JP5501360B2 - 光学顕微鏡およびその制御方法 - Google Patents

Description

本発明は、誘導ラマン散乱を用いた分子振動イメージング手法などに適用できる光学顕微鏡、ならびに光学計測に関する。

ラマン散乱原理を利用した顕微鏡は、分子の振動情報を反映した分子振動イメージング手法として、生体の細胞観察などへの応用が期待されている。

従来、ラマン散乱を用いた顕微鏡として、自発ラマン散乱顕微鏡とコヒーレント反ストークスラマン散乱（coherent anti-Stokes Raman scattering, ＣＡＲＳ）顕微鏡が知られていた。

前者では，試料の分子振動周波数だけ励起光が周波数変化することを利用して試料の分光情報を取得するが、得られる信号光が非常に微弱であるため、信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比を向上させることが大きな課題であった。一方、後者では、２色（ω_ＡＳ、ω_Ｓ）の光パルスを用いて励起光と異なる周波数（２ω_ＡＳ−ω_Ｓ）にＣＡＲＳ光を発生させる。ＣＡＲＳでは分子を強制的に振動させるために、高Ｓ／Ｎ比の信号が得られるという特長がある。しかし、試料の電子の非線形応答に起因する、いわゆる非共鳴信号というものが存在し、これがバックグラウンドとなってしまうため、得られる分子振動イメージのコントラストが低下するという課題があった。

このように相反する従来のラマン散乱顕微鏡の課題を解決する方法として、誘導ラマン散乱（stimulated Raman scattering、ＳＲＳ）顕微鏡が、発明者ら（非特許文献１参照）およびハーバード大学のSunny Xie ら（非特許文献２参照）から、独立して提案された。

誘導ラマン散乱顕微鏡の原理は、以下の通りである。

すなわち、２色（ω_ＡＳ、ω_Ｓ）の光パルスのうち、一方に強度変調を施した状態で試料に集光照射したとき、２色の周波数差が集光点の試料の分子振動周波数と一致すると、集光点で誘導ラマン散乱という現象が生じる。このとき、強度変調されていない方の励起光パルスに強度変調が生じ、試料から射出される励起光を光検出することにより、誘導ラマン散乱による強度変調分を検出できる。したがって、この誘導ラマン散乱によって生じた強度変調分から、試料の分子振動イメージングが可能となる。

図１２に、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡の、原理確認を行った際のブロック構成図を示す。

図１２に示すように従来の誘導ラマン散乱顕微鏡５００は、チタンサファイヤレーザー５０１から照射された反ストークス光（ω_ＡＳ）と、光パラメトリック発振器５０２から照射され、音響光学素子（ＡＯＭ）５０３で強度変調されたストークス光（ω_Ｓ）とを、ダイクロイックミラー５０５を用いて同軸に合波して、対物レンズ５０６を介して試料５０７に集光照射する。このときの散乱光を、対物レンズ５０８，ショートパスフィルタ５０９，集光レンズ５１０を介してフォトダイオード（ＰＤ）５１１とロックインアンプ５１２を用いて検出した。なお、５０４はミラーであり、反ストークス光（ω_ＡＳ）は、繰り返し周波数が７６ＭＨｚ、中心波長が７６５ｎｍ、パルス幅が１００ｆｓであり、ストークス光（ω_Ｓ）の繰り返し周波数は７６ＭＨｚ、中心波長が９８５〜１００５ｎｍ、パルス幅は２００ｆｓであった。また、高周波信号源５１３の周波数は２ＭＨｚとした。

誘導ラマン散乱顕微鏡の原理確認；嶽 文宏、小関泰之、伊東一良、Optics &Photonics Japan 2008，5pC12，2008年11月5日 Chiristian W. Freudiger, Wei Min, Brian G. Saar, Sijia Lu, Gary R. Holtom, Chengwei He, Jason C. Tsai, Jing X. Kang, X. Sunney Xie, "Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy (誘導ラマン散乱を用いた顕微鏡による非標識の高感度生物医学的画像解析)" SCIENCE VOL322 19 DECEMBER 2008 pp. 1857-1861

しかしながら、上記従来の誘導ラマン散乱顕微鏡では、光源であるレーザーの強度雑音の影響で、Ｓ／Ｎ比が低下するという問題があった。また、ストークス光を強度変調するための音響光学素子が必要となり、系が複雑化するという問題があった。

レーザーの強度雑音は高周波ほど少なくなるため、レーザーの強度雑音を低下させるためには、変調周波数を高くすることが有効である。しかし、変調周波数が高くなれば、強度変調を行う音響光学素子への要求が厳しくなり、系の複雑化に関する課題がさらに顕著となってしまう。また、強度変調を行う上での制約から、変調周波数を高くすることに制限があると、高品質の動画のイメージング画像を得ることが困難となる。

そこで本発明は、上記した従来の課題を解決して、光源系の複雑化を抑え、レーザーの強度雑音の影響を低減するためなどに変調周波数を高くした場合にも容易に対応できる光学系を備えた光学顕微鏡を得ることを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の光学顕微鏡は、第１の光周波数を有する第１の光パルス列を試料に照射する第１の光源と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光周波数を有する第２の光パルス列を前記試料に照射する第２の光源と、前記第１の光パルス列および前記第２の光パルス列が前記試料に照射されることにより生じた散乱光を電気信号に変換する受光素子と、前記第１の光パルス列の第１の繰り返し周波数をロックイン周波数として、前記受光素子からの前記電気信号を同期検波するロックインアンプと、を備えており、前記第１の光パルス列の前記第１の繰り返し周波数は、前記第２の光パルス列の第２の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする。

本発明の光学顕微鏡によれば、従来の光学顕微鏡に用いられていた強度変調のための素子が不要となり、光学顕微鏡の系を簡易化することができ、また、光パルス列の変調周波数を高く設定して、Ｓ／Ｎ比の高いイメージ画像を得ることができる。

本発明の第１の実施形態にかかる光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる誘導ラマン散乱信号の例を示す図である。 誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの例を示す。図３（ａ）（ｂ）は水の中のポリスチレンビーズの分子振動イメージを、図３（ｃ）（ｄ）は植物細胞の分子振動イメージを、それぞれ示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡で用いられるファイバーレーザーの概略構成を示すブロック図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡での、タイミング差検出光学系に用いられたフォトダイオードからの出力信号の状態を示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡での、２色の超短光パルスレーザービームの同期状態を示す図である。 ロックイン周波数が異なる場合に、誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの違いを示す図である。図８（ａ）は、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合のポリスチレンビーズの分子振動イメージであり、図８（ｂ）は、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合のポリスチレンビーズの分子振動イメージである。 ロックイン周波数が異なる場合に、誘導ラマン散乱顕微鏡で得られる分子振動イメージの違いを示す図である。図９（ａ）は、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の植物細胞の分子振動イメージであり、図９（ｂ）は、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の植物細胞の分子振動イメージである。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡で得られる分子振動イメージにおけるロックイン周波数とノイズの大きさとの関係を示す図である。 本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡でのフォトダイオード駆動回路の回路構成を示すブロック図である。 従来の誘導ラマン散乱顕微鏡の概略構成を示すブロック構成図である。

本発明の光学顕微鏡は、第１の光源が生成する第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源が生成する第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光を検出する光学顕微鏡であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一である。

このようにすることで、例えば、誘導ラマン散乱顕微鏡に用いた場合には、第１の光周波数と第２の光周波数との周波数差が試料の分子振動周波数に一致した際に、誘導ラマン散乱が生じて試料からの散乱光が強度変調され、この強度変調成分を検出することで試料の分子振動イメージングが可能となる。このため、従来のような強度変調のための素子を用いることなく、簡易な光学顕微鏡の系を有し、光パルス列の変調周波数を高く設定することが容易な誘導ラマン散乱を用いた光学顕微鏡を得ることができる。

また、本発明の光学顕微鏡において、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の二分の一であることが好ましい。このようにすることで、第１の光パルス列と第２の光パルス列とから、誘導ラマン散乱を最も効果的に生成させることができ、より良好に試料の分子振動イメージが作成できる光学顕微鏡を得ることができる。

さらに、前記第１の光源と、前記第２の光源と、前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列とを同時に前記試料に照射する照射光学系と、前記試料からの散乱光のうち、前記第１の光パルス列を除去して他を集光する集光光学系と、前記集光光学系で集光された散乱光を電気信号に変換して出力する受光素子と、前記受光素子の出力信号を同期検波する電子回路とを備えることが好ましい。このようにすることで、簡易な系の光学顕微鏡を容易に実現することができる。

さらにまた、前記第１の光源および前記第２の光源の少なくともいずれか一方がファイバーレーザーであり、前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列のタイミング差を検出するタイミング差検出光学系を備え、前記タイミング差検出光学系からの出力信号に基づいて、前記ファイバーレーザーの共振器内に配置された光路長変調手段を駆動して、前記第１の光パルス列のタイミングと前記第２の光パルス列のタイミングとを整合させることが好ましい。このようにすることで、高精度に、第１の光パルス列のタイミングと第２の光パルス列のタイミングを整合させることができ、Ｓ／Ｎ比の高いクリアな分子振動イメージが得られる光学顕微鏡を実現することができる。

また、前記タイミング差検出光学系において、前記第１の光パルス列のレーザー光と前記第２の光パルス列のレーザー光が集光照射されて生じる二光子吸収電流を検出することが好ましい。このようにすることで、高い精度で２色の超短光パルスレーザービームのタイミングずれを検出することができる。

さらに、前記光路長変調手段が、可変遅延線、および、位相変調器であることが好ましい。このようにすることで、光路長を長距離にわたって機械的に調節することができる可変遅延線と、印加される電圧によって結晶の屈折率を変化させることで高速に光路長を調節できる位相変調器を用いて、より高精度かつ長時間安定なタイミング同期を実現できる。

さらにまた、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、１０ＭＨｚ以上であることが好ましく、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、３８ＭＨｚ以上であることがより好ましい。

また、本発明の光学顕微鏡として、第１の光周波数を有する第１の光パルス列と、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光周波数を有する第２の光パルス列とを試料に照射し、前記試料からの散乱光をフォトダイオードで検出する光学顕微鏡であって、前記フォトダイオードからの出力信号を取得するフォトダイオード駆動回路が、前記フォトダイオードと並列に接続されたインダクタンスと、前記インダクタンスに並列に接続された抵抗値が１００Ω以上の負荷抵抗とを有していることを特徴とする。

このような構成とすることで、高いロックイン周波数でのイメージ画像の検出において、フォトダイオードの寄生容量による周波数特性の低下を効果的に防止することができる。

さらに本発明は、第１の光源から生成された第１の光パルス列と、第２の光源から生成された第２の光パルス列とを用いて、ロックイン検出を行う光学計測であって、前記第１の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数が、前記第２の光源が生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学計測として把握することができる。

このように、ロックイン検出を行う繰り返し周波数が異なる第１の光パルス列および第２の光パルス列が、異なる繰り返し周波数の光を生成する光源から生成されていることで、Ｓ／Ｎ比を高くできる高い周波数でロックイン検出を行う光学計測が、簡易な構成で可能になる。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。

（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態にかかる誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）効果を用いた光学顕微鏡の概略構成を示すブロック図である。

図１に示すように、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００は、第１の光パルス列を生成する第１の光源１と、第２の光パルス列を生成する第２の光源２と，ミラー３，ハーフミラー４と第１の対物レンズ５からなる照射光学系２１と、第２の対物レンズ７，フィルタ８および集光レンズ９からなる集光光学系２２と、受光素子であるフォトダイオード１０，フォトダイオード１０の出力信号を同期検波する電子回路であるロックインアンプ１１とを有している。

また、図１に示すように、第１の対物レンズ５と第２の対物レンズ７との間に、測定対象の試料６が配置されている。

本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、ストークス光（ω_Ｓ）の第１の光パルス列を生成する第１の光源１として、チタンサファイヤレーザー光源が用いられている。レーザー光の光周波数は中心周波数が１０００ｎｍ、パルス幅は２００ｆｓ（フェムト秒）で、繰り返し周波数は３８ＭＨｚに設定されている。

また、反ストークス光（ω_ＡＳ）である第２の光パルス列を生成する第２の光源２は、第１の光源と同様、チタンサファイヤレーザー光源が用いられていて、光周波数は７７０ｎｍ程度までの適宜の値であり、パルス幅は１００ｆｓで、繰り返し周波数は７６ＭＨｚである。この、第２の光パルス列の光周波数は、第１の光パルス列の光周波数との周波数差が、測定対象試料の分子振動周波数と一致するように、測定対象試料に合わせて適宜調整されるものである。

なお、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、第１の光源と第２の光源とに、それぞれ別々のパルスレーザー光源を用い、これらのレーザーパルス光源の同期を取るために、両者を電気的に接続している。しかし、本発明の第１の光源および第２の光源はこれに限らず、例えば、一方の光源をパルスレーザー光源、他方をパラメトリック発振器とすることもできる。

また、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００では、上記のように、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数を、第２の光源で生成される第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一としている。以下、本実施形態では、この第１の光パルス列の繰り返し周波数をｆと、また、第２の光パルス列の繰り返し周波数を２ｆとする。このようにすることで、第１の光源で生成される第１の光パルス列は、第２の光源で生成される第２の光パルス列の二つに一つと同期したタイミングで生成されるために、例えば、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数を、第２の光源で生成される第２の光パルス列繰り返し周波数の三分の一や四分の一とする場合と比較して、誘導ラマン散乱効果を引き起こす回数を最も多くすることができて、より高い精度で試料の分子振動イメージの取得が可能となるからである。

しかし、本発明の誘導ラマン散乱顕微鏡において、第１の光パルス列の繰り返し周波数は、第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一とすることは、必ずしも必須の要件ではなく、三分の一や四分の一など、第１の光パルス列の繰り返し周波数を第２の光パルス列の繰り返し周波数の整数分の一とすることで、誘導ラマン散乱効果による試料の分子振動イメージの取得が可能となる。

また、上記本実施の形態では、２つの光パルス列のうち、繰り返し周波数の低い第１の光パルス列を、ストークス光として用いる場合について説明したが、本発明はこれに限られるものではなく、繰り返し周波数の低い第１の光パルス列を、反ストークス光として用いることもできる。

照射光学系２１のミラー３で向きを変えられた、第２の光源２で生成された繰り返し周波数２ｆの第２の光パルス列は、照射光学系２１のハーフミラー４によって、第１の光源１で生成された繰り返し周波数ｆの第１の光パルス列と同軸に合波される。合波された光パルス列は、照射光学系２１の第１の対物レンズ５によって、試料６に集光照射される。なお、本実施形態では第１の対物レンズ５として、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いた。

このように、第１の光周波数（１色目の色）を持つ第１の光パルス列の繰り返し周波数をｆ、第２の光周波数（２色目の色）を持つ第２の光パルス列の繰り返し周波数を２ｆとしたとき、時間１／２ｆごとに、２色のパルスの両方と、２色目のパルスの一方のみとが、交互に現れる。このとき、第１の光周波数と第２の光周波数との周波数差が、測定試料６の被測定分子の分子振動数と一致した場合に誘導ラマン散乱が生じ、２色の光パルスの両方が照射された場合にのみ、第２の光パルス列の励起光パルスに周波数ｆの強度変調が生じる。

この試料６からの散乱光は、集光光学系２２の第２の対物レンズ７で集光される。この第２の対物レンズ７として、本実施形態では第１の対物レンズ５と同様に、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いた。第２の対物レンズ７で集光された散乱光から、集光光学系２２のショートパスフィルタ８によって、第２の光パルス列のみを透過させ、集光光学系２２の集光レンズ９で集光する。

集光レンズ９で集光された光は、受光素子であるフォトダイオード１０で光電変換され電気信号として出力される。このフォトダイオード１０の出力信号を、電子回路であるロックインアンプ１１によってロックイン周波数をｆとして同期検波することで、誘導ラマン散乱によって生じた光のみを検出することができる。

図２は、誘導ラマン散乱顕微鏡での、ロックインアンプの出力信号の例を示すものである。

図２において、横軸は第１の光パルス列と第２の光パルス列とが合波された光の、集光焦点の位置を示し、縦軸はその焦点位置において得られた、ロックインアンプからの出力信号の強さを示している。なお、第２の光パルス列の第２の光周波数の値から、第１の光パルス列の第１の光周波数の値を差し引いた周波数差（ω_ＡＳ−ω_Ｓ）であるラマンシフト（Raman shift）量は、３２４７ｃｍ^−１とした。

図２中の左側では、試料としてガラスのみをおいた場合の出力信号の推移を示していて、図２から明らかなように、空気中に焦点が位置している場合と、ガラス内に焦点が位置している場合での出力信号の差は生じていない。これに対し、試料としてガラスで水を挟んだものを用いた場合の出力信号を示す、図２の右側では、焦点がガラス部分に有る場合に比べて、焦点に水が存在している部分にあるときの出力信号電圧が大きくなっていることが分かる。これは、ガラス内では非共鳴信号が生じていないが、水のＯＨ振動モードによる誘導ラマン散乱効果が検出できていることを示す。

ここで、誘導ラマン散乱顕微鏡による、誘導ラマン散乱効果により得られる分子振動イメージの例を図３に示す。

図３（ａ）は、周波数差（ω_ＡＳ−ω_Ｓ）であるラマンシフト（Raman shift）量を３０２３ｃｍ^−１とした場合の分子振動イメージであり、ポリスチレンのみが白く光っており、周囲の水からの信号は抑制された高コントラストな像が得られる。このときのスキャンサイズは、縦１０μｍ、横１０μｍである。

図３（ｂ）は、図３（ａ）と同じ試料において、周波数差（ω_ＡＳ−ω_Ｓ）であるラマンシフト（Raman shift）量を３２２８ｃｍ^−１とした場合の分子振動イメージであり、この場合には、ポリスチレンビーズの信号レベルが下がるとともに、ＯＨ振動に由来する水からの信号が若干現れて全体のコントラストが低下する。

図３（ｃ）は、植物細胞（ＢＹ２）のＣＨ振動モードを可視化したものである。図３（ｃ）は、縦４０μｍ、横４０μｍの範囲をスキャンした二次元の分子振動イメージであり、ラマンシフト（Raman shift）量は３０２３ｃｍ^−１とした。細胞の周囲の水からの信号が抑制され、核や細胞壁が明確に可視化されていることが理解できる。

図３（ｄ）は、図３（ｃ）で示した二次元の分子振動イメージを、光軸方向に４μｍ間隔で４０μｍにわたって取得した結果から得られた三次元の分子振動イメージである。本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡によれば、このように照射されるビームの焦点の位置を光軸方向にシフトさせて複数の二次元の分子振動イメージを得ることで、測定試料の分子構造の三次元の分子振動イメージを得ることができる。

また、本実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡では、分子状態をリアルタイムで分子振動イメージとして検出することができるので、生体の細胞の変化する状況を動画像として把握することができる。

（第２の実施形態）
次に、本発明の第２の実施形態にかかる誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）効果を用いた光学顕微鏡として、２つの光パルス列のタイミングを高精度に整合させて、高いＳ／Ｎ比で分子振動イメージを取得することができる光学顕微鏡の構成例について説明する。

図４は、本発明の第２の実施形態にかかる光学顕微鏡２００の概略構成を示すブロック図である。

図４に示すように、本実施形態の誘導ラマン散乱効果を用いた光学顕微鏡２００は、第１の光パルス列を生成する第１の光源としてのファイバーレーザー１０１と、第２の光パルス列を生成する第２の光源としてのチタンサファイヤレーザー１０２を備えている。また、本実施形態の光学顕微鏡２００は、第１の光パルス列のレーザー光と、第２の光パルス列のレーザー光のタイミング差を検出するタイミング差検出光学系を有している点が、上記図１を用いて説明した第１の実施形態にかかる光学顕微鏡１００とは異なっている。

第２の光源であるチタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列である超短光パルスレーザービームは、ハーフミラー１０４によって、測定対象の試料１２３の分子振動イメージを得るための測定光１３１と、第１の光源から射出される第１の光パルス列である超短光パルスレーザービームとのタイミング差を検出するためのタイミング差検出光１３２に分離される。なお、タイミング差を検出する場合に、タイミング差検出光学系に導入されるタイミング差検出光１３２と、試料１２３の分子振動イメージを得るために試料に照射される測定光１３１との時間差を調整するために、測定光１３１の光路長を調整することができるよう、ミラー１０５とミラー１０６の位置が図中矢印Ｐで示す方向に調整可能となっている。

第１の光源であるファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列である超短光パルスレーザービームも、第２の光パルス列と同様に、ハーフミラー１１１によって、試料１２３の分子振動イメージを得るための測定光１４１と、第２の光源から射出される第２の光パルス列とのタイミング差を検出するためのタイミング差検出光１４２に分離される。

ファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と、チタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とは、ダイクロイックミラー１１５で同軸に合波されて、レンズ１１７を経てフォトダイオード１１８に集光照射される。このフォトダイオード１１８としては、合波されたレーザービームの二光子吸収を検出するために、例えば近赤外領域での光吸収が無く、可視域のみに吸収を有し、また、高周波特性に優れたＧａＡｓＰフォトダイオードを用いることが好ましい。なお、本実施形態では、第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と、第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とを集光照射するレンズ１１７と、照射された２つのレーザー光によって生じる二光子吸収電流を検出するフォトダイオード１１８とが、タイミング差検出光学系を形成する。

一方、ファイバーレーザー１０１から射出された第１の光パルス列の測定光１４１と、チタンサファイヤレーザー１０２から射出された第２の光パルス列の測定光１３１も、ハーフミラー１１５で同軸に合波されて、ビーム拡張器１２１でビーム径が拡大された後、第１の対物レンズ１２２の瞳全体に入射され、同対物レンズにより集光されて測定対象の試料１２３に照射される。試料１２３からの散乱光は、第２の対物レンズ１２４とショートパスフィルタ１２５を経て、受光素子であるフォトダイオード１２６で電気信号に変換され、フォトダイオード１２６の出力信号をロックインアンプ１２７で同期検波される。

本実施形態の光学顕微鏡２００では、ファイバーレーザー１０１で生成される第１の光パルス列のレーザー光が、ストークス光（ω_Ｓ）であり、中心波長が１０３０ｎｍ程度の適宜の値、パルス幅が３００ｆｓで、繰り返し周波数が３８ＭＨｚに設定されている。また、チタンサファイヤレーザー１０２で生成される第２の光パルス列のレーザー光が反ストークス光（ω_AＳ）であり、中心波長が７８０ｎｍ程度の適宜の値、パルス幅が３００ｆｓで、繰り返し周波数が７６ＭＨｚである。第１の実施形態の光学顕微鏡と同様、第１の光パルス列および第２の光パルス列の波長は、その光周波数差が測定対象試料の分子振動周波数と一致するように、測定対象試料に合わせて適宜調整される。

本実施形態の光学顕微鏡２００において、チタンサファイヤレーザーを繰り返し周波数の高い第２の光パルス列のレーザー光を生成する第２の光源としたのは、チタンサファイヤレーザーは、繰り返し周波数を低く設定するのがファイバーレーザーと比較して困難であるためである。したがって、このことは本発明における必須の要件ではなく、設定される繰り返し周波数に応じて適宜、第１の光源としてチタンサファイヤレーザーを用い、第２の光源としてファイバーレーザーを用いることができる。また、第１の光源、第２の光源の双方を、ファイバーレーザーとすることもできる。

なお、第１の光源で生成される第１の光パルス列の繰り返し周波数は、第２の光源で生成される第２の光パルス列の繰り返し周波数の二分の一でなく、整数分の一であればよい点、２つの光パルス列のうち、いずれをストークス光および反ストークス光として用いてもよいことは、上記第１の実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００の場合と同様である。

さらに、光学部材の仕様なども第１の実施形態の誘導ラマン散乱顕微鏡１００と同様でよく、例えば、第１の対物レンズ１２２および第２の対物レンズ１２４として、倍率×４０、開口数（ＮＡ）０．６のものを用いることができる。また、倍率×１００、ＮＡ１．４の対物レンズを用いればより高い空間分解能を得ることができる。

図４において、１０３，１０５，１０６，１０７，１０８，１０９，１１０，１１２，１１３，１１４，１１６，１２０はいずれもミラーを示している。これらミラーを用いた第１および第２の超短光パルスレーザービーム光の具体的な経路が、適宜変更可能であることは言うまでもない。

図５は、本実施形態の光学顕微鏡２００で用いられるファイバーレーザー１０１の具体的な構成例を示すブロック図である。

図５に示すように、本実施形態の光学顕微鏡２００で第１の光源として用いられるファイバーレーザー１０１は、イッテルビウム添加ファイバー１５１，複数の波長板１５２、偏光ビームスプリッター１５３、分散補償器１５４、可変遅延線１５５、位相変調器１５６、アイソレーター１５７から構成されている。このファイバーレーザー１０１の構成は、一般的なモード同期ファイバーレーザーの共振器内に光路長変換手段である可変遅延線１５５および位相変調器１５６を挿入したものである。

イッテルビウム添加ファイバー１５１は、波長１．０３μｍの光パルスを増幅する。複数個の波長板１５２は、イッテルビウム添加ファイバー１５１の入射光および射出光の偏光を調節する。偏光ビームスプリッター１５３は、ファイバーレーザー１０１内部の光パルスの一部を取り出して射出光１５８とするとともに、イッテルビウム添加ファイバー１５１内の非線形偏波回転効果によるモード同期動作を行う。分散補償器１５４は、ファイバーレーザー１０１内の群速度分散を調節するために挿入される。

可変遅延線１５５と位相変調器１５６とは、レーザー共振器の光路長を調節し、繰り返し周波数を制御するために挿入されている。可変遅延線１５５は、光路長を機械的に調節することができる。また、位相変調器１５６は、電気光学結晶を用いた導波路型デバイスであり、印加される電圧によって結晶の屈折率を変化させることで光路長を調節できる。位相変調器１５６は、調節可能な最大の光路長が数ミクロンと小さいものの、機械的な動作が不要なため、光路長をＭＨｚ以上の高速性をもって制御することができる。アイソレーター１５７は、共振器内の光パルスの進行方向を規定する。

このような構成のファイバーレーザー１０１内において、モード同期動作により光パルスが生成され、周回することによって、レーザー共振器内の光路長に依存した時間間隔で光パルスを出力させ、繰り返し周波数の制御された光パルス列を得ることができる。

図４に示した、同軸に合波された第１の光パルス列のタイミング差検出光１４２と第２の光パルス列のタイミング差検出光１３２とが入射されたフォトダイオード１１８の二光子吸収電流としての光電流は、例えば３００Ωの負荷抵抗で電圧値として検出することで、１ＭＨｚ以上の帯域をもって検出することができる。このとき、検出された信号に含まれる熱雑音等の揺らぎの影響を抑制するために、十分大きな二光子吸収電流を得る必要がある。このためには、２つのパルス列を同軸で合波し、開口数の大きなレンズ、例えば開口数０．５５、倍率５０倍のレンズでフォトダイオードに絞り込むことが有効である。

この検出されたタイミング差を示す電圧信号を、ループフィルター１１９を介して、ファイバーレーザー１０１の共振器内の可変遅延線１５５と位相変調器１５６に導入した。そして、上記電圧信号が一定となるよう、可変遅延線１５５のループ帯域を１Ｈｚ程度、位相変調器１５６のループ帯域を１４０ｋＨｚ程度として制御した。

なお、図５で示した本実施形態の光学顕微鏡２００で用いられるファイバーレーザーでは、光路長変調手段として可変遅延線１５５と位相変調器１５６との２つを用いたが、本発明においてこのことは必須の事項ではなく、ファイバーストレッチャーなど、ファイバーレーザー共振器内の光路長を変化させることができる部材であれば、これを光路長変調手段として用いることを排除するものではない。但し、ループ帯域を１００ｋＨｚ以上に設定できるよう、高速な光路長制御手段を用いることが必要となる。例えば、光路長変調手段としてピエゾ素子のみを用いた場合、ループ帯域を１ｋＨｚ以上に高めることは困難である。ファイバーレーザーが出力する光パルス列は元来大きなジッターを有しているため、ピエゾ素子のように低速な素子を用いてタイミング制御する場合は、２ピコ秒程度の大きなジッターが残留する。

図６は、本実施形態の光学顕微鏡２００における、第１および第２のレーザービームパルスの同期ずれを検出するためのタイミング差検出光学系に用いられたフォトダイオード１１８からの出力信号の状態を示している。

図６において、縦軸が二光子吸収によるフォトダイオード１１８での出力電圧値を示し、横軸が２つのレーザービームパルスのタイミングずれ量を示したものである。２つのパルスのタイミングが一致したときに最も高い電圧が得られ、また、タイミングがパルス時間幅以上ずれると、電圧が低下する様子が見て取れる。このことから、二光子吸収を用いて高精度なタイミング検出が可能になる。

本実施形態の光学顕微鏡２００では、２色のレーザービームパルスのタイミングのずれを、そのピーク位置である図６に示すＤｅｌａｙ＝０で検出するのではなく、約７Ｖ／ｐｓの傾きを有する図６中「Ａ」で示した部分で検出することにより、フォトダイオード１１８からの出力電圧値の変化から、直ちに、ファイバーレーザー１０１で生成される第１の光パルス列のレーザービームと第２の光パルス列のレーザービームとのタイミング差を検出し、ファイバーレーザーの繰り返し周波数制御に使用することができる。

このようにすることで、本実施形態の光学顕微鏡２００では、超短光パルスレーザービームのジッターの影響を回避し、高い精度で２色の超短光パルスレーザービームのタイミングを同期させることができる。

また、本実施形態の光学顕微鏡では、二光子吸収電流と繰り返し周波数制御の帯域を広くとり、ループ帯域を広くすることで、２つの光パルス列の同期が極めて容易となっている。このことは以下のように理解できる。

二光子吸収電流変化は、２つの光パルス列のタイミングがパルス時間ΔＴ程度まで近接した場合しか生じない。ここで、光パルス列が同期していない、すなわち、第１の光パルス列の繰り返し周波数ｆの２倍と、第２の光パルス列の繰り返し周波数２ｆの間にΔｆの差がある場合について考える。実際、未制御時のレーザーの繰り返し周波数は１Ｈｚのオーダーの揺らぎを有しており、このことはΔｆが時間とともに約１Ｈｚ以内で変化すると考えることができる。

このとき、１／Δｆの時間間隔で２つのパルス列のタイミングが揃い、それに伴って二光子吸収電流が変化する。しかし、その二光子吸収電流変化の生じる時間は、２つのパルスのタイミングが重なる時間、すなわちΔＴ／ＴΔｆである。同期を実現するためには、この時間内にタイミング制御を行う必要がある。

ここで、タイミング制御周波数帯域をＢとすると、タイミング同期に要する時間は約１／Ｂで表されるから、不等式 １／Ｂ＜ΔＴ／ＴΔｆ、すなわちΔｆ＜ＢΔＴ／Ｔが成立する必要がある。ここで、ΔＴを３００ｆｓ、Ｔを１２ｎｓ、Ｂを１４０ｋＨｚとすると、Δｆ＜３．５Ｈｚを得る。従って、このようにタイミング制御周波数帯域Ｂを大きくすることで、１Ｈｚオーダーの揺らぎがあったとしても、二光子吸収による同期が達成できる。一方、Ｂが小さい場合には、Δｆに対する要求条件は厳しくなり、未制御時のレーザーを同期させることは事実上不可能である。このような場合、他の同期手法を併用して低精度な同期を行った上で二光子吸収による同期を行う必要があり、系が複雑化する。

図７は、本実施形態にかかる光学顕微鏡２００での２色の超短光パルスレーザービームの同期状態を示す図である。

図７に示すように、本実施形態の光学顕微鏡２００では、２色の超短光パルスレーザービームの偏差として得られるタイミングジッターを、約６．０ｆｓにすることができる。一般的に、ＳＲＳ顕微鏡で分子振動イメージを観察する場合には、タイミングジッターを照射光パルスの時間幅の１０分の１以下とすることが好ましいと考えられるのに対し、本実施形態の光学顕微鏡２００では、タイミングジッターの大きさは、照射光パルスの時間幅の１００分の１程度が実現できている。

以上説明したように、本実施形態の光学顕微鏡２００では、高速光検出器でタイミング差を検出する場合のように測定系を複雑化させることなく、簡素な構成で２光子吸収を検出するとともに、ファイバーレーザーの繰り返し周波数を位相変調器で高速制御することにより、タイミングジッターの影響を抑えた高感度でかつ高いＳ／Ｎ比での分子振動イメージを得ることができる。

なお、上記本発明の第２の実施形態では、タイミング差検出光学系で、第１の光パルス列のレーザー光と第２の光パルス列のレーザー光とによって生じる二光子吸収電流を検出する場合について説明したが、これは、本発明の光学顕微鏡のタイミング差検出光学系を限定するものではない。例えば、タイミング差検出光学系として、和周波発生を用いて２色の超短光パルスレーザービームのタイミング差を検出することもできる。

以上のように、本発明の光学顕微鏡によれば、一方の光パルス列の繰り返し周波数をもう一方の整数分の一とした２色（光周波数：ω_ＡＳ，ω_Ｓ）の光パルス列を試料に集光照射した時に、２色の周波数差が、集光点の試料の分子振動周波数と一致したときに生じる誘導ラマン散乱現象によって、繰り返し周波数の高い励起光パルスの強度変調成分を検出する。この、誘導ラマン散乱は電子の非線形性の影響を受けないため、本顕微鏡で得られる出力信号には、バックグラウンド信号が存在せず、高コントラストな分子振動イメージを得ることができる。

そして、本顕微鏡では、２色の光パルス列の繰り返し周波数を、一方が他方の整数分の一とすることによって、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡で用いられていたような、一方の光パルス列に強度変調を与える音響光学素子などが不要となり、光学顕微鏡の系を簡易化でき、かつ、レーザーの強度雑音低減や動画でのイメージ取得により有利な、照射ビームの高周波変調が可能となる。この結果、簡易な系でありながら、信号対雑音の比率であるＳ／Ｎ比の高い、かつ、高品質の動画像を得ることができる光学顕微鏡を実現することができる。

ここで、誘導ラマン散乱顕微鏡において、ロックイン周波数と、得られる分子振動イメージとの関係について説明する。

図８、および、図９は、いずれも誘導ラマン散乱顕微鏡により得られた、試料の分子振動イメージである。

図８は、試料として水中のポリスチレンビーズを用いたものである。図８（ａ）が、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の分子振動イメージであり、図８（ｂ）が、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の分子振動イメージである。なお、図８（ａ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは５ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は５０ｍｓであった。また、図８（ｂ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは０．６ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は２ｍｓであった。

ロックイン周波数の低い図８（ａ）の分子振動イメージは、ロックイン周波数の高い図８（ｂ）の分子振動イメージよりも明らかに解像度が低く、得られたイメージ画像の周囲がぼやけてビーズの直径が大きく見えてしまっている。また、ロックイン周波数が高くなると、分子振動イメージを得るために必要なビーム照射パワーが小さくなり、ビーム照射系に対する負担が少なくなる。さらに、分子振動イメージを得るために要する時間も短くなり、動画像の取得にもより適していることがわかる。

図９は、試料として植物細胞（ＢＹ２）を用いたものである。図９（ａ）が、ロックイン周波数が２ＭＨｚの場合の分子振動イメージであり、図９（ｂ）が、ロックイン周波数が１０ＭＨｚの場合の分子振動イメージである。図９（ａ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは４．５ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は１００ｍｓ、図９（ｂ）の分子振動イメージを得たときの光パワーは１ｍＷ、分子振動イメージを得るために要した積算時間は３ｍｓであった。

図８と同様に、図９（ａ）および図９（ｂ）の分子振動イメージからも、ロックイン周波数が高いほど得られる分子振動イメージの信号対雑音比が高く、また、画像のコントラストも良好であり、植物細胞の詳細な様子が把握できることが分かる。また、図９（ａ）および図９（ｂ）を得るためのデータから、ロックイン周波数が高いほど、分子振動イメージを得るための光パワーや積算時間が少なくてすむことが分かる。

以上より、本実施形態として示した誘導ラマン散乱顕微鏡において、一定以上の解像度の分子振動イメージを得るためには、ロックイン周波数が１０ＭＨｚ以上あることが好ましいことが分かる。ロックイン周波数を１０ＭＨｚとするためには、繰り返し周波数の低い光パルス列の繰り返し周波数を１０ＭＨｚ、繰り返し周波数の高い光パルス列の繰り返し周波数を２０ＭＨｚとすればよい。また、ロックイン周波数を１０ＭＨｚ以上とすると、分子振動イメージを得るために必要な光パワーが１ｍＷ程度で済み、この程度の光パワーであれば、ビーム照射系に大きな負担がかからない。さらに、ロックイン周波数を１０ＭＨｚ以上とすると、分子振動イメージを得るための積算時間が数ｍｓ程度となることから、動画像の取得を考慮する意味でも好ましい条件といえる。

次に、本実施形態として示した誘導ラマン散乱顕微鏡で得られたロックイン信号に含まれるノイズレベルと、イメージ受光部としてのフォトダイオードで得られる出力電流の大きさとの関係について、図１０を用いて説明する。

図１０は、上記第２の実施形態として示した光学顕微鏡２００における、ロックイン信号中のノイズ成分を測定した結果を示すものである。図１０中の「黒丸」が、測定結果データのプロットである。

図４に示した光学顕微鏡２００において、チタンサファイヤレーザー１０２とファイバーレーザー１０１を同期させた状態で、チタンサファイヤレーザー光のみをフォトダイオード１２６に導入した。このとき、ファイバーレーザー光は、光フィルタ１２５により除去されている。フォトダイオード１２６の出力信号を、ロックインアンプ１２７に入力し、ファイバーレーザー１０１から得られる繰り返し周波数３８ＭＨｚの電気信号を、ロックインアンプ１２７の参照信号として用いた。

そして、フォトダイオード１２６に入力する光の強度を変化させながら、ロックインアンプ１２７の出力雑音を測定した結果が、図１０中のプロットである。なお、ロックインアンプ１２７の積分時間は０．１ｍｓとした。

図１０において、横軸はフォトダイオード１２６から得られた光電流の直流成分を表している。また、フォトダイオード１２６の受光回路の雑音レベルを点線ａで、光電流から計算されるフォトダイオード１２６のショット雑音を実線ｂで示した。

図１０より、図１０中左側に示す、光電流値が１０^−１ｍＡよりも小さい領域では回路の雑音が支配的であるが、光電流が大きくなるにつれて雑音が増大することがわかる。ここで、チタンサファイヤレーザー光がショット雑音以上の過剰雑音を有する場合、ロックイン信号の雑音電圧は光電流に比例すること、また、チタンサファイヤレーザー光がショット雑音限界の低雑音性を有する場合、ロックイン信号の雑音電圧は光電流の平方根に比例することが知られている。

実験では、ロックイン信号の雑音電圧は、光電流値が０．２ｍＡより大きい領域において、光電流の平方根に比例しており、ショット雑音限界の低雑音性が得られたことを示唆している。なお、この光電流値が０．２ｍＡより大きい領域のプロットを結ぶ実線ｃと、ショット雑音の理論値を示す実線ｂとの間には、図中ｙとして示した約１．６ｄＢの差があるが、これは光検出回路に含まれるバンドパスフィルタ回路の損失に起因すると推察される。

また、チタンサファイヤレーザーと光パラメトリック発振器により繰り返し周波数７６ＭＨｚの光パルスを得て、後者に対して光変調器を用いて１０．７ＭＨｚの光変調を行い、ロックイン検出を行ったシステムにおけるロックイン信号の雑音を、今回の実験条件に換算した結果を図中×（Ｂ）として示した。

図１０より、従来の雑音レベルＢと比較して、ロックイン周波数を３８ＭＨｚと高周波化したことにより、雑音レベルを図中ｘとして示すように１２ｄＢ以上抑制することができた。この結果からも、ロックイン周波数の高周波化による低雑音化の有効性が確認できた。図１０の実験データから明らかなように、ロックイン周波数を３８ＭＨｚとすることで、ロックイン信号のノイズレベルを受光素子であるフォトダイオード１２６のショット雑音レベルにまで低減できることから、ロックイン周波数を３８ＭＨｚ以上とすることで、極めてノイズレベルの小さな分子振動イメージが取得できることが分かる。

なお、実際に取得された分子振動イメージと、ノイズレベルについての実験データから確認できたように、ロックイン周波数が高くなるほど、より短時間でより鮮明な分子振動イメージを取得することができることが理解できる。このことは、特に、動画での分子振動イメージである動画像の取得にとって有利なものとなるが、フォトダイオードで分子振動イメージを取得するにはサンプルに照射される光パワーの平均レベルからの限界があり、ロックイン周波数を高くしすぎると投入された光エネルギーによるサンプルの損傷を引き起こす可能性がある。このため、ロックイン周波数の設定に当たっては、サンプルの損傷を起こさない限度において、受光回路系の能力を勘案した上で、適宜上限値を設定することが好ましい。

なお、図１０のデータを得るに当たっては、受光回路の雑音レベル（図１０における点線ａ）を低減するために、フォトダイオード１２６の受光回路として、図１１に示すものを用いた。

図１１に示すように、雑音レベルを低減する受光回路としては、フォトダイオードＰＤの寄生容量による周波数特性の低下を抑えるために、フォトダイオードＰＤと並列にインダクタンスＬを接続し、かつ、インダクタンスＬと並列に接続される負荷抵抗Ｒの値を、高周波回路に一般的に用いられる負荷抵抗値５０Ωよりも高くした。

図１０のデータを取得するための具体的な回路の一例としては、フォトダイオードＰＤの寄生容量が２０ｐＦ、インダクタンスＬが８２０ｎＨ、負荷抵抗Ｒの抵抗値を５００Ωとした。本実施形態の光学顕微鏡２００のように、誘導ラマン散乱顕微鏡に用いられるフォトダイオードＰＤは、受光面積が大きく寄生容量が大きくなりがちであるため、上記のような対策を受光回路に施すことで、雑音レベルを低減することができる。なお、このときの負荷抵抗Ｒの値としては、１００Ω以上であることが好ましいと考えられる。したがって、フォトダイオードＰＤの寄生容量の数値と用いるインダクタンスＬの値とを勘案しながら、負荷抵抗の値を１００オーム以上の適宜な値とすることが好ましい。

また、フォトダイオードＰＤの受光回路として、図１１に示したものを用いることによるフォトダイオードＰＤの周波数特性の低下を抑える効果は、試料に照射される光パルス列の生成経緯には関係のないものである。このため、図１１に示したフォトダイオードＰＤの受光回路は、上記本発明の実施形態として示した、第１の繰り返し周波数の光パルス列と第２の繰り返し周波数の光パルス列とを異なる光源で生成する光学顕微鏡のみならず、非特許文献１および非特許文献２に示された、一方の光パルス列を変調して他方の光パルス列を生成する従来の光学顕微鏡にも用いることができ、良好な効果を奏することができる。

上記検討したように、本実施形態の光学顕微鏡においてより高い解像度の分子振動イメージを得る上では、ロックイン周波数を高くすることが極めて有利であることが理解できる。本発明の光学顕微鏡によれば、２色の光パルス列の繰り返し周波数を、一方が他方の整数分の一の繰り返し周波数を持つ２つの光源により生成することで、ロックイン周波数の高周波化に容易に対応することができる。このため、本発明の光学顕微鏡は、音響光学素子をはじめとする変調器が不可欠な、従来の誘導ラマン散乱顕微鏡と比較して、光学顕微鏡の系を簡易化でき、かつ、レーザーの強度雑音が低減できてＳ／Ｎ比の高い分子振動イメージを得ることができ、さらに、動画像の取得がより有利となるという、実用面での優れた特徴を有している。

以上、上記実施の形態では、本発明の光学顕微鏡として、誘導ラマン散乱を検出するものについて説明したが、本発明の構成を用いて検出できるのは、上記の誘導ラマン散乱に限られたものではない。例えば、他にも、２色の光パルスの和周波数であるω_ＡＳ＋ω_Ｓが試料の２光子吸収周波数と一致するように光パルスの波長を選択することにより、高コントラストな２光子吸収像を得ることができる。

また、上記実施形態では、本発明の適用対象を光学顕微鏡に限定して説明してきた。しかし、第２の光パルス列の繰り返し周波数の整数分の１の繰り返し周波数を有する第１の光パルス列を生成するに当たり、同じ繰り返し周波数の２つの光パルス列のうちの一方を変調して繰り返し周波数を整数分の１とする方法に比べ、一方の生成する光パルス列の繰り返し周波数が、他方の生成する光パルス列の繰り返し周波数の整数分の１である２つの光源を用いる本願発明の方法によれば、より高い周波数でのロックイン検出を簡易な構成で行うことができる。

したがって、本発明の技術思想は、光学顕微鏡への適用に留まるものではなく、高い周波数でのロックイン検出を行うことで、測定結果のノイズ成分が低減され、Ｓ／Ｎ比の高い測定結果が得られる点で、各種の光学計測に適用して良好な結果を得ることができるものである。なお、このような、本発明の技術思想を適用すべき光学計測として、たとえばポンププローブ計測などが想定できる。

以上説明したように、本発明の光学顕微鏡は、生体細胞などの画像イメージ化ができる光学顕微鏡として、幅広い分野での用途が期待できる。また、本発明は、さまざまな光学計測に応用展開ができる。

Claims (15)

1. 第１の光周波数を有する第１の光パルス列を試料に照射する第１の光源と、
   前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光周波数を有する第２の光パルス列を前記試料に照射する第２の光源と、
   前記第１の光パルス列および前記第２の光パルス列が前記試料に照射されることにより生じた散乱光を電気信号に変換する受光素子と、
   前記第１の光パルス列の第１の繰り返し周波数をロックイン周波数として、前記受光素子からの前記電気信号を同期検波するロックインアンプと、
   を備えており、
   前記第１の光パルス列の前記第１の繰り返し周波数は、前記第２の光パルス列の第２の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学顕微鏡。
2. 前記第１の繰り返し周波数は、前記第２の繰り返し周波数の二分の一であることを特徴とする請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列とを同時に前記試料に照射する照射光学系と、
   前記試料からの散乱光のうち、前記第１の光パルス列を除去し、他を前記受光素子に集光する集光光学系と、
   をさらに備えることを特徴とする請求項１または２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記第１の光源および前記第２の光源の少なくともいずれか一方は、ファイバーレーザーであり、
   前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列のタイミング差を検出し、該タイミング差を出力信号に変換する検出光学系を備えることを特徴とする請求項３に記載の光学顕微鏡。
5. 前記ファイバーレーザーは、その共振器内に光路長変調手段を有しており、前記検出光学系からの出力信号に基づいて前記光路長変調手段を駆動することにより、前記第１の光パルス列のタイミングと前記第２の光パルス列のタイミングとを整合させることを特徴とする請求項４に記載の光学顕微鏡。
6. 前記光路長変調手段は、可変遅延線、および、位相変調器であることを特徴とする請求項５に記載の光学顕微鏡。
7. 前記検出光学系は、前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列が集光照射されて生じる二光子吸収電流を検出することを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
8. 前記ロックインアンプは、前記第１の光パルス列および前記第２の光パルス列が前記試料に照射されることで生じた誘導ラマン散乱により強度変調された前記第２の光パルス列を検出することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
9. 前記第１の光源及び前記第２の光源は、前記第１の光周波数と前記第２の光周波数との周波数差が前記試料の分子振動周波数と一致するように調整されていることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
10. 前記第１の光源及び前記第２の光源は、前記第１の光周波数と前記第２の光周波数との和周波数が前記試料の二光子吸収周波数と一致するように調整されていることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
11. 第１の光源により生成された第１の光周波数を有する第１の光パルス列を試料に照射するとともに、前記第１の光パルス列と時間的に同期した、第２の光源により生成された第２の光周波数を有する第２の光パルス列を前記試料に照射する照射ステップと、
    前記第１の光パルス列および前記第２の光パルス列が前記試料に照射されることにより生じた散乱光を電気信号に変換する変換ステップと、
    前記第１の光パルス列の第１の繰り返し周波数をロックイン周波数として、前記電気信号を同期検波する同期検波ステップと、
    を有しており、
    前記第１の光パルス列の前記第１の繰り返し周波数は、前記第２の光パルス列の第２の繰り返し周波数の整数分の一であることを特徴とする光学顕微鏡の制御方法。
12. 前記第１の繰り返し周波数は、前記第２の繰り返し周波数の二分の一であることを特徴とする請求項１１に記載の光学顕微鏡の制御方法。
13. 前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列とを前記試料に同時に照射する同時照射ステップと、
    前記試料からの散乱光のうち、前記第１の光パルス列を除去して他を集光する除去ステップと、
    を備えることを特徴とする請求項１１または１２に記載の光学顕微鏡の制御方法。
14. 前記第１の光パルス列および前記第２の光パルス列の少なくともいずれか一方はファイバーレーザーによって生成され、
    前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列のタイミング差を検出する検出ステップと、
    前記検出したタイミング差に基づいて、前記第１の光パルス列のタイミングと前記第２の光パルス列のタイミングとを整合させる整合ステップと、
    を有することを特徴とする請求項１３に記載の光学顕微鏡の制御方法。
15. 前記第１の光パルス列と前記第２の光パルス列が集光照射されて生じる二光子吸収電流を検出する検出ステップを有することを特徴とする請求項１４に記載の光学顕微鏡の制御方法。