-S. Hialuronidases deste tipo incluem, mas não estão limitadas a, hialuronidases de vacas (bovina (SEQ ID NOS:10, 11 e 64 e BH55 (U.S. Pat. Nos. 5,747,027 e
5,827,721), moléculas de ácido nucleico apresentadas na SEQ ID NOS:190-192), ovelha (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, 27, 63 e 65, moléculas de ácido nucleico apresentadas na SEQ ID NOS:66 e 193-194), vespa amarela (SEQ ID NOS:12 e 13), abelha (SEQ ID NO:14), vespão de cara branca (SEQ ID NO:15), vespa-do-papel (SEQ ID NO:16), camundongo (SEQ ID NOS:17-19, 32), porco (SEQ ID NOS:20-21), rato (SEQ ID NOS:22-24, 31), coelho (SEQ ID NO:25), orangotango (SEQ ID NO:28), macaco cynomolgus (SEQ ID NO:29), porco-da-Guiné (SEQ ID NO:30), chimpanzé (SEQ ID NO:101), macaco rhesus(SEQ ID NO:102), e hialuronidase humana (SEQ ID NOS:1-2, 36-39). Exemplos de hialuronidase em composições, combinações e métodos aqui proporcionados são hialuronidases solúveis.
[0392] Hialuronidases de mamíferos podem ser subdivididas em aquelas que são neutro-ativas, predominantemente encontradas em extratos de testículos e ácido ativo, predominantemente encontrada em órgãos como oO fígado. Hialuronidases neutro-ativas exemplares incluem PH20, incluindo mas não se limitando a PH20 derivada de espécies diferentes, tais como ovinos (SEQ ID NOS: 27, 63 e 65), bovinos (SEQ ID NO: 11 e 64) e humanos (SEQ ID NO: 1). A PH20 humana (também conhecida como proteína da superfície de esperma PH20 ou SPAM 1), está geralmente ligada à membrana plasmática por meio de uma âncora glicosilfosfatidilinositol (GPI). É naturalmente envolvida na adesão esperma-ovo e auxiliares de penetração, pelo esperma, da camada de células do cumulus por digestão de hialuronan.
[0393] Além da PH20 humana (também denominada SPAM1), cinco genes hialuronidase semelhantes foram identificados no genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYALA4 e HYALPl. HYALP1] é um pseudo-gene e HYAL3 (SEQ ID NO: 38) não demonstrou possuir atividade enzimática para quaisquer substratos conhecidos. HYALA (polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 39) é uma condroitinase e exibe pouca atividade em relação ao hialuronan. HYAL1 (precursor polipeptídico estabelecido na SEQ ID NO: 36) é a enzima ácido-ativa prototípica e PH20 (polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1) é a enzima neutro-ativa prototípica. Hialuronidases ácido-ativas, tais como HYAL1 e HYAL2 (polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 37) não possuem geralmente atividade catalítica a um pH neutro (isto é, pH 7). Por exemplo, HYAL1I tem pouca atividade catalítica in vitro sobre pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochem. 251:263-269). HYAL2 é uma enzima ácido-ativa com uma atividade específica muito baixa in vitro. As enzimas de hialuronidase também podem ser caracterizadas por aquelas que são geralmente ligadas à membrana plasmática por meio de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) como a HYAL2 humana e a PH20 humana ((Danilkovitch-Miagkova et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(8):4580-5), e aquelas que são geralmente solúveis, tais como HYALl humana (Frost et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5).
(a) PH20
[0394] PH20, como outras hialuronidases de mamíferos, é uma endo-B-l-N-acetil-hexosaminidase, que hidrolisa a ligação glicosídica B1 - 4 de hialuronan em vários comprimentos de oligossacarídeos, tais como tetrassacarídeos e hexassacarídeos. Tem tanto uma atividade hidrolítica como transglicosidase, e pode degradar ácido hialurônico e sulfatos de condroitina, tais como C4-S e C6- S. PH20 é naturalmente envolvida na adesão esperma-ovo e auxilia a penetração por esperma da camada de células do cumulus por digestão do hialuronan. PH20 está localizada na superfície do espermatozoide e do acrossoma derivado do lisossoma, onde é ligada à membrana acrossomal interior. PH20 de membrana plasmática tem atividade hialuronidase apenas com pH neutro, enquanto PH20 da membrana acrossomal interna tem atividade sob um ph tanto neutro como ácido. Além de ser uma hialuronidase, PH20 é relatada para ser um receptor de sinalização celular induzida por HA, e um receptor para a zona pelúcida em torno do oócito.
[0395] Proteínas PH20 exemplares incluem, mas não estão limitadas aos polipeptídeos PH20 humanos (polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1, polipeptídeo maduro como explicitado na SEQ ID NO: 2), chimpanzé (SEQ ID NO:101), macaco Rhesus (SEQ ID NO:102) bovino (SEQ ID NOS: 11 e 64), coelho (SEQ ID NO: 25), ovino PH20 (SEQ ID NOS: 27, 63 e 65), macaco Cynomolgus (SEQ ID NO: 29), porco-da-Guiné (SEQ ID NO: 30), rato (SEQ ID NO: 31) e camundongo (SEQ ID NO: 32).
[0396] PH20 bovino é um precursor polipeptídico de 553 aminoácidos (SEQ ID NO: 11). O alinhamento de PH20 bovino com a PH20 humano mostra apenas uma homologia fraca com várias lacunas existentes, desde o aminoácido 470 até o respectivo carboxi, devido à ausência de uma âncora de GPI com o polipeptídeo de bovino (ver, por exemplo, Frost Gl (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). Na verdade, as âncoras GPI limpas não são previstas em muitas outras espécies de PH20 além dos seres humanos. Assim, os polipeptídeos produzidos a partir de PH20 ovinos e bovinos naturalmente existem como formas solúveis. Embora exista PH20 bovino muito sensivelmente ligado à membrana plasmática, não está ancorado por meio de uma ancoragem sensível de fosfolipase (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628-36). Esta característica única de hialuronidase bovina tem permitido a utilização da enzima hialuronidase de testículos bovinos como um extrato solúvel para uso clínico (WydaseO, HyalaseO).
[0397] A transcrição de mRNA PH20 humana é normalmente traduzida para gerar um polipeptídeo precursor de aminoácido 509 (SEQ ID NO: 1) que contém uma sequência de sinal de 35 aminoácidos no N-terminal (posições de resíduos de aminoácidos 1-35) e uma sequência de sinal de ligação à âncora glicosilfosfatidilinositol de 19 aminoácidos (GPI) na extremidade C-terminal (posições de resíduos de aminoácidos 491-509). O PH20 maduro, portanto, é um polipeptídeo de 474 aminoácidos estabelecido na SEQ ID NO:2. Seguindo o transporte do polipeptídeo precursor para o ER e remoção do peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal ligado GPI C-terminal é clivado para facilitar a ligação covalente de uma âncora de GPI com o aminoácido C-terminal recém-formado na posição de aminoácido, que corresponde à posição 490 do polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1. Assim, um polipeptídeo maduro ancorado a GPI do aminoácido 474 com uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 2, é produzido.
[0398] PH20 humana exibe atividade de hialuronidase a pH neutro e ácido. Em um aspecto, a PH20 humana é a hialuronidase neutro-ativa prototípica que está geralmente bloqueada para a membrana do plasma, por meio de uma âncora de GPI. Em um outro aspecto, PH20 é expressa sobre a membrana acrossomal interior onde tem atividade de hialuronidase a pH neutro e ácido. PH20 contém dois sítios catalíticos em regiões distintas do polipeptídeo: as regiões de peptídeo 1 e 3 (Chem et al. (2001) Matrix Biology20:515-525). As evidências indicam que o Peptídeo região 1 de PH20, o que corresponde às posições de aminoácidos 107-137 do polipeptídeo maduro como explicitado na SEQ ID NO: 2, e posições 142-172 do polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1, são necessários para a atividade enzimática, a pH neutro. Os aminoácidos nas posições 111 e 113 (que correspondem ao polipeptídeo PH20 maduro estabelecido na SEQ ID NO: 2), dentro desta região, são relatados como importantes para a atividade, tal como mutagênese por resultados de substituição de aminoácidos em polipeptídeos PH20 com 3% de atividade de hialuronidase, ou atividade detectável de hialuronidase, respectivamente, em comparação com PH20 (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
[0399] A região de peptídeo 3, que corresponde às posições de aminoácidos 242-262 do polipeptídeo maduro como explicitado na SEQ ID NO: 2, e as posições 277-297 do polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1, são relatados como importantes para a atividade da enzima a pH ácido. Dentro desta região, os aminoácidos nas posições 249 e 252 do polipeptídeo maduro PH20 são referidos como essenciais para a atividade, como mutagênese dos resultados em um polipeptídeo essencialmente desprovido de atividade (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).
[0400] Em adição aos sítios catalíticos, PH20 também contém um local de ligação ao hialuronan. A evidência experimental indica que este local está localizado na região de Peptídeo 2, o que corresponde a posições de aminoácidos 205-235 do polipeptídeo precursor estabelecido na SEQ ID NO: 1 e as posições 170-200 do polipeptídeo maduro estabelecido na SEQ ID NO: 2. Esta região é altamente conservada entre as hialuronidases, e é semelhante ao motivo de ligação à heparina. A mutação do resíduo de arginina na posição 176 (que corresponde ao polipeptídeo PH20 maduro estabelecido na SEQ ID NO: 2) para uma glicina, resulta em um polipeptídeo com apenas cerca de 1% da atividade de hialuronidase do polipeptídeo do tipo selvagem (Arming et al., (1997) Eur. J. Biochem. 247:810- 814).
[0401] Existem sete potenciais locais de glicosilação, incluindo os locais de glicosilação ligados a N, na PH20 humana em N82, Nl66, N235, N254, N368, N393, S490 do polipeptídeo exemplificado na SEQ ID NO: 1. Porque os aminoácidos 36-464 da SEQ ID NO: 1 são relatados para conter o domínio de hialuronidase PH20 humana minimamente ativo, o local de glicosilação S-490 não é necessário para a atividade de hialuronidase adequada. Existem seis ligações dissulfeto em PH20 humana. Duas ligações de dissulfeto entre os resíduos de cisteína C60 e C351 e entre C224 e C238 do polipeptídeo exemplificado na SEQ ID NO: 1 (que correspondem aos resíduos C25 e C316, e C189 e C203 do polipeptídeo maduro como explicitado na SEQ ID NO:2, respectivamente). Outras quatro ligações de dissulfeto são formadas entre os resíduos de cisteína, C376 e C387; entre C381 e C435; entre C437 e C443; e entre C458 e C464 do polipeptídeo exemplificado na SEQ ID NO: 1 (que corresponde aos resíduos C341 e C352; entre C346 e C400; entre C402 e C408, e entre C423 e C429 do polipeptídeo maduro como explicitado na SEQ ID NO: 2, respectivamente).
(2) Outras hialuronidases
[0402] Hialuronidases bacterianas (EC 4.2.2.1 ou
4.2.99.1) degradam hialuronan e, em graus diferentes, sulfatos de condroitina e sulfatos de dermatan. Liases de hialuronan isoladas de bactérias diferem de hialuronidases (a partir de outras fontes, por exemplo, hialuronoglucosaminidases, EC 3.2.1.35) por seu modo de ação. São endo-fB-N-acetilhexosaminidases que catalisam uma reação de eliminação, em vez de hidrólise, da ligação glicosídica Bl -— 4 entre -N-acetil-beta-D-glucosamina e resíduos de ácido D -glucorônico em hialuronan, obtendo-se
3- (4-desoxi-B-D-gluc-4-enuronosil)-N-acetil-D-glucosamina de tetra- e hexassacarídeos, e produtos finais de dissacarídeo. A reação resulta na formação de oligossacarídeos com resíduos de ácido hexurônico insaturado nas suas extremidades não redutoras.
[0403] Exemplos de hialuronidases de bactérias para utilização nas composições, combinações e métodos proporcionados incluem, mas não estão limitados às enzimas que degradam hialuronan em microrganismos, incluindo as cepas de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, Peptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, e Streptomyces. Os exemplos particulares de tais cepas e enzimas incluem, mas não estão limitados a Arthrobacter sp. (cepa FB24 (SEQ ID NO:67)), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO:68), Propionibacterium acnes (SEQ ID NO:69), Streptococcus agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); sorotipo Ia (SEQ ID NO:72); sorotipo III (SEQ ID NO:73)), Staphylococcus aureus (cepa COL (SEQ ID NO:74); cepa MRSA252 (SEQ ID NOS:75 e 76); cepa MSSA476 (SEQ ID NO:77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); cepa bovina RF122 (SEQ ID NOS:79 e 80); cepa USA300 (SEQ ID NO:81)), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO:82); cepa ATCC BAA-255/R6 (SEQ ID NO:83); sorotipo 2, cepa D39/NCTC 7466 (SEQ ID NO:84)), Streptococcus pyogenes (sorotipo Ml (SEQ ID NO:85); sorotipo M2, cepa MGAS 10270 (SEQ ID NO:86); sorotipo M4, cepa MGAS 10750 (SEQ ID NO:87); sorotipo M6 (SEQ ID NO:88); sorotipo Ml12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 e 90); sorotipo Ml12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO:91); sorotipo M28 (SEQ ID NO:92)), Streptococcus suis (SEQ ID NOS:93-95); Vibrio fischeri (cepa ATCC 700601/ES114 (SEQ ID NO:96)), e a enzima hialuronidase Streptomyces hyaluronolyticus, que é específica para o ácido hialurônico e não cliva a condroitina ou o sulfato de condroitina (Ohya, T. e Kaneko, Y. (1970)Biochim. Biophys. Acta 198:607). Hialuronidase de sanguessugas, outros parasitas, e crustáceos (EC 3.2.1.36) são endo-b- glucuronidases que geram produtos finais de tetra- e hexassacarídeos. Estas enzimas catalisam a hidrólise de ligações 1-3- entre resíduos B-D-glucuronato e de N-acetil- D-glucosamina em hialuronato. Exemplos de hialuronidases de sanguessugas incluem, mas não estão limitados a, hialuronidase de Hirudimidae (por exemplo, Hirudo medicinalis), Erpobdellidae (por exemplo, Nephelopsis obscura e Erpobdella punctata), Glossiphoniidae (por exemplo, Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossiphonia complanata, Placobdella ornata e Theromyzon sp.) e Haemopidae (Haemopis marmorata) (Hovingh et al. (1999) Comp Biochem Physiol B Biochem Mol. Biol. 124(3):319-26). Uma hialuronidase exemplar a partir de bactérias que tem o mesmo mecanismo de ação que a hialuronidase de sanguessuga é aquela originada de cianobactérias, Synechococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID NO:97).
(3) Outras enzimas que degradam Hialuronan
[0404] Além da família hialuronidase, Outras enzimas degradantes de hialuronan podem ser utilizadas em composições, combinações e métodos fornecidos. Por exemplo, as enzimas, que incluem nomeadamente condroitinases e liases, que têm a capacidade para clivar o hialuronan, podem ser utilizadas. Condroitinases exemplificativas que podem degradar hialuronan incluem, mas não estão limitadas a condroitina ABC liase (também conhecida como a condroitinase ABC), condroitina AC liase (também conhecida como liase de sulfato de condroitina ou eliminasse de sulfato de condroitina) e liase condroitina C. Os métodos para a produção e purificação de tais enzimas para utilização nas composições, combinações e métodos aqui fornecidos, são conhecidos na arte (por exemplo, Patente dos EUA No. 6,054,569; Yamagata, et al. (1968) J. Biol. Chem. 243(7):1523-1535; Yang et al. (1985) JJ. Biol. Chem. 160(30) : 1849-1857).
[0405] Condroitina ABC liase contém duas enzimas, condroitina-sulfato-ABC endoliase (EC 4.2.2.20) e condroitin-sulfato-ABC exoliase (EC 4.2.2.21) (Hamai et al. (1997) J Biol. Chem. 272(14):9123-30), que degradam uma variedade de glicosaminoglicanos do tipo sulfato de condroitina e sulfato de dermatan. O sulfato de condroitina, condroitina-sulfato proteoglicano e sulfato de dermatan são os substratos preferidos para a condroitina- sulfato-ABC endoliase, mas a enzima também pode atuar em hialuronan a uma taxa inferior. A condroitina-sulfato-ABC endoliase degrada uma variedade de glicosaminoglicanos do tipo condroitina-sulfato e dermatan-sulfato, produzindo uma mistura de oligossacarídeos AM4-insaturados de diferentes tamanhos, que são em última instância, degradados para tetra- e dissacarídeos AM4-insaturados. A condroitina- sulfato-ABC exoliase tem a mesma especificidade de substrato, mas remove resíduos de dissacarídeos a partir das extremidades não redutoras, de ambos os sulfatos de condroitina poliméricos e os seus fragmentos de oligossacarídeos produzidos pela condroitina-sulfato-ABC endoliase (Hamai, A. et al. (1997). J. Biol. Chem. 272:9123-9130). Endoliases exemplares condroitina-sulfato- ABC e exoliases condroitina-sulfato-ABC incluem, mas não estão limitadas às de Proteus vulgaris e Pedobacter heparinus (Proteus vulgaris condroitina-sulfato-ABC endoliase está estabelecida na SEQ ID NO: 98 (Sato et al. (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1) :39 —46).
[0406] Condroitina AC liase (CE 4.2.2.5) está ativa nos sulfator de condroitina A e C, condroitina e hialuronan, mas não está ativa no sulfato de dermatan (sulfato de condroitina B). Exemplos de enzimas condroitinase AC de bactérias incluem, mas não estão limitados as de Pedobacter heparinus e Victivallis vadensis, estabelecidas nas SEQ ID NOS: 99 e 100 respectivamente, e de Arthrobacter aurescens (Tkalec et al. (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(1):29-35; Ernst et al. (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5):387-444).
[0407] Condroitinase Cc cliva sulfato de condroitina Cc produzindo tetrassacarídeo mais um dissacarídeo 6-sulfatado insaturado (delta Di-68S). Também cliva o ácido hialurônico produzindo dissacarídeo insaturado não sulfatado (delta Di-OS). Exemplos de enzimas condroitinase C a partir de bactérias incluem, mas não estão limitados aos de Streptococcus e Flavobacterium (Hibi et al. (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2):121-4; Michelacci et al. (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda et al. (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133).
ii. Enzimas que degradam hialuronan solúvel
[0408] São fornecidas nas composições, combinações, usos e métodos aqui descritos, enzimas que degradam hialuronan solúvel, incluindo hialuronidases solúveis. Enzimas “degradantes de hialuronan solúveis incluem qualquer enzima que degrada hialuronan que é segregada a partir de células (por exemplo células CHO) sobre expressão, e que exista na forma solúvel. Estas enzimas incluem, mas não estão limitadas a, hialuronidases solúveis, incluindo hialuronidases solúveis não humanas, incluindo hialuronidase solúveis de animais não humanos, hialuronidases solúveis bacterianas e hialuronidase humanas, Hyall, PH20 bovina e ovina, suas variantes alélicas e outras variantes das mesmas. Por exemplo, incluídas entre as enzimas que degradam hialuronan solúvel, estão as enzimas que degradam hialuronan que foram modificadas para serem solúveis. Por exemplo, enzimas degradadoras de hialuronan que contêm uma âncora de GPI podem ser solubilizadas por truncagem e remoção da totalidade ou de uma parte da âncora de GPI. Em um exemplo, a hialuronidase PH20 humana, que é normalmente ancorada à membrana por meio de uma âncora de GPI, pode ser feita solúvel por truncagem e remoção da totalidade, ou de uma parte da âncora de GPI no C-terminal.
[0409] Enzimas que degradam hialuronan solúvel também incluem hialuronidases neutro-ativas e ácido-ativas. Dependendo de fatores, tais como, mas não limitados ao nível desejado de atividade da enzima após a administração e/ou do local de administração, hialuronidases neutro- ativas e ácido-ativas podem ser selecionadas. Em um exemplo particular, a enzima degradadora de hialuronan para utilização nas composições, combinações e métodos aqui descritos é uma hialuronidase neutro-ativa solúvel.
[0410] Exemplos de uma hialuronidase solúvel é PH20, a partir de qualquer espécie, tal como qualquer uma estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25 27, 29-32, 63-65 e 101-102, ou suas formas truncadas, faltando toda ou uma porção da âncora de GPI na extremidade C-terminal, enquanto a hialuronidase é solúvel (segregada por expressão) e retém a atividade de hialuronidase. Também incluídos entre os hialuronidases solúveis são variantes alélicas ou outras variantes de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65 e 101-102, ou suas formas truncadas. As variantes alélicas e outras variantes são conhecidas por um perito na arte, e incluem polipeptídeos com 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NO: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63-65 e 101-102, ou suas formas truncadas. Variantes de aminoácidos incluem mutações conservadoras e não conservadoras. Entende-se que os resíduos que são importantes ou de outra forma requeridos para a atividade de hialuronidase, como acima descrito, ou qualquer um conhecido pelos peritos na arte, são geralmente invariáveis e não podem ser alterados. Estes incluem, por exemplo, resíduos de sítios ativos. Assim, por exemplo, resíduos de aminoácidos 111, 113 e 176 (correspondentes aos resíduos no polipeptídeo maduro PH20 descrito em SEQ ID NO: 2) de um polipeptídeo PH20 humana, ou sua forma solúvel, são geralmente invariáveis e não são alterados. Outros resíduos que conferem glicosilação e formação de ligações dissulfeto necessárias para a dobra adequada também podem ser invariantes.
[0411] Em alguns casos, a enzima degradadora de hialuronan solúvel é normalmente ancorada à GPI (tais como, por exemplo, PH20 humana) e é tornada solúvel por truncamento no C-terminal. Esse truncamento pode remover toda a sequência do sinal de ligação à âncora de GPI, ou pode remover apenas algumas das referidas sequências. O polipeptídeo resultante, no entanto, é solúvel. Nos casos em que a enzima degradante de hialuronan solúvel mantém uma parte da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de sinal de ligação à âncora de GPI podem ser retidos, desde que o polipeptídeo seja solúvel. Os polipeptídeos que contém um ou mais aminoácidos da âncora de GPI são denominados como enzimas que degradam hialuronan solúveis prolongadas. Um perito na arte pode determinar se um polipeptídeo é GPI-ancorado usando métodos bem conhecidos na arte. Tais métodos incluem, mas não estão limitados ao uso de algoritmos conhecidos para prever a presença e à localização da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI e local w, e a realização de análises de solubilidade antes e depois da digestão com fosfolipase específica de fosfatidilinositol C(PI-PLC) ou D (PI-PLD).
[0412] Enzimas degradantes de hialuronan solúvel prolongadas podem ser produzidas fazendo truncagens de C - terminal de qualquer enzima degradante de hialuronan naturalmente ancorada ao GPI, de modo que o polipeptídeo resultante seja solúvel e contenha um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI (ver, por exemplo, Requerimento de Pat. dos EUA publicado Nº. US20100143457). Exemplos de enzimas degradantes de hialuronan solúvel prolongadas que estão no C-terminal truncadas, mas retêm uma porção da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI incluem, mas não estão limitados ao polipeptídeo PH20 solúvel prolongado (esPH20) de origem primata, tal como, por exemplo, polipeptídeos esPH20 de humanos e chimpanzé. Por exemplo, os polipeptídeos esPH20 podem ser feitos por truncagem C- terminal de qualquer um dos polipeptídeos maduros Ou precursores expostos nas SEQ ID NOS: 1, 2 ou 101, ou alélicas ou outra variação da mesma, incluindo seu fragmento ativo, em que o polipeptídeo resultante é solúvel e retém um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI. As variantes alélicas e outras variantes são conhecidas por um perito na arte, e incluem polipeptídeos com 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, Ou mais de identidade de sequência de qualquer uma das SEQ ID NO: 1 ou 2. Os polipeptídeos esPH20 aqui proporcionados podem ser truncados no C-terminal por
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos, em comparação com o tipo selvagem do polipeptídeo, tal como um polipeptídeo com uma sequência apresentada nas SEQ ID NOS: 1, 2 ou 101, desde que o polipeptídeo resultante seja solúvel esPH20 e retenha um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI.
[0413] Normalmente, para a utilização nas composições, combinações e métodos desta invenção, uma enzima que degrada hilauronan humana solúvel, tal como uma PH20 humana solúvel, é usada. Embora enzimas que degradam hilauronan, tais como o PH20, a partir de outros animais possam ser utilizadas, tais preparações são potencialmente imunogênicas, uma vez que são proteínas de origem animal. Por exemplo, uma proporção significativa dos pacientes demonstra sensibilização prévia secundária aos alimentos ingeridos, e uma vez que estas são as proteínas animais, todos os pacientes têm um risco de sensibilização posterior. Assim, as preparações não-humanas podem não ser adequadas para utilização crônica. Se são desejadas preparações não-humanas, é aqui contemplado, que estes polipeptídeos podem ser preparados para ter uma imunogenicidade reduzida. Tais modificações estão dentro do nível de um especialista na arte e podem incluir, por exemplo, a remoção e/ou substituição de um ou mais epítopos antigênicos na molécula.
[0414] Enzimas degradantes de hialuronan, incluindo hialuronidases (por exemplo, PH20), utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser produzidas de forma recombinante, ou podem ser purificadas ou parcialmente purificadas a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, a partir de extratos de testículo. Os métodos para a produção de proteínas recombinantes, incluindo as enzimas que degradam o hialuronan recombinante, são fornecidos aqui, em outra parte, e são bem conhecidos na arte.
(1) PH20 Humana Solúvel
[0415] Exemplos de uma hialuronidase solúvel é PH20 humana solúvel, formas solúveis de PH20 humana recombinantes foram produzidas e podem ser utilizadas em composições, combinações e métodos aqui descritos. A produção de tais formas solúveis de PH20 descrita nos Requerimenos de Patente dos EUA Publicados EUA Nºs US20040268425; US20050260186, US20060104968, US20100143457 e Requerimento Internacional PCT No. WO2009111066. Por exemplo, polipeptídeos PH20 solúveis incluem polipeptídeos variantes de C-terminal truncados, que incluem uma sequência de aminoácidos na SEQ ID NO: 1, ou tem, pelo menos, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97%, 98% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos incluída na SEQ ID NO: 1, retêm a atividade de hialuronidase e são solúveis. Incluídos entre esses —polipeptídeos estão polipeptídeos PH20 solúveis em que falta a totalidade ou uma porção da sequência de sinal de ligação à âncora de GPI.
[0416] Também estão incluídos polipeptídeos PH20 solúveis estendidos (esPH20) que contêm pelo menos um aminoácido de âncora de GPI. Assim, em vez de ter uma âncora de GPI covalentemente ligada ao C-terminal da proteína no ER e ser ancorado à folha extracelular da membrana plasmática, estes polipeptídeos são segregados e solúveis. Polipeptídeos PH20 truncados de C-terminal podem ser truncados no C-terminal por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais aminoácidos, em comparação com o polipeptídeo de comprimento total de tipo selvagem, tal como um polipeptídeo de comprimento total de tipo selvagem com uma sequência apresentada nas SEQ ID NOS: 1 ou 2, ou variantes alélicas ou variantes de espécies, ou outras variantes das mesmas.
[0417] Por exemplo, as formas solúveis em água incluem, mas não se limitam a polipeptídeos truncados no C- terminal de PH20 humana descrita na SEQ ID NO: ll com um resíduo de aminoácido C-terminal de 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 ou 500 da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1, ou polipeptídeos que exibem pelo menos 85% de identidade com esta. As formas solúveis de PH20 humana incluem geralmente aquelas que contêm os aminoácidos 36-464 apresentados na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, quando expressa em células de mamíferos, a sequência de sinal de 35 aminoácidos N-terminal é clivada durante o processamento, e a forma madura da proteína é secretada. Assim, os polipeptídeos solúveis maduros contêm aminoácidos 36 a 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483 da SEQ ID NO:
1. A Tabela 3 apresenta exemplos não limitativos de polipeptídeos exemplificativos PH20 truncados C- terminal, incluindo polipeptídeos PH20 truncados C-terminal solúveis. Na Tabela 3 abaixo, oO comprimento (em aminoácidos) do precursor e polipeptídeos maduros, e o identificador de sequência (SEQ ID NO), em que as sequências de aminoácidos exemplares do precursor e polipeptídeos maduros das proteínas PH20 truncadas C-terminal são definidos, são fornecidos. O polipeptídeo PH20 de tipo selvagem está também incluído na Tabela 3 para comparação. Em particular, exemplos de hialuronidases solúveis são polipeptídeos PH20 humanos solúveis que são 442, 443, 444, 445, 446 ou 447 aminoácidos de comprimento, tal como definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-9, ou variantes alélicas ou espécies variantes ou outras variantes das mesmas. : Madura Madura Polipeptídeo Precursor Precursor 2 SEQ ID (aminoácido) | seo 1D No | (Aminoácidos) NO [Teo semvagen [509 E E [sPamevsie — [499 [206 [ME [5 |sPaMmInTMEZO [495 Nos a 52 | |sPamInsatM — [aos ro as 53 [sramenzenn [ass [46 [MB [4 | [sPpamI-TERRO [47 [42 [Bo [E |samI=IDAR [ae UN asso 168 |
[0418] Por exemplo, exemplos de polipeptídeos PH20 C- terminal truncados, que exibem atividade de hialuronidase, que são segregadas a partir de células e são solúveis, incluem qualquer das formas maduras de PH20 humana truncada apresentadas na Tabela 3, ou variantes das mesmas, que exibem atividade de hialuronidase. Por exemplo, PH20 ou sua forma truncada contém a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4- 9, 47, 48, 150-170 e 183-189, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-9, 47, 48, 150-170 e 183-189. Por exemplo, o polipeptídeo PH20 pode apresentar, pelo menos, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4- 9, 47, 48, 150-170 e 1183-189.
[0419] Geralmente as formas solúveis de PH20 são produzidas utilizando sistemas de expressão de proteínas que facilitam a N-glicosilação correta para assegurar a atividade de retenção do polipeptídeo, uma vez que a glicosilação é importante para a atividade catalítica, e a estabilidade de hialuronidase. Tais células incluem, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO) (por exemplo, células DG44 CHO).
(2) rHuPH20
[0420] Formas solúveis recombinantes de PH20 humana têm sido geradas e podem ser utilizadas em composições, combinações e métodos aqui fornecidos. A geração de tais formas solúveis de PH20 humana recombinante está descrita, por exemplo, no Requerimento de Patente dos EUA Publicado Nºs US20040268425; US20050260186; US20060104968; US20100143457; e Internacional PCT nº WO2009111066. Exemplos de tais polipeptídeos são aqueles gerados por expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica os aminoácidos 1-482 (estabelecida na SEQ ID NO: 3). Tal molécula de ácido nucleico exemplar é descrita na SEQ ID NO: 49. O processamento pós-translacional remove a sequência de sinal de 35 aminoácidos, deixando uma PH20 recombinante humana solúvel de 447 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Tal como produzido no meio de cultura, há heterogeneidade no C-terminal de tal forma que o produto, designado rHuPH20, inclui uma mistura de espécies, que pode incluir qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS. 4-9 em enorme abundância. Normalmente, rHuPH20 é produzido em células que facilitam a N-glicosilação correta para reter a atividade, tal como células CHO (por exemplo, células DG44 CHO).
iii. Glicosilação de enzimas que degradam hialuronan
[0421] A glicosilação, incluindo a glicosilação ligada a N- e O-, de algumas enzimas degradantes de hialuronan, incluindo hialuronidases, pode ser importante para a sua atividade catalítica e a estabilidade. Embora a alteração do tipo de glicano que modifica uma glicoproteína possa ter efeitos dramáticos sobre a antigenicidade de uma proteína, dobra estrutural, solubilidade e estabilidade, a maioria das enzimas não são pensados para exigir glicosilação para a atividade enzimática 6Ótima. Para algumas hialuronidases, a remoção de N-glicosilação pode resultar em uma quase inativação completa da atividade de hialuronidase. Assim, para tais hialuronidases, a presença de glicanos ligados a N é importante para a geração de uma enzima ativa.
[0422] Oligossacarídeos ligados a N se enquadram em vários tipos “principais (oligomannose, complexo, híbrido, sulfatado), todos os quais têm (Man)3-GlcNACc- GlcNAc-cores ligados através do nitrogênio de amida de resíduos Asn que se enquadram em sequências -Asn-Xaa- Tre/Ser- (onde Xaa não é Pro). A glicosilação em um local - Asn-Xaa-Cys-tem sido relatada para a proteína de coagulação C. Em alguns casos, uma enzima que degrada ácido hialurônico, tal como uma hialuronidase, pode conter tanto ligações N-glicosídicas como O-glicosídicas. Por exemplo, PH20 tem oligossacarídeos ligados a O, bem como oligossacarídeos ligados a N-. Existem sete potenciais locais de glicosilação ligados a N em N82, Nl66, N235, N254, N368, N393, N490 da PH20 humana exemplificada na SEQ ID NO: 1. Resíduos de aminoácidos N82, N166 e N254 são ocupados pelos glicanos de tipo complexo enquanto os resíduos de aminoácido N368 e N393 são ocupados por altos glicanos tipo manose. O resíduo de aminoácido N235 é ocupado por cerca de 80% de altos glicanos tipo manose e 20% do tipo complexo de glicanos. Como observado acima, a glicosilação ligada a N em N490 não é necessária para a atividade de hialuronidase.
[0423] Em alguns exemplos, enzimas degradantes de hialuronan para utilização nas composições, combinações e/ou métodos fornecidos são glicosiladas em um ou todos os locais de glicosilação. Por exemplo, para a PH20 humana, ou uma forma sua solúvel, 2, 3, 4, 5, ou 6 dos locais de N - glicosilação correspondentes aos aminoácidos N82, Nl66, N235, N254, N368, N393 e da SEQ ID NO: 1 são glicosiladas. Em alguns exemplos, enzimas degradantes de hialuronan são glicosiladas em um ou mais sítios de glicosilação nativos. Em outros exemplos, enzimas degradantes de hialuronan são modificadas em um ou mais sítios de glicosilação não- nativo para conferir a glicosilação do polipeptídeo de um ou mais sítios adicionais. Em tais exemplos, a ligação de porções de açúcar adicionais pode melhorar as propriedades farmacocinéticas da molécula, tais como a melhoria da meia- vida e/ou atividade melhorada.
[0424] Em outros exemplos, enzimas degradantes de hialuronan para utilização nas composições, combinações e/ou os métodos aqui proporcionados são parcialmente desglicosiladas (ou polipeptídeos N-parcialmente glicosilados). Por exemplo, polipeptídeos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados que retêm toda ou uma parte da atividade de hialuronidase de uma hialuronidase totalmente glicosilada podem ser utilizados em composições combinações e/ou métodos aqui fornecidos. Exemplos de hialurodinases parcialmente desglicosiladas incluem formas solúveis de polipeptídeos PH20 parcialmente desglicosilados de qualquer espécie, tal como definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 29-32, 63, 65, e 101-102, ou suas variantes alélicas, variantes truncadas, Ou Outras variantes das mesmas. Tais variantes são conhecidas por um perito na arte, e incluem polipeptídeos com 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS : 1, 2, 11, 25 27, 29-32, 63, 65 e 101-102, ou formas truncadas. As hialuronidases parcialmente desglicosiladas aqui previstas também incluem hialuronidases parcialmente desglicosiladas híbridas, de fusão e quiméricas e conjugados hialuronidase parcialmente desglicosilados.
[0425] Glicosidases ou hidrolases de glicosil são enzimas que catalisam a hidrólise da ligação glicosídica para gerar dois açúcares menores. Os principais tipos de N- glicanos em vertebrados incluem elevados glicanos de manose, glicanos híbridos e glicanos complexos. Existem várias glicosidases que resultam em desglicosilação de proteína apenas parcial, incluindo: EndoFl, que cliva manose elevada e glicanos do tipo híbrido; EndoF2, que cliva glicanos de tipo complexo biternários; EndoF3, que cliva glicanos do tipo complexo biternários e ainda ramificados; e EndoH, que cliva glicanos de manose elevada e do tipo híbrido. O tratamento de uma enzima degradante de hialuronan, tal como hialuronidase solúvel, tal como uma
PH20 solúvel, com uma ou todas estas glicosidases pode resultar em desglicosilação apenas parcial e, por conseguinte, a retenção de atividade de hialuronidase.
[0426] Enzimas que degradam Hialuronan parcialmente desglicosiladas, tais como hialuronidases solúveis parcialmente desglicosiladas, podem ser produzidas através de digestão com uma ou mais glicosidases, geralmente uma glicosidase que não remova todos os N- glicanos, mas apenas possa desglicosilar parcialmente a proteína. Por exemplo, o tratamento de PH20 (por exemplo, uma PH20 recombinante designada rHuPH20) com uma ou todas as glicosidases (por exemplo, EndoFl, EndoF2 e/ou EndoF3) acima resulta em desglicosilação parcial. Estes polipeptídeos PH20 parcialmente desglicosilados podem exibir uma atividade enzimática de hialuronidase que é comparável aos polipeptídeos totalmente glicosilados. Em contraste, o tratamento de PH20 com PNGaseF, uma glicosidase que cliva todos os N-glicanos, resulta na completa remoção de todos os N-glicanos e, assim, torna PH20 enzimaticamente inativa. Assim, apesar de todos os locais de glicosilação ligados a N (tal como, por exemplo, os nos aminoácidos N82, N1l66, N235, N254, N368, N393 de PH20 humana, exemplificados na SEQ ID NO: 1) poderem ser glicosilados, o tratamento com uma ou mais glicosidases pode processar o grau de glicosilação reduzida em comparação com uma hialuronidase que não é digerida com uma ou mais glicosidases.
[0427] As enzimas degradantes de hialuronan parcialmente desglicosiladas, incluindo polipeptídeos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados, podem ter 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou 80% do nível de glicosilação de um polipeptídeo totalmente glicosilado. Em um exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos locais de N-glicosilação correspondentes aos aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, N393 e da SEQ ID NO: 1 são parcialmente desglicosilados, de tal modo que eles já não contêm glicanos de manose elevada ou glicanos de tipo complexo, mas contêm pelo menos uma porção N-acetilglucosamina. Em alguns exemplos, 1, 2 ou 3 dos locais de N-glicosilação correspondentes aos aminoácidos N82, Nl166 e N254 da SEQ ID NO: 1 são desglicosilados, ou seja, que não contêm uma porção de açúcar. Em outros exemplos, 3, 4, 5, ou 6 dos locais de N-glicosilação correspondentes aos aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, e N393 da SEQ ID NO: 1 são glicosilados. Resíduos de aminoácidos glicosilados contêm minimamente uma porção N-acetilglucosamina. Normalmente, enzimas degradantes de hialuronan parcialmente desgliclosiladas, incluindo polipeptídeos PH20 solúveis parcialmente desglicosilados, exibem atividade de hialuronidase que é 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400% 500%, 1000% ou mais da atividade de hialuronidase exibida pelo polipeptídeo totalmente glicosilado.
iv. Enzimas que degradam hialuronan (conjugado de polímero) modificado
[0428] Em um exemplo, as composições e combinações previstas contêm enzimas que degradam hialuronan, em particular, hialuronidases solúveis, que foram modificadas por conjugação com uma ou mais moléculas poliméricas (polímero), normalmente para aumentar a meia- vida da enzima degradante de hialuronan, por exemplo, para promover os efeitos do tratamento prolongados/sustentados em um indivíduo.
[0429] Fixação estável covalente ou outra fixação estável (conjugação) de moléculas poliméricas, tais como polietileno-glicol (porção PEGuilação(PEG)), para enzimas degradantes de hialuronan, tais como hialuronidases, conferem propriedades benéficas à composição de enzima- polímero degradante de hialuronan resultante. Tais propriedades incluem a biocompatibilidade melhorada, a extensão da proteína (e a atividade enzimática), meia-vida no sangue, células e/ou em outros tecidos dentro de um indivíduo, blindagem eficaz da proteína a partir de proteases e de hidrólise, a melhoria da biodistribuição, farmacocinética e/ou farmacodinâmica melhorada, e maior solubilidade em água.
[0430] Assim, nos exemplos especiais aqui apresentados, a enzima degradadora de hialuronan é conjugada com um polímero. Exemplos de polímeros são tais como polióis (isto é, poli-OH), as poliaminas (isto poli- NH2) e os ácidos policarboxila (isto poli-COOH), e outros heteropolímeros ou seja, polímeros que compreendem um ou mais diferentes grupos de acoplamento, por exemplo, um grupo hidroxila e grupos amina. Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas selecionadas entre os óxidos de polialquileno (PAO), tais como polialquilenoglicóis (PAG), incluindo polipropileno glicóis (PEG), glicóis de metoxipolietilenoglicol (MPEG) e polipropileno-glicóis, éteres de PEG-glicidila (Epox-PEG) PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) polietilenoglicóis ramificados (PEGS), álcool polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D, L- aminoácidos, anidrido de ácido de polietileno-co-maleico, anidrido de ácido poliestireno -co-maleico, dextranos, incluindo carboximetil-dextrano, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, carboxietilcelulose hidroxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosano, amidas, tais como hidroxietil-amidas e hidroxipropil-amidas, glicogênio, agaroses e seus derivados, goma de quar, pululano, inulina, goma xantana, carragenina, pectina, ácido algínico hidrolisado e bio - polímeros.
[0431] Em particular, o polímero é um polietileno glicol (PEG). Moléculas poliméricas adequadas para fixação às enzimas degradantes de hialuronan, incluindo hialuronidases, incluem, mas não estão limitadas a, polietilenoglicol (PEG) e derivados de PEG tais como glicóis de metoxi-polietileno (MPEG), éteres de PEG- glicidila (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEGs ramificados, e óxido de polietileno (PEO) (ver por exemplo, Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review (2002) 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) “Poly (ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., JJ. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, (2003) Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221; and Tsubery, (2004) 3. Biol. Chem. 279(37):38118-24). A molécula polimérica pode ser de um peso molecular que varia normalmente entre cerca de 3 kDa e cerca de 60 kDa. Em algumas modalidades a molécula polimérica que é conjugada para uma proteína, tal como rHuPH20, tem um peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais do que 60 kDa.
[0432] Vários métodos de modificação de polipeptídeos por ligação covalente (conjugação) de um derivado de PEG ou PEG (isto é, "PEGuilação") são conhecidos na arte (ver, por exemplo, U.S. 2006/0104968; U.S. Pat. No. 5,672,662; U.S. Pat. No. 6,737,505; e U.S. 2004/0235734). Tais técnicas são descritas aqui em outra parte.
2. Composições e Formulações Farmacêuticas
[0433] São aqui proporcionadas composições farmacêuticas de agentes anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada (por exemplo, enzimas degradadoras de hialuronan PEGuiladas, tais como hialuronidases peguiladas), para uso nos métodos de tratamento fornecidos. Também aqui estão as composições farmacêuticas que contêm um segundo agente que é utilizado para tratar uma doença ou distúrbio associado com uma doença ou condição associada ao hialuronan, tal como o câncer. Exemplos de tais agentes incluem, mas não estão limitados aos agentes anti-câncer que incluem fármacos, polipeptídeos, ácidos nucleicos, anticorpos, peptídeos, moléculas pequenas, vetor de terapia genética, os vírus e outros agentes terapêuticos. Os agentes anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada (por exemplo, enzimas degradadoras de hialuronan PEGuiladas, tais como hialuronidases PEGuiladas ou PEGPH20), podem ser co-formuladas ou co-administradas com formulações farmacêuticas de tais segundos agentes, para melhorar a sua entrega aos locais desejados ou tecidos dentro do corpo, associados com excesso ou acumulo de ácido hialurônico.
[0434] Composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas, tendo em vista as aprovações para uma agência reguladora ou outra agência, de acordo com farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e em seres humanos. Os compostos podem ser formulados em quaisquer preparações farmacêuticas adequadas para qualquer administração oral e intravenosa, tais como soluções, suspensões, pós ou formulações de liberação sustentada. Normalmente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas utilizando técnicas e procedimentos bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
[0435] Em um exemplo, a preparação farmacêutica pode estar na forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões. Caso seja fornecida na forma líquida, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como uma preparação de concentrado para serem diluídas para uma concentração terapeuticamente eficaz, antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p- hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). Em outro exemplo, as preparações farmacêuticas podem ser apresentadas em forma de liofilizado para reconstituição com água Ou outro veículo adequado antes da utilização.
[0436] As composições farmacêuticas podem incluir veículos tais como um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual as composições (por exemplo, corticosteroide ou agente anti-hialuronan, tal como enzimas degradadoras de hialuronan PEGuiladas) são administradas. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto ou agente, geralmente, na forma purificada ou na forma parcialmente purificada, em conjunto com uma quantidade adequada de veículo de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao doente. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, e óleo de sésamo. A água é um veículo típico. As soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas também podem ser utilizadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveis. As composições podem conter, juntamente com o ingrediente ativo: um diluente tal como lactose, sacarose, fosfato dicálcico, ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco ; e um ligante tal como amido, gomas naturais, tais como goma arábica, gelatina, glicose, melaço, polivinilpirrolidina, celuloses e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros agentes ligantes conhecidos pelos especialistas na arte. os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, cal, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água e etanol. Por exemplo, os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. A composição, se desejado, também pode conter outras quantidades menores de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes umectantes ou emulsionantes, agentes de tamponamento de pH, estabilizantes, intensificadores de solubilidade e outros agentes deste tipo, tais como, por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
[0437] Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em preparações parentéricas incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos,
agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersão, agentes emulsionantes, agentes sequestrantes ou quelantes, e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis . Exemplos de veículos aquosos incluem injeção de cloreto sódio, injeção de Ringer, Injeção de dextrose isotônica, Injeção de água estéril, injeção de dextrose e Lactato de Ringer. Veículos parentéricos não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo e óleo de amendoim. Agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados a preparações parentéricas embaladas em recipientes de dose múltipla, que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres de ácidos metil e propil p-hidroxibenzoicos, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Os tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de dispersão e suspensão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. os agentes emulsionantes incluem polisorbato 80 (TWEEN 80). Um agente sequestrante ou quelante de íons metálicos inclui EDTA. Os veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajustamento do pH.
[0438] Os injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, quer como soluções líquidas ou suspensões, formas sólidas adequadas para solução Ou suspensão em líquido antes da injecção, ou como emulsões. As preparações para administração intraprostática incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente imediatamente antes da utilização, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para combinação com um veículo imediatamente antes da utilização, emulsões estéreis. As soluções podem aquosas ou não aquosas.
3. Dosagens e Administração
[0439] Normalmente, a dose de um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, é uma que também atinge um efeito terapêutico no tratamento de uma doença ou condição associada ao hialuronan, tal como o câncer. Assim, as composições de um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, estão incluídas em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil. A composição que contém o agente ativo pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições de um agente anti-hialuronan podem também incluir um segundo agente terapêutico.
[0440] Concentrações terapeuticamente eficazes de um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, podem ser determinadas empiricamente testando os compostos em conhecidos sistemas in vitro e in vivo, tais como os ensaios aqui proporcionados. Por exemplo, a concentração de um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, como hialuronidase PEGuilada) depende das taxas de absorção, inativação e excreção, das características físico-químicas, o horário de dosagem, e quantidade administrada, assim como outros fatores conhecidos por peritos na arte. Por exemplo, entende-se que a dosagem precisa e a duração do tratamento são uma função do tecido a ser tratado, a doença ou condição a ser tratada, a via de administração, o paciente ou indivíduo e o agente anti- hialuronan em particular, e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou por extrapolação, a partir de dados de testes in vivo ou in vitro e/ou podem ser determinadas a partir de regimes de dosagem conhecidos do agente particular. A quantidade de um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada (por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan PEGuilada, tal como uma hialuronidase PEGuilada), a ser administrada para oO tratamento de uma doença ou condição, por exemplo uma doença ou condição associada a hialuronan, tal como um tumor rico em HA, podem ser determinadas por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro e modelos animais podem ser utilizados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ótimos. A dosagem exata, que pode ser determinada empiricamente, pode depender da enzima em particular, a via de administração, o tipo de doença a ser tratada e a gravidade da doença.
[0441] Por exemplo, métodos de utilização de agentes —anti-hialuronan, como enzimas degradadoras de hialuronan, ou suas formas modificadas (por exemplo, formas PEGuiladas) para o tratamento de doenças e condições associadas a hialuronan são bem conhecidos na arte (ver por exemplo, Requerimento de Patente dos EUA Pub. No. 20100003238 e Requerimento Internacional Publicado PCT No. WO 2009/128917). Assim, as dosagens de um agente anti- hialuronan, tal como uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase, podem ser escolhidas com base em regimes de dosagem convencionais para esse agente, de acordo com uma determinada via de administração.
[0442] Exemplos de quantidades eficazes de um agente anti-hialuronan para o tratamento de uma doença ou condição associada ao hialuronan é uma dose variando entre 0,01 ug a 100 pg por kg de peso corporal. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um agente anti-hialuronan é uma dose variando entre 0,01 pg e 100 mg por kg de peso corporal, tal como 0,01 ug a 1 mg por kg de peso corporal, 1 pg a 100 ug por kg de peso corporal, de 1 ug a 10 ug por kg de peso corporal ou de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal. Por exemplo, as quantidades eficazes incluem, pelo menos, ou cerca de, pelo menos, ou cerca de 0,01 ug ou, 0.05, 0.1,
0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg/kg de peso corporal. Outros exemplos de quantidades eficazes incluem 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 g/kg de peso corporal. Por exemplo, um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase (por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada como PEGPH20), pode ser administrada a ou cerca de 0,1 pg/kg to 1 mg/kg, por exemplo 0,5 upg/kg a 100 pg/kg, 0,75 pg/kg a 15 pog/kg, 0,75 nug/kg a 7,5 pg/kg ou 1,0 pg/kg a 3,0 pog/kg. Em outros exemplos, um agente anti-hialuronan como uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, um hialuornidase (por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada como PEGPH20), pode ser administrada a ou 1 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo, 100 mg/kg a 400 mg/kg, tal como 200 mg/kg. Por exemplo, as composições contêm 0,5 mg a 100 gramas de agente anti-hialuronan, por exemplo, 20 ug a 1 mg, tal como
100 ug até 0,5 mg ou pode conter de 1 mg a 1 grama, tal como de 5 mg a 500 mg.
[0443] Por exemplo, agentes e tratamentos para o tratamento de doenças e condições associadas a hialuronan, tais como agentes anti-câncer, são bem conhecidos na arte (ver por exemplo, Requerimento dos EUA No. 20100003238 e Requerimento Internacional publicado PCT No. WO 2009/128917). Assim, as dosagens de uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase, ou outros agentes de uma segunda composição podem ser escolhidos com base em regimes de dosagem convencionais para esse agente, de acordo com uma determinada via de administração.
[0444] Exemplos de quantidades eficazes de uma enzima degradadora de hialuronan é aa doses variando desde 0,01 ug a 100 g por kg de peso corporal. Por exemplo, uma quantidade eficaz de uma enzima degradadora de hialuronan é uma dose variando entre 0,01 ug e 100 mg por kg de peso corporal, tal como de 0,01 pg a 1 mg por kg de peso corporal, de 1 ug a 100 ug por kg de peso corporal, de 1 ug a 10 ug por kg de peso corporal ou de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal. Por exemplo, as quantidades eficazes incluem, pelo menos, ou cerca de, pelo menos, ou cerca de 0,01 ug ou, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 mg/kg de peso corporal. Outros exemplos de quantidades eficazes incluem 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 g/kg de peso corporal. Por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, por exemplo, uma hialuronidase (por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada como PEGPH20), pode ser administrada a ou cerca de 0,1 pg/kg to 1 mg/kg, por exemplo 0,5 ug/kg a 100 ug/kg, 0,75 pg/kg a 15 pg/kg, 0,75 ng9/kg a 7,5 pg/kg ou 1,0 p9g/kg a 3,0 po/kg. Em outros exemplos, uma enzima que degrada hialuronan, por exemplo, um hialuornidase (por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada como PEGPH20), pode ser administrada a ou 1 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo, 100 mg/kg a 400 mg/kg, tal como 200 mg/kg. Geralmente, as composições contêm 0,5 mg a 100 gramas de uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, 20 pg a 1 mag, tal como 100 ug até 0,5 mg ou pode conter de 1 mg a 1 grama, tal como de 5 mg a 500 mg.
[0445] A dose ou composições podem ser para administração de dosagem única ou para a administração de dosagem múltipla. A dose ou a composição pode ser administrada em uma única administração uma vez, Várias vezes por semana, duas vezes por semana, a cada 15 dias, 16 dias, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 dias, uma vez por mês, várias vezes por ano ou anual. Em outros exemplos, a dose ou a composição pode ser dividida e administrada uma vez, várias vezes por semana, duas vezes por semana, a cada 15 dias, 16 dias, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 dias, uma vez por mês, várias vezes por ano ou anual. As composições de enzimas degradadoras de hialuronan podem ser formuladas na forma de composições líquidas ou podem ser liofilizadas. As composições também podem ser formuladas como um comprimido ou cápsula.
[0446] É fornecida abaixo a descrição de dosagens e regimes de dosagem de um exemplar de enzimas que degradam hialuronan conjugadas com um polímero (por exemplo, ligadas a PEG) para utilização nos métodos aqui descritos. As enzimas que degradam hialuronan podem ser utilizadas sozinhas em uma terapia com um agente único ou em combinação com outros agentes, para utilização no tratamento de uma doença ou condição associada ao HA, tal como o câncer. Como discutido aqui em outra parte, em exemplos “específicos dos métodos e utilizações aqui presentes, os agentes podem ser administrados em combinação com um corticosteroide, a fim de atenuar um efeito colateral associado com o tratamento de um agente anti- hialuronan.
a. Administração de uma enzima degradadora de hialuronan PEGuilado
[0447] Uma enzima degradadora de hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado (por exemplo, uma hialuronidase), pode ser administrada sistemicamente, por exemplo, por via intravenosa (IV), por via intramuscular, ou por qualquer outra via sistêmica. Em exemplos particulares, doses mais baixas podem ser dadas localmente. Por exemplo, a administração local de uma enzima degradadora de hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada (por exemplo PH20) inclui a administração intratumoral, injeção arterial (por exemplo, artéria hepática), a administração intraperitoneal, a administração intravesical, e outras vias locais utilizadas para a terapia do câncer, que pode aumentar a ação local a uma dose absoluta mais baixa.
[0448] O intervalo de dosagem exemplar é, ou é de cerca de 0.3 Unidades/kg a 320,000 unidades/kg, tais como a Unidades/kg de 320,000 Unidades/kg de uma hialuronidase PEGuilada, ou de uma quantidade funcionalmente equivalente de uma outra enzima que degrada hialuronan PEGuilado. É aqui entendido que uma unidade de atividade é normalizada para uma atividade padrão, por exemplo, uma atividade como medida em um ensaio de microturbidez que ensaia a atividade de hialuronidase. A hialuronidase solúvel PEGuilada pode exibir menor atividade por mg de proteína total, isto é, possui uma atividade específica mais baixa, em comparação com uma hialuronidase nativa solúvel não tão conjugada. Por exemplo, uma preparação rHuPH20 exemplar apresenta uma atividade específica de 120,000 Unidades/mg, enquanto uma forma peguilada de rHuPH20 exibe uma atividade específica de, ou cerca de 32,000 unidades/mg. Normalmente, uma forma peguilada de uma enzima degradadora de hialuronan, tal como, por exemplo, hialuronidase rHuPH20, apresenta uma atividade específica no intervalo de, entre, ou cerca de 18,000 e em, ou cerca de 45,000 U/mg. Em um exemplo, a enzima degradadora de hialuronan PEG pode ser fornecida como uma solução estoque, por exemplo, a 3.5 mg/ml a 112,000 U/ml (- 32,000 U/mg), com uma proporção molar PEG para proteína entre 5:1 e 9:1, por exemplo, 7:1, ou pode ser proporcionada em uma forma menos concentrada. Para os fins desta invenção, as dosagens podem estar em referência a Unidades.
[0449] Por exemplo, uma enzima degradadora de hialuronan PEG, tal como hialuronidase, por exemplo PEGPH20, pode ser administrada por via intravenosa duas vezes por semana, uma vez por semana ou uma vez a cada 21 dias. Normalmente, a enzima degradadora de hialuronan PEG é administrada duas vezes por semana. o ciclo da administração pode ser por um período definido, geralmente por 3 semanas ou 4 semanas. O ciclo da administração pode ser repetido em um regime de dosagem por mais de um mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, l ano ou mais. Geralmente, o ciclo de administração é repetido a critério de um médico assistente e pode depender de fatores tais como a remissão da doença ou condição, a gravidade da doença ou condição, eventos adversos e de outros fatores. Em outros exemplos, em ciclos subsequentes de administração, a enzima degradadora de hialuronan pode ser administrada menos frequentemente. Por exemplo, em um primeiro ciclo, a enzima degradadora de hialuronan é administrada duas vezes por semana durante quatro semanas, e em ciclos subsequentes de administração, a enzima degradadora de hialuronan é administrada uma vez por semana, ou uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada 3 semanas (por exemplo, uma vez a cada 21 dias) ou uma vez a cada quatro semanas. Tal como aqui descrito, a dose ou regime de dosagem de corticosteroide é dependente do regime de dosagem de enzima degradadora de hialuronan.
[0450] Embora as dosagens possam variar dependendo da doença e do paciente, a enzima degradadora de hialuronan, tal como uma hialuronidase PEGuilada, é geralmente administrada em uma quantidade que é ou é de cerca de, no intervalo de 0,01 ug/kg, tal como 0,0005 mg/kg (0,5 pg/kg9) a 10 mg/kg (320,000 U/kg), por exemplo, 0,02 mg/kg a 1,5 mg/kg, por exemplo, 0,05 mg/kg. A hialuronidase PEGuilada pode ser administrada, por exemplo, a uma dosagem de, a ou cerca de 0,0005 mg/kg (do indivíduo), 0,0006 mg/kg, 0,0007 mg/kg, 0,0008 mg/kg, 0,0009 mg/kg, 0,001 mg/kg, 0,0016 mg/kg, 0,002 mg/kg, 0,003 ma/kg, 0,004 mg/kg, 0,005 mg/kg, 0,006 mg/kg, 0,007 mg/kg, 0,008 mg/kg, 0,009 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,016 mg/kg, 0,02 mg/kg, 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg/kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg, 0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mao/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg,
5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, 21 mg/kg, 22 mg/kg, 23 mg/kg, 24 mg/kg, 25 mg/kg, ou mais, é administrado, a um ser humano adulto médio, normalmente pesando cerca de 70 kg a 75 kg. Em exemplos particulares, a enzima degradadora de hialuronan é administrada em quantidades inferiores, tais como menos do que 20 ug/kg, por exemplo de 0,01 pg/kg a 15 unug/kg, 0,05 npg/kg a 10 npg/k9g9, 0,75 ug/kg a 7,5 1ug/kg, ou 1,0 poa/kg a 3,0 pg /kg.
[0451] Uma enzima degradadora de hialuronan, tal como hialuronidase PEGuilada (por exemplo PH20), aqui proporcionada, por exemplo, PEGPH20, pode ser administrada a, ou cerca de 1 Unidade/kg a 800,000 Unidades/kg, tal como a 10 a 800,000 Unidades/kg, 10 a 750,000 Unidades/kg, 10 a 700,000 Unidades/kg, 10 a 650,000 Unidades/kg, 10 a 600,000 Unidades/kg, 10 a 550,000 Unidades/kg, 10 a 500,000 Unidades/kg, 10 a 450,000 Unidades/kg, 10 a 400,000 Unidades/kg, 10 a 350,000 Unidades/kg, 10 a 320,000 Unidades/kg, 10 a 300,000 Unidades/kg, 10 a 280,000 Unidades/kg, 10 a 260,000 Unidades/kg, 10 a 240,000 Unidades/kg, 10 a 220,000 Unidades/kg, 10 a 200,000 Unidades/kg, 10 a 180,000 Unidades/kg, 10 a 160,000 Unidades/kg, 10 a 140,000 Unidades/kg, 10 a 120,000 Unidades/kg, 10 a 100,000 Unidades/kg, 10 a 80,000 Unidades/kg, 10 a 70,000 Unidades/kg, 10 a 60,000 Unidades/kg, 10 a 50,000 Unidades/Kkg, 10 a 40,000 Unidades/kg, 10 a 30,000 Unidades/kg, 10 a 20,000 Unidades/kg, 10 a 15,000 Unidades/kg, 10 a 12,800 Unidades/kg, 10 a 10,000 Unidades/kg, 10 a 9,000 Unidades/kg, 10 a 8,000 Unidades/kg, 10 a 7,000 Unidades/kg, 10 a 6,000 Unidades/kg, 10 a 5,000
Unidades/kg, 10 a 4,000 Unidades/kg, 10 a 3,000 Unidades/kg, 10 a 2,000 Unidades/Kkg, 10 a 1,000 Unidades/kg, 10 a 900 Unidades/kg, 10 a 800 Unidades/kg, 10 a 700 Unidades/kg, 10 a 500 Unidades/kg, 10 a 400 Unidades/kg, 10 a 300 Unidades/kg, 10 a 200 Unidades/kg, 10 a 100 Unidades/kg, 16 a 600,000 Unidades/kg, 16 a 500,000 Unidades/kg, 16 a 400,000 Unidades/kg, 16 a 350,000 Unidades/kg, 16 a 320,000 Unidades/kg, 16 a 160,000 Unidades/kg, 16 a 80,000 Unidades/kg, 16 a 40,000 Unidades/kg, 16 a 20,000 Unidades/kg, 16 a 16,000 Unidades/kg, 16 a 12,800 Unidades/kg, 16 a 10,000 Unidades/kg, 16 a 5,000 Unidades/kg, 16 a 4,000 Unidades/kg, 16 a 3,000 Unidades/kg, 16 a 2,000 Unidades/kg, 16 a 1,000 Unidades/kg, 16 a 900 Unidades/kg, 16 a 800 Unidades/kg, 16 a 700 Unidades/kg, 16 a 500 Unidades/kg, 16 a 400 Unidades/kg, 16 a 300 Unidades/kg, 16 a 200 Unidades/kg, 16 a 100 Unidades/kg, 160 a 12,800 Unidades/kg, 160 a 8,000 Unidades/kg, 160 a 6,000 Unidades/kg, 160 a 4,000 Unidades/kg, 160 a 2,000 Unidades/kg, 160 a 1,000 Unidades/kg, 160 a 500 Unidades/kg, 500 a 5000 Unidades/kg, 1000 a 100,000 Unidades/kg ou 1000 a 10,000 Unidades/kg, da massa de um indivíduo a quem ela é administrada. Em alguns exemplos, uma enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase PEG (por exemplo PH20), aqui fornecida, por exemplo PEGPH20, pode ser administrada a, ou cerca de 1 Unidade/kg a 1000 Unidades/kg, 1 Unidades/kg a 500 Unidades/kg ou 10 Unidades/kg a 50 Unidades/kg.
[0452] Geralmente, quando a atividade específica da hialuronidase PEGuilada é, ou é de cerca de 18,000 U/mg a 45,000 U/mg, geralmente a ou cerca de 18,000 U/mg a 45,000 U/mg, geralmente a ou cerca 1 Unidade/kg (U/kg), 2 U/kg, 3 U/kg, 4 U/kg, 5 U/kg, 6 U/kg, 7 U/kg, 8 U/kg, 8
U/kg 10 U/kg, 16 U/kg, 32 U/kg, 64 U/Kkg, 100 U/kg, 200 U/kg, 300 U/kg, 400 U/kg, 500 U/kg, 600 U/kg, 700 U/kg, 800 U/kg, 900 U/kg, 1,000 U/kg, 2,000 U/kg, 3,000 U/kg, 4,000 U/kg, 5,000 U/kg, 6,000 U/kg, 7,000 U/kg, 8,000 U/kg, 9,000 U/kg, 10,000 U/kg, 12,800 U/kg, 20,000 U/kg, 32,000 U/Kkg, 40,000 U/kg, 50,000 U/kg, 60,000 U/kg, 70,000 U/kg, 80,000 U/kg, 90,000 U/kg, 100,000 U/kg, 120,000 U/kg, 140,000 U/kg, 160,000 U/kg, 180,000 U/kg, 200,000 U/kg, 220,000 U/kg, 240,000 U/kg, 260,000 U/kg, 280,000 U/kg, 300,000 U/kg, 320,000 U/kg, 350,000 U/kg, 400,000 U/kg, 450,000 U/kg, 500,000 U/kg, 550,000 U/kg, 600,000 U/kg, 650,000 U/kg, 700,000 U/kg, 750,000 U/kg, 800,000 U/kg ou mais, por massa do indivíduo a ser administrado.
[0453] Em alguns aspectos, a enzima degradadora de hialuronan PEGuilado é formulada e doseada para manter, pelo menos, 3 U/mL de hialuronidase PEGuilada no plasma (ver por exemplo Requerimento de patente dos EUA publicado No. US20100003238 e Requerimento de patente dos EUA publicado No. WO2009128917). Por exemplo, a hialuronidase solúvel PEGuilada é formulada para a administração sistêmica de uma quantidade suficiente para manter, pelo menos, cerca de 3 U/mL, no plasma, em geral, 3 U/mL-12 U/ml ou mais, por exemplo, a partir de, pelo menos, ou sobre, ou a um nível 4 U/mL, 5 U/mL, 6 U/mL, 7 U/mL, 8 U/mML, 9 U/mL, U/mL, 11 U/mL, 12 U/mL, 13 U/mL, 14 U/mML, 15 U/mL, 16 U/mL, 17 U/mL, 18 U/mL, 19 U/mL, 20 U/mL, 25 U/mL, 30 U/mL, U/mL, 40 U/mL, 45 U/mL, 50 U/ML ou mais. Geralmente, para os fins aqui descritos, pelo menos, 3 U/mL de hialuronidase no plasma, ou cerca de 0,02 mg/kg (do indivíduo), 0,03 mg/kg, 0,04 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,06 mg/kg, 0,07 mg/kg, 0,08 mg/kg, 0,09 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,15 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,30 mg/kg, 0,35 mg/kg, 0,40 mg/kg, 0,45 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,55 mg:kg, 0,6 mg/kg, 0,7 mg/kg,
0,8 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg ou mais é administrado. Geralmente, quando a atividade específica da hialuronidase modificada é, ou é cerca de 20,000 U/mg a 60,000 U/mg, geralmente ou cerca de 35,000 U/mg, 60,000 U; 70,000 U; 80,000 U; 90,000 U; 100,000 U; 200,000 U; 300,000 U; 400,000 U; 500,000 U; 600,000 U; 700,000 U; 800,000 U; 900,000 U; 1,000,000 U; 1,500,000 U; 2,000,000 U; 2,500,000 U; 3,000,000 U; 3,500,000 U; 4,000,000 U ou mais é administrado. Para manter esses níveis, a administração pode ser por dia, várias vezes por semana, duas vezes por semana, semanalmente ou mensalmente.
[0454] Está dentro do nível de um especialista na arte, determinar as quantidades de enzima degradante de ácido hialurônico PEGuilado, por exemplo, PEG PH20, para manter, pelo menos, 3 U/mL de hialuronidase no sangue. O nível de hialuronidase no sangue pode ser monitorado ao longo do tempo, a fim de garantir que uma quantidade suficiente da hialuronidase esteja presente no sangue. Qualquer ensaio conhecido por um perito na arte, para medir a hialuronidase no plasma, pode ser realizado. Por exemplo, um ensaio de microturbidez ou enzimático, descrito nos Exemplos aqui apresentados, podem ser realizados em proteínas no plasma. É entendido que o plasma normalmente contém enzimas hialuronidase. Tais enzimas hialuronidase do plasma têm normalmente atividade de um pH ácido (pat. dos EUA No. 7,105,330). Assim, antes do tratamento com uma enzima modificada, os níveis plasmáticos de hialuronidase devem ser determinados e utilizados como linha de base. Medições subsequentes de níveis plasmáticos de hialuronidase após o tratamento, podem ser comparados a níveis antes dos tratamentos. Alternativamente, o ensaio pode ser realizado sob condições de pH que suprimem a atividade hialuronidase lisossomal endógena no plasma, que normalmente apresenta atividade com pH ácido. Assim, onde a hialuronidase solúvel modificada é ativa a um pH neutro (por exemplo PH20 humana), somente o nível de hialuronidase solúvel neutro-ativa modificado é medido.
[0455] Em outros exemplos, a enzima degradadora de hialuronan PEGuilado é formulada e administrada a uma dose mais baixa, que se encontra aqui para ter efeitos terapêuticos, de um tratamento de uma doença ou condições associadas ao hialuronan, na ausência de um nível detectável de hialuronidase mantida no sangue. Por exemplo, a hialuronidase solúvel PEGuilada é administrada em uma quantidade que é inferior a 20 pg/kg, por exemplo 0,01 ug/kg a 15 pg/kg, 0,05 ug/kg a 10 pg/kg, 0,75 pg/kg a 7,5 vg/kg ou 1,0 pg/kg a 3,0 pg/kg, tal como a, ou cerca de 0,01 ug/kg (do indivíduo), 0,02 pg/kg, 0,03 upg/kg, 0,04 vg/kg, 0,05 ug/kg, 1,0 pg/kg, 1,5 npg/kg, 2,0 np9g/kg, 2,5 p9/kg, 3,0 pg/kg, 3,5 pg/kg, 4,0 p9/k9, 4,5 pg/kg, 5,0 p9I/kg, 5,5 pg/kg, 6,0 pg/kg, 7,0 np9/kg9, 7,5 npg/kg, 8,0 vo/kg, 9,0 pg/kg, 10,0 pog/kg, 12,5 p9g/kg ou 15 pupg/kg. Geralmente, quando a atividade específica da hialuronidase é modificada ou é de cerca de 20,000 U/mg a 60,000 U/mg, normalmente a ou cerca de 35,000 U/mg, 200 Unidades para 50,000 (U) são administradas, tal como 200 U, 300 U; 400 U; 500 U; 600 U; 700 U; 800 U; 900 U; 1,000 U; 1250 U; 1500 U; 2000 U; 3000 U; 4000 U; 5,000 U; 6,000 U; 7,000 U; 8,000 U; 9,000 U; 10,000 U; 20,000 U; 30,000 U; 40,000 U; ou 50,000 U é administrado. Para manter esses níveis, a administração pode ser por dia, várias vezes por semana, duas vezes por semana, semanalmente ou mensalmente.
[0456] Normalmente, os volumes de injeções Ou infusões de hialuronidase PEGuilada aqui contemplados são a partir de, ou cerca de 0,5 mL, 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL ou mais. A enzima degradadora de hialuronan PEGuilada, tal como uma hialuronidase PEGuilada pode ser fornecida como uma solução estoque ou cerca de 50 U/mL, 100 U/mL, 150 U/mML, 200 U/mL, 400 U/mML ou 500 U/mL (ou uma quantidade funcionalmente equivalente) ou pode ser fornecida sob uma forma mais concentrada, por exemplo a, ou cerca de 1000 U/mL, 2000 U/mL, 3000 U/mL, 4000 U/mL, 5000 U/mL, 6000 U/mL, 7000 U/mL, 8000 U/mL, 9000 U/mL, 10,000 U/mL, 11,000 U/mL, 12,000 U/mL, ou 12,800 U/mL, para uso direto ou por diluição, a uma concentração efetiva antes de um uso. O volume de enzima que degrada hialuronan PEGuilado, tais como hialuronidase PEGuilada, administrado é uma função da dosagem necessária, mas pode ser variado, dependendo da concentração de uma enzima degradadora de hialuronan, tal como uma formulação estoque disponível de hialuronidase solúvel. Por exemplo, é contemplado aqui, que a enzima que degrada hialuronan PEGuilado, como hialuronidase PEGuilada, não é administrada em volumes maiores do que cerca de 50 ml, e, normalmente, é administrada em um volume de 5-30 ml, geralmente em um volume que é não maior do que cerca de 10 mL. A enzima degradadora de hialuronan PEGuilado, tal como uma hialuronidase PEGuilada, pode ser fornecida como uma formulação líquida ou liofilizada. Formulações Liofilizadas são ideais para armazenamento de grandes doses de unidades de enzimas degradadoras de hialuronan PEGuilado.
4. Tratamentos combinados
[0457] Os agentes anti-hialuronan, tais como enzimas que degradam hialuronan, ou sua forma modificada (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado ou hialuronidase PEGuilada como PEGPH20) pode ser administrada em uma terapia de associação, por exemplo,
para o tratamento de uma doença ou condição associada a hialuronan, como o câncer. As composições de um agente anti-hialuronan podem ser co-formuladas ou co-administradas em conjunto com, antes de, de forma intermitente com, ou subsequentemente a, outros agentes ou tratamentos terapêuticos, ou farmacológicos, tais como os procedimentos, por exemplo, agentes ou tratamentos para tratar uma doença ou condição associada ao ácido hialurônico, por exemplo, cânceres associados ao ácido hialurônico. Tais agentes incluem, mas não estão limitados a, outros agentes biológicos, agentes anticâncer, compostos de moléculas pequenas, agentes dispersantes, anestésicos, vasoconstritores e cirurgia, e suas combinações. Tais outros agentes e tratamentos que estão disponíveis para o tratamento de uma doença ou condição, incluindo todos os aqui exemplificados, são conhecidos por um perito na arte ou podem ser determinados empiricamente.
[0458] Uma preparação de um segundo agente ou agentes, ou tratamento ou tratamentos podem ser administrados de uma só vez, ou podem ser divididos em um número menor de doses a serem administradas em intervalos de tempo. As preparações do tratamento/agentes selecionados podem ser administrados em uma ou mais doses durante o decurso de um tempo de tratamento, por exemplo, ao longo de várias horas, dias, semanas ou meses. Em alguns casos, a administração contínua é útil. Entende-se que a dosagem precisa e curso da administração dependem da indicação e tolerabilidade do doente. Geralmente, os regimes de dosagem para segundos agentes/tratamentos aqui descritos são conhecidos para um perito na arte.
[0459] Em exemplo, um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada conjugada com um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, como hialuronidase PEGuilada), é administrada com um segundo agente ou tratamento, ou para o tratamento da doença ou condição.
Em um exemplo, um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou uma forma sua modificada conjugada com um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan PEGuilado) e segundo agente Ou tratamento pode ser co-formulado e administrado em conjunto.
Em outro exemplo, um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada conjugada com um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, como hialuronidase PEGuilada) é — subsequentemente administrada, de forma intermitente ou em simultâneo com a preparação do segundo agente ou tratamento.
Geralmente, um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado) é administrada antes da administração da preparação do segundo agente ou tratamento, para permitir que o agente reduza o nível ou quantidade de hialuronan associada ao tecido ou às células.
Por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, é administrada antes de um segundo agente ou tratamento, para permitir que a enzima reduza Ou degrade o ácido hialurônico em uma célula, tecido ou fluido do indivíduo, tal como, por exemplo, o espaço intersticial, matriz extracelular, tecido do tumor, sangue ou outros tecidos.
Por exemplo, um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada conjugada com um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado, tal como hialuronidase solúvel) pode ser administrada 0,5 minutos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 6 minutos, 7 minutos, 8 minutos, 9 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 1 hora ou mais, antes da administração do segundo agente ou preparação. Em alguns exemplos, um agente anti- hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan ou sua forma modificada conjugada a um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan PEGuilado) é administrada juntamente com o segundo agente de preparação. Como irá ser apreciado pelos peritos na arte, a proximidade desejada da co-administração depende, em parte significativa, do efeito de meia-vida dos agentes no tecido determinado, e da doença particular a ser tratada, e pode ser facilmente otimizada através do teste dos efeitos da administração dos agentes em diferentes tempos em modelos adequados, tais como em modelos animais adequados. Em algumas situações, a altura ótima de administração do agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, ou sua forma modificada conjugada com um polímero (por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan PEGuilado, tal como uma hialuronidase PEGuilada) será superior a 60 minutos.
[0460] Por exemplo, um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, pode ser administrada em conjunto com agentes anticâncer (ver, por exemplo, Publicação dos EUA No. US2010-0003238). O (s) agente (s) ou tratamento (s) anticancerígeno (s) para utilização em combinação com uma enzima degradadora de hialuronan inclui, mas não está limitado a, cirurgia, radiação, medicamentos, quimioterapia, polipeptídeos, anticorpos, peptídeos, moléculas pequenas ou vetores de terapia genética, vírus ou DNA.
[0461] Em outros exemplos, os métodos de tratamento aqui proporcionados incluem métodos de administração de um ou mais agentes anti-hialuronan para a terapia, além de uma enzima degradadora de hialuronan.
Os agentes anti-hialuronan incluem qualquer agente que reduz ou elimina a acumulação de HA em um tumor.
Tais agentes incluem, mas não estão limitados às enzimas que degradam hialuronan aqui descritas, e também os agentes que inibem a síntese de HA.
Por exemplo, agentes anti-hialuronan que inibem a síntese de hialuronan incluem moléculas sense ou anti-sense contra um gene has.
Tal inibição sense ou anti- sense é normalmente baseada na hibridização de hidrogênio à base de ligação de fios ou segmentos de oligonucleotídeos, de tal modo que, pelo menos, um fio ou um segmento é clivado, degradado ou de outra forma tornado inoperável.
Em outros exemplos, o silenciamento pós-transcricional (PTGS), RNAi, ribozimas e DNAzimas podem ser utilizados.
Está dentro do nível de um especialista na arte, gerar estas construções com base na sequência HAS1 (estabelecida na SEQ ID NO: 195), HAS2 (estabelecida na SEQ ID NO:196) ou HAS3 (estabelecida na SEQ ID NO:197 ou 198). É entendido na arte que a sequência de um composto sense ou anti-sense, não necessita ser 100% complementar a do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridável.
Um oligonucleotídeo pode hibridizar ao longo de um ou mais segmentos, de tal modo que segmentos de intervenção ou adjacentes não estão envolvidos no evento de hibridização (por exemplo, uma estrutura loop ou estrutura hairpin). Geralmente, os compostos sense ou anti-sense tem, pelo menos, 70% de complementaridade de sequência com uma região alvo no ácido nucleico alvo, por exemplo, 75% a 100% de complementaridade, tal como 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100%. Moléculas exemplares sense ou anti-sense são conhecidas na arte (ver por exemplo, Chao et al. (2005) JJ.
Biol.
Chem.280:27513-27522; Simpson et al. (2002) J.
Biol.
Chem. 277:10050-10057; Simpson et al. (2002) Am.
J
Path. 161:849; Nishida et al. (1999) JJ. Biol. Chem. 274:21893-21899; Edward et al. (2010) British 4 Dermatology 162:1224-1232; Udabage et al. (2005) Cancer Res. 65:6139; e Requerimento de Patente dos USA publicado No. US20070286856). Outro agente anti-hialuronan exemplar que é um inibidor da síntese de HA é 4-metilumbeliferona (4-MU; 7-hidroxi-4-metilcumarina) ou um derivado seu. 4-MU age reduzindo o precursor UDP-GlIcUA, que é necessário para a síntese de HA. Outros exemplos de agentes anti-hialuronan são os inibidores da tirosina quinase, tais como a leflunomida (Arava), ou genisteína erbstatina.
[0462] Em alguns exemplos, um corticosteroide pode ser administrado para melhorar os efeitos colaterais ou efeitos adversos de uma enzima degradadora de hialuronan na terapia de combinação (Requerimento de Patente dos EUA publicado No. 13/135,817). Em alguns exemplos, o glicocorticoide é selecionado entre cortisona, dexametasonas, hidrocortisonas, metilprednisolonas, prednisolonas e prednisonas. Em um exemplo particular, o glicocorticoide é dexametasona. Geralmente, o corticosteroide é administrado por via oral, apesar de qualquer método de administração de corticosteroide ser contemplado. Normalmente, o glicocorticoide é administrado em uma quantidade entre, ou cerca de 0,4 e 20 mg, por exemplo, a ou cerca de 0.4 mgs, 0.5 mgs, 0.6 mgs, 0.7 mgs
0.75 mgs, 0.8 mgs, 0.9 mas, 1 mg, 2 mgs, 3 mgs, 4 mgs, 5 mgs, 6 mgs, 7 mgs, 8 mas, 9 mgs, 10 mgs, 11 mas, 12 mgs, 13 magos, 14 mgs, 15 mgs, 16 mas, 17 mgs, 18 mgs, 19 mgs ou 20 mgs por dose.
F. MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPEPTÍDEOS CODIFICADOS DE ENZIMAS QUE DEGRADAM HIALURONAN E PROTEÍNAS LIGADAS AO HIALURONAN
[0463] Os polipeptídeos de uma proteína de ligação a hialuronan, para utilização nas composições e métodos “proporcionados, ou uma enzima degradadora de hialuronan, por exemplo, um hialuronidase solúvel, para o tratamento aqui apresentado, pode ser obtida por métodos bem conhecidos na arte, para a purificação de proteínas e expressão de proteínas recombinantes. Qualquer método conhecido por peritos na arte para a identificação de ácidos nucleicos que codificam os genes desejados, pode ser utilizado. Qualquer método disponível na arte pode ser utilizado para obter uma proteína de ligação a hialuronan que codifica um clone de DNA genômico ou CcDNA de comprimento total (ou seja, que abranja toda a região de codificação) ou uma hialuronidase, tal como, a partir de uma fonte de célula ou tecido. Proteínas de ligação ao hialuronan ou hialuronidases modificadas ou variantes, podem ser manipuladas a partir de um polipeptídeo do tipo selvagem, tal como por mutagênese dirigida a um local.
[0464] Os polipeptídeos podem ser clonados Ou isolados, utilizando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na especialidade para a clonagem e isolamento de moléculas de ácidos nucleicos. Tais métodos incluem a amplificação de ácidos nucléicos e triagem de bibliotecas, incluindo screening de hibridização de ácidos nucleicos, baseada em anticorpos, e screening baseado em atividade.
[0465] Métodos para a amplificação de ácidos nucleicos podem ser utilizados para isolar moléculas de ácido nucleico que codificam para um polipeptídeo desejado, incluindo, por exemplo, métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Um ácido nucleico contendo o material pode ser utilizado como material de partida, a partir do qual uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo desejado pode ser isolada. Por exemplo, as preparações de DNA e de mRNA, extratos celulares, extratos de tecidos, amostras de fluidos (por exemplo, sangue, Soro, saliva), amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes podem ser utilizadas em métodos de amplificação. Bibliotecas de ácidos nucleicos podem também ser utilizadas como uma fonte de material de partida. Os primers podem ser concebidos para amplificar um polipeptídeo desejado. Por exemplo, os primers podem ser concebidos com base em sequências expressas a partir das quais um polipeptídeo desejado é gerado. Primers podem ser projetados com base na tradução de uma sequência de aminoácido de polipeptídeo. Moléculas de ácidos nucleicos geradas por amplificação podem ser sequenciadas e confirmadas para codificar um polipeptídeo desejado.
[0466] Sequências de nucleotídeos adicionais podem ser ligadas a uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, incluindo sequências de ligantes contendo locais de endonucleases de restrição para oO objetivo de clonagem do gene sintético em um vetor, por exemplo, um vetor de expressão da proteína, ou um vetor concebido para a amplificação das sequências de DNA que codificam o núcleo da proteína. Além disso, as sequências de nucleotídeos adicionais que especificam os elementos de DNA funcionais podem ser operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo. Exemplos de tais sequências incluem, mas não estão limitadas a sequências promotoras concebidas para facilitar a expressão intracelular de proteínas, e as sequências de secreção, por exemplo sequências de sinal heterólogas, destinadas a facilitar a secreção de proteína. Tais sequências são conhecidas por peritos na arte. Sequências de resíduos de nucleotídeos adicionais, tais como sequências de bases que especificam as regiões de ligação de proteínas também podem ser ligadas as moléculas de ácido nucleico que codificam a enzima. Tais regiões incluem, mas não estão limitadas às sequências de resíduos que facilitam ou codificam proteínas que facilitam a absorção de uma enzima em células alvo especificas, ou de outro modo, alteram a farmacocinética de um produto de um gene sintético. Por exemplo, as enzimas podem ser ligadas a porções PEG.
[0467] Além disso, marcadores ou outras porções podem ser adicionadas, por exemplo, para auxiliar a detecção ou purificação por afinidade do polipeptídeo. Por exemplo, sequências adicionais de resíduos de nucleotídeos, tais como sequências de bases que especificam um epítopo marcador ou outro marcador detectável também podem ser ligadas às moléculas de ácido nucleico que codificam enzima. Exemplos de tais sequências incluem as sequências de ácidos nucleicos que codificam uma His tag (por exemplo, 6exHis, HHHHHH; SEQ ID NO:54) ou Flag tag (DYKDDDDK; SEQ ID NO:55).
[0468] Os ácidos nucleicos identificados e isolados podem, então, ser inseridos em um vetor de clonagem adequado. Um grande número de sistemas vetor- hospedeiro conhecidos na arte pode ser utilizado. Os vetores possíveis incluemy mas não estão limitados a, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema vetor deve ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos tais como os derivados de lambda, ou plasmídeos tais como PpCMVA4, pBR322 ou plasmídeo derivado pUC, ou vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). Outros vetores de expressão incluem o vetor de expressão HZ24 aqui exemplificado. A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser realizada ligando o fragmento de DNA em um vetor de clonagem que possua terminais coesivos complementares. A inserção pode ser realizada utilizando vetores de clonagem TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se os locais de restrição complementares utilizados para fragmentar o DNA não estão presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser modificadas enzimaticamente. Alternativamente, qualquer local desejado pode ser produzido ligando sequências de nucleotídeos (ligantes) aos terminais de DNA; estes ligantes ligados podem conter oligonucleotídeos específicos sintetizados quimicamente que codificam sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição. Em um método alternativo, oO vetor clivado e o gene da proteína podem ser modificados por caudas homopoliméricas. Moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras através de, por exemplo, transformação, transfecção, infecção, eletroporação e sonoporação, de modo que muitas cópias da sequência do gene sejam geradas.
[0469] Em modalidade específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas DNA recombinantes que incorporam o gene isolado de proteína, cDNA, ou uma sequência de DNA sintetizada permite a geração de múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades por transformadores de cultura, isolando as moléculas de DNA recombinante, a partir dos transformadores e, quando necessário, recuperando o gene inserido a partir do DNA recombinante isolado.
1. Vetores e Células
[0470] Para a expressão recombinante de uma ou mais das proteínas desejadas, tais como qualquer proteína de ligação a hialuronan ou enzima degradadora de hialuronan aqui descrita, o ácido nucleico que contém a totalidade ou uma porção da sequência de nucleotídeo que codifica a proteína, pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contenha os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação das proteínas inseridas. os sinais de transcrição e de tradução necessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo para os genes de enzimas, e/ou suas regiões flanqueadoras.
[0471] Também são fornecidos vetores que contêm um ácido nucleico que codifica a enzima. As células que contêm os vetores são também fornecidas. As células incluem células eucariotas e procariotas, e os vetores são adequados para qualquer utilização nas mesmas.
[0472] As células procariotas e eucariotas, incluindo células endoteliais que contêm os vetores, são fornecidas. Tais células incluem células bacterianas células de leveduras, células de fungos, Archea, células vegetais, células de insetos e células animais. As células são utilizadas para produzir uma proteína das mesmas, fazendo crescer as células acima descritas em condições tais que a proteína codificada é expressa pela célula, e pela recuperação da proteína expressa. Para os fins aqui descritos, por exemplo, a enzima pode ser segregada para oO meio.
[0473] São proporcionados vetores que contêm uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de enzima degradadora de hialuronan, em alguns exemplos, um polipeptídeo hialuronidase solúvel, juntamente com a sequência de sinal nativa ou heteróloga, assim como várias das suas cópias. Os vetores podem ser selecionados para a expressão da proteína da enzima na célula, ou de tal modo que a proteína de enzima seja expressa como uma proteína segregada.
[0474] Uma variedade de sistemas hospedeiro-vetor pode ser utilizada para expressar a sequência de codificação da proteína. Estes incluem, mas não estão limitados a sistemas de células de mamíferos infectados com vírus (por exemplo, vírus vaccinia, adenovírus e outros vírus); sistemas de células de insetos infectados com vírus (por exemplo, baculovírus); microrganismos tais como vetores de leveduras contendo leveduras; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA, plasmídeo de DNA, ou cosmídeo de DNA. Os elementos de expressão de vetores variam nos seus pontos fortes e especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vetor utilizado, qualquer um de um certo número de elementos de translação e transcrição apropriado pode ser utilizado.
[0475] Quaisquer métodos conhecidos por peritos na arte para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo um gene quimérico que contém sinais de controle translacionais/transcricionais apropriados, e sequências codificadoras de proteína. Estes métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas de síntese e recombinantes in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácidos nucleicos que codificam para proteínas, Ou domínios, derivados, fragmentos ou seus homólogos, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico, de modo que os genes ou fragmentos dos mesmos sejam expressos em um hospedeiro transformado com a molécula de DNA recombinante. Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/estimulador conhecido na arte. Em uma modalidade específica, o promotor não é nativo ao gene para uma proteína desejada. Os promotores que podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados ao promotor precoce de SV40 (Bernoist and Chambon, Nature
290:304-310 (1981)), o promotor contido na extremidade 3' da repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al.
Cell22:787-797 (1980)), o promotor da quinase de timidina de herpes (Wagner et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:1441-1445 (1981)), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982) ); vetores de expressão procarióticos tais como o promotor B-lactamase (Jay et al., (1981) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al., Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 80:21-25 (1983)); ver também Gilbert e Villa-Komaroff “Useful Proteins from Recombinant Bacteria” Scientific American 242:74-94 (1980)); Os vetores de expressão de plantas contendo o promotor da nopalina-sintetase ((Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor do RNA 35S do vírus do mosaico da couve-flor ( (Gardner et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), e o promotor da enzima fotossintética de ribulose bifosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de levedura e outros fungos tais como o promotor Gal, o promotor de álcool- desidrogenase, o promotor da fosfoglicerol quinase, O promotor da fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controle transcricional animal que exibem especificidade do tecido e vem sendo utilizadas em animais transgênicos: região de controle do gene da elastase I, que é ativo em células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639- 646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp.
Quant.
Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)) ; região de controle do gene da insulina que é ativo em células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controle do gene da imunoglobulina que é ativo em células linfoides
(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controle do vírus do tumor mamário em camundongos, que é ativo em testículo, mama, linfoides e mastócitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), região de controle do gene da albumina que é ativo no fígado (Pinkert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), região de controle do gene alfa-fetoproteína que é ativo no fígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639- 1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987) ), região de controle do gene alfa-l antitripsina que atua no fígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), região de controle do gene beta globina que é ativo em células mieloides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)),, região de controle do gene da proteína básica da mielina que é ativa em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), região de controle do gene miosina da cadeia -2 leve, que é ativa no músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), e na região de controle de gene do hormônio de liberação gonadotrófica que é ativo em gonadotropos do hipotálamo (Mason et al.,Science 234:1372-1378 (1986)).
[0476] Em uma modalidade específica, um vetor que é usado contém um promotor operacionalmente ligado a ácidos nucleicos que codificam uma proteína desejada, Ou um domínio, fragmento, derivado ou homólogo dos mesmos, uma ou mais origens de replicação e, opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de resistência aos antibióticos). Exemplos de vetores plasmídicos para a transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vetores de expressão Pp0EOE (disponíveis a partir da Qiagen, Valência, CA, ver também a literatura publicada pela Qiagen descrevendo o sistema). Vetores poQE ter um promotor de fago T5 (reconhecido por E. coli, RNA polimerase) e um módulo de repressão do operador lac duplo, para proporcionar expressão fortemente regulada, de alto nível, de proteínas recombinantes em E. coli, um local de ligação ao ribossoma sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência de codificação de marcação 6XHis, terminadores da transcrição TO e Tl, origem ou replicação de ColEl, e um gene da beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vetores poQE permitem a colocação de uma marcação 6xHis tanto no N- ou C- terminal da proteína recombinante. Tais plasmídeos incluem POE 32, poE 30, e poE 31, que fornecem vários sítios de clonagem para todos os três quadros de leitura, e para proporcionar a expressão de proteínas marcadas 6xHis no n- terminal. Outros exemplos de vetores plasmídeo para a transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (ver, Patente dos EUA No.
4.952.496; disponível a partir de Novagen, Madison, WI; ver, também a literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem pET lla, que contém o promotor T7lac, o terminador T7, o operador E. coli lac induzido, e o gene repressor lac ; pET l12a-c, que contém o promotor T7, terminador T7, e o sinal de secreção de E. coli ompT; e pET 15b e pET19b (Novagen, Madison, WI), que contém uma sequência líder His-Tag"”" para utilização na purificação com uma coluna His e um local de clivagem de trombina, que permite a clivagem seguida de purificação sobre a coluna, a região de promotor T7-lac, e o terminador T7.
[0477] Exemplos de um vetor para expressão de células de mamífero é o vetor de expressão HZ24. O vetor de expressão HZ24 foi derivado a partir da espinha dorsal do vetor pCI (Promega). Ele contém DNA que codifica o gene de resistência de beta-lactamase (AMpR) , uma origem de replicação Fl, uma região potenciadora/promotora precoce- imediata de citomegalovírus (CMV), e um sinal de poliadenilação tardia de SV40 (SV40). O vetor de expressão também possui um local interno de entrada do ribossoma (IRES) do vírus ECMV (Clontech) e o gene da di-hidrofolato redutase de camundongo.
2. Expressão
[0478] Proteínas de ligação ao hialuronan e polipeptídeos de enzima que degradam hialuronan, incluindo polipeptídeos hialuronidase solúveis, podem ser produzidos por qualquer método conhecido por peritos na arte, incluindo, métodos in vivo e in vitro. Proteínas desejadas podem ser expressas em qualquer organismo apropriado para produzir as quantidades necessárias e as formas de proteínas, tais como, por exemplo, as necessárias para a administração e tratamento. Hospedeiros de expressão incluem organismos procariotas e eucariotas, tais como E. coli, leveduras, plantas, células de insetos, células de mamíferos, incluindo linhagens de células humanas e animais transgênicos. Hospedeiros de expressão podem diferir nos seus níveis de produção de proteína, bem como os tipos de modificações pós- traducionais que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e outros fatores, tais como considerações regulatórias e de segurança, e os custos de produção e à necessidade de métodos para a purificação.
[0479] Muitos vetores de expressão estão disponíveis e são conhecidos pelos peritos na arte, e podem ser utilizados para a expressão de proteínas. A escolha do vetor de expressão vai ser influenciada pela escolha do sistema de expressão do hospedeiro. Em geral, os vetores de expressão podem incluir promotores de transcrição e, opcionalmente, potenciadores, sinais de tradução e de transcrição, e sinais de terminação da tradução. Os vetores de expressão que são usados para a transformação estável têm normalmente um marcador selecionável que permite a seleção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, uma origem de replicação pode ser utilizada para amplificar o número de cópias do vetor.
[0480] Proteínas de ligação ao hialuronan e polipeptídeos de enzima degradadora de hialuronan, tais como polipeptídeos de hialuronidase solúveis, também podem ser utilizados, ou expressos como proteínas de fusão. Por exemplo, uma enzima de fusão pode ser gerada para adicionar funcionalidades a uma enzima. Exemplos de proteínas de fusão de enzimas incluem, mas não estão limitados a, fusões de uma sequência de sinal, uma marcação, tal como para a localização, por exemplo, uma His6 tag ou myc tag, ou uma marcação para a purificação, por exemplo, uma fusão de TSG, e uma sequência para dirigir a secreção de proteínas e/ou associação de membranas.
a. células procariotas
[0481] Os procariotas, em especial E. coli, proporcionam um sistema para a produção de grandes quantidades de proteínas. A transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida por peritos na arte. Os vetores de expressão de E. coli podem conter promotores induzíveis, tais promotores são úteis para a indução de níveis elevados de expressão da proteína, e para a expressão de proteínas que exibem alguma toxicidade para as células hospedeiras. Exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac híbrido, os promotores T7 e SP6 RNA e o promotor APL de temperatura regulada.
[0482] Proteínas, tais como qualquer aqui proporcionada, podem ser expressas no ambiente citoplasmático de E. coli.
O citoplasma é um ambiente redutor, e para algumas moléculas, pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis.
Os agentes redutores tais como ditiotreitol e RB -mercaptoetanol e desnaturantes, tal como guanidina-HCl e ureia podem ser usados para ressolubilizar as proteínas.
Uma abordagem alternativa é a expressão de proteínas no espaço periplasmático da bactéria, que proporciona um ambiente oxidante e isomerases de dissulfeto e de chaperonina, e pode levar à produção de proteína solúvel.
Normalmente, uma sequência líder é fundida com a proteína a ser expressa, que dirige a proteína para o periplasma.
O líder é então removido por peptidases de sinal no interior do periplasma.
Exemplos de sequências líder de alvo periplásmico incluem o líder pelB do gene da pectato-liase, e o líder derivado do gene da fosfatase alcalina.
Em alguns casos, a expressão periplasmática permite o vazamento da proteína expressa no meio de cultura.
A secreção de proteínas permite a purificação rápida e simples a partir do sobrenadante da cultura.
As proteínas que não são secretadas podem ser obtidas a partir do periplasma por liase osmótica.
Similares à expressão citoplasmática, em alguns casos, as proteínas podem tornar-se insolúveis e desnaturantes, e agentes redutores podem ser utilizados para facilitar a solubilização e a redobra.
A temperatura de indução e de crescimento também pode influenciar os níveis de expressão e solubilidade, são geralmente usadas as temperaturas entre 25ºC e 37ºC.
Normalmente, as bactérias produzem proteínas aglicosiladas.
Assim, se as proteínas necessitam de glicosilação para a função, a glicosilação pode ser adicionada in vitro, após a purificação das células hospedeiras.
b. Células de levedura
[0483] células de levedura tais como Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiras de expressão de levedura bem conhecidas, que podem ser usadas para a produção de proteínas, tal como qualquer aqui descrita. A levedura pode ser transformada com vetores epissomais replicantes ou pela integração cromossômica estável por recombinação homóloga. Normalmente, os promotores induzíveis são utilizados para regular a expressão do gene. Exemplos de tais promotores incluem GAL1, GAL7 e GAL5 e promotores da metalotioneina, tais como o promotor CUPl, AOX1l ou outro Pichia, ou outro promotor de levedura. Os vetores de expressão incluem geralmente um marcador selecionável, tal como LEU2, TRP1l, HIS3, e URA3, para seleção e manutenção do DNA transformado. As proteínas expressas em levedura são frequentemente solúveis. A co-expressão com chaperoninas como Bip e proteína dissulfeto isomerase pode melhorar os níveis de expressão e solubilidade. Além disso, as proteínas expressas em levedura podem ser dirigidas para a secreção utilizando fusões de peptídeo sinal de secreção, tais como o sinal de secreção do fator alfa de combinação de leveduras de Saccharomyces cerevisae e fusões com proteínas da superfície das células de levedura, tais como o receptor de adesão de combinação Aga2p ou a Arxula adeninivorans glucoamilase. Um local de clivagem de protease, tal como para a protease Kex- 2, pode ser manipulado para remover as sequências fundidas de polipeptídeos expressos à medida que saem da via de secreção. A levedura também é capaz de glicosilação em motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de insetos
[0484] As células de inseto, em particular, utilizando a expressão de baculovírus, são úteis para a expressão de polipeptídeos, incluindo as proteínas de ligação ao hialuronan e polipeptídeos de enzima degradadora de hialuronan, tais como polipeptídeos hialuronidase solúveis. As células de inseto expressam elevados níveis de proteína e são capazes da maioria das modificações pós- traducionais utilizadas por eucariotas superiores. Baculovirus têm uma variedade de hospedeiros restritiva que melhora a segurança, e reduz preocupações regulatórias de expressão eucariótica. Os vetores de expressão típicos utilizam um promotor para a expressão de alto nível, tal como o promotor da poliedrina de baculovírus. Sistemas de baculovírus normalmente usados incluem os baculovírus tais como o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (ACNPV), e o vírus da poliedrose nuclear Bombyx mori (BMNPV) e uma linhagem celular de inseto, tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para a expressão de alto nível, a sequência de nucleotídeos da molécula a ser expressa, é fundida imediatamente a jusante do códon de iniciação da poliedrina do vírus. Sinais de secreção de mamíferos são transformados com precisão em células de insetos e podem ser usados para segregar a proteína expressa para o meio de cultura. Além disso, as linhagens celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DPN 1) produzem proteínas com padrões de glicosilação semelhantes aos sistemas de células de mamíferos.
[0485] Um sistema de expressão alternativo em células de inseto é o uso de células transformadas de forma estável. As linhagens celulares, tais como a Schneider 2 (52) e células Kc (Drosophila melanogaster) e células C7 (Aedes albopictus) podem ser utilizadas para a expressão. O promotor Drosophila metalotioneína pode ser utilizado para induzir níveis elevados de expressão na presença de indução por metais pesados com cádmio ou cobre. Os vetores de expressão são normalmente mantidos pelo uso de marcadores selecionáveis, tais como neomicina e higromicina.
d. Células de mamíferos
[0486] Os sistemas de expressão de mamíferos podem ser utilizados para expressar as proteínas, incluindo as proteínas de ligação ao hialuronan e polipeptídeos de enzima degradadora de hialuronan, tais como polipeptídeos hialuronidase solúveis. As construções de expressão podem ser transferidas para as células de mamífero através de infecção viral, tais como adenovírus ou através de transferência direta de DNA, tais como os lipossomas, O fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, e por meios físicos, tais como a eletroporação e a microinjeção. Os vetores de expressão para células de mamíferos normalmente incluem um local de mRNA cap, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação de tradução (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Elementos IRES podem também ser adicionados para permitir a expressão bicistrônica com outro gene, tal como um marcador selecionável. Tais vetores geralmente incluem promotores-potenciadores transcricionais para a expressão de alto nível, por exemplo, o promotor- potenciador SV40, o citomegalovírus humano (CMV) e .a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Estes potenciadores-promotores são ativos em muitos tipos de células. Regiões promotoras e potenciadoras de tecidos e célula também podem ser utilizadas para expressão. Regiões promotoras/potenciadoras exemplares incluem, mas não estão limitadas aquelas de genes, tais como a elastase [, insulina, a imunoglobulina, do vírus do tumor mamário, albumina, alfa-fetoproteína, a alfa-l-antitripsina, beta globina, proteína básica de mielina, miosina de cadeia leve 2 e gonadotrópico que libera o controle do gene hormonal. os marcadores selecionáveis podem ser usados para selecionar e manter as células com a construção de expressão. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, fosfotransferase de higromicina B, adenosina deaminase, xantina-guanina fosforibosil transferase, aminoglicosídeo-fosfotransferase, di-hidrofolato redutase (DHFR) e timidina quinase. Por exemplo, a expressão pode ser realizada na presença de metotrexato para selecionar apenas as células que expressam o gene DHFR. A fusão com moléculas de sinalização de superfície celular, tais como TCR-C e FckxRI-y pode dirigir a expressão de proteínas em um estado ativo na superfície da célula.
[0487] Muitas linhagens celulares estão disponíveis para expressão em mamíferos, incluindo células de camundongo, rato, humanos, macaco, frango e de hamster. Exemplos de linhagens celulares incluem, mas não estão limitadas a CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, camundongo NSO (não secretores) e outras linhagens celulares de mieloma, hibridoma e heterohibridoma, linfócitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 e HKB. As linhagens celulares estão também disponíveis adaptadas para meios livres de soro, o que facilita a purificação de proteínas segregadas a partir do meio de cultura celular. Exemplos incluem células de CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA., cat $11619-012) e a linhagem celular EBNA-1 livre de soro (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-342). As linhagens celulares que estão também disponíveis são adaptadas para crescer em meios especiais otimizados para a expressão máxima. Por exemplo, células DG44 CHO estão adaptadas para crescer em cultura de suspensão em um meio isento de produtos de origem animal, quimicamente definido.
e. plantas
[0488] Células de plantas transgênicas e de plantas podem ser utilizadas para expressar as proteínas, tais como qualquer aqui descrita. As construções de expressão são normalmente transferidas para as plantas através de transferência direta de DNA, tal como o bombardeamento de microprojéteis e transferência mediada por PEG para protoplastos, e com a transformação mediada por Agrobacterium. Os vetores de expressão podem incluir sequências promotoras e potenciadoras, elementos de terminação da transcrição e os elementos de controle de tradução. os vetores de expressão e técnicas de transformação são geralmente divididos entre os hospedeiros dicotiledôneas, como a Arabidopsis e tabaco, e os hospedeiros monocotiledôneas, como milho e arroz. Exemplos de promotores de plantas utilizados para a expressão incluem o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, o promotor da nopalina sintetase, o promotor da ribose bifosfato carboxilase, e os promotores de ubiquitina e do gene UBQO3. Os marcadores selecionáveis, tais como higromicina, isomerase fosfomanose e fosfotransferase de neomicina são muitas vezes utilizados para facilitar a seleção e manutenção de células transformadas. As células vegetais transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregadas (tecido de callus) ou regeneradas em plantas inteiras. Células vegetais transgênicas também podem incluir algas modificadas para produzir polipeptídeos hialuronidase. Porque as plantas têm mais padrões diferentes de glicosilação do que as células de mamífero,
isto pode influenciar a escolha da proteína produzida nestes hospedeiros.
3. Técnicas de purificação
[0489] os métodos para a purificação de polipeptídeos, incluindo as proteínas de ligação ao hialuronan e polipeptídeos de enzima degradadora de hialuronan, (por “exemplo, polipeptídeos hialuronidase solúveis) ou outras proteínas, a partir de células hospedeiras, dependerão das células hospedeiras escolhidas e sistemas de expressão. Para moléculas secretadas, proteínas são geralmente purificadas a partir do meio de cultura, após a remoção das células. Para a expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas a partir do extrato. Quando os organismos transgênicos, tais como plantas e animais transgênicos são utilizados para expressão, tecidos ou órgãos podem ser utilizados como material de partida, para fazer um extrato de células lisadas. Além disso, a produção de animais transgênicos pode incluir a produção de polipeptídeos em leite ou ovos, que podem ser recolhidos, e se necessário, as proteínas podem ser extraídas e adicionalmente purificadas utilizando métodos padrão na arte.
[0490] As proteínas podem ser purificadas utilizando técnicas de purificação de proteínas conhecidas na arte, incluindo, mas não limitadas a, SDS -PAGE, fração de tamanho e cromatografia de exclusão por tamanho, precipitação com sulfato de amônia, e cromatografia de permuta iônica, tais como a permuta de ânions. Técnicas de purificação por afinidade podem também ser utilizadas para melhorar a eficiência e a pureza das preparações. Por exemplo, anticorpos, receptores e outras moléculas que se ligam a proteínas de ligação a hialuronan, ou enzimas hialuronidase, podem ser utilizadas na purificação de afinidade. Construções de expressão podem também ser modificadas para adicionar um marcador de afinidade para uma proteína, tal como um epítopo myc, fusão TSG ou His6 e afinidade purificada com anticorpo myc, resina de glutationa e Ni-resina, respectivamente. A pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na arte, incluindo eletroforese em gel e coloração, e técnicas espectrofotométricas. Composições rHuPH20 purificadas, tal como aqui fornecidas, normalmente possuem uma atividade específica de, pelo menos, 70,000 a 100,000 unidades/mg, por exemplo, cerca de 120,000 unidades/mg. A atividade específica pode variar de acordo com a modificação, tal como com um polímero.
4. PEGuilação de polipeptídeos de enzimas que degradam hialuronan
[0491] Oo polietilenoglicol (PEG) tem sido amplamente utilizado em biomateriais, biotecnologia e medicina, principalmente porque o PEG é um polímero solúvel em água biocompatível, não-tóxico, que é normalmente não imunogênico (Zhao and Harris, ACS Symposium Series680: 458- 72, 1997). Na área de distribuição de fármaco, derivados de PEG têm sido amplamente utilizados em ligação covalente (isto é, "PEGuilação") para proteínas, para reduzir a imunogenicidade, proteólise e depuração renal, e para melhorar a solubilidade (Zalipsky, Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82, 1995). De modo semelhante, PEG foi ligado ao baixo peso molecular, fármacos relativamente hidrofóbicos, para melhorar a solubilidade, a redução de toxicidade e alterar a biodistribuição. Normalmente, os medicamentos PEGuilados são injetados como soluções.
[0492] Uma aplicação estreitamente relacionada é a síntese de redes de PEG degradáveis reticuladas Ou formulações para utilização na administração de medicamentos, uma vez que muito da mesma química usada na concepção de veículos de fármacos, degradáveis solúveis, também pode ser utilizado na criação de géis degradáveis (Sawhney et al., Macromolecules 26: 581-87, 1993). Sabe-se também que os complexos intermacromoleculares podem ser formados por mistura de soluções de dois polímeros complementares. Tais complexos são geralmente estabilizados por interações eletrostáticas (poliânion-policátion) e/ou ligações de hidrogênio (poliácido-polibase) entre os polímeros envolvidos, e/ou por interações hidrofóbicas entre os polímeros em meio aquoso circundante (Krupers et al., Eur. Polym JJ. 32:785- 790, 1996). Por exemplo, a mistura de soluções de ácido poliacrílico (PAAC) e óxido de polietileno (PEO), sob as condições apropriadas, resulta na formação de complexos com base principalmente na ligação de hidrogênio. A dissociação destes complexos em condições fisiológicas tem sido usada para a entrega de fármacos livres (isto é, não-peguilados). Além disso, complexos de polímeros complementares vem sendo formados a partir de ambos os homopolímeros e copolímeros.
[0493] Numerosos reagentes de PEGuilação foram descritos na arte. Tais reagentes incluem, mas não estão limitados a N-hidroxissuccinimidila (NHS) de PEG ativado, succinimidila mPEG, mMPEG,;-N-hidroxisuccinimida, MPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mMPEG succinimidil butanoato, mPEG ácido carboximetil 3-hidroxibutanoico succinimidil éster, PEG- succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldeído homobifuncional, PEG butiraldeido homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mPEG- benzotriazol carbonato, propionaldeído PEG, MPEG butrialdeído, mPEG; butiraldeído ramificado, mPEG acetila, MPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG “sem ligante”
maleimida, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil disulfeto, Fmoc-PEG- NHS, Boc-PEG-NHS, vinilsulfona PEG-NHS, acrilato PEG-NHS, fluoresceína PEG-NHS, e biotina PEG-NHS (ver por exemplo, Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197- 207, 1997; U.S. Pat. No. 5,672,662; U.S. Pat. No. 5,932,462; U.S. Pat. No. 6,495,659; U.S. Pat. No. 6,737,505; U.S. Pat. No. 4,002,531; U.S. Pat. No. 4,179,337; U.S. Pat. No. 5,122,614; U.S. Pat. No. 5,324,844; U.S. 5,446,090; U.S. Pat. No. 5,612,460; U.S. Pat. No. 5,643,575; U.S. Pat. No. 5,766,581; U.S. Pat. No. 5,795,569; U.S. Pat. No. 5,808,096; U.S. Pat. No. 5,900,461; U.S. Pat. No. 5,919,455; U.S. Pat. No. 5,985,263; U.S. Pat. No. 5,990,237; U.S. Pat. No. 6,113,906; U.S. Pat. No. 6,214,966; U.S. Pat. No. 6,258,351; U.S. Pat. No. 6,340,742; U.S. Pat. No. 6,413,507; U.S. Pat. No. 6,420,339; U.S. Pat. No. 6,437,025; U.S. Pat. No. 6,448,369; U.S. Pat. No. 6,461,802; U.S. Pat. No. 6,828,401; U.S. Pat. No. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WOO5000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 1064951; EP 0822199; WO 01076640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; e WO 0187925).
[0494] Em um exemplo, o polietileno glicol tem um peso molecular que varia de cerca de 3 kDa e cerca de 50 kD, e normalmente de cerca de 5 kDa a cerca de 30 kD. A ligação covalente de PEG para o fármaco (conhecido como "PEGuilação") pode ser realizada por técnicas de síntese química conhecidas. Por exemplo, a PEGuilação da proteína pode ser realizada por reação de PEG ativado por NHS, com a proteína em condições de reação adequadas.
[0495] Enquanto numerosas reações foram descritas para PEGuilação, aquelas que são mais geralmente aplicadas conferem direcionalidade, utilizam condições reacionais brandas, e não necessitam de extenso tratamento a jusante, para remover catalisadores tóxicos ou subprodutos. Por exemplo, monometoxi PEG (MPEG) tem apenas um terminal hidroxila reativo, e assim, a sua utilização limita algo da heterogeneidade da mistura do produto PEG-proteína resultante. A ativação do grupo hidroxila na extremidade do polímero oposta ao grupo metoxi terminal é geralmente necessária para realizar uma PEGuilação da proteína eficiente, com o objetivo de tornar o PEG derivatizado mais susceptível a ataque nucleofílico. O ataque nucleofílico é geralmente o grupo epsilon-amina de um resíduo de lisil mas outras aminas também podem reagir (por exemplo, a alfa -amina do N-terminal ou as aminas em anel de histidina) se as condições locais são favoráveis. Uma ligação mais direcionada é possível em proteínas que contêm uma única lisina ou cisteína. O último resíduo pode ser alvo de PEG - maleimida para a modificação específica do tiol. Em alternativa, PEG-hidrazida pode reagir com uma enzima que degrada a hialuronan oxidado com periodato, e reduzida na presença de NaCNBH;. Mais especificamente, açúcares PEGuilados CMP podem reagir com uma enzima que degrada hialuronan na presença de glicosil transferases apropriadas. Uma técnica é a técnica de "PEGuilação", em que um certo número de moléculas poliméricas é acoplado ao polipeptídeo em questão. Ao utilizar esta técnica, O sistema imune tem dificuldades em reconhecer os epítopos na superfície do polipeptídeo responsável pela formação de anticorpos, reduzindo assim, a resposta imune. Para polipeptídeos introduzidos diretamente no sistema circulatório do corpo humano para dar um efeito fisiológico específico (isto é, produtos farmacêuticos) a resposta imune típica potencial é uma resposta IgG e/ou IgM, ao passo que os polipeptídeos que são inalados através do sistema respiratório (por exemplo, polipeptídeo industrial) potencialmente podem causar uma resposta de IgE (ou seja, resposta alérgica). Uma das teorias que explicam a redução da resposta imune é que o (s) epítopo (s) protetor (es) da (s) molécula (s) de polímero (s) sobre a superfície do polipeptídeo responsável pela resposta imunitária, conduz à formação de anticorpos. Outra teoria ou, pelo menos, um fator parcial é que quanto mais pesado for o conjugado, a resposta imunitária mais reduzida é obtida.
[0496] Normalmente, para produzir as enzimas de degradação de hialuronan PEGuiladas aqui proporcionadas, incluindo as hialuronidases PEGuiladas, porções de PEG são conjugadas, através de ligação covalente, aos polipeptídeos. Técnicas para PEGuilação incluem, mas não estão limitadas a, ligantes especializados e químicas de acoplamento (ver, por exemplo, Roberts, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), ligação de várias porções de PEG a um único local de conjugação (tais como através do uso de PEG ramificado, ver, por exemplo, Guiotto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGuilação específicas do local e/ou mono-PEGuilação (ver, por exemplo, Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), e PEGuilação enzimática dirigida ao local (ver, por exemplo Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002). Métodos e técnicas descritos na arte podem produzir proteínas com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais, de 10 PEG ou derivados de PEG ligados a uma única molécula de proteína (ver, por exemplo, EUA 2006/0104968).
[0497] Como um método de ilustração exemplar para fazer enzimas degradadoras de hialuronan PEGuilado, tais como hialuronidases PEGuiladas, PEG aldeídos, succinimidas e carbonatos, sendo cada um aplicado cada conjugar porções de PEG, PEG succinimidil normalmente, para rHuPH20. Por exemplo, rHuPH20 foi conjugado com reagentes succinimidil exemplares —“monoPEG (MPEG), incluindo mPEG-Succinimidil Propionatos (mMPEG-SPA), MPEG-Succinimidil Butanoatos (mPEG- SBA), e (PEGS “ramificados” para ligação) mMPEG2-N- hidroxilsuccinimida. Estes ésteres succinimidila PEGuilados contêm estruturas de carbono de diferentes comprimentos entre o grupo PEG e o agente de reticulação ativado, e um único grupo PEG ou ramificado. Estas diferenças podem ser usadas, por exemplo, para proporcionar diferentes cinéticas de reação, e para restringir potencialmente locais disponíveis para ligação PEG ao rHuPH20 durante o processo de conjugação.
[0498] Succinimidil PEGS (como acima), que compreendem tanto os PEGs lineares ou ramificados, podem ser conjugados com rHuPH20. PEG pode ser usado para gerar rHuPH20s reprodutíveis contendo moléculas que têm, em média, entre cerca de 3-6 ou 3-6 moléculas de PEG por hialuronidase. Tais composições rHuPH20 PEGuiladas podem ser facilmente purificadas, para se obter composições que possuem atividades específicas de cerca de 25.000 ou 30.000 unidades/mg de proteína, de atividade de hialuronidase, e sendo substancialmente livres de rHuPH20 não PEGuilada (inferior a 5% não PEGuilado).
[0499] Utilizando vários reagentes PEG, versões exemplares de enzimas degradadoras de hialuronan, em particular hialuronidase humana recombinante solúvel (por exemplo, rHuPH20), podem ser preparadas, por exemplo, utilizando mPEG-SBA (30 kD), mPEG-SMB (30 kD), e versões ramificadas baseadas em mPEG2-NHS (40kD) e mPEG2-NHS (60 kD) . Versões PEGuiladas de rHuPH20 foram geradas utilizando químicas NHS, assim como carbonatos, e aldeídos, usando cada um dos seguintes reagentes: mMPEG2-NHS-40K ramificada, mMPEG-NHS-10K ramificada, mPEG-NHS-20K ramificada, mPEG2-NHS-60K ramificada; mPEG-SBA-5K, mPEG- SBA-20K, mPEG-SBA-30K; mPEG-SMB-20K, mPEG-SMB-30K; mPEG- butiraldeído; mPEG-SPA-20K, mPEG-SPA-30K; e PEG-NHS-5K- biotina. Hialuronidases PEGuiladas foram também preparadas utilizando reagentes PEG disponíveis a partir de Dowpharma, uma divisão da Dow Chemical Corporation; incluindo hialuronidases PEGuiladas com p-nitrofenil-carbonato PEG de Dowpharma (30 kDa) e com propionaldeído PEG (30 kDa).
[0500] Em um exemplo, a PEGuilação inclui a conjugação de mPEG-SBA, por exemplo, mPEG-SBA-30K (tendo um peso molecular de cerca de 30 kDa) ou outros ésteres de succinimidila derivados de ácido butanoico PEG, a uma hialuronidase solúvel. Ésteres de succinimidila de derivados de ácido butanoico PEG, como mPEG-SBA-30K prontamente fazem par com grupos amina de proteínas. Por exemplo, a conjugação covalente de m-PEG-SBA-30K e rHuPH20 (que é cerca de 60 kDa em tamanho) proporciona ligações amida estáveis entre rHuPH20 e mPEG, tal como mostrado no Esquema 1, abaixo.
Esquema 1 o o etrodoaad- A) + apo amem DO | o neafoneno icnenent nuno rHuPH20 PEGuilada
[0501] Normalmente, o mPEG-SBA-30K ou outro PEG é adicionado à enzima degradadora de hialuronan, em alguns casos, uma hialuronidase, em uma proporção molar PEG: polipeptídeo 10:1 em um tampão adequado, por exemplo, 130 mM NaCl/10 mM HEPES a pH 6,8 ou 70 mM de tampão fosfato, pH 7, seguido de esterilização, por exemplo, filtração esterilizada, e a conjugação contínua, por exemplo, com agitação, durante a noite a 4ºC em uma sala fria. Em um exemplo, a enzima que degrada hialuronan PEG conjugado é concentrada e tem o tampão permutado.
[0502] Outros métodos de ésteres succinimidila de acoplamento de derivados de ácido butanoico PEG, como mPEG -SBA-30K são conhecidos na arte (ver por exemplo, Patente dos EUA No. 5.672.662; Patente dos EUA No. 6.737.505; e 2004/ 0235734). Por exemplo, um polipeptídeo, tal como uma enzima que degrada hialuronan (por exemplo, uma hialuronidase), pode ser acoplado a um derivado PEG ativado de NHS por reação em um tampão de borato (0,1 M, pH 8,0) durante uma hora a 4ºC. A proteína PEGuilada resultante pode ser purificada por ultrafiltração. Alternativamente, a PEGuilação de uma fosfatase alcalina bovina pode ser conseguida através da mistura do fosfatase com mPEG-SBA em um tampão contendo fosfato de sódio a 0,2 M e NaCl a 0,5 M (pH 7,5) a 4ºC durante 30 minutos. O PEG que não reagiu pode ser removido por ultrafiltração. Outro método reage polipeptídeo com mPEG-SBA em água desionizada, de modo que a trietilamina é adicionada para aumentar o pH para 7,2-9. A mistura resultante é agitada à temperatura ambiente durante várias horas para completar a PEGuilação.
[0503] os métodos para a PEGuilação de polipeptídeos que degradam hialuronan, incluindo, por exemplo, hialuronidase de origem animal e as enzimas de degradação a hialuronan bacterianas, são conhecidos por um perito na arte. Ver, por exemplo, a Patente Europeia Nº EP 0400472, que descreve a peguilação de testículos bovinos hialuorindase e condroitina ABC-liase. Além disso, a Publicação dos EUA No. 2006014968 descreve a PEGuilação de uma hialuronidase humana derivada de PH20 humana. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan PEGuilado geralmente contém, pelo menos, três porções de PEG por molécula. Por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan pode ter um PEG a proporção molar da proteína 5:1-9:1, por exemplo, 7:1.
G. MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES E MONITORAMENTO DOS EFEITOS DOS AGENTES ANTI-HIALURONAN
[0504] Os agentes anti-hialuronan, por exemplo, enzimas que degradam-hialuronan, tais como uma hialuronidase ou hialuronidase modificada (por exemplo PH20 ou PEGPH20) atuam como agentes terapêuticos, quer por si só, ou em combinação com agentes secundários, tais como agentes quimioterapêuticos, para o tratamento de doenças e condições associadas a hialuronan, em cânceres específicos (ver, por exemplo, EUA 2010/ 0003238 e WOO09/128, 917). Além disso, como aqui descrito em outra parte, a terapia com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, pode ser acompanhada por tratamento com um corticosteroide para minimizar os efeitos colaterais sistêmicos, por exemplo, músculo-esquelético, da hialuronidase PEGuilada. Os diagnósticos de acompanhamento de HABP, tais como TSG-6-LM ou TSG-6-LM: Fc ou suas variantes, aqui proporcionadas, podem ser usadas em conjunto com uma terapia com um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma terapia de enzima degradadora de hialuronan, utilizada para o tratamento de doenças ou perturbações associadas a hialuronan, tais como o câncer, a fim de controlar a capacidade de resposta e a eficácia do tratamento com o agente (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan). Além disso, os métodos auxiliares ou suplementares podem também ser utilizados para avaliar os efeitos dos agentes anti-hialuronan (por exemplo, enzimas que degradam hialuronan) de tratamento, isoladamente ou em combinação com corticosteroides. Está dentro do nível de um especialista na técnica, avaliar a melhoria de efeitos colaterais por corticosteroides, bem como estudos de eficácia, tolerabilidade e farmacocinética da terapia de agente anti-hialuronan, incluindo terapia de enzima degradadora de hialuronan. Esta seção fornece a descrição dos métodos auxiliares ou suplementares que podem ser utilizados para avaliar a eficácia, a capacidade de resposta, tolerância e/ou a farmacocinética de uma terapia de enzima degradadora de hialuronan.
1. Métodos para avaliar os efeitos colaterais
[0505] Os ensaios in vivo podem ser utilizados para avaliar a eficácia dos corticosteroides na melhoria ou eliminação dos efeitos colaterais músculo-esqueléticos que podem ser causados por um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan, tais como hialuronidase ou hialuronidase modificada, para expor maior meia-vida sistêmica (por exemplo PH20 ou PEGPH20). Os efeitos colaterais que podem ser avaliados incluem, por exemplo, dores musculares e nas articulações, rigidez de membros superiores e inferiores, câimbras, miosite, dor muscular e sensibilidade ao longo de todo o corpo, fraqueza, fadiga e/ou uma diminuição da amplitude de movimento de articulações do joelho e do cotovelo. Ensaios para avaliar os efeitos colaterais podem incluir modelos animais em que o animal pode ser observado para o movimento reduzido, mudanças de comportamento ou postura, descobertas radiológicas, alterações histopatológicas e outras observações clínicas notáveis. Outros ensaios podem incluir ensaios clínicos em seres humanos, em que os pacientes podem ser questionados sobre sintomas, avaliados através do exame físico, de imagem (por exemplo, ressonância magnética ou PET) ou por avaliação radiológica. A melhoria de um efeito colateral causado pela administração de um agente anti-hialuronan (por exemplo, um agente de enzima degradadora de hialuronan) é observada quando o efeito colateral é melhorado, eliminado, reduzido ou diminuído na presença do corticosteroide, em comparação com a sua ausência.
[0506] Nestes exemplos, a dose de agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) e/ou de corticosteroides, pode ser variada para identificar a dose ótima ou mínima necessária para se obter a atividade, melhorando os efeitos colaterais. Tais estudos estão dentro do nível de um especialista na arte. Além disso, o regime de dosagem pode ser variado. Por exemplo, estudos podem ser realizados utilizando um esquema de dosagem de enzima degradadora de hialuronan mensal, quinzenal, uma vez por semana, duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana ou mais. Além disso, o corticosteroide pode ser administrado antes, concorrentemente e/ou subsequentemente à administração do agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan).
[0507] Por exemplo, modelos animais in vivo podem ser utilizados para avaliar a capacidade de corticosteroides, tais como a dexametasona, para melhorar ou eliminar os efeitos colaterais associados com a administração do agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan). Os modelos animais podem incluir primatas não humanos, tais como macacos cynomolgus e macacos rhesus, cães, por exemplo, da raça beagle, Ou qualquer outro animal que apresente efeitos colaterais adversos, em resposta ao tratamento com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase PEGuilada, por exemplo PEGPH20). Os modelos animais podem ser tratados com um agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada a hialuronan) na presença ou ausência de efeitos corticosteroides e músculo-esqueléticos observados ou medidos.
[0508] Por exemplo, animais, tais como macacos cynomolgus, beagles ou outro modelo animal semelhante, capaz de eventos músculo-esqueléticos observáveis ou quantificáveis, pode ser tratado com à enzima degradadora de hialuronan na presença ou ausência de corticosteroide. Em um exemplo, um grupo de animais, por exemplo, macacos cynomolgus ou beagles, é administrado com um agente anti- hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan sozinha, por exemplo, uma hialuronidase PEGuilada, tal como por administração intravenosa. Por exemplo, a administração pode ser de duas vezes por semana. O tratamento pode continuar até que mudanças na amplitude de movimento de articulações nas pernas são observadas no joelho e no cotovelo, ou rigidez ou mobilidade reduzida são observadas. Em seguida, um outro grupo de animais pode ser tratado com o agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) e corticosteroide administrado, tal como pela administração de doses orais de dexametasona ou outro corticosteroide, dadas no mesmo dia em que o agente anti- hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan) foi administrado. Os grupos de animais podem ser comparados, por exemplo, através de exame físico da amplitude de movimento das articulações, ou outra mobilidade reduzida,
histopatologia das articulações, palpação para rigidez, Ou imagiologia, conhecidos por especialistas na técnica, para avaliar a capacidade do corticosteroide, tal como dexametasona, para melhorar os efeitos colaterais músculo- esqueléticos mediados pelo agente anti-hialuronan, tal como mediados por enzimas que degradam o agente anti-hialuronan. Dosagem, frequência de dosagem, via de administração, e tempo de doseamento de corticosteroide, tal como dexametasona, podem ser variados para otimizar a eficácia do corticosteroide.
[0509] Em outro exemplo, a eficácia dos corticosteroides, tais como a dexametasona, na melhoria ou eliminação dos efeitos colaterais adversos associados com a administração de agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) pode ser avaliada em pacientes “humanos com tumores sólidos. Por exemplo, pacientes humanos podem ser doseados para examinar a capacidade de corticosteroides para melhorar e/ou eliminar os eventos adversos mediados pelo agente anti-hialuronan (por exemplo, mediados por enzimas que degradam hialuronan), incluindo, mas não limitadas a qualquer uma ou mais das seguintes características: dores musculares e nas articulações, rigidez de membros superiores e inferiores, câimbras, miosite, dor muscular e sensibilidade ao longo de todo o corpo, fraqueza, fadiga. Os pacientes podem ser tratados com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) com ou sem co-tratamento com um corticosteroide, tal como dexametasona. Durante e após a administração de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), os efeitos colaterais de ambos os grupos de tratamento podem ser avaliados. Um médico pode determinar a gravidade dos sintomas através de exame físico do indivíduo, incluindo, por exemplo, as queixas do paciente, sinais vitais, alterações no peso corporal, ECG de 12 derivações, ecocardiograma, química clínica, ou de imagem (ressonância magnética, PET Ou avaliação radiológica). A gravidade dos sintomas pode ser quantificada utilizando os critérios de terminologia comum NCI para o sistema de classificação de Eventos Adversos (CTCAE). O CTCAE é uma terminologia descritiva utilizada para relatórios de eventos adversos (AE). A escala de classificação (severidade) é fornecida para cada termo AE. O CTCAE exibe graus 1 a 5, com descrições clínicas de gravidade para cada evento adverso com base na seguinte orientação geral: Grau 1 (AE leve); Grau 2 (AE moderado); Grau 3 (AE grave); Grau 4 (AE com risco de vida ou incapacitante); e Grau 5(morte relacionada com AE). A capacidade de um corticosteroide para melhorar os efeitos colaterais adversos associados com a administração de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) pode ser medida através da observação de uma redução na gravidade ou classificação na escala CTCAE em um ou mais efeitos colaterais em indivíduos tratados com o agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) e corticosteróides, em comparação com pacientes tratados com o mesmo agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) isoladamente, ou seja, a gravidade dos efeitos colaterais, é reduzida de grau 3 para o grau l ou grau 2.
[0510] Em outro exemplo, pacientes humanos podem ser doseados para avaliar a tolerabilidade de uma escalada da dose de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) e avaliar a toxicidade limitante da dose, tal como medida por gravidade dos efeitos colaterais. Em um exemplo, a dose máxima tolerada de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) que pode ser tolerada na presença de um agente de melhora, tal como um corticosteroide, pode ser determinada. Os regimes de tratamento podem incluir um escalonamento de dose, em que cada paciente receba uma dose mais elevada de enzima degradadora de hialuronan, ao mesmo nível de dose de corticosteroides. Os pacientes podem ser monitorados para determinar os efeitos adversos para a dose mais elevada de enzima degradadora de hialuronan que pode ser administrada com um corticosteroide, antes que os efeitos colaterais não sejam tolerados. A tolerabilidade pode ser medida com base na gravidade dos sintomas emergentes durante e após o tratamento. Doses de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) podem ser escaladas até que os efeitos adversos cheguem a um nível predeterminado, por exemplo, de grau 3. Regimes de dosagem também pode incluir uma redução da quantidade de corticosteroide administrada, para examinar a necessidade de continuar para o Ccorticosteroide, e a possibilidade de aclimatação ao agente anti-hialuronan em relação aos efeitos colaterais resultantes.
2. Avaliação de biomarcadores associados à atividade de um Agente anti-hialuronan (por exemplo, uma atividade de enzima que degrada hialuronan)
[0511] Tal como aqui descrito, a medida e nível de fenótipos de HA é um biomarcador que está associado com, e correlaciona-se com a eficácia e a atividade de um agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan). Por exemplo, para doentes com câncer com tumores, tais como tumores sólidos avançados, associado ao tumor e estroma reduzido, é um biomarcador da atividade de uma enzima administrada que degrada hialuronan. Um ensaio de ligação HABP para detectar HA presente no tecido (por exemplo, biopsia do tumor) ou fluidos corporais (por exemplo, plasma), tal como descrito aqui, em outro local, pode ser realizado para avaliar e monitorar o efeito terapêutico de um anti-hialuronan (por exemplo enzima degradadora de hialuronan).
[0512] Além disso, os ensaios podem ser realizados em separado ou em conjugação com os ensaios de HABP descritos, aqui utilizados, para detectar HA em tecidos (por exemplo, biopsia do tumor) ou fluidos corporais (por exemplo, plasma) para avaliar melhor os efeitos de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) na inibição de ácido hialurônico ou atividade de degradação. Em particular, para o tratamento de uma doença ou condições associadas ao hialuronan, tais como o câncer, as medidas clínicas ou biomarcadores associados com a atividade de um agente anti- hialruonan, por exemplo, uma atividade da enzima que degrada hialuronan incluem, mas não estão limitadas a, redução da atividade metabólica de tumores, aumento da difusão aparente e perfusão de tumor melhorada e/ou aumento dos catabólitos de HA. Ensaios adicionais para medir tais biomarcadores podem incluir, mas não se limitam a medições de catabólitos de hialuronan no sangue ou na urina, medições da atividade de hialuronidase no plasma, Ou medições de pressão do fluido intersticial, o volume vascular ou do teor de água em tumores. Está dentro do nível de um especialista na técnica efetuar tais ensaios.
[0513] Estes ensaios podem ser realizados em modelos animais tratados com uma enzima de degradação de hialuronan ou em pacientes humanos. Por exemplo, modelos animais de doenças, distúrbios ou condições associadas a hialuronan podem ser utilizados para avaliar a eficácia in vivo da administração de um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tais como hialuronidase ou hialuronidase modificada para exibir o aumento de meia-vida (por exemplo, PH20 ou PEGPH20). Um outro agente, tal como um agente quimioterapêutico pode também ser incluído na avaliação da atividade. Exemplos de doenças associadas ao ácido hialurônico, para as quais, um modelo animal apropriado pode ser utilizado, incluem tumores sólidos, por exemplo, tipos de câncer em estágio avançado, um câncer metastático, câncer indiferenciado, câncer do ovário, carcinoma in situ (ISC), carcinoma espinocelular (SCC), câncer de próstata, câncer pancreático, câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama, câncer de cólon e outros tipos de câncer. São também exemplos de doenças e distúrbios associados a hialuronan, doenças inflamatórias, a pressão no disco, câncer e edema, por exemplo, edema causado por transplante de órgão, acidente vascular cerebral, trauma cerebral ou outra lesão.
[0514] Modelos animais podem incluir, mas não estão limitados a, camundongos, ratos, coelhos, cães, porcos-da Guiné e modelos de primatas não humanos, tais como macacos cynomolgus e macacos rhesus. Em alguns exemplos, os ratos imunodeficientes, tais como camundongos sem pelo ou SCID, são transplantados com uma linhagem de células de tumor a partir de um câncer associado ao hialuronan, para estabelecer um modelo animal do respectivo câncer. Exemplos de linhagens celulares de cânceres associados ao hialuronan incluem, mas não estão limitados a, células de carcinoma da próstata PC3, células de adenocarcinoma do pâncreas BxPC-3, carcinoma da mama MDA-MB -231, células MCF-7 do tumor da mama, células de tumor de mama BT474, células tumorais da próstata Tramp-C2, e células de câncer da próstata Mat-LyLu, e outras linhagens celulares descritas aqui, que são associadas, por exemplo,
ao ácido hialurônico, contêm níveis elevados de ácido hialurônico. Um agente anti-hialuronan, tal como uma enzima que degrada hialuronan, pode então ser administrada ao animal, com ou sem um corticosteroide, tal como dexametasona, para avaliar os efeitos do corticosteroide na atividade anti - hialuronan, por medição, por exemplo, dos níveis ou teor de hialuronan. O teor de hialuronan pode ser medido por coloração de amostras de tecido de tumor de hialuronan, ou pela medição dos níveis de hialuronan solúveis no plasma. Outras medidas de atividade anti- hialuronan incluem a avaliação do volume tumoral, a formação ou o tamanho dos halos, pressão do fluido intersticial, teor de água e/ou volume vascular.
[0515] Em outros exemplos, os cães, como os cães da raça beagle, podem ser tratados com um agente anti- hialuronan na presença ou ausência de um corticosteroide, tal como dexametasona. Os tecidos tais como a pele ou o tecido do músculo esquelético são biopsiados e corados para hialuronan e avaliados visualmente. Os tecidos de animais tratados com um agente anti-hialuronan sozinho, são então comparados com os tecidos de animais tratados com o agente anti-hialuronan e corticosteroide para medir o efeito do corticosteroide na atividade anti-hialuronan.
[0516] Os ensaios para a atividade de um agente anti-hialuronan, tal como uma atividade enzimática que degrada hialuronan, também podem ser realizados em seres humanos. Por exemplos, os ensaios para medir um biomarcador associado com uma atividade de agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) podem ser realizados em indivíduos humanos conhecidos ou suspeitos de terem uma doença ou condição associada ao hialuronan (por exemplo, câncer), e que vem sendo tratados com uma enzima que degrada hialuronan (por exemplo PEGPH20).
a. Ensaios para avaliar a atividade de uma enzima que degrada hialuronan
[0517] A atividade de uma enzima que degrada hialuronan pode ser avaliada utilizando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, o ensaio USP XXII para hialuronidase determina indiretamente a atividade através da medição da quantidade de ácido hialurônico ou hialuronan que não degradada, o substrato (HA) que fica depois da enzima pode reagir com o HA durante 30 min. a 37ºC (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD). Um padrão de referência de hialuronidase (USP) ou solução National Formulary (NF) Standard Hyaluronidase pode ser utilizada em um ensaio para determinar a atividade, em unidades, de qualquer hialuronidase. Em um exemplo, a atividade é medida usando um ensaio de microturbidez. Este baseia-se na formação de um precipitado insolúvel, quando o ácido hialurônico se liga à albumina do soro. A atividade é medida por incubação de hialuronidase ou uma amostra contendo hialuronidase, por exemplo, no sangue ou no plasma, com o hialuronato de sódio (ácido hialurônico), durante um período de tempo definido (por exemplo, 10 minutos) e, em seguida, precipitando o hialuronato de sódio não digerido com a adição de soro de albumina acidificado. A turbidez da amostra resultante foi medida a 640 nm após um período de desenvolvimento adicional. A diminuição da turbidez resultante da atividade de hialuronidase no substrato de hialuronato de sódio é uma medida da atividade enzimática de hialuronidase.
[0518] Em outro exemplo, a atividade da hialuronidase é medida utilizando um ensaio de microtitulação, em que o ácido hialurônico biotinilado residual é medido seguido de incubação com hialuronidase, ou uma amostra contendo hialuronidase, por exemplo, no sangue ou plasma (ver por exemplo, Frost and Stem (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicação de Patente dos EUA No. 20050260186). Os grupos carboxila livres nos resíduos de ácido glucurônico de ácido hialurônico são biotinilados, e o substrato de ácido hialurônico biotinilado é acoplado covalentemente a uma placa de microtitulação. Após a incubação com hialuronidase, o substrato de ácido hialurônico biotinilado residual é detectado através de uma reação de avidina- peroxidase e, em comparação com a reação seguinte obtida com os padrões de hialuronidase de atividade conhecida. Outros ensaios para medir a atividade de hialuronidase também são conhecidos na arte e podem ser usados nos métodos aqui descritos (ver, por exemplo Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
[0519] A capacidade de uma enzima degradante de hialuronan ativa, tal como uma hialuronidase solúvel modificada (por exemplo, ligada a PEG PH20) para atuar como um agente de propagação ou difusão, por exemplo, para quimioterápicos, também pode ser avaliada. Por exemplo, o corante azul de tripano pode ser injetado, tal como por via subcutânea ou por via intradérmica, com ou sem uma enzima que degrada o hialuronan na pele lateral de cada lado, de camundongos sem pelo. A área de corante é então medida, por exemplo, com um microcalibrador, para determinar a capacidade da enzima de degradação de hialuronan para atuar como um agente de propagação (ver por exemplo, Requerimento dos EUA Publicada No. 20060104968).
b. Medição de catabólitos de HA
[0520] Em outro exemplo, sangue e urina podem ser recolhidos em diferentes pontos de tempo durante o tratamento do paciente e ensaiados para catabólitos de hialuronan. A presença de catabólitos é indicativa da degradação do hialuronan e é, portanto, uma medida da atividade de hialuronidase. A enzima de plasma também pode ser avaliada e medida ao longo do tempo após a administração. Por exemplo, catabólitos HA, que são produtos de degradação de HA-dissacarídeos, pode ser avaliada por meio de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) para separar e medir as áreas dos picos de sacarídeos. O Exemplo 15 exemplifica este ensaio.
c. Atividade Metabólica do tumor
[0521] A redução da atividade metabólica do tumor está associada com a atividade do agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima degradante de ácido hialurônico). A atividade metabólica do tumor pode ser avaliada utilizando processos padrão conhecidos na arte. Por exemplo, a tomografia por emissão de positrões [18F]- fluorodesoxiglucose (FDG-PET) pode ser utilizada. A PET é um diagnóstico não invasivo que produz imagens e os parâmetros quantitativos da perfusão, viabilidade celular, proliferação e/ou a atividade metabólica dos tecidos. As imagens resultantes da utilização de diferentes substâncias biológicas (por exemplo, açúcares, aminoácidos, precursores metabólicos, hormônios) marcadas com radioisótopos emissores de positrões. Por exemplo, FDG é um análogo da glicose e é absorvido pelas células vivas por intermédio das primeiras fases da via normal de glicose. Nos cânceres, existe aumento da atividade glicolítica resultando na captura de FDG na célula cancerosa. Uma diminuição no aprisionamento na FDG se correlaciona com uma diminuição da atividade metabólica do tumor e a atividade anti- tumorigênica. Orientações para a imagiologia de PET são conhecidas por um perito na arte, e devem ser seguidas por qualquer médico ou técnico de tratamento.
d. Aumento da difusão aparente e melhora na Perfusão do Tumor
[0522] Métodos adicionais de avaliação de atividade de um agente anti-hialuronan (por exemplo, a enzima degradadora de hialuronan) incluem ensaios que avaliam a difusão de água nos tecidos. Como discutido aqui em outro momento, os tecidos que acumulam geralmente hialuronan, tem uma pressão mais elevada do fluido intersticial do que o tecido normal, devido à acumulação concomitante de água. Assim, os tecidos que acumulam HA, tais como tumores, tem a pressão do fluido intersticial elevada, que pode ser medida por vários métodos conhecidos na arte. Por exemplo, ressonância magnética de difusão, tais como ADC MRI ou DCE MRI, podem ser utilizadas. A difusão da água pode ser avaliada por esses procedimentos, e está diretamente relacionada à presença de tecidos ricos em ácido hialurônico, como os tumores sólidos (ver, por exemplo Chenevert et al. (1997) Clinical Cancer Research, 3:1457-1466). Por exemplo, os tumores que acumulam hialuronan tem um aumento perceptível na ressonância magnética ADC ou na ressonância magnética DCE por causa de um aumento na perfusão. Tais ensaios podem ser realizados na presença e na ausência de uma enzima degradadora de hialuronan, e os resultados foram comparados. Método de medição de difusão é uma medida útil para avaliar alterações celulares após essas terapias.
3.Tamanho e volume do tumor
[0523] A atividade de um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzimas que degradam hialuronan) está associada à redução do tamanho e/ou volume do tumor. O tamanho e volume do tumor podem ser monitorados com base em técnicas conhecidas por um perito na arte. Por exemplo, o tamanho e volume do tumor podem ser monitorados por meio de radiografia, ultrassom, a necropsia, por utilização de compassos de calibre, por microcCT ou por *F-FDG-PET. O tamanho do tumor também pode ser avaliado visualmente. Em exemplos particulares, o tamanho do tumor (diâmetro) é diretamente medido utilizando compassos de calibre.
[0524] Em outros exemplos, o volume do tumor pode ser medido utilizando uma média de medições do diâmetro do tumor (D) obtido por avaliações de ultrassom ou compassos de calibre. Por exemplo, o volume do tumor pode ser determinado utilizando ultrassom de alta resolução VisualSonics Vevo 770 ou outro ultrassom semelhante. O volume pode ser determinado a partir da fórmula V=D"xn/6 (para o diâmetro medido utilizando compassos de calibre) ou V=Dº x d x n/6 (para o diâmetro medido utilizando ultrassons, onde d é a profundidade ou a espessura). Por exemplo, medições de calibre podem ser feitas do comprimento do tumor (1) e a largura (w) e o volume do tumor calculado como comprimento x largura? x 0,52. Em outro exemplo, varreduras microCT podem ser utilizadas para medir o volume do tumor (ver por exemplo, Huang et al. (2009) PNAS,106:3426-3430). Como um exemplo, os ratos podem ser injetados com injeção de 74% de meio de contraste Optiray Pharmacy ioversol (por exemplo, 741 mg de loversol/mL), ratos anestesiados, e a tomografia computadorizada feita usando um scanner MICROCAT 1A ou outro scanner semelhante (por exemplo, IMTEK) (40 kV, 600 VA, 196 etapas de rotação, ângulo total ou rotação = 196). As imagens podem ser reconstruídas usando o software (por exemplo, programa de software RVA3; ImTeK). Volumes tumorais podem ser determinados usando o software disponível (por exemplo, software Amira 3.l; Mercury Computer Systems). O volume ou o tamanho do tumor também pode ser determinado com base no tamanho ou peso de um tumor.
[0525] A percentagem de inibição do crescimento do tumor pode ser calculada com base no volume, utilizando a equação% TGI=[1-(TnhW-To)-(Cn-Co)]x100%, em que "T,", é O volume médio do tumor para o grupo de tratamento no dia "n" após a última dose de enzima degradadora de hialuronan; "TÁ" é o volume médio do tumor, no grupo de tratamento no dia O, antes do tratamento ; " Cn " é o volume médio do tumor para o grupo de controle correspondente ao dia "n" ; e " CY" é o volume médio do tumor no grupo de controle no dia O, antes do tratamento. A análise estatística do volume do tumor pode ser determinada.
4. Ensaios Farmacocinéticos e farmacodinâmicos
[0526] os estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos podem ser realizados utilizando modelos animais ou podem ser realizados durante os estudos com pacientes para avaliar as propriedades farmacocinéticas de um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima degradante de hialuronan, tais como hialuronidase Ou hialuronidase modificada (por exemplo, PEGPH20). Os modelos animais incluem, mas não estão limitados a, camundongos, ratos, coelhos, cães, porcos da guiné e modelos de primatas não humanos, tais como macacos cynomolgus e macacos rhesus. Em alguns casos, os estudos farmacocinéticos ou farmacodinâmicos são realizados usando animais saudáveis. Em outros exemplos, os estudos são realizados utilizando modelos animais de uma doença para a qual a terapia com hialuronan é considerada, por exemplo, modelos animais de qualquer doença ou distúrbio associado a hialuronan, por exemplo, um modelo de tumor.
[0527] As propriedades farmacocinéticas de um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tal como hialuronidase modificada) pode ser avaliada através da medição de parâmetros como a concentração máxima (pico) (Cmax), o tempo de pico (isto é, quando ocorre a concentração máxima; Tmax), a concentração mínima (isto é, a concentração mínima entre as doses; Cmin), a meia-vida de eliminação (T1,/2) e a área sob a curva (isto é, a área sob à curva gerada por tempo traçado versus concentração; AUC), após a administração. A biodisponibilidade absoluta do agente ou enzima (por exemplo, uma hialuronidase) pode ser determinada por comparação da área sob a curva após a entrega subcutânea (AUCsc) com a entrega intravenosa seguida por AUC(AUCiv). A biodisponibilidade absoluta (F), pode ser calculada usando a fórmula: F=([AUC] sc* dosesc) / ([AUC] 14x dose;,) . Uma variedade de doses e diferente frequência da dosagem pode ser administrada em estudos farmacocinéticos para avaliar o efeito de aumentar ou diminuir a concentração de um agente anti-hialuronan, por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan, tais como hialuronidase ou hialuronidase modificada (p.ex. PH20 PEGuilada) na dose.
H. KITS E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[0528] Aqui proporcionados são kits para utilização na seleção de pacientes para o tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan), para prever a eficácia de tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo enzima que degrada hialuronan), para a determinação do prognóstico de um paciente com uma doença associada ao HA, ou para monitorar a eficácia do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) para oO tratamento de doenças associadas ao HA, em particular o câncer. Os kits aqui proporcionados contêm um reagente HABP aqui proporcionado, para a detecção e quantificação de hialuronan em uma amostra e, opcionalmente, os reagentes para a realização dos métodos. Por exemplo, os kits podem conter, adicionalmente, reagentes para a recolhimento de tecidos, preparação e o processamento de tecidos, e os reagentes para a quantificação da quantidade de HA em uma amostra, tal como, mas não limitados a, reagentes de detecção, tais como anticorpos, tampões, substratos para coloração enzimática, cromagens ou outros materiais, tais como lâminas, containers, placas de microtitulação e, opcionalmente, instruções para realizar os métodos. Os peritos na arte reconhecerão muitos outros possíveis recipientes e as placas, e os reagentes que podem ser usados para entrar em contato com os diversos materiais. Kits também podem conter amostras de controle representando tecidos com diferentes níveis de HA, ou amostras de referência coloridas, para o teor de HA para comparação e classificação das amostras de teste. O diagnóstico de HABP fornecido pode ser fornecido em uma formulação liofilizada ou outra, estável, do agente de diagnóstico. Em alguns exemplos, o kit inclui um dispositivo, tal como um sistema automatizado de imagiologia celular (ACIS) fluorômetro, luminômetro ou espectrofotômetro para detecção do ensaio.
[0529] Também são fornecidas combinações de um reagente de HABP aqui previstas, incluindo a melhoria dos reagentes de HABP aqui fornecidos, e uma enzima que degrada ácido hialurônico. Tal como aqui descrito, HABPs podem ser utilizadas como agentes de diagnóstico complementares para o tratamento com uma enzima de degradação de hialuronan. Tais combinações podem, opcionalmente, ser embaladas em kits para o uso em seleção de pacientes para o tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) e o tratamento de tais pacientes com o agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada o hialuronan), para predizer a eficácia do tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) em um paciente e tratamento de tais pacientes com o agente anti-hialuronan (por exemplo enzima que degrada hialuronan), para a determinação do prognóstico de um paciente com uma doença associada ao HA, e tratamento de tais pacientes com agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan), ou para monitorar a eficácia do tratamento de um paciente com uma enzima anti- hialuronan(por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) para o tratamento de doenças associadas ao HA, em particular o câncer, e tratamento de tais pacientes com o agente anti-hialuronan (por exemplo enzima que degrada hialuronan) com base na eficácia do tratamento.
As combinações, que podem ser embaladas em kits, podem incluir, um ou mais agentes adicionais para a terapia, tais como um agente anticâncer, ou para o tratamento ou um efeito colateral da terapia, incluindo um corticosteroide para o tratamento dos efeitos colaterais músculo- esqueléticos associados com o tratamento com um agente anti-hialuronan (por exemplo, enzima que degrada hialuronan). Os kits podem incluir materiais de embalagem para o acondicionamento do agente anti-hialuronan (por exemplo enzima que degrada hialuronan) ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
Por exemplo, os kits podem conter um container incluindo uma câmara única e containers de dupla câmara.
Os containers incluem, mas não estão limitados a tubos, frascos e seringas.
Os recipientes podem ainda incluir materiais para administração, tais como uma agulha para a administração subcutânea.
O agente anti- hialuronan (por exemplo, uma enzima que degrada hialuronan) ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser fornecidos em conjunto ou separadamente.
O kit pode,
opcionalmente, incluir instruções para administração, incluindo dosagens, regimes de dosagem e instruções para modos de administração.
[0530] Os kits aqui proporcionados também podem incluir reagentes para a detecção da expressão de uma ou mais proteínas adicionais ou que codificam RNA na amostra, tal como, por exemplo, um ou mais marcadores de câncer adicional, tais como, por exemplo, mas não limitados a, antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína (AFP) CAl25, CAl9 -9, antígeno específico da próstata (PSA), gonadotrofina coriônica humana (HCG), antígeno HER2/neu, CA27.29, CYFRA 21-2, LASA-P, CAl5-3, TPA, S-100 e CA-125.
IT. EXEMPLOS
[0531] Os exemplos seguintes são incluídos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.
Exemplo 1 Linhagens celulares que expressam rHuPH20 A. Geração de uma linhagem de células que expressam rHuPH20 solúvel Inicial
[0532] Células de ovário de hamster chinês (CHO) foram transfectadas com o plasmídeo HZ24 (estabelecido na SEQ ID NO: 52). O vetor plasmídeo HZ24 para a expressão de rHuPH20 solúvel contém uma estrutura de vetor pCI (Promega), o DNA que codifica aminoácidos 1-482 de hialuronidase PH20 humana (SEQ ID NO: 49), um local de entrada ribossômico interno (IRES) do vírus ECMV (Clontech), e o gene di-hidrofolato-redutase do rato (DHFR). O vetor de espinha dorsal pCI também inclui o DNA que codifica o gene de resistência a beta-lactamase (AmpR), a origem fl de replicação, uma região potenciadora/promotora precoce imediata de citomegalovírus (CMV), um intron quimérico, e um sinal de poliadenilação tardio de SV40 (SV40). O DNA que codifica o constructo rHuPH20 solúvel contém um sítio Nhel e uma sequência de consenso Kozak antes do DNA que codifica para a metionina na posição do aminoácido 1 da sequência de sinal de aminoácido 35 nativa de PH20 humana, e um codon de paragem na sequência do DNA que codifica a tirosina correspondendo à posição de aminoácido 482 da hialuronidase PH20 humana descrita na SEQ ID NO: 1), seguida por um local de restrição BamHI. O constructo pCI- PH20-IRES-DHFR SV40pa (HZ24), por isso, resulta em uma única espécie de mRNA dirigida pelo promotor CMV que codifica os aminoácidos 1- 482 da redutase PH20 humana (estabelecida na SEQ ID NO: 3 e os aminoácidos 1-186 de rato di-hidrofolato redutase (estabelecida na SEQ ID NO: 53 separada pelo local de entrada do ribossoma interno (IRES).
[0533] As células CHO não transfectadas crescem em meios GIBCO CD- CHO modificados GIBCO para células DHFR (-), suplementadas com glutamina 4 mM e 18 ml/L de Plurionic F68/L (Gibco), foram semeadas a 0,5 x 106 células/ml em um recipiente agitador em preparação para transfecção. As células foram cultivadas a 37ºC em 5% de CO; em uma incubadora umidificada, com agitação a 120 rpm. Exponencialmente, o crescimento de células CHO não transfectadas foi testado quanto à viabilidade antes da transfecção.
[0534] Sessenta milhões de células viáveis da cultura de células CHO não transfectadas foram sedimentadas e ressuspensas a uma densidade de 2 x 10º células em 0,7 ml de 2 x tampão de transfecção ((2xHeBS: 40 mM Hepes, pH 7,0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,4 mM NaszHPOs, 12 mM dextrose). A cada alíquota de células ressuspensas, 0,09 mL (250 pg) do plasmídeo HZ24 linear (linearizado por digestão durante a noite com Cla I (New England Biolabs) foi adicionado, e as soluções de célula/DNA foram transferidas para 0,4 centímetros BTX (Gentronics) cubetas de eletroporação à temperatura ambiente. Um controle negativo de eletroporação foi realizado sem o DNA de plasmídeo misturado com as células. As misturas de células/plasmídeo foram eletroporadas com descarga de um condensador de 330 V e 960 npF ou a 350 V e 960 yupF.
[0535] As células foram removidas das cubetas após a eletroporação e transferidas para 5 ml de meios CD- CHO modificados para células DHFR (-), suplementadas com glutamina a 4 mM e 18 ml/L de Plurionic F68/L (Gibco), e deixadas para crescer em uma placa de cultura de tecido de 6 poços, sem seleção durante 2 dias a 37ºC, em 5% de CO, em uma incubadora umidificada.
[0536] Dois dias após a eletroporação, 0,5 mL de meio de cultura de tecido foi removido de cada poço e testado para a presença de atividade de hialuronidase, utilizando o ensaio de microturbidez descrito no Exemplo 3. Células que expressam os níveis mais elevados de atividade de hialuronidase foram recolhidas a partir da cultura de tecidos bem contados e diluídos para 1 x 10º para 2 x 10º de células viáveis por mL. Uma alíquota de 0,1 ml da suspensão de células foi transferida para cada poço de cinco, de placas de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 poços. Cem microlitros de meio CD-CHO (GIBCO) contendo 4 mM de suplemento GlutaMAX*-1 (GIBCO”", Invitrogen Corporation) e, sem suplementos de hipoxantina e timidina, foram adicionados aos poços que continham as células (volume final de 0,2 mL).
[0537] Dez clones foram identificados a partir das 5 placas cultivadas sem o metotrexato. Seis destes clones HZ24 foram expandidos em cultura e transferidos para balões de agitação como suspensões de células únicas. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1El1, e 4D10 foram plaqueados em placas de 96 poços de cultura de tecidos de fundo redondo utilizando uma estratégia de diluição infinita bidimensional, em que as células foram diluídas 1:2 abaixo da placa, e 1:3 pela placa, a partir de 5000 células no lado superior esquerdo do poço. Clones diluídos foram cultivados em um fundo de 500 células DG44 CHO não transfectadas por poço, para fornecer fatores de crescimento necessários para os primeiros dias em cultura. Dez placas foram feitas por subclone, com 5 placas contendo 50 nM de metotrexato e 5 placas sem o metotrexato.
[0538] O clone 3D3 produziu 24 subclones visuais (13 a partir do tratamento sem metotrexato, e 11 a partir do tratamento com 50 nM de metotrexato). A atividade de hialuronidase significativa foi medida nos sobrenadantes de 8 dos 24 sub-clones (> 50 unidades/ml), e estes 8 subclones foram expandidos em frascos T-25 de cultura de tecidos. Os clones isolados a partir do protocolo de tratamento com metotrexato foram expandidos na presença de 50 nM de metotrexato. O clone 3D35M foi expandido em 500 nM de metotrexato em frascos agitados, e deu origem a clones produtores de mais de 1000 unidades/ml de atividade hialuronidase (clone 3D35M; ou Genl 3D35M). Um banco de células principal (MCB) das células 3D35M foi então preparado.
B. Geração de uma Linhagem celular de Segunda Geração que expressa rHuPH20 solúvel
[0539] A linhagem celular Genl 3D35M descrita no Exemplo 1A foi adaptada para níveis mais elevados de metotrexato, para produzir clones de geração 2 (Gen2). Células 3D35M foram semeadas a partir de culturas contendo metotrexato, estabelecidas em meio CD CHO contendo 4 mM GlutaMAX-1" e 1,0 uM de metotrexato. As células foram adaptadas a um nível mais elevado de metotrexato, por crescimento, e passadas 9 vezes durante um período de 46 dias a 37ºC, 7% de incubadora umidificada de CO;. A população de células amplificadas foi clonada por diluição limitante em placas de 96 poços de cultura de tecidos contendo meio com 2,0 uM de metotrexato. Após cerca de 4 semanas, os clones foram identificados e clones 3E10B selecionados para expansão. Células 3E10B foram cultivadas em meio CD CHO contendo 4 mM GlutaMAX-1" e 2,0 uM de metotrexato, durante 20 passagens. Um banco de células principal (MCB), da linhagem celular 3E1lO0B foi criado e congelado, e utilizado para estudos posteriores.
[0540] A amplificação da linhagem celular continuou pela cultura de células 3E10B em meio CD CHO contendo 4 mM GlutaMAX-1""º e 4,0 uM de metotrexato. Após a 12º passagem, as células foram congeladas em frascos como um banco de células de pesquisa (RCB). Um frasco do RCB foi descongelado e cultivado em meio contendo 8,0 unM de metotrexato. Após 5 dias, a concentração de metotrexato no meio foi aumentada para 16,0 uM, em seguida 20,0 uM, após 18 dias. Células da oitava passagem em meio contendo 20,0 uM de metotrexato foram clonadas por diluição limitante em placas de 96 poços de cultura de tecidos contendo meio CD CHO com 4 mM GlutaMAX-1"” e 20,0 pM de metotrexato. Os clones foram identificados 5 a 6 semanas mais tarde, e o clone 2B2 foi selecionado para expansão em meio contendo 20,0 pM de metotrexato. Após a 11º passagem, as células 2B2 foram congeladas em frascos como um banco de células de pesquisa (RCB).
[0541] As células resultantes 2B2 são deficientes de dihidrofolato redutase(dhfr-) de células DG44 CHO que expressam PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20). O PH20 solúvel está presente em células 2B2 em um número de cópias de cerca de 206 cópias/célula. A análise Southern blot de DNA de célula 2B2 genômica de Spe I-, Xba I- e BamH I/Hind III digerido, utilizando uma sonda específica para rHuPH20, revelou o seguinte perfil de digestão de restrição: uma grande banda de hibridização de - 7,7 kb e quatro bandas de hibridização menores (- 13,9, - 6,6, - 5,7, e - 4,6 kb) com o DNA digerido com Spe I ; uma grande banda de hibridização de - 5,0 kb e duas bandas de hibridização menores (- 13,9 e - 6,5 kb) com o DNA digerido com XbaIl ; e uma única banda de hibridização de - 1,4 kb, observados utilizando 2B2 DNA digerido com BamH I/Hind III. A análise da sequência do transcrito de mRNA indicou que o CDNA derivado (SEQ ID NO: 56) foi idêntico à sequência de referência (SEQ ID NO: 49), exceto para uma diferença de par de bases na posição 1131, que foi observada como sendo uma timidina (T) em vez da esperada citosina (C). Esta é uma mutação silenciosa, com nenhum efeito sobre a sequência de aminoácidos. Exemplo 2 Produção e Purificação de rHuPH20 A. Produção de rHuPH20 Solúvel Gen2 em uma Cultura de Células de biorreator 300 L
[0542] Um frasco de células HZ24-2B2 (Exemplo 1B) foi descongelado e expandido a partir de frascos de agitação através de 36 frascos rotativos em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbady, CA) suplementado com 20 pnM de metotrexato e GlutaMAX-1" (Invitrogen). Resumidamente, um frasco de células foi descongelado em um banho de água de 37ºC, o meio foi adicionado, e as células foram centrifugadas. As células foram ressuspensas em um frasco de 125 ml com agitação de 20 mL de meio fresco, e colocadas em um banho a 37ºC, 7% de incubadora de CO;. As células foram expandidas até 40 mL em um frasco agitado de 125 mL.
Quando a densidade celular atingiu mais do que 1,5 x“ 10º células/ml, a cultura foi expandida em um frasco giratório de 125 mL em 200 mL de volume de cultura, e o frasco foi incubado a 37ºC, 7% de CO». Quando a densidade celular atingiu mais do que 1,5 x 10º células/ml, a cultura foi expandida em um balão giratório em 200 mL de volume da cultura, e o frasco foi incubado a 37ºC, 7% CO». Quando a densidade celular atingiu mais do que 1,5 x* 10º células/ml, a cultura foi expandida em um balão de agitação de 1 L em 800 ml de volume de cultura e incubadas a 37 º C, 7% CO2. Quando a densidade celular atingiu mais do que 1,5 x 10º células/mL da cultura foi expandida em um balão de agitação de 6 L em 5000 ml de volume de cultura e incubadas a 37 * C, 7% CO;z. Quando a densidade celular atingiu mais do que 1,5 x 10º células/mL da cultura foi expandida em um balão de 36 L giratório em 32 L de volume de cultura e incubada a 37 º C, 7% CO.
[0543] Um reator de 400 L foi esterilizado e adicionado 230 mL de meio CD-CHO. Antes da utilização, O reator foi verificado para a contaminação. Aproximadamente 30L de células foram transferidos dos frascos rotativos de 36L para o biorreator de 400 L (Braun) a uma densidade de inoculação de 4,0 x 10º células viáveis por ml, e um volume total de 260 L. Os parâmetros foram ajustados para temperatura de 37ºC ; Impulsor de velocidade 40-55 RPM; Pressão do recipiente: 3 psi ; Pulverizador de Ar 0,5-1,5 L/min.; Sobreposição de Ar: 3 L/min. O reator foi amostrado diariamente para contagem de células, verificação de pH, análise de meio, produção de proteínas e retenção. Além disso, durante a execução, alimentações de nutriente foram adicionadas. Em 120 horas (dia 5), 10.4 L de meio de alimentação t1 (4xCD-CHO+33 9/L Glicose+160 mL/L Glutamax- 17+83 mL/L Yeastolate+33 mg/L rHulnsulin) foram adicionados. Em 168 horas (dia 7), 10,8 L de alimentação t2 (2xCD-CHO+33 g/L Glicoser80 mL/L Glutamax-l1"+167 mL/L Yeastolate+0.92 g/L butirato de sódio) foi adicionado, e a temperatura de cultura foi alterada para 36,5ºC. A 216 horas (dia 9), 10,8 L de alimentação *3 (1 x CD-CHO+50 g/L Glicose+50 mL/L Glutamax-1"+250 mL/L Yeastolate+1,80 g/L de butirato de sódio) foi adicionado, e a temperatura de cultura foi alterada para 36ºC. A 264 horas (dia 11), 10,8 L de alimentação $4 (1 x CD-CHO+33 g/L Glicose+33 mL/L Glutamax-1"+250 mL/L Yeastolate+0,92 g/L de butirato de sódio) foi adicionado, e a temperatura de cultura foi alterada para 35,5ºC. A adição dos meios de alimentação foi observada para aumentar dramaticamente a produção de rHuPH20 solúvel em fase final de produção. O reator foi colhido aos 14 ou 15 dias, ou quando a viabilidade das células caiu abaixo de 40%. O processo resultou em uma produtividade final de 17.000 unidades por ml, com uma densidade celular máxima de 12 milhões de células/mL. Na colheita, a cultura foi amostrada para micoplasma, carga biológica, endotoxina e viral in vivo e in vitro, Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) e atividade enzimática.
[0544] A cultura foi bombeado por uma bomba peristáltica através de quatro módulos do sistema de filtração Millistak (Millipore) em paralelo, contendo cada um, uma camada de terra de diatomáceas graduada para 4-8 um e uma camada de terra de diatomáceas graduada para 1,4-1,1 pm, seguido de uma membrana de celulose, em seguida, através de um segundo sistema de filtragem Millistak único (Millipore), contendo uma camada de terra de diatomáceas graduada para 0,4-0,11 pm e uma camada de terra de diatomáceas graduada para < 0,l um, seguida por uma membrana de celulose, e, em seguida, através de um filtro final de 0,22 uM de saco flexível estéril para um uso único com uma capacidade de 350 L. O fluido da cultura de células recolhido foi suplementado com EDTA 10 mM e Tris 10 mM a um pH de 7,5. A cultura foi concentrada 10 x com um aparelho de filtração de fluxo tangencial (TFF), utilizando quatro filtros Sartoslice TFF de poliéter -sulfona (PES) de peso molecular de corte de 30 kDa (MWCO) (Sartorius), seguido de uma permuta do tampão 10 x com 10 mM Tris, Na2SO4 a 20 mM, pH 7,5 para um filtro final de 0,22 pm, para um saco de armazenagem estéril de 50 L.
[0545] A colheita diafiltrada concentrada foi inativada por vírus. Antes da inativação viral, foi preparada uma solução de 10% de Triton X-100, 3% de tri (n- butil) fosfato (TNBP). A colheita diafiltrada concentrada foi exposta a 1% de Triton X-100, 0,3% de TNBP por 1 hora em um recipiente de vidro de reação de 36 L, imediatamente antes da purificação na coluna de OQ.
B. Purificação de Gen2 Solúvel rHuPH20
[0546] Uma coluna de permuta iônica (resina de 9 L, H = 29 cm, D = 20 cm) de Q-Sepharose (Pharmacia) foi preparada. Amostras lavadas foram coletadas para a determinação de pH, ensaio de condutividade e endotoxinas (LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de 10 mM Tris, 20 mM de NaszSOa, pH 7,5. Após a inativação viral, a colheita diafiltrada concentrada (Exemplo 2A) foi carregada na coluna de Q a uma taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 volumes de 10 mM Tris, 20 mM de Na2S04, pH de 7,5 e 10 mM de Hepes, 50 mM de NaCl, pH 7,0 da coluna. A proteína foi eluída com 10 mM de Hepes, 400 mM de NaCl, pH 7,0 para um filtro final de 0,22 um em saco estéril. A amostra de fluido foi testada para carga biológica, concentração de proteína e atividade de hialuronidase.
Leituras de absorvância A280 foram obtidas no início e no final da permuta.
[0547] Cromatografia de interação hidrofóbica Fenil-Sepharose (Pharmacia) foi realizada a seguir. Uma coluna de Fenil-Sepharose (PS) (19-21 resina L, H = 29 cm, D = 30 cm) foi preparada. A lavagem foi recolhida e amostrada para pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amônia, CaCl, 0,1 mM, pH 7,0. O eluato de proteína a partir da coluna de Q -Sepharose foi complementado com sulfato de amônia a 2M, fosfato de potássio a 1 M, e soluções estoque de CaCl, para se obterem concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. A proteína foi carregada na coluna de PS, a uma taxa de fluxo de 100 cm/h, e o fluxo através da coluna recolhido. A coluna foi lavada com fosfato de potássio 5 mM, 0,5 M de sulfato de amônia e 0,1 mM de CaCl,, pH 7,0 a 100 cm/h, e a lavagem foi adicionada ao fluxo recolhido através dela. Combinado com a lavagem da coluna, o fluxo foi passado através de um filtro final de 0,22 um para um saco estéril. O fluxo passado foi amostrado para carga microbiana, concentração de proteínas e atividade de enzimas.
[0548] Uma coluna aminofenil boronato (ProMedics) foi preparada. A lavagem foi recolhida e amostrada para pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amônia. O fluxo de PS passado contendo proteína purificada foi carregado na coluna aminofenil boronato, a uma taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com fosfato de potássio a 5 mM, 0,5 M de sulfato de amônia, pH 7,0. A coluna foi lavada com 20 mM de bicina, 0,5 M de sulfato de amônia, pH 9,0. A coluna foi lavada com mM de bicina, cloreto de sódio a 100 mM, pH 9,0. A proteína foi eluída com tampão Hepes a 50 mM, NaCl a 100 mM, pH 6,9, e passada através de um filtro estéril para um saco estéril. A amostra eluída foi testada para carga biológica, concentração de proteína e atividade enzimática.
[0549] A coluna de hidroxiapatita (HAP) (BioRad foi preparada. A lavagem foi recolhida e testada para o pH, condutividade e endotoxinas (ensaio LAL). A coluna foi equilibrada com 5 mM de fosfato de potássio, 100 mM de NaCl, CaCl,; 0,1 mM, pH 7,0. A proteína purificada de aminofenil boronato foi suplementada com concentrações finais de fosfato de potássio a 5 mM e CaCl; a 0,1 mM, e carregada na coluna de HAP, a uma taxa de fluxo de 100 em/h. A coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, pH 7, NaCl a 100 mM, CaCl; a O0,l mM. A coluna foi, em seguida, lavada com fosfato de potássio a 10 mM, pH 7, NaCl a 100 mM, CaCl; a 0,1 mM. A proteína foi eluída com fosfato de potássio a 70 mM, pH 7,0, e passada através de um filtro estéril de 0,22 um para um saco estéril. A amostra eluída foi testada para carga biológica, concentração de proteína e atividade enzimática.
[0550] A proteína purificada de HAP foi então passada através de um filtro de remoção de vírus. O filtro Viosart esterilizado (Sartorius) foi preparado, primeiramente, por lavagem com 2 L de fosfato de potássio a 70 mM, pH 7,0. Antes do uso, o tampão filtrado foi amostrado para pH e condutividade. A proteína purificada de HAP foi bombeada através de uma bomba peristáltica, através do filtro de remoção de vírus de 20nM. A proteína filtrada em fosfato de potássio 70 mM, pH 7,0, foi passada através de um filtro final de 0,22 pm para um saco estéril. A amostra filtrada viral foi testada para a concentração de proteínas, atividade enzimática, oligossacarídeos,
monossacarídeos e perfil de ácido siálico. A amostra também foi testada para o processo relacionado com impurezas. Exemplo 3 Determinação da Atividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel
[0551] Atividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel em amostras de culturas de células, tais como, plasma, frações de purificação e soluções purificadas foi determinada utilizando um ensaio de turbidimetria, que baseia-se na formação de um precipitado insolúvel, quando o ácido hialurônico se liga à albumina do soro, ou um ensaio de substrato de ácido hialurônico biotinilado, que mede a quantidade de rHuPH20 enzimaticamente ativa ou PEGPH20, pela digestão do substrato de ácido hialurônico biotinilado (b-HA) não-covalentemente ligado a placas de microtitulação de plástico de multi-poços.
A. Ensaio de Microturbidez
[0552] A Atividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel é medida por incubação de rHuPH20 solúvel com o hialuronato de sódio (ácido hialurônico) por um determinado período de tempo (10 minutos) e, em seguida, precipitando o hialuronato de sódio não digerido, com a adição de albumina de soro acidificada. A turbidez da amostra resultante foi medida a 640 nm após um período de desenvolvimento de 30 minutos. A diminuição da turbidez resultante da atividade da enzima sobre o substrato de hialuronato de sódio é uma medida da atividade de hialuronidase de rHuPH20 solúvel. O método é realizado utilizando uma curva de calibração gerada com diluições de um ensaio de rHuPH20 solúvel padrão de referência de trabalho, e medições da atividade da amostra são feitas em relação a esta curva de calibração.
[0553] As diluições da amostra foram preparadas em soluções diluentes de enzima. A solução diluente de enzima foi preparada por dissolução de 33,0 t+ 0,05 mg de gelatina hidrolisada em 25,0 mL de tampão de reação PIPES a 50 mM (140 mM de NaCl, 50 mM de PIPES, pH 5,5) e 25,0 mL de água estéril para injeção (SWFI), e diluição de 0,2 ml de solução em 25% de Buminato, para a mistura e centrifugação durante 30 segundos. Esta foi realizada no prazo de 2 horas de utilização e armazenada em gelo até ser necessária. As amostras foram diluídas para cerca de 1 a 2 U/ml. Geralmente, a diluição máxima por etapa não excede a 1:100, e o tamanho da amostra inicial para a primeira diluição não foi inferior a 20 pL. Os volumes mínimos de amostra necessária para efetuar o ensaio foram como se segue: No processo de Amostras, frações FPLC: 80 ul; sobrenadantes de cultura de tecidos: 1 mL; Material concentrado: 80 1nL ; Material de etapa final ou purificado: 80 pl. As diluições foram feitas em triplicado em uma placa de 96 poços de ligação a baixa proteína, e 30 pl de cada diluição foram transferidos para placas de fundo preto/claro Optilux (BD Biosciences).
[0554] As diluições do conhecido rHuPH20 solúvel com uma concentração de 2,5 U/ml foram preparadas em solução diluente de enzima, para gerar uma curva padrão, e adicionou-se a placa Optilux em triplicado. As diluições incluíram O U/mL, 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL, e 2,5 U/mL. Poços “nulos de reagente" que continham 60 1"npL de Solução de Enzima diluente foram incluídos na placa como um controle negativo. A placa foi então coberta e aquecida em um bloco de aquecimento durante minutos a 37ºC. A tampa foi removida e a placa foi agitada durante 10 segundos. Após agitação, a placa foi devolvida para o bloco de aquecimento, e o dispositivo de manipulação de líquidos MULTIDROP 384 foi iniciado com 0,25 mg/ml de uma solução quente de hialuronato de sódio
(preparada por dissolução de 100 mg de hialuronato de sódio (Lifecore Biomedical) em 20,0 ml de SWFI. Tudo foi então misturado por rotação suave e/ou agitação a 2 a 8ºC durante 2 a 4 horas, ou até que estivesse completamente dissolvido). A placa da reação foi transferida para oO MULTIDROP 384 e a reação foi iniciada, pressionando a tecla de início para distribuir 30 pL de hialuronato de sódio a cada poço. A placa foi, em seguida, removida do MULTIDROP 384 e agitada durante 10 segundos, antes de ser transferida para um bloco de aquecimento com a tampa substituída. A placa foi incubada a 37ºC durante 10 minutos.
[0555] O MULTIDROP 384 foi preparado para parar a reação preparando a máquina com solução de soro de trabalho e alterando a definição de volume para 240 pl. (25 mL de solução estoque de soro [1 volume de Soro de Cavalo (Sigma) foram diluídos com nove volumes de 500 mM de solução tampão de acetato, e o pH foi ajustado para 3,l com ácido clorídrico] em 75 mL de 500 mM de solução tampão de acetato). A placa foi removida do bloco de aquecimento e colocada sobre o MULTIDROP 384, e 240 upL de soluções de trabalho de soro foram distribuídos para os poços. A placa foi removida e agitada em um leitor de placas durante 10 segundos. Depois de mais 15 minutos, a turbidez das amostras foi medida a 640 nm, e a atividade de hialuronidase (em U/mL) de cada amostra foi determinada pelo ajuste com a curva padrão.
[0556] A atividade específica (unidades/mg) foi calculada dividindo-se a atividade da hialuronidase (U/mL) pela concentração de proteína (mg/mL).
B. Ensaio de hialuronan biotinilado
[0557] O ensaio do ácido hialurônico biotinilado mede a quantidade de rHuPH20 ou PEGPH20 enzimaticamente ativa em amostras biológicas, pela digestão de um substrato de ácido hialurônico biotinilado (b-HA) de grande peso molecular (- 1,2 megadaltons) não-covalentemente ligado a placas de microtitulação de multi-poços plásticos. A rHuPH20 ou PEGPH20 em padrões e amostras são deixadas para incubar em uma placa revestida com b-HA a 37ºC. Após uma série de lavagens, permanecendo não clivado/ligado b-HA é tratado com o conjugado de estreptavidina peroxidase de rábano (SA-HRP). A reação entre SA-HRP imobilizada e o substrato cromogênico, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), produz uma solução de cor azul. Depois de parar a reação com ácido, a formação do produto de reação solúvel amarelo é determinada pela leitura da absorvância a 450 nm, utilizando um espectrofotômetro de placas de microtitulação. A diminuição na absorvância a 450 nm resultante da atividade da enzima sobre o substrato de ácido hialurônico biotinilado (b-HA) é uma medida da atividade de hialuronidase rHuPH20 solúvel. O método é realizado utilizando uma curva de calibração gerada com diluições de rHuPH20 ou PEGPH20 solúvel padrão de referência, e medições da atividade da amostra são feitas em relação a esta curva de calibração.
[0558] As diluições da amostra e o calibrador foram preparados em diluente de ensaio. O Diluente de Ensaio foi preparado pela adição de 1% v/v de bancos de plasma (a partir de espécies apropriadas) para 0,1% (w/v) de BSA em HEPES, pH 7,4. Tudo foi preparado diariamente e armazenado a 2 a 8ºC. Dependendo dos tipos de espécies, bem como o nível antecipado de hialuronidase, diluições únicas ou múltiplas foram preparadas para assegurar, pelo menos, que uma diluição da amostra cairia dentro do intervalo da curva de calibração. Para orientar a seleção de diluição da amostra de teste (s), a informação conhecida sobre a dose de hialuronidase administrada, via de administração, volume de plasma aproximado das espécies, e o ponto no tempo foram utilizados para calcular os níveis de atividade de hialuronidase.
Cada diluição da amostra foi misturada conforme foi preparada por breve pulso-centrifugação, e as ponteiras das pipetas foram alteradas entre cada diluição.
Em geral, as diluições começaram com uma diluição inicial de 50 ou 100 vezes, seguida por diluições seriais adicionais.
Uma curva de calibração de sete pontos de rHuPH20 ou PEGPH20 (dependendo do tratamento administrado) foi preparada variando em concentração 0,004-3,0 U/mL para rHuPH20 e 0,037-27 U/mL para PEGPH20. Cem microlitros (100 pl) de cada diluição de amostra de teste e de pontos da curva de calibração foram aplicados em poços triplicados de uma placa de microtitulação de 96 poços (Immulon 4HBX, Thermo) que tinham sido previamente revestidos com 100 ul por poço de b-HA a 0,1 mg/ml, e bloqueados com 250 pL de 1,0% (w/v) de albumina de soro bovino em PBS.
A (s) placa (s) foram cobertas com uma vedação adesiva e incubadas a 37ºC durante aproximadamente 90 minutos.
No final do período de incubação, a vedação adesiva foi removida da placa, as amostras foram aspiradas e a placa lavada cinco (5) vezes com 300 pl por poço de tampão de lavagem (10 mM de tampão fosfato, 2,7 mM de cloreto de potássio, cloreto de sódio a 137 mM, pH 7,4, com 0,05% (v/v) Tween 20, de PBST) usando um lavador automático de placas (BioTek ELX405 Select CW, Programa '4HBX1'). Cem microlitros de Solução de Trabalho Conjugado de streptavidina-HRP [conjugado de Estreptavidina-HRP (1:5000 v/v) em 20 mM Tris-HCl, 137 mM de cloreto de sódio, 0,025% (v/v) Tween 20, 0,1% (w/v) Albumina de Soro Bovino] foram adicionados por poço.
A placa foi selada e incubada à temperatura ambiente durante cerca de 60 minutos, sem agitação e protegida da luz.
No final do período de incubação, a vedação adesiva foi removida da placa, as amostras foram aspiradas e a placa lavada cinco (5) vezes com 300 1pl por poço de tampão de lavagem, tal como descrito acima. Solução de TMB (à temperatura ambiente) foi adicionada a cada poço e deixada para incubar sob luz, durante cerca de cinco (5) minutos, à temperatura ambiente. Solução de Paragem de TMB (KPL, Catálogo * 50-85-06) foi então adicionada como 100 pl por poço. A absorbância de cada poço a 450 nm foi determinada utilizando um espectrofotômetro de placas de microtitulação. A resposta da curva de calibração de cada placa foi modelada utilizando um ajuste de curva logística de parâmetro 4. A atividade de hialuronidase de cada desconhecido foi calculada por interpolação a partir da curva de calibração, corrigida para o fator de diluição da amostra, e relatada em U/mL. Exemplo 4 Preparação de rHuPH20 PEGuilado
[0559] Neste exemplo, rHuPH20 foi peguilado através da reação da enzima com éster N- hidroxisuccinimidila linear de ácido metoxi poli (etileno glicol) butanoico (mMPEG-SBA-30K). A. Preparação de mPEG-SBA-30K
[0560] A fim de gerar PEGPH20, rHuPH20 (que é aproximadamente de 60 kDa de tamanho) foi conjugada covalentemente com um éster de N-hidroxisuccinimidila linear de ácido metoxi poli (etileno glicol) butanoico (MPEG-SBA-30K), com um peso molecular aproximado de 30 kDa. A estrutura de mPEG-SBA é mostrada abaixo, onde n * 681. o o entratonal- O n mMPEG-SBA É
[0561] Os métodos utilizados para preparar o mMPEG-SBA-30K que foi usado para rHuPH20 PEGuilado são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA No. 5672662. Resumidamente, o mPEG-SBA-30K é feito de acordo com o seguinte procedimento.
[0562] Uma solução de malonato de etila (2 equivalentes) dissolvida em dioxano é adicionada gota a gota a hidreto de sódio (2 equivalentes) e tolueno, sob uma atmosfera de nitrogênio. Metano sulfonato mPEG (1 equivalente, MW 30 kDa, Shearwater) é dissolvido em tolueno e adicionado à mistura acima. A mistura resultante é submetida a refluxo durante aproximadamente 18 horas. A mistura de reação é concentrada até metade do seu volume original, extraída com solução aquosa de NaCl a 10%, extraída com ácido clorídrico aquoso a 1%, e os extratos aquosos são combinados. As fases aquosas recolhidas são extraídas com diclorometano (3 x), e a camada orgânica é seca com sulfato de magnésio, filtrada e evaporada até secar. O resíduo resultante é dissolvido em 1N hidróxido de sódio, contendo cloreto de sódio, e a mistura é agitada durante 1 hora. O pH da mistura é ajustado para cerca de 3 por adição de 6N de ácido clorídrico. A mistura é extraída com diclorometano (2 x).
[0563] A camada orgânica é seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, concentrada, e posta sobre éter dietílico frio. O precipitado é recolhido por filtração e seco sob vácuo. O composto resultante é dissolvido em dioxano e submetido a refluxo durante 8 horas, e em seguida, concentrado até secar. O resíduo resultante é dissolvido em água e extraído com diclorometano (2 x), seco sobre sulfato de magnésio, e a solução é concentrada por evaporação rotativa e, em seguida, vertida em éter dietílico frio. O precipitado é recolhido por filtração e seco sob vácuo. O composto resultante (1 equivalente) é dissolvido em diclorometano, e N- hidroxissuccinimida (2,1 equivalentes) é adicionada. A solução é arrefecida a 0ºC e uma solução de diciclohexilcarbodi-imida (2,1 equivalentes em diclorometano é adicionada, gota a gota. A solução é agitada à temperatura ambiente durante aproximadamente 18 horas. A mistura de reação é filtrada, concentrada e precipitada em éter dietílico. O precipitado é recolhido por filtração e seco sob vácuo, para se obter o pó de mPEG -SBA-30K que é, em seguida, congelado a < -15ºC.
B. Conjugação de MPEG- SBA- 30K para rHuPH20
[0564] Para fazer PEGPH2O0, mMPEG-SBA-30K foi acoplado ao (s) grupo (s) amina de rHuPH20 por conjugação covalente, proporcionando ligações amida estáveis entre rHuPH20 e mPEG, conforme mostrado abaixo, onde n * 681.
o
Ú otrotonal-d + —HN—HWPH mMPEG-SBA d | o tcoforenod-cienene—Ni ríniao rHuPH20 PEGilado
[0565] Antes da conjugação, a proteína granel rHuPH20 purificada preparada no Exemplo 2B foi concentrada para 10 mg/mL, utilizando cassetes de filtração de fluxo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 10 KkDa cassetes (Sartorius) com uma área de filtração de 0,2 m?, e tampão trocado contra 70 mM de fosfato de potássio a pH 7,2. A proteína concentrada foi, em seguida, armazenada a 2 a 8ºC até utilização.
[0566] Para conjugar rHuPH20, mMPEG-SBA-30K (Nektar) foi descongelado à temperatura ambiente, no escuro, durante não mais do que 2 horas. Dependendo do tamanho do lote, uma barra de agitação estéril de 3" foi colocada em um balão Erlenmeyer de 1 ou 3 litros, e uma proteína rHuPH20 de tampão trocado foi adicionada. Cinco gramas de pó seco de mPEG-SBA-30K por grama de rHuPH20 (10:1 de proporção molar de mPEG-SBA-30K: rHuPH20) foram adicionados ao balão sob uma cobertura a vácuo, e a mistura foi misturada durante 10 minutos, ou até que o mMPEG-SBA-30K estivesse completamente dissolvido. A taxa de agitação foi criada de tal forma que ocorreu centrifugação sem formação de espuma.
[0567] A solução foi então filtrada sob uma cobertura classe 100 por bombeamento da solução, por uma bomba peristáltica através de um poliestireno de 0,22 mM, cápsula de filtro de acetato de celulose (Corning de 50 mL filtro tubetop) para um novo frasco de Erlenmeyer de 1 ou de 3 litros, contendo uma barra de agitação estéril de 3". O volume da mistura de reação de PEGPH20 foi determinado por massa (1 g/mL densidade) e 0,22 um de um filtro usado para filtração foi examinado em um teste de integridade de pós-utilização.
[0568] A mistura foi, em seguida, colocada sobre uma placa de agitação a 2 a 8ºC, e misturada durante 20 + 1 horas no escuro. A taxa de agitação foi novamente definida de tal forma que centrifugação ocorreu sem formação de espuma. O recipiente Erlenmeyer inteiro estava envolto em papel alumínio para proteger a solução da luz. Após a mistura, a reação foi interrompida pela adição de 1 M de glicina para uma concentração final de 25 mM. As amostras foram removidas a partir do recipiente para testar o pH e a condutividade. O pH e a condutividade foram, em seguida, ajustados por adição de uma solução de 5 mM Tris Base (5,65 L/L) e 5 mM Tris, 10 mM de NaCl, pH 8,0 (13,35 L/L) para prosseguir com a purificação com Q Sepharose.
[0569] Uma coluna de permuta iônica QFF Sepharose (GE Healthcare) (Comprimento = 21,5-24,0 cm, diâmetro = 20 cm) foi preparada por equilíbrio com 5 volumes de coluna (36 L) de 5 mM Tris, 10 mM de NaCl, pH 8,0. O produto conjugado foi carregado na coluna QFF a uma taxa de fluxo de 95 cm/h. A coluna foi então lavada com 11 L de tampão de equilíbrio (5 mM Tris, 10 mM NaCl, pH 8,0) a uma taxa de fluxo de 95 cm/h, seguida de uma lavagem com 25 L de tampão de equilíbrio a uma taxa de fluxo de 268 centímetros/hr. O produto de proteína foi então eluído com 5 mM Tris, 130 mM NaCl, pH 8,0 a uma taxa de fluxo de 268 cm/h. O PEGPH20 purificado resultante foi concentrado até 3,5 mg/mL, utilizando um cassete de filtração de fluxo tangencial (TFF) de polietersulfona (PES) de 30 kDa cassetes (Sartorius) com uma área de filtração de 0,2 mê, e tampão trocado contra histidina a 10 mM, NaCl a 130 mM, pH 6,5. O material resultante foi testado quanto à atividade da enzima tal como descrito no Exemplo 3. O material rHuPH20 PEGuilado a uma concentração de 3,5 mg/mL (atividade enzimática final de 140,000 U/mL) foi preenchido, em volumes de 3 mL, em frascos de vidro de 5 ml com um stopper de borracha bromobutil siliconado e um selo flip-off de alumínio congelado (congelado durante a noite em um freezer a -20ºC, e então colocado a -80ºC por períodos mais longos de armazenagem). A rHuHP20 PEGuilada continha cerca de 4,5 mols de PEG por mol de rHuPH20.
B. Análise de rHuPH20 PEGuilado
[0570] O material PEGuilado rHuPH20 (PEGPH20) foi analisado por eletroforese em gel. Três lotes de PEGPH20 feitos tal como descrito no Exemplo 4A acima, revelaram um padrão idêntico de bandas múltiplas, que não reagiu, representando PEG e várias espécies de conjugados PEGPH20 que não reagiram, e migraram a diferentes distâncias. Com base na comparação com a migração de um marcador de peso molecular, as bandas que representam as espécies variaram de cerca de 90 kDa a 300 kDa, com três bandas escuras migrando acima do marcador de 240 kDa. Estes dados indicaram que o PEGPH20, gerado por conjugação covalente de MPEG-SBA-30K, continha uma mistura heterogênia de espécies de PEGPH20, provavelmente incluindo proteínas mono-, di- e tri- PEGuiladas. A falta de uma banda visível em 60 KDa sugere que todas as proteínas que reagiram com o PEG, e que não detectaram rHuPH20 nativo estavam presentes na mistura. Exemplo 5 Competência das células tumorais para formar matriz pericelular e Relação com o teor de células tumorais de hialuronan (AH), Níveis de sintase de hialuronana (HAS) e expressão de hialuronidase (Hyal) A. Comparação de teor de Ácido hialuronan em células tumorais (AH), Expressão de HAS1, 2, 3 e Hyal l1 e 2, e formação da matriz pericelular
[0571] Neste Exemplo, a quantidade de enzimas de síntese de HA endógena, sintase de hialuronan (HAS) 1, 2, e 3, hialuronidase (Hyal) 1 e (Hyal) 2, e a quantidade de acumulação de hialuronan (HA), em células tumorais foi comparada com a apresentação de cada um correlacionado com a formação da matriz pericelular pelas células tumorais.
1. Linhagens celulares utilizadas no estudo
[0572] Dez linhagens de células de tumores de origem de diferentes tecidos (por exemplo, da próstata, da mama, do ovário, pâncreas e pulmão) e origem das espécies (por exemplo, humano, rato e camundongo) foram examinadas no estudo. As seguintes linhagens celulares foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC): 4T1l tumor de mama de camundongo (ATCC CRL-2539), adenocarcinoma da próstata humano PC-3 de (ATCC CRL -1435), adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 (ATCC CRL-1687), adenocarcinoma de mama MDA MB 231 (ATCC HTB- 26), carcinoma de próstata maligno de rato Mat- lylu (ATCC JHU -92), adenocarcinoma pancreático humano AsPc -1 (ATCC CRL -1682), carcinoma de próstata humana DU-145 (ATCC HTB-81), e carcinoma pancreático humano MIA PaCa 2 (ATCC CRL -1420). As linhagens celulares da ATCC foram cultivadas em meio de cultura recomendado contendo 10% de FBS a 37ºC em uma incubadora umidificada provida com 5% de CO0,/95% de ar. Células MDA-MB-23l-Luc (Cat. No. D3H2LN), que expressam o gene da luciferase do pirilampo da América do Norte, foram adquiridas da Caliper Life Sciences Inc., e cultivadas em meio RPMI contendo 10% de FBS.
[0573] As linhagens celulares DU-l145/HAS2 e MDA- MB-231-Luc/HAS2 foram geradas através de transdução de linhagens de células DU-l45 e MDA-MB-23l-Luc com um retrovírus que codifica hialuronan sintase 2 (HAS2) (SEQ ID NO: 195). Para gerar os retrovírus HAS2, cDNA hHAS2 marcado His6 N-terminal (SEQ ID NO: 196) foi inserido nos locais AvrII e NotI do vetor pLXRN (SEQ ID NO:197; Clontech, Cat No. 631512), que inclui o gene de resistência à neomicina, para criar pLXRN-hHAS2 (SEQ ID NO: 201). O plasmídeo pLXRN- hHAS2 foi, em seguida, co-transfectado com o vetor envelope pVSV-L (SEQ ID NO: 198 Clontech, parte de Cat. No. 631530) em células GP -293, utilizando o reagente Lipofectamina 2000 (Life Technologies). Uma linhagem celular DU-l45 Mock também foi gerada por co-transfecção do plasmídeo pLXRN vazio e do vetor envelope pVSV-G.
[0574] O título do vírus foi determinado pelo método de PCR quantitativo (retro-X" qRT- Kit Titulação PCR; Clontech, catálogo n º 631453), utilizando os seguintes primers (Clontech nº de Catálogo * K1060-E): pLXSN 5' primer (1398-1420):
5! -=CCCTTGAACCTCCTCGTTCGACC-3' (SEQ ID NO: 199); PpPLXSN 3' primer (1537-1515): 5!" -GAGCCTGGGGACTTTCCACACCC-3' (SEQ ID NO: 200).
[0575] Para estabelecer linhagens celulares de expressão HAS2, as células cancerosas confluentes em 70% DU-145 e MDA MB 231 Luc, foram incubadas com uma proporção de 60:1 para 6:1 de retrovírus em DMEM (Mediatech) contendo 10% de FBS durante 72 horas. As culturas foram mantidas em meio seletivo contendo 200 ug/ml de G418. Células cancerígenas que expressam HAS2 estáveis foram geradas após 2 semanas de seleção de meio condicional de G418.
2. Quantificação de ácido hialurônico
[0576] Um ensaio com base de proteína de ligação a hialuronan (HABP) foi utilizado para determinar a quantidade de hialuronan produzido pelas células tumorais. Os ensaios baseados em HABP são preferíveis a métodos químicos, para a medição de HA como um biomarcador de microambiente tumoral (TME) porque a HABP preferencialmente detecta HA composto de, pelo menos, 15 (n- acetil glucose - ácido glucurônico) dissacarídeos, que são competentes para ligar proteínas de ligação ao HA (ver, por exemplo, Haserodt S, et al. (2011)Glycobiology 21: 175-183).
[0577] As células de tumor foram semeadas a células 1 x 10º em frascos de 75 cm?” e incubadas durante 24 horas. Os sobrenadantes de cultura de tecidos foram colhidos para a quantificação de AH utilizando um ensaio sandwich de HABP ligada a enzima (R & D Systems, Catalog No. DY3614), que utiliza aggrecan humano recombinante como uma captura de HA e reagente de detecção (domínios G1-IGD- G2 aggrecan humano recombinante, Val20-Gly676 de Adesão nº NP-037359 (SEQ ID NO: 202), com o 10-HIS tag C-terminal, R & D Systems, Nº de Catálogo 1220- PG). O ensaio para a detecção do HA foi realizado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as placas de ensaio foram revestidas com aggrecan humano recombinante, e as amostras (isto é, sobrenadantes de cultura de tecido) contendo HA foram adicionadas à placa (três repetições independentes de cada linhagem celular foram testadas). As placas foram lavadas e o HA ligado foi detectado usando aggrecan biotinilado humano recombinante. Após a remoção da sonda não ligada, estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) foi adicionada como um reagente de detecção secundário. Após lavagem da placa, a HRP ligada foi detectada por incubação com a solução de substrato 1:1 de H,0;)/Tetrametilbenzidina (R & D Systems) e quantificada por detecção de densidade óptica a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas SpectraMax M3 Multi-Mode (Molecular Devices, CA). A concentração de HA no meio de cultura para cada tipo de célula tumoral foi expressa como a concentração média de HA (ng/mL) em meio de cultura (Tabela 5).
3. Quantificação de HAS1, HAS2, HAS3, HYAL1 e Expressão de HYAL2 mRNA
[0578] O RNA foi extraído a partir de sedimentos celulares usando um RNeasy O Mini Kit (Qiagen GmbH) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA extraído foi então quantificado usando um espectrofotômetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). PCR quantitativo em tempo real (aRT-PCR) utilizando primers específicos para o gene foi usado para quantificar os níveis de mMRNA relativos a cada sintase hialuronan e hialuronidase. Primers qaRT-PCR foram adquiridos de Bio Applied Technologies Joint, Inc., (San Diego,
CA). As sequências de DNA para os primers utilizados nas reações de PCR individuais foram as seguintes: TABELA 4: Sequências dos primers utilizados para a análise de gRT-PCR de HAS e expressão gênica de HYAL nas 5 "-TACAACCAGAAGTTCCTGGG- | 5'-CTGGAGGTGTACTTGGTAGC-3'(SEQ ID o 3'(SEQ ID NO: 395) NO: 396) HAS2 S '=GTATCAGTTTGGTTTACAATC- S '" =GCACCATGTCATATTGTTGTC-3' (SEQ > 3'(SEQ ID NO: 397) ID NO: 398) HAS3 5 ' =CTTAAGGGTTGCTTGCTTGEGC- 5 '=GTTCGTGGGAGATGAAGGAA-3'(SEQ ID nao 3'(SEQ ID NO: 399) NO: 400) UYALL S'-GTGCTGCCCTATGTCCAGAT- | 5'-ATTTTCCCAGCTCACCCAGA-3' (SEQ ID ” 3'(SEQ ID NO: 401) NO: 402) HYAL?2 5'- TCTACCATTGGCGAGAGTG- | 5'-GCAGCCGTGTCAGGTAAT-3'(SEQ ID 3'(SEQ ID NO: 403) NO: 404) GAPDH 5 "-TGCACCACCAACTGCTTAGC- 5 ' -GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3' (SEQ o 3'(SEQ ID NO: 405) ID NO: 406)
[0579] Para as reações de PCR, as amostras foram misturadas com uma mistura de iQ SYBR Green master (Bio-Rad) e os pares de iniciadores designados para cada gene. As reações de PCR foram realizadas em um dispositivo Bio-Rad Chromo 4 qPCR. A síntese da primeira cadeia foi efetuada sob as seguintes condições: 42ºC durante 2 minutos para a reação de eliminação do DNA, 42ºC durante minutos para transcrição reversa, e 3 minutos a 95ºC durante a inativação de transcriptase reversa. Para a amplificação, 3 minutos de desnaturação inicial a 95ºC, foram utilizados 45 ciclos de 15 segundos de desnaturação e extensão de annealing 1 minuto a 58ºC. O valor de CT de expressão do gene a partir de cada amostra foi calculado através da normalização com o gene GAPDH de manutenção interna e os valores relativos foram traçados. A Tabela 5 lista os valores de CT para cada tipo de células de tumor para cada um dos genes do ensaio.
4. Ensaio para a formação da matriz pericelular
[0580] Culturas de monocamada das dez linhagens de células foram cultivadas e testadas para a formação da matriz pericelular facilitada por aggrecan. Para visualizar as matrizes pericelulares de HA mediadas por agracano in vitro, ensaios de exclusão de partículas foram utilizados como anteriormente descrito em Thompson C B, et al. (2010) Mol Cancer Ther 9: 3052-3064, com algumas modificações. Resumidamente, as células foram semeadas a 1 x 105 de células por poço em uma placa de seis poços, durante 24 horas, e depois tratadas com meios de células de cultura sozinhos ou meios contendo 1000 U/ml de rHuPH20 a 37ºC durante 1 hora. O pré- tratamento com rHuPH20 inibe a formação da matriz pericelular; assim, foi utilizado como um controle negativo para a formação da matriz pericelular, para cada tipo de célula. As células foram então incubadas com 0,5 mg/ml de aggrecan bovino (Sigma-Aldrich), a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente, os meios foram removidos e substituídos com 10º/ml de suspensão de 2% de glóbulos vermelhos de camundonfo fixados com glutaraldeído (RBC) isolado de camundongos Balb/c (Taconic, Hudson, NY), em PBS, pH 7,4. As partículas foram deixadas em repouso por 15 minutos. As culturas foram então fotografadas com um microscópio de contraste de fase, acoplado com um scanner de câmara e um programa de imagem (Diagnostic Instruments). A área de exclusão de partículas e a área de células foram medidas usando o programa SPOT Advance (Diagnostic Instruments, Inc., Sterling Heights, MI). A área da matriz pericelular foi calculada como a área da matriz menos a área celular, e expressa como um? (Tabela 5).
5. Resultados: comparação do teor de HA na célula tumoral e Expressão de HAS e HYAL para Formação de Matrix Pericelular
[0581] A concentração de HA em meio condicionado, tal como determinado pelo ensaio de detecção baseado em HABP correlacionou-se com a área da matriz pericelular mediada por aggrecan formada por células tumorais em cultura de monocamada (Tabela 5, P < 0,0029). Além disso, as linhagens celulares que foram modificadas para expressarem a sintase 2 de hialuronan (HAS2), DU- 145/HAS2 e MDA-MB-231/HAS2, mostraram aumento da produção de HA, e aumento da formação de matriz pericelular in vitro, em comparação com as respectivas linhagens celulares parentais. Em contraste, não foi encontrada correlação entre a formação de matriz pericelular e níveis relativos de expressão de mRNA HAS1, 2 ou 3, ou Hyal 1 ou 2. Estes resultados indicam que a medida direta de HA associado à célula tumoral prevê especificamente um preditor para a formação da matriz pericelular. TABELA 5. Quantificação da produção de HA, formação de matriz pericelular, expressão de HAS e Hyal em linhagens de células tumorais PME HA em MRNA? isoforma HAS mMRNA” isoforma Linhagens cv Hialuronidase celulares HAS1 HAS2 HAS3 Hyall Hyal2 do tumor MDA-MB- -
088.55 | 372.2 2.48 .90 . . .53 í Coeficiente de correlação 0.0029 0.23 |0.34 0.71 | 0.66 0.36 (valor p) de Spearman NE: não avaliada "Área de matriz Pericelular (pm3) avaliada através do ensaio de exclusão de partículas. *Concentração de HA média (ng/ml) em meio de cultura (n = 3, culturas independentes). ?º* Expressões de Sintase de Hialuronan (HAS) e hialuronidase (Hyal) tal como determinado por RT-PCR em tempo real. Os valores Ct foram normalizados por GAPDH mRNA e as diferenças de dobra são relativas à expressão de BxPC3. Exemplo 6
Medição da concentração de Ácido hialurônico em células tumorais e Relação com a Atividade Anti-tumoral de PEGPH20
[0582] Neste exemplo, a concentração de hialuronan em diferentes linhagens de células de tumor foi avaliada por análise de imuno-histoquímica e comparada com a capacidade de PEGPH20 para inibir o crescimento tumoral de tumores de xenoenxerto gerados a partir das linhagens de células tumorais, e crescimento de colônias de tumor de linhagem de células de tumor rico em HA.
A. Comparação do teor deHA com Eficácia de PEGPH20 em Vários modelos de tumor de Xenoenxerto
1. Modelos de tumor de Xenoenxerto
[0583] Quatorze tumores de xenoenxerto derivado da linhagem de células de tumor foram gerados a partir das seguintes linhagens de células de tumor: carcinoma da próstata humana DU- 145 (ATCC HTB - 81 simulada transfectada com plasmídeo vazio pLXRN, ver Exemplo 5.A.1), DU-l145 HAS2 (ver Exemplo 5.A.1), adenocarcinoma do mama humana MDA MB 231 (ATCC HTB-26), MDA-MB-231 NY Luc (D3H2IN, Caliper Life Sciences), MDA MB 231 Luc/HAS2 (ver “Exemplo
5.A.1) , carcinoma do ovário humano SKOV3 (ATCC HTB- 77), adenocarcinoma pancreático humano AsPc-l1 (ATCC CRL -1682), carcinoma pancreático humano MIA PaCa 2 (ATCC CRL -1420), tumor de mama de rato 4T1 (ATCC CRL- 2539), adenocarcinoma pancreático humano BxPC -3 (ATCC CRL -1687), carcinoma maligno de próstata de camundongo Mat- lylu (ATCC JHU -92) e adenocarcinoma de próstata humano PC-3 (ATCC CRL -1435). Linhagens de células de tumores foram mantidas como descrito no Exemplo 5. Explantes de tumores humanos LUM 697 e LUM 330 foram obtidos a partir da Crown Bioscience, Beijing, China.
[0584] Ratos sem pelo atímicos (Taconic) nu/nu (NCR)ou Balb/c (Harlan) ou Balb/c com seis a oito semanas de idade (Xangai Laboratory Animal Center, CAS (SLACCAS), ver Exemplo 7) foram alojados em micro-isoladores, em uma sala de ambiente controlado em um ciclo de 12 horas luz/ 12 horas de escuro, e receberam comida estéril e água ad libitun. Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com protocolos IACUC aprovados.
[0585] Para a geração de tumores, os camundongos foram inoculados com células tumorais peritibiais (injeção intramuscular adjacente ao periósteo da tíbia direita), por via subcutânea (s.c., da perna traseira direita), ou na almofada de gordura mamaria de acordo com a Tabela 6, abaixo.
Tabela 6 Modelos de tumor Animal Modelos Tipo de Fonte Local de Número de Tumor Camundongo Animal inoculação células (Fonte) . Taconic 5x Dul45 Mock | Ca. Próstata (H) femea Peritibial 10º/0.05 mL - Taconic 1x 1x1 MDA MB 231 |ca. Mama (H) Ner nu/nu; Peritibial |mmºao cubo fêmea de tecido SKOV e 11: Ncr nu/nu; Taconic - x 10//0.1 MDA MB ' Ner nu/nu; Taconi VI 1 x 107/0.1 fêmea Poritábiar |m DA ME 231 "- . Taconic 1 x 107/0.1 MDA MB 23 Ca. Mama (H) Ner nu/nus Peritibial |mL Luc/HAS2 êmea AsPc-l Ca. Pancreático Ner nu/nu; Taconic : * 10/0.1 nem (4) fêmea oe mb A Paca o | Ca. Pancreático Ner nu/nu; Taconic "= 1 x 107/0.1 Harlan Almofada de | 5:0 * 10º 471 Ca. Mama (M) BALB/c; fêmea gordura células/0.0 mamária 5 mb c3 Ca. Pancreático Ner nu/nu; Taconi: "e 1 x 10/0.1 BxPC3 mm) fêmea s.c. nt Taconic 2.0 x 10 MatLylu Ca. Próstata (R) er nu/nos Peritibial | células/0.0 macho 4 mo : Taconic Tx PC3 Ca. Próstata (Hm) | “EF DU/nwi FPeritibial | 10 /0.05 ml macho 2 AS - Ss... Ner nu/nu; Taconic cricibial 5 SLACCAS 3x 3x3 LUM858 Ca. Pulmão (H) BALB/c nud s. mm? cube SLACCAS 3x 3x3 LUM 697 Ca. Pulmão (H) BALB/c nude s.c mm? cube SLACCAS 3 x 3x3 LUM 330 Ca. Pulmão (H) BALB/c nude S.c Tm? cube
[0586] Para tumores peritibiais, os volumes dos tumores foram determinados usando ultrassom VisualSonics Vevo 770 de alta resolução. Para os tumores subcutâneos e almofada de gordura mamária, os volumes dos tumores foram calculados por medição de calibre do comprimento (L) e a largura (W) das massas tumorais sólidas. O volume do tumor (TV) foi calculado como: (L x w) /2. Os animais foram selecionados para tratamento com PEGPH20 quando os volumes tumorais alcançaram - 400-500 mm. Os animais foram randomizados em grupos de tratamento e controle (n 2 6 ratos/grupo).
[0587] O tratamento com PEGPH20 e análise da inibição do crescimento tumoral (TGI) foram realizados como descrito (Thompson et al.). Os camundongos foram tratados com veículo (histidina 10 mM, pH 6,5, 130 mM de NaCl) ou PEGPH20 durante 2-3 semanas, de acordo com o esquema indicado na Tabela 7. Os volumes dos tumores foram medidos duas vezes por semana. Quando o tamanho do tumor excedeu 2,000 mr, os animais foram retirados do estudo e humanamente eutanasiados. PEGPH20 PEGPH20 Modelos dose Quant. por | Freq.de No . de GT Nº de (mg/kg) 0.1mL | dosagem Doses (dia x) | animais dose (i.v.) duas 0,7% Dul45 Mock 15 10,000 U vezes 6 (das) 8 p/semana duas MDA MB 231 4.5 3,000 U vezes 6 0% (dl7) 5 p/semana duas MDA MB - o veres D/ 23% o o : semana MDA duas a3: MB 23 4.5 -3,000 U | vezes p/ 5 a 10 Luc/HAS2 semana (o ; ' 6 duas 18% , AsPc- 4.5 73,000 U | vezes p 4 (11) 9 semana duas 248 MIA PaCa 2 4.5 -3,000 U | vezes p (915) 9 semana duas 61º 4T1 9 - oU vezes p/ 21º 5 4T1 3.9 3,000 U | vezes p 6 (dia) 5 semana duas 155 BxPC3 5 - oU vezes p/ De 7 BxPC3 4.5 3,000 U zes p 4 (das) semana
Fa TO IE Ts E EE Ss duas 65º PC3 15 -10,000 U | vezes p/ 6 (318) 6 semana = duas 0 DU145 HAS2 15 -10,000 U | vezes p/ 6 (d18) semana o LUMBS58 (ver 1.5 2,000 U aos - 16% o Ex.7) 4.5 Tô, oU vezes P/ > (d14) 10 semana duas LUM 697 (ve - , 97% semana - 2 . duas 14º mo oe 4.5 -3,000 U vezes 5 (dão) 10 == p/semana &
[0588] A TGI para cada modelo de tumor foi calculada com base no volume do dia final do estudo, como indicado na Tabela 7. A percentagem de Inibição do Crescimento do Tumor (TGI) para cada modelo de tumor respectivo foi calculada utilizando a seguinte equação: STGI=[1- (Th-To) = (Cn-Co) ] x100% onde "Tn" é o volume médio do tumor para o grupo de tratamento (os animais que receberam rHuPH20 PEGuilado) no dia "n", após a última dose de rHuPH20 PEGuilado; "T,W" é o volume médio do tumor, do grupo de tratamento no dia O, antes do tratamento; "Cr," é o volume médio do tumor para o grupo de controle correspondente ao dia "n"; e "Cy" é o volume médio do tumor no grupo de controle no dia 0, antes do tratamento. A análise estatística dos volumes tumorais entre os grupos de controle e de tratamento foi realizada por meio de um teste ANOVA de uma via com valor P de P < 0,05 definido como estatisticamente significativo.
2. Coloração Histoquímica de HA no tecido tumoral e Semi- quantificação do teor de HA
[0589] Ao término do estudo de inibição do crescimento do tumor, cada um dos tumores de quatorze xenoenxerto gerados foram analisados quanto ao teor de HA por histoquímica, usando proteína ligada ao ácido hialurônico biotinilado (B- HABP) como uma sonda para a detecção e quantificação digital de HA.
[0590] os tecidos tumorais foram colhidos, fixados em solução de 10% de formalina neutra tamponada (NBF), embebidos em parafina e cortados em seções de 5 mM. Para a análise histoquímica, os cortes foram desparafinados e reidratados. Peroxidases endógenas foram bloqueadas com uma solução de peróxido- bloco (Invitrogen, CA, EUA) durante 2 minutos. Coloração não específica foi bloqueada usando 2% de BSA em 2% de soro de cabra normal PBS durante 1 hora à temperatura ambiente (RT) antes da incubação com 2,5 pg/ml de proteína biotinilada ligada ao HA (B-HABP, Catálogo No. 400763, Seikagaku, Tóquio, Japão) durante 1 hora a 37ºC., para confirmar a especificidade da coloração, um subconjunto de seções foi pré-tratado com rHuPH20 (1000 U/mL) em tampão PIPES (PIPES a 25 mM, NaCl a 70 mM, BSA a 0,1%, pH 5,5) a 37ºC durante 1 h antes da adição de B-HABP. Após lavagem para remover o reagente primário, as amostras foram incubadas com uma solução de peroxidase estreptavidina-rábano (BD Pharmingen, Catálogo No. 550946) durante 30 minutos à TA e detectadas com 3, 3'- diaminobenzidina (DAB; Dako, No. Catálogo K3467). Os cortes foram então contrastados em hematoxilina de Gill (Vector Labs, Catalog No. H-3401), desidratados e montados em meio Cytoseal 60 (American Mastertech).
[0591] Um Aperio T2 ScanScope (Aperio) foi usado para gerar imagens de alta resolução dos cortes de tecido. As imagens foram analisadas quantitativamente com software Aperio Spectrum, usando um contador de algoritmo de contagem de pixels de cor marrom (HA). O núcleo do tecido nas seções com menos de 10% das células tumorais ou mais de 50% de tecido necrosado foi excluído da avaliação. Os tecidos de tumor de xenoenxerto PC3 (HA”*) foram utilizados como um controle positivo. Uma proporção da área colorida positiva forte (marrom) para a soma da área total colorida foi calculada e teve como score +3, +2, +1 ou 0, quando a proporção foi de mais de 25%, 10-25%, menos do que 10, ou O, respectivamente.
[0592] O coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para avaliar a relação entre a expressão de HA e a resposta ao tratamento de PEGPH20
3. Resultados: Comparação do teor de HA no tumor e inibição do crescimento do tumor após o tratamento com PEGPH20
[0593] Os resultados apresentados na Tabela 8, comparam o nível medido de HA em seções de tecidos retiradas do tumor de xenoenxerto, e a percentagem de inibição do crescimento do tumor (TGI) por PEGPH20. Os resultados são a partir de tumores tratados com, pelo menos, 1 mg/kg de PEGPH20. As doses superiores a 1 mg/kg não aumentaram a inibição do crescimento tumoral. Nos modelos animais PC-3 (HA*?) e BxPC3 (HA?) não foi observado aumento significativo na eficácia com doses maiores do que pg/kg e 100 pg/kg, respectivamente.
[0594] Apesar da diversidade de tipos de células tumorais (de origem humana, murina e de rato), houve uma correlação significativa (P <0,001, de Spearman r = 8, n = 14) entre o aumento na intensidade da coloração de HA mediada por B-HABP e na atividade anti-tumoral in vivo de PEGPH20 (Tabela 8) TABELA 8: Intensidade da coloração de HA no tumor e inibição do crescimento mediada por PEGPH20 correspondente Modelos Tipo de Tumor Pixels positivos TGI (fonte) De HA (%) (%) [DU145S Mock ——Jca, Próstata (AU [MAB 23 [ca mama Do [no PA
= = HiHumano ;M: Camundongo; R: Rato B. Comparação do teor de HA com Eficácia de PEGPH20 em um modelo de tumor Xenoenxerto de superexpressão de HAS2
[0595] O efeito de aumento da produção de HA, em uma célula de tumor, no aumento da sensibilidade de tumores ao tratamento com PEGPH20, foi ainda analisado em xenoenxertos tumorais que expressam sintase 2 de hialuronan exógeno (HAS). Como mostrado no Exemplo 5, a produção de HA pela linhagem de células de tumor DU-l45 poderia ser aumentada por transdução das células com um gene que codifica HAS2, o que levou a um aumento da formação da matriz pericelular in vitro. Além disso, DUl42-HAS2 mostrou aumento da coloração de HA e aumento da inibição do tumor por PEGPH20, nos modelos de xenoenxerto anteriormente descritos. Neste exemplo, a eficácia do tratamento com PEGPG20 ao longo do tempo foi comparada no xenoenxerto DU- 145 contra DU-145-HAS2.
[0596] Os modelos de xenoenxerto de rato foram preparados como descrito acima no Exemplo 6A. Resumidamente, os camundongos foram inoculados tanto com os controles DU-l45/vetor, como com as células DU-145/HAS2, conforme indicado na Tabela 6. Quando os tumores alcançaram aproximadamente 500 mm” em tamanho, os camundongos foram divididos em grupos de tratamento (n = 8) e tratados só com veículo ou PEGPH20. Para o tratamento de PEGPH20, os camundongos foram injetados através da veia da cauda a uma dose de 4,5 mg/kg, duas vezes por semana, durante 3 semanas. O volume do tumor foi monitorado por medição de compasso de calibre, tal como descrito acima. Os tumores de xenoenxerto foram analisados quanto ao teor de HA por histoquímica usando proteína ligada ao ácido hialurônico biotinilado (B-HABP), conforme descrito acima, 24 horas após o último tratamento com PEGPH20.
[0597] O xenoenxerto de tumor de próstata DU-145 com superexpressão de HAS2 cresceu de forma mais agressiva em camundongos sem pelo, do que a linhagem celular parental transfectada com vetor vazio (DU-l45 Mock), semelhante aos relatos anteriores (Tabela 7) (Thompson et al. (2010)). PEGPH20 inibiu o crescimento do tumor em tumores DU-145- HAS2 (TGI = 50%, P < 0,001, n = 8), mas não em tumores de controle do vetor DU-l45 (TGI = 0,7%, P < 0,05, n = 8). Além disso, a coloração histoquímica com B-HABP de tumores tratados com PEGPH20 mostrou uma remoção de HA em amostras de tumor, em comparação com tumores de controle. Estes dados sugerem que a acumulação de HA em ECM facilita o desenvolvimento do tumor, e esse aumento do acúmulo de HA associado a tumor, está relacionado com a atividade anti- tumoral de PEGPH20.
C. Efeitos relacionados à dose do tratamento de PEGPH20 em tumores ricos em Ácido hialurônico
[0598] Nesta experiência, o efeito dose- dependente de PEGPH20 na inibição do crescimento do tumor, de tumores ricos em HA, foi examinado. Modelos de xenoenxerto de rato foram preparados como descrito acima no Exemplo 6A. Resumidamente, os camundongos foram inoculados com adenocarcinoma pancreático humano BxPC-3 (ATCC CRL - 1687) ou com adenocarcinoma da próstata humano PC-3 (ATCC CRL-1435) de acordo com a Tabela 6. Quando os tumores alcançaram aproximadamente 500 mm? em tamanho, os camundongos foram divididos em grupos de tratamento (n = 10) e tratados com veículo sozinho ou PEGPH20. Para o tratamento PEGPH20, os camundongos foram injetados sistemicamente na veia da cauda a uma dose de 0,01, 0,1, 1, 4,5 e 15 mg/kg (350, 3500, 35000, 157500 e 500000 L/kg, respectivamente) duas vezes por semana, durante 2 semanas. O volume do tumor foi monitorado por medição de compasso de calibre, tal como descrito acima.
[0599] Observou-se que a dose máxima eficaz de PEGPH20 está abaixo de 1 mg/kg. Inibição significativa do tumor foi observada em todas as doses de PEGPH20 no modelo PC-3 de xenoenxerto (P < 0,001 para 0,1, 1, 4,5, 15 mg/kg dose, P < 0,01 para 0,01 mg/kg, em comparação com oO veículo) e para todas as doses superiores a 0,01, no modelo de xenoenxerto BxPC-3 (P < 0,001 para 0,1, 1, 4,5, 15 mg/kg doses de comparação com o veículo). Não foi observado aumento significativo na eficácia com doses maiores do que 0,01 pg/kg (PC3, HA?) ou 0,1 pg/kg (BxPC3, HA”).
D. Efeito de rHuPH20 PEGuilado sobre o crescimento da colônia de Células Tumorais ricas de hialuronan in Vitro
[0600] Para determinar se PEGPH20 pode inibir o crescimento e proliferação independente de ancoragem de células ricas em hialuronan prostáticas tumorais (PC3) in vitro, um ensaio clonogênico tridimensional foi realizado sobre as células. As células PC3, a aproximadamente 80% de confluência, foram tripsinizadas, recolhidas, e lavadas uma vez em meio completo. Densidade celular foi ajustada para células 8 x células 10/mL e suspensa em MatrigelO (BD Biosciences, San Jose, CA) em gelo. 0,025 ml desta mistura de células/Matrigel O foram semeadas em uma placa de cultura de 48 poços de células que havia sido pré- revestida com MatrigelO em 0,1 ml por poço, e solidificada a 37ºC durante 1 hora. Para a exposição contínua, durante 17 dias, para controlar o tampão de API e várias concentrações de PEGPH20, 0,6 mL/poço de tampão API contendo meio completo, 1, 3, 10 e 100 U/mL de PEGPH20 foram adicionados ao topo do poço apropriado. Os poços foram incubados a 37ºC, em uma atmosfera umidificada com 5% de CO, no ar, durante 17 dias, meio de tratamento fresco, incluindo a concentração adequada da enzima, quando apropriado, foi substituído a cada 34 dias durante o período de 17 dias.
[0601] No dia 17, o crescimento das colônias foi avaliado por captação de imagens com um microscópio invertido Nikon Eclipse TE2000U acoplado a uma câmara digital Insight FireWire (Diagnostic Instruments, Michigan). O número de colônias e diâmetro de cada colônia em uM foi medido utilizando o software ImageJ (software open source, um programa publicamente disponível para visualização e análise de imagens, para o cálculo do valor da área e de pixels) e função de calibração acoplada (os volumes de colônia foram calculados utilizando diâmetro de colônias e utilizando a fórmula: 4/3 nrº.
[0602] O volume médio de colônias de poços para cada condição foi determinado e os efeitos de PEGPH20 em volume de colônia avaliado comparando o volume médio de colônias no tampão da amostra de controle (API (ingrediente farmacêutico ativo) (Hepes a 10 mM e NaCl a 130 mM, pH 7,0), sem enzima) para as amostras que foram incubadas na presença de rHuPH20 PEGuilado. Relações inibitórias foram calculadas utilizando a fórmula: (Volume médio de controle-volume médio de tratados) / (volume médio de controle) * 100.
[0603] rHuPH20 PEGuilada induziu uma inibição dependente da dose do crescimento, evidenciada pelo volume de colônias mais baixo em comparação com o controle. Com base em proporções de inibição calculadas de acordo com a fórmula acima, as culturas foram incubadas na presença de
PEGPH20 a 1, 3, 10, e 100 U/ml apresentaram uma redução média do volume de colônias de 39%, 67%, 73%, e 75%, respectivamente (p < 0,01 para as amostras de 3 U e 10 U: p < 0,001 para as amostras de 100 Ur, n = 6), em comparação com as culturas incubadas com tampão de controle. As diferenças estatísticas foram analisadas utilizando o teste Mann-Whitney.
[0604] O ICs, de PEGPH20 na redução do volume de colônias, determinada utilizando o programa Graphpad PrismO 4 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA), foi de aproximadamente 1,67 U/mL. O número médio de colônias foi de 10,17 t+ 1,56 por poço em culturas (de controle) tratadas com veículo, e 11,50 + 0,89 por poço nas culturas tratadas com 100 U/mL de PEGPH20. A diferença no número de colônias não foi significativa entre o controle e as culturas de 100 U/mML (n=6, p> 0,05). Estes resultados indicam que PEGPH20 pode inibir a proliferação e/ou a sobrevivência de células cancerosas ricas em hialuronan.
[0605] Em uma experiência independente, as células PC3 foram semeadas na membrana basal reconstituída (matrigel) como descrito acima, e continuamente expostas ao veículo ou 0,1, 1, 10, 100, e 1000 U/ml de PEGPH20 durante 19 dias. As imagens foram então capturadas digitalmente, e o volume de colônia foi avaliado utilizando o programa ImageJ. A inibição do volume de colônia em comparação com o controle foi de 22, 45, 63, 73 e 74%, respectivamente, (P < 0,01 para 1 U/ml, P < 0,001 para 10 U/ml e acima em relação ao veículo, n = 3).
Exemplo 7 Avaliação de HA como um biomarcador para prever a resposta de tumores NSCLC humanos para PEGPH20 A. Expressão de HA em biópsias de pacientes NSCLC
[0606] Trabalhos anteriores mostraram que O acúmulo elevado de HA ocorre no câncer de pulmão de células não-pequenas (CPNPC) (Hernández JIJ R, et al. (1995) Int 3 Biol Markers 10: 149-155 e Pirinen R, et al. (2001) Int 3 Cancer 95: 12-17). Em contraste, linhagens celulares de derivadas de NSCLC exibem níveis baixos, sugerindo que as linhagens de células NSCLC perdem a expressão de HA durante passagem in vitro. Assim, a expressão de HA em biópsias de tumores primários foi examinada.
[0607] Um painel de microarranjo de tecidos (TMA) de 190 biópsias de NSCLC (EUA Biomax, Inc.) foi examinado para histotipo e acumulação de HA. O Teor de HA foi determinado por coloração histoquímica de B - HABP, como descrito no Exemplo 6. Amostras foram pontuadas como 3, 2, 1 ou O, quando a proporção da área da coloração forte positiva (marrom) para a soma do total de área colorida foi mais de 25%, 10-25%, inferior a 10% ou O, respectivamente. Neste painel, os tipos de células de adenocarcinoma (ADC) carcinoma espinocelular (SCC), e carcinoma de grandes células (LCC) foram observados sob frequências de 32%, 51% e 3%, respectivamente, classificados com base no diagnóstico de patologia fornecido por US Biomax (Tabela 9). Outros subtipos não identificados correspondem a cerca de 11% das 190 amostras examinadas.
[0608] A análise da acumulação de HA associada a um tumor mostrou que todos os histotipos possuem subconjuntos de células que expressam o fenótipo HA com HA elevado HA”, com uma taxa global de cerca de 27% (Tabela 9). Em particular, 40% dos casos de SCC que exibiram o fenótipo HA”, enquanto que 11% do casos de ADC e 33% dos casos de LCC, foram pontuados como HA'*. 34% dos casos de SCC exibiram o fenótipo HA “, enquanto que 48% dos casos de ADC e 50% dos casos de LCC foram pontuados como HA ”P.
25% dos casos de SCC exibiram o fenótipo HA “, enquanto que 36% dos casos de ADC e 17% dos casos de LCC foram pontuados como HA *?*, Nesta base de dados, nenhuma das amostras de tecido de pulmão normais expressaram o fenótipo HA “*, embora HA detectável tenha sido observado na maioria das amostras de tecido de pulmão normal. Tabela 9. Distribuição de expressão de HA em amostras de câncer de pulmão humano score' HA oo pe pe fe pe Je | THA scores foram definidos com base na% de intensidade positiva de coloração para HA ?ADC: Adenocarcinoma ºSCC: Carcinoma de células escamosas ºLCC: Carcinoma de células grande B. Expressão de HA em explantes de pacientes NSCLC e Previsão da eficácia de PEGPH20
[0609] A fim de testar prospectivamente a relação entre sobre-expressão de HA e a resposta antitumoral de NSCLC de depleção de HA mediado por PEGPH20, explantes de tumores de pacientes NSCLC humanos que apresentam diferentes graus de acumulação de HA foram selecionados e avaliados quanto à capacidade de resposta ao tratamento com PEGPH20 em um modelo de tumor de xenoenxerto. Explantes primários caracterizados por acúmulo de HA foram usados para este estudo, pois os modelos de explantes contêm uma amostragem mais representativa da diversidade genética dos tumores intactos, e devem manter os aspectos do estroma tumoral nativo.
[0610] Biópsias de tumores foram obtidas a partir de dezesseis pacientes com NSCLC, e mantiveram-se a um baixo número de passagens por via subcutânea em camundongos sem pelo (Crown Bioscience, Beijing, China). Os explantes de tumores de NSCLC foram rastreados para a acumulação de HA em tecidos de explante a partir de passagens 1-4, e foram atribuídos a um fenótipo de HA (isto é, 1, 2 ou 3) por coloração histoquímica de B-HABP, como descrito acima. Três explantes de células escamosas (SCC) foram selecionados prospectivamente para o transplante de xenoenxerto, representando os fenótipos HA*? (LUM697), HA*? (LUM330) e HA” (LUMBS8).
[0611] Quando os tumores semeados para os explantes de tumores selecionados atingiram 500-700 mm3 de tamanho, os camundongos foram sacrificados, e os tumores foram extraídos e picados em fragmentos 3x3x3 mm. Um fragmento de cada tumor foi implantado por via subcutânea no flanco direito traseiro de uma fêmea de camundongo sem pelo Balb/c (n = 10 para cada grupo), tal como indicado na Tabela 6. Volumes dos tumores foram determinados por medições calibradas do maior diâmetro longitudinal (comprimento (L)) e o maior diâmetro transversal (largura (W)) e estimados através do cálculo de (L x W)/2. Quando o tamanho médio do tumor atingiu 500 mm? (intervalo de 300- 600 mm?) , os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Para terapia, os animais foram tratados com veículo ou PEGPH20 em 4,5 mg/kg, duas vezes por semana durante cinco doses, como mostrado na Tabela 7, acima. A porcentagem de inibição do crescimento do tumor (TGI%) e a análise estatística foram realizadas como descrito no Exemplo 6.
[0612] O ranking de ordem de fenótipo HA (isto é, 1, 2 ou 3), tal como determinado por histoquímica foi encontrada para prever o grau de inibição do crescimento do tumor por PEGPH20 (Tabela 9). Por exemplo, a inibição percentual de crescimento foi de 97% para LUM697 (HA), 44% para LUM330(HA+2), e 16% para LUM858 (HA+l). Além disso, a regressão do tumor foi observada no grupo de explante de tumor LUM697 (HA), mas não nos grupos LUM330 (HA?) e LUM858 (HA): 4 de 10 animais com tumores LUM697 (HA) tiveram diminuição da carga do tumor, em comparação com a pré-terapia.
Exemplo 8 Efeito do tratamento na síntese de DNA de células de tumor de Xenoenxerto e o microambiente do tumor (TME) A. Efeito do Esgotamento de HA na síntese de DNA de Células de tumor
[0613] Para testar se o esgotamento de HA tem efeitos antiproliferativos em células tumorais in vivo, xenoenxertos tumorais PC-3 (HA +3) tratados com PEGPH20 foram examinados para os níveis de síntese de DNA.
[0614] Camundongos sem pelo atímicos nu/nu (NCR) de seis a oito semanas de idade foram intraperitibialmente implantados com células de tumor PC-3 de, tal como descrito no Exemplo 6 (células 1 x 10º em 0,05 ml por camundongo). O volume do tumor foi monitorado por medição de compasso de calibre. Quando os tumores atingiram + 400 mmº, os camundongos foram tratados com veículo ou PEGPH20 (1 mg/kg (35,000 U/kg) ou 4,5 mg/kg (157,500 U/kg); cerca de 700 U/dose ou 3150 U/dose baseado em 20 g de peso corporal do rato, a 100 pl, através de injeção na veia da cauda, duas vezes por semana, durante duas semanas. As 24 horas antes do fim do estudo, os camundongos foram administrados 10 mg/kg de BrdU (0,2 mL) (Invitrogen, Cat. t 00-0103) por via intraperitoneal. os tumores foram excisados dos camundongos, fixados em 10% de formalina tamponada e embebidos em parafina. Os tecidos foram cortados em seções de 5 mM, e a proliferação das células foi avaliada após coloração com um anticorpo anti-BrdU (BrdU Staining Kit; Invitrogen, Cati$93-3943) de acordo com as instruções do fabricante.
[0615] Os animais tratados com PEGPH20 foram comparados com os animais tratados com veículo. Uma redução de 58,3% em núcleos sinteticamente ativos foi observada nos tumores tratados com PEGPH20, em comparação com os tumores tratados com o veículo (a porcentagem de núcleo positivo BrdU foi reduzida de 4,8% a 2%). Este resultado assemelha a inibição de xenoenxertos observada de crescimento da próstata PC3 (HA!) ou BxPC3 pancreático (HA *) como um resultado de tratamento com PEGPH20 (- 50% TGI em doses de 1 mg por kg ou mais) (ver Exemplo 6).
B. Efeito do Esgotamento de HA na Expressão de Proteínas Associadas a microambiente tumorais
[0616] Estudos anteriores demonstraram que O tratamento de tumores HA” com PEGPH20 tem um efeito dramático sobre a pressão do fluido intersticial do tumor (IFP), e, por conseguinte, o diferencial de pressão de fluido entre o tumor e o ambiente externo (ver Thompson et al. (2010)). As mudanças físicas no TME podem ter uma expressão gênica de impacto (Shieh AC (2011) Ann Biomed Eng 39:1379-1389). A fim de testar se a remoção de HA tem um impacto sobre o volume ou a expressão de proteínas TME, tais como o colágeno murino I (Collal), colágeno murino VíCol5al), e tenascina C (TNC), que são encontrados na remodelação da matriz ativa, foram examinados.
1. Localização e Semi-quantificação de colágeno em tecido de tumor
[0617] Os tecidos tumorais com a pele adjacente de tumores PC-3 gerados no Exemplo 8A foram fixados em 10% de formalina tamponada neutra, durante 48 horas, processadas usando um processador de tecido (Tissue-TEKVIP,
Sakura Finetek, CA) e embebido em bloco de parafina. As amostras de tecido embebidas em parafina foram cortadas em seções de 5 um, desparafinadas e reidratadas em água deionizada. A recuperação de antígenos foi processada por lâminas de aquecimento em tampão de EDTA, a pH 8,0, 100ºC durante 25 min. As lâminas foram lavadas em PBS-T, bloqueadas com 2% de soro de cabra normal a 2% em PBS/BSA durante 30 min., seguido por incubação com anticorpos anti- colágeno tipo 1 policlonais de coelho (1:200, Abcam, Cat + ab34710) para 2 horas à temperatura ambiente. As seções foram então incubadas em IgG de cabra anti-coelho marcada com vermelho Texas(1:200, Vector Laboratories, Cat. + F1 - 1000) durante 1 hora à temperatura ambiente, e contra- coloridas e montadas com reagente antifade ProlongarO Gold com DAPI (Invitrogen, CA). Micrografias foram capturadas em um microscópio Zeiss Axioskop acoplado a uma câmera RT3 (Diagnostic Instruments, MI). 5 campos aleatórios de cada seção foram analisados para a intensidade de colágeno positivo usando o programa Image-Pro plus.
2. Análise de aranjos de CDNA da expressão gênica em tecido de tumor Xenoenxerto PC3
[0618] Camundongos NCR nu/nu portadores de tumores PC3 foram produzidos e tratados com veículo ou PEGPH20 como descrito no Exemplo 6A. Os animais foram sacrificados 8 e 48 horas após o tratamento com veículo ou PEGPH20. Os tecidos tumorais foram excisados em condições estéreis e rapidamente congelados em nitrogênio líquido. O RNA total foi isolado a partir de tecido congelado, de acordo com os procedimentos habituais de funcionamento de Asuragen. A pureza e a quantidade das amostras de RNA total foram determinadas por leituras de absorbância a 260 e 280 nm, utilizando um espectrofotômetro de UV NanoDrop ND-1000. A integridade do RNA total foi qualificada pela eletroforese microfluídica Agilent Bioanalyzer 2100. As amostras para estudos de perfil de mRNA foram processadas por Asuragen, Inc. utilizando Arranjos Affymetrix Mouse 430
2.0 e Human U133 Plus 2.0.
3. Resultados
[0619] Redução específica de Collal nos tumores PC-3 foi observada após a depleção de HA por tratamento com PEGPH20. Redução de 80% em comparação com a coloração Collal para tumores tratados com veículo foi observada (P < 0,05 teste t). A coloração Collal em pele de camundongos tratados com PEGPH20, no entanto, manteve-se estável. Além disso, a diminuição dos níveis de mRNAs murinos (estromais) para Collal, Col5al, e TNC foram observados como medido por análise de arranjo de expressão de mRNA. TNC ARNM foi influenciado de forma mais significativa (66% de redução) seguido por Collal (53% de redução) e Col5al (45% de redução). Estes resultados sugerem que a depleção de HA resultada em mudanças significativas na expressão de proteínas dentro do TME.
Exemplo 9 Produção de Proteína de Fusão IgG Fc do Módulo de ligação TSG-6
[0620] Uma proteína de fusão, TSG-6-LM-Fc, contendo o módulo de ligação de TSG-6 e o domínio Fc de IgG foi gerada. Uma proteína de fusão TSG-6-LM-Fc/AHep mutante em que a região de ligação de heparina do módulo de ligação TSG-6 sofreu mutação, foi também gerada.
A. Construção do Vetor de Proteínas de Fusão do Módulo de Ligação TSG- 6 recombinante humana
[0621] A síntese de novo de DNA (GenScript, NJ) foi utilizada para gerar o ácido nucleico que codifica a proteína de fusão TSG-6-LM-Fc. O ácido nucleico contém um DNA que codifica uma sequência de peptídeo de sinal kappa(x) líder de cadeia leve de imunoglobulina humana (SEQ ID NO: 210), um fragmento de cDNA de 669 pb de comprimento, de cadeia pesada de IgGl humana (Gl No. 5.031.409 ; SEQ ID NO: 203, que codifica para a sequência peptídica apresentada na SEQ ID NO: 204) e um fragmento de cDNA de 285 pb de comprimento, da região do módulo de ligação de TSG-6 humana (SEQ ID NO: 216, que codifica para a sequência peptídica apresentada na SEQ ID NO: 207, o que corresponde às posições de aminoácidos 35 a 129 da pré-proteina TSG-6, Gl No. 315139000, estabelecidas na SEQ ID NO: 205 (mRNA) e SEQ ID NO: 206 (proteína)). A cadeia pesada de IgGl humana e regiões do módulo de ligação TSG-6 humana foram ligados com um local de clivagem de enzima de restrição Agel 6 pb, e uma sequência de 12 pb, GACAAAACTCAC (SEQ ID NO: 208) que codifica quatro aminoácidos adicionais (DKTH; SEQ ID NO: 209), originalmente publicados como parte da sequência de IgGl Fc ((Nucleic Acids Research, 1982, Vol. 10, p4047). Dois sítios únicos de clivagem de enzimas de restrição, Nhel na extremidade 5' e BamHI na extremidade 3', foram sintetizados a flanquear a sequência da proteína de fusão. O fragmento sintetizado possui uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 217. O fragmento foi optimizado por códon para a expressão melhorada de proteínas, e sintetizado por síntese de novo de DNA. O fragmento otimizado de códon tem uma sequência estabelecida na SEQ ID NO: 211. A sequência de proteína para a proteína de fusãoTSG-6-LM-Fc está descrita na SEQ ID NO: 212.
[0622] o fragmento optimizado de códon sintetizado foi inserido através de sítios de clivagem de Nhel e BamHI no vetor de expressão mamífero bicistrônico pHZ24 IRES (SEQ ID NO: 52) utilizando procedimentos bem conhecidos de recombinação de DNA (por enzimas de restrição e os reagentes de ligação obtidos a partir de New England
Biolabs, Ipswich, MA) para gerar a construção pHZ24-TSG-6- LM-Fc (SEQ ID NO: 213). A expressão da proteína recombinante, neste vetor, é dirigida por um promotor de CMV.
[0623] A fim de melhorar a especificidade de ligação ao (HA), para reduzir a ligação para outras cadeias de GAG, uma construção que codifica uma proteína de fusão mutante, TSG-6-LM-Fc/AHep, que contém 3 mutações de lisina para alanina nas posições de aminoácidos 55, 69, 76 do módulo de ligação TSG-6 construído. As mutações reduzem a atividade de ligação à heparina do módulo de ligação TSG-6, enquanto não afetam a atividade de ligação ao HA (ver Mahoney D J et al. (2005) J Biol. Chem. 280:27044-27055), que se reporta 10 vezes menos a atividade de ligação à heparina para o mutante triplo; K20A/K34A/K41A no local de ligação de heparina). TSG-6-LM-Fc/AHep foi gerado por mutagênese do fragmento de ácido nucleico que codifica a proteína de fusãoTSG-6-LM-Fc e inserção no vetor pHZ24 IRES, para gerar pHZ24-TSG-6-LM-Fc/AHep (SEQ ID NO: 218). A sequência do fragmento de TSG-6-LM-Fc/AHep está estabelecida na SEQ ID NO: 214, que codifica a proteína de fusão TSG-6-LM-Fc/AHep estabelecida na SEQ ID NO: 215.
B. Expressão de Proteína Recombinante e purificação
[0624] Células em suspensão FreeStyle CHO-S (Invitrogen) foram utilizadas para expressão das proteínas de fusão TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/NHep. A linhagem de células em suspensão FreeStyle CHO-S foi mantida em meio de cultura de CHO-S CD(Invitrogen) antes da transfecção. Para a preparação das células para transfecção e expressão de proteínas recombinante, as células Freestyle CHO-S foram cultivadas em meio de expressão Freestyle (Invitrogen) suplementado com 8 mM de L-glutamina em frascos de agitação a 37ºC., em uma atmosfera úmida de CO; a 8% no ar, em uma plataforma de agitação orbital a 125 rpm de rotação, com tampas soltas de frascos para permitir a aeração.
[0625] A transfecção transiente de células em suspensão foi realizada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram divididas a uma densidade de 6 x 10º/ml de 24 horas antes da transfecção, e transfectadas utilizando FreeStyle Max lipídico com uma proporção de DNA/lipídio na razão de 1:1. Após 96 horas pós-transfecção, as células foram colhidas a 4.000 g durante 20 min., e os sobrenadantes foram recolhidos. Uma análise de evolução temporal do nível de expressão da proteína durante a transfecção pós-transiente revelou que o nível de expressão da proteína atingiu um patamar após 96 horas após a transfecção. Assim, a proteína recombinante foi colhida 96 horas pós-transfecção.
[0626] As proteínas de fusãoTSG-6-LM-Fc e TSG-6- LM-Fc/AHep expressas nos sobrenadantes recolhidos foram purificadas por afinidade por resinas de proteína A (Bio-r Rad, Hercules, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os sobrenadantes recolhidos foram ajustados para pH 7,4, NaCl a 0,15 M com 1 M de Tris- HCl, pH 7,4 (Teknova Catalog No. T1074) e NaCl a 5 M (Sigma) e diluídos 3 vezes com tampão, antes de carregados para uma coluna de proteína A. O produto eluído foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl a 1M, pH 8,5, e dialisada contra uma solução equilibrada de fosfato(PBS, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, NazHPOs, a 8 mM, KH>PO, a 1,46 mM, e pH 7,4) a 4ºC, e armazenado a -20ºC. O rendimento das proteínas purificadas a partir dos sobrenadantes por meio de uma única etapa de coluna de afinidade de Proteína A foi entre 3 a 5 mg/litro.
C. A análise SDS-PAGE e Western Blot de proteínas recombinantes expressas
[0627] A pureza, tamanho e identidade da proteína de fusão purificada foi determinada por SDS-PAGE 4-20% de gel de gradiente sob condições de redução e não redução, e análise de Western Blot. 60 ng de proteína purificada foi utilizada na análise. O tamanho das proteínas de fusão purificadas foram cerca de 40 kDa sob condições de redução, e cerca de 80 kDa em condições não-redutoras, indicando que as proteínas expressas formam homodímeros através de ligações dissulfeto na região de articulação da IgG Fc. A pureza das amostras de proteínas foi maior do que 95%. As proteínas purificadas foram estáveis em PBS durante pelo menos um mês a 4ºC, sem qualquer degradação visível, ou perda de atividade de ligação.
[0628] A identidade do módulo de ligação TSG-6 em TSG-6-LM -Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep foi avaliada por Western blot com anticorpos de cabra anti-humano IgG TSG-6 (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) seguido por anticorpo de coelho anti-cabra IgG-HRP (EMD, San Diego, CA). Proteína TSG-6 de comprimento total recombinante humana (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) foi utilizada como controle positivo. O padrão de proteínas detectadas por análise de Western blot sob condições redutoras e não redutoras foi a mesma que a análise de SDS-PAGE, exceto por uma pequena quantidade de bandas superiores observadas sob a condição de não redução, provavelmente representando tetrâmeros das proteínas recombinantes com base no seu tamanho de peso molecular.
[0629] A identidade da porção Fc nas proteínas recombinantes purificadas foi confirmada por análise de Western blot com HRP de coelho anti-humano IgGFc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). O padrão de proteínas detectadas foi o mesmo que para as análises SDS-PAGE e anti-TSG-6, o que indica que as proteínas purificadas contêm tanto o módulo de ligação TSG-6 (LM), bem como hIgGFc.
[0630] Para analisar se as proteínas foram glicosiladas, as proteínas purificadas foram tratadas com PNGase F glicosidase (0,5 unidades por ng de proteína), que remove oligossacarídeos ligados a N, a partir de proteínas, e analisados por SDS-PAGE e Western blot. Observou-se uma diferença de 5 kDa de pesos moleculares de proteínas entre antes e depois do tratamento com PNGase F, o que indica que as proteínas expressas foram glicosiladas.
Exemplo 10 Ligação de TSG-6 para Hialuronan e heparina
[0631] Dois formatos foram usados para testar a ligação de ambos TSG-6-LM-Fc e seu mutante para HA e heparina. Em um formato, a ligação deTSG-6-LM-Fc e TSG-6- LM-Fc/NHep ao HA imobilizado ou heparina sobre uma microplaca foi utilizada. No segundo formato, a ligação de HA biotinilado e heparina para imobilizar as proteínas TSG- 6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep recombinantes em uma microplaca foi utilizada.
A. ligação do TSG-6 -LM -Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep recombinantes para HA e Heparina imobilizados
[0632] Homodímeros de fusão do mutanteTSG- 6-LM Fc e do tipo selvagem foram testados quanto as suas atividades de ligação a HA e heparina, usando microplacas revestidas com heparina Ee também HA. Resumidamente, hialuronan com média MW de cerca de 1000 kDa (Lifecore, Chaska, MN) ou heparina com MW médio de 15 kDa (Calbiochem, San Diego, CA), na concentração de 100 pg/ml em tampão de carbonato de sódio de 0,5 M, pH 9,6, foram vertidos para placas de 96 poços, em duplicado, com 100 pnl/poço, e incubados a 4ºC durante a noite. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% em PBS para reduzir a ligação não específica. As amostras de proteínaTSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep purificadas foram diluídas para dar origem à variedade de concentrações de 0,31-40 ng/ml para a ligação à placa revestida de HA, 0,78 a 100 ng/ml para a ligação a placa revestida com heparina. Para cada amostra, 100 pl por poço em duplicado foram adicionados a microplacas e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas com PBS a 0,05% Tween 20, 5 vezes, para remover proteína não ligada. TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep ligados ao AH e heparina foram detectados com anticorpo de coelho anti-humano IgG Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa.), seguido de substrato de TMB (3,3', 5,5'- tetrametilbenzidina) (KPL, Gaithersburg, MD). As amostras foram incubadas durante 60 minutos com anticorpo de coelho anti-humano IgG Fc-HRP. Após a lavagem, a ligação à HRP foi detectada com uma solução de TMB durante 10-15 minutos de tempo de desenvolvimento, seguido pela adição de reagente de ácido fosfórico para parar o desenvolvimento de cor. A absorvância foi medida a DO450 utilizando um espectrofotômetro Spectra M3 da Molecular Devices.
[0633] Tanto TSG-6 -LM -Fc como TSG-6-LM-Fc/AHep exibiram a mesma atividade de ligação na placa revestida com HA; e as suas curvas de titulação de atividade de ligação a HA foram quase sobrepostas, indicando que as duas expressaram proteínas ligadas ao HA, com elevada afinidade, com base nos valores de EC50, a partir de curvas de titulação de ligação ao HA. A mutação tripla no local de ligação à heparina não tem qualquer efeito na ligação ao HA. Em contraste, a ligação das duas proteínas para a placa revestida com heparina mostrou uma diferença significativa. O tipo selvagem de TSG-6-LM-Fc ligado à heparina, embora com uma atividade de ligação relativamente baixa, em comparação com a sua ligação ao HA, que pode ser devida à diferença de tamanho das duas cadeias de GAG revestidas nas placas. A proteína mutante TSG-6-LM-Fc exibiu cerca de 10% da atividade de ligação à heparina em comparação com a de tipo selvagem, o que foi consistente com o resultado relatado para o monômero TSG-6-LM triplo mutante (Mahoney DJ et al. (2005) B. Ligação da HA e Heparina biotinilados para TSG-6 -LM -Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep imobilizados recombinantes
[0634] As propriedades de ligação GAG do tipo selvagem de TGS6 -LM -Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep foram ainda examinadas pelo revestimento das microplacas com as proteínas recombinantes e avaliação da sua ligação a HA e heparina biotinilados.
[0635] Para a preparação das microplacas, TSG-6- LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep a uma concentração de 2 ug/ml em 1 x tampão PBS foram distribuídos por placas de 96 poços, em duplicado, com 100 nl/poço, e incubados a 4ºC durante a noite. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% em PBS para reduzir a ligação não específica.
[0636] As amostras de proteínaTSG-6-LM-Fc e TSG- 6-LM-Fc/AHep purificadas foram diluídas para dar origem a gama de concentrações de 0,31-40 ng/ml para a ligação à placa revestida de HA, 0,78 a 100 ng/ml para a ligação à placa revestida com heparina. 100 pl por poço de cada uma das amostras em duplicado, foram adicionados à microplaca e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. TSG-6-LM- Fc e TSG-6-LM-Fc/NHep ligados ao AH e heparina foram detectados com anti-humana IgG Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa.), seguido de substrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) (KPL, Gaithersburg, MD).
[0637] Por biotinilação do HA, foram utilizados os grupos carboxila no HA para a conjugação através de hidrazida química. Resumidamente, a biotina-hidrazida foi dissolvida em DMSO a uma concentração de 25 mM, e adicionada a uma proporção em volume de 6:100 em uma solução de HA, contendo 1000 kDa ou 150 kDa de peso molecular de HA (Lifecore Biomedical, LLC Chaska, MN) a 1 mg/ml em 0,1 M MES, pH 5,0. Cloridrato de 1-Etil- 3-[ 3- dimetilaminapropil ] carbodiimida (ECD) e sulfo-N- hidroxisuccinimida (sulfo-NHS) foram adicionados na reação de conjugação a uma concentração de 40 uM e 850 uM, respectivamente, para mediar a conjugação de biotina- hidrazida e HA. A reação foi mantida a 4ºC durante a noite, com agitação. A quantidade em excesso de produtos químicos foi removida do HA biotinilado por diálise. A heparina biotinilada foi adquirida de EMD, San Diego (Catálogo No. 375054).
[0638] Hialuronan ou heparina biotinilada foram diluídos em PBS com intervalo de concentração de 0,78 ng/ml a 100 ng/ml, 100 p1pl/poço dispensado, e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas com PBS a 0,05% Tween 20, 5 vezes para remover a proteína não ligada. O hialuronan e a heparina biotinilados ligados foram detectados com anti-estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), seguido por substrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) (KPL, Gaithersburg, Md.) como descrito acima. A absorvância foi medida a OD450.
[0639] Os resultados de ligação observados eram semelhantes para o ensaio de ligação realizado no Exemplo 10A, que utilizou HA e heparina imobilizados e TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep livres. Não houve diferença de atividade de ligação do TSG-6-LM-Fc e do TSG-6-LM-Fc/AHep imobilizados para HA biotinilado, ou nas curvas de titulação de ligação entre TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep, e uma redução significativa na ligação do TSG-6-LM-Fc/AHep mutante à heparina biotinilada, em comparação com a da proteína do tipo selvagem, também foi observada. Portanto, as propriedades de ligação ao HA e à heparina de TSG-6-LM — Fc do tipo selvagem e seu mutante, podem ser avaliadas, tanto no formato revestido de proteína recombinante como revestido de GAG; e ambos os formatos revelaram padrões de ligação semelhantes.
C. Cálculo de afinidade de ligação do TSG-6 -LM - Fc
[0640] A afinidade de ligação ao HA de TSG-6 -LM -Fc foi medida usando tecnologia tecnologia de Interferometria de Bio-Layer (BLI) através do instrumento Octeto Qke (ForteBio, Menlo Park, CA). A proteína recombinante TSG-6 de comprimento total (R & D Systems, Inc., Minneapolis, MN) foi utilizada como controle. Resumidamente, HA biotinilado com um peso molecular médio de 150 kDa foi imobilizado em biosensores revestidos com estreptavidina durante 240 segundos. TSG-6-LM-Fc e TSG-6- LM-Fc/AHep foram, em seguida, associados com HA imobilizado durante 180 segundos, em diferentes concentrações em PBS a pH 6,0 ou pH 7,4, seguido por dissociação de proteínas ligadas em PBS a pH 6,0 ou pH 7,4 por 240 segundos. Os resultados da cinética de ligação foram analisados com o software fornecido pelo fabricante. Os resultados para a afinidade de ligação calculados são apresentados na Tabela
10.
(nM)
Exemplo 11 Avaliação de Inibição Competitiva da ligação TSG-6 para Hialuronan e heparina por outros Glicoaminaglicans
[0641] Os locais de ligação ao HA e heparina GAG do módulo de ligação TSG-6 estão localizados em regiões diferentes do módulo de ligação. A fim de determinar se os dois locais de ligação iriam interferir uns com os outros durante a interação com o módulo de ligação TSG-6 Ou na presença de outras cadeias de GAG , um ensaio de inibição competitiva foi realizado para avaliar a ligação de HA ou heparina na presença de outras cadeias GAG.
[0642] Microplacas de 96 poços revestidas com HA e heparina foram preparadas conforme descrito no Exemplo 10A. TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep, a uma concentração de 40 ng/ml para as placas revestidas com HA, e 100 ng/ml para as placas revestidas com heparina, foram pré-incubadas com quatro cadeias de GAG diferente: HA (Lifecore Biomedical, LLC Chaska, MN), sulfato de condroitina A (EMD, San Diego, Califórnia, Catalog No. 230687) sulfato de condroitina C (EMD, San Diego, Califórnia, Catalog No. 2307) e sulfato de heparina (EMD, San Diego, Califórnia, Catalog No. 375095) em três concentrações diferentes (0,11, 0,33, 1,0 ug/ml) ou sem cadeia GAG como controle, à temperatura ambiente durante 10 minutos. As amostras foram, em seguida, distribuídas (100 pl) em duplicado para as microplacas de 96 poços revestidas por HA e heparina, e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas com PBS a 0,05% Tween 20, 5 vezes, para remover a proteína não ligada. TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep foram detectados com IgG anti-humana Fc-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), seguida por substrato de
TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina) (KPL, Gaithersburg, MD) como descrito acima. A absorbância foi medida a OD450.
[0643] Para a placa revestida de HA, tanto TSG-6 -LM -Fc como TSG-6-LM-Fc/AHep revelaram padrões de inibição competitiva similares. A ligação de TSG-6-LM-Fc ao HA imobilizado foi eficazmente inibida pela pré-incubação da mesma quantidade de proteína com diferentes doses de HA livre (cerca de 68%, 85%, e 93% de inibição para as doses 0,11, 0,33, 1,0 pg/ml de doses, respectivamente), mas não foi afetada pela pré-incubação com doses diferentes de heparina livre ou sulfato de condroitina C livre. Alguma inibição de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep foi observada para pré-incubação com o sulfato de condroitina A, embora fosse menos de HA (cerca de 23%, 43%, e 63% de inibição para as doses 0,11, 0,33, 1,0 pg/ml de doses). Assim, aproximadamente, uma quantidade superior a 10 vezes de sulfato de condroitina A foi necessária para a inibição. (Em experiências independentes até 30 vezes mais de quantidade de sulfato de condroitina A, foi necessária para a inibição em relação ao HA). Pelo fato de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep terem mostrado inibição semelhante com pré-incubação com o sulfato de condroitina A, é provável que o sítio de ligação ao HA no módulo TSG-6 seja responsável pela ligação ao sulfato de condroitina A.
[0644] Para as placas revestidas de heparina, a ligação de TSG-6-LM-Fc para a heparina foi eficientemente inibida, não só através da pré-incubação com heparina, mas também através da pré-incubação tanto com HA como sulfato de condroitina A. Estes dados mostram que a ligação de TSG- 6-Fc-LM ao HA pode bloquear a sua atividade de ligação à heparina. Como esperado, o mutante TSG-6-LM-Fc/AHep não se liga à heparina e, consequentemente, exibia leituras próximas às anteriores tanto para as amostras de controle como para as amostras de pré-incubação.
[0645] Este estudo demonstra que a ligação do módulo de ligação de TSG-6 ao HA não é afetada pela presença de heparina livre ou um complexo de TSG - 6- heparina pré-formado, enquanto que a sua ligação à heparina é significativamente inibida pela presença de HA livre ou TSG -6 HA pré-formado. Com base nestas observações conclui-se que TSG-6-LM se liga a HA e heparina simultaneamente, ou a ligação de TSG-6-LM para HA é mais forte do que a sua ligação à heparina. A formação do complexo HA e TSG-6-LM pode causar alteração de conformação da proteína ou outras modalidades da proteína que não são favoráveis para a sua ligação à heparina.
Exemplo 12 Comparação de Propriedades de ligação aos glicosaminoglicans de TSG-6 -LM -Fc, TSG-6-LM-Fc/AHep e
HABP
[0646] Neste exemplo, a especificidade e atividade de ligação de TSG-6-LM-Fc, TSG-6-LM-Fc/AHep e a proteína de ligação (HABP) para HA, heparina, e outros GAGs foram comparadas. Para esta experiência, proteínas de ligação ao HA, TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep HA biotiniladas foram geradas e comparadas com a proteína de ligação ao HA biotinilado disponível comercialmente (HABP) (Seikagaku, Tóquio, Japão) para a sua atividade de ligação em placas revestidas de cadeia GAG.
A. Biotinilação de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep
[0647] Uma abordagem de marcação aleatória foi utilizada para conjugar a biotina para resíduos que contêm amina primária (Lys) na proteína diretamente, sem pré- incubação com HA livre, a fim de proteger os sítios de ligação ao HA. Por biotinilação de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-
Fc/AHep, a conjugação direta do reagente ativo da amina primária NHS-PEG4-Biotina (Thermo Fisher Scientific, Chicago, IL) foi realizada de acordo com instruções do fabricante. 0,5 mg de proteína em PBS a uma concentração de 1 mg/ml e 10 pl de 20 mM de reagente de biotinilação foi utilizado para a reação de biotinilação. O grupo de éster de N- hidroxissuccinimida (NHS) de NHS-PEG4-Biotina reage especificamente e de forma eficiente com a lisina e os grupos amina N-terminal a um pH de 7-9, para formar ligações amida estáveis. o braço espaçador de polietilenoglicol hidrófilo (PEG) transmite solubilidade em água, que é transferida para a molécula biotinilada, reduzindo, assim, a agregação de proteínas marcadas armazenadas em solução. O braço espaçador PEG também dá ao reagente, uma conexão longa e flexível para minimizar o impedimento estérico envolvido com a ligação a moléculas de avidina. A NHS-PEG4-biotina que não reagiu, foi removida através de diálise contra 1 x PBS e armazenada a -20ºC.
[0648] Para comparação, as proteínas TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep também foram biotiniladas utilizando o método de marcação orientado, que conjuga as unidades de biotina para cadeias de açúcar sobre as proteínas, por oxidação de cadeia polissacarídica da proteína, utilizando NaIO, seguido de biotina-hidrazida. Resumidamente, 1 ml de proteína a uma concentração de 1 mg/ml em tampão fosfato a 0,1 M, pH 7,2, foi oxidado pela primeira vez por periodato de sódio (NaIO04) a uma concentração final de 5 mg/ml, a 4ºC durante 30 minutos. A reação converte os dois grupos hidroxila primários adjacentes em açúcares para os grupos reativos de aldeído correspondentes. A proteína oxidada foi dialisada contra tampão de fosfato 0,1 M, pH 7,2. A proteína dialisada foi, em seguida, misturada com 50 mM de hidrazida-biotina preparada em DMSO, proporção em volume de
9 para l1, resultando em 5 mM de hidrazida- biotina na reação, e incubada à temperatura ambiente durante 2 horas, para formar ligações hidrazona entre grupos aldeído e grupos hidrazida. A proteína marcada foi dialisada contra 1 x PBS e armazenada a -20ºC.
[0649] Depois da conjugação e remoção de biotina livre, a atividade de ligação ao HA de biotina- TSG-6 -LM - Fc e biotin-TSG-6-LM-Fc/AHep foi testada em conjunto com proteínas não marcadas correspondentes para examinar se a marcação causaria redução na atividade de ligação ao HA, usando o ensaio de ligação, tal como descrito no Exemplo 10A, utilizando placas revestidas com HA. Não foi encontrada diferença na atividade de ligação ao HA entre proteínas não rotuladas vs. rotuladas.
B. A ligação de TSG-6-LM - Fc, TSG-6-LM-Fc/AHep e HABP biotinilados para GAGs
[0650] Para a preparação das microplacas revestidas GAG, HA, heparina, sulfato de condroitina A, ou sulfato de condroitina C, a uma concentração de 100 pg/ml em tampão de carbonato de sódio de 0,5 M, foram dispensados 100 pL/poço, em placas de 96 poços duplicadas, e incubados a 4ºC durante a noite. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% em PBS para reduzir a ligação não específica. As três proteínas biotiniladas, TSG-6-LM-Fc, TSG-6-LM-Fc/NHep e HABP biotinilada foram diluídas para concentrações de 0,05 a 100 ng/ml para se ligar ao HA, placas revestidas de sulfato de condroitina A e sulfato de condroitina C, e 0,23 a 500 ng/ml para a ligação a placas revestidas de heparina. As amostras de proteína diluídas foram dispensadas para as placas, 100 ul /poço, em duplicado, e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. As proteínas ligadas às placas revestidas de GAG foram detectadas com estreptavidina-HRP (Jackson ImmunoResearch, West Grove,
PA), seguido de substrato de TMB (3,3, 5,5'- tetrametilbenzidina) (KPL, Gaithersburg, MD) como descrito acima. A absorbância foi medida a OD450.
[0651] Todas as três proteínas de ligação GAG biotiniladas apresentaram atividade forte de ligação ao HA na placa revestida de HA. Na concentração de proteína 11,1 ng/ml, que representa uma diluição menor do que as concentrações máximas de ligação (ou seja, 33,3 ng/ml e 100 ng/ml) de HA, a ligação de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep biotinilados para HA, foi de aproximadamente 14 vezes sobre a antecedente, e a ligação B-HABP ao HA foi de aproximadamente 9 vezes sobre a antecedente.
[0652] HABP e TSG-6-LM-Fc/NHep biotinilados exibiram pouca atividade de ligação contra a placa revestida de heparina.-TSG-6-LM-Fc biotinilado do tipo selvagem também mostrou atividade de ligação a heparina negativa, o que sugere que a abordagem de marcação aleatória com NHS-PEG4-biotina causou uma perda de atividade de ligação à heparina. Quando TSG-6-LM-Fc foi biotinilado pela abordagem orientada para marcação, tal como descrito acima, a ligação à heparina foi restaurada e a proteína exibiu uma atividade de ligação à heparina semelhante ao TSG-6-LM-Fc não marcado. Assim, a modificação de biotina de lisinas no sítio de heparina de TSG-6-LM-Fc poderia abolir a sua atividade de ligação à heparina.
[0653] Todas as três proteínas não apresentaram atividade de ligação à placa revestida de sulfato de condroitina C, mas demonstraram forte ligação para a placa revestida de sulfato de condroitina A. TSG-6 -LM -Fc e biotin-TSG-6-LM-Fc/AHep biotinilados foram observados para exibir algumas vezes maior atividade de ligação do que a biotina-HABP. Na concentração de proteína 11,1 ng/ml, a ligação de TSG-6-LM-Fc e TSG-6-LM-Fc/AHep biotinilados ao
HA, era de aproximadamente 20 vezes e 12 vezes sobre o antecedente, respectivamente, e a ligação B-HABP ao HA foi cerca de 6 vezes sobre o antecedente. No entanto, tanto TSG-6-LM-Fc como TSG-6-LM-Fc/nHep têm preferência muito mais forte para a ligação ao HA, tal como demonstrado no ensaio competitivo de GAG. Como mostrado no Exemplo 11, pelo menos 10 vezes mais de sulfato de condroitina A, foi necessário para alcançar a inibição competitiva semelhante ao HA. Além disso, em uma experiência em separado, HABP biotinilada foi comparada com TSG-6-LM-Fc biotinilado em um ensaio competitivo de GAG, e padrões semelhantes das quatro cadeias de GAG (HA, Heparina, sulfatos de Condroitina A & C) para a ligação de biotina-HABP para o HA, contra a ligação de TSG-6-LM-Fc para o HA, foram observados. Exemplo 13 A determinação quantitativa de hialuronan no plasma humano K3-EDTA pelo ensaio de ligação ao Aggrecan
[0654] A concentração de hialuronan foi determinada em amostras clínicas de plasma humano, utilizando um ensaio de ligação de sandwich. As amostras de plasma foram obtidas de 19 pacientes com tumores sólidos e vários tipos de tumores em estágio avançado que foram inscritos em um estudo clínico (Fase 1-101 e Fase 1-102, ver tabela 11) pela avaliação da dosagem de PEGPH20 escalada em pacientes, na presença ou ausência de dexametasona. Além disso, as amostras de plasma foram também obtidas a partir de vinte (20) pacientes normais (obtidos a partir de BioReclamation, Hicksville, NY). Antes do tratamento com PEGPH20, os níveis basais de HA foram determinados como se segue.
[0655] Placas de microtitulação de fundo plano Immulon 4HBX de 96 poços (Immulon/Thermo; Catálogo N * 3855) foram revestidas com um aggrecan recombinante humano
(rHu-aggrecan) R & D Systems, Catalog No. 842162) como reagente de captura. Antes do uso, rHu-aggrecan foi reconstituído pela adição de 250 pl de diluente de reagente para um frasco e armazenado a 2-8ºC durante até 1 mês. Em seguida, para gerar uma solução de 0,5 pg/ml de rHu- aggrecan, foi preparada uma diluição de 240 vezes de estoque (por exemplo,41,7 nuL do estoque até cerca de 10 mL de PBS). Imediatamente após diluição, 100 nl foram distribuídos por cada poço de uma placa 4HBX, e a placa foi coberta com um selante de placa e incubada durante a noite, ou até 3 dias à temperatura ambiente. Depois da incubação, cada poço na placa foi lavado cinco (5) vezes com um tampão de lavagem 1XPBST (1 x PBS, 0,05% Tween 20), utilizando o lavador de placas ELX405Select CW. A placa de ensaio foi então bloqueada com tampão de bloqueio (5% Tween 20 em PBS) por adição de 300 pL de tampão de bloqueio a cada poço. A placa foi coberta com uma tampa de placa adesiva e incubada à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora, sem agitação.
[0656] Antes da incubação da placa com a amostra, foram preparadas amostras de plasma e uma curva padrão. Resumidamente, as amostras de teste de plasma foram obtidas e armazenadas a <€ 60ºC, até análise. Imediatamente antes da análise, as amostras de teste foram descongeladas em gelo úmido e rapidamente misturadas por centrifugação imediatamente antes da diluição. Em seguida, várias diluições em série, de diluições de amostras de plasma de teste foram preparadas a fim de assegurar, pelo menos, que uma diluição da amostra estivesse dentro do intervalo da curva de calibração, através da diluição em Diluente Reagente (solução PBS Tween-20 a 5%, preparada por adição de 6,5 ml de Tween-20 (Sigma; Catalog No. P7949) para 123,5 ml de tampão fosfato salino (PBS; Cellgro; Catálogo nº 21-
031- CV)). Para avaliar a validade do ensaio, duas amostras de controle de qualidade também foram diluídas para o ensaio. Os controles foram de plasma humano agrupados coletados em K; -EDTA (plasma K3 -EDTA humana agrupado; "controle de baixa qualidade") e plasma K3 -EDTA agrupado humano enriquecido com hialuronan exógeno (HA) (“controle de qualidade alto"). O requisito mínimo de diluição (MRD) para plasma humano K3-EDTA (utilizado como um controle) foi de 1:4. As diluições foram em tubos de polipropileno (por exemplo, tubos BioRad; BioRad, Catalog No. 223-9391) e foram efetuadas para um volume total (amostra e diluente) de 500 ul. Cada diluição foi misturada, e foi preparada por breve pulso-centrigugação. As pipetas foram mudadas entre cada diluição.
[0657] Para a curva padrão, um estoque de hialuronan (132 kD), 1,800 ng/ml; R & D Systems, Catalog No. 842.164) foi diluído por diluição em série, em diluente de reagente (5% Tween 20 em PBS) até concentrações finais de 500 ng/ml, 167 ng/ml, 55,6 ng/ml, 18,5 ng/ml, 6,2 ng/ml, 2,1 ng/ml, e 0,68 ng/ml. Um poço contendo diluente de reagente em branco também foi incluído no padrão.
[0658] Então, no final da etapa de bloqueio, cada poço foi lavado cinco (5) vezes com tampão de lavagem 1 x“ PBST (1 x PBS, 0,05% Tween 20), utilizando o lavador de placas ELX405Select CW. As amostras de ensaio, controles e curva padrão foram adicionadas à placa revestida e bloqueada por adição de 100 pL de cada, em triplicado, aos poços da placa. A placa foi coberta com um selante de placa adesivo e incubada à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas. Depois da incubação, cada poço foi lavado cinco (5) vezes com um tampão de lavagem lx PBST (1 x PBS, 0,05% Tween 20), utilizando o lavador de placas ELXx405Select CW.
[0659] Para detectar a ligação de HA ao rHu- aggrecan revestido, um reagente de detecção rHuAggrecan biotinilado (72 pg/ml, R & D Systems, Catalog No. 842163) foi adicionada à placa.
Primeiro, 10 mL de uma solução de 0,3 ug/ml de aggrecan biotinilado foram preparados por diluição da solução estoque, 240 vezes em diluente de reagente (5% Tween/PBS). Em seguida, 100 pl de reagente de detecção, foram adicionados a cada poço.
A placa foi coberta com um selo adesivo e incubada à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas.
Cada poço foi lavado cinco (5) vezes com um tampão de lavagem lx PBST (1 x PBS, 0,05% Tween 20) utilizando o lavador de placas ELX405Select CW.
Em seguida, uma solução de trabalho de Estreptavidina-HRP (SA-HRP; R & D Systems, Catálogo No. 890803) foi preparada em diluente de reagente, diluindo o estoque 200 vezes.
Em seguida, 100 upL da solução de trabalho diluída SA-HRP foram adicionados a cada poço.
A placa foi coberta com um selo adesivo e incubada à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos, com agitação a 500 rpm.
No final do período de incubação de SA -HRP, cada poço foi lavado cinco (5) vezes com um tampão de lavagem 1x PBST (1 x PBS, 0,05% Tween 20) utilizando o lavador de placas ELX405Select CW.
Em seguida, 100 1pl de substrato de TMB (KPL, Catalog No. 52-00-03), que foi equilibrado à temperatura ambiente e protegido da luz, foram adicionados a cada poço e incubados à temperatura ambiente durante 20 minutos, com agitação a 500 rpm.
Em seguida, 100 mL de solução de paragem de TMB (KPL, Catálogo No. 50-85-06) foram adicionados a cada cavidade, durante pelo menos 5 minutos, mas menos do que 30 minutos antes da determinação da densidade óptica a 450 nm (OD 450 nm) usando um espectrofotômetro de placa de microtitulação e o software SoftMax Pro.
[0660] Com base no valor de DO450 nm, a concentração de hialuronan intacto para cada amostra foi determinada por interpolação a partir da curva padrão. Os resultados foram multiplicados pelo fator de diluição da amostra. Os dados foram apresentados como a média de todos os valores dentro dos limites de quantificação da curva de calibração, em ng/ml. Os resultados são apresentados nas Tabelas 11 e 12. Os resultados mostram que o HA plasmático médio em seres humanos saudáveis foi de 0,015 upg/ml, enquanto que nos indivíduos da fase 1, foi de 0,06 ug/ml. Isso representou uma diferença estatisticamente significativa com p <0,0001. TABELA 11. HA em plasma de indivíduos com tumores Result. Indivíduo Tipo de Tumor dade Sexo (ng/mL FE gar e Es 9 o [E 12 Câncer de pulmão de 61 T 348.3 células não-pequenas 1
E fígado TABELA 12. HA em plasma de indivíduos saudáveis 26 E 7 28
Em EE Exemplo 14 Detecção histoquímica de HA
[0661] A detecção histoquímica de HA foi obtida a partir de um espécime de tumor pré-biópsia e uma amostra de biopsia de fígado metastático pós-tratamento, a partir de uma amostra de biópsia do paciente doseado durante 4 semanas com 1,6 u1pg/kg PEGPH20 + dexametasona. A biópsia pré-dose (pré-biópsia) era uma amostra arquivada obtida em 2007 (3,5 anos anterior ao tratamento com PEGPH20). A amostra da biópsia pós-tratamento foi obtida 3 dias após a última dose (8º dose) em um regime de tratamento de PEGPH20 mais dexametasona, a partir de uma paciente fêmea com câncer de cólon com metástases hepáticas. Especificamente, a biópsia pós- tratamento do paciente foi obtida após um ciclo de tratamento PEGPH20 a 1,6 pg/kg de um programa semanal, de duas vezes para o ciclo de administração, com o co-tratamento com dexametasona. O ciclo de tratamento foi definido como um período de 28 dias, com PEGPH20 administrado por via intravenosa (IV) e dexametasona administrada por via oral. Em cada dia de dosagem, um regime de pré-medicação de 4 mg de dexametasona foi administrado oralmente uma hora antes da PEGPH20, seguido por uma segunda dose de 4 mg de dexametasona 8 a 12 horas após a dosagem PEGPH20.
[0662] Resumidamente, as biópsias de tumores foram fixadas em formol tamponado normal (NBF) e cortes de seções de 5 um, e coloridas utilizando uma proteína de ligação ao hialuronan marcada por biotina(HABP-bio) (Seikagaku, Japão). Após lavagem para remover o reagente primário, foi utilizado um reagente secundário marcado. Os núcleos foram contra-coloridos utilizando um reagente DAPI (4',6- diamidina-2-fenilindol). As micrografias foram capturadas por meio de um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse TEZ000U invertido, acoplado a uma câmera digital Insight FireWire (Diagnostic Instruments, Michigan) ou ZEISS overhead scope (Carl Zeiss, Inc.), que tem o mesmo sistema de imagem.
[0663] A coloração histoquímica das amostras com proteína de ligação ao HA biotinilada demonstrou uma diminuição nos níveis de HA pericelulares e estromais, após um ciclo de tratamento PEGPH20. Os resultados estão resumidos na Tabela 13. A pontuação H representa a intensidade relativa do HA pericelular e estromal. Os dados demonstram a capacidade de PEGPH20 de degradar o HA associado a um tumor, tal como demonstrado por uma redução da coloração de HA na biópsia do tumor após o tratamento.
Células de tumor pericelular Estroma % área total e ES maes | TA | mo | Pré- mes de 1 de e e e e fes e fes | | biopsia o 25 75 |25 30 [30 [23 |17 |173 |20 5 **Estroma associado ao tumor Exemplo 15 Método HPLC para a Estimativa do nível de Hialuronan (AH) no Plasma
[0664] Este Exemplo descreve um método para a determinação do teor de HA-dissacarídeo no plasma como uma medida de catabólitos de HA, que são os produtos de degradação após a atividade enzimática da PEGPH20. O método utiliza a hidrólise de HA com Condroitinase ABC para libertar os HA- dissacarídeos, derivatizá-los com 2-amina- acridona (AMAC) e analisá-los em uma HPLC de fase reversa com detecção de fluorescência. A quantificação dos HA- dissacarídeos é realizada por comparação com os padrões de HA-dissacarídeo. Este ensaio foi utilizado para medir a atividade enzimática de PEGPH20, por monitoramento das concentrações de catabólitos hialuronan no plasma de pacientes que foram selecionados em programas de pacientes após o tratamento com PEGPH20.
1. Padrões de trabalho
[0665] No método, uma solução padrão de trabalho foi gerada. Primeiramente, uma solução estoque diluída (DSS) foi gerada a partir de uma solução estoque de HA- dissacarídeo(SS). O dissacarídeo HA SS foi gerado pela adição de 1 ml de água para um frasco de HA-Disac (V-labs, Cat. No. C3209) contendo 2 mg de pó liofilizado para se obter uma suspensão uniforme. Para gerar soluções estoque diluídas, 5 pL da solução SS foram diluídos com 125 npL de água para produzir uma solução DSS1 (contendo 200 pmols/unl de HA-Disac; 200 nmol/ml de HA-Disac). Cinco diluições em série, em água, foram feitas para gerar DSS2 (contendo 40 pmols/pyl de HA-Disac; 40 nmol/ml de HA-Disac) e, em seguida, DSS3 (contendo 8 pmols/ul de HA-Disac ; 8 nmols/ml de HA-Disac). Em seguida, as soluções padrão de trabalho foram geradas como estabelecido em 25% de albumina do soro humano (HAS) (ABO Pharmaceuticals, Cat. No. 1.500.233) ou de plasma de camundongo normal (Bioreclamation, Cat. No. MSEPLEDTA2-BALB-M), conforme estabelecido nas Tabelas 14 e
15.
(nl) HSA (pl) (pm:
FELLI LE LAEILLEEEILEEEI EI IEn E50 DD] eso Pp en em eso as o e [1287 [rnn Ti [ssz Bo Doo do est Room TES [1553 [625 o o [23:75 [20:00
20.00 — [100 rss Do EB Do Bs Rr Es isso o eso O Tso [20:00 hs o e Es Es ron Gesso o de 25 urso [20 25 rss o es oo os oo [20 oo rss Do Tso: s0:00 20:00 TABELA 15. Solução Padrão de Trabalho em Plasma de Camundongo Normal HAODisac nsst DSS3 DSS2 DSS1 Água am (pmols (nl) Camuna. | SM 150 pl) Normal (nl) rss Pp [e nao
100.00 [10 [sz Bo Doo do EST [on TE [ns [6a o ass rm E ssa eso Do o stse room T Isso Do se Gts Room Ts ss e E ass rom Ts ss Do o 2:50 Enso 100:00 2500 [ss Do o [25:00 25:00 o0:00 5000 Gesso Do Do seo oo ooo Tron
2. Hidrólise e Derivação de Amostras
[0666] Em seguida, a amostra foi hidrolisada. A referida amostra (por exemplo, plasma) foi preparada utilizando cerca de 100 pg de proteína em um tubo de polipropileno e ajustando o volume para 340 pl com água. Uma matriz em branco também foi preparada utilizando tampão de diluição (1,59 g de HEPES, 5,07 g de NaCl, 1800 ml de água, pH 7,0) equivalente ao volume da amostra, e o volume foi ajustado para 340 pl. A hidrólise de amostras e uma matriz em branco foram efetuadas por adição de 60 pl de TFA para o tubo de amostra e a matriz tubular bruta, e os teores foram misturados e incubados a 100ºC durante 4 horas. os frascos foram deixados arrefecer até a temperatura ambiente. Os mesmos foram evaporados até ser usada uma velocidade vac. Em seguida, 300 ml de água foram adicionados a cada tubo, e centrifugados para ressuspender as amostras.
[0667] Para a derivação de amostras hidrolisadas, amostras brutas e de trabalho, 45 pÀpL de cada amostra (amostra, amostra em branco, ou de trabalho) foram evaporados até secar em um Speed Vac. Em seguida, 10 pl de SAS foram adicionados à amostra seca, em branco e padrão de trabalho. Em seguida, foram adicionados 50 pl de solução de marcação ABA/NaCNBH3. os tubos foram agitados e centrifugados brevemente. Em seguida, 440 pl da fase móvel A foram adicionados e os tubos foram bem misturados. A fase móvel A foi preparada como se segue: 132 mL de 1 M tampão de acetato de amônia (Sigma, Cat. A7330) foram adicionados a um balão volumétrico de 1 litro, e água foi adicionada para encher o frasco. Após derivação, cargas nominais em colunas por 20 pl de injeção para os padrões de trabalho são como definidos na Tabela 16.
Fuc GalN Glen WSS * (pmol) (pmol) (pmol) Gal (pmol) | Man (pmol)
3. HPLC
[0668] A coluna HPLC foi equilibrada a uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. com as configurações iniciais da fase móvel, como descrito na Tabela 20. O sistema foi deixado equilibrar até que a linha de base estivesse constante. A análise por HPLC foi realizada com os parâmetros do aparelho, conforme descrito na Tabela 17.
Coluna Coluna de fase reversa Bakerbond CI18 e ? 4,6 x 250 mm, 5 um
Dos amena mens | tetrahidrofurano em água Fluorescência; Excitação 360 nm, [esses O mpegs | LL EEE a EFE EaD
[0669] A sequência para a análise da amostra foi como se apresenta a seguir: WSS5 (1 injeção) para ganho de coluna condicionado/equilíbrio/detector; injeção de água (1 injeção); WSS3 (3 injeções); WSS1l (1 injeção); WSS2 (1 injeção); WSS4 (1 injeção); WSS5 (1 injeção); Água (1 injeção); Matrix em branco (1 injeção); Amostra 1 (1 injeção); Amostra 2 (1 injeção); WSS3 (3 injeções); Água (1 injeção). O sistema foi considerado adequado quando houve separação de qualidade aceitável; o sinal para a proporção de ruído para o pico mais curto do monossacarídeo na amostra WSSl foi igual ou superior a 10; o desvio padrão relativo (RSD) das áreas dos picos, para cada padrão monossacarídeo, para as seis injeções de WSS3, foi igual ou inferior a 4%; o coeficiente de correlação (r) foi de 0,99 (r foi medido usando o software para traçar a área do pico de cada padrão de trabalho contra a carga sobre a coluna (expressa como pmol) utilizando as três primeiras injeções com a norma padrão WSS3, e calculando o coeficiente de declive, intercepção e correlação para os padrões de trabalho, utilizando um modelo de regressão linear dos mínimos quadrados); as áreas de picos para os picos correspondentes aos monossacarídeos não foram mais do que 2% da área do pico medida por WSS5 ; e as áreas de pico para os picos correspondentes aos monossacarídeos na injeção de água, não foram mais do que 0,5% das áreas de picos medidas para WSS5.
4. Análise da Amostra
[0670] A média da área do pico corrigida para cada monossacarídeo em cada preparação da amostra foi determinada. A integração vale-para-vale foi utilizada para o pico GalN. Para determinar isto, as curvas lineares geradas a partir dos padrões de trabalho foram usadas para calcular a quantidade de cada monossacarídeo carregado para cada preparação de amostra. Para cada tipo de monossacarídeo, a proporção molar média dos monossacarídeos por molécula de proteína para cada amostra, foi calculada. Em seguida, para cada amostra, a soma total das proporções molares médias de todos os cinco monossacarídeos foi determinada. Os cálculos foram executados com base no seguinte: o peso molecular (MW) de proteína hialuronidase não glicosilada é 51106 g/mol; o volume total de cada amostra foi de 500 pl; o fator de diluição da amostra é de 0,15 ; o volume de cada injeção é 20 pl ; e o fator de conversão de mg para pg é de 10º. Os cálculos foram realizados conforme se segue, para cada monossacarídeo:
[0671] A quantidade de monossacarídeos para cada preparação foi calculada usando a seguinte equação: Monossacarídeo (pmol)= Area de pico-Intercept declive
[0672] O número de monossacarídeos por molécula de proteína foi calculado pelo uso da seguinte fórmula: Proporção monossacarídeos por proteína = Monossacarídeo (pmol) x MW x 500pl 0,1 mg x 10º x 20p1l x 0,15
[0673] Os resultados para cada amostra foram relatados como a proporção de monossacarídeos por proteína para cada monossacarídeo, juntamente com o somatório das cinco proporções de monossacarídeos.
5. Resultado
[0674] O ensaio de dissacarídeo descrito acima foi utilizado para medir HA e os seus catabólitos, de pacientes envolvidos em estudos clínicos de fase I, que receberam IV doses de PEGPH20, em doses que variaram de 0,5 uvg/kg a 50 pg/kg ao longo de um ciclo de regime de dosagem com, ou sem dexametasona. As concentrações plasmáticas de HA antes da dosagem com PEGPH20 eram normalmente menores do que 1 ug/mL ou abaixo do nível de quantificação (0,5 pg/ml) para todos os pacientes no estudo.
[0675] Plasma recolhido a partir de um paciente que recebeu uma dose única de 50 upg/kg de PEGPH20 foi avaliado ao longo do tempo após o tratamento. Os resultados mostram que as concentrações plasmáticas de hialuronan aumentaram significativamente. Neste paciente, enquanto as concentrações PEGPH20 diminuíram com uma meia-vida terminal de 2 dias, concentrações elevadas de catabólitos HA acumularam mais lentamente, e persistiram por até 2 semanas de tratamento pós-PEGPH20, com uma concentração máxima de plasma de HA observada cerca de 200 horas de pós-dose de PEGPH20.
[0676] O plasma também foi colhido a partir de 12 pacientes adicionais com início 24 horas após a dose inicial de PEGPH20, ou foram tratados com 0,5 pg/kg PEGPH20 duas vezes por semana (1 paciente), 0,5 ug/kg todos os 21 dias (3 pacientes), 0,75 upg/kg todos os 21 dias (4 pacientes), 1,0 upg/kg todos os 21 dias (3 pacientes), ou 1,5 1ug/kg todos os 21 dias (1 paciente). Os resultados mostram que após a administração de doses únicas Ou múltiplas de PEGPH20, que variaram de 0,5 u1pg/kg a 1,5 vg/kg, os níveis de HA catabólicos aumentaram de uma forma dependente da dose ao longo de uma semana.
Concentrações máximas de HA (Cmax) e estimativas área-sob-curva de uma semana (AUCo- 168n) também foram determinadas para cada paciente, para quantificar a resposta farmacodinâmica.
Os resultados mostraram que a exposição sistêmica aos catabólitos de HA, tal como medido pela concentração máxima no plasma, ou área-sob-curva, aumentou com o aumento da dose de PEGPH20. Além disso, amostras de sangue de pacientes administrados com PEGPH20, onde dexametasona foi adicionada a um regime de dosagem como uma pré-medicação, para eliminar ou melhorar os efeitos músculo-esqueléticos causados pela administração de PEGPH20. O ciclo de tratamento foi definido como um período de 28 dias, com PEGPH20 administrado por via intravenosa (IV) e dexametasona administrada por via oral.
A dosagem de PEGPH20 e dexametasona teve lugar nos dias 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22 e 25 do ciclo de 28 dias.
Em cada dia de dosagem, um regime de pré-medicação de 4 mg de dexametasona foi administrado oralmente uma hora antes da PEGPH20, seguido por uma segunda dose de 4 mg de dexametasona, 8-12 horas após a dosagem de PEGPH20. O plasma foi utilizado em vários pontos de tempo após a administração de PEGPH20 durante a primeira semana de tratamento.
De acordo com as observações nas amostras de pacientes que receberam apenas PH20 descrito acima, a concentração de plasma de HA vs. dados de tempo, aumentou após a administração de PEGPH20. As concentrações de plasma de HA medidas durante a primeira semana de dosagem aumentaram com o aumento da dose de PEGPH20. Em três pacientes que completaram um ciclo completo de tratamento e receberam 8 doses de PEGPH20, os resultados mostraram um aumento sustentado das concentrações de HA em amostras de plasma de todos os três pacientes medidos durante todo o período de dosagem.
[0677] Estes resultados são consistentes com o mecanismo de atividade esperado de PEGPH20, e apoiam o papel de HA como um biomarcador para farmacodinâmicas de PEGPH20.
Exemplo 16 Ressonância Magnética
[0678] MRI ponderada em difusão foi realizada utilizando uma única sequência de pulso spin-eco para estimar os valores de pixel-por-pixel para coeficiente de difusão aparente. O Contraste dinâmico aprimorou a ressonância magnética (DCE- MRI) incluída durante a infusão com um agente de contraste. A calibração foi realizada utilizando um simulador de duas partes contendo uma câmara de ar e mistura de gelo/água. Os exames foram realizados no pré-tratamento e no pós- tratamento.
1. Ressonância Magnética de Coeficiente de difusão aparente (ADC-MRI)
[0679] A Ressonância Magnética de Coeficiente de difusão aparente (ADC-MRI) mede o volume de água que passou através da membrana celular com base em um cálculo derivado das varreduras de pré- e pós- tratamentos. Varreduras ADC- MRI foram concluídas para um total de 10 dos 14 pacientes em uma fase I de um estudo clínico, que avalia o tratamento com PEGPH20 sem a pré-medicação de dexametasona, e em 4 dos pacientes em uma fase I de um estudo clínico, que avalia o tratamento com PEGPH20, com a pré-medicação de dexametasona.
[0680] A análise das imagens obtidas de cada paciente foi realizada por um radiologista de Imaging Endpoints (Scottsdale, AZ), e as estimativas quantitativas da ADC foram computadas para os tecidos em cada paciente.
Um resumo dos resultados de MRI-ADC associado com regiões do tumor é mostrado na Tabela 18. Como mostrado na Tabela, os aumentos na ADC-MRI foram observados em 7 de 14 (50%) dos pacientes após a dosagem com PEGPH20. O aumento dos valores de ADC é consistente com o mecanismo de ação de PEGPH20. Os valores de ADC, no entanto, não se alteraram em de 14 pacientes, e os valores diminuíram em 2 dos 14 pacientes. Modificação no Tumor ADC- Dose e Frequência Dias de varredura MRI a partir Pós-dose da linha de base Exemplo 15 50 va/kg 0-5 1g/x9; 2X/semana 0-5 na/Kkg; ciclo 21 dias | D3 NN.. diminuição nos nódulos
0.5 upg/kg; ciclo 21 dias |D4 Linfáticos 0-5 va/Kg; ciclo 21 dias 0:75 ug/kgs ciclo 21 dias | D3 0:75 pa/Kka; ciclo 21 dias 0:75 vg/Kka; ciclo 21 dias
1.0 pg/Kg; ciclo 21 dias [DS
1.5 1g/Kg; ciclo 21 dias 2x/semana
5.0 pg/kg + dexametasona; | 1, pa aumento DL 2x/semana 2x/semana
1.6 pg/kg + dexametasona; | 51, po sem modificação 2x/semana
2. Ressonância Magnética aprimorada por Contraste Dinâmico (DCE- MRI)
[0681] A Ressonância Magnética aprimorada por Contraste Dinâmico mede o fluxo de sangue que indica uma mudança na vascularização do tumor. Os exames foram concluídos em 4 pacientes, em uma fase I de um estudo clínico, que avalia o tratamento com PEGPH20 com uma pré- medicação com dexametasona. A análise de imagens obtidas de cada paciente foi realizada por um radiologista no Imagem Endpoints (Scottsdale, Arizona), e as estimativas quantitativas do coeficiente de transferência de volume (Ktrans), volume de sangue (Vp) e fração de volume extracelular (Ve) foram computados para tecidos em cada paciente. Um resumo dos resultados da DCE-MRI associados às regiões do tumor é apresentado na Tabela 19. Aumentos significativos no parâmetro Ktrans foram observados nos dois pacientes que foram verificados no dia da dosagem com PEGPH20. O aumento no Ktrans dentro das horas de dosagem é consistente com os dados pré-clínicos que mostram que PEGPH20 provoca descompressão vascular e aumento do fluxo sanguíneo (Thompson et al. (2010) Mol. Cancer. Ther., 9:3052-64. Modificação no Tumor DCE- Dose e Frequência Dias de varredura MRI a partir Pós-dose da linha de base 7 amstasona; 2x/por semana DL exametasona; Aumento no ktrans, Ve, Vp (8
5.0 pg/kg + dexametasona; | 71 pn, hr). Retorno à linha de base 2x/por semana — (D4) Nenhuma varredura de linha A etasnna. base disponível. Dn Naa d derametasona; D2, D25 Aumento em Vp no D25 vs /por semanê D2. Nenhuma mudança no Ktrans Aumento no ktrans (8 hr, 24 hr. Aumento em Ve para o / ametasona; EE gd deraner sOnã* |p1, D2 tumor de pulmão mas não para Por Semana o de fígado(Dl, D2). Sem modificação em Vp
[0682] A imagiologia DCE-MRI também foi executada em um paciente com um tumor pancreático inscrito em um estudo clínico de fase I recebendo 3,0 ug/kg + dexametasona /wk em um ciclo de administração de 28 dias. As imagens de pré-dose e pós-dose foram obtidas, tal como se segue: 8 horas (Dia 1), 24 horas (dia 2) e 3 dias após a quarta dose semanal de PEGPH20 no ciclo 1 (final do ciclo 1). Os resultados são apresentados na Tabela 20, e mostram que PEGPH20 aumenta o Ktrans do tumor medido por DCE-MRI serial. TABELA 20. Resultados DCE-MRI de um paciente recebendo 3.0 ug/kg + dexametasona/por semana uu A A jm 1
3. FDG-PET
[0683] A tomografia por emissão de pósitrons (PET) utilizando FDG, um análogo de glicose, foi utilizada para se obter atividade metabólica de tecido, em termos de absorção de glicose regional. A FDG-PET foi realizada em um paciente com carcinoma retal metastático com metástase pulmonar em um estudo clínico de fase de I, recebendo 3,0 nug/kg + dexametasona; 2 */por semana, em um ciclo de administração de 28 dias. As imagens de pré-dose foram obtidas 8 horas após a dose, 24 horas após a dose, e no final do ciclo (1 dia após a oitava dose). O valor de captação padronizado FDG (SUV) foi determinado utilizando métodos padronizados. Os resultados são apresentados na Tabela 21, e mostraram que o paciente exibiu diminuição do da atividade metabólica do tumor após o tratamento com PEGPH20 de metástases pulmonares de referência. TABELA 21. Resultados FDG-PET de um paciente recebendo 3.0 pg/kg dexametasona 2x /por semana Localização inha | 8h E 24h [n8n |Dia26/0 24h a anatômica de (SUV | Linha (SUV) | Para (SUV) | para dia | Linha de base |) De base 24h 26 Base p/ (SUV) para 8 h| Dia 26 Segmento superior do lóbulo 12.9 |9.4 -27% -15% 8 [E —38% inferior esquerdo Base do pulmão esquerdo 11.2 [9.1 -19% 7.1 |-22% 6.7 6% 40% Lóbulo superior dir. Na Região 6.8 4.5 34% 3.9 13% 4 +3% 41% perihilar dir. Lóbulo inferior 8.1 5.4 |-33% 5.2 as 4. 10% 42% dir.
4. Sumário
[0684] Os resultados mostram que as várias modalidades de imagiologia tumoral podem ser utilizadas para demonstrar e monitorar a atividade de PEGPH20 no tecido do tumor.
Exemplo 17 Imagiologia direcionada tumor TSG-6 -Fc para Diagnóstico e Tratamento de Câncer rico em hialuronAN
[0685] Camundongos controle e camundongos portadores de tumor rico em hialuronAN foram administrados com TSG-6-LM-Fc/NHep marcado com reagente de marcação DyLight 755 Fluor (TSG-6-LM-Fc/AHep”""**), e os camundongos foram fotografados para avaliar a ligação tumoral e distribuição de TSG-6-LM-Fc/AHep""**, A especificidade também foi avaliada comparando a coloração e distribuição a um controle IgerrTo, Para a geração de camundongos portadores de tumor peritibial BxPC3, os camundongos foram inoculados com células de tumor BxPC-3 de adenocarcinoma pancreático humano (ATCC CRL-1687), subcutaneamente (s.c., pata traseira direita) a 1 x 10' células/0,1 mL. Para a geração de camundongos portadores de tumor HA *Dul45-Has2 e HA-DU145, os camundongos foram inoculados com ambas as células Dul45-Has2 (produzidas como descrito acima) e as células Dul45, de modo peritibial (injeção intramuscular adjacente ao periósteo da tíbia direita em ambos os lados) a 5x10º/0,05 mL.
[0686] TSG-6-LM-Fc/aAHep?”W"** foi gerado por fluorescência, através da marcação de TSG-6-LM-Fc/AHep (gerado como descrito no Exemplo 9) com DyLight 755, usando o kit de corante reativo a amina Thermo Scientific DyLight 755 (Catálogo Nº 84538; Thermo Scientific, Rockford, IL), de acordo com o protocolo do fabricante.
A. Distribuição de TSG-6-LM-Fc/AHep"""*** com e sem o pré-tratamento com PEGPH20
[0687] Os camundongos portadores de um tumor peritibial HA? BxPC3 com cerca de 18 a 20 mm de diâmetro, foram injetados por via intravenosa com 5 ug ou 10 pg de TSG-6-LM-Fc/AHepD""**. Em um grupo de camundongos, os referidos camundongos foram pré-tratados com a administração intravenosa de PEGPH20 a 4,5 mg/kg, três (3) horas antes da administração de TSG-6-LM-Fc/AHep”"**,
[0688] Um sistema de imagem de corpo total fluorescente (IVIS Lumina XR, Caliper Life Sciences Mountain View, CA) foi usado para rastrear fluorescência no animal. A excitação seletiva de DyLight755 foi feita usando um filtro do tipo long-pass D/745 nm, e a fluorescência emitida foi coletada através de um filtro do tipo long-pass D800 nm. Os três grupos de camundongos (não injetados, TSG- 6-LM-Fc/AHep"""** e PEGPH20 + TSG-6-LM-Fc/AHep"""**) foram fotografados em vários pontos temporais pós TSG-6-LM- Fc/aHep?Too (1 horas, 4 horas, dia 1, dia 2, dia 3, dia 4 dia 5 e dia 6). Para imagiologia, os camundongos de controle não injetados foram também avaliados. Imagens fluorescentes foram capturadas com uma câmera digital com super resfriamento, de alta sensibilidade. Imagens fluorescentes foram posteriormente analisadas com Living Image (Caliper Life Sciences, Mountain View, CA).
[0689] Os resultados mostram que em 1 hora e 4 horas após a injeção, TSG-6-LM-Fc/AHep"""** foi detectado como circulante na corrente sanguínea, e também foi detectado como um começo de ligação ao tumor. A ligação ao tumor era dependente da dose, com o aumento da intensidade de coloração observada com a dose de 10 mg. Uma ligação menor ao tumor foi detectada por imagem em camundongos tratados com PEGPH20, em todas as doses e intervalos de tempo. Em momentos posteriores após a injeção (por exemplo, um dia ou dois dias), a ligação ao fígado também foi detectada, embora esta tenha sido menor nos ratos injetados com o 1 ug de dose baixa de TSG-6-LM-Fc/AHep”""**. TSG-6-LM- Fc/AHep"""** atingiu níveis máximos entre os dias 1 e 2, tal como avaliado por análise de imagem. Em camundongos tratados com baixa dosagem, TSG-6-LM-Fc/AHep"""** foi eliminado no terceiro dia após a injeção. TSG-6-LM- Fc/AHep??S ainda circulou em camundongos tratados com doses elevadas 5 dias após a injeção, e todas as ligações ao tumor foram diminuídas 6 dias após a injeção.
[0690] Em suma, os resultados de imagem in vivo mostram que a ligação TSG-6-LM-Fc/AHep"""** foi dependente da dose e atingiu níveis de pico de 1-2 dias após a injeção. Além disso, a remoção de HA por PEGPH20 resultou em uma ligação menor de TSG-6-LM-Fc/AHep"""**. A ligação TSG-6-LM-Fc/AHep”""** foi eliminada do tumor 6 dias após a injeção.
B. Comparação da ligação TSG-6-LM-Fc/AHep”*"** entre o tumor Du 145 + /- HAS2
[0691] Camundongos portadores de tumor HA*? DU1l45-HAS2 e HA -DUl45 foram injetados por via intravenosa com 5 ug TSG-6-LM-Fc/AHep?”T*, Os ratos foram fotografados diariamente após a inhjeção de TSG-6-LM-Fc/AHepDL755. Embora tenha sido detectado um baixo nível de coloração de fundo do tumor HA-DUl45, havia muito mais ligação TSG-6-LM- Fc/AHep ”“** ao Dul45-has2 rico em HA avaliado por resultados de imagem. A ligação foi de pico no dia 1-2, tal como determinado pela intensidade da coloração. Assim, os resultados mostram que quanto mais HA está presente no tumor, mais TSG-6-LM-Fc/AHep”""** se liga ao tumor.
C. Especificidade de TSG-6-LM-Fc/AHep”""**
[0692] A especificidade de TSG-6-LM-Fc/AHepDL755 para tumores ricos em HA foi ainda avaliada comparando a ligação de TSG-6-LM-Fc/AHep”""** ou IgG”""** para camundongos portadores de tumor peritibial HA”? BxPC3. Camundongos portadores de tumor peritibial HA + + BxPC3 foram injetados por via intravenosa com 5 ug TSG-6-LM-Fc/AHep”"**, ou com 5 ng IgE, Os camundongos foram fotografados diariamente após a injeção. Os resultados de imagem mostraram pouca ou nenhuma coloração detectável de IgGDL755 para o tumor e, assim, uma maior ligação de TSG-6-LM-Fc/AHep”"*** ao tumor PC3 do que IgE”.
[0693] Uma vez que as modificações serão evidentes para os peritos nesta arte, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo âmbito das reivindicações anexas.

Claims (47)

REIVINDICAÇÕES
1. Multímero de módulo de ligação (LM) TSG-6 caracterizado pelo fato de compreender: um primeiro polipeptídeo que contém um TSG-6-LM ligado direta ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização; e um segundo polipeptídeo que contém um TSG-6-LM ligado direta ou indiretamente, através de um ligante a um domínio de multimerização, em que: o primeiro e segundo domínios de multimerização interagem para formar um multímero contendo dois ou mais módulos de ligação TSG-6; o primeiro e segundo polipeptídeos não compreendem a sequência de comprimento total de TSG-6; e o multímero TSG-6-LM tem uma afinidade de ligação para hialuronano (HA) com uma constante de associação de pelo menos 10' M.
2. Multímero TSG-6-LM, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o módulo de ligação é a única porção TSG-6 do primeiro polipeptideo e do segundo polipeptídeo.
3. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo módulos de ligação são o mesmo ou diferentes.
4. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o TSG-6-LM compreende a sequência de resíduos de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, ou uma sequência de resíduos de aminoácidos que compreendendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos estabelecida na
SEQ ID NO: 207, 360, 417 ou 418, que se liga especificamente ao HA.
5. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o TSG-6-LM é modificado para reduzir ou eliminar a ligação à heparina.
6. Multímero TSG-6-LM, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o TSG-6-LM compreende uma substituição de aminoácidos na posição de aminoácido correspondente ao resíduo de aminoácido 20, 34, 41, 54, 56, 72 ou 84 estabelecida na SEQ ID NO: 360, em que um resíduo de aminoácido correspondente é identificado por alinhamento de um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID NO: 360.
7. Multímero TSG-6-LM, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a substituição de aminoácido é em um resíduo de aminoácido não-básico selecionado entre Asp (D), Glu (E), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gln (0), Ala (A), Val (V), Ile (1), Leu (L) Met (M), Phe (F), Tyr (Y) e Trp (W).
8. Multímero TSG-6-LM, de qualquer uma das reivindicações 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o TSG-6-LM compreende uma substituição de aminoácidos correspondente a uma ou mais substituições de aminoácidos K20A, K34A ou K41A em um TSG-6-LM estabelecido na SEQ ID no: 360, ou a substituição no resíduo correspondente no outro TSG-6-LM.
9. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o TSG-6-LM compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:361 ou 416, ou uma sequência de aminoácidos compreendendo pelo menos 85% de identidade de sequência de aminoácidos para a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 361 ou 416, que se liga especificamente ao HA.
10. Multímero TSG-6-LM, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de multimerização é selecionado entre uma região constante de imunoglobulina (Fc), um fecho de leucina, regiões hidrofóbicas complementares, regiões hidrofílicas complementares, domínios de interação proteína-proteína compatíveis, tióis livres que formam uma ligação intermolecular de dissulfeto entre duas moléculas, e uma protuberância-em-cavidade e uma cavidade de compensação de tamanho idêntico ou semelhante que formam multímeros estáveis.
11. Multímero TSG-6-LM, de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de multimerização é uma região contante de imunoglobulina (Fc) ou uma variante deste, que efetua multimerização.
12. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo polipeptídeos compreendem, cada um, um TSG-6-LM e um domínio Fc de imunoglobulina.
13. Multímero TSG-6-LM, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de compreender a sequência de aminoácidos estabelecida como aminoácidos 24-349 na SEQ ID NO: 212 ou 215, ou uma sequência de aminoácidos que apresenta identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 85% com os aminoácidos 21-349 da SEQ ID NO: 212 ou
215.
14. Multímero TSG-6-Lm, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
12 ou 13, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos codificada pela sequência de nucleotídeos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 211, 214 ou 217, ou uma sequência de nucleotídeos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 211, 214 ou 217.
15. Multímero TSG-6-LM, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o domínio de multimerização compreende a sequência de resíduos de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 359 ou uma sequência de resíduos de aminoácidos tendo 85% de identidade de sequência com a mesma.
16. Molécula de ácido nucleico que codifica o multímero TSG-6-LM conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 15 caracterizada pelo fato de que: a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo de fusão contendo um TSG-6-LM ligado diretamente ou indiretamente através de um ligante a um domínio de multimerização; e o domínio de multimerização é um polipeptídeo que interage com ele mesmo para formar uma interação proteína- proteína estável, pelo que a proteína codificada forma um multímero contendo pelo menos dois módulos de ligação TSG-
6.
17. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 211, 214 ou 217, ou uma sequência de nucleotídeos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 211, 214 ou 217.
18. Vetor caracterizado pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico conforme qualquer uma das reivindicações 16 ou 17.
19. Célula isolada ou cultura de células caracterizada pelo fato de compreender a molécula de ácido nucleico conforme qualquer uma das reivindicações 16 ou 17.
20. Método para produzir um multímero TSG-6-LM caracterizado pelo fato de compreender: introduzir a molécula de ácido nucleico conforme qualquer uma das reivindicações 16 ou 17 em uma célula; cultivar a célula sob condições pelas quais o polipeptídeo de fusão é expresso pela célula; e opcionalmente, recuperar o multímero TSG-6-LM.
21. Kit ou combinação caracterizado pelo fato de compreender: uma primeira composição compreendendo um multímero TSG-6-LM conforme qualquer uma das reivindicações l1al5; e uma segunda composição compreendendo um agente anti-hialuronan; e opcionalmente, reagente para detecção do multímero TSG-6-LM.
22. Kit ou combinação, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima degradante de hialuronan ou é um agente que inibe a síntese de hialuronan.
23. Kit ou combinação, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzina degradante de ácido hialurônico que é uma hialuronidase.
24. Kit ou combinação, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a enzima degradadora de hialuronan é um hialuronidase PH20 ou a forma truncada da mesma sem um local de ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI) C-terminal, ou uma parte do local de ligação GPI.
25. Kit ou combinação, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que PH20 ou sua forma truncada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 a 9, 47, 48, 150 a 170 e 183 a 189, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 a 9, 47, 48, 150 a 170 e 183 a 189.
26. Kit ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima degradante de hialuronan que é modificada por conjugação com um polímero.
27. Kit ou combinação, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o polímero é PEG e a enzima degradante de ácido hialurônico está PEGuilada.
28. Método para a seleção de um indivíduo para o tratamento de um tumor, com um agente anti-hialuronan, caracterizado pelo fato de compreender: contatar uma amostra de tecido ou fluido corporal previamente obtida de um indivíduo que tem um tumor ou câncer, com um multímero TSG-6-LM conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e detectar a ligação do multímero TSG-6-LM à amostra, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, em que se a quantidade de hialuronan na amostra é igual ou superior a um limiar predeterminado, há a seleção do indivíduo para o tratamento com um agente anti- hialuronan.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o nível de limiar predeterminado é HA elevado.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o nível de limiar predeterminado é de pelo menos ou superior a 0,025 ug de HA/ml de amostra, 0,030 upg/mL, 0,035 upg/mL, 0,040 ug/mL, 0,045 ug/mL, 0,050 ug/ml, 0,055 mg/ml, 0,060 ung/ml, 0,065 ug/mL, 0,070 ug/ml, 0,08 ug/mL, 0,09 vg/ml, 0,1 vg/ml, 0,2 pvoa/ml, 0,3 pg/ml ou superior; ou a amostra é uma amostra de tecido de tumor e o limiar predeterminado é uma pontuação de HA de pelo menos +2 (HA?) ou pelo menos +3 (HA); ou a amostra é uma amostra de tecido de tumor e o nível de limiar predeterminado é de pelo menos um por cento de pixels positivos de HA no tumor (células e estroma) para coloração total no tecido tumoral de, pelo menos, 10%, 10% a 25% ou maior do que 25%.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o nível de limiar predeterminado é uma pontuação de HA de pelo menos +3 (HA) (níveis elevados).
32. Método para prever a eficácia de tratamento de um indivíduo com um agente anti-hialuronan caracterizado pelo fato de compreender: contatar uma amostra de tecido ou fluido corporal de um indivíduo que seja ou tenha sido tratado com um agente anti-hialuronan com um multímero TSG-6-LM conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 15; detectar a ligação do multímero TSG-6-LM à amostra, determinando assim, a quantidade de hialuronan na amostra, em que a detecção de uma diminuição no hialuronan em comparação com o tratamento anterior com o agente anti- hialuronan ou antes da dose anterior de agente anti- hialuronan, indica que o tratamento é eficaz.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima degradante de hialuronan ou é um agente que inibe a síntese de hialuronan.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima de degradação de hialuronan que é uma hialuronidase.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma hialuronidase PH20 solúvel ou uma forma truncada Cr-terminal de uma hialuronidase PH20 humana sem todos ou uma porção do local de ligação de GPI.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima degradante de hialuronan que é uma hialuronidase PH20 ou uma forma truncada da mesma sem todos ou uma porção do local de ligação de GPI.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que PH20 ou sua forma truncada compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 a 9, 47, 48, 150 a 170 e 183 a 189, ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4 a 9, 47, 48, 150 a 170 e 183 a 189.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, caracterizado pelo fato de que o agente anti-hialuronan é uma enzima degradante de hialuronan que é modificada por conjugação com um polímero.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o polímero é PEG e a enzima degradante de ácido hialurônico é PEGuilada.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o indivíduo de quem se obtém a amostra tem um tumor ou câncer.
41. Método de diagnóstico de uma doença Ou condição associada ao hialuronan caracterizado pelo fato de compreender: contatar uma amostra de tecido ou fluido corporal previamente obtida de um indivíduo com um TSG-6-LM conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 14; e detectar a ligação de TSG-6-LM, determinando assim a quantidade de hialuronan na amostra, em que oO indivíduo é diagnosticado com uma doença ou condição associada a hialuronan, se a quantidade de hialuronan estiver acima de um nível predeterminado ou for superior ao nível de hialuronan de uma amostra de referência.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição associada ao hialuronan é um tumor ou câncer.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que o nível de referência ou predeterminado é o nível médio de hialuronan presente no tecido saudável ou normal, ou amostras de fluidos a partir de uma população de indivíduos de controle.
44, Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 40, 41, 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que:
o nível de limiar predeterminado é maior do que 0,015 ug de HA/ml de amostra; ou a amostra é uma amostra de tumor ou tecido e o nível de limiar predeterminado é uma pontuação de HA de HA*', HA”? ou HA”.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 Ou 44, caracterizado pelo fato de que: a amostra é uma amostra de tecido estromal; ou a amostra é uma amostra de fluido que é uma amostra de sangue, soro, urina, suor, sêmen, saliva, fluido cerebro-espinal, ou linfa.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de tecido estromal de um tumor.
47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o tumor é de um câncer selecionado entre o câncer de mama, câncer pancreático, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de pulmão células não-pequenas, carcinoma in situ (ISC), carcinoma de células escamosas(SCC), câncer de tireoide, câncer cervical, câncer uterino, câncer de próstata, câncer testicular, câncer cerebral, câncer de bexiga, câncer de estômago, hepatoma, melanoma, glioma, retinoblastoma, mesotelioma, mieloma, linfoma e leucemia.
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