JP5463012B2 - 膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法 - Google Patents
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Description
好ましくは、グリセリドは、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている。
好ましくは、グリセリドはトリグリセリドである。
好ましくは、トリグリセリドはトリオレインである。
好ましくは、グリセリン測定試薬は、グリセロールキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬を含む。
好ましくは、展開層は、布または多孔質膜からなるものである。
好ましくは、多孔質膜は、ポリスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成される多孔質膜である。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼの添加量は8000U/m2から1000U/m2である。
本発明では展開層に布製の展開層を用いることが好ましいが、ポリスルホン、アセチルセルロースからなる多孔質膜または、微小ビーズから形成する多孔質膜、ガラス繊維濾紙、濾紙など布以外の材質を使用することも可能である。
(1)グリセリン発色試薬の添加:
ゼラチン下塗りがされている厚さ180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に下記の組成の試薬を水溶液として塗布、乾燥させたのち、続いて、水を均一供給し湿潤させ、その上に50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥温度20℃でゼラチンを固めたのち、45℃で乾燥させた。なお、pH緩衝剤PIPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH6に調整したものを用いた。
PIPES(同仁化学) 22 g/m2
塩化マグネシウム(和光純薬工業)0.52 g/m2
ATP−2ナトリウム塩(オリエンタル酵母)1.4 g/m2
ポリオキシエチレントリデシルエーテルHLB14.8(第一工業製薬)0.55 g/m2
ポリエチレンアルキル分岐デシルエーテルHLB15.9 (第一工業製薬)0.059 g/m2
ロイコ色素 0.21 g/m2
ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡)14 KU/m2
グリセロールキナーゼ(旭化成)3.8 kU/m2
L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ(旭化成)19 kU/m2
1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン 3.3 g/m2
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で、15分間、温風乾燥させた。風速は0.5m/分で1分、5m/分で15分であった。ここで、トリオレイン1.1gに対し、エタノールを175g加えることで溶解した。
ポリビニルピロリドンK90(BASF社製)2.0 g/m2
トリオレイン(95%、ICN-Biochemical)1.1 g/m2
さらに、下記試薬を水に溶解し、塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pH緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH8.0に調整したものを用いた。
デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬) 4.6 g/m2
タウロデオキシコール酸ナトリウム 1.5 g/m2
メトロース 2.1 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/m2
ブタコリパーゼ(ロシュ)0.051 g/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡)8500 U/m2
ヒトリパーゼ(旭化成ファーマ)を血清に添加した液10μlを実施例1で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム5500を用いた。測定の結果を図1に示す。膵リパーゼ濃度に依存し、発色反応が起きることが確認された。
実施例1の実験において、基質の添加の部のトリオレインを、以下のように1,2-ジグリセリドに変更した以外は、実施例1と同様にして膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。実施例2では、実施例1のアスコルビン酸オキシダーゼは添加しなかった。
上記の布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で、温風乾燥させた。
塩化カルシウム(和光純薬)0.18 g/m2
ポリビニルピロリドンK90 2.0 g/m2
1,2-ジリノイルグリセロール(旭化成ファーマ)1.1 g/m2
ヒトリパーゼ(旭化成ファーマ)を血清に添加した液10μlを実施例2で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム5500を用いた。測定の結果を図2に示す。図2の通り、トリオレインと同様に、ジグリセリドであるリノリルジグリセリドでも膵リパーゼによる発色が確認された。ただし、反応のバックグランド(7%ヒトアルブミン液での発色)が高い結果を得た。
基質の溶剤、および乾燥条件を調べるため、実施例1の実験のグリセリン発色試薬を添加した布ラミネートシートに、下記の通りの溶剤を加えた後(添加量は実施例1と同等)、すぐに、または3〜20分室温に放置した後、乾燥方法として室温での真空乾燥と温風乾燥(実施例1と同等)を行い乾燥した。評価として、3mMグリセリンの7%ヒトアルブミン液を10μl点着し、37℃で加温し650nmの反射濃度を測定することで、グリセリンの色素への変換反応を測定した。測定装置は、市販の富士ドライケム5500を用いた。
解析のため、実施例1で基質であるトリオレインを加えず、モノグリセリドリパーゼ量を下表の通り変更し、乾式分析要素を作製した。
リパーゼをほとんど含まないイヌ乳び検体10μlを実施例3で作製した膵臓リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム5500を用いた。測定の結果を図4に示す。
実施例1の基質トリオレインの代わりに、トリステアリンを使用し、基質液の成分の塗布量は以下に示した条件で、他は実施例1と同じ条件でリパーゼ測定用乾式分析要素を作製した。基質の溶剤は、実施例と同じくエタノールを用い、トリステアリン1.14gに対しエタノール174gを加えたが、基質の溶解性が悪かったため懸濁液として塗布した。このため、塗布液の凝集を抑制するため、ポリビニルピロリドンK90は増やした。
塩化カルシウム(和光純薬)0.18 g/m2
ポリビニルピロリドンK90(BASF社製)10.0 g/m2
トリステアリン(シグマ社)1.1 g/m2
ヒトリパーゼ(旭化成ファーマ)をイヌ血清に添加した液10μlを実施例4で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し発色濃度の変化を調べた。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。測定の結果を図5に示す。膵リパーゼ濃度に依存し、発色反応が起きることが確認された。しかし、リパーゼの反応性はトリオレインより低かった。
イヌ血清(N=105)10μlを実施例1で作製した膵リパーゼ乾式分析要素に点着し、37℃で加温し3分から5分の2分間の発色濃度の変化からリパーゼ濃度を算出した。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。対照法は、1,2−O−ジラウリルーrac−グリセロ−3−グリタル酸・レゾルフィンエステルを基質とする溶液法(ロシュ社)を用いた。結果を図6に示す。R=0.95と良好であった。
実施例1で作製した膵リパーゼ乾式分析要素にイヌ血清10μlをN=20で点着し、37℃で加温し3分から5分の2分間の発色濃度の変化からリパーゼ濃度(U/L)を算出し、同時再現性(CV)、標準偏差(SD)を求めた。測定装置は、市販の富士ドライケム7000を用いた。結果を表3に示すが、良好な結果を得た。
Claims (14)
- 炭素数14から20の長鎖アルキル脂肪酸のジグリセリドまたはトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開層または試薬層を含む体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、低級アルコールまたはアセトンに溶解したグリセリドを上記展開層または試薬層に添加して温度が25〜40℃である温風乾燥により乾燥する工程を含み、モノグリセリドリパーゼの添加量が8000U/m 2 から2000U/m 2 であることを特徴とする、上記乾式分析要素の製造方法。
- グリセリドが、メタノール、エタノール、プロピルアルコールまたはアセトンに溶解されている、請求項1に記載の乾式分析要素の製造方法。
- グリセリドがエタノールに溶解されている、請求項1又は2に記載の乾式分析要素の製造方法。
- グリセリドがトリグリセリドである、請求項1から3の何れかに記載の乾式分析要素製造方法。
- トリグリセリドがトリオレインである、請求項1から4の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
- モノグリセリドリパーゼがバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである、請求項1から5の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
- グリセリン測定試薬が、グリセロールキナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼと発色試薬を含むことを特徴とする、請求項1から6の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
- 乾式分析要素の構成が、水不透過性支持体と試薬層と展開層からなる、請求項1から7の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
- 展開層が、布または多孔質膜からなるものである、請求項1から8の何れかに記載の乾式分析要素の製造方法。
- 多孔質膜が、ポリスルホンもしくはアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成される多孔質膜である、請求項9に記載の乾式分析要素の製造方法。
- 展開層が、布からなるものである、請求項9に記載の乾式分析要素の製造方法。
- 請求項1から11の何れかに記載の方法によって製造される、体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素。
- 請求項1から11の何れかに記載の方法によって製造される体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素に体液を適用して、該体液中の膵リパーゼを測定する方法。
- 体液がイヌ血液である、請求項13に記載の体液中の膵リパーゼを測定する方法。
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