JPH0560360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］ 本発明は液体、殊に生物体液中の、酵素活性の
測定に適する乾式液体分析要素に関する。 ［従来技術］ 水浸透性層に乳酸またはその塩と酸化型ニコチ
ンアミド補酵素（NAD⁺）とを含み、生成する還
元型ニコチンアミド補酵素（NADH）を呈色試
薬等により検出する乾式液体分析要素は、液体中
の乳酸脱水素酵素（如何LDHと略記する）活性
測定に適する。このようなLDH活性分析要素は
特開昭59−88097号等で知られている。 しかしこのような乾式液体分析要素の使用中
に、背景濃度が増大し、予め設定された検量線が
利用できなくなることがしばしば経験され、その
原因が不明であつた。 特にNAD⁺を含む水浸透性層に試薬を結合剤と
して、NAD⁺に対する安定剤として特公昭49−
27717号の記載で知られるポリビニルピロリドン
を用いると、この現象が顕著であつた。 ［発明の目的］ 本発明者らは上記の現象を原因を追求した結
果、水浸透性層にNAD⁺を含むLDH活性分析要
素が、照明、特に蛍光灯照明下に長い時間置かれ
たときに背景濃度が増大することを見出した。 本発明の目的の一つは、少なくとも一つの水浸
透性層を有し、その少なくとも一つは多孔性液体
展開層であり、水浸透性層の少なくとも一つに乳
酸またはその塩とNAD⁺を含む、液体中のLDH
活性測定に適する乾式液体分析要素を取り扱い中
の背景濃度の増大を防止し、精度の高い分析要素
を得ることである。 ［発明の構成］ 本発明の上記目的は、水浸透性層の少なくとも
一つに基質とNAD⁺を含む、液体中の酵素活性測
定に適する乾式液体分析要素において、水浸透性
層の少なくとも一つに アクリルアミド重合体、 メタクリルアミド重合体、 アクリルアミドとメタクリルアミドの共重合
体、 から選ばれる親水性高分子を含むことを特徴とす
る乾式液体分析要素によつて達成された。 本発明の上記目的は、前記乾式液体分析要素に
おいて基質とNAD⁺を含む親水性層またはNAD⁺
を含む層に前記親水性高分子を含む乾式液体分析
要素によつて、好ましく達成された。 前記親水性高分子を含む層は、多孔性展開層で
あることが好ましいが、他の水浸透性層でもよ
い。 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用する
ことが出来る。要素は反応試薬層のほか、支持
体、検出像、光遮蔽層、多孔性液体展開層、接着
層、ろ過層、吸水層、下塗り層および公知のその
他の層を含む多重層であつてもよい。かような分
析要素として、米国特許第3992158号、同4042335
号および特開昭55−164356号各明細書に開示され
たものがある。 支持体を用いる場合、本発明で製造される乾式
分析要素に実用的に採りうる構成は (1) 支持体上に試薬層を兼ねる液体展開層を有す
るもの。支持体と展開層との間に検出層または
吸水層を設けてもよい。 (2) 支持体上に試薬層、その上に液体展開層を有
するもの。支持体と試薬層との間に吸水層を設
けてもよい。試薬層または液体展開層に前記親
水性高分子を含む。 (3) 支持体上に検出層、試薬層、液体展開層をこ
の順に有するもの。試薬層または液体展開層、
あるいは両者に前記親水性高分子を含む。 (4) 支持体上に試薬層、光反射層、液体展開層を
この順に有するもの。試薬層、液体展開層のい
ずれか１層以上に前記親水性高分子を含む。 (5) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層を兼ね
る液体展開層をこの順に有するもの。液体展開
層に前記親水性高分子を含む。 (6) 支持体上に検出層、試薬層、光反射層、液体
展開層をこの順に有するもの。試薬層、液体展
開層のうち少なくとも１層に親水性高分子を含
む。 (7) 支持体上に検出層、光反射層、試薬層、液体
展開層をこの順に有するもの。少なくとも試薬
層または液体展開層に前記親水性高分子を含
む。 (8) 支持体上に検出層、第二試薬層、光反射層、
第一試薬層、液体展開層をこの順に有するも
の。第二試薬層またはそれより支持体から離れ
た層のうち、少なくとも１つに前記親水性高分
子を含む。 上記(2)ないし(8)において、支持体と試薬層また
は検出層との間に、吸水層を設けてもよい。本発
明で好ましいのは上記(2)または(4)の層構成であ
る。上記(2)ないし(3)において試薬層と検出層また
は液体展開層の間、または複数の試薬層の間に、
ろ過層を設けてもよい。上記(4)ないし(8)において
光反射層と検出層、試薬層または液体展開層との
間、試薬層と検出層との間、試薬層と液体展開層
の間、または第二試薬層と第一試薬層の間に、さ
らにろ過層を設けてもよい。 本発明の分析要素に含まれる反応試薬系は、 基質としての乳酸またはその塩と NAD⁺、および NADHと反応して検出し得る変化、例えば 発色、変色、蛍光等を生ずる試薬 から成る。NADH検出試薬としては電子伝達
剤とホルマザン染料前駆体の組み合わせが好まし
い。反応試薬系は多孔性担体層に含まれても、ま
たそれ以外の水浸透性層に含まれてもよい。試薬
系の一部の残部とが、異なる層に含まれてもよ
い。 電子伝達剤としては、ヂアホラーゼ、Ｎ−
methyl phenazonium methosulfate等を用いる
ことができる。フオルマザン染料前駆体として
は、INTすなわち２−（ｐ−iodophenyl）−３−
（ｐ−nitrophenyl）−５−phenyltetrazolium
chloride、BTすなわち３，3′−（３，3′−
dimethoxy−４，4′−biphenylene）−bis［２，５
−diphenyltetrazolium chloride］、３，3′−（４，
4′−biphenylene）−bis［２，５−
diphenyltetrazolium chloride］等を用いること
もできるが、ニトロテトラゾリウムブルー
（NTBまたはNBT）すなわち３，3′−（３，3′−
dimethoxy−４，4′−biphenylene）bis［２−（ｐ
−nitrophenyl）−５−phenyltetrazolium
chloride］が好ましい。 本発明の乾式分析要素において基質は二つ以上
の層（例えば試薬層と液体展開層、試薬層と光遮
蔽層、第二試薬層と第一試薬層、第一試薬層と液
体展開層）に含有されてもよい。この場合に基質
を、支持体から遠い層か支持体に近い層のいずれ
かに、より多く分布させることもできる。 本発明においてNAD⁺も二つ以上の層に含有さ
れてもよく（例えば試薬層と液体展開層、試薬層
と光反射層）、この場合支持体から遠い層か支持
体に近い層のいずれかにより多く分布させること
もできる。 本発明の乾式分析要素を用いることができる光
透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエ
チレンテレフタレート、ポリカルボネート、ポリ
スチレン、セルロースエステル（例、セルロース
トリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約50μｍか
ら約１mm、好ましくは約80μｍから約300μｍの範
囲のフイルムもしくはシート状の透明支持体を挙
げることができる。これら支持体の表面には必要
により下塗層を設けて、支持体の上に設けられる
検出層あるいはその他の層と支持体との接着を強
固なものにすることができる。また、下塗層に代
りに、支持体の表面に物理的（たとえばグロー放
電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処理を
施して接着力の向上を図つてもよい。 本発明の一体型多層分析要素には、光透過性・
水不透過性支持体の上に（下塗層等の他の層を介
してもよい）検出層または吸水層を設けてもよ
い。本発明の乾式分析要素に備えられる検出層は
親水性結合性、すなわち水を吸収して膨潤する親
水性ポリマーを層形成成分とする層であることが
好ましい。検出層は呈色指示薬から生じた色体が
拡散し得る層を言い、吸水層は色体が実質上拡散
しえない層である。 検出層または吸水層に用いることができる親水
性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30℃
で約1.5から20、好ましくは約2.5から15の範囲の
天然または合成親水性ポリマーである。そのよう
な親水性ポリマーの例としては、ゼラチン（例え
ばアルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、脱イ
オンゼラチン）、ゼラチン誘導体（例えばフタル
化ゼラチン）、アガロース、ポリアクリルアミド、
等をあげることができる。 検出層の乾燥時の厚さは約1μｍから約50μｍの
範囲であることが好ましく、より好ましくは約
3μｍから約30μｍの範囲である。さらに検出層に
は、必要に応じて界面活性（カチオン性、両性又
は非イオン性）や緩衝剤を含有させることもでき
る。 吸水層、検出層、光遮へい層、過層、試薬層
等の層の上には、展開層を接着し積層するための
接着層を設けてもよい。接着層は水で湿潤または
水を含んで膨潤したときに展開層を接着すること
ができるような親水性ポリマーからなることが好
ましい。接着層に用いることができる親水性ポリ
マーの例としては、検出層に用いられると同様な
親水性ポリマーがあげられる。これらのうちでは
ゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド
等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μ
ｍから約20μｍ、好ましくは約1μｍから約10μｍ
の範囲である。なお、接着層は検出層上以外に
も、他の層間の接着力を向上させるため所望の層
上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、
必要によつて加えられる界面活性剤等を含む水溶
液を公知の方法で、検出層や試薬層等の上に塗布
する方法などにより設けることができる。 本発明の乾式分析要素の試薬層には、親水性ポ
リマー、緩衝剤等を必要に応じて含有させること
ができる。 本発明の乾式分析要素の試薬層に含有させるこ
とができる親水性ポリマーの例としては、澱粉、
セルロース、アガロース、ゼラチンおよびこれら
の誘導体（例えばフタル化ゼラチン等）、アクリ
ルアミド重合体、アクチルアミドと各種ビニル性
モノマーとの共重合体、メタアクリルアミド重合
体、メタアクリルアミドと各種ビニル性モノマー
との共重合体、等を挙げることができる。 本発明の乾式分析要素の試薬層に含有させるこ
とができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸
塩、燐酸塩やグツト（Good）の緩衝剤などを挙
げることができる。これらの緩衝剤は『蛋白質・
酵素の基礎実験法』（堀尾武一ほか著、南江堂、
1981）等の公知文献を参考にして選択し、使用す
ることができる。 光遮蔽層は、検出層、試薬層等に生じた検出可
能な変化（色変化、発色等）を光透過性を有する
支持体側から反射側光する際に、展開層に点着供
給された被検液の色、特に試料が全血である場合
のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反
射層または背景層として機能する。光遮蔽層は、
皮膜形成能を有する親水性ポリマーをバインダー
として、酸化チタン、硫酸バリウム等の光反射性
微粒子が分散された水浸透性の層であることが好
ましい。 皮膜形成能を有する親水性ポリマーバインダー
の例としては、前述の検出層に用いられる親水性
ポリマーのほか、弱親水性の再生セルロール、セ
ルロースアセテート等を挙げることができ、これ
らのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリア
クリルアミド等が好ましい。ゼラチン、あるいは
ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加すること
ができる。 光遮蔽層は、酸化チタン等と親水性ポリマーと
の水性分散液を公知の方法により検出層、試薬層
等の上に塗布し乾燥することにより設けることが
できる。分析要素には、必要に応じ展開層、試薬
層、検出層等に酸化チタン等の粒子を含有させて
もよい。 展開層は、液体計量作用を有する展開層である
ことが好ましい。液体計量作用を有するとは、そ
の表面に点着供給された液体試料を、その中に含
有している部分を実質的に偏在させることなく、
横（水平）方向に単位面積当りほぼ一定量の割合
で広げる作用を有することである。 展開層のマトリツクスを構成する材料として
は、紙、不織布、織物生地（例えば平織生地）、
編物生地（例えば、トリコツト編）、ガラシ繊維
紙、ブラツシユポリマーより形成されるメンブ
ランフイルター、あるいはポリマーミクロビーズ
等からなる三次元格子状構造物等を用いることが
できる。これらのうちでは、繊維生地および編物
生地等の繊維質層を用いることが好ましい。これ
らを詳細については特開昭55−164356号、同57−
66359号および同60−222769号を参照すればよい。 本発明の乾式分析要素に用いることができる織
物生地または編物生地は水洗体の脱脂処理により
少なくとも糸、織物あるいは編物の製造時に付着
した油脂類が実質的に除去されていることが好ま
しい。 本発明の一体型多層分析要素は一辺約15mmから
約30mmの正方形またはほぼ同サイズ円形等の小片
に裁断し、特開昭57−63452号、特開昭54−
156079号、実開昭56−125424号、実開昭58−
32350号および特表昭58−501144号各公報等に開
示のスライド枠等に納めて分析スライドとして用
いるのが製造、包装、輸送、保存および測定操作
等の全ての観点で好ましい。 以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。 実施例 １ ゼラチン下塗りされている厚さ180μｍのポリ
エチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上
に下記の組成(a)の水溶液を乾燥後の厚さが10μｍ
になるように塗布（133c.c.／m²）し、乾燥した
（発色層）。 (a) ゼラチン 150ｇ 水 1350ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール３ｇ NTB＊ 9.5ｇ （希NaOH溶液でPHを6.5に調整する） ＊Nitrotetrazolium blue＝３，3′−（３，3′−ジ
メトキシ−４，4′−ビフエニレン）ビス［２−
（ｐ−ニトロフエニル）−５−フエニルテトラゾリ
ウムクロライド］ 上記発色層を約30ｇ／m²の水で湿らせた後、ポ
リエチレンテレフタレート紡績糸（36ゲージ、
50D）からなるトリコツト編物を圧着し、乾燥さ
せて展開層とした。 上記展開層に下記の組成(b)の塗布液を120c.c.／
m²の割合で塗布し、乾燥し、LDH活性測定用一
体型多層分析要素を作製した。 (b) ノニルフエノキシポリエトキシエタノール（ｎ＝
40） １ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール（ｎ
＝10） １ｇ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ６ｇ 乳酸リチウム ３ｇ ポリアクリルアミド（分子量 約20万） 25ｇ β−NAD 0.6ｇ シアホラーゼ 1.5万単位 水 100ｇ （希HCl溶液でPHを8.5に調整する） 比較例 １ 実施例１における展開層塗布液の組成(b)を下記
組成（b′）に変えた他は、実施例１と同様にして
LDH活性測定分析要素を作製した。 （b′） ノニルフエノキシポリエトキシエタノール（ｎ＝
40） １ｇ オクチルフエノキシポリエトキシエタノール（ｎ
＝10） １ｇ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン ６ｇ 乳酸リチウム ３ｇ ポリビニルピロリドン（分子量 ） 25ｇ β−NAD⁺ 0.6ｇ ジアホラーゼ 1.5万単位 水 100ｇ （希HCl溶液でPHを8.5に調整する） 測定例 １ 上記実施例１および比較例１の分析要素に、ナ
シヨナル蛍光灯FLR／40S−Ｗ／Ｍ−Ｘを光源と
して用い、1000LUXの照度を白色光を温度25℃
で０、５、10、15、、および30分間照射したとき
の、分析要素の透明支持体の面からの反射光学濃
度（波長540nｍ）をそれぞれ測定した。その結
果は第１表の通りである。

【表】 第１表から明らかなごとく、本発明の分析要素
は比較例１の場合に比べて、蛍光灯による影響を
受けにくい。 本発明で用いられるアクリルアミドまたはメタ
クリルアミドの、重合体または共重合体の分子量
は５千から200万の範囲、好ましくは２万から50
万である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも一つの水浸透性層を有し、水浸透
   性層のうち少なくとも一つは多孔性液体展開層で
   あり、前記水浸透性層の少なくとも一つにNAD⁺
   を含み、液体中の乳酸脱水素酵素活性測定用の乾
   式液体分析要素であつて、前記少なくとも一つの
   水浸透性層の少なくとも一つに、アクリルアミド
   もしくはメタクリルアミドから選ばれる親水性高
   分子を含むことを特徴とする乾式液体分析要素。 ２ NAD⁺を含む水浸透性層に前記親水性高分子
   を含む特許請求の範囲１の乾式液体分析要素。 ３ 少なくとも一つの水浸透性層にNAD⁺と乳酸
   またはその塩を含む特許請求の範囲１の乾式液体
   分析要素。 ４ NAD⁺と乳酸またはその塩を含む水浸透性層
   に前記親水性高分子を含む特許請求の範囲３の乾
   式液体分析要素。 ５ 多孔性展開層中に前記親水性高分子を含む特
   許請求の範囲１の乾式液体分析要素。 ６ 多孔性展開層中にNAD⁺と前記親水性高分子
   を含む特許請求の範囲１の乾式液体分析要素。 ７ 多孔性展開層中に乳酸またはその塩、NAD⁺
   及び前記親水性高分子を含む特許請求の範囲１の
   乾式液体分析要素。 ８ 水浸透性層の少なくとも一つにNAD⁺と電子
   伝達剤を、該層と同じまたは異なる水浸透性層の
   少なくとも一つに電子受容性染料前駆体を含む、
   特許請求の範囲１の乾式液体分析要素。 ９ 少なくとも一つの水浸透性層に乳酸またはそ
   の塩とNAD⁺と電子伝達剤とを含む特許請求の範
   囲８の乾式液体分析要素。 １０ 多孔性展開層中に乳酸またはその塩、
   NAD⁺および電子伝達剤を含む特許請求の範囲８
   の乾式液体分析要素。 １１ 多孔性展開層中に乳酸またはその塩、
   NAD⁺および電子伝達剤を含み、他の層に電子受
   容性染料前駆体を含む、特許請求の範囲８の乾式
   液体分析要素。