JP5081680B2 - リパーゼ測定用乾式分析要素 - Google Patents
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Description
好ましくは、トリグリセリドに対し重量比10倍量以上の親水性ポリマーが含まれる。
好ましくは、親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、ゼラチン、又はこれらの組み合わせから選択される親水性ポリマーである。
好ましくは、セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はメチルセルロースである。
好ましくは、モノグリセリドリパーゼはバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
好ましくは、トリグリセリドはトリオレインである。
好ましくは、展開層は、布または多孔質膜からなる。
好ましくは、多孔質膜は、ポリビニルスルホン又はアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成された多孔質膜である。
好ましくは、トリグリセリドに対し重量比10倍量以上の親水性ポリマーを含む状態でトリグリセリドを塗布する。
好ましくは、セルロース誘導体は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はメチルセルロースである。
好ましくは、トリグリセリドはトリオレインである。
本発明の炭素差12〜22の長鎖アルキル脂肪酸のトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有し、水不透過性支持体と少なくとも1つ以上の展開または試薬層からなる体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素は、トリグリセリドに対し重量比1.8倍量以上の親水性ポリマーを含むことを特徴とする。
本発明で用いる親水性ポリマーとしては、澱粉、セルロースおよびセルロース誘導体(メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等)、アガロース、ゼラチン(例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等)、アクリルアミド重合体、アクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体、ビニルピロリドン重合体、ビニルピロリドンと各種ビニル性モノマーとの共重合体、アクリレート重合体およびアクリレートと各種ビニル性モノマーとの共重合体等を挙げることができる。特に好ましい親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、ゼラチンである。
本発明で使用するトリグリセリドは、膵リパーゼへの特異性を向上させるために、長鎖アルキル鎖の脂肪酸からなるトリグリセリドである。長鎖アルキル鎖は飽和でも不飽和でもよい。好ましくは、不飽和脂肪酸のトリグリセリドである。不飽和脂肪酸の膵リパーゼの反応性が相対的に低い。長鎖アルキル鎖の脂肪酸のアルキル鎖長は、膵リパーゼへの選択性から炭素数12以上22以下であればよく、好ましくは炭素数16以上20以下である。以下に例を示す。
本発明の乾式分析要素に組み込まれる試薬系には、モノグリセリドリパーゼを加える。モノグリセリドリパーゼは、トリグリセリドおよびジグリセリドと実質的に反応せず、長鎖脂肪酸のモノグリセリドに反応するものが好ましい。特に好ましいのは、特開昭63-245672、特開平4-316500号公報に記載の、バチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである。
本発明で採用している測定反応系は、測定対象であるリパーゼによって基質であるトリグリセリドが分解して生成するモノグリセリドをモノグリセリドリパーゼで分解する。好ましいグリセリン発色系は、このグリセロールをグリセロールキナーゼによってL−α−グリセロリン酸とし、L−α−グリセロリン酸をL−α−グリセロリン酸オキシダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸に変えるとともに過酸化水素を発生させ、この過酸化水素によりペルオキシダーゼの作用で発色色素を発色させるものである。
層構成は、少なくとも1つ以上の展開層または試薬層、並びに、より測定精度と強度を高めるために、また、製造工程における搬送性を向上させるため支持体を含む。最もシンプルな形態は支持体と試薬層の機能も持つ展開層からなる。層の数は多くしてもよい。
本発明のリパーゼ測定用乾式分析要素の支持体層を構成するものとしては、光透過性でかつ水不透過性である支持体が用いることができる。展開層側から測定する場合には光不透過性の支持体を用いてもよい。支持体は、乾式分析要素の強度を与え、製造効率を向上させる。光不透過性・水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールAのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル(例、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等)等のポリマーからなる厚さ約50μmから約1mm、好ましくは約80μmから約300μmの範囲のフィルムもしくはシート状の透明支持体を挙げることができる。好ましい材料は、強度、光学特性からポリエチレンテレフタレートである。
支持体の上には(場合によっては下塗層等の他の層を介して)試薬層が設けてよい。試薬層はアナライトであるリパーゼと反応して光学的に検出可能な変化を生じる後述の試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。
本発明では多孔性展開層に布製の展開層を用いることが好ましいが、ポリビニルスルホン、アセチルセルロースからなる多孔質膜または、微小ビーズから形成する多孔質膜、ガラス繊維濾紙、濾紙など布以外の材質を使用することも可能である。
この布製の多孔性展開層としては特開昭55−164356号公報、特開昭57−66359号公報等に記載の織物布地展開層(例:ブロード、ポプリン等の平織布地等)、特開昭60−222769号公報等に記載の編物布地展開層(例:トリコット編布地、ダブルトリコット編布地、ミラニーズ編布地等)、特開平1−172753号公報に記載のアルカリエッチング液でエッチング処理した織物布地又は編物布地からなる展開層、等がある。好ましいものは編物布であり、特にトリコット編物が好ましい。布の材質としてはポリエステル、綿、ナイロン、絹、ビニロン、レーヨン、ポリアミド、アクリル、ウール、ポリプロピレン、麻等が用いられ、好ましいものはポリエステルである。展開層の厚さは50〜400μm程度、好ましくは200〜300μm程度が適当である。布の空隙率は20〜90%程度、好ましくは40〜85%程度である。
トリグリセリドは、親水性ポリマーのエタノール溶液として溶解し、添加することができる。塗布安定性を増すために、動的・静的表面張力を適正化するため界面活性剤を加えることができる。ノニオン界面活性剤が使用されることが多いが、添加される共役酵素への影響が小さい場合はアニオン界面活性剤を使用できる。
また、トリグリセリドを水系の乳化分散液を作製し、それを乾式分析要素に添加することも可能である。この乳化分散液を作製する際、界面活性剤または保護ポリマーを添加することができる。
トリグリセリドの等の試薬の添加方法の中で、ギーサーにより塗布し乾燥する工程が均一で効率の高い生産方法を与える。この工程において、乾燥は温風乾燥が好ましい。乾燥風は温度20〜60℃が好ましく、特に、25〜40℃が好ましい。露点は0℃から10℃が好ましい。風量は0.5〜10m/秒が好ましい。乾燥時間は溶剤が実質的に乾燥すればよく、一方、長時間の乾燥では、共役酵素が失活する場合があるので、1分から60分が好ましい。複数の乾燥ゾーンを用い、それぞれのゾーンで、乾燥風の温度、露点、風速、風向、時間を制御し、良好な乾燥条件を設定することもできる。
(1)グリセリン発色試薬の作製:
ゼラチン下塗りがされている厚さ180μmのポリエチレンテレフタレート無色透明平滑フイルム上に下記の組成の試薬を水溶液として123ml/m2で塗布、乾燥させたのち、続いて、水を均一供給し湿潤させ、その上に50デニール相当のポリエチレンテレフタレート紡績糸を36ゲージ編みしたトリコット編み物布地を軽く圧力をかけて積層し、乾燥温度20℃でゼラチンを固めたのち、45℃で乾燥させた。なお、pH緩衝剤PIPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH5.5に調整したものを用いた。
PIPES(同仁化学) 22 g/m2
塩化マグネシウム(和光純薬工業)0.52 g/m2
ATP−2ナトリウム塩(オリエンタル酵母)1.4 g/m2
ポリオキシエチレントリデシルエーテルHLB14.8(第一工業製薬)0.55 g/m2
ポリエチレンアルキル分岐デシルエーテルHLB15.9 (第一工業製薬)0.059 g/m2
ロイコ色素 0.21 g/m2
ワサビペルオキシダーゼ(東洋紡)14 kU/m2
グリセロールキナーゼ(旭化成)3.8 kU/m2
L-α-グリセロリン酸オキシダーゼ(旭化成)19 kU/m2
1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン 3.3 g/m2
トリオレインは親水性ポリマーであるポリビニルピロリドンのエタノール溶液として溶解し、上記の布地上に123ml/m2で塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で、温風乾燥させた。さらに、他のリパーゼ反応用試薬を水に溶解し、140ml/m2で塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pH緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH8.0に調整したものを用いた。乾燥塗布量を以下に示す。
トリオレイン(95%、MP-Biomedicals)3.3 g/m2
HEPES(同仁化学) 6.1 g/m2
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬) 0.67 g/m2
デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬) 4.6 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/m2
ブタコリパーゼ(ロシュ)0.05 g/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡)8500 U/m2
ポリビニルピロリドン(PVP)K90 2.4 g/m2
比較例1-1で、トリオレイン(95%、MP-Biomedicals)2.2 g/m2 とした。
比較例1において、トリオレイン量と親水性ポリマーPVPK90を以下の表1に記載の通りの条件で、膵リパーゼ分析スライドを作製した。条件を表1に示す。
(1)リパーゼ分析要素の布面から富士ドライケム・トリグリセリドスライド布面への転写:
実施例の塗布品の塗布面の4x3cm部分を富士ドライケム・トリグリセリドスライドで擦り転写させ、手加工機で再マウント後、FDC5500アナライザーで7%ヒトアルブミン生食液を点着し、トリグリセリドスライドの発色ODを測定した。各スライドからのODと比較対照OD(トリオレインを塗布しない比較例1の下地を擦ったスライド)との差(ΔOD)をトリオレイン転写の指標とした。比較例、実施例の条件およびトリオレイン転写結果を以下の表1に示す。
次に、トリオレインを添加する工程において、塗布された分析要素を巻き取る段階でのトリオレイン転写を測定した。
比較例1において、グリセリン発色試薬の作製後、以下の塗布量になるようにトリオレインおよび親水性ポリマーを布地上に下記組成の試薬をエタノールに溶解し塗布し、乾燥温度32℃、露点0℃の風で温風乾燥させ、巻き取った。トリオレイン添加工程での、トリオレインおよび親水性ポリマーの各添加量およびそれらの比を表に記載した。測定1の方法で、トリオレインの転写量を測定した。結果を以下の表2に示す。
実施例2と同じ方法で、トリオレイン添加までの製造工程を行い、測定1の方法でとトレオレイン転写量を測定した。結果を以下の表3に示す。水溶性ポリマー/トリオレイン重量比が大きければ、トリオレイン転写量は抑制された。ヒドロキシプロピルセルロースも効果があった。
(1)リパーゼ分析要素の中間作製品の布面から支持体へのトリオレイン転写:
実施例2-1〜2-5の塗布品10cmx12cm(各水準3枚づつ)の布面側を、各々、支持体(PETベ−ス)18cm x 10cmに重ね合わせた。これら15組(5水準x3枚)の塗布品と支持体を重ね合わせたものの上に、10cm x10cmのステンレス板をのせ、さらに3280gの荷重をかけることで均一に圧力を与え、この状態で、25℃で、まる2日放置した。塗布物の布面(トリオレインが付着している)に接したことで、トリオレインが転写した支持体の10cmx10cm部分を、富士ドライケム・トリグリセリドスライドの布面で擦り、支持体に付着したトリオレインをトリグリセリドスライドに転写させた。このトリグリセリドスライドを、FDC7000アナライザーで7%ヒトアルブミン生食液を点着し、転写したトリオレインに応じた発色量を測定した。
比較例2−2、実施例3−3 のトリオレインまで添加した製造中間品を、支持体側を搬送ロール(ステンレス製)に付着する方向で、30m/分で搬送試験を行った。その結果を表5に示す。
測定3の実施例2−1、実施例3−3の製造工程搬送試験後のサクションドラム(ベース搬送のためのロール、ベースを吸引しながら搬送する)に、新品の支持体をセットし、吸引しながら水平に引っ張った時にサクションドラムからベースが滑り出す時の最大摩擦力を求めた。
(1)トリオレインの微細乳化分散液の作製
精製水175mlにポリビニルピロリドンK90(BASF製)4.0g、ゼラチン(新田ゼラチン製)6.0g、および直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬製)0.5gを60℃にて30分溶解した後、液温度を40℃に下げ、この水溶液中にトリオレイン(95%、MP Biomedicals)5.0gを撹拌しながら添加した。上記油水混合粗分散液を、超音波ホモジナイザーUS−600T(日本精機製)にて3分間分散した後、スターバーストミニ超高圧ホモジナイザー(スギノマシン製)を用い245MPaの圧力にて5回処理することで、微細乳化を行った。
得られた乳化物中のトリオレインの体積平均粒径を、動的光散乱粒径分布測定装置であるナノトラックUPA(日機装製)で測定したところ、190nmであった。
比較例1-1で作製したグリセリン発色下地(布ラミネート品)に、基質は上記実施例4、(1)で作製したトリオレイン乳化分散液を用い、さらに親水性ポリマー、塩化カルシウムを加え、下記乾燥添加量で、水系塗布によって乾式分析要素の製造中間品を作製した。塗布量は123ml/m2とし、その他は比較例と同じにした。
ポリビニルピロリドンK90 (BASF) 1.96g/m2
塩化カルシウム(無水) (和光純薬工業) 0.18g/m2
実施例4のトリオレイン乳化分散液(以下に塗布量としての処方量を示す)
・ポリビニルピロリドンK90 (BASF) 0.9g/m2
・750ゼラチン (新田ゼラチン) 1.3g/m2
・トリオレイン(95%、MP Biomedicals) 1.1g/m2
・直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬) 0.11 g/m2
本トリオレイン乳化分散塗布液における、親水性ポリマー/トリオレイン重量比は4である。
さらに、下記試薬を水に溶解し、140ml/m2で塗布、乾燥し、膵リパーゼ乾式分析要素を作製した。なお、pH緩衝剤HEPESを含む塗布液は1N-NaOH水溶液でpH8.0に調整したものを用いた。
HEPES(同仁化学) 6.1 g/m2
直鎖ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(和光純薬) 0.67 g/m2
デオキシコール酸ナトリウム(和光純薬) 4.6 g/m2
タウロデオキシコール酸ナトリウム 1.5 g/m2
メトロース 2.1 g/m2
モノグリセリドリパーゼ(旭化成) 4300 U/m2
ブタコリパーゼ(ロシュ)0.05 g/m2
アスコルビン酸オキシダーゼ(東洋紡)8500 U/m2
実施例4(2)のトリオレインまで添加した製造中間品を、測定2の方法でスリップ故障の実験を行い、支持体側を搬送ロール(ステンレス製)に付着する方向で、30m/分で搬送したところ、実施例3の製造中間品は、150m搬送時でスリップは13mであり、比較例2-1に対し、スリップは軽減された。また、10m/分で搬送したところ、スリップは発生しなかった。
Claims (17)
- 炭素差12〜22の長鎖アルキル脂肪酸のトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開または試薬層と、水不透過性支持体とからなる体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素において、トリグリセリドに対し重量比1.8倍量以上の親水性ポリマーを含むことを特徴とする乾式分析要素。
- トリグリセリドに対し重量比5倍量以上の親水性ポリマーを含む、請求項1に記載の乾式分析要素。
- トリグリセリドに対し重量比10倍量以上の親水性ポリマーを含む、請求項1又は2に記載の乾式分析要素。
- 親水性ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、ゼラチン、又はこれらの組み合わせから選択される親水性ポリマーである、請求項1から3の何れかに記載の乾式分析要素。
- セルロース誘導体が、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はメチルセルロースである、請求項4に記載の乾式分析要素。
- グリセリン測定試薬が、グリセリンキナーゼ、グリセロリン酸キナーゼ、ペルオキシダーゼおよび発色試薬を含む、請求項1から5の何れかに記載の乾式分析要素。
- モノグリセリドリパーゼがバチルス・ステアロサーモフィラスH-165由来のモノグリセリドリパーゼである、請求項1から6の何れかに記載の乾式分析要素。
- トリグリセリドがトリオレインである、請求項1から7の何れかに記載の乾式分析要素。
- 体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素が、水不透過性支持体、試薬層および展開層を含む構成を有している、請求項1から8の何れかに記載の乾式分析要素。
- 展開層が、布または多孔質膜からなる、請求項1から9の何れかに記載の乾式分析要素。
- 多孔質膜が、ポリビニルスルホン又はアセチルセルロースからなる多孔質膜、または微小ビーズから形成された多孔質膜である、請求項10に記載の乾式分析要素。
- 炭素差12〜22の長鎖アルキル脂肪酸のトリグリセリド、モノグリセリドリパーゼ、及びグリセリン測定試薬を含有する少なくとも1つ以上の展開または試薬層と、水不透過性支持体とからなる体液中の膵リパーゼ測定用乾式分析要素の製造方法において、トリグリセリドに対し重量比1.8倍量以上の親水性ポリマーを含む状態でトリグリセリドを展開または試薬層に塗布する工程を含む、乾式分析要素の製造方法。
- トリグリセリドに対し重量比5倍量以上の親水性ポリマーを含む状態でトリグリセリドを塗布する、請求項12に記載の方法。
- トリグリセリドに対し重量比10倍量以上の親水性ポリマーを含む状態でトリグリセリドを塗布する、請求項12に記載の方法。
- 親水性ポリマーが、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、ゼラチン、又はこれらの組み合わせから選択される親水性ポリマーである、請求項12から14の何れかに記載の方法。
- セルロース誘導体が、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、又はメチルセルロースである、請求項15に記載の方法。
- トリグリセリドがトリオレインである、請求項12から15の何れかに記載の方法。
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