CN105377882A - 宿主细胞和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及经遗传修饰的宿主细胞，特别是酵母细胞，其包含至少一种编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的分离的多核苷酸，以及至少一种编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的分离的多核苷酸。本文中还提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含至少一种编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的分离的多核苷酸，至少一种编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的分离的多核苷酸，以及至少一种编码内质网氧化还原素(Ero1)或具有至少一种Ero1功能活性的其片段和/或变体的分离的多核苷酸。

Description

宿主细胞和使用方法

发明领域

本发明属于生物化学工程领域。更具体地，本发明涉及经遗传修饰的宿主细胞和用于在它们中产生多肽的方法。

发明背景

可在多种宿主细胞中表达治疗性多肽和蛋白质，包括细菌细胞、大肠杆菌细胞、真菌或酵母细胞、微生物的细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。真菌宿主如甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)具有用于治疗性蛋白质表达的独特优势：例如，它不分泌大量的内源性蛋白质，它具有较强的可诱导启动子，它可在确定成分化学培养基中生长，且它可以产生高滴度的重组蛋白(Cregg等,Mol.Biotech.16:23-52(2000))。已将酵母和丝状真菌成功用于产生胞内和分泌的重组蛋白(Cereghino,J.L.和J.M.Cregg2000FEMSMicrobiologyReviews24(1):4566；Harkki,A.,等1989Bio-Technology7(6):596；Berka,R.M.,等1992Abstr.PapersAmer.Chem.Soc.203:121-BIOT；Svetina,M.,等2000J.Biotechnol.76(23):245-251。酿酒酵母是用于表达重组人血清清蛋白(HSA)的一种突出的宿主细胞。然而，表达包括与HAS遗传融合的多肽在内的其他治疗性多肽面临着重组蛋白的低滴度的技术障碍。

如此，需要能以高滴度重组蛋白产生异源肽、多肽和/或蛋白质的宿主细胞，特别是酿酒酵母菌株。

发明概述

在本发明的一个方面，提供经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码杀伤表达蛋白酶(KillerExpressionprotease,Kex2p)或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，以及编码蛋白二硫化物异构酶(ProteinDisulfide-Isomerase,Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸。本文中还提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，以及编码内质网氧化还原素(Oxidoreductin)(Ero1)或具有至少一种Ero1功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸。

在另一个方面，本发明提供经遗传修饰的宿主细胞，当在培养物中培养所述经遗传修饰的宿主细胞时，其表达或过表达所述至少一种分离的多核苷酸的至少一种基因产物，所述多核苷酸编码选自以下的蛋白质或具有所述蛋白质的至少一种功能活性的其片段和/或变体：Kex2p、Pdi1和Ero1。本发明的另一个方面提供经遗传修饰的宿主细胞，当在培养物中培养所述经遗传修饰的宿主细胞时其相比于野生型宿主细胞过表达选自Kex2p、Pdi1和Ero1的至少两种蛋白质或所述至少两种蛋白质的具有至少一种功能活性的其片段和/或变体，其中所述野生型宿主细胞属于同一物种且在相同培养条件下培养，但不过表达选自Kex2p、Pdi1和Ero1的至少两种基因产物。宿主细胞可以是原核或真核的。宿主细胞的例子可包括但不限于：HeLa、CHO、COS、HEK293、THPI、酵母和昆虫细胞。在具体的实施方案中，哺乳细胞是仓鼠、人或鼠细胞。在一个特定的实施方案中，细胞是CHO细胞系、HEK293细胞系或BHK细胞系。

本文中还提供产生重组多肽的方法，包括培养本发明的宿主细胞。在另一个方面，本发明提供通过本发明的方法制备的重组多肽。本文中还提供包含通过本发明的方法制备的重组多肽的药物组合物。在本发明的另一个方面，提供治疗有此需要的患者的方法，包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物。

附图简述

图1：创建产生阿必鲁肽(albiglutide)的菌株的预备主细胞库(PreliminaryMasterCellBank)。从KEX2-KanMX表达盒PCR产物至BXP10KEX2PDIERO1生产宿主的步骤是序贯整合表达盒以构建过程IV(ProcessIV)宿主菌株BXP10_KEX2_PDI_ERO1。在转化pCID3610质粒后，选择最终生产克隆并用于制备预备主细胞库(PCB)。

图2：宿主菌株中PDI1和KEX2的Southern印迹分析。内源性KEX2和PDI1基因分别以单拷贝(野生型)位于染色体XIV和III中。在染色体XII中的野生型下显示整合的靶位点。每个基因的检测探针显示为实心矩形。

图3：来自宿主菌株的Pdi1和Kex2p的Western印迹分析。道中的样品，第1-5道：BXP10-KEX2-PDI1菌株的5个克隆；PDI：过表达Pdi1的BXP10；KEX2：过表达Kex2p的BXP10；和BXP10：作为对照的宿主菌株。加载等量的蛋白质。

图4：来自振动平板测试的12份上清液样品的SDS-PAGE。凝胶中的道；L：SeeBlue2预染色的蛋白质梯(Invitrogen)；RS：pCID3610蛋白的参照标准；1-12：表达pCID3610的12个亚克隆。

图5：在DasGip发酵运行中产生的pCID3610蛋白的滴度(A)和质量(B)的分析。将pCID3610蛋白的上清液滴度产率(yield)和6-AA水平(％)与作为对照的BXP10-KEX2-PDI1比较，后者是过表达Kex2p和Pdi1的BXP10。

图6：从研究细胞库小瓶(ResearchCellBankVial)细胞生成的生长曲线。

图7：从预备主细胞库(Pre-MasterCellBank)细胞生成的生长曲线。

发明详述

如本文中使用的“宿主细胞”指已导入(例如转化、感染或转染)有分离的多核苷酸序列或能够用分离的多核苷酸序列导入(例如转化、感染或转染)的细胞。本发明的宿主细胞可包括但不限于，细菌细胞、真菌细胞、酵母细胞、微生物的细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。本发明的具有酵母和/或丝状真菌起源的宿主细胞可包括但不限于以下科、属和种：巴斯德毕赤酵母、Pichiafinlandica、Pichiatrehalophila、Pichiakoclamae、Pichiamembranaefaciens、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、Pichiaminuta(Ogataeaminuta、Pichialindneri)、Pichiaopuntiae、Pichiathermotolerans、Pichisalictaria、Pichiaguercum、Pichiapijperi、Pichiastiptis、毕赤酵母属菌种(Pichiasp.)、Saccharomycescastelii、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、克鲁维酵母(Saccharomyceskluyveri)、酵母属菌种(Saccharomycessp.)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)、Schizosaccharomycescryophilus、裂殖酵母属菌种(Schizosaccharomycessp.)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、克鲁维酵母属菌种(Kluyveromycessp.)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、假丝酵母属菌种(Candidasp.)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、里氏木霉(Trichodermareesei)、Chrysosporiumlucknowense、镰刀霉菌种(Fusariumsp.)、Fusariumgramineum、镶片镰孢(Fusariumvenenatum)、Physcomitrellapatens、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、Arxulaadeninivorans、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、和粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)。

如本领域已知的，“转化”是经由外部DNA或RNA的导入对生物体的基因组或附加体的定向修饰，或外部DNA或RNA的任何其他稳定导入。

如本领域中已知的，“转染”是将外部DNA或RNA(包括但不限于重组DNA或RNA)导入微生物。

如本领域中已知的，“同一性”是两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列(视情况而定)之间的关系，如通过比较所述序列来确定的。在本领域中，“同一性”还意指多肽或多核苷酸序列(视情况而定)之间的序列相关性程度，如由这类序列的串之间的匹配所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”，包括但不限于以下描述的那些(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.编,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.编,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,PartI,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987；和SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.编,MStocktonPress,NewYork,1991；及Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.,48:1073(1988)。测定同一性的方法设计为给出所测试序列之间的最大匹配。而且，测定同一性的方法汇编在公开可获的计算机程序中。测定两序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux,J.,等,NucleicAcidsResearch12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)。BLASTX程序从NCBI和其他来源公开可获(BLASTManual,Altschul,S.,等,NCBINLMNIHBethesda,MD20894；Altschul,S.,等,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。还可以使用著名的SmithWaterman算法来测定同一性。

用于多肽序列比较的参数包括以下：算法：Needleman和Wunsch,J.MolBiol.48:443-453(1970)比较矩阵：来自Hentikoff和Hentikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:10915-10919(1992)的BLOSSUM62

缺口罚分：12

缺口长度罚分：4

与这些参数可用的程序公开可获为来自GeneticsComputerGroup,MadisonWI的"gap"程序。前述参数是用于肽比较的缺省参数(以及末端缺口无罚分)。

用于多核苷酸比较的参数包括以下：算法：Needleman和Wunsch,J.MolBiol.48:443-453(1970)

比较矩阵：匹配＝+10，错误匹配＝0

缺口罚分：50

缺口长度罚分：3

获得：来自GeneticsComputerGroup,MadisonWI的"gap"程序。这些是用于核酸比较的缺省参数。

下面(1)和(2)中提供了多核苷酸和多肽(视情况而定)的“同一性”的含义。

(1)多核苷酸实施方案还包括包含与参照序列(例如SEQIDNO:3)具有至少50,60,70,80,85,90,95,97或100％同一性的多核苷酸序列的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸序列可以与SEQIDNO:3的参照序列相同，或可以与参照序列相比包含多达特定整数数目的核苷酸改变，其中所述改变选自下组：至少一个核苷酸缺失、取代(包括转换和颠换)或***，其中所述改变可发生在参照核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任意处，单个地散布在参照序列中的核苷酸中或者散布在参照序列内的一个或多个连续组中，且其中所述核苷酸改变数通过将SEQIDNO:3中的核苷酸总数乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从所述SEQIDNO:3中的核苷酸总数减去该乘积来确定，或：

nn≤xn-(xn·y),

其中n_n是核苷酸改变的数目，x_n是SEQIDNO:3中的核苷酸总数，y对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘法算子的符号，且其中x_n与y的任何非整数乘积在从x_n减去其之前被向下取整至最接近的整数。编码多肽的多核苷酸序列的改变可以在该编码序列中创建无义、错义或移码突变，由此在这类改变后改变由多核苷酸编码的多肽。

(2)多肽实施方案还包括分离的多肽，其包含与多肽参照序列如SEQIDNO:1具有至少50,60,70,80,85,90,95,97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以与参照序列相同，或可以与参照序列相比包含多达特定整数数目的氨基酸改变，其中所述改变选自下组：至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或***，其中所述改变可发生在参照多肽序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任意处，单个地散布在参照序列中的氨基酸中或者散布在参照序列内的一个或多个连续组中，且其中所述氨基酸改变数通过将氨基酸总数乘以定义百分比同一性的整数除以100，然后从所述氨基酸总数减去该乘积来确定，或：

na≤xa-(xa·y),

其中n_a是氨基酸改变的数目，x_a是序列中的氨基酸总数，y对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘法算子的符号，且其中x_a与y的任何非整数乘积在从x_a减去其之前被向下取整至最接近的整数。

“分离的”意指“通过人工”从其天然状态改变，即如果其存在于自然界中，其被从其初始环境改变或取出，或两者皆有。例如，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，自其天然状态的共存材料分离的同一多核苷酸或多肽才是“分离的”，包括但不限于，当这类多核苷酸或多肽被导入回到细胞中时。

“分离的”或“基本纯的”核酸或多核苷酸(例如RNA、DNA或混合的聚合物)是与天然伴随天然多核苷酸于其天然宿主细胞中、与其天然联合的其他细胞组分(例如核糖体、聚合酶和基因组序列)基本分离的核酸或多核苷酸。该术语涵盖以下核酸或多核苷酸，其(1)已从其天然存在的环境取出，(2)不与其中自然发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分联合，(3)可操作地连接于在自然界中其不连接的多核苷酸，或(4)在自然界中不存在。术语“分离的”或“基本纯的”还可用于指重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物、或通过异源***生物学合成的多核苷酸类似物。

然而，“分离的”不一定要求这样描述的核酸或多核苷酸本身已从其天然环境中物理上取出。例如，如果将异源序列置于内源核酸序列附近，使得该内源核酸序列的表达被改变(例如增加、降低或消除)，那么生物体基因组中的该内源核酸序列在本文中被视为“分离的”。在此背景中，异源序列是不天然临近于内源核酸序列的序列，不管该异源序列本身是内源(源自相同宿主细胞或其后代)还是外源的(源自不同宿主细胞或其后代)。举例而言，启动子序列可取代宿主细胞基因组中基因的天然启动子(例如通过同源重组)，从而使得该基因具有改变的表达模式。该基因现将变为“分离的”，因为其与天然侧接其的至少一些序列分离。

如果核酸含有不天然发生在基因组中相应核酸中的任何修饰，则该核酸也被视为“分离的”。例如，如果内源编码序列含有人工(例如通过人干预)引入的***、缺失或点突变，则该序列被视为“分离的”。“分离的核酸”还包括在异源位点整合到宿主细胞染色体中的核酸和作为附加体存在的核酸构建体。而且，“分离的核酸”可以基本没有其他细胞材料，或当通过重组技术产生时基本没有培养基，或当化学合成时基本没有化学前体或其他化学物。

如本文中使用的，“编码功能基因产物的核酸序列”指基因编码部分的任意部分。核酸序列编码的功能基因产物可以是酶的一部分，其能实现全酶或完整酶的至少一种活性。

如本文中使用的，“表达至少一种基因产物必需的核酸”指编码基因任意部分和/或可操作地连接于编码基因产物的核酸但不一定包含编码序列的核酸序列。例如，表达至少一种基因产物必需的核酸序列包括但不限于，增强子、启动子、调控序列、开始密码子、终止密码子、多腺苷酸化序列、和/或编码序列。

如本文中使用的，“蛋白酶解”或“负责细胞中蛋白酶解的基因产物”指能够导致至少一种肽、多肽和/或蛋白质的切割的任意肽、多肽、蛋白质和/或酶或其部分。负责蛋白酶解的基因产物可以是直接负责切割(即肽酶)，或者它可以作为肽酶合成途径的一部分间接负责。负责细胞中蛋白酶解的基因产物的例子包括但不限于，天冬氨酰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、分泌的天冬氨酰蛋白酶、分泌的丝氨酸蛋白酶、酵母甲基营养型蛋白酶、DPPIV样内肽酶、金属内肽酶、Prb1样丝氨酸蛋白酶、Prb1丝氨酸蛋白酶和CPY样羧肽酶。还有，包括在该定义中的是可从细胞分泌，但仍保留其一些或所有蛋白酶解活性的蛋白酶，如分泌的丝氨酸蛋白酶。分泌的蛋白酶可以负责细胞内和/或细胞外部的蛋白酶解。

如本文中使用的，“糖基化”或“负责细胞中糖基化的基因产物”指涉及在细胞中至少一种糖模块对多肽的添加或至少一种糖链的延长的任意肽、多肽、蛋白质和/或酶或其部分。负责细胞中糖基化的基因产物可以是直接负责细胞中糖对多肽的添加，例如但不限于甘露糖基转移酶。甘露糖基转移酶可以将来自Dol-P-Man的残基转移至肽、多肽和/或蛋白质上的丝氨酸和/或苏氨酸残基，或者可以作用于将来自GPD-Man的甘露糖残基转移至糖，如此延长糖链。或者，负责糖基化的基因产物可以是糖基化途径的部分且可以间接负责细胞中多糖对多肽的添加。负责细胞中糖基化的基因产物的例子包括但不限于甘露糖基转移酶。

“多核苷酸”一般指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于，单链和双链DNA，作为单链和双链区或单链、双链和三链区混合物的DNA，单链和双链RNA，和作为单链和双链区混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂合体分子，其可以为单链或更通常为双链或三链区或单链和双链区混合物。另外，如本文中使用的“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。这类区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。区域可包含全部的一种或多种分子，但更通常仅涉及一些分子的某区域。三重螺旋区的分子之一经常是寡核苷酸。如本文中使用的，术语“多核苷酸”还包括包含一种或多种经修饰碱基的上文描述的DNA或RNA。如此，具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中意图的那样。而且，包含不寻常的碱基(如肌苷)或经修饰的碱基(如三苯甲基化碱基)(仅举两个例子)的DNA或RNA是多核苷酸，如该术语在本文中使用的那样。将领会已经对DNA和RNA进行很多种修饰，其满足本领域技术人员已知的许多有用目的。术语“多核苷酸”在其在本文中采用时涵盖多核苷酸的这类经化学、酶或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”还涵盖经常称为寡核苷酸的短的多核苷酸。

“多肽”指包含通过肽键或经修饰的肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任意肽或蛋白质。“多肽”指常称为肽、寡肽和寡聚体的短链和一般称为蛋白质的更长链两者。多肽可包含除20种基因编码氨基酸以外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程(如加工和其他翻译后修饰)修饰的那些以及通过化学修饰技术修饰的那些。这类修饰在基础教科书中和更具体的专论以及大量研究文献中有详细记载，且其是本领域技术人员公知的。将领会同一类型的修饰在给定多肽的几个位点可以相同或不同程度存在。还有，给定的多肽可包含许多修饰类型。修饰可发生在多肽中的任一处，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。修饰包括，例如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素模块的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、gamma-羧化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化(racemization)、糖基化、脂质附接、硫酸化、谷氨酸残基的gamma-羧化、羟基化和ADP-核糖基化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转运RNA介导的对蛋白质添加氨基酸，诸如精氨酰化(arginylation)，和泛素化(ubiquitination)。参见，例如PROTEINS-STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES,2ndEd.,T.E.Creighton,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1993)和Wold,F.,PosttranslationalProteinModifications:PerspectivesandProspects,pgs.1-12inPOSTTRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS,B.C.Johnson编,AcademicPress,NewYork(1983)；Seifter等,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)和Rattan等,ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992)。在进行或不进行分支化(branching)的情况下，多肽可以是分支的或环状的。环状、分支或分支环状多肽可源自翻译后天然过程，而且也可通过完全合成方法制备。

“变体”在该术语在本文中使用时是与参照多核苷酸或多肽分别不同但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变体与另一个参照多核苷酸在核苷酸序列上不同。变体核苷酸序列中的变化可以改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可引起由参照序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下文论述的。多肽的典型变体与另一参照多肽在氨基酸序列中不同。一般而言，不同之处是有限的，从而使得参照多肽和变体的序列总体上极其相似，且在许多区域相同。变体和参照多肽在氨基酸序列中差异可在于任意组合的一个或多个取代、添加、缺失。取代或***的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的残基。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的(如等位基因变体)，或者它可以是已知不天然存在的变体。本发明还包括本发明的每种多肽的变体，其是与参照序列的不同之处在于保守氨基酸取代的多肽，其中残基被另一个具有类似特征的残基取代。典型的这类取代为在Ala、Val、Leu和Ile中；在Ser和Thr中；在酸性残基Asp和Glu中；在Asn和Gln中；和在碱性残基Lys和Arg中；或在芳香族残基Phe和Tyr中。具体地，存在其中几个(5-10、1-5、1-3、1-2或1个)氨基酸被以任意组合取代、缺失或添加的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或直接合成来制备。变体还可包括但不限于，具有其一个或多个其氨基酸侧链基团的化学修饰的多肽或其片段。化学修饰包括但不限于，添加化学模块，创建新键，和除去化学模块。氨基酸侧链基团处的修饰包括但不限于，赖氨酸-ε-氨基基团的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基基团的修饰包括但不限于，脱-氨基、N-低级烷基(alkyl)、N-双-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基基团的修饰包括但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。此外，可通过有普通技术的蛋白质化学家已知的保护性基团来保护一种或多种侧链基团或末端基团。

如本文中使用的，“片段”在提到多肽使用时指具有与完整的天然存在多肽的部分而非整个氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。如本文中使用的“片段”在提到多核苷酸或核酸序列使用过时，指编码以下氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列与完整的天然存在多肽的部分而非整个氨基酸序列的部分。片段可以是“独立的(free-standing)”或包含在更大多肽内的，其中该片段形成一部分或区域作为单个更大多肽中的单个连续区域。举例而言，天然存在的GLP-1的片段将包含天然存在的氨基酸1至36的氨基酸7至36。此外，多肽的片段还可以是天然存在的部分序列的变体。例如，包含天然存在的GLP-1的氨基酸7-36的GLP-1片段还可以是在其部分序列内具有氨基酸取代的变体。再举例而言，“片段”可以指本文中描述的任意异源多肽或编码所述多肽的核酸(包括但不限于Kex2p、Pdi1和Ero1)，其中所述片段保留所述野生型多肽或酶的至少一种功能活性。

如本文中使用的，“缀合”或“缀合的”指彼此结合的两个分子。例如，第一多肽可以共价或非共价结合第二多肽。第一多肽可通过化学接头共价结合于或可以遗传融合于第二多肽，其中第一和第二多肽共享共有的多肽主链。在本发明的宿主细胞中表达的重组多肽可包含缀合于人血清清蛋白的至少一种治疗性多肽。其他缀合物可包括但不限于，缀合于转铁蛋白、单链可变域和/或抗体的至少一个Fc区的至少一种治疗性多肽。缀合物可以包含或不包含接头。

如本文中使用的，“串联取向的”指作为同一分子一部分彼此相邻的两个或更多个多肽。它们可以共价或非同价连接。两个或更多个串联取向的多肽可形成同一多肽主链的部分。串联取向的多肽可以具有直接或倒转取向和/或可以被其他氨基酸序列分开。

如本文中使用的，“阿必鲁肽”指一种重组融合蛋白，其由与重组人血清连续遗传融合的、经修饰的人胰高血糖素样肽1的30个氨基酸序列(GLP-1，片段7-36(A8G))的2拷贝组成。阿必鲁肽的氨基酸序列如下显示为SEQIDNO：1。

HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRHGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR60

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAE120

NCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPE180

VDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLL240

PKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT300

KVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMP360

ADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEK420

CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVS480

TPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTE540

SLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKA600

TKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL674

(SEQIDNO：1)

“重组表达***”指引入、转染或转化到宿主细胞或宿主细胞裂解物中以产生本发明的多核苷酸和多肽的本发明的表达***或其部分或多核苷酸。

如本文中使用的，“清蛋白融合蛋白”包含治疗性多肽的至少一个片段或变体和人血清清蛋白的至少一个片段或变体，它们彼此联合，优选通过基因融合。

具有GLP-1活性的多肽可包含人GLP-1的至少一种片段和/或变体。人GLP-1的两个天然存在片段示于SEQIDNO:2。

其中：位于第37位的Xaa是Gly(下文中称为“GLP-1(7-37)”)，或–NH₂(下文中称为“GLP-1(7-36)”)。GLP-1片段可包含但不限于，包含或组成为人GLP-1的氨基酸7至36(GLP-1(7-36))的GLP-1分子。GLP-1或其片段的变体可包含但不限于在野生型GLP-1中或在SEQIDNO.:2显示的天然存在的GLP-1片段中的1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代。变体GLP-1或GLP-1片段可包括但不限于，类似于野生型GLP-1的丙氨酸8的丙氨酸残基的取代，这类丙氨酸被突变为甘氨酸(下文中称为“A8G”)(参见例如，美国专利No.5,545,618中公开的突变，本文通过提述完整并入)。

如本文中使用的，“KEX2”指编码称为“杀伤表达蛋白酶”或“Kex2p”(本文中亦称为“kexp”)的蛋白质的基因。Kex2p是涉及蛋白原(proprotein)加工的钙依赖性丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶在识别序列Arg-Arg/X和Lys-Arg/X的羧基端切割多肽。其他Kex2p活性包括但不限于，水解酶活性、金属离子结合活性、丝氨酸型内肽酶活性、肽酶活性和丝氨酸型肽酶活性。KEX的假名包括：Pcsk2,Pcsk4,kpc-1。酿酒酵母内肽酶(KEX2)基因具有GenBankIDNo.855483且编码NCBI蛋白序列RefSeqNP:014161.1。该KEX2基因在果蝇、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、E.gossypii、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、M.oryzae和粗糙链孢霉(N.crassa)中保守。KEX2的变体可以是与来自酿酒酵母的(KEX2)基因具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的多核苷酸，或编码具有与来自酿酒酵母的Kex2p有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质。Kex2p的功能片段和/或变体将保留Kex2p的至少一种功能，包括但不限于，在识别序列Arg-Arg/X和Lys-Arg/X的羧基端切割多肽的能力。来自酿酒酵母的KEX2的基因序列(SEQIDNO:3)和Kex2p的相应氨基酸序列(SEQIDNO:4)显示如下：

来源酿酒酵母

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如本文中使用的，“PDI”或“PDI1”指编码亦称为“蛋白质二硫化物异构酶”的“pdi”或“Pdi1p”的基因，该蛋白质二硫化物异构酶是在真核生物的内质网中在蛋白质折叠时催化蛋白质内半胱氨酸残基之间的二硫键的形成和断裂(WilkinsonB,GilbertHF(June2004)."Proteindisulfideisomerase".BiochimicaetBiophysicaActa1699(1-2):35–44和GruberCW,CemazarM,HerasB,MartinJL,CraikDJ(August2006)."Proteindisulfideisomerase:thestructureofoxidativefolding".TrendsinBiochemicalSciences31(8):455–64))且可充当分子伴侣蛋白(Wang,CC和Tsou,CLFASEBJ.1993Dec；7(15):1515-7)的酶。蛋白质二硫化物异构酶是一种存在于内质网腔中的多功能蛋白质，是形成分泌性和细胞表面蛋白质中的二硫键所必需的，解开(unscramble)非天然二硫键；与具有外切甘露糖苷酶活性的Mnl1p形成复合物，所述外切甘露糖苷酶活性将解折叠蛋白质结合的Man8GlcNAc2寡糖加工成Man7GlcNAc2，这促进解折叠蛋白质应答中的降解。Pdi1还具有氧化还原酶活性。来自酿酒酵母的Pdi1p由GenBankIDNO.850314编码。pdi的功能片段和/或变体可以是与NCBIRefSeqNP_009887的氨基酸序列具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的多肽，其由与GenBankIDNo.850314具有至少85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％序列同一性的多核苷酸编码，该多肽将保留Pdi的至少一种功能，包括但不限于，异构酶活性。Pdi1功能活性包括但不限于，催化二硫键的形成和/或断裂，帮助错误折叠蛋白质的正确折叠。PDI的假名包括：PDI1,PDIA2,Pdia3,P4HB,PADI1,Padi2,EUG1,NCU09223,SOAC1F5.02和AGOS_AFR718W。PDI1基因在人、恒河猴、犬、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、果蝇、蚊、秀丽隐杆线虫(C.elegans)、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、E.gossypii、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、M.oryzae、粗糙链孢霉(N.crassa)、拟南芥(A.thaliana)和稻中是保守的。(PDI1)能发挥功能。来自酿酒酵母的PDI的基因序列(SEQIDNO:5)和Pdi1的相应氨基酸序列(SEQIDNO:6)显示如下：

来源酿酒酵母

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MKFSAGAVLSWSSLLLASSVFAQQEAVAPEDSAVVKLATDSFNEYIQSHDLVLAEFFAPWCGHCKNMAPEYVKAAETLVEKNITLAQIDCTENQDLCMEHNIPGFPSLKIFKNSDVNNSIDYEGPRTAEAIVQFMIKQSQPAVAVVADLPAYLANETFVTPVIVQSGKIDADFNATFYSMANKHFNDYDFVSAENADDDFKLSIYLPSAMDEPVVYNGKKADIADADVFEKWLQVEALPYFGEIDGSVFAQYVESGLPLGYLFYNDEEELEEYKPLFTELAKKNRGLMNFVSIDARKFGRHAGNLNMKEQFPLFAIHDMTEDLKYGLPQLSEEAFDELSDKIVLESKAIESLVKDFLKGDASPIVKSQEIFENQDSSVFQLVGKNHDEIVNDPKKDVLVLYYAPWCGHCKRLAPTYQELADTYANATSDVLIAKLDHTENDVRGVVIEGYPTIVLYPGGKKSESVVYQGSRSLDSLFDFIKENGHFDVDGKALYEEAQEKAAEEADADAELADEEDAIHDEL(SEQIDNO：6)

PDI是细胞内质网腔中的常住蛋白。在酶细胞分布、其亚细胞定位及其形成特性上的一系列证据表明其在蛋白质生物合成和分泌途径中起作用(Freedman，1984，TrendsBiochem.Sci.9，pp.438-41)且这得到原位直接交联研究的支持(Roth和Pierce，1987，Biochemistry，26，pp.4179-82)。PDI有缺陷的微粒体膜显示蛋白质二硫化物形成中的特定缺陷的发现(Bulleid和Freedman，1988，Nature，335，pp.649-51)暗示该酶充当分泌性和细胞表面蛋白质的生物合成期间天然二硫键形成的催化剂。这一作用与已知的该酶在体外的催化特性一致；其催化硫醇：二硫化物交换反应，引起净蛋白质二硫化物形成、断裂或异构化，且能催化很多种还原的解折叠的蛋白质底物中的蛋白质折叠和天然二硫键形成(Freedman等，1989，Biochem.Soc.Symp.，55，pp.167-192)。已知几个物种中该酶的DNA和氨基酸序列(Scherens，B.等，1991，Yeast，7，pp.185-193；Farquhar，R.，等，1991，Gene，108，pp.81-89)且对于从哺乳动物肝纯化至同质的该酶的作用机制有越来越多的信息(Creighton等，1980，J.Mol.Biol.，142，pp.43-62；Freedman等，1988，Biochem.Soc.Trans.，16，pp.96-9；Gilbert，1989，Biochemistry28，pp.7298-7305；Lundstrom和Holmgren，1990，J.Biol.Chem.，265，pp.9114-9120；Hawkins和Freedman，1990，Biochem.J.，275，pp.335-339)。在目前涉及作为细胞中蛋白质折叠、组装和移位的介导物的许多蛋白质因子中(Rothman，1989，Cell59，pp.591-601)，PDI的不平常处在于具有定义明确的催化活性。

PDI从哺乳动物组织容易地分离，且同质的酶是具有特征性酸性pI(4.0-4.5)的同二聚体(2x57kD)(Hillson等,1984,MethodsEnzymol.,107,pp.281-292)。还已从小麦和藻类Chlamydomonasreinhardii纯化该酶(Kaska等,1990Biochem.J.268,pp.63-68)。该活性已在很多种来源中检测到，且在一项初步报告中，声称PDI活性可在酿酒酵母中检测到(Williams等,1968,FEBSLetts.,2,pp.133-135)。最近报告了许多PDI的完整氨基酸序列，大部分源自克隆的cDNA序列；这些包括来自大鼠(Edman等,1985,Nature,317,pp.267-270)、牛(Yamauchi等,1987,Biochem.Biophys.ReS.comm.,146,pp.1485-1492)、人(Pihlajaniemi等,1987,EMBOJ.,6,pp.643-9)、酵母(Scherens,B.,等，见上文；Farquhar,R.等，见上文)和鸡(Parkkonen等,1988,Biochem.J.,256,pp.1005-1011)的PDI。来自这些脊椎动物物种的蛋白质显示自始至终的高度序列保守程度，且均显示在大鼠PDI序列中首先注意到的几个总体特征(Edman等1985，见上文)。

在目标为分析二硫键形成以外的功能的工作中鉴定了对应于或紧密关联于PDI的序列。例如，有鲜明的证据表明PDI充当四聚体αβ-酶脯氨酰-4-羟化酶的β亚基，该酶催化E.R.内新生或新合成的前胶原多肽的主要翻译后修饰(Pihlajaniemi等,1987，见上文；Koivu等,1987,J.Biol.Chem.,262,pp.6447-49))。还有证据表明PDI参与用于共翻译N-糖基化的***(Geetha-Habib等,1988,Cell,4,pp.63-68)且最近提出该酶参与将甘油三酯转移至新生分泌性脂蛋白的复合物(Wetterau等,1990,J.Biol.Chem.,265,pp.9800-7)。如此，PDI在分泌性蛋白质的共翻译和翻译后修饰中可能是多功能的(Freedman,1989,Cell,57,pp.1069-72)。

增加细菌、酵母和昆虫细胞表达***中的Pdi1活性可导致含有二硫键的重组蛋白的增加的分泌。氨基酸序列显示于SEQIDNO:1的阿必鲁肽(ALB)由融合至人清蛋白的DPP-4抗性GLP-1二聚体组成。该蛋白含有8个二硫键。过表达Pdi1能改进SEQIDNO:1在宿主细胞中和/或从宿主细胞的正确折叠和分泌是可能的。

ERO1是编码ER氧化还原素1(Ero1)的基因，该ER氧化还原素1(Ero1)是催化真核生物内质网(ER)中蛋白质二硫键的形成和异构化的酶氧化还原酶。(FrandAR,CuozzoJW,KaiserCA(2000)."Pathwaysforproteindisulphidebondformation".TrendsCellBiol.10(5):203–10和FrandAR,KaiserCA(2000)."TwopairsofconservedcysteinesarerequiredfortheoxidativeactivityofEro1pinproteindisulfidebondformationintheendoplasmicreticulum".Mol.Biol.Cell11(9):2833–43)。来自酿酒酵母的ERO1具有NCBI基因IDNO.854909和NCBI蛋白质RefSeqNP_013576。ERO1的假名包括但不限于：ERO1L、ERO1LB、Ero1a、Ero1b、ero-1、NCU02074。ERO1基因在人、黑猩猩、恒河猴、犬、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、E.gossypii、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、M.oryzae、粗糙链孢霉(N.crassa)、拟南芥和稻中保守。ERO1活性包括但不限于，黄素腺嘌呤双核苷酸结合、氧化还原酶活性、蛋白质二硫化物异构酶活性、和硫醇氧化酶活性。Ero1的功能片段和/或变体将会是保留野生型Ero1的至少一种功能活性的多肽。

“内质网氧化还原素”或“ERO”是催化真核生物细胞的内质网中蛋白质二硫键的形成和异构化的氧化还原酶。二硫键形成是一个氧化过程。在蛋白二硫化物异构酶(PDI)催化新生多肽中的二硫键形成后，PDI在硫醇-二硫化物交换反应期间被还原。需要ERO来引入PDI的氧化等同物。在酿酒酵母中，内质网氧化还原素由ERO1编码。

来自酿酒酵母的ERO1的基因序列(SEQIDNO:7)和Ero1的相应氨基酸序列(SEQIDNO:8)显示如下：

来源酿酒酵母

来源酿酒酵母

MRLRTAIATLCLTAFTSATSNNSYIATDQTQNAFNDTHFCKVDRNDHVSPSCNVTFNELNAINENIRDDLSALLKSDFFKYFRLDLYKQCSFWDANDGLCLNRACSVDVVEDWDTLPEYWQPEILGSFNNDTMKEADDSDDECKFLDQLCQTSKKPVDIEDTINYCDVNDFNGKNAVLIDLTANPERFTGYGGKQAGQIWSTIYQDNCFTIGETGESLAKDAFYRLVSGFHASIGTHLSKEYLNTKTGKWEPNLDLFMARIGNFPDRVTNMYFNYAVVAKALWKIQPYLPEFSFCDLVNKEIKNKMDNVISQLDTKIFNEDLVFANDLSLTLKDEFRSRFKNVTKIMDCVQCDRCRLWGKIQTTGYATALKILFEINDADEFTKQHIVGKLTKYELIALLQTFGRLSESIESVNMFEKMYGKRLNGSENRLSSFFQNNFFNILKEAGKSIRYTIENINSTKEGKKKTNNSQSHVFDDLKMPKAEIVPRPSNGTVNKWKKAWNTEVNNVLEAFRFIYRSYLDLPRNIWELSLMKVYKFWNKFIGVADYVSEETREPISYKLDIQ″(SEQIDNO：8)

“微生物”意指(i)原核生物，包括但不限于，以下属的成员：链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特氏菌属(Bordetella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、Fancisella、巴斯德氏菌属(Pasturella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属(Streptobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺旋状菌属(Spirillum)、弯曲菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和支原体属(Mycoplasma)，且进一步包括但不限于，以下种或组的成员：组A链球菌、组B链球菌、组C链球菌、组D链球菌、组G链球菌、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、屎链球菌(Streptococcusfaecium)、耐性链球菌(Streptococcusdurans)、奈瑟氏***(Neisseriagonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)、***加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、Actinomyctesisraelii、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertusis)、副百日咳博多氏杆菌(Bordatellaparapertusis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、博德特氏菌(Bordetella)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、肺炎克雷伯氏菌(Kleibsiellapneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcessens)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、Shigelladysenterii、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、土拉弗朗西斯菌(Franscisellatularensis)、流产布氏杆菌(Brucellaabortis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomitis)，(ii)古菌(archaeon)，包括但不限于古细菌(Archaebacter)，和(iii)单细胞或纤维状真核生物，包括但不限于，原生动物，真菌，酵母属、克鲁维酵母属(Kluveromyces)或假丝酵母属(Candida)的成员，和酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyceslactis)或白色假丝酵母(Candidaalbicans)的种的成员。

“细菌”意指(i)原核生物，包括但不限于，以下属的成员：链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、博德特氏菌属(Bordetella)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线菌属(Actinomycetes)、链霉菌属(Streptomycetes)、诺卡氏菌属(Nocardia)、肠杆菌属(Enterobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、Fancisella、巴斯德氏菌属(Pasturella)、莫拉氏菌属(Moraxella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、布兰汉氏球菌属(Branhamella)、放线杆菌属(Actinobacillus)、链杆菌属(Streptobacillus)、李斯特菌属(Listeria)、鞘杆菌属(Calymmatobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属(Kleibsiella)、弧菌属(Vibrio)、变形杆菌属(Proteus)、欧文氏菌属(Erwinia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)、钩端螺旋体属(Leptospira)、螺旋状菌属(Spirillum)、弯曲菌属(Campylobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、军团菌属(Legionella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、衣原体属(Chlamydia)、包柔氏螺旋体属(Borrelia)和支原体属(Mycoplasma)，且进一步包括但不限于，以下种或组的成员：组A链球菌、组B链球菌、组C链球菌、组D链球菌、组G链球菌、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、屎链球菌(Streptococcusfaecium)、耐性链球菌(Streptococcusdurans)、奈瑟氏***(Neisseriagonorrheae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiptheriae)、***加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、Actinomyctesisraelii、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertusis)、副百日咳博多氏杆菌(Bordatellaparapertusis)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilusparainfluenzae)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、博德特氏菌(Bordetella)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、肺炎克雷伯氏菌(Kleibsiellapneumoniae)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcessens)、液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)、霍乱弧菌(Vibriocholera)、Shigelladysenterii、弗氏志贺菌(Shigellaflexneri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、土拉弗朗西斯菌(Franscisellatularensis)、流产布氏杆菌(Brucellaabortis)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(Clostridiumtetani)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridiumbotulinum)、梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)、立氏立克次体(Rickettsiarickettsii)和沙眼衣原体(Chlamydiatrachomitis)，(ii)古菌(archaeon)，包括但不限于古细菌。

如本文中使用的，“异源核酸序列”指***、转化或转染到感兴趣的宿主细胞或微生物中的核酸序列。异源核酸序列可以是多肽全部或部分的编码序列和/或它可以包含非编码调控元件，如启动子、增强子、核糖体结合元件或聚腺苷酸化区。异源核酸序列可以是不天然见于宿主细胞的核酸序列，如编码来自不同于宿主细胞的生物体、属或种的多肽的核酸序列。或者，异源核酸序列可以是宿主细胞基因组天然有的，但被***、转化或转染到宿主细胞中以增加天然核酸序列的功能或由所述核酸序列表达的多肽的表达。例如，野生型酿酒酵母可含有编码野生型Kex2p的核酸序列，但可将编码野生型Kex2p的异源核酸转化到所述酿酒酵母中以提高所述宿主细胞的Kex2p生产。类似地，野生型酿酒酵母可以含有编码野生型Kex2p的核酸序列，但可将来自不同生物体的编码Kex2p的异源核酸***所述酿酒酵母中以提高所述宿主细胞的Kex2p生产。本发明还涵盖含有以下异源核酸序列的宿主细胞，其为来自同一物种的宿主细胞的野生型核酸的变体和/或片段。

如本文中使用的，“重组多肽”及其语法变体指并非由被转化的目的宿主细胞或微生物天然合成，而是通过重组DNA引入所述宿主细胞或微生物中的多肽。例如，酿酒酵母可充当宿主细胞用于表达不存在于未经转化或未经转染酿酒酵母中的人血清清蛋白。重组多肽可包括经修饰以协助分离的多肽。

如本文中使用的，“亲和标签”指与分子联合的任何模块，其可以给予所述分子对另一物质或分子的选择性亲和力。例如，可将亲和标签用于协助分子的纯化，其通过为分子提供对柱的填充材料的选择性亲和力。亲和标签的非限制性例子是his标签。

核酸在其被置于与另一个核酸序列的功能性关系中时是“可操作连接的”。例如，如果编码前序列(presequence)或者分泌前导序列的DNA以参与多肽分泌的前蛋白表达，则它可操作地连接编码多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它可操作地连接编码序列；或者如果核糖体结合位点定位为使得促进翻译，则它可操作地连接编码序列。通常，“可操作地连接”意味着被连接在一起的DNA序列是连续的，而且在分泌前导序列的情况，是连续的且符合读码框的。但增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制位点处连接完成的。如果不存在这样的位点，按照常规做法使用合成寡核苷酸衔接头或接头。

如本文中使用的，“收获”细胞指从细胞培养物收集细胞。可以通过例如离心或过滤在收获期间浓缩细胞以将其从培养液分离。收获细胞可进一步包括裂解细胞以获得胞内材料(如但不限于多肽和多核苷酸)的步骤。熟练的技术人员应理解在培养期间可从细胞释放某些细胞材料，包括但不限于，异源表达的多肽。如此，感兴趣的产物(例如重组表达的多肽)在收获细胞后可以保持在培养液中。

还有，提供其中重组DNA构建体编码可选择标志物的方法。这类可选择标志物提供阳性或阴性选择。还提供以下方法，其包括表达所述可选择标志物并将由选择步骤的至少一种第一转化细胞产生的可选择标志物的量与由选择步骤的至少一种第二转化细胞产生的可选择标志物的量比较，其中所述第一和第二转化细胞产生相同的可选择标志物。如本领域理解的，可选择标志物包括但不限于，二氢叶酸还原酶(dhfr)、β-半乳糖苷酶、荧光蛋白、人胎盘碱性磷酸酶的分泌形式、beta-葡糖醛酸糖苷酶、酵母可选择标志物LEU2和URA3、凋亡抗性基因和反义寡核苷酸，以及赋予在存在以下抗生素时生长的能力的抗生素抗性基因，包括新霉素(neo)、卡那霉素、遗传霉素(geneticin)、潮霉素B、嘌呤霉素、zeocin、杀稻瘟素、诺尔丝菌素(nourseothricin)、双丙氨膦(bialaphos)、腐草霉素(phleomycin)和氨苄青霉素。如本领域中还理解的，可通过多种手段来分选细胞，包括但不限于，视觉检查或细胞分选器如BDFACSAria，其能检测可选择标志物的表达。

如本领域中理解的，术语“野生型”指存在于没有遗传修饰的天然群体中的宿主细胞或多肽或多核苷酸序列。例如，“野生型宿主细胞”指在宿主细胞的基因组中进行或发生任何遗传修饰之前的未经修饰的宿主细胞菌株。

如本文中使用的，“滴度”或“滴度产率”指溶液(例如培养液或细胞裂解混合物或缓冲液)中产物(例如重组表达的多肽)的浓度且通常表示为mg/L或g/L。滴度产率的增加可以指在两个限定的条件组下产生的产物浓度的绝对或相对增加。

如本文中使用的“肠降血糖素激素”意指加强胰岛素分泌或以另外方式增加胰岛素水平的任何激素。肠降血糖素激素的一个例子是GLP-1。GLP-1是由肠L细胞响应食物摄取而分泌的肠降血糖素。在健康的个体中，GLP-1在调节餐后血糖水平中起着重要作用，其通过刺激胰腺的葡萄糖依赖性胰岛素分泌，产生***区域中增加的葡萄糖吸收。GLP-1还抑制胰高血糖素分泌，导致降低的肝葡萄糖输出。另外，GLP-1延迟胃排空时间并延缓小肠能动性，导致延迟的食物吸收。GLP-1通过刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌中涉及的基因的转录和通过促进beta细胞新生来促进持续的beta细胞能力(competence)(Meier,等Biodrugs2003；17(2):93-102)。

如本文中使用的“GLP-1活性”意指天然存在的人GLP-1的一种或多种活性，包括但不限于，降低血液和/或血浆葡萄糖，刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌或者以另外方式提高胰岛素水平，抑制胰高血糖素分泌，降低果糖胺，增加葡萄糖对脑的投递和代谢，延迟胃排空，和促进beta细胞能力和/或新生。这些活性和与GLP-1活性有关的其他活性中的任一种可由具有GLP-1活性的组合物或GLP-1激动剂直接或间接导致。例如，具有GLP-1活性的组合物可直接或间接刺激葡萄糖依赖性而刺激胰岛素产生则可能间接降低哺乳动物中的血浆葡萄糖水平。

如本文中使用的“肠降血糖素模拟物”是能加强胰岛素分泌或以另外方式提高胰岛素水平的化合物。肠降血糖素模拟物可以能够在哺乳动物中刺激胰岛素分泌、增加beta细胞新生、抑制beta细胞凋亡、抑制胰高血糖素分泌、延迟胃排重和诱导饱足。肠降血糖素模拟物可包括但不限于，具有GLP-1活性的任意多肽，包括但不限于，exendin3和exendin4，包括其任意片段和/或变体和/或缀合物。

“域抗体”或“dAb”可以视为与“单可变域”相同，其能结合抗原。单可变域可以是人抗体可变域，但还包括来自其他物种如啮齿动物的单抗体可变域(例如如WO00/29004中公开的)、护士鲨和骆驼类V_HHdAb。骆驼类V_HH是源自骆驼(camel)、美洲驼羊(llama)、羊驼(alpaca)、单峰骆驼(dromedary)、和大羊驼(guanaco)在内的物种的免疫球蛋白单可变域多肽，其产生天然没有轻链的重链抗体。这类V_HH域可依照本领域中可获的标准技术人源化，且这类域被视为“域抗体”。如本文中使用的V_H包括骆驼类V_HH域。

短语“单可变域”指特异性结合抗原或表位的抗原结合蛋白可变域(例如V_H、V_HH、V_L)，该结合独立于不同的可变区或域。

如本文中使用的术语“抗原结合蛋白”指能结合抗原的抗体、抗体片段和其他蛋白构建体，如域，但不限于，可变域和域抗体。

如本文中使用的，在经遗传修饰的宿主细胞中比较的酶或其片段或酶活性的“降低的量”及其语法变体指一种经遗传修饰的宿主细胞，其与未经遗传修饰的宿主细胞相比产生更少的至少一种酶或显示更少的至少一种酶活性。通常，将由经遗传修饰的宿主细胞产生的酶活性与同一物种的遗传修饰之前的野生型菌株进行比较。然而，比较还可以在经遗传修饰的宿主和来自该属但为不同物种或菌株的野生型宿主之间或与另一种经遗传修饰的菌株进行比较。至少一种酶或酶活性的降低还包括完全消除至少一种酶或酶活性，其中所述至少一种酶中没有一种产生于经遗传修饰的宿主细胞和/或所述至少一种酶中没有一种是功能性的或显示活性。还包括在该定义中的是降低量的至少一种酶活性。亦即，具有超过一种活性的酶可以维持第一活性的量而同时降低同一酶的第二活性。

如本文中使用的，在经遗传修饰的宿主细胞中酶或其片段或酶活性的“增加的量”及其语法变体指一种经遗传修饰的宿主细胞，其与未经遗传修饰的宿主细胞相比产生更多的至少一种酶或显示更多的至少一种酶活性。通常，将由经遗传修饰的宿主细胞产生的酶活性与同一物种的遗传修饰之前的野生型菌株进行比较。然而，比较还可以在经遗传修饰的宿主和来自该属但为不同物种或菌株的野生型宿主之间或与另一种经遗传修饰的菌株进行比较。还包括在该定义中的是增加量的至少一种酶活性。亦即，具有超过一种活性的酶可以维持第一活性的量而同时增加同一酶的第二活性。另外，该术语包括除了宿主细胞产生的酶量以外，增加酶活性。例如，经遗传修饰的宿主细胞可以产生与由野生型宿主细胞产生的相同或相似量的酶或其片段和/或变体，如通过质量(mass)或量测量的，但在所述酶的至少一种功能活性的量中相比于野生型可以有可测量的增加。

如本文中使用的，术语“严格条件”和“严格杂交条件”意指杂交仅在序列之间有至少70％和至少80％，但至少95％同一性的情况下发生。严格杂交条件的一个例子是在42℃在包含以下的溶液中过夜温育：50％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x登哈特(Denhardt)溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/ml变性、剪切的鲑精DNA，接着在0.1xSSC中在约65℃清洗滤器。杂交和清洗条件是公知的且例示于Sambrook,等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.,(1989)，特别是其中第11章，通过提述由此将完整公开内容并入本文。

如本文中使用的，“遗传修饰”或“经遗传修饰的”指对细胞DNA序列的一个或多个碱基或片段的任何抑制、取代、删除和/或***。这类遗传修饰可体外(直接在分离的DNA上)或原位获得，例如通过遗传工程化技术或通过将细胞暴露于诱变剂。诱变剂包括例如，物理因素如能量射线(X-射线、γ-射线、UV等)或能与DNA的不同官能团反应的化学试剂，如烷化剂(EMS、NQO等)、双烷化剂、嵌入剂等。遗传修饰还可通过遗传破坏，例如依照Rothstein等公开的方法获得(Meth.Enzymol.194:281-301(1991))。依照该方法，将部分或全部基因经由同源重组替换为体外经修饰的型式。遗传修饰还可以通过在DNA序列上的任何突变***，如转座子、噬菌体等获得。还有，如本文中使用的“经遗传修饰的”可指编码多肽的基因或多肽，其分别在核酸或氨基酸中具有至少一个缺失、取代或抑制。例如，其中至少一个氨基酸从野生型形式被取代的多肽将视为经遗传修饰的。

可通过细胞机制逆转或减弱遗传修饰。或者，突变可以是非回复的或非渗漏的。“渗漏性突变”包括导致野生型功能部分而非完全失活的突变。

本发明的宿主细胞携带的遗传修饰可位于细胞DNA序列的编码区和/或影响基因表达的区域中。因此，本发明的修饰一般将影响涉及蛋白酶解和/或糖基化的蛋白质和/或酶的基因产物或基因产物的调控或促进。本发明的细胞蛋白酶解性切割和/或糖基化异源表达的多肽的能力降低可能是由于结构和/或构象变化，来自具有改变的生物学特性的一种或多种酶的产生，来自缺乏所述一种或多种酶的产生，或来自一种或多种酶以低水平产生。

本发明的遗传修饰还影响涉及本文中描述的Kex2p、Pdi1和ero1的任一种功能活性的蛋白质和/或酶的基因产物或基因产物的调控或促进。本发明的细胞正确折叠和分泌重组表达的多肽的增加的能力可能是由于涉及这些过程的酶具有改变的生物学特性或以高水平产生。

在本发明的一个方面，提供经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码杀伤表达(KEX)蛋白酶(Kex2p)或具有至少一种Kex2p蛋白酶功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，以及编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸。本发明的经遗传修饰的宿主细胞包括以下经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码内质网氧化还原素(ero1)或具有至少一种ERO功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸。

本发明的经遗传修饰的宿主细胞还包括以下经遗传修饰的宿主细胞，当所述经遗传修饰的宿主细胞在培养物中培养时，相比于第二宿主细胞，其表达或过表达至少一种分离的多核苷酸的至少一种基因产物，所述分离的多核苷酸编码选自下组的蛋白质和/或具有所述蛋白质的至少一种功能活性的其变体：Kex2p、Pdi1和Ero1，其中所述第二宿主细胞不表达或不过表达选自KEX、PDI和ERO的至少一种基因产物。本发明还包括以下经遗传修饰的宿主细胞，当所述经遗传修饰的宿主细胞在培养物中培养时，相比于第二宿主细胞，其过表达至少两种选自下组的蛋白质或具有所述蛋白质的至少一种功能活性的其片段和/或变体：Kex2p、Pdi1和Ero1，其中所述第二宿主细胞属于相同物种且在相同培养条件下培养但不过表达选自KEX、PDI和ERO的至少两种基因产物。在一些情况下，第二宿主细胞可具有遗传修饰，但不具有允许其表达或过表达至少一种分离的多核苷酸的至少一种基因产物的遗传修饰，所述分离的多核苷酸编码选自下组的蛋白质和/或具有所述蛋白质的至少一种功能活性的其变体：Kex2p、Pdi1或Ero1。在一些情况下，第二宿主细胞可以是与经修饰的宿主细胞相同物种的野生型细胞(即无遗传修饰)。在一些情况中，除了包含编码选自下组的蛋白质和/或具有所述蛋白质的至少一种功能活性的其变体的核酸外，第二宿主可以含有与经遗传修饰的宿主细胞相同的所有遗传修饰。本发明还涵盖经经遗传修饰以提高从宿主细胞中已经含有的基因的内源多肽表达的宿主细胞，所述多肽包括但不限于：Kex2p、Pdi1和Ero1。

在本发明的另一个方面，提供经遗传修饰的宿主细胞，其进一步包含至少一种以下遗传修饰：pep4蛋白酶敲除、相比于野生型宿主细胞更低的ubc4和/或ubc5活性、yps1敲除、hsp150敲除和pmt1敲除。已发现这些遗传修饰增加重组人血清清蛋白分泌能力和降低不想要的翻译后修饰。

在清蛋白融合蛋白的生产中使用的酵母菌株包括但不限于D88、DXY1和BXP10。D88[leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4]是亲本菌株AH22his.sup.+的衍生物(也称为DB1；参见例如Sleep等Biotechnology8:42-46(1990))。该菌株含有leu2突变，其允许对含有LEU2基因的基于2微米的质粒的营养缺陷性选择。D88还展现出葡萄糖过剩时的PRB1的去阻遏。PRB1启动子正常由监测葡萄糖水平和生长阶段的两个检查点控制。当葡萄糖耗尽和进入稳定期时，在野生型酵母中启动子被活化。菌株D88展现出通过葡萄糖的阻遏但在进入稳定期时维持诱导。PRA1基因编码定位于ER中的酵母液泡蛋白酶YscA内切蛋白酶A。UBC4基因在泛素化途径中且涉及靶向寿命短且异常的蛋白质以进行泛素依赖性降解。发现该ubc4突变的分离增加表达质粒在细胞中的拷贝数且导致从质粒表达的期望蛋白质的水平增加(参见例如国际公开文本No.WO99/00504，通过提述完整并入本文中)。

D88的衍生物DXY1具有以下基因型：[leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4,ura3:yap3]。除了在D88中分离的突变外，该菌株还具有YAP3蛋白酶的敲除。该蛋白酶导致大多数双碱性残基(RR,RK,KR,KK)的切割而且还可促进蛋白质中单碱基残基处的切割。该yap3突变的分离导致全长HAS产生的更高水平(参见例如美国专利No.5,965,386和Kerry-Williams等,Yeast14:161-169(1998)，由此通过提述完整并入本文中)。

BXP10具有以下基因型：leu2-3,leu2-122,can1,pra1,ubc4,ura3,yap3::URA3,lys2,hsp150::LYS2,pmt1::URA3。除了DXY1中分离的突变外，该菌株还具有PMT1基因和HSP150基因的敲除。PMT1基因是多萜基磷酸-D-甘露糖蛋白O-甘露糖基转移酶(Pmt)的进化保守家族的成员。Pmt1p的跨膜拓扑学表明它是在O-连接的糖基化中有作用的内质网整合膜蛋白。该突变作用于减少/消除HAS融合物的O-连接的糖基化(参见例如国际公开文本No.WO00/44772，由此通过提述完整并入本文中)。研究揭示Hsp150蛋白通过离子交换层析从rHA低效分离。HSP150基因中的突变除去了潜在的污染物，该污染物已被证明是通过标准纯化技术难以除去的。参见例如美国专利No.5,783,423，由此通过提述完整并入本文中。

本发明的经遗传修饰的宿主细胞包括但不限于，真菌细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。本发明的经遗传修饰的宿主细胞包括但不限于：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和耶氏酵母属(Yarrowia)。本发明的经遗传修饰的宿主细胞还包括但不限于酿酒酵母。

本发明的经遗传修饰的宿主细胞还可包含编码重组多肽的至少一种多核苷酸。能够表达至少一种异源多肽的多核苷酸包括但不限于，载体、转化到宿主细胞基因组中的DNA、病毒或病毒的部分、和/或质粒。能够表达异源多肽的多核苷酸可被转化到宿主细胞的基因组中和/或可以是表达载体和/或附加体表达***的部分。

在本发明的一些方面，编码重组多肽的核酸包含在质粒中。在其他方面，编码重组多肽的核酸被转化到本发明的宿主细胞的基因组中。

如本领域中理解的，可通过几种不同的方法将DNA转化到宿主细胞中。在酵母中，可以使用DNA转移的任何方便方法，如电穿孔、氯化锂方法、醋酸锂方法、或原生质球方法。为了产生适合高密度发酵的稳定菌株，期望将DNA整合到宿主染色体中。使用本领域中已知的技术，经由同源重组进行整合。例如，可给能够表达至少一种异源蛋白的DNA提供与宿主生物体序列同源的侧翼序列。以这种方式，整合发生在宿主基因组中的限定位点处，而不破坏期望或必要的基因。另外/或者，将能够表达至少一种异源蛋白的DNA整合到宿主染色体中不想要的基因的位点中，从而实现该基因或该基因产物的表达的破坏或缺失。

基因产物的增加的表达或过表达可通过将额外拷贝的能表达基因产物的DNA整合到宿主染色体中来实现。另外/或者，编码基因产物的DNA可以可操作地连接于强启动子，且完整的表达盒可以整合到宿主染色体中限定的位点处。例如，将可操作地连接于强启动子(例如PGK1启动子)的编码Kex2p、Pdi1或Ero1的DNA整合到NTS2-2的位点中允许相应基因产物的过表达。在其他实施方案中，可经由染色体、质粒、逆转录病毒载体或随机整合到宿主基因组中来将DNA引入宿主。

本发明的经遗传修饰的宿主细胞包括以下经遗传修饰的宿主细胞，其中编码kex蛋白酶或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接于选自下组的至少一种启动子：TEF1,PRB1ADH1,ADH2,PYK1,PGK1,ENO,GAL1.10.7,GALS,MET25,CUP1,PHO5,tetO-CYC1,CaMV,HXT6,HXT7和ARE。启动子适宜是PGK1。本发明的经遗传修饰的宿主细胞还包括以下经遗传修饰的宿主细胞，其中编码PDI或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接于选自下组的至少一种启动子：TEF1,PRB1ADH1,ADH2,PYK1,PGK1,ENO,GAL1.10.7,GALS,MET25,CUP1,PHO5,tetO-CYC1,CaMV,HXT6,HXT7和ARE。启动子适宜是PGK1。另外，本发明的经遗传修饰的宿主细胞包括以下经遗传修饰的宿主细胞，其中编码ERO或具有至少一种ERO功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸可操作地连接于选自下组的至少一种启动子：TEF1,PRB1ADH1,ADH2,PYK1,PGK1,ENO,GAL1.10.7,GALS,MET25,CUP1,PHO5,tetO-CYC1,CaMV,HXT6,HXT7和ARE。启动子适宜是PGK1。

在另一个方面，在本发明的经遗传修饰的宿主细胞中表达的重组多肽具有至少一个二硫键。在一些方面，所述重组多肽是清蛋白融合蛋白。在一些方面，所述重组多肽包含具有GLP-1活性的至少一种治疗性多肽缀合于清蛋白。

在一些方面，GLP-1的至少一种片段和变体包含GLP-1(7-36(A8G))且遗传融合于人血清清蛋白。在又一个实施方案中，本发明的多肽包含融合于人血清清蛋白或其变体的N或C末端的1、2、3、4、5或更多个串联取向的GLP-1分子和/或其片段和/或变体。其他实施方案具有融合于清蛋白或其变体的N或C末端的这类A8G多肽。两个串联取向的GLP-1(7-36)(A8G)片段和/或变体融合于人血清清蛋白的N末端的一个例子包括SEQIDNO:1，其呈现于图3中。在另一个方面，GLP-1的至少一种片段和变体包含串联并遗传融合于人血清清蛋白的至少两个GLP-1(7-36(A8G))。至少两个GLP-1(7-36(A8G))可以在人血清清蛋白的N末端遗传融合。至少一种具有GLP-1活性的多肽可包含SEQIDNO:1。

GLP-1(7-37)的变体可表示为例如Glu²²-GLP-1(7-37)OH，其指示其中正常见于GLP-1(7-37)OH第22位的甘氨酸已被谷氨酸替换的GLP-1变体；Val⁸-Glu²²-GLP-1(7-37)OH指示其中正常见于GLP-1(7-37)OH第8位的丙氨酸和正常见于第22位的甘氨酸已分别被缬氨酸和谷氨酸替换的GLP-1化合物。GLP-1变体的例子包括但不限于，

GLP-1的变体还可以包括但不限于，其一个或多个氨基酸侧链基团具有化学修饰的GLP-1或GLP-1片段。化学修饰包括但不限于，添加化学模块，创建新键，和除去化学模块。氨基酸侧链基团处的修饰包括但不限于，赖氨酸-ε-氨基基团的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基基团的修饰包括但不限于，脱-氨基、N-低级烷基(alkyl)、N-双-低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基基团的修饰包括但不限于，酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。此外，可通过有普通技术的蛋白质化学家已知的保护性基团来保护一种或多种侧链基团或末端基团。

GLP-1片段或变体还可包括其中一个或多个氨基酸已添加到所述片段或变体的GLP-1(7-37)OH的N末端和/或C末端处的多肽。其中氨基酸已被添加到N末端或C末端处的GLP-1中的氨基酸由与GLP-1(7-37)OH中的相应氨基酸相同的编号指示。例如，通过向GLP-1(7-37)OH的N末端添加两个氨基酸获得的GLP-1化合物的N末端氨基酸在位置5；且通过向GLP-1(7-37)OH的C末端添加一个氨基酸获得的GLP-1化合物的C末端氨基酸在位置38。如此，在这两种GLP-1化合物中，位置12被苯丙氨酸占据，而位置22被甘氨酸占据，如GLP-1(7-37)OH中的。氨基酸被添加到N末端的GLP-1的氨基酸1-6可以与GLP-1(1-37)OH的相应位置处的氨基酸相同或是保守取代。氨基酸被添加到C末端的GLP-1的氨基酸38-45可以与胰高血糖素或exendin-4的相应位置处的氨基酸相同或是保守取代。

在另一个方面，具有GLP-1活性的至少一种多肽包含融合于人血清清蛋白的至少一种人GLP-1片段和/或变体。在另一个方面，GLP-1的至少一种片段和变体包含GLP-1(7-36(A8G))。所述GLP-1的至少一种片段和变体遗传融合于人血清清蛋白。在另一个方面，本发明的重组多肽包含串联并遗传融合于人血清清蛋白的至少两个GLP-1(7-36(A8G))。所述两个GLP-1(7-36(A8G))在人血清清蛋白的N末端处遗传融合。在一些情况中，重组多肽包含SEQIDNO:1。

在本发明的一个实施方案中，重组多肽包含与SEQIDNO:1中所列的多肽具有99％序列同一性的多肽，或具有在C末端和/或N末端截短的SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽。在一个方面，重组多肽具有GLP-1活性。在一个方面，相比于SEQIDNO:1，多肽在N末端截短了1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个氨基酸，或者多肽在整个序列中与SEQIDNO:1具有99％序列同一性。在一个方面，相比于SEQIDNO:1，重组多肽在C末端截短了1,2,3,4,5,6,7,8,9,10个氨基酸，或者多肽在整个序列中与SEQIDNO:1具有99％序列同一性。

在再一个实施方案中，在本发明的宿主细胞中表达的至少一种重组多肽包括以下一项或多项：至少一种抗原结合蛋白、至少一种单可变域、和/或至少一种域抗体。包含至少一种抗原结合域的多肽还可包含至少一种多肽和/或肽受体激动剂和/或拮抗剂。在一些情况中，所述多肽激动剂可以是GLP-1受体激动剂。如本领域中理解的，超过一种重组多肽可以在同一细胞中表达。例如，具有GLP-1活性的重组多肽可在与抗原结合蛋白的相同的细胞中表达。具有GLP-1活性的多肽可从与抗原结合蛋白相同的多核苷酸表达，该多核苷酸可操作地连接于表达所必需的核酸序列。或者且例如，具有GLP-1活性的多肽可独立于第二重组多肽如抗原结合蛋白从同一附加体DNA或基因组但可操作地连接于表达必需的不同多核苷酸序列进行表达，或从位于分开载体上的DNA序列表达。

还提供经遗传修饰的宿主细胞，其包含编码杀伤表达(KEX)蛋白酶(Kex2p)或具有至少一种Kex2p功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸，和编码内质网氧化还原素(Ero1)或具有至少一种ERO功能活性的其片段和/或变体的至少一种异源核酸序列。本发明的经遗传修饰的宿主细胞包含编码重组多肽的至少一种核酸。在本发明的另一个方面，在培养物中培养时，与属于同一物种且有相同遗传修饰但不包含编码杀伤表达(KEX)蛋白酶Kex2p或具有至少一种KEX功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸序列、编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或具有至少一种Pdi功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸、和编码内质网氧化还原素(Ero1)或具有至少一种Ero1功能活性的其片段和/或变体的至少一种分离的多核苷酸的宿主细胞相比，所述经遗传修饰的宿主细胞提高所述重组多肽的表达。在一些情况中，经遗传修饰的宿主细胞是酿酒酵母。

在另一个方面，在本发明的经遗传修饰的宿主细胞中表达的重组多肽包含与SEQIDNO:1具有至少95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性的氨基酸序列。

在另一个方面，提供产生重组多肽的方法，包括培养本发明的经遗传修饰的宿主细胞。在其他方面，所述方法还包括从培养基回收所述重组多肽。在其他方面，提供通过所述方法制备的重组多肽。在另一个方面，通过本发明的方法制备的重组多肽包含与SEQIDNO:1具有99％序列同一性的氨基酸序列。在其他方面，所述重组多肽包含SEQIDNO:1中所列的氨基酸序列。在另一方面，重组多肽包含前导序列。在一个方面，所述前导序列是经修饰的KEX前导序列，其包含SEQIDNO:10中所列的氨基酸序列。如本领域中理解的，宿主细胞和生长条件能影响由宿主细胞产生的重组蛋白的终产物。例如，翻译后修饰可由宿主细胞类型和生长条件实现。重组蛋白的这些翻译后修饰(包括但不限于糖基化和甲基化)能实现以下方面，如但不限于，由所述宿主细胞产生的重组蛋白的蛋白质折叠和蛋白质活性或效力。

在本发明的再一个方面，提供一种药物组合物，其包含通过本发明方法制备的重组多肽。还提供治疗有此需要的患者的方法，包括施用治疗有效量的所述药物组合物。在一些情况中，患者患有选自以下的疾病或状况：I型糖尿病、II型糖尿病、葡萄糖不耐受、高血糖、阿耳茨海默氏病、肥胖、心血管病症、充血性心力衰竭和视网膜病变。

如本文中使用的，“治疗性多肽”指具有一种或多种治疗和/或生物学活性，特别是可用于治疗、预防或改善疾病的至少一种生物学活性的蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或变体。本发明涵盖的治疗性多肽包括但不限于，蛋白质、多肽、肽、抗体和生物制剂。(术语肽、蛋白质和多肽可在本文中交换使用)。治疗性多肽可拥有的生物学活性的一个非包容性列表包括，本文中描述的任意GLP-1活性，增强免疫应答，促进血管发生，抑制血管发生，调节内分泌功能，调节造血功能，刺激神经生长，增强免疫应答或抑制免疫应答。

如本文中使用的，“患者”是患有疾病、状况或病症的动物，优选为哺乳动物，最优选为人。

如本文中使用的，“治疗有效量”指在治疗、预防或改善疾病、状况或病症中有效的量。将在治疗、抑制或预防与治疗性多肽的异常表达和/或活性有关的疾病或病症中有效的本发明药物组合物的量可通过标准临床技术确定。另外，可以任选地采用体外测定法来帮助鉴定最佳的剂量范围。要在制剂中采用的准确剂量还将依赖于施用路径和疾病或病症的严重程度，且应依照从业人员的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从源自体外或动物模型测试***的剂量-应答曲线外推而来。

如本文中使用的，“药物组合物”包含治疗性多肽和药学可接受的载体。在一个特定的实施方案中，术语“药学可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准，或列于美国药典或其它一般公认用于动物，更具体的用于人的药典。术语“载体”指与治疗物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油，动物、植物或合成来源的，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等等。若想要的话，所述组合物也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等等的形式。所述组合物可以配制为栓剂，使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯。口服制剂可以包括标准的载体例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药物载体的例子描述于E.W.Martin的“Remington'sPharmaceuticalSciences”中。这类组合物将含有治疗有效量的化合物或治疗性多肽(优选为纯化形式)连同适宜量的载体，从而为患者提供适宜施用的形式。制剂应适合施用模式。

如本领域中理解的，“在培养物中培养/生长”及其语法变体指用宿主细胞接种营养培养基并温育细胞培养物(通常在对于具体宿主细胞生长最佳或标准的条件下)以允许细胞生长和/或***。如本领域中理解的，由培养中的宿主细胞产生的一种或多种酶的酶活性可受到培养物的生长条件的影响。例如，由培养中的宿主细胞产生的蛋白酶的蛋白水解活性可通过改变一种或多种以下条件来降低：pH、溶解氧、温度、同渗容摩(osmolarity)、一种或多种培养基组分、特定蛋白酶抑制剂、生长时间和/或速率、细胞浓度、培养持续时间、和/或葡萄糖进料速率(例如分批进料)。向培养物添加复杂蛋白质水解产物对于抑制蛋白酶解可能尤其有效。而且，在培养期间一个或多个特定时间时可以以使得效果最大化的方式来改变条件。类似地，培养物中产生的蛋白质的糖基化可受类似因素的影响。因此，用于降低或增加培养物中宿主细胞的酶活性(如蛋白水解或糖基化活性)的生长条件可通过调整上文所列的一种或多种非限制性因素来优化。

还有，如本领域中理解的，在宿主细胞中异源蛋白质和/或重组蛋白的产生可通过控制上文所述的许多相同因素来增加。另外，添加增加载体拷贝数的因素(包括但不限于，向生长培养基添加雷帕霉素(rapamycin))也可以增加生产。可以增加生产的其他因素包括但不限于，共表达一种或多种伴侣蛋白，如蛋白二硫化物异构酶(PDI)。另外，血红蛋白(HB)可以与至少一种异源多肽一起在宿主细胞中共表达以增强氧化性代谢的氧利用度，如此增加多肽产生。

在另一个方面，从本发明的经遗传修饰的宿主细胞表达的重组多肽包含前导序列。在一些方面，所述前导序列是KEX2前导序列或经修饰的KEX2前导序列。

野生型KEX前导序列在下文显示为SEQIDNO:9。

MetLysTrpValSerPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAraTyrSerArgSerLeuAspLysArg(SEQIDNO：9)

在一些情况中，使用显示为SEQIDNO:10的经修饰的KEX前导序列。

MetLysTrpValSerPheIleSerLeuLeuPheLeuPheSerSerAlaTyrSerGlySerLeuAspLysArg(SEQIDNO：10)

在一些情况中，KEX前导序列在整个序列中可与SEQIDNO:9具有90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％序列同一性。

在生产期间从宿主细胞分泌的异源蛋白质或重组蛋白可以包含促进分泌的前导序列。前导序列可经过修饰以改进分泌，由此改进异源表达蛋白质的总体产生和回收；例如来自多种分泌蛋白质的不同前导序列可以可操作地连接于异源蛋白质并评估增强的表达。或者，给定的前导序列可通过定点诱变修饰，或通过组合文库办法鉴定改进的前导序列变体来修饰。可发现包含来自两个或更多个前导肽的区域的嵌合前导序列改进异源蛋白质表达水平。

实施例

以下实施例例示了本发明的多个非限制性方面。

实施例1–过表达KEX2,PDI1和ERO1的酿酒酵母菌株

使用在Nottingham，UK的DeltaBiotechnologyLtd.(Delta)开发的酵母宿主表达***(酿酒酵母BXP10)来构建过表达KEX2、PDI1和ERO1的酿酒酵母菌株。BXP10源自酿酒酵母菌株AH22，其自ATCC获得且源自s288c。BXP10的构建涉及一系列随机诱变和靶向性特定基因破坏以增加重组人血清清蛋白(rHSA)分泌能力和降低不想要的翻译后修饰。

图1显示创建BXP10-KEX2-PDI1-ERO1，一种过表达KEX2、PDI1和ERO1的菌株。将含有可操作地连接于PGK1启动子的KEX2-KanMX，可操作地连接于PGK1启动子的PDI-HphMX，或可操作地连接于PGK1启动子的ERO-BsdMX的表达盒序贯整合入BXP10的NTS2-2位点(rDNA重复中的非转录间隔区)，从而创建以下菌株：BXP10-KEX2(过表达KEX2的菌株),BXP10-KEX2-PDI1(过表达KEX2和PDI1的菌株)和BXP10-KEX2-PDI1-ERO1(过表达KEX2、PDI1和ERO1的菌株)。

为了构建KEX2的表达盒，通过PCR从BXP10基因组DNA分别扩增KEX2ORF、PGK1基因启动子(P_PGK1)和ADH1基因转录终止序列(T_ADH1)，然后使用另一PCR反应(“缝合”或“融合”PCR反应)进行组装。将组装的P_PGK1-KEX2-T_ADH1片段克隆到pRS314KanMX中以生成pRS314KanMXpPGK1-KEX2。该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得DNA片段通过电穿孔转化到BXP10宿主菌株中并铺板于含有G418的平板上。通过菌落PCR进一步确认G418抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

构建携有PDI1的表达盒的质粒pRS314HphMXpPGK1-PDI1，其通过将pRS314KanMXpPGK1-KEX2中的KEX2ORF和KanMX区用PCR扩增的PDI1ORF和潮霉素B抗性标志物HphMX替换。该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得DNA片段通过电穿孔转化到BXP10-KEX2宿主菌株中并铺板于含有潮霉素B的平板上。通过菌落PCR进一步确认潮霉素B抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

通过PCR从BXP10的基因组DNA扩增ERO1ORF，然后进一步克隆到pRS314pPGK1BsdMX中以制备pRS314BsdMXpPGK1-ERO1。该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得DNA片段通过电穿孔转化到BXP10-KEX2-PDI1宿主菌株中并铺板于含有杀稻瘟素S的平板上。通过菌落PCR进一步确认杀稻瘟素抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

图2显示确认KEX2和PDI1整合到BXP10的NTS2-2位点，从而创建BXP10-KEX2和BXP10-KEX2-PDI1菌株的Southern印迹分析。对于KEX2，2.6kb条带对应于内源性KEX2拷贝，而1.6kb条带对应于成功整合的拷贝。对于PDI1，1.3kb条带对应于内源性PDI1拷贝，而1.7kb条带对应于成功整合的拷贝。

图3显示PDI1和KEX2的Western印迹分析，其显示PDI1和KEX2在BXP10-KEX2-PDI1克隆中的过表达。在5个BXP10-KEX2-PDI1克隆中，克隆#2显示PDI1和KEX2两者的最高表达，因此被选作宿主菌株来构建BXP10-KEX2-PDI1-ERO1。

然后，将宿主菌株用含有重组融合蛋白(“pCID3610蛋白”)的pCID3610质粒转化，该融合蛋白由两个拷贝的人胰高血糖素样肽1(GLP-1，片段7-36(A8G))和重组人清蛋白(rHA)组成。每个GLP-1序列已经过修饰，其中用甘氨酸取代位置8的天然存在的丙氨酸以赋予对蛋白酶解的抗性。第二GLP-1序列充当第一GLP-1序列和rHA之间的肽间隔物。pCID3610蛋白是由645个氨基酸组成的非糖基化蛋白且具有72,970.4Da的分子量。pCID3610详细描述于美国专利No.7,569,384，其完整并入本文。

使用基于pSAC35的表达载体，在Rockville，MD的HumanGenomeSciences构建pCID3610质粒。pSAC35含有酿酒酵母的LEU2基因作为选择标志物，其弥补了BXP10中的亮氨酸营养缺陷。pSAC35还含有强酵母启动子(PRB1)、独特克隆位点(NotI)和来自大肠杆菌质粒pUC9的序列以允许在大肠杆菌中克隆和增殖。另外，pSAC35是***性(disintegrative)载体，一旦其在酵母中转化，源自pUC9的序列就通过位点特异性重组被切除。该切除通过FLP识别靶物(FLPrecognitiontarget，FRT)和酵母FLP(“flip”)重组酶从2微米质粒的表达实现。pSAC35中的其他区段包括D-基因的REP1和REP2区。REP1和REP2基因编码帮助调控质粒拷贝数的产物，且在细胞***期间在质粒分离中也起作用。D-基因的产物通过减轻由REP1和REP2导致的抑制来增加FLP表达。pCID3610详细描述于美国专利No.7,569,384，其完整并入本文。

在英国牛津大学Dr.F.E.Baralle的实验室，从人cDNA文库分离人清蛋白(HA)的全长cDNA并克隆到质粒pAT153ALB中。之后，通过引入新限制性位点通过Delta修饰pAT153ALB以便于克隆到pSAC35中。

通过引入如下组装的GLP-1-rHSA融合基因从pSAC35构建表达载体质粒pCID3610。首先，制备编码前导肽和成熟GLP-1变体的合成基因，该变体在成熟肽的位置2具有单个A至G取代。使用针对酵母的最优密码子反向翻译变体GLP-1肽，并使用重叠寡核苷酸经由PCR合成串联拷贝。这一合成的基因在第二轮PCR中用作模板以加入5’和3’限制性位点，从而允许其克隆到rHSA基因的5’端中。最后，将信号肽编码序列连接至GLP-1构建体的5’端。将所得片段连接到pSAC35中独特的NotI位点处并转化到DH5α中，得到表达载体pCID3610。确认pCID3610的核苷酸序列。然后，将pCID3610再次转化到DH5α中用于进一步扩展和分离质粒DNA。

为了构建表达pCID3610的BXP10-KEX2-PDI1-ERO1菌株，将pCID3610通过电穿孔转化到BXP10-KEX2-PDI-ERO1中，然后将细胞铺板于ESFM2琼脂糖平板，在30C温育板4天后选择Leu+菌落。将转化体的十二个(12)菌落进一步在ESFM2琼脂糖平板上划线以获得单个克隆。将来自每划线的一个菌落接种到ESFM2培养基中用于使用24深孔培养板筛选。

在搅拌情况下3天温育后，在SDS-PAGE上分析12个克隆培养物中每一个的上清液。图4显示12份上清液样品的SDS-PAGE。然后，从12个克隆中选出4个克隆(克隆#2、克隆#8、克隆#10和克隆#12)用于进一步发酵测试(选择的克隆在图4中用箭头标示)。由于来自每个孔的培养基在培养板的蒸发不同，基于生长结束时每份培养物的终体积、细胞培养物的OD测量和SDS-PAGE凝胶上的条带强度的考虑选择4个克隆。

然后，使用发酵程序在DASGIP迷你生物反应器中运行4个选择的克隆，并将所得滴度产率和蛋白质质量与表达pCID3610的BXP10的那些相比较，BXP10是一种不过表达KEX2、PDI1和ERO1的宿主菌株。图5显示对发酵运行中产生的蛋白质的滴度产率和的蛋白质质量的分析。蛋白质质量通过以下蛋白质产物的百分比来测量，该蛋白质产物由于低效的前导序列切割而在N末端具有额外的6个氨基酸(6-AA)。相比于在相同发酵条件下仅生成多达1.6g/LpCID3610蛋白的表达pCID3610的BXP10，克隆#2和克隆#8显示在pCID3610蛋白质浓度中的显著增加(表达pCID3610的BXP10的数据未显示在图5中)。此外，相比于4-7％的蛋白质产物有额外的6-AA的表达pCID3610蛋白的BXP10中的6-AA水平，6-AA在所有克隆中的水平(<1％的蛋白质产物具有额外的6-AA)显著降低(表达pCID3610的BXP10的数据未显示在图5中)。这些结果表明KEX2、PDI1和ERO1的过表达极大地改进了宿主菌株(BXP10)以产生更多的具有更好质量的pCID3610蛋白。

尽管克隆#2和克隆#8中的滴度产率和6-AA水平是可比的，但将克隆#8选作前导克隆，因为其在发酵运行中显示稍好的结果。为了确认pCID3610的改进的滴度产率和蛋白质质量，在15L发酵器中运行克隆#8。来自四个(4)运行批次的平均滴度产率为2.5g/L，其从使用表达pCID3610的BXP10的滴度产率增加了40-50％。

接着制备BXP10-KEX2-PDI1-ERO1克隆#8的两个分别的冷冻储备物。第一冷冻储备物(“ResearchCellBankVial”)通过在含有所有3种抗生素(G418、潮霉素和杀稻瘟素)的200mlESFM2培养基中培养克隆#8来制备。当细胞培养物达到OD₆₀₀～3.0时，收获、清洗、重悬细胞并等分取样以制备20％海藻糖冷冻储备物。

然后，将来自研究细胞库小瓶(ResearchCellBankVial)的细胞融化并在30℃和250rpm在ESFM2培养基中培养。通过测量培养物的OD₆₀₀监测培养物密度。图6显示细胞的生长曲线。在约OD₆₀₀＝2.54时，收获、清洗和重悬细胞以制备第二冷冻储备物(“Pre-MasterCellBank”)。图7显示来自预备主细胞库(Pre-MasterCellBank)的细胞的生长曲线。

然后通过体外细胞龄和15L生产研究来测试BXP10-KEX2-PDI1-ERO1克隆#8的稳定性。简言之，将来自预备主细胞库的克隆#8细胞通过7个连续的摇瓶步骤传代，其对应于约51个细胞世代。然后，将细胞接种到15L发酵器中并经由发酵程序运行。该发酵过程再增加14代。上清液滴度产率达到5.3g/L，6-AA水平低于1.5％。数据指示BXP10-KEX2-PDI1-ERO1克隆#8在约65代后稳定产生pCID3610蛋白。

为了构建KEX2的表达盒，通过PCR从BXP10基因组DNA分别各扩增PGK1基因启动子(P_PGK1)、KEX2ORF和ADH1基因转录终止序列(T_ADH1)，然后使用另一PCR反应(“缝合”或“融合”PCR反应)进行组装。将组装的P_PGK1-KEX2-T_ADH1片段克隆到pRS314KanMX中以生成pRS314KanMXpPGK1-KEX2。然后，该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得PCR片段通过电穿孔转化到BXP10宿主菌株中并铺板于含有G418的平板上。通过菌落PCR进一步确认G418抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

从BXP10基因组DNA扩增PDI1ORF。将该DNA片段和潮霉素B抗性标志物HphMX用于替换pRS314KanMXpPGK1-KEX2中的KEX2ORF和KanMX区，其产生质粒pRS314HphMXpPGK1-PDI1。然后，该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得DNA片段通过电穿孔转化到BXP10-KEX2宿主菌株中并铺板于含有潮霉素B的平板上。通过菌落PCR进一步确认潮霉素B抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

类似地，通过PCR从BXP10的基因组DNA扩增ERO1ORF，然后进一步克隆到pRS314pPGK1BsdMX中以制备pRS314BsdMXpPGK1-ERO1。该质粒在最后一轮PCR中用作模板以加入与NTS2-2整合位点同源的5’和3’侧翼序列(分别为105bp和101bp)。将所得DNA片段通过电穿孔转化到BXP10-KEX2-PDI1宿主菌株中并铺板于含有杀稻瘟素S的平板上。通过菌落PCR进一步确认杀稻瘟素抗性克隆对于位点特异性整合是阳性的。

Claims (40)

1.一种宿主细胞，其包含至少一种编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或其片段和/或变体的异源核酸序列和至少一种编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或其片段和/或变体的异源核酸序列。

2.权利要求1的宿主细胞，其还包含至少一种编码内质网氧化还原素(Ero1)或其片段和/或变体的异源核酸序列。

3.权利要求1或2的宿主细胞，其中当在培养物中培养所述宿主细胞时，所述宿主细胞表达或过表达所述至少一种异源核酸序列的至少一种基因产物，所述异源核酸序列编码选自以下的蛋白质或其片段和/或变体：Kex2p、Pdi1和Ero1。

4.权利要求1至3中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌细胞。

5.权利要求4的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酵母细胞。

6.权利要求5的宿主细胞，其中所述酵母细胞的属选自下组：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和耶氏酵母(Yarrowia)。

7.权利要求1至6中任一项的宿主细胞，其中所述酵母细胞是酿酒酵母(S.cerevisiae)。

8.权利要求1至3中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

9.权利要求1至8中任一项的宿主细胞，其中所述至少一种编码Kex2p或其片段和/或变体的异源核酸序列可操作地连接于至少一种选自下组的启动子：TEF1、PRB1ADH1、ADH2、PYK1、PGK1、ENO、GAL1.10.7、GALS、MET25、CUP1、PHO5、tetO-CYC1、CaMV、HXT6、HXT7和ARE。

10.权利要求1至8中任一项的宿主细胞，其中所述至少一种编码Pdi1的异源核酸序列可操作地连接于至少一种选自下组的启动子：TEF1、PRB1ADH1、ADH2、PYK1、PGK1、ENO、GAL1.10.7、GALS、MET25、CUP1、PHO5、tetO-CYC1、CaMV、HXT6、HXT7和ARE。

11.权利要求2至8中任一项的宿主细胞，其中所述至少一种编码Ero1的异源核酸序列可操作地连接于至少一种选自下组的启动子：TEF1、PRB1ADH1、ADH2、PYK1、PGK1、ENO、GAL1.10.7、GALS、MET25、CUP1、PHO5、tetO-CYC1、CaMV、HXT6、HXT7和ARE。

12.权利要求1至11中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含至少一种以下遗传修饰：pep4蛋白酶敲除、相比于野生型宿主细胞更低的ubc4和/或ubc5活性、yps1敲除、hsp150敲除和pmt1敲除。

13.权利要求1至12中任一项的宿主细胞，其包含至少一种编码重组多肽的核酸。

14.权利要求13的宿主细胞，其中所述至少一种编码重组多肽的核酸包含在质粒中。

15.权利要求13的宿主细胞，其中所述至少一种编码重组多肽的核酸整合到所述宿主细胞的基因组中。

16.权利要求13至15中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽具有至少一个二硫键。

17.权利要求13至16中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽是清蛋白融合蛋白。

18.权利要求13至17中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽包含至少一种遗传融合于清蛋白的具有GLP-1活性的治疗性多肽。

19.权利要求13至18中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽具有与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的多肽。

20.权利要求13至19中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽包含SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列。

21.权利要求13至20中任一项的宿主细胞，其中所述重组多肽包含前导序列。

22.权利要求21的宿主细胞，其中所述前导序列是KEX2前导序列或经修饰的KEX2前导序列。

23.权利要求13至22中任一项的宿主细胞，其中所述重组蛋白包含如SEQIDNO:10中所示的经修饰的前导序列。

24.一种产生重组多肽的方法，包括培养权利要求13至23中任一项的宿主细胞。

25.权利要求24的方法，其还包括从所述培养基回收所述重组多肽。

26.通过权利要求24或25的方法制备的重组多肽。

27.权利要求26的重组多肽，其中所述重组多肽包含与SEQIDNO:1具有99％序列同一性的氨基酸序列。

28.权利要求27的重组多肽，其中所述重组多肽由SEQIDNO:1的氨基酸序列组成。

29.药物组合物，其包含权利要求27或28的重组多肽。

30.一种治疗有此需要的患者的方法，包括施用治疗有效量的权利要求29的药物组合物。

31.权利要求30的方法，其中所述患者患有选自以下的疾病或状况：I型糖尿病、II型糖尿病、葡萄糖不耐受、高血糖、阿耳茨海默氏病、肥胖、心血管病症、充血性心力衰竭和视网膜病变。

32.一种宿主细胞，其包含至少一种编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列、至少一种编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列和至少一种编码内质网氧化还原素(Ero1)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列。

33.权利要求32的宿主细胞，其中所述Kex2p或其功能片段和/或变体是SEQIDNO:3的功能基因产物。

34.权利要求32的宿主细胞，其中所述Pdi1或其功能片段和/或变体是SEQIDNO:5的功能基因产物。

35.权利要求32的宿主细胞，其中所述Ero1或其功能片段和/或变体是SEQIDNO:7的功能基因产物。

36.权利要求32至35中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。

37.权利要求32或36的宿主细胞，其还包含至少一种编码重组多肽的核酸。

38.权利要求37的宿主细胞，其中所述重组多肽包含与SEQIDNO:1中所示的氨基酸序列具有至少99％序列同一性的多肽。

39.权利要求37或38的宿主细胞，其中与至少一种属于同一物种且具有相同遗传修饰但不包含编码杀伤表达蛋白酶(Kex2p)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列、至少一种编码蛋白二硫化物异构酶(Pdi1)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列和至少一种编码内质网氧化还原素(Ero1)或其功能片段和/或变体的异源核酸序列的宿主细胞相比，所述宿主细胞当在培养物中培养时提高所述重组多肽的滴度产率。

40.一种宿主细胞，当在培养物中培养所述宿主细胞时其相比于野生型宿主细胞过表达至少两种选自Kex2p、Pdi1和Ero1的蛋白质或其片段和/或变体，其中所述野生型宿主细胞属于同一物种且在相同培养条件下培养，但不过表达至少两种选自Kex2p、Pdi1和Ero1的基因产物。