JP3071852B2 - 膵リパーゼ測定試薬 - Google Patents
膵リパーゼ測定試薬Info
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Description
度の高いドライケミストリー(乾燥系の反応)を利用し
た膵リパーゼ測定試薬に関する。
ーゼは、トリグリセリドに作用してモノグリセリドを生
成せしめることが知られている(試験例1)。膵リパー
ゼは膵臓の腺房細胞から分泌され、膵管を通じて十二指
腸に送られ、脂肪を消化する酵素である。膵炎や膵癌等
の膵疾患が起こると、膵腺房細胞の破壊、膵管の狭窄、
閉塞等により膵リパーゼが血中に逸脱し、血清中のリパ
ーゼ活性値は上昇する。従って、血中の膵リパーゼ活性
の測定は、膵疾患の診断に有用である。
が知られているが、トリグリセリドを用いる方法として
は現在では乳化オリーブ油を基質として膵リパーゼの作
用により基質であるトリグリセリドがモノグリセリドへ
の酵素作用を受けることによる減少する基質の濁度を測
定する比濁法がよく用いられている。しかしながら、こ
の方法は吸光度の変化がわずかであるため、精度、正確
性に問題がある。
「ドライケミストリー」という)を用いる分析法が、操
作が簡便であることから注目されている。ドライケミス
トリーを用いる膵リパーゼ活性の測定方法としては、合
成基質として1−オレイル−2,3 −ジアセチルグリセロ
ールを用い、膵リパーゼにより生成した2,3 −ジアセチ
ルグリセロールをエステラーゼで分解し、遊離したグリ
セリンを酵素学的に測定する方法が知られている。しか
しながら、ここで用いられる1−オレイル−2,3−ジア
セチルグリセロールは、合成基質であるため高価であ
り、低級アシル基を含むため不安定であり、天然のリパ
ーゼ基質でないため得られた測定値が天然の基質を用い
た場合と異なるおそれがある等の欠点を有する。従っ
て、この様な欠点がなく、ドライケミストリーを用いた
簡便、かつ正確な膵リパーゼ測定試薬が望まれていた。
明者らは鋭意研究を行なったところ、膵リパーゼは、天
然脂質及び天然脂質に近い合成脂質をほとんどモノグリ
セリドにまで分解するために比濁法であるウェットケミ
ストリー法をなし得るが、しかしながら生成物がモノグ
リセリドであることからドライケミストリー法では比濁
法を使用し得なかったもので、そのため好適なドライケ
ミストリー法を研究するに当り、基質としてトリグリセ
リドを用い、これとモノグリセリドリパーゼ及びグリセ
リン測定試薬とを組み合せ、フィルムに保持または含有
せしめてなるドライケミストリー用リパーゼ測定試薬
が、上記欠点がなく、容易に膵リパーゼ活性を測定で
き、しかも正確な測定値が得られることを見出し本発明
を完成した。
ド、(b) ジグリセリド及びトリグリセリドに実質的に作
用しないモノグリセリドリパーゼ並びに (c)グリセリン
測定試薬を含有することを特徴とするドライケミストリ
ー用膵リパーゼ測定試薬を提供するものである。
ドとしては、例えば天然の動植物油又は3つの長鎖脂肪
酸の炭素数が14〜20である合成若しくは半合成長鎖脂肪
酸トリグリセリド等が挙げられるが、入手の容易性より
特にトリオレイン酸グリセリドが好ましい。
ては、モノグリセリドに作用し、ジグリセリド及びトリ
グリセリドに実質的に作用しないものが好ましく、具体
的には、バチルスステアロサーモフィラスH-165(微工研
条寄第1673号) が産生するモノグリセリドリパーゼが好
ましい。
は、生成されるグリセリンに作用する酵素とを発色試薬
を用いる公知のグリセリン測定系に使用される試薬が用
いられる。ここに用いられる酵素としては、グリセロキ
ナーゼとグリセロリン酸オキサダーゼとの組み合せ、グ
リセロキナーゼとグリセロリン酸デヒドロキナーゼとの
組合せ、グリセロールオキシダーゼ、及びグリセロール
デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。
TPの存在下グリセロキナーゼを用いてグリセリンから
生成されるグリセロ−3−リン酸をグリセロリン酸オキ
シダーゼで酸化させるグリセロキナーゼ・グリセロリン
酸オキシダーゼ法を用いる系、またはグリセロールオキ
シダーゼ法を用いる系が好ましい試薬として挙げられ
る。いずれの系を用いる場合も、グリセリン測定系にお
ける最終生成物である過酸化水素を測定、またはこれら
の系の反応によって生成されるジヒドロキシアセトンリ
ン酸、ジヒドロキシアセトンのいづれを測定してもよ
い。例えば、グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシ
ダーゼ法を用いる場合、トリグリセリドから生成したグ
リセリンに、グリセロキナーゼ0.1 〜20U/ml、グリセ
ロリン酸オキシダーゼ3〜30U/ml、ATP1〜10mM、
またグリセロキナーゼの酵素活性を高めるための添加剤
としてマグネシウムイオンを放出するイオン放出性塩
類、例えば塩化マグネシウム1〜10mMを各々作用させる
ことにより、酸素を消費して過酸化水素およびジヒドロ
キシアセトンリン酸が生成される。従って生成されるジ
ヒドロキシアセトンリン酸を公知の方法(Method of Enz
ymatic Analysis,3巻,1314〜1319頁) 等に基づいて測
定してもよい。さらに、過酸化水素を測定する方法とし
ては、生成される過酸化水素にパーオキシダーゼおよび
4−アミノアンチピリンと下記一般式(1) で表されるフ
ェノール性化合物、または下記一般式(2) で表されるア
ニリン誘導体の発色試薬を作用させ、生じた発色体を測
定する方法を用いてもよい(特公昭60−3480号)。
されるフェノール化合物としては、例えば、p−クロル
フェノール、p−ブロムフェノール、2,4 −ジクロルフ
ェノール、2,4 −ジブロムフェノール、2,4 −ジクロル
フェノールスルホネート等が挙げられる。また、一般式
(2) で表されるアニリン誘導体としては、例えばジエチ
ルアニリン、N,N−ジエチル−m−トルイジン、m−メ
トキシ−N,N −ジメチルアニリン、N−エチル−N−
(3−メチルフェニル)−N−アセチルエチレンジアミ
ン、ソジウム−N−エチル−N−(3−スルホプロピ
ル)メタトルイジン、ソジウム−N−エチル−N−(2
−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)−3,5−ジメトキ
シアニリン等が挙げられる。
通常としては過酸化水素と反応して検出できる生成物に
変化する指示薬を用いて定量すればよく、この指示薬と
して、過酸化水素の存在下で色調変化を受ける1種また
は2種以上の呈色薬組成物、蛍光薬組成物または発光薬
組成物からなる組合せを使用すればよい。呈色薬組成物
としては、通常色調の変化を可視にて生ずるもので、パ
ーオキシダーゼ作用を有する物質と呈色前駆体との含有
物を用いる。このパーオキシダーゼ作用を有する物質と
しては、西洋ワサビ由来のパーオキシダーゼが通常よく
用いられ、呈色前駆体としては、4−アミノアンチピリ
ンと一般式(1) で表されるフェノール系化合物の組合せ
による方法が通常よく用いられる。また、呈色前駆体と
して、4−アミノアンチピリンと一般式(2) で表される
アニリン誘導体の組合せによる方法でもよく、例えば4
−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼとN−エ
チル−N−(2−ハイドロキシ−3−スルホプロピル)
−メタ−トルイジン(TOOS)との反応によって、生成す
る発色体の量をその呈色の強さによって測定する方法が
挙げられる。さらに、ジエチルアニリンまたはジメチル
アニリンと3−メチル−2−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンを作用させ生じた発色体を呈色の強さによって測定
する方法もあり、また生成する過酸化水素と反応して安
定な赤色体を形成する4価チタン化合物とキシレノール
オレンジによって生成する発色体の量をその呈色の強さ
によって測定する方法もあり、さらに2,6 −ジクロルフ
ェノールインドフェノールとパーオキシダーゼとの組合
せ、グアヤク脂とパーオキシダーゼとの組合せ等による
パーオキシダーゼを用いる種々の組成、方法が挙げられ
る。さらにこれらの指示薬においては溶液として予めそ
の目的に応じて混合使用して調製してもよい。使用量と
しては、例えばこのフェノール誘導体またはアニリン誘
導体、4−アミノアンチピリンおよびバーオキシダーゼ
による反応においては、フェノールあるいはTOOSは全液
量に対し0.01〜0.1 %程度使用すればよく、4−アミノ
アンチピリンは全液量に対して、0.01〜0.05%、好まし
くは0.03%、さらにパーオキシダーゼは3〜30U/ml、
好ましくは4〜6U/ml使用すればよい。さらに上記の
呈色薬組成物の代りに、紫外線照射により蛍光を発する
蛍光薬組成物としてホモバニリン酸などを用いて行って
もよく、さらに発色する発光薬組成物を用いて行う等、
分光光学的手段によりその変化を定量し得る組成物が用
いられる。
いる系としては、上記の通り、トリグリセリドから生成
されたグリセリンにグリセロールオキシダーゼ1〜50U
作用させることにより酸素を消費してジヒドロキシアセ
トンおよび過酸化水素を生成するもので、生成されるジ
ヒドロキシアセトンまたは過酸化水素を測定する。好ま
しくは生成された過酸化水素を測定するものであるが、
その場合はグリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダ
ーゼ法における過酸化水素の定量試薬を同様にして用い
ればよい。また生成されるジヒドロキシアセトンを公知
の方法(Methodof Enzymatic Analysis,3巻,1442〜14
45頁)等に基づいて行えばよい。
のグリセロリン酸オキシダーゼの代りにグリセロリン酸
デヒドロゲナーゼおよびNADを用いて生成する還元型
NADを公知の定量試薬、例えばジアホラーゼとニトロ
テトラゾリウムブルーやテトラゾリウムブルー等のテト
ラゾリウム塩とをもちいるホルマザン色素形成用試薬を
用いて分析してもよく、さらに生成されるグリセロール
にATPおよびグリセロキナーゼを作用させた場合にお
いてATPから生成するADPを公知方法(Method of
Enzymatic Analysis,4巻,2127〜2129頁)等に基づく
試薬を用いて測定してもよく、公知の種々のグリセリン
定量系に用いられる試薬が使用可能である。
に、他の成分を加えることができる。この成分として
は、カルシウム、コ・リパーゼ、デオキシコール酸ナト
リウム等の胆汁酸塩等の膵リパーゼ活性化剤、アラビア
ゴム、ポリビニルアルコール等の乳化剤等が挙げられ
る。
(b)の配合量は、特に制限されないが、測定時にトリ
グリセリドが0.05〜5mM、モノグリセリドリパーゼが0.
05〜5U/mlとなるようにするのが好ましい。また、グ
リセリン測定試薬(c)として、グリセロキナーゼ−グ
リセロリン酸オキシダーゼ系を用いた場合の好ましい配
合量に関して、例えば特開昭63-245672 号公報、同59-1
40900 号公報(サイクリング反応系)に記載の各酵素、
試薬等の使用量を参考として調製、使用すればよい。各
酵素、試薬の調製について例示すれば(なお、カッコ内
数値は使用比の好適例を示す) トリグリセリド(リパーゼ基質) 0.05〜20mM(1) モノグリセリドリパーゼ 15〜50U/ml(0.5 ) グリセロキナーゼ 5〜20U/ml(0.5) グリセロリン酸オキシダーゼ 50〜200U/ml(0.5) グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ 15〜50U/ml(1) NAD 5〜20mM(1) ジアフォラーゼ 20〜80U/ml(0.5) コ・リパーゼ 200〜800U/ml(0.5) デオキシコール酸ナトリウム 50〜200mM(1) 塩化カルシウム 5〜80mM(0.5) 塩化マグネシウム 10〜80mM(0.5) トリス−塩酸緩衝液 0.1〜0.5M(2) ATP 20〜80mM(0.5) ペルオキシダーゼ 50〜200U/ml(0.5) 4−アミノアンチピリン 10〜40mM(1) フェノール 10〜40mM(1) グリセロールオキシダーゼ 200〜800U/ml(1) ニトロテトラゾリウムブルー 0.1〜0.5%(1) の適宜な膵リパーゼ測定のための酵素、試薬の調製液の
10〜100 μlを用いて、1テスト用のドライケミストリ
ー用測定試薬となせばよい。
のために用いるフィルムは、必要な成分を保持または含
浸させることのできるフィルム状であれば合成フィル
ム、半合成フィルム又は天然フィルムのいずれであって
もよく、好ましくは、濾紙、ナイロン、酢酸セルロー
ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等が具
体例として挙げられる。
は、トリグリセリド(a)をアラビアゴム等で乳化せし
めるか、ゼラチン、変性ゼラチン、ポリビニルアルコー
ルやポリビニルピロリドン等の親水性コロイドを媒体と
して用いてこれと他の必要な成分を混合し、フィルムに
保持または含浸せしめ、乾燥すればよく、前記した過酸
化水素を測定するための好ましい態様として、例えば特
開昭49-53888号公報、同50-137192 号公報、同51-40191
号公報、同55-90859号公報、同55-16436号公報、同57-6
6359号公報、同57-128846 号公報、同57-128849 号公報
等に記載されているような水不透過性光透過性のフィル
ム(またはシート)の支持体上に、上記の酵素、試薬層
や多孔性展開層等を適宜形成せしめたドライケミストリ
ー用としての多層一体型フィルム状(またはシート状)
のリパーゼ測定試薬となし得る。このようにして得られ
るドライケミストリー用フィルム、例えばグリセロキナ
ーゼ−グリセロリン酸オキシダーゼ系を用いた場合、約
1cm2 当りの各々の絶対量としては、好ましくはトリス
−塩酸120 〜400 μg、トリオレイン15〜50μg、アラ
ビアゴム0.2 〜1mg、塩化カルシウム5〜40μg、塩化
マグネシウム5〜40μg、ATP30〜100 μg、デオキ
シコール酸ナトリウム100 〜500 μg、4−アミノアン
チピリン5〜50μg、フェノール5〜50μg、グリセロ
キナーゼ0.01〜0.05U、グリセロリン酸オキシダーゼ0.
1 〜0.5 U、ペルオキシダーゼ0.1 〜0.5 U、モノグリ
セリドリパーゼ0.03〜0.15Uである。
を測定するには、例えば本発明ドライケミストリー用フ
ィルム状測定試薬上に検体、例えば血清5〜20μlを載
せて反応させ、発色する色素等を肉眼又は分光光度計を
用いて測定すればよい。
ば、精度良くリパーゼ活性が測定でき、しかも操作は簡
単である。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
きの生成物はグリセリンでなく、モノグリセリドである
ことの試験:トリオレイン(10mMになるように10%アラ
ビアゴム溶液で超音波処理したもの)0.1ml 、0.2 Mト
リス−塩酸緩衝液(pH8.6)0.2ml、40mM塩化カルシウム
0.05ml、40mM ATP0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.0
5ml、0.1 Mデオキシコール酸ナトリウム0.1 ml、コ・
リパーゼ(400U/ml)0.05ml、グリセロキナーゼ(10
U/ml)0.05ml、グリセロリン酸オキシダーゼ(100U
/ml)0.05ml、ペルオキシダーゼ(100U/ml)0.05m
l、20mM4−アミノアンチピリン0.1ml 、及び20mMフェ
ノール0.1ml にモノグリセリドリパーゼ(30U/ml)0.
05mlを添加した反応液(A)、並びに(A)のモノグリ
セリドリパーゼの代りに精製水0.05mlを加えた反応液
(B)を各々ナイロン製膜にしみ込ませ、風乾した後、
膵リパーゼ(250U/L)20μlを加え37℃で10分間反
応を行ない2%SDS20μlで反応を止め、500nm の吸
光度をスポットスキャナーCS−9000で測定した。表1
にその結果を示す。
リパーゼが作用しても遊離のグリセリンは殆んど検出さ
れなかったか、モノグリセリドリパーゼ添加ではじめて
発色がみられた。この結果から、トリグリセリド膵リパ
ーゼが作用した場合、その生成物のほとんどはモノグリ
セリドである。
超音波処理したもの)0.1ml 、0.2 Mトリス−塩酸緩衝
液(pH8.6)0.2ml、40mM塩化カルシウム0.05ml、40mM
ATP0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.05ml、0.1 Mデ
オキシコール酸ナトリウム0.1 ml、コ・リパーゼ(400
U/ml)0.05ml、グリセロキナーゼ(10U/ml)0.05m
l、グリセロリン酸オキシダーゼ(100U/ml)0.05ml、
ペルオキシダーゼ(100U/ml)0.05ml、20mM4−アミ
ノアンチピリン0.1ml 、20mMフェノール0.1ml 及びモノ
グリセリドリパーゼ(30U/ml)0.05mlから構成される
反応液20μlを濾紙にしみ込ませた後、風乾した。この
スポットした濾紙の部分に20μlのヒト膵リパーゼ(25
0U/L)を置き37℃で10分間反応を行ない、2%SD
S20μlで反応を止めた後、スポットスキャナーCS−
9000で500nm における吸光度を測定した。結果を表2に
示した。
波処理分散したもの)0.1ml 、0.2 Mトリス−塩酸緩衝
液(pH8.6)0.2ml 、40mM塩化カルシウム0.05ml、40mM
ATP0.05ml、40mM塩化マグネシウム0.05ml、0.1 Mデ
オキシコール酸ナトリウム0.1ml 、コ・リパーゼ(400
U/ml)0.05ml、グリセロールオキシダーゼ(400U/m
l)0.1ml 、ペルオキシダーゼ(100U/ml)0.05ml、20
mM4−アミノアンチピリン0.1ml 、20mMフェノール0.1m
l 、モノグリセリドリパーゼ(30U/ml)0.05ml及び精
製水0.05mlから成る組成の反応液100 μlをナイロン製
膜にスポット後、乾燥させた。この部分にリパーゼ活性
の高い血清検体(425U/L)20μlを置き、37℃で10
分間反応後2%SDS20μlで反応を止めた後、吸光
度(500nm)を測定した。結果を表2に示した。
、0.2 Mトリス−塩酸緩衝液(pH8.6)0.2ml、40mM塩
化カルシウム0.05ml、40mM ATP0.05ml、40mM塩化マ
グネシウム0.05ml、0.1 Mデオキシコール酸ナトリウム
0.1 ml、コ・リパーゼ(400U/ml)0.05ml、グリセロ
キナーゼ(10U/ml)0.05ml、グリセロリン酸デヒドロ
ゲナーゼ(30U/ml)0.1ml 、10mM NAD0.1 ml、ジ
アフォラーゼ(40U/ml)0.05ml及び0.25%ニトロテト
ラゾリウムブルー0.1mlから成る組成の反応液50μlを
濾紙にしみ込ませた。乾燥後、実施例2で用いたヒト血
清20μlを置き、37℃で10分間反応後20%SDS20
μlで反応を止め550nm の吸光度を測定した。結果を表
2に示した。
Claims (5)
- 【請求項1】(a)トリグリセリド、(b)ジグリセリド及び
トリグリセリドに実質的に作用しないモノグリセリドリ
パーゼ並びに(c)グリセリン測定試薬を含有することを
特徴とするドライケミストリー用膵リパーゼ測定試薬。 - 【請求項2】 トリグリセリド(a)が、天然の動植物
油又は炭素数14〜20の合成もしくは半合成長鎖脂肪酸ト
リグリセリドである請求項1記載の測定試薬。 - 【請求項3】 モノグリセリドリパーゼ(b)が、バチ
ルス・ステアロサーモフィラスH-165 由来のモノグリセ
リドリパーゼである請求項1記載の測定試薬。 - 【請求項4】 グリセリン測定試薬(c)が、グリセロ
キナーゼとグリセロリン酸オキシダーゼとの組み合せ、
グリセロキナーゼとグリセロリン酸デヒドロキナーゼと
の組み合せ、グリセロールオキシダーゼ及びグリセロー
ルデヒドロゲナーゼより選ばれた酵素、並びに発色試薬
より構成されるものである請求項1記載の測定試薬。 - 【請求項5】 フィルムが、ナイロンまたは濾紙である
請求項1記載の測定試薬。
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