CN109735589B

CN109735589B - 一种胰岛素DesB30的制备方法

Info

Publication number: CN109735589B
Application number: CN201910002001.2A
Authority: CN
Inventors: 姚元锋; 张超; 刘本达; 马文柱; 夏玉平; 赖红星; 肖拥军; 罗湘冀
Original assignee: Zhuhai Jinbaikang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhuhai Jinbaikang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-02
Filing date: 2019-01-02
Publication date: 2020-07-10
Anticipated expiration: 2039-01-02
Also published as: CN109735589A

Abstract

本发明公开了一种胰岛素DesB³⁰的制备方法，包括以下步骤：S1、向胰岛素前体蛋白的发酵液中添加蛋白酶；S2、调节所述步骤S1处理后的溶液的pH值和温度使蛋白酶进行酶切，酶切后得到含有胰岛素DesB³⁰的溶液。所述制备方法还可以包括步骤S3、对酶切后的含有胰岛素前体的溶液进行等电点沉淀回收操作，得到纯度更高的胰岛素DesB³⁰。与现有技术相比，通过本发明方案制备胰岛素前体操作简便、设备投入低且工艺过程收率高，具有良好的工业应用前景。

Description

一种胰岛素DesB30的制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种胰岛素DesB³⁰的制备方法。

背景技术

胰岛素是糖尿病治疗过程中的重要药物之一，目前，市场生产的胰岛素主要采用重组技术，重组胰岛素的生产过程通常包括以下几个步骤：S1、通过微生物如大肠杆菌或酵母菌等表达胰岛素原；S2、通过纯化后去除发酵液中的大部分杂质；S3、通过胰蛋白酶或赖氨酰内切酶酶切获得去B链30位氨基酸残基的胰岛素(DesB³⁰胰岛素)固体粉末；S4、对上述操作得到的DesB³⁰胰岛素进行不同的修饰得到功效不同的重组胰岛素衍生物，如通过转肽反应等工艺可以获得起效迅速的门冬胰岛素；或通过不同脂肪酸侧链的修饰可以获得长效的地特胰岛素或德谷胰岛素。

其中，步骤S2中胰岛素原纯化方式通常采用阳离子交换层析，通过使用在酸性条件下，0.5～1.0M NaCl进行洗脱获得胰岛素或胰岛素类似物前体。这种方式得到的人胰岛素类似物前体存在的大量无机盐会严重抑制胰蛋酶的活性，往往需要进一步脱盐、加大酶量或延长酶切时间来调控酶切效率。此外，步骤S1利用微生物(如大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等)发酵平台，获得大量的表达胰岛素时不仅会产生大量色素，而且发酵液中残留的无机盐含量非常高，电导率值可达到40-50mS/cm，因此，在进行纯化时对发酵上清液进行超滤换液或适当稀释来降低电导，以实现胰岛素前体结合层析填料进而实现分离纯化。中国发明专利文件CN105111304B公开了一种重组人胰岛素前体的纯化和酶切换方法，具体公开了采用离子交换对胰岛素原发酵液进行纯化，然后通过加入有机溶剂乙腈并进行酶切，随后旋蒸出有机溶剂并等电点沉淀获得DesB³⁰胰岛素，该方法虽能得到纯度相对较高的胰岛素前体，然而工艺整体却十分繁琐，且整体摩尔收率只有约80%。中国发明专利文件CN1699412B公开了一种胰岛素及胰岛素类似物的基因工程制备新方法，具体公开了应用XAD-7疏水吸附填料分离纯化--旋蒸除有机试剂--凝胶过滤除去色素和部分杂质，然后利用阳离子交换柱SP-Fast flow除去多脂类等杂质，收集的胰岛素前体的工艺，该方法也能提升产品纯度，然而其所采用的工艺步骤长、有机试剂消耗大、疏水吸附层析交换容量低、脱盐步骤产率低，不适合大规模的生产。中国发明专利申请文件CN105153294A公开了一种重组胰岛素及胰岛素类似物前体纯化方法，具体公开了采用更先进的可以耐受高电导率的离子交换填料进行胰岛素前体的回收，如采用Capto MMC可以在几乎不稀释发酵液的情况下直接进行纯化，且收率有85%左右，但类似填料价格往往是常用离子交换填料的5倍以上，导致其生产成本大大增加，仍不适用于工业化大规模生产。

综上所述，现有技术中采用重组表达法制得的胰岛素前体在制备DesB³⁰胰岛素过程中存在着常规层析填料前体纯化过程不能耐受高盐上样、超滤换液脱盐、大体积稀释、高盐洗脱后与后续酶切工艺衔接困难等诸多问题，而非常规疏水填料在层析中则存在有机试剂用量大、填料成本高、污染严重等问题。因此，如何简单方便的制备胰岛素前体(DesB³⁰胰岛素)以使其适合于工业生产是目前胰岛素类似物制备过程中亟待解决的重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种操作简便且工艺过程收率高的胰岛素前体的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种胰岛素前体的制备方法，包括以下步骤：

S1、向胰岛素前体蛋白的发酵液中添加蛋白酶；

S2、调节所述步骤S1处理后的溶液的pH值和温度使蛋白酶进行酶切，酶切后得到含有胰岛素前体的溶液。

进一步地，所述蛋白酶为赖氨酸酰肽链内切酶；优选地，所述赖氨酸酰肽链内切酶的用量为0.1～10U/g胰岛素前体蛋白；更优选地，所述赖氨酸酰肽链内切酶的用量为0.5～4U/g胰岛素前体蛋白。

进一步地，所述步骤S1中，所述胰岛素前体蛋白的发酵液可参考现有技术制备，如参考中国发明专利文件CN105111304B或中国发明专利文件CN105087724A制备而得。

进一步地，所述步骤S2中，所述pH值为8.0～10.0；优选地，所述pH值为9.0～10.0。

进一步地，所述步骤S2中，所述温度为0～40℃；优选为20～40℃；更优选为25-40℃。

进一步地，所述步骤S2中，酶切反应的时间为2-30h；优选地，所述酶切反应时间为10～30h。

进一步地，所述制备方法还包括步骤S3、对酶切后的含有胰岛素前体的溶液进行等电点沉淀回收操作，得到纯度更高的胰岛素前体。

进一步地，所述步骤S3中，所述等电点回收操作为将酶切后的含有胰岛素前体的溶液pH值调节至4.6-4.8。

进一步地，所述等电点回收操作是在0～5℃下反应5～12h；优选地，所述等电点回收操作是在4℃下反应10h。

本发明的有益效果在于：本发明方案直接从发酵液中直接制备去B链30位氨基酸残基的胰岛素前体，通过直接对重组人胰岛素类似物前体进行酶切，避免了直接从酵母发酵液中纯化时需要对发酵液进行稀释或超滤，且不必对发酵液进行纯化，大大简化了操作流程；通过等电点沉淀回收后对获得的沉淀进行脂肪酸侧链修饰，避免了传统方法存在的影响修饰效率的问题；通过本发明方案制备胰岛素前体设备投入低且工艺过程收率高，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1不同操作处理后制得的重组人胰岛素DesB³⁰的HPLC图谱：(A)酶切；(B)等电点沉淀后取上清液；(C)等电点沉淀后将沉淀溶解；

图2为本发明对比例1不同操作处理后制得的重组人胰岛素DesB³⁰的HPLC图谱：(A)酶切；(B)等电点沉淀后取上清液；(C)等电点沉淀后将沉淀溶解；

图3为本发明实施例2不同操作处理后制得的门冬胰岛素DesB³⁰的HPLC图谱：(A)酶切；(B)等电点沉淀后取上清液；(C)等电点沉淀后将沉淀溶解；

图4为本发明实施例3不同酶量酶切后的HPLC图谱：(A)0.2U/g；(B)2U/g；(C)5U/g；

图5为本发明实施例4不同pH值条件下酶切后的HPLC图谱：(A)pH＝8.0；(B)pH＝9.5；(C)pH＝10.5；

图6为本发明实施例5不同温度条件下酶切后的HPLC图谱：(A)15℃；(B)37℃；

图7为本发明实施例6的不同方法制得的重组人胰岛素DesB³⁰后修饰制得的地特胰岛素的HPLC图谱：(A)对比例1方案制备；(B)实施例1方案制备。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明实施例1为：一种胰岛素前体的制备方法，包括以下步骤：将参照中国发明专利文件CN105111304B说明书第4页第[0037]～[0038]段的步骤制得的胰岛素前体蛋白发酵液(重组人胰岛素发酵液中重组胰岛素前体的含量为3.45g/L(摩尔质量为7043g/mol))，利用此发酵液，按照5U/g胰岛素前体加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mMTris，调节pH至9.0，控制温度至30摄氏度，搅拌酶切20h，然后用高效液相色谱法(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)检测酶切后上清液中DesB³⁰ (摩尔质量为5707g/mol)，检测结果如图1(A)所示，计算DesB³⁰浓度为2.43g/L。

以发酵液中重组胰岛素前体的含量计算摩尔收率为88.45%。

本发明对比例1为：利用实施例1中制得的胰岛素前体蛋白发酵液，参照专利申请文件CN 105153294A教导的采用Capto MMC纯化重组人胰岛素前体蛋白，收率84.5%，收集液中重组人胰岛素前体浓度为7.2g/L。按照5U/g胰岛素前体蛋白加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mM Tris，调节pH至9.0，控制温度至30摄氏度，搅拌酶切20h，最后用HPLC检测酶切后上清液中DesB³⁰的浓度为4.89g/L，检测结果如图2(A)所示，以发酵液中重组胰岛素前体的含量计算摩尔收率为74.75%。

将实施例1和对比例1酶切后的溶液调节pH至4.7，4摄氏度过夜(约10h)沉淀，将沉淀上清用HPLC检测(分别如图1(B)和图2(B)所示)，分别测得上清中DesB³⁰的残留量约20.5%和21.2%。通过对比实施例1与对比例1可以发现两种方式的沉淀效率基本相当，表明采用本发明方案进行发酵液的直接酶切制备DesB³⁰对后续沉淀获得DesB³⁰固体物无影响。

将上述操作沉淀获得的重组胰岛素DesB³⁰分别用0.01mol/L HCl溶解后，通过HPLC检测纯度(分别如图1(C)和图2(C)所示)，测得的重组胰岛素DesB³⁰固体的纯度分别为92.8%和93.6%。

综上所述，通过对比实施例1与对比例1可以发现两者酶切效率基本一致，酶切产物纯度基本一致，但本发明方案节省了纯化步骤，制备工艺大大简化，而且避免了纯化步骤的收率损失，从而直接提高了DesB³⁰的摩尔收率。

本发明实施例2为：一种胰岛素前体的制备方法，包括以下步骤：门冬胰岛素前体蛋白发酵液参照中国发明专利申请文件CN 105087724A实施例1制备。制备获得的门冬胰岛素发酵液含量为4.45g/L。利用此发酵液，按照3U/g胰岛素前体加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mM Tris缓冲液，调节pH至9.5，控制温度至37摄氏度，搅拌酶切20h，最后用HPLC检测酶切后上清液中DesB³⁰的浓度为3.24g/L，色谱图如图3(A)所示。

以发酵液中重组胰岛素前体的含量计算摩尔收率为90.11%。

将酶切后的溶液调节pH至5.5，4摄氏度过夜沉淀，取沉淀上清液用HPLC检测，如图3(B)所示，上清中门冬胰岛素DesB³⁰的残留量约12.5%。

将DesB³⁰沉淀用0.01M HCl溶解后，HPLC检测纯度，获得的门冬胰岛素DesB³⁰固体的纯度为89.8%；色谱图如图3(C)所示。

本发明实施例3为：酶切条件对酶切效果的影响：取实施例2制得的发酵液，分别按照0.2U/g、0.5U/g、2U/g、4U/g和5U/g门冬胰岛素前体蛋白加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mM Tris，调节pH至9.5，控制温度至30摄氏度，搅拌酶切10h、15h以及20h分别取样，最后HPLC检测酶切后上清液中DesB³⁰的峰面积比例(其中，0.2U/g、2U/g和5U/g的色谱图如图4(A)、4(B)和4(C)所示)，计算结果如下表1所示：

表1酶用量及酶切时间对酶切效果的影响实验数据表

酶用量	10h	15h	20h
				0.2U/g	7.20%	37.64%	47.07%
0.5U/g	19.13%	60.13%	80.33%
				2U/g	22.03%	66.75%	82.43%
4U/g	28.05%	70.81%	84.12%
				5U/g	30.75%	73.21%	84.92%

由上表可以看出随着酶切时间的延长，DesB³⁰的量越来越多，但随着时间的延长其增长速度越来越慢。同时4U/g和5U/g酶用量最终得到DesB³⁰的量也相差不大，这表明酶用量对于DesB³⁰的量影响较小。因此，综合考虑酶切过程的稳定性和确保酶切的效率，酶的用量在0.5-4U/g胰岛素前体较适宜，酶切时间在10-30h较适宜。

本发明实施例4为：不同酶切pH值对酶切效果的影响：取实施例2制得的发酵液，利用此发酵液，按照3U/g门冬胰岛素前体加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mM Tris，分别调节pH至8.0、9.5和10.5，控制温度至37摄氏度，搅拌酶切15h分别取样，最后用HPLC检测得酶切后上清液中DesB³⁰的峰面积比例分别为42.25%、78.92%和53.62%，色谱图分别如图5(A)、5(B)和5(C)所示，由上述测试结果可以看出采用9.5的pH值时，酶切效果最佳。

本发明实施例5为：不同酶切温度对酶切效果的影响：取实施例1制得的发酵液，利用此发酵液，按照2U/g胰岛素前体加入重组赖氨酰内切酶(Wako)，然后加入终浓度10mMTris，调节pH至9.5，控制温度分别为15摄氏度和37摄氏度，搅拌酶切20h，最后用HPLC检测酶切后上清液中DesB³⁰的峰面积比例分别为54.88%和89.79%，色谱图如图6(A)和6(B)所示，由上述测试结果可以看出采用37℃时，酶切效果最佳。

实施例6：不同方式制备的DesB³⁰重组人胰岛素前体制备地特胰岛素的对比：按照刘海峰(《重组胰岛素前体转化成人胰岛素和地特胰岛素的工艺研究》，华东理工大学，2014)博士论文的教导，在完全相同的条件下，将对比例1和实施例1中制备的DesB³⁰重组人胰岛素前体进行修饰制备地特胰岛素，对修饰制备的样品进行HPLC检测分析，色谱图如图7(A)和7(B)所示，其中，地特胰岛素的峰面积比分别为69.39%和71.72%，两者无显著差异。

本发明中，所称“赖氨酰肽链内切酶”为其通用名称，系指可以切割赖氨酸残基的一类蛋白酶，其国际分类编号EC编码为3.4.21.50。

上述实施例中，HPLC检测过程中的参数设置如下：

C18反相层析条件为：流动相A为0.1%三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)，流动相B为0.1%TFA+100%乙腈，超声脱气20min，进样量20μl，流速1.0ml/min，15%B平衡，线性梯度洗脱程序为0～20min，15～50%(B)。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种胰岛素DesB³⁰的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、向胰岛素前体蛋白的发酵液中添加蛋白酶；

S2、调节步骤S1处理后的溶液的pH值和温度使蛋白酶进行酶切，酶切后得到含有胰岛素DesB³⁰的溶液；

所述蛋白酶为赖氨酸酰肽链内切酶；所述赖氨酸酰肽链内切酶的用量为0.5～5U/g胰岛素前体蛋白；

步骤S2中，所述pH值为8.0～10.0，所述温度为15～37℃，所述酶切的反应时间为15-20h。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述赖氨酸酰肽链内切酶的用量为0.5～4U/g胰岛素前体蛋白。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中所述pH值为9.0～10.0。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述温度为20～37℃。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述温度为25-37℃。

6.根据权利要求1-5任一项所述的胰岛素DesB³⁰的制备方法，其特征在于：所述制备方法还包括步骤S3、对酶切后的含有胰岛素DesB³⁰的溶液进行等电点沉淀回收操作，得到纯度更高的胰岛素DesB³⁰。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述等电点沉淀回收操作是在4℃下反应10h。