JP4855640B2 - インシュリン前駆体及びその調製方法 - Google Patents
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Description
式中、
X1は少なくとも1つのProを含む1〜5アミノ酸残基のペプチド配列であり、
Yは切断部位である。
「連結ペプチド」又は「C−ペプチド」は、単鎖プレプロインシュリン様分子のB−C−Aポリペプチド配列の連結部分「C」を意味する。具体的には、天然インシュリン鎖では、C−ペプチドはB鎖の30位とA鎖の1位を連結する。本明細書に記載したものなどの「ミニC−ペプチド」又は「連結ペプチド」はB29をA1に連結し、天然C−ペプチドのそれとは配列及び長さが異なる。
発現プラスミドはすべて欧州特許第171,142号に記載のものに類似したC−POTタイプであり、S.cerevisiae中でのプラスミドの選択及び安定化のためにSchizosaccharomyces pombeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことを特徴とする。このプラスミドは、S.cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーターも含む。これらの配列は、リーダーとインシュリン前駆体産物の融合タンパク質をコードするEcoRI−XbaI断片の配列以外のすべての配列が(国際公開第90/100075号に記載の)プラスミドpKFN1003の対応する配列に類似している。異なる融合タンパク質を発現するために、対象となるリーダー−インシュリン前駆体融合物をコードするEcoRI−XbaI断片でpKFN1003のEcoRI−XbaI断片を単純に置き換える。このようなEcoRI−XbaI断片を、標準技術に従い合成オリゴヌクレオチド及びPCRを用いて合成することができる。
5’−TTGCTTAAATCTATAACTAC−3’(配列番号4)
プライマーB:
5’−TTAGTTTCTAGACTAGTTGCAGTAGTTTTCCAATTGGTACAAGGAGCAGATGGAGGTACAGCATTGTTCGACAATACCCTTTGGMNNCTTAGGAGTGTAGAAGAA−3’(配列番号5)
N=ACTG
M=AC
ポリメラーゼ連鎖反応法。PCRを一般に以下に示すように実施した。プライマーA(20pmol)5μl、プライマーB(20pmol)5μl、10×PCR緩衝液10μl、dNTP混合物8μl、E.H.F.酵素0.75μl、テンプレートとしてpAK855プラスミド1μl(DNA約0.2μg)及び蒸留水70.25μl。
標準技術に従って、精製したPCR DNA断片を水と制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、適切な制限エンドヌクレアーゼ(例えばBgl II及びXba I)で消化した。BglII−XbaI DNA断片をアガロース電気泳動にかけ、The Gene Clean Kitを用いて精製した。
QPIDDTESQTTSVNLMADDTESAFATQTNSGGLDVVGLISMAKR(配列番号6)である。
Claims (4)
- desB30ヒトインシュリン又はヒトインシュリンを作製するための方法であって:
(i)以下の式を有するインシュリン前駆体をコードするポリヌクレオチド配列を含む酵母細胞を、前記インシュリン前駆体の発現に適した培養条件下で培養すること;
B(1−29)−X1−Y−A(1−21)
ここで、
B(1−29)は、B30アミノ酸残基を欠失したヒトインスリンのB鎖であり、
X1は、GlnPro、ThrPro、GluPro、GlyPro、MetPro、SerPro、AspPro、SerAspPro、AsnAspPro、GluAspPro、およびAlaAspProからなる群より選択されるペプチド配列であり、
Yは、Lysであり、
A(1−21)は、ヒトインスリンのA鎖である
(ii)前記インシュリン前駆体を培地から単離すること;及び
(iii)インビトロでの化学的転化又は酵素による転化によって、前記インシュリン前駆体をdesB30ヒトインシュリン又はヒトインシュリンに転化すること
を含む方法。 - X1がGluProである、請求項1に記載の方法。
- X1がAspProである、請求項1に記載の方法。
- X1がGlnProである、請求項1に記載の方法。
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